CN104487585A - 基于木质纤维原料产糖发酵生产微生物油脂的高新技术 - Google Patents

Abstract

提供了帮助从木质纤维原料中糖释放和利用这些糖来生产微生物油脂(例如，生物燃料)的方法。这些方法包含了利用多种氧化剂(臭氧，超氧水，等)在不超过50℃的温度和不超过1.5大气压的压强下对木质纤维原料预处理，使原材料更容易进行酶水解降解成糖和通过产油微生物利用这些可溶性糖发酵生产微生物油脂。

Description

基于木质纤维原料产糖发酵生产微生物油脂的高新技术

技术领域

这项发明是关于一个高效地从木质纤维原料中释放糖类，并且利用这些糖为原料发酵生产生物能源和生物化学品，例如微生物油脂的方法。这项发明的特别之处在于不仅提供了木质纤维原料预处理，在高固含量下用不同酶水解预处理后的生物质，利用含有从纤维原料中释放出的糖的酶解液来发酵产油酵母生产微生物油脂，即木质纤维原料分步水解发酵法，而且包含了用同步糖化发酵(即预处理后的纤维原料酶解和产油微生物发酵同时进行)生产微生物油脂的方法。

背景技术

木质纤维原料，例如农业和林业中的残留物是具有吸引力的生产生物能源和生物化学产品原料。因为它们量大，价格低(Cardona&Sánchez，2007)并且对环境的可持续发展有好处(2003)。木质纤维原料是由纤维素，半纤维素和木质素组成的复杂性网络结构，并且它们在其中所占比例随着种，属，甚至原产地的不同而改变(Carere et al.，2008；Chandra et al.，2007)。因为这些复杂的聚合物的难以处理的天然属性，需要用强热化学处理(例如，预处理)来使原料易于被商业纤维酶或者微生物产生的酶水解，来释放其中的糖进行后续发酵。

不同的木质纤维原料对纤维素酶有不同程度的抵抗能力。如木质素含量，纤维素结晶度，排列结构以及半纤维素分支等因素影响整体原料的糖化能力。预处理可以通过木质素脱除(Jeoh et al.，2007)和纤维素结晶度降低(Mosieret al.，2005)来达到促进植物原料降解的目的。然而，预处理阶段是在植物原料转变成生物能源或生物化学品过程中比较昂贵的阶段之一。可以接受的预处理方法应该满足高糖得率、低酶用量、低成本和最小碳水化合物降解量。与此同时，预处理过程不能产生高浓度的对后续糖化和发酵产生抑制作用的抑制物(Lynd et al.，1999；Tao et al.，2011)。许多的预处理方法，例如稀酸，蒸汽爆破，热水，氨爆破，碱水解，氧化脱木质素，有机溶剂法，生物预处理法臭氧化已经被探索和用来改变植物原料物理化学性质，从而降低其耐降解性。

之前有大量报道讨论关于臭氧对木质纤维原料进行预处理。之后的专利和参考文献描述了这个过程：U.S.Pat.No.20100159521A1(Cirakovic&Diner，2010b)；U.S.Pat.No.20100159522A1(Cirakovic&Diner，2010a)；E.P.Pat No.0,045,500(Ishibashi et al.，1985)；(Garcia-Cubero et al.，2009；García-Cubero et al.，2012)。所有的这些专利和出版物都在这一发明中整体引用。

利用无水的液氨或者是氢氧化铵溶液来对木质纤维原料预处理已经很好的实践了。之后的专利和参考文献描述了这个过程：：U.S.Pat.No.20120325202(Dale，2012)；U.S.Pat.No.7915017B2(Dale，2011)；U.S.Pat.No.20090221042A1(Dale et al.，2009)；U.S.Pat.No.00610688A(Dale&Weaver，2000)；(Kim&Lee，2005，2007；Kim et al.，2008；Yoo et al.，2013)。所有的这些专利和出版物也整体整合在本发明中。

以上所提到的预处理方法有些缺陷，包括分离五碳糖和六碳糖流(例如浓酸和稀酸法)，糖的降解(例如，酸或醛会导致较差的碳水化合物回收和对接下来下游过程，如糖化和发酵，有抑制作用)，长的预处理时间(例如，生物预处理)，不完全破坏木质素-碳水化合物网(例如，蒸汽预处理)和在中和酸或碱过程中废弃产品的处置。组合预处理策略通常可以更高效地促进植物原料的降解，并且经常应用于设计先进的预处理技术。一种用结合在较高的温度下(75-150℃)，低浓度无水氨碱性处理之后，用臭氧氧化或者反过这两者顺序的方法已经被证明了可以提高酶解糖化得率(Cirakovic&Diner，2010b)。然而，在之前的文章中每个步骤的具体作用没有明确的阐释。一种用氢氧化铵在室温下处理棉秸秆60天，之后用臭氧处理的预处理方法可以获得其中50％木质素的降解(Ben-Ghedalia et al.，1980)。这种用羟基自由基(臭氧/双氧水，超氧水)先进的氧化过程的反应速率比单纯的臭氧处理反应速率要高，因为它们与有机和无机化合物反应速度快，并且克服了扩散效应的影响(Nothe et al.，2009)。

植物原料预处理后，一般分步或同步用纤维素酶进行酶解产糖。对于工业生产生物能源过程来说，经过糖化步骤后，高糖浓度更利于实现连续的或间歇的发酵过程。之后，在乙醇发酵过程中，同步糖化发酵技术被广泛应用来取代分步糖化发酵技术(Elliston et al.，2013；Lim et al.，2013；Lin et al.，2013；Suriyachai et al.，2013)，但是还未广泛用于利用产油微生物生产微生物油脂。产油微生物，例如酵母和真菌可以利用从木质纤维原料中生产的五碳糖和六碳糖(Gao et al.，2013；Huang et al.，2009；Tsigie et al.，2011；Yu et al.，2011；Zenget al.，2013)，使整个过程更有效率，同时也需要开发一套预处理糖化过程可以生产单一的糖流(包含五碳糖和六碳糖)，并且测试这些从木质纤维原料得到的糖来生产生物能源或生物产品的应用能力。产油微生物有积累油脂的达到细胞干重的70％的能力(Chen et al.，2009)。然而，其需要异样培养是需要有机碳源的。大量的报告指出，利用产油酵母作用于不同的底物来积累油脂，比如甘油(Duarte et al.，2013；Kitcha&Cheirsilp，2013；Meesters et al.，1996；Papanikolaou&Aggelis，2002)，下水道污泥(Angerbauer et al.，2008；Huang etal.，2013a；Peng et al.，2013)，whey permeate(Akhtar et al.，1998；Ykema et al.，1988)，甘蔗糖浆(Alvarez et al.，1992；Gonzalez-Garcia et al.，2013；Schneider etal.，2013)，稻杆水解物(Huang et al.，2009)。用木质纤维原料避免了“用于能源还是作为粮食的矛盾”的问题。微生物油脂中的脂肪酸与传统植物油脂中的相类似，产油酵母已经被证实是可以满足生物柴油工厂生产的可行的微生物(Zhao et al.，2010)。

