ES2642621T3 - Materiales de enfriamiento y procesamiento - Google Patents

Description

DESCRIPCION

Materiales de enfriamiento y procesamiento 5 ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Hay una gran abundancia de biomasa, especialmente, de residuos de biomasa. Serfa util obtener materiales y combustible, tales como el etanol, a partir de biomasa.

10 El documento WO2008/073186 desvela el procesamiento de biomasa para producir productos utiles, tales como combustibles. El documento EP1669434 describe un metodo y una instalacion para la transformacion de material organico procedente de residuos domesticos en combustible.

El documento US4769082 desvela que la eficiencia de la sacarificacion enzimatica y la fermentacion de la celulosa 15 en un recurso de residuo de celulosa se pueden aumentar mediante un tratamiento preliminar con radiacion ionizante.

El documento EP0794243 describe un aceite derivado del petroleo que se somete a desasfaltado con propano para producir un residuo de asfalteno solido y un procesamiento especificado de este para formar suspensiones. El 20 documento US4797135 desvela un metodo de produccion de harina de madera altamente conminuida y otros tipos de biomasa vegetal adecuados para su uso como combustible.

RESUMEN

25 Los materiales, tales como la biomasa, se pueden procesar para alterar sus estructuras a uno o mas niveles mediante enfriamiento y procesamiento. A continuacion, los materiales procesados se pueden usar, por ejemplo, como fuentes de otros materiales y combustible.

Muchas formas de realizacion de esta solicitud usan la qufmica Natural Force™. Los metodos qufmicos Natural 30 Force™ usan la aplicacion y manipulacion controladas de fuerzas ffsicas, tales como haces de partfculas, gravedad, luz, temperatura, etc., para generar los cambios moleculares qufmicos y estructurales previstos.

La lignina presente en muchos tipos diferentes de biomasa, biomasa celulosica y lignocelulosica incluidas, puede complicar los esfuerzos de alterar la biomasa para formar materia prima intermedia para su transformacion a 35 azucares mas sencillos y, en ultima instancia, productos tales como los alcoholes. Como resultado, los rendimientos de productos, tales como el etanol obtenido a partir de biomasa, pueden ser inferiores (y en algunos casos, considerablemente inferiores) a los rendimientos maximos teoricos de tales productos.

Los metodos desvelados en el presente documento utilizan el enfriamiento y procesamiento de materiales, por 40 ejemplo, el enfriamiento criogenico, en combinacion con una o mas tecnicas de procesamiento diferentes que incluyen una o mas etapas de procesamiento por radiacion (por ejemplo, exposicion a partfculas cargadas tales como electrones y/o iones). Estas otras tecnicas de procesamiento se llevan a cabo despues del enfriamiento.

Enfriando la biomasa u otro material, se puede aumentar la fragilidad de diversos componentes de la biomasa u otro 45 material (por ejemplo, hemicelulosa y/o lignina y/o protefnas y/o pectina y/o minerales), mejorando significativamente de ese modo la efectividad de las tecnicas de procesamiento que se usan para alterar el material. Aumentando la fragilidad de los materiales, los materiales se pueden fracturar (por ejemplo, los bordes de las fibras se pueden fracturar) o agrietar como resultado de diversas etapas de procesamiento. La fracturacion puede ser, por ejemplo, microfracturacion.

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Ademas, el enfriamiento del material puede tener otros efectos que provienen de las velocidades diferenciales de expansion y/o contraccion de los diversos componentes del material. Por ejemplo, ciertos componentes (por ejemplo, lignina con presencia de agua) se pueden contraer o expandir a velocidades mas rapidas que, o en diferentes cantidades que, otros componentes (por ejemplo, hemicelulosa, celulosa) con los que estan asociados. 55 Como resultado, el material en cuestion se puede debilitar, lo que favorece la separacion (por ejemplo, separacion de fases, delaminacion, escision interfacial, ruptura o fracturacion, por ejemplo, microfracturacion) de sus componentes. Estos procesos, que pueden suceder independientemente de otras tecnicas de procesamiento o de manera conjunta a otras tecnicas de procesamiento, tambien pueden mejorar los rendimientos de los productos, por ejemplo, el etanol, obtenidos a partir de hemicelulosa o celulosa que han sido separadas de la lignina. La separacion 60 de la lignina del material reduce la recalcitrancia del material, lo que facilita la transformacion de los componentes

celulosicos del material en una solucion de azucar (sacarificacion de la celulosa mediante una enzima). Sin querer estar limitados por la teona, se cree que la fracturacion del material puede permitir que la enzima penetre en el material en los sitios de fractura, acelerando de ese modo la sacarificacion. A continuacion, el material sacarificado se puede convertir en un producto, por ejemplo, se puede fermentar a etanol.

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Puesto que el enfriamiento se combina con otras tecnicas de procesamiento, es decir, radiacion y oxidacion, las otras tecnicas se pueden usar en menor grado para obtener resultados equivalentes. Por ejemplo, cuando se usa el enfriamiento con radiacion, la radiacion se puede usar en una dosis mas baja para proporcionar el mismo grado de reduccion de la recalcitrancia.

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Durante las diversas tecnicas de procesamiento que se usan para alterar y/o convertir materiales en otros materiales, se puede generar una cantidad significativa de calor en los materiales. Para evitar la combustion, o de otra forma, la iniciacion de alteracion termica no deseada de los materiales, los metodos de enfriamiento desvelados en el presente documento se pueden usar para disipar o compensar el exceso de calor. El grado de enfriamiento 15 (por ejemplo, la cantidad de calor eliminado del material) se puede variar en funcion de la cantidad de calor generado durante el procesamiento del material. El grado de enfriamiento tambien se puede ajustar para ajustar ciertas propiedades del material de biomasa, tales como su fragilidad, para mejorar la eficiencia de ciertas etapas de procesamiento posteriores. Por ejemplo, la conminucion de la hemicelulosa, la celulosa y la lignina, y la separacion de estos componentes, se pueden mejorar mediante los metodos desvelados en el presente documento.

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Tal y como se usa en el presente documento, un material "criogenico" es un material a una temperatura de 200 K o menos (por ejemplo, 170 K o menos, 150 K o menos, 130 K o menos, 120 K o menos, 110 K o menos, 100 K o menos, 90 K o menos, 80 K o menos, 70 K o menos, 60 K o menos, 50 K o menos, 40 K o menos, 30 K o menos). Por tanto, por ejemplo, un “lfquido criogenico” es un lfquido que tiene una temperatura de 200 K o menos.

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Como se comentara con mas detalle a continuacion, se pueden usar diversos materiales para el enfriamiento, entre los que se incluyen, por ejemplo, el nitrogeno lfquido, el dioxido de carbono y el hielo.

Los metodos desvelados en el presente documento pueden producir partfculas de material (por ejemplo, fibras) que 30 tienen una relacion entre el diametro y la longitud de 5:1 o mas (por ejemplo, 6:1 o mas, 8:1 o mas, 10:1 o mas, 12:1 o mas 15:1 o mas, 20:1 o mas).

Los metodos desvelados en el presente documento tambien pueden producir partfculas que tienen una dimension mas grande, por ejemplo, el diametro, de menos de, por ejemplo, 2000 nm, 1000, 750, 500, 250, 100, 50, 25, 20, 10, 35 5, o incluso 1 nm.

Los metodos desvelados en el presente documento pueden producir materiales que tienen una densidad aparente reducida. Por ejemplo, la densidad aparente de los materiales producidos usando los metodos desvelados en el presente documento puede ser 0,8 g/cm3 o menos (por ejemplo, 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2 o menos, por ejemplo, 0,1 40 g/cm3).

Los metodos desvelados en el presente documento pueden producir materiales que tienen secciones transversales relativamente finas, debido a los efectos combinados del enfriamiento del material para aumentar su fragilidad y el procesamiento del material usando una o mas de las tecnicas desveladas en el presente documento. En general, los 45 materiales que tienen secciones transversales finas se pueden enfriar mas eficientemente que los materiales que tienen secciones transversales mas gruesas; como resultado, se pueden reducir los costes (por ejemplo, el consumo de energfa) de procesamiento del material (por ejemplo, especialmente los costes de consumo de energfa en las tecnicas de procesamiento).

50 En un aspecto, la invencion presenta un metodo que incluye el enfriamiento de un material, que tiene mas de un componente y una interfaz entre los componentes, a una temperatura a la que los componentes se separan en la interfaz. A continuacion, el material enfriado se puede procesar para producir un producto que es diferente, por ejemplo, diferente qmmicamente, del material en sf Por ejemplo, la biomasa se puede enfriar y, a continuacion, procesar para producir etanol.

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Algunas implementaciones incluyen una o mas de las siguientes caractensticas. El material puede ser o incluir biomasa, por ejemplo, en algunos casos el material comprende un material lignocelulosico. Los componentes pueden incluir lignina y celulosa. La temperatura puede ser menor o igual al punto de fragilidad del material. El metodo incluye ademas la irradiacion del material, por ejemplo, con radiacion de haz de electrones. El metodo puede 60 incluir ademas el tratamiento mecanico del material, por ejemplo, mediante molienda, trituracion o conminucion. Por

ejemplo, el tratamiento mecanico del material puede incluir la molienda tras congelacion previa o la trituracion tras congelacion previa del material. El enfriamiento puede incluir un preenfriamiento del material antes la molienda tras congelacion previa o la trituracion tras congelacion previa. Los componentes pueden tener coeficientes de expansion termica diferentes. El metodo puede incluir el sometimiento del material a ciclos termicos. El material puede ser o 5 puede incluir un material que contiene hidrocarburo.

En otro aspecto, la invencion presenta un metodo que comprende el procesamiento de un material para hacer un producto, material que se ha producido mediante tratamiento de un material de partida para fragilizar el material de partida y procesamiento del material de partida para producir un producto diferente del material fragilizado. En 10 algunas implementaciones, el metodo incluye ademas la trituracion o conminucion del material fragilizado.

Algunas implementaciones incluyen una o mas de las siguientes caracterfsticas. El tratamiento incluye el enfriamiento del material de partida. Ademas, el tratamiento incluye la irradiacion del material. El material de partida incluye biomasa. El tratamiento y la trituracion o conminucion se pueden llevar a cabo simultaneamente, por ejemplo, 15 en un dispositivo de molienda o trituracion tras congelacion previa. El procesamiento del material puede incluir la puesta en contacto del material con una enzima y/o un microorganismo. El tratamiento puede incluir el sometimiento del material de partida a ciclos termicos. La biomasa puede incluir material lignocelulosico y el metodo puede incluir ademas la separacion de la lignina de la celulosa. La invencion presenta un metodo que incluye el enfriamiento de un material de biomasa para reducir la recalcitrancia del material y, despues del enfriamiento, el procesamiento del 20 material enfriado para producir un producto que es diferente, por ejemplo, diferente qufmicamente, del material de biomasa. En algunas implementaciones, el procesamiento comprende la puesta en contacto del material con una enzima y/o microorganismo, por ejemplo, la sacarificacion del material con una enzima o la fermentacion del material con un microorganismo. El material incluye celulosa y la puesta en contacto del material puede incluir la utilizacion de una enzima para sacarificar la celulosa. El metodo incluye ademas la irradiacion del material de biomasa. El 25 enfriamiento se puede llevar a cabo en un dispositivo de molienda tras congelacion previa o trituracion tras congelacion previa. La puesta en contacto del material puede incluir la utilizacion de un microorganismo para producir un alcohol. El enfriamiento puede incluir el enfriamiento del material a una temperatura por debajo del punto de fragilidad del material.

30 En otros aspectos, la invencion presenta un metodo que incluye el procesamiento, tal como mediante procesamiento mecanico, de un material de biomasa para reducir una dimension tal como un tamano de partfcula del material de biomasa, y el enfriamiento del material a una temperatura de 273 K o menos, o el mantenimiento del material a una temperatura de 273 K o menos durante el procesamiento. El metodo puede incluir ademas la puesta en contacto del material procesado con una enzima y/o un microorganismo. En algunos casos, el metodo incluye la sonicacion del 35 material y/o el tratamiento del material con partfculas cargadas. El enfriamiento puede fragilizar el material, lo que puede provocar la separacion de los componentes del material en una interfaz.

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden normalmente los expertos en la materia a los que se dirige la presente invencion. 40 En caso de conflicto, prevalecera la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son meramente ilustrativos.

Otras caracterfsticas y ventajas resultaran evidentes a partir de la descripcion, los dibujos y las reivindicaciones.

45 DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 es un diagrama esquematico que muestra un sistema de procesamiento de biomasa.

La FIG. 2 es un diagrama esquematico que muestra un sistema de procesamiento de biomasa.

La FIG. 3 es un diagrama esquematico que muestra una unidad de molienda.

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DESCRIPCION DETALLADA

Ciertos tipos de materiales, entre los que se incluyen los materiales celulosicos y/o lignocelulosicos, pueden incluir fracciones significativas de lignina unida a la celulosa y/o hemicelulosa en un complejo entramado de estructura 55 polimerica. Sin querer estar limitados por la teorfa, algunas pruebas sugieren que la lignina puede estar unida covalentemente tanto a la celulosa como a la hemicelulosa en los materiales (vease, por ejemplo, Karlsson et al., Journal of Pulp and Paper Science 27: 196-201 (2001)). Ademas, generalmente, se ha observado que la separacion de la lignina de la celulosa y/o la hemicelulosa aumenta los rendimientos de los azucares, los alcoholes y otros productos derivados del procesamiento adicional de la celulosa y/o la hemicelulosa. Ademas, la separacion de la 60 lignina de la celulosa y la hemicelulosa genera un coproducto valioso, la lignina.

Entre los ejemplos de materiales de biomasa se puede incluir cualquier material de biomasa que es o incluye carbohidratos compuesto exclusivamente por una o mas unidades de sacaridos o que incluye una o mas unidades de sacaridos y puede ser procesado mediante cualquiera de los metodos descritos en el presente documento. Por 5 ejemplo, el material de biomasa puede ser materiales celulosicos o lignocelulosicos, materiales amilaceos, tales como granos de mafz, granos de arroz u otros alimentos, o materiales que son o que incluyen uno o mas azucares de bajo peso molecular, tales como la sucrosa o la celobiosa.

Por ejemplo, entre tales materiales de biomasa se pueden incluir el papel, los productos de papel, la madera, los 10 productos relacionados con la madera, los tableros de partfculas, las hierbas, las cascarillas de arroz, el bagazo, el algodon, el yute, el canamo, el lino, el bambu, el sisal, el abaca, la paja, las mazorcas de mafz, las cascarillas de arroz, el pelo de coco, las algas, las algas marinas, el algodon, las celulosas sinteticas o mezclas de cualquiera de estos.

15 La biomasa tambien incluye fuentes de fibra celulosica, entre las que se incluyen el papel y los productos de papel (por ejemplo, el papel policubierto y el papel Kraft) y fuentes de fibra lignocelulosica, entre las que se incluyen la madera y los materiales relacionados con la madera, por ejemplo, los tableros de partfculas. Entre otras biomasas tambien se incluyen fuentes de fibra natural, por ejemplo, hierbas, cascarillas de arroz, el bagazo, el algodon, el yute, el canamo, el lino, el bambu, el sisal, el abaca, la paja, las mazorcas de mafz, las cascarillas de arroz, el pelo 20 de coco; fuentes de fibra con alto contenido de a-celulosa, por ejemplo, el algodon; y fuentes de fibra sintetica, por ejemplo, el hilo extruido (hilo orientado o hilo no orientado). Las fuentes naturales o sinteticas se pueden obtener a partir de materiales textiles de desecho, por ejemplo, remanentes, o pueden ser residuos posconsumo, por ejemplo, trapos. Cuando se usan productos de papel, pueden ser materiales vfrgenes, por ejemplo, materiales vfrgenes de desecho, o pueden ser residuos posconsumo. Ademas de materias primas vfrgenes, tambien se pueden usar 25 residuos posconsumo, industriales (por ejemplo, despojos) y de procesamiento (por ejemplo, efluente procedente del procesamiento del papel). La fuente de fibra tambien se puede obtener o proceder de residuos humanos (por ejemplo, aguas residuales), animales o de plantas. Se describen fuentes adicionales de biomasa en las patentes US6448307, US6258876, US6207729, US5973035 y US5952105.

30 La separacion de la lignina de la celulosa y/o la hemicelulosa puede resultar costosa y requerir mucho tiempo. Las tecnicas de procesamiento, entre las que se incluyen metodos tales como la molienda y la trituracion, pueden tener una eficiencia limitada por los fuertes enlaces que unen la lignina a la celulosa y la hemicelulosa.

Muchos metodos de procesamiento, entre los que se incluyen metodos mecanicos, exposicion a radiacion, 35 sonicacion e incluso algunas etapas qufmicas de procesamiento, generan calor en el material. Mientras que el calor de proceso adicional puede resultar ventajoso en algunas formas de realizacion, las grandes cantidades de calor generadas por ciertas etapas de procesamiento tambien pueden llevar a la alteracion termica de la celulosa y/o la hemicelulosa, reduciendo los rendimientos de los azucares, alcoholes y otros productos producidos a partir de la celulosa y/o la hemicelulosa.

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Asimismo, por ejemplo, cuando se calienta la lignina (por ejemplo, mediante el calor de proceso generado durante las etapas de procesamiento) por encima de su temperatura de transicion vftrea, la lignina se puede volver mas blanda y mas deformable (por ejemplo, menos fragil) y, por lo tanto, mas diffcil de procesar.

45 Los metodos desvelados en el presente documento usan tecnicas de enfriamiento, por ejemplo, tecnicas de enfriamiento criogenico, por ejemplo, para garantizar que no se produce descomposicion termica no deseada, por ejemplo, de la celulosa y/o la hemicelulosa, durante el procesamiento del material. El enfriamiento tambien se puede usar para ajustar propiedades del material con el fin de mejorar la eficiencia de separacion, por ejemplo, de la lignina de la celulosa y/o la hemicelulosa.