发明内容

因此，本发明的目标是提供一个可以对木质纤维原料进行预处理，糖化，并且用这些可溶性糖/植物原料进行发酵获得生物燃料或生物产品的过程。这个过程有两个步骤，第一步骤，主要是破坏纤维素表面木质素阻碍，从而使疏水作用降低。第二步骤是允许植物次生壁细胞中的木质素脱除，并且使纤维结构溶胀，从而利于纤维素酶水解纤维素产糖。此外，这项发明的目标是预处理过程中木质素改性或是分解，通过在第一步中用强反应试剂来提高第二步反应的效率。另外，这项发明的目的是开发一种可以用高的预处理木质纤维原料底物浓度来生产可溶性糖的酶解过程。还有，这项发明的目的是用预处理的植物原料直接地应用于同步糖化发酵过程，去生产微生物油脂或是用从分步酶水解先得到的可溶性糖，再通过产油微生物(任何种类的真菌、细菌、酵母和水藻)来生产微生物油脂。这些或其他的目的将会通过参考后面描述和图画的逐渐阐述。

本发明提供了促进木质纤维原料水解来生产可溶性糖和应用其中木质素的预处理方法。糖和木质素产品可以用来生产生物燃料或生物化学品。这些方法可以用于经过机械磨碎含有不同水分的木质纤维原料。这些原料可以被氧化剂选择性地进行表面木质素改性，然后用液态氨进行纤维素溶胀和结晶度降低。经过处理后，预处理后的原料主要是碳水化合物，并且更容易进行酶解产糖。预处理之后，高碳水化合物含量的原料被纤维素酶水解来产生单一可溶可发酵糖流包括五碳糖(木糖和阿拉伯糖)和六碳糖(葡萄糖和半乳糖)。这个糖流中包含极少量的预处理产生的抑制物，如有机酸、呋喃、羧甲基糠醛等。得到的可发酵糖可以用于生物化学品或生物产品的生产。

在方案中，预处理木质纤维原料的过程包含：

(a)提供含有纤维素，半纤维素和木质素的木质纤维原料；

(b)研磨木质纤维原料，比如到达20-60目；

(c)用水调整植物原料的湿度从0到90％；

(d)用含有臭氧的气流在半连续模式不锈钢容器中处理原料，其中臭氧浓度在1-20％(质量比)之间，温度在0到25℃，反应时间1到20分钟。原料中的木质素被改性到一定的程度。

(e)之后，原料用液氨浸泡，氨水的浓度不要超过30％(质量体积比)，并且原料固含量在1-20％(质量体积比)之间，在15-50℃温度范围，反应1-24小时。反应之后，包含木质素和液氨的液相用过滤或离心法分离，并且剩余的固体被清洗或中和，例如加入酸，如硫酸或者盐酸。预处理过程扩大了纤维素微束的结构，并且降低了纤维素的结晶度，使原料容易水解成单糖。

在另一个方案中，预处理木质纤维原料的过程包含：

(a)提供含有纤维素，半纤维素和木质素的木质纤维原料；

(b)研磨木质纤维原料，比如到达20-60目；

(c)形成或提供3-30％(质量体积比)的双氧水水溶液；

(d)用双氧水调整植物原料的湿度从0到90％；

(e)用含臭氧的气流在半连续模式不锈钢容器中处理原料，其中臭氧浓度在1-20％(质量比)之间，温度0到25℃，反应时间1到20分钟。原料中的木质素被改性到一定的程度。

(f)之后，原料用液氨浸泡，氨水的浓度不要超过30％(质量体积比)，并且原料固含量在1-20％(质量体积比)之间，在15-50℃下，反应1-24小时。反应之后，包含木质素和液氨的液相用过滤或离心法分离，并且剩余的固体被清洗或中和，例如加入酸，如硫酸或者盐酸。预处理过程扩大了纤维素微束的结构，并且降低了纤维素的结晶度，使原料容易水解成单糖。

在一些方案中，预处理木质纤维原料的过程包含：

经过上述(a)和(b)过程之后，用水或用3-30％(w/v)的双氧水水溶液调整原料的湿度0％-90％(质量体积比)。

湿度调节之后，原料用液氨浸泡，氨水的浓度不要超过30％(质量体积比)，并且原料固含量在1-20％(质量体积比)之间，温度在15-50℃，反应1-24小时。反应之后，包含木质素和液氨的液相用过滤或离心法分离，并且剩余的固体被清洗或中和，例如加入酸，如硫酸或者盐酸。预处理过程扩大了纤维素微束的结构，并且降低了纤维素的结晶度，使原料容易水解成单糖。

(f)之后的步骤用液氨按照上述叙述浸泡，来生产可以糖化的原料。

在另一个方案中，预处理木质纤维原料的过程包含：

经过上述(a)和(b)过程之后，用水或用3-30％(w/v)的双氧水水溶液调整原料的湿度0％-90％(质量体积比)。

用含臭氧的气流在一系列或单个不锈钢容器反应釜中以半连续模式处理经过湿度调节的原料，其中臭氧浓度在1-20％(质量比)之间，温度在0到25℃之间，反应时间2到20分钟。原料中的木质素被改性到一定的程度。未反应的臭氧或产生的其他气体被回收用来生产纯的空气和氧气。

之后的步骤是用液氨按照上述叙述浸泡，来生产可以糖化的原料。

在另一个方案中，用来回收(e)步骤中氨废液中的木质素和氨的过程包含：

收集木质素-液氨(温度30-50℃)溶液到储存罐中；

在50-80℃下，将木质素-液氨溶液中的氨蒸发；

用氢氧化铵的形式将氨回收，并且继续用于液氨浸泡处理；

从剩余溶液中回收的不含氨的木质素，通过蒸发，酸沉淀或者膜过滤来获得；

纯化分离出的木质素的过程包含：1.醋酸溶解，2.过量水沉淀，3.离心，4.用二氯甲烷溶解，5.用乙醚沉淀，6.干燥得到最终纯的木质素。

在另一个方案中，这项发明的方法进一步地与用酶水解预处理原料来生产可酵解糖结合。水解过程包含用缓冲液将原料配成5-20％的固含量的溶液，然后用酶水解原料(例如，用混合微生物)来生产浓缩的糖流。