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En particular, los metodos de enfriamiento desvelados en el presente documento se pueden usar por sf solos o en combinacion para aumentar la fragilidad de los materiales, haciendo los materiales enfriados mas susceptibles de separacion mediante uno o mas metodos de procesamiento, especfficamente, una o mas etapas de procesamiento por radiacion (por ejemplo, exposicion a partfculas cargadas tales como electrones y/o iones). Aumentando la 55 fragilidad del material mediante enfriamiento y mejorando la eficiencia con la que el material se puede procesar mediante enfriamiento, por ejemplo, mediante conminucion o separacion, se pueden reducir los costes de procesamiento (por ejemplo, los costes de procesamiento relacionados con la energfa) y se pueden aumentar los rendimientos del producto previsto.

60 Asimismo, cuando se enfrfa un material multicomponente, diferentes componentes del mismo se contraeran y/o

expandiran a velocidades diferentes y/o en cantidades diferentes. En ciertas formas de realizacion, este proceso puede llevar a la ruptura de los enlaces qmmicos del material. Por ejemplo, este comportamiento en el enfriamiento puede introducir tensiones entre componentes unidos, llevando a procesos tales como la delaminacion, la fracturacion, la descamacion, la disociacion y la separacion de los componentes unidos. Como resultado, la 5 eficiencia con la que los componentes se pueden separar, y los rendimientos de los diversos productos derivados del material previstos, puede aumentar, disminuir o mantenerse en equilibrio.

El enfriamiento en combinacion con otros tratamientos tales como una irradiacion y oxidacion se pueden usar para controlar la funcionalizacion del material fibroso, es decir, los grupos funcionales que estan presentes sobre o en el 10 material. La funcionalizacion del material puede aumentar la solubilidad y/o dispersabilidad y puede hacer el material mas susceptible a conversion mediante enzimas y/o microorganismos.

En algunas formas de realizacion, despues de tratar el material, desde aproximadamente 1 de cada 2 hasta aproximadamente 1 de cada 250 unidades de sacarido incluyen un grupo acido carboxflico, o un ester o una sal del 15 mismo, mientras que el material base nativo o sin procesar puede tener menos de 1 grupo acido carboxflico por cada 300 unidades de sacarido. En otras formas de realizacion, desde aproximadamente 1 de cada 5 hasta aproximadamente 1 de cada 250 unidades de sacarido, por ejemplo, 1 de cada 8 hasta aproximadamente 1 de cada 100 unidades o desde 1 de cada 10 hasta aproximadamente 1 de cada 50 unidades incluyen un grupo acido carboxflico, o un ester o una sal del mismo.

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En algunas formas de realizacion, en el material irradiado, desde aproximadamente 1 de cada 5 hasta aproximadamente 1 de cada 1500 unidades de sacarido incluyen un grupo nitrilo, un grupo nitroso o un grupo nitro. En otras formas de realizacion, desde aproximadamente 1 de cada 10 hasta aproximadamente 1 de cada 1000 unidades de sacarido, por ejemplo, 1 de cada 25 hasta aproximadamente 1 de cada 1000 unidades o desde 1 de 25 cada 35 hasta aproximadamente 1 de cada 750 unidades incluyen un grupo nitrilo, un grupo nitroso o un grupo nitro.

En algunas formas de realizacion, las unidades de sacarido incluyen mezclas de grupos acido carboxflico, grupos nitrilo, grupos nitroso y grupos nitro. Los grupos mezclados pueden mejorar la solubilidad de un material celulosico o lignocelulosico. El material tratado tambien puede incluir grupos funcionales seleccionados de entre el grupo que 30 consiste en grupos aldehfdo, grupos cetona, grupos amino, grupos alquilamino, grupos alquilo, grupos cloroalquilo, grupos clorofluoroalquilo y grupos enol.

La FIG. 1 muestra un diagrama esquematico de un sistema de procesamiento de biomasa (100). El sistema (100) incluye una unidad de almacenamiento de material (102), un primer subsistema de procesamiento del material (104), 35 un conducto refrigerante (106), un segundo subsistema de procesamiento de material (108), un deposito de material procesado (110) y una unidad de suministro de fluido refrigerante (112). Durante su funcionamiento, el material almacenado en la unidad de almacenamiento (102) se transporta a traves del conducto (114) hasta el primer subsistema de procesamiento de material (104).

40 El subsistema (104) puede incluir una variedad de unidades de procesamiento diferentes. Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, el subsistema (104) puede incluir una o mas unidades de procesamiento mecanico (por ejemplo, unidades de trituracion, unidades de agitacion, unidades de molienda, unidades de abrasion, unidades de picado, unidades de cizallamiento). En ciertas formas de realizacion, el subsistema (104) puede incluir una o mas unidades de procesamiento por radiacion. Las unidades de procesamiento por radiacion pueden incluir fuentes de 45 partfculas cargadas (por ejemplo, fuente de haces de electrones y/o fuentes de iones), en las que el material se expone a partfculas cargadas para provocar la alteracion del material. En algunas formas de realizacion, el subsistema (104) puede incluir una o mas unidades de sonicacion, en las que el material se expone a ondas ultrasonicas para alterar el material. En ciertas formas de realizacion, el subsistema (104) puede incluir una o mas unidades de pirolisis y/o una o mas unidades de procesamiento qmmico. En algunas formas de realizacion, el 50 subsistema (104) puede incluir una o mas unidades de procesamiento por explosion por vapor. En algunas formas de realizacion, el subsistema (104) puede incluir una o mas combinaciones de estas unidades de procesamiento.

En general, el subsistema (104) puede incluir una o mas de las unidades de procesamiento anteriores, en cualquier combinacion. Generalmente, el subsistema (104) esta configurado para facilitar una etapa inicial de alteracion del 55 material, como preparacion para las etapas de procesamiento posteriores. En algunas formas de realizacion, el subsistema (104) puede no estar presente para nada y el material se puede transferir directamente desde la unidad de almacenamiento (102) hasta el conducto refrigerante (106). La FIG. 2 muestra una forma de realizacion de un sistema de procesamiento de material que no incluye un subsistema de procesamiento (104). Los diversos componentes de la FIG. 2 se han comentado anteriormente en relacion con la FIG. 1 y sus descripciones no se 60 repiten en este punto.

Volviendo a hacer referencia a la FIG. 1, despues de que el material se ha procesado en el subsistema (104), por ejemplo, mediante corte, picado, cizallamiento o fragmentacion, el material de transfiere a traves del conducto (116) al conducto refrigerante (106). La unidad de suministro del fluido refrigerante (112) suministra el fluido refrigerante 5 (por ejemplo, nitrogeno lfquido y/o gas nitrogeno enfriado, y/o helio lfquido y/o gas helio enfriado, y/o argon lfquido

y/o gas argon enfriado, y/o CO2 solido y/o CO2 lfquido, y/o aire lfquido y/o aire gaseoso enfriado) al conducto

refrigerante (106) a traves del conducto (120). El material se transporta a traves del conducto refrigerante (106) en la direccion mostrada por la flecha (128). A medida que el material se mueve a traves del conducto (106) (por ejemplo, sobre un dispositivo de transporte tal como una cinta transportadora y/o un tornillo sin fin), el material se enfrfa

10 mediante intercambio de calor con el fluido refrigerante suministrado por la unidad de suministro de fluido

refrigerante (112).

Cuando el material alcanza el final del conducto refrigerante (106), el material se transporta a traves del conducto (118) a un segundo subsistema de procesamiento de material (108). En algunas formas de realizacion, la unidad de 15 suministro de fluido refrigerante (112) suministra el fluido refrigerante a traves del conducto (122) a un segundo subsistema (108), tal y como se muestra en la FIG. 1. En general, el segundo subsistema de procesamiento (108) puede incluir una o mas de cualquiera de las unidades de procesamiento desveladas en el presente documento en relacion con el primer subsistema de procesamiento (104). Entre las unidades de procesamiento ejemplares se incluyen una o mas unidades de procesamiento tales como unidades de trituracion, picado o cizallamiento, unidades 20 de procesamiento por radiacion, unidades de procesamiento por sonicacion, unidades de procesamiento por pirolisis, unidades de procesamiento por explosion por gas y unidades de procesamiento qufmicas. El fluido refrigerante se puede reciclar para ser usado posteriormente en el conducto refrigerante (106) transportando el fluido a traves del conducto (124).

25 El material procesado, despues de salir del segundo subsistema de procesamiento (108), se transporta al deposito de material (110) a traves del conducto (126). Una vez en el deposito (110), el material se puede someter a etapas de procesamiento posteriores, entre las que se incluyen una o mas etapas adicionales de entre aquellas desveladas en relacion con los subsistemas de procesamiento (104, 108) anteriores. Alternativamente, o ademas, el material procesado se puede someter a etapas de procesamiento adicionales, entre las que se incluyen uno o mas procesos 30 que usan agentes biologicos tales como enzimas y/o microorganismos, tales como bacterias y/o levaduras y diversos productos qufmicos y formulaciones y soluciones qufmicas.

En general, los metodos de enfriamiento desvelados en el presente documento se pueden usar con una amplia variedad de diferentes tecnicas de procesamiento de biomasa y otros materiales. Tecnicas ejemplares que se 35 pueden usar con los metodos de enfriamiento comentados en el presente documento se desvelan, por ejemplo, en las solicitudes de patente siguientes: WO 2008/073186; y las patentes estadounidenses con numeros de serie 12/417,699, 12/417,707, 12/417,720, 12/417,723, 12/417,731, 12/417,786, 12/417,840, 12/417,880, 12/417,900, 12/417,904, 12/429,045, y 12/486,436.

40 En algunas formas de realizacion, cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, por ejemplo, tales como la conminucion, pueden resultar particularmente ventajosos cuando se usan en combinacion con uno o mas metodos de enfriamiento, por ejemplo, metodos de enfriamiento criogenico. Sin querer estar limitados por la teorfa, se cree que el aumento de fragilidad del material lignocelulosico que resulta del enfriamiento del material ayuda, al menos parcialmente, a la separacion de componentes, por ejemplo, en una interfaz. Ademas, se 45 cree que, aumentando la fragilidad de un material, las tecnicas pueden ser mas efectivas a la hora de la ruptura del material; en efecto, el material (y, a modo de ejemplo, la fraccion de lignina del material) se puede transformar de un polfmero flexible y deformable a un material rfgido similar al vidrio que se puede “desmenuzar”.

La FIG. 3 muestra una forma de realizacion ejemplar de una unidad de molienda (200) que puede formar una parte 50 de uno de los subsistemas de procesamiento (104, 108) o de ambos. La unidad de molienda (200) incluye un conducto (202) a traves del cual se transporta el material. En el interior del conducto estan colocadas unas cuchillas fijas (204). Las cuchillas rotativas (206) estan unidas a un eje colocado centralmente (208). Durante su funcionamiento, el material se muele mediante la accion de corte de las cuchillas (204, 206).

55 Se pueden usar equipos de molienda tras congelacion previa, trituracion tras congelacion previa, criomolienda y criotrituracion disponibles en el mercado. Tales equipos combinan el enfriamiento del material con la conminucion del material. Entre los ejemplos de dispositivos de criotrituracion disponibles en el mercado se incluyen el molino criogenico Freezer/Mill 6870, disponible en SPEX CertiPrep, Metuchen, Nueva Jersey y los dispositivos de criotrituracion de Pulva Corporation, Saxonburg, PA. Entre otros proveedores se incluyen Air Products, Praxair, y Air 60 Liquide. En algunas formas de realizacion, el equipo puede incluir un area de preenfriamiento, por ejemplo, un

transportador refrigerante tal como un extrusor de tornillo refrigerado. En algunos casos, el nitrogeno liquido se pulveriza sobre el material que se va a refrigerar en el area de preenfriamiento. La trituracion la puede realizar, por ejemplo, un pin reciprocante u otro elemento. Por ejemplo, el dispositivo de trituracion puede ser un molino de pines. Generalmente, es preferible que se supervise y controle la temperatura del material durante la alimentacion y 5 trituracion.

La trituracion tras congelacion previa se combina con irradiacion, en cuyo caso, la irradiacion se lleva a cabo despues de la trituracion tras congelacion previa. En algunos casos, la trituracion tras congelacion previa puede reducir la cantidad de radiacion necesaria para reducir la recalcitrancia de un material de biomasa o procesar un 10 material que contiene hidrocarburo.

Las tecnicas de procesamiento por sonicacion pueden, en ciertas formas de realizacion, ser particularmente ventajosas cuando se usan en combinacion con, por ejemplo, antes, inmediatamente despues o durante, los metodos de enfriamiento desvelados en el presente documento. En general, el procesamiento por sonicacion del 15 material es efectivo a la hora de alterar el material debido al calor suministrado al material a traves de ondas mecanicas (por ejemplo, ondas sonoras). Cuando se usan metodos de enfriamiento para reducir la temperatura del material, el material se vuelve mas fragil y es menos capaz de deformarse en respuesta a ondas mecanicas incidentes y/o experimentar una expansion rapida debido al calentamiento local. Como resultado, la eficiencia con la que la sonicacion cambia el material de forma efectiva aumenta. Primero se refrigerara el material y, a continuacion, 20 se irradiara (por ejemplo, en el subsistema (108)). La dosis de radiacion puede ser de, por ejemplo, desde aproximadamente 0,1 MRad hasta 200 Mrad, por ejemplo, desde aproximadamente 10 MRad hasta 100 Mrad o aproximadamente 30 MRad hasta 90 MRad. La radiacion se puede emitir en una unica etapa de irradiacion o en multiples etapas de irradiacion y el material, si se desea, se puede refrigerar entre las etapas de irradiacion. Tal enfriamiento se describe en el documento estadounidense con numero de serie 12/417,880.

25

La exposicion del material a ciertos tipos y dosis de radiacion puede aumentar la fragilidad del material. El material se puede enfriar para disminuir su temperatura y aumentar aun mas su fragilidad. Durante y/o despues del enfriamiento del material, el material se puede procesar (por ejemplo, mediante molienda, trituracion, cizallamiento y otras tecnicas similares) para alterar el material como preparacion para etapas de procesamiento posteriores que 30 produzcan productos utiles. Ademas, la exposicion a radiacion (por ejemplo, exposicion a haz de electrones y/o exposicion a haz de iones) del material despues del enfriamiento del material se usa para alterar aun mas el material y/o hacer el material mas fragil. Puesto que tanto la exposicion a radiacion como el enfriamiento se usan para hacer el material mas fragil, los rendimientos del producto (por ejemplo, etanol y/o otros alcoholes) pueden aumentar significativamente y la cantidad de energfa requerida para procesar el material se puede reducir.

35

En ciertas formas de realizacion, se pueden usar multiples etapas de enfriamiento y procesamiento mecanico, o etapas de enfriamiento y calentamiento alternas, por ejemplo, con o sin procesamiento mecanico adicional u otro procesamiento ffsico, para procesar un material, por ejemplo, biomasa. Por ejemplo, cada etapa sucesiva puede reducir aun mas el tamano medio de las partfculas de biomasa hasta alcanzar un tamano de partfcula deseado. 40 Cada etapa de enfriamiento puede ser similar o diferente (por ejemplo, el sistema puede incluir una pluralidad de subsistemas refrigerantes similares). En algunas formas de realizacion, el sistema puede incluir un unico subsistema refrigerante a traves del cual pasa el material multiples veces. Alternativamente, en ciertas formas de realizacion, se pueden usar etapas de enfriamiento diferentes (por ejemplo, etapas de enfriamiento que enfrfan la biomasa a diferentes temperaturas, tal como a temperaturas progresivamente mas bajas) para procesar el material.

45

De forma similar, en ciertas formas de realizacion, se pueden usar multiples etapas de procesamiento mecanico para procesar biomasa. Los materiales se pueden recircular a traves de la misma unidad de procesamiento multiples veces y/o el sistema puede incluir multiples unidades mecanicas. Las unidades pueden ser todas similares unas a otras, o algunas de las unidades pueden ser distintas (por ejemplo, en su estructura) unas de otras.

50

En general, se puede usar una amplia variedad de fluidos refrigerantes diferentes para enfriar el material. En las formas de realizacion antes comentadas, se uso nitrogeno liquido y/o gaseoso frio como fluido refrigerante. Sin embargo, en algunas formas de realizacion, se pueden usar uno o mas fluidos refrigerantes diferentes, entre los que se incluyen el helio, el oxigeno liquido, el hidrogeno liquido, el aire liquido, otros fluidos de este tipo y combinaciones 55 de los mismos. En ciertas formas de realizacion, los fluidos pueden ser gases mas que lfquidos, o pueden incluir solidos (por ejemplo, hielo, CO2 solido) mezclados con, o en lugar de, los lfquidos. Por ejemplo, se puede usar una amplia variedad de gases enfriados (incluyendo gases nobles enfriados, gas nitrogeno enfriado, gas oxigeno enfriado y gas hidrogeno enfriado) en lugar de, o junto con, los fluidos refrigerantes lfquidos.

60 En ciertas formas de realizacion, se pueden anadir solidos a los materiales para ayudar al procesamiento de los

materiales. Por ejemplo, se puede anadir CO2 solido a los materiales para ayudar a la alteracion de los materiales en una o mas unidades de procesamiento. Entre otros solidos que tambien se pueden usar se incluye, por ejemplo, el hielo. El solido tambien puede ser un elemento solido que posteriormente se retira o separa del material, por ejemplo, una o mas bolas, pines u otros elementos de molienda solidos.

5

La temperatura a la que se enfrfa el material depende de varios factores, entre los que se incluyen las tecnicas de procesamiento usadas para alterar el material y la naturaleza del material. En algunas formas de realizacion, por ejemplo, el material se enfrfa a una temperatura inferior a la temperatura de transicion vftrea de la lignina, que es de aproximadamente 100° a 170 ° C, por ejemplo, de aproximadamente 120° a 150 ° C, por ejemplo, aproximadamente 10 125 °C. Cuando la lignina se enfrfa por debajo de su temperatura de transicion vftrea, cambia de un material blando y deformable a un material cristalino y fragil. La lignina cristalina y fragil se puede alterar mas facilmente mediante diversos procesos, incluyendo los procesos antes desvelados. Ademas, enfriando la lignina por debajo de su temperatura de transicion vftrea, se puede cambiar la estructura ffsica de la lignina. Los cambios en la estructura de la lignina pueden llevar a tensiones internas dentro del material, donde la lignina esta unida a la celulosa y/o la 15 hemicelulosa. Estas tensiones internas pueden llevar a la delaminacion y, por tanto, separacion de la lignina de la celulosa y/o la hemicelulosa. En algunas implementaciones, el material se enfrfa por debajo de la temperatura a la que el material se vuelve fragil (el “punto de fragilidad” del material. Este punto de fragilidad de un material concreto se puede medir usando equipos de ensayo disponibles en el mercado, por ejemplo, el Benz BPT2100 Brittlepoint Tester disponible en Benz Material Testing Instruments, Providence, Rhode Island.