在这一部分中，包含用可溶性糖进行发酵的过程。可溶性糖通过这里的描述方法可以得到。通过酶解反应后得到的水解液可以被用来生产微生物油脂，乙醇，丁醇，异丁醇或者其它的生物化学品和生物产品。

在这个部分，包含直接用预处理后的原料进行同步酵解发酵的过程。预处理后的原料可以被用来在25-40℃下，进行同步酵解发酵来生产生物燃料和生物产品。

这项发明的其他的特点和优点将会在之后的发明的描述中阐述，并且部分可以从描述中明显获得或者从现实实践中获得。这项发明从此文叙述和声名中特别指出组成和方法。

附图说明

为了详细的了解和阐述这项发明，用之后的容易理解的描述和配图来做参照：

图1.是两步法“臭氧-液氨浸泡”预处理过程100的流程图。

图2.是两步法“臭氧-液氨浸泡”预处理过程中在一系列反应器中臭氧氧化过程102的流程图。

图3.是两步法“臭氧-液氨浸泡”预处理过程中，通过废气处理器来报废不需要的气体和残留的臭氧来净化气体流，降低空气/气体成本过程103。

图4.是氨和木质素回收过程104的流程图。

图5.是用分步水解过程200和产油微生物发酵产生物油脂过程300的流程图。

图6.是用产油微生物进行同步糖化发酵产生物油脂过程400的流程图。

图7.代表不同种类的产油酵母产微生物油脂。

图8.展示了稻草杆粒径和臭氧-氨浸泡预处理的同步糖化发酵物料衡算数据。

细节描述

木质纤维原料的主要成分碳水化合物或者多糖(纤维素和半纤维素)有提供为生产成本低廉、可再生，经过发酵或非生物学转化产生生物燃料(包括生物乙醇，生物丁醇，微生物油脂和生物甲烷等)或生物化学品的糖源的可能性。然而，木质纤维原料难于降解，需要用有效的预处理过程使多糖更容易被水解。本发明的系统提供了两步原料预处理方法。开始，疏水的木质素分子被高效氧化剂(如臭氧、超氧水)进攻，然后部分处理过的原料进一步地在相对低温，低压强的条件下，用液氨浸泡处理。这里公开包括减少预处理试剂(臭氧，双氧水和氨)用量或将其回收的方法。这些方法的优点部分体现在预处理时，较低的温度和压力需求。

这项发明的基本的预处理过程100已经在流程图(图1)中展示。木质纤维原料用锤式粉碎机E-01研磨，然后通过P-02传到湿度调整反应器E-04。用蒸汽发生器E-03进行湿度调整。经过湿度调整的原料被送到预处理段101。在一些方案中，双氧水和水加入到E-02罐。(从E-05储藏罐)中提供的纯的氧气、氧气-空气混合气体或者纯的空气的气体流通过气体输送装置P-07被输送到压缩系统E-06。压缩气体流(P-08)被输送到臭氧发生器E-07。富含臭氧的气体由管道P-09输送到已经装填好调整好湿度原料的预处理反应器E-08。预处理反应后，多余的气体混合物通过连接器P-10经E-09排出。预处理后的原料输通过管道P-11送到氨浸泡预处理反应器E-10。预处理中需要的液氨溶液可以由储藏池E-11经过管道和泵系统(P-12，P-13and E-12)提供新鲜的液氨，或是从回收过程104(图4)经过相同的系统提供回收氨。处理过后的原料稀浆由管道P-14被注入到分离罐E-13中，分离后的原料可以用E-15罐中的新鲜的水洗涤，或者用E-15储存槽中的酸中和残余氨。分理出的溶液经过分离釜E-13输送到E-14(图4)。从反应器E-13中输出的更多反应的原料之后被送往过程200去生产可以酵解的糖在过程300生产生物燃料或生物产品，或者原料直接送到过程400进行产品生产。

图2.阐释了101段为了更高效的在一系列的反应器(E-08A或E-08B a或E-08C)中应用臭氧，降低它的成本的改变。在102段改变包括富含臭氧的气体输送穿过E-08A罐，并且它的废气通过管阀系统(P-18，P-19和V-1)连接/不连接到E-08B罐，相似的通过管阀系统(P-20，P-21和V-2)连接/不连接到E-08C罐。

图3.解释了对101和102段改变通过引用气体清洁系统E-16来减少通入气体成本。气体净化系统可能包含一个洗涤器和/或热降解和/或催化降解器，这些在之前的参考文献中阐述：：U.S.Pat.No.6315861B1(Joseph etal.，2001)；E.P.Pat.No.0526383(Joseph et al.，1993)，之后连接包含冷却单元和/或干燥气体状态单元E-17。气体清洁系统已经商业化，并且通过阅读指南很容易理解使用。

图4显示了下一个用来处理从过程100中得到的溶液方法的过程104。最初，利用泵E-18和管道P-25和P-26，溶液被泵供给到可在市场中买到的滴流床容器E-19。然后，蒸汽从底部通过容器E-19来从溶液中用逆流法汽提大部分的氨。在说明书中，知道如何操作的氨汽提系统需要一定的技能。含氨蒸气再经氢氧化钠接触(从容器E-22提供)在接触容器E-21中再次被转化为氢氧化铵。回收氨然后被存储在容器E-11用来做下一步液氨浸泡预处理。下游出来的管流中含有水，木质素，硅，抽出物等，经过热交换器E-23来进行热回收，冷却流被供给到分离容器E-24。在筛选或膜分离之后，大分子量的木质素被回收并存储到容器E-25。从分离容器E-24产生的流供给到吸附柱吸附低分子量的木质素，并把它存储在容器E-28。来自塔的废物流进一步接收到储罐E-27。

图5和6显示下一步处理过的木质纤维素生物质的酶解过程200，油脂发酵过程300和同步糖化发酵过程400。下一步的处理，包括经过101和/或102和/或103过程得到的预处理后的木质纤维素材料与一种或多种水解酶反应的过程200。潜在的，处理是在含有木质纤维原料，糖化酶，柠檬酸或醋酸缓冲液中的一种和水的液态介质中进行。在糖化过程中的固含量，例如约0.1％(w/v)到20％(W/V)合适的葡聚糖可以加入到液态溶解介质。在说明书中，一项技能是了解关于木质纤维原料的葡聚糖含量。可溶性糖的流(例如，葡萄糖，木糖，阿拉伯糖，甘露糖等)可以在过程200的后期获得。这个流然后被进一步用于发酵过程300，在本发明中用产油酵母作为示范，并不仅限于它们，而一系列的利用糖的微生物可用于各种过程，如生产生物乙醇，丁醇，有机酸，抗生素等。在另一个过程400中，预处理的生物质是被直接用在同步糖化发酵过程。

定义

“木质纤维原料”是指主要包括木质素，纤维素和半纤维素的材料。“木质纤维素生物质”是指植物材料含有木质素，纤维素和半纤维素，包括但不限于，小麦秸秆，麦秸，稻草，玉米秸秆，甘蔗，甘蔗渣，草(例如柳枝稷)，麻，玉米，高粱，甘蔗，竹，树木和木材(如棕榈油，桉树，杨树，柳，奇岗，等)，废报纸，报纸，果壳，牛粪，都市固体废弃物，等。木质纤维素生物质大致可分为原始植物原料，废弃植物原料和能源作物。原始生物质包括所有自然生长的陆生植物，如树木，灌木和草。废弃生物质是各产业部门生产的低价值的副产品如农业(如玉米秸秆，甘蔗渣，秸秆等)，林业(锯木厂和造纸厂的废物)。能源作物是以产量高的木质纤维素生物质作物作为第二代生物燃料的生产原料；例如柳枝稷和大象草。

“碳水化合物”指的是长链的糖分子或在木质纤维素生物质中发现的多糖，包括纤维素、半纤维素。

“糖”是指从木质纤维素生物质水解得到的糖。这些糖包括，葡萄糖，木糖，甘露糖，阿拉伯糖，半乳糖。

“预处理”指的是一种在酶解前用于处理木质纤维素生物质的过程。本文所包含的方法包括为了使植物原料更易于水解，如酶水解，的预处理方法。用来预处理的试剂包括一个或多个：一个或一个以上的高活性氧化剂和一种或多种碱化剂。预处理方法的步骤一般是在降低(低)温度和/或降低(低)压条件下运行。在某些方面，只采用降低温度。在其他方面，只采用减少压力。在另一实施例中，低的温度和低的压力都被采用。我们指的“低温”是温度在30℃左右，最低可达4℃。因此，温度使用范围从大约4到30度。用“低压力”，我们的意思是，预处理反应进行的压力可达1.5个大气压。在下降低温度和/或压力的条件下进行这些反应的优点包括，例如：低维护成本，运营和资本成本。

适当的纤维原料的粒径按照一些实施例中的描述，植物原料被引入一个反应釜或容器进行反应。容器必须能够耐受描述所需的温度和压力，可以进一步包括混合或搅拌，监测温度和压力的各种仪表，为了引进和去除(如吸走)反应物的各种进口和出口阀，等。罐的制作材料还应当暴露在这里使用的试剂时，不易被腐蚀，如不锈钢。

生物质，然后接触(暴露)于至少一种氧化剂。示例性的氧化剂，可用于本发明的包括但不限于：臭氧，超氧水(臭氧加过氧化氢)；单独的过氧化氢酶，酶，如漆酶，过氧化物酶等，以及它们的组合。结合”是指生物原料可能在相同的时间里会接触到两种或两种以上的氧化剂(例如，在一个单一的混合物，含有生物原料和两种或两种以上的试剂)或按顺序，比如生物原料可能接触到第一个氧化剂，然后接触到另一个不同的氧化剂。在某些方面，如果是按步骤地接触，洗涤或漂洗原料的步骤在接触一个(例如第一)氧化剂后和在接触到另一个(第二个)之前可以进行，或不包括在接触间干燥原料的步骤。示范性的氧化和碱化剂的特点，以及它们的组合，描述如下。

“臭氧化”是用臭氧处理的木质纤维素生物质的行为。木质纤维素类生物质可在水悬浮液中或在固体干燥相。在本发明的某些方面，木质纤维素生物质最初与含有臭氧的气体接触。臭氧氧化木质纤维素聚合物，导致聚合物的脱木素和碎裂，从而减少木质纤维素材料的疏水性，缩短氨水浸泡所需的时间和提高用于产糖的糖化酶对原料中纤维素的接触性。

“包括臭氧的气体”指的是一种气体，包含至少是约80％至约99％的其它气体，通常是约1至约20％的臭氧。气体的其他成分可能是任何可以作为一个臭氧的载体，包括但不限于“空气”，例如压缩空气；氮；氧；二氧化碳，一氧化碳，氢，氦及其混合物等。这种气体混合物可以被称为“富含臭氧的气体”。

富含臭氧的气体通常作为气体流传递到生物质中的速率从约0.1升/分钟到约10升/分钟或更高的传递率，一般是在范围从约0.5到约5升/分钟，如0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，或5升/分钟。气体可能被吹到或越过生物物质的表面，最好伴有原料的搅拌或以某种方式将气体混合其中；或气体可通入或通过原料；或气体可以引入存有原料的容器(如密闭容器)，用旋转，振动，或一些其他形式的搅拌的方法将气体和容器中的原料混合；或原料和气体通过一个共同的通道或管道同时对流，等。考虑到互相的影响，充分的气体和原料的运动可以提供臭氧和木质纤维素材料之间的接触，通过用原料接触和/或扩散(注，渗透，浸渍)中的方式，允许气体以某种方式氧化原料。

臭氧可能来自任何合适的来源。例如，制备臭氧的方法如：科罗娜放电的法，经紫外线(UV)的臭氧发生器，通过真空紫外线(VUV)臭氧发生器，通过冷等离子体的方法，通过电解产生臭氧(EOG)，等。在一些实施例中，臭氧是用一个或两个例如L11-L24臭氧发生器(由美国加利福尼亚太平洋臭氧制作)用空气和氧气生产臭氧。

臭氧处理的时间长度是从2分钟到2小时，通常是从2分钟到60分钟左右，例如2，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55或60分钟或更长的时间，例如65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，或120分钟。臭氧处理通常是在压力为约1至约1.5的大气压下或1，2，3，4，5或6psig。

在一个方面中，本发明采用结合过氧化氢和臭氧(超氧水)产生的羟基自由基方法处理木质纤维素原料。在这方面采用通过H₂O₂产生高活性的羟基自由基基于芬顿原理用于使木质素碎片化。羟基自由基与芳香木质素化合物反应并使之降解，造成脱甲氧基化，β-O-4醚键的裂解，羟基化和Ca键的氧化。

根据这一方面，大小合适的原料与过氧化氢溶液(通常为水溶液)接触或混合，并随后接触如上叙述的臭氧。加入反应的过氧化氢浓度(用过氧化氢和臭氧的摩尔比表示)范围一般从约为0.25∶1摩尔比到约为3∶1的摩尔比，例如约为0.25∶1，0.5∶1，0.75∶1，1∶1，1.25∶1，1.5∶1，1.75∶1，2∶1，2.25∶1，2.5∶1，2.75∶1，或3∶1。这一浓度的加入量一般在100(10^-6到约1000(10^-6(例如100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950或1000(10^-6)升/每克原料。提供最终的过氧化氢/原料的质量/质量比为约0.03到0.3(例如0.03，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25或0.3)。