20

En algunas formas de realizacion el material se puede enfriar por debajo de la temperatura de transicion vftrea de uno o mas elementos o componentes diferentes del material, tales como la hemicelulosa. Consideraciones similares a las comentadas anteriormente en relacion con la lignina se aplican tambien a la hemicelulosa. En particular, el enfriamiento de la hemicelulosa puede hacerla mas fragil, lo que mejora la eficiencia de las etapas de procesamiento 25 posteriores. El enfriamiento tambien puede introducir tensiones internas dentro de la estructura de la biomasa, que pueden llevar a la separacion de la hemicelulosa de otros componentes (por ejemplo, celulosa) del material.

En ciertas formas de realizacion, el material se puede enfriar a una temperatura de 400 K o menos (por ejemplo, 380 K o menos, 360 K o menos, 340 K o menos, 320 K o menos, 300 K o menos, 280 K o menos, 260 K o menos, 240 K 30 o menos, 220 K o menos, 200 K o menos, 150 K o menos, 100 K o menos, 80 K o menos, 77 K o menos, 70 K o menos, 50 K o menos). En algunas formas de realizacion, el material se puede enfriar a una temperatura menor o igual a la temperatura ambiente (por ejemplo, 293 K). En ciertas formas de realizacion, el material se puede enfriar a aproximadamente la temperatura del nitrogeno lfquido (por ejemplo, 77 K) o menos. El enfriamiento del material a temperaturas inferiores a la temperatura del nitrogeno lfquido se puede lograr mediante el uso de fluidos 35 refrigerantes con un punto de ebullicion mas bajo que el del nitrogeno lfquido (por ejemplo, helio lfquido).

En algunas formas de realizacion, se puede controlar la velocidad a la que el material se enfrfa para ayudar a la separacion de componentes del material. Por ejemplo, enfriando el material rapidamente, las disposiciones de los componentes asociados en la biomasa de mas baja energfa puede que no tengan tiempo suficiente para formarse. 40 En otras palabras, el material enfriado puede estar en un estado de energfa que no es el estado de energfa mfnimo y, por tanto, puede ser inestable y mas facil de alterar usando etapas de procesamiento posteriores. Por ejemplo, en ciertas formas de realizacion, la velocidad a la que el material se enfrfa es de 1 K/s o mas (por ejemplo, 2 K/s o mas, 3 K/s o mas, 5 K/s o mas, 7,5 K/s o mas, 10 K/s o mas, 15 K/s o mas, 20 K/s o mas, 30 K/s o mas, 40 K/s o mas, 50 K/s o mas, 75 K/s o mas, 100 K/s o mas, o incluso mas).

45

En ciertas formas de realizacion, usando los sistemas de procesamiento desvelados en el presente documento, el material se puede mantener a una temperatura seleccionada y/o dentro de un intervalo de temperatura seleccionado durante el procesamiento del material usando una o mas de las diversas tecnicas de procesamiento desveladas en el presente documento. Por ejemplo, el material se puede mantener a una temperatura de 400 K o menos (por 50 ejemplo, 380 K o menos, 360 K o menos, 340 K o menos, 320 K o menos, 300 K o menos, 280 K o menos, 260 K o menos, 240 K o menos, 220 K o menos, 200 K o menos, 150 K o menos, 100 K o menos, 80 K o menos, 77 K o menos, 70 K o menos, 50 K o menos). En algunas formas de realizacion, el material se puede mantener a, o por debajo de, la temperatura ambiente (por ejemplo, 293 K). En ciertas formas de realizacion, la biomasa se puede mantener a la temperatura del nitrogeno lfquido (por ejemplo, 77 K) o menos.

55

En ciertas formas de realizacion, el material se puede someter a una secuencia de etapas de calentamiento y enfriamiento que se seleccionan para provocar una disrupcion adicional de la asociacion (por ejemplo, presuntos enlaces covalentes) entre la lignina y la celulosa y/o la hemicelulosa. El sometimiento del material a ciclos termicos rapidos puede introducir tensiones internas dentro del material, que pueden llevar a la separacion de los 60 componentes de la biomasa (por ejemplo, sin procesamiento posterior, o como resultado de etapas de

procesamiento posteriores).

Ademas, se puede anadir una variedad de agentes diferentes al material antes de, durante y/o despues del enfriamiento del material. Entre los agentes ejemplares que se pueden anadir se incluyen el agua (y, mas 5 generalmente, cualquier otro compuesto que se expanda o se contraiga cuando se enfrfa), agentes oxidantes, agentes reductores, acidos, bases y materiales que se contraen significativamente al enfriarse. En general, se pueden introducir agentes tales como el agua en uno o mas de los componentes del material para provocar el hinchamiento de los componentes cuando se hidraten. Por ejemplo, cuando el material, por ejemplo, biomasa, se enfrfa, el agua se expande y/o contrae, creando tensiones internas periodicas en el material que pueden llevar a la 10 escision de los enlaces en el interior del material, por ejemplo, entre la lignina y la celulosa y/o la hemicelulosa. Tambien se pueden usar otros agentes que experimentan sublimacion (por ejemplo, dioxido de carbono) para producir resultados similares. Generalmente, los agentes que subliman experimentan cambios significativos de volumen molar en una transicion de fase. Tales agentes se pueden introducir en el material para favorecer aun mas la separacion de los componentes en el cuando se produce una expansion y/o contraccion relativamente rapida del 15 material como resultado de los agentes anadidos.

Como se ha senalado anteriormente, se pueden anadir diversos agentes qufmicos, tales como agentes oxidantes y/o agentes reductores y/o acidos y/o bases, al material. Los diversos agentes pueden reaccionar con el material antes, durante y/o despues del enfriamiento para ayudar aun mas a la alteracion del material antes de la formacion y 20 extraccion del producto. En general, ciertos componentes del material pueden ser estables en presencia de un agente, pero reactivos en presencia de otros agentes. Por ejemplo, la celulosa es estable frente a las bases, pero se ve alterada por los acidos. Introduciendo bases en uno o mas de los diversos subsistemas de procesamiento, se pueden alterar y disociar selectivamente uno o mas componentes seleccionados del material, por ejemplo, la lignina, de otro(s) componente(s), por ejemplo, la celulosa y/o la hemicelulosa, lo que mejora los rendimientos de los 25 productos derivados del material. Se pueden anadir agentes qufmicos a los diversos subsistemas de procesamiento en forma de lfquidos, soluciones y/o gases. En algunas formas de realizacion, los agentes se pueden introducir en forma gaseosa y se pueden condensar a lfquidos a medida que se enfrfa el material.

En ciertas formas de realizacion, se pueden anadir diversos agentes qufmicos oxidantes y/o reductores antes, 30 durante y/o despues del enfriamiento para favorecer la separacion de al menos alguno de los componentes del material mediante reacciones qufmicas. Se puede usar el enfriamiento por sf solo, o junto con una o mas de las tecnicas de procesamiento desveladas anteriormente, para favorecer la disociacion, por ejemplo, de la lignina de la celulosa y/o la hemicelulosa. Esta disociacion se puede favorecer aun mas haciendo reaccionar la celulosa, la hemicelulosa y/o la lignina con agentes tales que los productos de tales reacciones no se reasocien facilmente. 35 Entre los agentes oxidantes y reductores ejemplares se incluyen el ozono, el oxfgeno, el aire, el amoniaco y una amplia variedad de otros agentes.

En algunas formas de realizacion, se pueden usar multiples etapas de enfriamiento diferentes, cada una de las cuales se configura para enfriar el material a una temperatura diferente. Por ejemplo, en una etapa inicial de 40 procesamiento, el material se puede enfriar a una temperatura seleccionada y se puede procesar (por ejemplo, mecanicamente, mediante exposicion a radiacion, mediante sonicacion y/o mediante diversas otras tecnicas). Por ejemplo, en cada etapa de procesamiento posterior, puesto que las partfculas de material se pueden hacer cada vez mas pequenas, se puede enfriar el material a temperaturas sucesivamente mas bajas y se puede procesar aun mas, para continuar reduciendo el tamano de las partfculas y/o disociando aun mas componentes del material tal como la 45 biomasa (por ejemplo, disociar la lignina de la celulosa y/o la hemicelulosa) o para cambiar la estructura.

En general, la descripcion de la invencion no se limita al sistema de procesamiento especffico descrito anteriormente en la FIG. 1. En particular, se pueden usar varios metodos de enfriamiento diferentes para reducir la temperatura del material antes, durante y/o despues de la aplicacion de diversas tecnicas de procesamiento. Ademas, en general, se 50 puede usar una amplia variedad de subsistemas refrigerantes diferentes para enfriar el material.