原料与过氧化氢(水溶液)的混合物被放置在一个容器里，并暴露于臭氧如上所述，在低温、低压条件中的一个或两个条件下进行。暴露于臭氧的时间长度通常是从2分钟到20分钟左右(例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20分钟)和从2分钟到2小时(例如10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110或120分钟)。臭氧处理通常是在压力为约1至约1.5的大气压下或1，2，3，4，5或6psig。

“结合预处理”，根据本发明的另一方面，臭氧或超氧水过程中用一种快速的氧化剂，进行初始或初步的木质素脱除，以提高效率和减少氨与原料预处理所需要的时间。氨可以是液体或气体。臭氧或超氧水最初改变木质素的结构(Bule et al.，2013)，并且随后暴露于氨造成进一步的变化(Gao et al.，2012)，同时，降低纤维素原料中的结晶度使它容易糖化成碳水化合物。如果用液体(如含水)氨，原料中的纤维也会有利地发生溶胀。

初始的臭氧或超氧水处理通常是在(如上述的臭氧或超氧水预处理)一个周期，时间范围从2分钟到60分钟，通常从2分钟到2小时中进行。这一步反应的条件是低温度和/或压力，如上。此后，经过处理的材料暴露于气态氨，或浸泡在液态氨，例如氢氧化铵溶液。

如果使用气态氨，处理方法如下：经臭氧氧化或超氧水处理后的生物质装在一个圆柱形反应器中，然后气态氨在要求的时间内通过填充柱。

如果用氨溶液，一般是水和溶液，氨的浓度一般是从约5％至约30％(例如5，10，15，20，25，或30％)。原料与含水氨的比，例如，从约5％至约25％质量/质量(如5，10，15，20，或25％)。

在含水氨中浸泡(暴露，接触，等)的步骤通常在一段时间范围从30分钟到24小时内进行，通常从30分钟到几天。这一步也是在较低的温度和/或压力条件下进行，如在温度范围从约20℃至约70℃(例如20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，或70℃)，最好是从约30℃到约60℃。一般，最高温度约60℃被应用于本发明。

“水解”或“纤维素分解“酶指的是一系列的酶通常会包含一种或多种纤维素酶，木聚糖酶，或用来消化木质纤维素生物质的酶。适当的酶可能包括，例如，(1)一种或一种以上的纤维素酶，(2)一种或更多的半纤维素酶，(3)一种或更多的木质素酶。纤维素酶包括纤维素内切酶(内切葡聚糖酶)，纤维素外切酶(外切葡聚糖酶)，和/或(-葡萄糖苷酶(纤维二糖酶)等。半纤维素酶包括(-木糖苷酶，α-阿拉伯呋喃糖苷酶，木葡聚糖酶，乙酰木聚糖酯酶，α-葡萄糖醛酸苷酶，木聚糖酶，等。“木质素酶”包括木质素过氧化物酶，漆酶和锰过氧化物酶，等。

“水解液”指的是一个含有水解酶，预处理的木质纤维素生物质和酶作用在生物质而得到的糖的溶液。

“酶用量”是用来消化木质纤维素生物质的酶量，并考虑使用滤纸单元(FPU)或纤维二糖单元(CBU)或酶溶液的克重。

“毒物”或“抑制剂”是抑制微生物生长的有机酸和呋喃化合物，如乙酸和5-羟甲基糠醛，糠醛，等。

“糖化”指的是用酶水解多糖生产糖。

“产油微生物”或“产油的”，指的是任何微生物(细菌，酵母，真菌和藻类)，可利用糖发酵生产油脂。证明可以产油的酵母菌株包括：弯曲隐球菌，胶红类酵母菌，红冬孢酵母菌，斯达油脂酵母，解脂耶氏酵母，发酵丝孢酵母，等。可以举出的一些潜在的脂质生产真菌菌株，如稻根霉菌，费希新萨托菌，球毛壳，黑曲霉，深黄被孢霉，雅致小克银汉霉，卷枝毛霉菌，土曲霉，密丛毛霉和疏绵状嗜热丝孢菌，等。可用于实践本发明的细菌的例子包括但不限于物种，如分枝杆菌，棒状杆菌，诺卡氏菌，分节孢子杆菌等。藻类可用于实践本发明包括但不限于：小球藻，盐藻等。

“发酵”是指用酶水解产生的糖利用产油微生物生产目标产品的过程。

“废物”是在预处理工艺中无用的化学物质。废弃化学品包括酸如硫酸或盐酸，以及碱，如氢氧化钠。

“碱性处理”是是用碱性的或高pH的化学品的混合物对木质纤维素生物质进行预处理。

“室温”或“环境温度”，是指在约15℃至约30℃之间的任何温度。

“同步糖化发酵(SSF)”是指在这一过程中，糖化发酵步骤发生在同一个单元的操作。在这一过程中，预处理后的木质纤维素生物质混合糖化酶和产油微生物进行同步糖化发酵(SSF)。酶破坏复杂的二糖或寡糖或多糖(如纤维二糖，木聚糖，葡三聚糖，纤维素，半纤维素，等)释放供微生物生长和生产生物燃料或生物制品时可使用的单糖(如葡萄糖，木糖，甘露糖，阿拉伯糖，半乳糖)。固含量和纤维素酶的用量可随特定条件的变化而适当变化，例如微生物类型，原料类型，等。

SSF经常应用到乙醇的生产中。由于减少酶解过程中形成的纤维二糖和葡萄糖对酶解的抑制作用，SSF可以产生更高的产品产率和需要较少量的酶(Elliston et al.，2013；Emert&Katzen，1980；Emert et al.，1980；Gauss et al.，1976；Gutierrez et al.，2013；Hoyer et al.，2013；Huang et al.，2013b；Spindler et al.，1989；Spindler et al.，1987；Takagi et al.，1977；Wright et al.，1987)。SSF和半纤维素糖发酵相结合，因为较低的成本，已引起人们的重视(Dien et al.，2000；Golias etal.，2002)，并且，这样的组合可以在本发明中应用。

“物理化学因素”指的是预处理时物理和化学参数，包括但不限于温度，木质纤维素生物质颗粒大小，化学试剂的使用和浓度，和停留时间。

“停留时间”是指，木质纤维生物质在预处理反应器中的时间。

“固含量”是指在预处理反应器中固体和液体的比例。

“氨水”或“含有氨的水溶液”指的是氨气(NH3)使用或铵离子(NH4+)在水中形成氢氧化铵。

用于木质纤维素或木质素时“碎片化”，是指在木质素和木质素，以及木质素和碳水化合物分子间的结构键的断裂。

“粒径”指的是木质纤维素生物质用于预处理时的颗粒大小。

“网格”指的是泰勒筛规模，它通过穿过铁丝网的能力定义了粒径的大小。

对于原料用“处理”或“预处理”指的是对原料进行预处理。

“含水量”指的是包含在木质纤维素生物质中或添加到木质纤维素生物质中的水的比例。

“固体残留物”是指经过预处理后，不是溶液形式的固体生物质。

“失活”当指酶通过加热或化学方法变性，不再具有其催化功能。

“微生物油脂”或“脂类”或“单细胞油”是指使用本发明的方法，用生物法合成并储存在产油微生物，如细菌，真菌，藻类和酵母菌，中的脂质。这样的脂类包括但不限于以下的一种或多种脂肪酸：肉豆蔻酸，棕榈油酸，硬脂酸，油酸，亚油酸，亚麻酸，花生四烯酸，等。特定的脂质包括但不限于：十七碳烯酸，二十二烷酸，二十四烷酸，十五烷酸，十六碳烯酸，γ-亚麻酸和二十碳烯酸，等。

使用此处描述的方法得到的微生物油脂可以用于任何合适的目的，如精细化工原料。一方面，它们被用来生产生物燃料，特别是“添加的”生物燃料。“生物燃料”指的是一种由生物材料制作的燃料。典型的生物燃料可以按照此处的描述使用脂质生成，包括但不限于可再生汽油和柴油，喷气燃料和生物柴油。在这个专利中，需要一定的熟悉提取和处理脂类方法的技能。提取后，油按照描述可用于生产生物燃料(例如沼气，生物柴油，乙醇等醇类，等)，说明如下的例子：US patents(Day et al.，2013；Franklin et al.，2011；Oyler，2011)，其内容完整特此纳入参考。

“添加”的燃料是燃料的一种，使用前生物燃料通常不需要适应常规的基于石油的发动机燃油系统或燃料配送网络。添加燃料可以“用来”和/或以任何量与其他的添加燃料，添加的共混物，和/或常规燃料混合。

除非另有规定，在本发明中所有的技术和科学术语与普遍的用语一致。虽然任何方法和材料相似或等价的描述也可用于实施本发明或在本发明中测试，现在介绍代表性的典型方法和材料。

在本规范中引用的所有的出版物和专利已经具体化引用做参考，如果每个出版物或专利是具体和个别地引用和被纳入参照和描述的方法和/或材料与引用的有关的出版物一致。任何出版的引文在其批准的申请日之前，不应视为承认本发明不得早于之前早发表出来的发明等出版物。此外，如果出版日期设置可能不同于实际出版日期，可能需要被独立的证实。

值得注意的是，这里所使用和附加要求阐述的，单数形式“a”，“an”和“the”，包括多个参照物，除非上下文中另有明确规定。它进一步指出，要求可能被起草排除任何可选的元素。因此，这一说法为专有名词前置基础服务，如“完全””“只有”，等和与要求内容复述相联系，或使用“否定”限制。

将阅读这个文件在本领域的技术人员，每个描述的实施案例和示出的具有离散的组件和功能，可以很容易地分离或结合其他的几个实施例的特征不背离本发明实施例的范围或精神。任何的列举方法可以在逻辑允许的情况下，以任何的顺序将列举的事件应用。

在本发明的示例性实施例中有更详细的描述，本发明并不限于特定的实施例中，如可能，当然，变化，是可以理解的。这也可以理解，所使用的术语在这里是描述具体的实施例，唯一的目的，并不是要限制，由于本发明的范围将仅由附加要求限制。

实施例

实验工作的目标按照下面描述是酶糖化之前，为了最大限度地提高单体糖的生产和减少这种糖的损失，开发高效的，具有最小毒性的(或最少抑制物)，加工木质纤维素生物质(如小麦秸秆，草坪草)的经济的预处理技术。本发明进一步阐述了关于利用产生的单糖生产生物制品和生物燃料的详情，在下面的例子中进行描述。应该认识到，在本发明的示例性实施例中的这些例子，只用图解的方式表明。

代表作名录列出的例子中使用的化学品和材料，都是分析纯试剂和化学品。

葡萄糖，木糖，甘露糖，半乳糖，纤维二糖，柠檬酸，氢氧化钠，氢氧化铵，过氧化氢来自于西格玛奥德里奇公司(St.Louis，Mo.)。

稻草来自美国普尔曼的葛兰奇供应公司，并在华盛顿州立大学的木材材料与工程实验室用锤式粉碎机粉碎。通过用一个特定的泰勒网格标准筛对秸秆进行筛分，然后将所得的颗粒，用于下一步的预处理。

原料中糖的分析

生物质在105℃的热风炉中干燥24小时，然后用于组份分析。NREL的标准的实验室分析方法(LAP)用于碳水化合物和木质素含量的测定(Sluiter etal.，2004)。在两个阶段的酸水解过程约0.3克样品被称重和处理。初始3毫升72％(w/w)硫酸在37℃水解后，样品用蒸馏水稀释到总体积为84毫升，并高温灭菌1小时。用离子色谱法测定在水相中的糖(戴安ICS-3000与PAC PA20柱和CarboPac PA20戴安保护柱)。每个样品持续60分钟，在换样品之间冲洗柱子先用100％200mM NaOH，然后用去离子水冲洗。通过对标准样品糖比较计算出糖的浓度，所有的测量都是三平行。

糖化或酶解

用对照和处理后的样品进行酶水解，估计预处理前后的糖回收率。在环形震荡摇床(Gyromax 747)中，水解在50℃下，用1到20％的固含量，以及含有100微升2％叠氮化钠的50毫摩醋酸钠缓冲液(pH 4.8)，30FPU(每克原料)的纤维素酶(Novozymes NS 50013)和30CBU(每克原料)的β-葡甘聚糖酶(Novozymes NS 50010)的溶液中，在规定时间内进行。在某些实施例中，来自NovozymesCTec2和HTec2也被应用于酶解，除非有其他说明。酶水解后，在规定时间释放的总糖，被用来计算糖回收率。酶解产物的糖组分使用dionex-ic按照前部分详细介绍进行分析(原料中糖的分析)。