En algunas formas de realizacion, los sistemas de procesamiento desvelados en el presente documento pueden incluir un subsistema de separacion que sirva para separar los diversos componentes del material despues de que el material se ha enfriado y procesado. Por ejemplo, cuando el material se procesa para disociar la lignina de la 55 celulosa y/o la hemicelulosa, el sistema de procesamiento puede incluir un subsistema de separacion configurado para retirar la lignina disociada. Se pueden usar diversos metodos, incluyendo metodos de separacion ffsica, tales como la decantacion, la centrifugacion, la destilacion y la extraccion, para separar los componentes, por ejemplo, la lignina de los otros componentes de un material lignocelulosico, o la arena de los hidrocarburos en una arena petrolffera. Entre otros metodos que se pueden implementar en el subsistema de separacion se incluyen el 60 procesamiento termoqufmico, el procesamiento qufmico y el procesamiento por exposicion a radiacion.

En ciertas formas de realizacion, los sistemas de procesamiento desvelados en el presente documento pueden incluir una o mas estaciones de humectacion para introducir diversos agentes humectantes, particularmente agua y/o otros lfquidos tales como dimetilsulfoxido, en los materiales. Por ejemplo, despues de las unidades de 5 procesamiento mecanico tales como la unidad de molienda mostrada en la FIG. 3, el sistema de procesamiento puede incluir un pulverizador que anada agua y/o otros agentes al material. El pulverizador puede crear una niebla fina que se deposita sobre las superficies de las partfculas de material. Si el material se enfna durante o despues de la aplicacion de la niebla, la niebla se puede congelar sobre las superficies de las partfculas para garantizar la adherencia. La temperatura del material puede experimentar uno o mas ciclos de enfriamiento y calentamiento para 10 hinchar aun mas el material con la niebla aplicada. Ademas, en ciertas formas de realizacion, los cambios, por ejemplo, los cambios rapidos de temperatura del material, pueden alterar aun mas la estructura del material.

En algunas formas de realizacion, se pueden usar multiples etapas de humectacion. Cada una de las multiples etapas de humectacion puede introducir el mismo agente en el material, o diferentes etapas pueden introducir 15 diferentes agentes. La seleccion de que agentes se deben introducir depende de factores tales como la aplicacion prevista del material, el estado ffsico-qmmico del material y las condiciones de las etapas posteriores de procesamiento del material.

Sistemas y metodos de mejorar la humectacion de los materiales antes, durante y despues del procesamiento se 20 desvelan, por ejemplo, en el documento estadounidense con numero de serie 12/417,880.

En algunas formas de realizacion, despues de que los materiales se han procesado usando los metodos desvelados en el presente documento, los materiales procesados se pueden someter a etapas de procesamiento adicionales. En particular, los materiales procesados se pueden poner en contacto con agentes biologicos tales como enzimas 25 y/o con microorganismos tales como levaduras (por ejemplo, P. stipitis) y/o bacterias para extraer una variedad de productos utiles a partir de los materiales procesados, entre los que se incluyen productos tales como el hidrogeno, los alcoholes (por ejemplo, etanol y/o butanol), los acidos organicos (por ejemplo, acido acetico), los hidrocarburos, los coproductos (por ejemplo, protemas) o mezclas de cualquiera de estos. Agentes biologicos y microorganismos adecuados para el procesamiento posterior de los materiales de desvelan, por ejemplo, en el documento WO 30 2008/073186.

Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, se usan las tecnicas descritas en el presente documento para separar y retirar la lignina de un material lignocelulosico y, a continuacion, los componentes celulosicos restantes se sacarifican, por ejemplo, usando una enzima. La eliminacion de la lignina reduce la recalcitrancia del material, lo que 35 permite la conversion de la celulosa a azucares que, a continuacion, se pueden fermentar para producir alcoholes.

EJEMPLO

Se ensayaron diversas muestras de materiales celulosicos en matraces oscilantes, usando P. stipitis NRRL Y-7124 y 40 una formula de medio nutriente estandar a diversos niveles. Se midio la concentracion de etanol a lo largo del tiempo en cada matraz. Tal y como se senala a continuacion (vease la leyenda de la Tabla 1), las muestras celulosicas procedfan de hierba cortada (CG). Algunas de las muestras se trituraron por congelacion (FG), usando un molino criogenico SPEX Certiprep® Freezer/Mill 6870. Las condiciones de la trituracion tras congelacion previa fueron las siguientes: 4 minutos de preenfriamiento, seguidos de tres ciclos de 10 minutos de tiempo de operacion y 2 minutos 45 de tiempo de enfriamiento, con una frecuencia de trituracion de 15 Hz. Algunas de las muestras se irradiaron sin someterse a trituracion tras congelacion previa, mientras que otras se irradiaron despues de someterse a trituracion tras congelacion previa. La irradiacion se llevo a cabo usando un haz de electrones. La dosis de radiacion se indica mediante el numero despues de "CG," donde 0,2E indica 0,2 MRad, 0,4E indica 0,4 MRad, etc. Cuando la dosis de radiacion era de 10 MRad o menos, se suministraba en un unico paso. Cuando la dosis de radiacion era superior a 50 10 MRad, se suministraba en multiples pasos de 10 MRad (por ejemplo, 50 MRad = 5 x 10 MRad), con intervalos de 1 minuto entre pasos para permitir que el material enfriara a temperatura ambiente.

Reactivos usados

Componente del medio

Fabricante N.° de referencia N.° de lote

Urea

ScholAR Chemistry 9472706 AD-7284-43

Base nitrogenada de levadura

Becton Dickinson 291940 7128171

Peptona

Becton Dickinson 211677 4303198

Xilosa (>98 %)

Alfa Aesar A10643 10131481

Glucosa (>98,9 %)

Fisher BP-350-1, 50-997 030064, 030439

Caldo YM

Becton Dickinson 271120 6278265

Novozyme® 188*

Novozymes Sigma C6105 018K0735, 058K1144

Celluclast 1, 5 FG

Novozymes Sigma C2730 077K0735, 058K1144

Enzima Optimash™ TBG**

Genencor® N/A 1600925859

* Celobiasa de Aspergillus niger * B-glucanasa EC 3.2.1.6.

Preparacion del banco de celulas y desarrollo del matraz de siembra

Para preservar el cultivo original, se preparo un banco de celulas de cada cultivo. Se preparo un banco de celulas de 5 trabajo de P. stipitis NRRL Y-7124 a partir de un cultivo liofilizado rehidratado obtenido de la Coleccion de Cultivos ARS. Se almacenaron crioviales que contenfan cultivo de P. stipitis en glicerol al 15 % en volumen a -75 °C.

Para preparar el matraz de siembra, se sembro en estrfa una porcion del material del banco de celulas de trabajo descongelado sobre un caldo para levaduras y hongos (YM) + 20 g/L de agar (pH 5,0) y se incubo a 30 °C durante 2

10 dfas. Las placas se mantuvieron 2 dfas a 4 °C antes de su uso. Se uso una colonia del medio para hongos y

levaduras con agar para inocular un matraz Erlenmeyer de 250 mL Erlenmeyer que contenfa 100 mL de caldo esteril (40 g/L de glucosa, 1,7 g/L de base nitrogenada de levadura, 2,27 g/L de urea, 6,56 g/L de peptona, 40 g/L xilosa, pH 5,0) y se incubo durante 24 horas a 25 °C y 150 rpm. Tras 23 horas de crecimiento, se tomo una muestra y se analizo su densidad optica (OD a 600 nm en un espectrofotometro UV), su recuento celular total y su pureza (tincion

15 de Gram). En base a estos resultados, se uso un matraz con una OD de entre 6 y 11 y un recuento de celulas de 2 a

6 x108 celulas/mL para inocular los matraces de ensayo. Se anadio un mL del contenido de los matraces de siembra a los matraces de ensayo de 100 mL (1 % en volumen).

Matraces de ensayo

20

Los matraces de ensayo fueron matraces Erlenmeyer de 250 mL que contenfan 100 mL de caldo. Los matraces de ensayo contenfan el medio estandar (1,7 g/L de base nitrogenada de levadura, 2,27 g/L de urea, 6,56 g/l de peptona, pH 5,0). Habfa tres conjuntos de matraces de control, porque el ensayo se realizo a lo largo de un periodo de tres semanas y los matraces de control se analizaron para cada semana de ensayo.

25

La cronologfa de actividades fue la siguiente. La muestra lignocelulosica (7,77 g) se combino con 100 mL de caldo esteril en un matraz esteril de 250 mL y se permitio que se embebiera durante 14 horas a temperatura ambiente. Despues de embeberse, se ajusto el pH del contenido del matraz a 5,0 con NaOH 1N. Una vez ajustado el pH, se anadieron 3,89 mL de Celluclast 1,5 FG, 0,77 mL de Novozyme® 188 y 0,77 mL de Optimash™ TBG y se incubaron 30 los matraces a 50 °C durante 21 horas.