实施例1

控制臭氧处理和氨水浸泡(SAA)处理以及两者相结合(臭氧处理后，在进行氨水浸泡处理)处理麦草的糖的分析

对对照和经2小时臭氧处理(状态：(臭氧化：90％湿度调整到42-60目的粒径，5.4％臭氧在2升/分钟的气流量下反应2小时)，只有氨浸泡处理(条件60℃和24小时)，结合处理(臭氧化：90％湿度调整到42-60目的粒径，5.4％臭氧在2升/分钟的气流量下反应10分钟；氨浸泡：20％固含量(w/v)，20％氢氧化铵水溶液(w/v)，50℃反应温度和6小时的反应时间)的稻草秸秆样品的糖分析结果在表1中显示。臭氧处理后的样品中单糖的浓度随时间减少，这可能是臭氧与糖反应有关。用测得的百分比来看，经过SAA和OSAA处理后的样品糖浓度显着增加，这是去除抽提物，灰分和木质素到一定程度的协同效应。

表1

注：表中提到的所有的糖浓度代表％的糖

实施例2

单独臭氧预处理小麦秸秆粒径对糖回收的影响

小麦秸秆颗粒径(42-60目)调整到90％(W/W)的水分含量，并用含有5.4％臭氧的富含臭氧的氧气气流(氧流量2升/分钟)在室温(23℃)下，在不锈钢反应釜中反应5到30分钟。将处理后的生物原料取出，并按下列程序糖化。从上述程序中得到的小麦秸秆残留物(0.2克)被添加到20毫升的柠檬酸盐缓冲液(pH＝4.8)，同时加入1.5L(71.0μL，蛋白质浓度＝126.5mg/mL)和Novozym 188(14.0μL，蛋白质浓度＝134mg/mL)酶混合液，混合物停留在摇床50℃下进行搅拌。样品72小时后取出，酶用沸水煮5分钟失活，糖的浓度是通过戴安离子色谱分析。结果如表2所示。结果表明，相对于对照样品，臭氧预处理小麦秸秆颗粒，增加了糖回收率。

表2

注：§符号代表％的糖回收率

实施例3

超氧水处理对于麦秆颗粒酶解的影响

3克小麦秸秆颗粒(42-60目)彻底与含过氧化氢(浓度调整提供的双氧水与臭氧摩尔比为1∶2)的水混合调整为90％(W/W)的水分含量。混合物放在不锈钢反应釜，并用含有5.4％臭氧的富含臭氧的氧气气流(氧流量2升/分钟)在室温(23℃)下产生高反应活性的羟基自由基，5到30分钟。将处理后的生物原料取出，并按下列程序糖化。从上述程序中得到的小麦秸秆残留物(0.2克)被添加到20毫升的柠檬酸盐缓冲液(pH＝4.8)，同时加入1.5L(71.0μL，蛋白质浓度＝126.5mg/mL)和Novozym 188(14.0μL，蛋白质浓度＝134mg/mL)酶混合液，混合物停留在摇床50℃下进行搅拌。72小时后取出，酶用沸水煮5分钟失活，糖的浓度是通过戴安离子色谱分析。结果如表3所示。结果表明，预处理的小麦秸秆颗粒与超氧水反应，与例2和对照样品对比，进一步增加了糖回收率。

表3

注：§符号代表％的糖回收率

实施例4-12

臭氧和氨水浸泡(SAA)预处理结合的效果

小麦秸秆颗粒径(42-60目)调整到90％(W/W)的水分含量，并用含有5.4％臭氧的富含臭氧的氧气气流(氧流量2升/分钟)在室温(23℃)下，在不锈钢反应釜中反应10，15和20分钟。经臭氧预处理的颗粒随后利用20％(w/w)的氢氧化铵溶液，在50℃和20％(w/v)固含量下处理3，6和9小时。得到的固体残留物经过滤，分离，用蒸馏水洗涤至中性的pH值。洗涤后的固体残留物在50℃干燥后，产生预处理后的原料。从上述程序中得到的小麦秸秆残留物(0.2克)被添加到20毫升的柠檬酸盐缓冲液(pH＝4.8)，同时加入1.5L(71.0μL，蛋白质浓度＝126.5mg/mL)和Novozym 188(14.0μL，蛋白质浓度＝134mg/mL)酶混合液，混合物停留在摇床50℃下进行搅拌。在12，24，48和72小时后取样，酶用沸水煮5分钟失活，糖的浓度是通过戴安离子色谱分析。结果如表4所示。结果表明，组合预处理方法对提高糖回收率是非常有效的，无论是在氨浸泡预处理前进行臭氧或超氧水处理，从木质纤维素生物质中获得廉价的糖是一个经济可行的过程。

表4

注：§符号代表％的糖回收率

实施例13-24

高固相含量、不同酶量对臭氧-氨浸泡预处理小麦秸秆糖释放的影响

两组实验将小麦秸秆颗粒(42-60目)按照例4方法预处理，并包含对照(未处理)样品。例如实施例13到18，从上述程序中得到的小麦秸秆残留物(0.2克)被添加到20毫升的柠檬酸盐缓冲液(pH＝4.8)，同时加入1.5L(71.0μL，蛋白质浓度＝126.5mg/mL)和Novozym 188(14.0μL，蛋白质浓度＝134mg/mL)酶混合液，混合物停留在摇床50℃下进行搅拌。在1，3，6，12，24，36，48和72小时后取样，酶用沸水煮5分钟失活，糖的浓度是通过戴安离子色谱分析。实施例12，13，和14代表对照样本，实施例15，16和17代表臭氧-氨浸泡预处理的样品。本研究的结果显示在表5。

同样的，实施例19到24，从实施例3中得到的小麦秸秆残留物被利用来研究。试验用的不同的固含量为5％，7.5％和10％(W/V)被添加到20毫升的柠檬酸盐缓冲液(pH＝4.8)，同时加入1.5L(71.0μL，蛋白质浓度＝126.5mg/mL)和Novozym 188(14.0μL，蛋白质浓度＝134mg/mL)酶混合液，混合物停留在摇床50℃下进行搅拌。在1，3，6，12，24，36，48和72小时后取样，酶用沸水煮5分钟失活，糖的浓度是通过戴安离子色谱分析。实施例18，19，和20代表对照样本，实施例21，22和23代表臭氧-氨浸泡预处理的样品。本研究的结果显示在表6。在表5和6显示的结果：用臭氧-氨浸泡预处理木质纤维素生物质适于生产浓缩五碳糖和六碳糖流。

表5

注：实施例13：对照样品用5％(w/v)固含量和30CBU以及30FPU酶用量；实施例14：对照样用7.5％(w/v)固含量和30CBU以及30FPU酶用量；实施例15：对照样品用10％(w/v)固含量和30CBU以及30FPU酶用量；实施例16：臭氧-氨浸泡处理样用5％(w/v)固含量和30CBU以及30FPU酶用量；实施例17：臭氧-氨浸泡处理样用7.5％(w/v)固含量和30CBU以及30FPU酶用量；实施例18：臭氧-氨浸泡处理样用10％(w/v)固含量和30CBU以及30FPU酶用量；并且这里所说的所有的糖回收率结果是用百分比表示。