Tras el tratamiento enzimatico, se ajusto el pH del contenido del matraz a 5,5, 6,0 o 6,25. Tras el ajuste del pH, se inocularon los matraces con 1 mL del contenido del matraz de siembra de P. stipitis y se incubaron durante 96 horas a 25 °C y 125 rpm.

35

Se inocularon tres matraces de control (dos positivos y uno negativo) cada semana, nueve en total. Los dos matraces de control positivos contenfan azucares. Uno contenfa 80 g/L de azucares (40 g/L de glucosa y 40 g/L de xilosa), el otro contenfa 30 g de azucares (15 g/L de glucosa y 15 g/L de xilosa). No habfa azucares anadidos al matraz de control negativo.

40

Un conjunto de matraces (cinco en total) contenfan caldo solo de xilosa (40 g/L de xilosa, 1,7 g/L de base nitrogenada de levadura, 2,27 g/L de urea, 6,56 g/L de peptona) a pH 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5. Los matraces se incubaron a 125 rpm y 25 °C despues de su inoculacion con 1 mL de P. stipitis.

45 Un segundo conjunto de matraces (cinco en total) contenfan caldo solo de xilosa (40 g/L de xilosa, 1,7 g/L de base

nitrogenada de levadura, 2,27 g/L de urea, 6,56 g/L de peptona) a pH 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5. Los matraces se incubaron a 250 rpm y 25 °C despues de su inoculacion con 1 mL de P. stipitis.

Durante la semana 1, se ensayaron las muestras CG0.4E y CG0.4E-FG4102315 en matraces a pH 5,5. Sin 5 embargo, el protocolo indicaba que se deberfan ensayar tanto a 5,5 como a 6,0. Por lo tanto, ambas muestras se ensayaron a pH 5,5 y 6,0 en la semana 2 del experimento (matraces del 28 al 31).

Analisis

10 Se tomo un total de ocho muestras de cada matraz a las 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, y 96 horas posinoculacion y se analizo la concentracion de glucosa, etanol y xilosa usando el analizador YSI Biochem Analyzer (YSI, Interscience). Las muestras se centrifugaron a 14 000 rpm durante 20 minutos y el sobrenadante se almaceno a -20 °C. Se analizo un estandar diariamente para garantizar que se mantenfa la integridad de la membrana.

15 Se analizo el recuento de celulas de cada matraz de siembra con el fin de determinar la concentracion inicial de celulas en los matraces de ensayo. Se tomo una muestra de cada matraz a las 72 horas de incubacion y se analizo el recuento de celulas. Se mezclaron muestras adecuadamente diluidas con azul de tripano al 0,05 % y se cargaron en un hemocitometro Neubauer. Se realizo el recuento de celulas con una magnificacion de 40x.

20 Se midio el pH de cada matraz a las 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, y 96 horas.

Resultados

Se analizo el numero de celulas de los matraces de siembra. Durante la semana 1 (matraces del 1 al 27), la 25 concentracion de celulas del matraz de siembra fue de 5,03 x 108 celulas/mL. Por lo tanto, la concentracion de celulas de partida de los matraces de ensayo fue de 5,03 x 106 celulas/mL. Durante la semana 2 (matraces del 28 al 64), el numero de celulas del matraz de siembra fue de 6,38 x 108 celulas/mL. Por lo tanto, la concentracion de celulas de partida de los matraces de ensayo fue de 6,38 x 106 celulas/mL. Durante la semana 3 (matraces del 65 al 105), el numero de celulas del matraz de siembra fue de 5,93 x 108 celulas/mL. Por lo tanto, la concentracion de 30 celulas de partida de los matraces de ensayo fue de 5,93 x 106 celulas/mL.

La concentracion de etanol de cada uno de los matraces durante la incubacion se enumera a continuacion en la tabla 1:

35 Tabla 1

Leyenda: "CG" = Hierba cortada; "FG" = Triturado criogenico; 0.xE = irradiado con radiacion de 0.x MRad usando haz de electrones.

N.° de matraz

N.° de muestra pH de partida Concentracion de etanol (g/L) en el tiempo de incubacion (h)