表6

注：实施例19：对照样品用5％(w/v)固含量和15CBU以及15FPU酶用量；实施例20：对照样品用7.5％(w/v)固含量和15CBU以及15FPU酶用量；实施例21：对照样品用10％(w/v)固含量和15CBU以及15FPU酶用量；实施例22：臭氧-氨浸泡处理样用5％(w/v)固含量和15CBU以及15FPU酶用量；实施例23：臭氧-氨浸泡处理样用7.5％(w/v)固含量和15CBU以及15FPU酶用量；实施例24：臭氧-氨浸泡处理样用10％(w/v)固含量和15CBU以及15FPU酶用量；并且这里所说的所有的糖回收率结果是用百分比表示。

实施例25

利用五碳糖和六碳糖单流生产微生物油脂

产油酵母菌株弯曲隐球菌，胶红类酵母菌，红冬孢酵母菌，解脂耶氏酵母利用按照例23中所描述的酶水解过程得到的五碳糖和六碳糖混合物生长。最初，所有的菌株的种子培养在含有的营养成分如酵母提取物10克/升，蛋白胨10克/升和葡萄糖20克/升的YPD培养基，并且在温度30℃，振动在150转/分钟的条件下孵育24小时。约10％的种子培养液加入含50毫升酶解液，硫酸铵0.5克/升，酵母提取物1克/升，磷酸二氢钾0.4克/升，硫酸镁1.5克/升，pH值调整到6的生产培养基中。培养维持在28℃和200转/分的250毫升锥形瓶中。培养4天，细胞收获积累的脂质通过O’Fallon et al.，(2007)的分析方法确定脂质含量。本研究的结果显示在图4。据观察，五碳糖和六碳糖单流适合培养产油酵母。如图7所示，在本发明中，与其他菌株相比，C.curvatus是最高的生物量和脂质积累的菌株，约24.97克/升和11.43克/升。C.curvatus利用所有的六碳糖(葡萄糖)，仅仅留下少量的五碳糖(木糖)。

实施例26

用臭氧-氨浸泡处理的小麦秸秆颗粒利用酵母进行同时糖化和发酵(SSF)微生物产油

从实施例3到11中得到的预处理后的原料使用在这个例子中。培养C.curvatus产油酵母利用在本研究中。种子培养制备和其他营养成分的补充是与实施例24相似的。试验用7.5％(w/v)固含量和30CBU以及30FPU酶用量在30℃，转速为200转/分条件下，培养4天显示约20％的糖直接转化为生物油脂。图8显示了过程的物料平衡，即100克原料使用臭氧-氨浸泡预处理后，用C.curvatus进行同步糖化发酵。从本发明中报道来看，经臭氧-氨浸泡预处理得到的生物质特别适合微生物油脂生产，像其它方法，如稀酸预处理，氨爆破(AFEX)，蒸汽爆破，和其他的预处理方法在美国专利No.20100159521A1(Cirakovic&Diner，2010b)保留了大量的木质素在预处理原料中。

同时本发明已在其优选的实施方案中描述，本领域技术人员会认识到，本发明可以使用在所附的权利提出的概念和范围的改变。因此，本发明的实施例中，不应局限于上面所描述的，但还应包括在所有描述的精神和范围内的所有修改和等价物的规定。

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Claims (25)

1.一个在酶水解糖化之前，木质纤维素生物质的预处理方法，包括与H₂O₂的水溶液混合制备0％至90％(W/W)水分含量的原料，接触指的是原料/过氧化氢混合物与臭氧气体，在所述温度15℃-30℃进行接触。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括步骤：在混合之前，筛选原料粒径。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤将时间范围从约1到20分钟。

4.如权利要求3所述的方法，所述接触步骤是至少15分钟。

5.如权利要求1所述的方法，所述接触步骤之后，酶水解糖化之前是由漂洗和干燥的步骤的其中之一或两者都有。

6.如权利要求1所述的方法，其中酶水解糖化得到的糖用于产油微生物生产油脂。

7.一个在酶水解糖化之前，预处理木质纤维素生物质方法，包括在温度15℃-30℃下，原料与臭氧进行接触，已经被臭氧处理过的原料，在压强低于一个大气压的条件下，用液氨在50℃下处理。

8.如权利要求7所述的方法，该方法包括在接触之前，对原料经行粒径筛选。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述接触的步骤时间从约3至约36小时。

10.如权利要9所述的方法，其中所述接触的步骤进行了从约6至约9小时。

11.如权利要求7所述的方法，其中第二步骤接触压强要低于一个大气压。

12.如权利要求7所述的方法，其中，所产生的较低的木质素含量原料特别适用于任何生物燃料或生物制品的同步糖化和发酵过程。

13.如权利要求7所述的方法，所述接触步骤之后，酶水解糖化之前是由漂洗和干燥的步骤的其中之一或两者都要。

14.如权利要求7所述的方法，氨水的量相对于经臭氧处理的原料干重是4∶1到10∶1。

15.如权利要求7所述的方法，还包括过滤和酸沉淀原料浸泡后的氨溶液的步骤，并从中回收可溶性或不溶木质素。

16.如权利要求20所述的方法，其中酶水解糖化得到的糖用于产油微生物油脂生产。

17.一个在酶水解糖化之前，预处理木质纤维素生物质方法，包括与H₂O₂的水溶液混合制备0％至90％(W/W)水分含量的原料。接触指的是原料/过氧化氢混合物与臭氧气体，在所述温度15℃-30℃进行接触，然后已经被臭氧处理过的原料，用液氨在50℃下处理。

18.如权利要求15所述的方法，该方法包括在混合之前，对原料经行粒径筛选

19.如权利要求15所述的方法，所述接触步骤时间大约5到20分钟。

20.如权利要求15所述的方法，所述接触的步骤时间从约3至约9小时。

21.如权利要求15所述的方法，所述接触步骤之后，接触之前是由漂洗和干燥的步骤的其中之一或两者都要。

22.如权利要求15所述的方法，所述接触步骤之后，酶水解糖化之前是由漂洗和干燥的步骤的其中之一或两者都要。

23.如权利要求15所述的方法，氨水的量相对于经臭氧处理的原料干重是4∶1到10∶1。

24.如权利要求15所述的方法，还包括过滤和酸沉淀原料浸泡后的氨溶液的步骤，并从中回收可溶性或不溶木质素。

25.如权利要求15所述的方法，其中酶水解糖化得到的糖用于产油微生物油脂生产。