0

12 24 36 48 60 72 96 5

1

CG 5,5 0,10 0,14 0,16 0,05 0,03 0,04 0,05 0,07

2

CG 6,0 0,12 0,21 0,24 0,19 0,14 0,09 0,08 0,07

3

CG-FG 5,5 0,10 1,35 4,34 4,31 5,75 5,98 5,54 3,32

4

CG-FG 6,0 0,10 1,44 4,33 4,12 6,59 6,46 5,71 3,61

5

CG0.2E 5,5 0,10 0,21 0,21 0,07 0,04 0,17 1,25 0,08

6

CG0.2E-FG 5,5 0,10 1,24 4,42 3,85 5,82 6,05 5,52 3,03

7

CG0.4E 5,5 0,10 0,88 2,13 2,80 3,95 3,47 2,54 0,33

8

CG0.4E-FG 5,5 0,09 1,33 4,38 4,38 5,47 5,76 5,92 3,83

9

CG0.6E 5,5 0,11 1,06 1,98 2,67 2,94 0,91 1,13 0,11

10

CG0.6E-FG 5,5 0,10 1,33 4,53 4,65 5,94 6,22 6,33 4,09

11

CG0.8E 5,5 0,10 0,60 2,28 2,75 4,55 3,99 2,07 0,12

12

CG0.8E-FG 5,5 0,10 0,83 4,36 4,44 5,62 5,91 5,43 3,35

13

CG2E 5,5 0,10 0,61 2,23 2,72 3,79 2,33 0,06 0,08

14

CG2E-FG 5,5 0,1 1,13 4,39 4,51 5,74 6,20 6,12 3,91

15

CG4E 5,5 0,10 0,66 2,37 2,78 3,96 3,56 2,04 0,12

16

CG4E-FG 5,5 0,09 1,16 4,75 4,45 5,61 5,94 6,33 4,04

17

CG6E 5,5 0,10 0,62 2,45 2,74 4,26 4,36 3,04 0,20

18

CG6E-FG 5,5 0,00 1,17 4,66 4,38 5,77 6,06 6,27 4,26

19

CG8E 5,5 0,10 0,77 2,18 2,26 2,36 2,33 2,10 1,32

20

CG8E-FG 5,5 0,11 1,05 4,78 4,79 5,70 6,25 6,23 3,81

21

CG10E 5,5 0,12 0,70 2,28 2,62 3,88 4,04 2,82 0,14

22

CG10E 6,0 0,11 0,64 2,21 2,20 3,24 3,84 3,13 1,02

23

CG10E-FG 5,5 0,11 0,99 4,81 4,92 5,71 6,25 6,03 3,98

24

CG10E-FG 6,0 0,10 1,28 4,85 5,12 6,58 6,88 6,46 3,90

25

Control (80 g de azucar) 5,0 0,04 0,89 6,95 9,57 11,10 11,90 12,40 11,90

26

Control (30 g de azucar) 5,0 0,06 1,54 6,09 6,54 7,63 8,11 8,17 6,91

27

Control (sin azucar) 5,0 0,06 0,01 0,00 0,00 0,00 0,16 0,00 0,04

28

CG0.4E 5,5 0,09 0,12 0,15 0,11 0,15 0,07 0,84 0,05

29

CG0.4E 6,0 0,08 0,30 1,51 1,55 1,92 3,06 2,59 1,18

30

CG0.4E-FG 5,5 0,15 0,49 4,14 4,78 5,27 5,87 5,44 3,73

31

CG0.4E-FG 6,0 0,14 0,58 4,38 5,13 6,09 5,69 5,22 3,53

32

CG20E 5,5 0,18 0,27 2,55 2,70 2,71 3,19 4,14 2,56

33

CG20E-FG 5,5 0,14 0,40 4,98 5,89 5,46 5,36 5,58 3,84

34

CG30E 5,5 0,12 0,19 2,75 3,27 3,19 2,67 3,07 2,18

35

CG30E-FG 5,5 0,15 0,30 5,24 6,33 6,08 5,83 6,12 4,91

36

CG40E 5,5 0,14 0,18 3,18 4,26 4,00 3,20 3,55 2,90

37

CG40E-FG 5,5 0,14 0,30 5,62 6,50 6,99 6,74 6,91 5,37

38

CG50E 5,5 0,17 0,22 3,06 4,33 4,27 3,97 3,60 3,38

39

CG50E 6,0 0,17 0,37 4,47 4,62 5,11 4,93 5,13 3,60

40

CG50E-FG 5,5 0,17 0,27 5,77 7,93 7,58 6,95 6,92 5,90

41

CG50E-FG 6,0 0,16 0,34 6,23 7,70 7,13 5,94 5,81 4,25

42

CG60E 5,5 0,14 0,18 4,24 5,76 5,99 5,58 5,56 4,33

43

CG60E-FG 5,5 0,13 0,25 6,01 8,36 8,92 8,42 8,47 7,63

44

CG70E 5,5 0,15 0,17 6,61 6,40 6,63 6,41 6,35 5,57

45

CG70E-FG 5,5 0,13 0,20 4,52 8,98 9,25 8,75 8,68 7,44

46

CG80E 5,5 0,13 0,18 5,13 7,20 6,93 6,69 7,12 5,88

47

CG80E-FG 5,5 0,14 0,20 6,96 9,58 10,20 9,54 9,03 8,52

48

CG90E 5,5 0,14 0,16 5,10 7,34 7,69 7,07 7,40 6,83

49

CG90E-FG 5,5 0,15 0,21 7,03 9,42 11,50 11,00 9,79 8,90

50

CG100E 5,5 0,18 0,20 5,84 8,05 8,99 8,52 8,32 7,14

51

CG100E 6,0 0,15 0,24 6,46 9,03 8,73 8,75 8,38 5,94

52

CG100E 6,25 0,16 0,18 6,45 9,13 8,88 8,21 7,78 6,56

53

CG100E- FG 5,5 0,13 0,14 7,30 8,87 10,90 10,20 10,40 9,28

54

CG100E- FG 6,0 0,13 0,24 7,30 10,40 10,50 10,10 9,73 8,43

55

CG100E- FG 6,25 0,13 0,19 7,33 10,50 10,70 10,60 10,00 8,94

56

CG110E 5,5 0,16 0,12 6,19 7,95 9,65 8,60 8,66 7,94

57

CG110E 6,0 0,19 0,22 6,35 8,76 9,26 8,70 8,21 7,12

58

CG110E- FG 5,5 0,15 0,14 7,06 8,80 10,40 10,10 9,74 8,88

59

CG110E- FG 6,0 0,14 0,19 7,70 10,50 11,60 10,90 10,00 8,57

60

CG120E 5,5 0,19 0,14 6,45 7,83 9,88 9,79 8,91 8,11

61

CG120E- FG 5,5 0,15 0,13 7,35 9,02 10,60 10,70 10,00 8,88

62

Control (80 g de azucar) 5,0 0,10 0,54 5,22 8,46 9,85 10,90 11,90 12,50

63

Control (30 g de azucar) 5,0 0,09 0,97 5,79 7,07 8,41 8,63 8,82 4,50

64

Control (sin azucar) 5,0 0,07 0,04 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

65

CG130E 5,5 0,10 0,19 6,71 8,15 9,88 9,13 9,16 9,15

66

CG130E 6,0 0,11 0,28 6,62 9,15 9,86 9,27 9,20 8,52

67

CG130E- FG 5,5 0,11 0,20 7,42 8,72 10,50 10,50 10,10 9,45

68

CG130E- FG 6,0 0,11 0,25 7,08 9,72 10,30 10,50 9,87 8,95

69

CG140E 5,5 0,11 0,16 6,27 7,43 9,27 9,23 9,03 8,82

70

CG140E 6,0 0,09 0,22 6,34 7,90 9,44 8,94 8,88 8,17

71

CG140E- FG 5,5 0,10 0,17 7,08 8,22 9,88 10,10 9,88 8,80

72

CG140E- FG 6,0 0,10 0,30 7,21 9,50 10,30 10,20 9,64 8,72

73

CG150E 5,5 0,10 0,16 6,04 7,65 9,00 8,96 9,20 9,14

74

CG150E 6,0 0,9 0,21 6,89 8,80 9,92 9,90 9,69 8,62

75

CG150E 6,25 0,12 0,23 6,29 8,91 9,66 7,52 9,29 8,38

76

CG150E- FG 5,5 0,10 0,18 5,86 8,36 9,73 9,41 9,31 8,87

77

CG150E- FG 6,0 0,10 0,27 7,05 9,63 9,81 9,76 9,26 8,31

78

CG150E- FG 6,25 0,06 0,28 6,89 8,86 8,90 9,95 7,52 5,97

79

CG160E 5,5 0,10 0,12 6,02 7,55 8,99 8,70 8,62 7,92

80

CG160E- FG 6,0 0,10 0,20 6,92 9,11 9,84 10,10 9,53 8,58

81

CG170E 5,5 0,10 0,14 4,89 7,39 8,60 9,49 8,68 7,59

82

CG170E- FG 6,0 0,11 0,19 7,18 8,66 10,10 9,49 9,16 7,99

83

CG180E 5,5 0,11 0,15 6,27 7,37 8,65 9,58 8,38 7,95

84

CG180E- FG 6,0 0,11 0,22 7,00 8,69 9,22 8,98 8,84 7,85

85

CG190E 5,5 0,01 0,15 5,12 6,92 8,00 9,50 8,65 8,37

86

CG190E- FG 6,0 0,09 0,17 6,66 7,92 9,12 8,87 8,75 8,03

87

CG200E 5,5 0,10 0,15 5,75 7,12 8,68 9,05 7,99 7,55

88

CG200E 6,0 0,08 0,16 6,38 8,80 8,92 8,57 8,30 6,98

89

CG200E 6,25 0,10 0,22 6,28 8,17 8,55 8,67 8,30 7,84

90

CG200E- FG 5,5 0,01 0,16 5,54 7,47 8,69 8,50 8,32 7,67

91

CG200E- FG 6,0 0,11 0,21 5,69 7,78 8,90 8,75 8,44 7,40

92

CG200E- FG 6,25 0,11 0,19 6,29 8,30 9,37 9,08 7,93 7,31

93

Control (80 g de azucar) 5,0 0,02 0,50 4,25 6,81 7,75 8,90 8,72 9,46

94

Control (30 g de azucar) 5,0 0,04 0,59 4,49 5,29 6,19 8,60 5,81 5,72

95

Control (sin azucar) 5,0 0,04 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

96

Sin muestra, caldo solo de xilosa 4,5 0,03 0,28 2,07 3,82 4,37 5,44 6,41 6,72

97

5,0 0,04 0,27 2,63 4,15 7,42 8,16 8,63 9,13

98

5,5 0,04 0,34 2,94 5,00 5,96 7,96 8,77 9,39

99

6,0 0,04 0,29 2,27 5,05 6,29 7,33 8,27 8,36

100

6,5 0,04 0,28 1,59 4,40 5,72 5,61 6,93 6,21

101

Sin 4,5 0,02 0,18 1,50 2,13 1,91 2,37 1,99 0,23

102

muestra, caldo solo de xilosa 5,0 0,04 0,13 1,62 2,72 2,76 2,36 2,45 1,45

103

5,5 0,04 0,12 0,99 2,31 1,62 1,52 1,41 0,06

104

6,0 0,04 0,09 0,87 1,77 1,90 2,03 1,66 0,09

105

6,5 0,04 0,13 1,17 2,54 2,66 2,69 2,08 0,89

Tal y como indican los datos de la Tabla 1, el rendimiento de etanol generalmente aumento al aumentar la dosis de radiacion, hasta 90 MRad, despues de la cual el rendimiento se estabilizo a dosis crecientes. Para una dosis de radiacion y un pH determinados, el rendimiento fue, en general significativamente mas alto cuando la hierba tambien 5 se habfa sometido a trituracion tras congelacion previa. Para la hierba que no habfa sido irradiada, o que habfa recibido solo una dosis baja de radiacion, los rendimientos fueron notablemente superiores si la hierba habfa sido sometida a trituracion tras congelacion previa.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   I. Metodo de procesamiento de una biomasa lignocelulosica que comprende:

   5 procesamiento de un material fragilizado mediante una enzima y/o un microorganismo para hacer un producto que es qufmicamente diferente del material fragilizado, material fragilizado que se ha producido mediante tratamiento de un material de biomasa lignocelulosica para fragilizar el material de biomasa, donde el tratamiento comprende la irradiacion del material de biomasa con radiacion de haz de electrones, donde el tratamiento comprende ademas el enfriamiento del material de biomasa a una temperatura de 273 K o menos,

   10 donde el enfriamiento se lleva a cabo antes de la irradiacion, y

   donde el procesamiento del material comprende la puesta en contacto del material con una enzima y/o un microorganismo, o el material comprende celulosa y el metodo comprende la utilizacion de una enzima para sacarificar la celulosa.

   15 2. Metodo de la reivindicacion 1, donde la produccion del material fragilizado comprende ademas la

   trituracion o conminucion del material de partida.
2. 3. Metodo de la reivindicacion 2, donde la trituracion o conminucion se lleva a cabo antes de que el material de partida se haya fragilizado.

   20
3. 4. Metodo de la reivindicacion 2, donde el enfriamiento y la trituracion o conminucion se llevan a cabo simultaneamente en un dispositivo de trituracion tras congelacion previa o molienda tras congelacion previa.
4. 5. Metodo de la reivindicacion 1, donde el producto comprende un alcohol.

   25
5. 6. Metodo de la reivindicacion 5, donde el producto comprende etanol o butanol.
6. 7. Metodo de la reivindicacion 1, donde el metodo comprende ademas la separacion de la lignina de la celulosa.

   30
7. 8. Metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el material de biomasa tiene mas de un componente y una interfaz entre los componentes, y el tratamiento comprende el enfriamiento del material de partida a una temperatura a la cual los componentes se separan en la interfaz.

   35 9. Metodo de la reivindicacion 8, donde la temperatura es menor o igual al punto de fragilidad del

   material.
8. 10. Metodo de la reivindicacion 8, donde los componentes tienen coeficientes de expansion termica

   diferentes.

   40

   II. Metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la dosis de radiacion es de 10 Mrad a 100 Mrad, o 30 Mrad a 90 Mrad.