CN108823102A - 寒地秸秆腐熟真菌被孢霉菌株及其在水稻秸秆腐熟中的应用 - Google Patents

寒地秸秆腐熟真菌被孢霉菌株及其在水稻秸秆腐熟中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株寒地秸秆腐熟真菌被孢霉菌株及其在水稻秸秆腐熟中的应用，属于寒地秸秆腐熟真菌的分离及应用领域。本发明首先公开了一株分离的寒地秸秆腐熟真菌被孢霉菌株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.15188。本发明进一步公开了所述的寒地秸秆腐熟真菌被孢霉菌株在水稻秸秆腐熟中的应用。本发明分离的寒地秸秆腐熟真菌被孢霉菌菌株为耐冷微生物，耐冷性强，而且该菌株具有较强的纤维素分解能力，在低温条件下对水稻秸秆的酵解效果好。本发明所分离的寒地秸秆腐熟真菌被孢霉菌株在制备秸秆腐熟剂，尤其是水稻秸秆腐熟剂中具有应用前景。

Description

寒地秸秆腐熟真菌被孢霉菌株及其在水稻秸秆腐熟中的应用
技术领域
本发明涉及一株分离的寒地秸秆腐熟真菌菌株，还涉及所述寒地秸秆腐熟真菌菌株在低温下高效酵解水稻秸秆中的应用，属于寒地秸秆腐熟真菌的分离及应用领域。
背景技术
水稻秸秆含有丰富的纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质和矿物质元素等营养物质，是一种可再生的生物资源，但中国秸秆利用率不足33％。由于秸秆中纤维素含量最高，因此，筛选具有高纤维素酶产酶特性的微生物成为研究秸秆腐熟剂的重要方向之一。
EM菌是由光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、发酵丝状菌和放线菌等多种微生物组成的一个有益菌群，在应用时具有成本低、使用方法简便等优点，已经在农业领域、畜牧业领域、水产领域和水污染领域等方面被广泛应用。本发明人研究室经过研究表明，在中国东北室外温度在零下12℃至25℃之间的条件下，采用EM菌发酵液发酵水稻秸秆，在45d内可以实现秸秆有效酵解。因此，以高寒地带冬季EM菌酵解水稻秸秆的腐熟物为研究对象，对寒地水稻秸秆腐熟真菌菌株进行分离，筛选出能够在低温条件下腐熟秸秆的高效菌株，将为增加寒地水稻秸秆腐熟菌剂的菌种组成及秸秆腐熟剂的应用，提供实践基础和理论依据。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株分离的寒地秸秆腐熟真菌菌株；
本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述寒地秸秆腐熟真菌菌株在酵解水稻秸秆以及制备水稻秸秆腐熟剂中的应用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明从高寒地带冬季EM菌酵解水稻秸秆的腐熟物中进行寒地水稻秸秆腐熟真菌菌株的分离和纯化，共获得了23个菌株。本发明对所分离的菌株进行低温秸秆腐熟菌的初筛，结果筛选出7株能够在15℃低温条件下正常生长的真菌菌株。
本发明进一步以低温筛选获得的微生物是否具有分解纤维素的能力为依据，对寒地秸秆腐熟菌进行复筛，结果表明低温真菌菌株E3的液体培养滤纸具有较大的破损程度，菌株E3液体培养10d后，滤纸分解呈半清状，表明该菌株对纤维素的分解能力较强。本发明将复筛到的E3菌株在固体培养基上培养，观察菌株的生长状况和滤纸破损程度，结果培养10d后菌株生长良好，滤纸被作为菌株生长的营养物质被分解，滤纸分解腐烂均匀。以上结果表明，真菌菌株E3具有较强的纤维素分解能力。
形态学观察结果表明，秸秆腐熟真菌E3的菌落形态较大，菌丝体白色絮状，质地致密，外观干燥；其营养菌丝为一种透明管状的细丝，为无隔膜菌丝，分生孢子为球形，初步判断E3为霉菌。分子生物学鉴定结果表明，菌株E3经PCR扩增获得的ITS序列片段，长度为609bp。本发明对扩增获得的序列进行BLAST比对及系统发育树构建，根据系统发育树的结果确定E3为被孢霉菌(Mortierella sp)。本发明将该菌株定名为Mortierella sp-E3。
耐冷性鉴定结果表明，Mortierella sp-E3菌株在5℃时可以正常生长，在15℃培养7d后菌株直径达到其最大直径的64％，在低温环境中生长较好，耐冷性强。本发明筛选获得的腐熟菌株为耐冷微生物，可以在低温地区正常生长。
本发明将分离的寒地秸秆腐熟真菌菌株Mortierella sp-E3提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.15188；分类命名为：被孢霉Mortierella sp。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2018年1月11日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明进一步公开了所述的寒地秸秆腐熟真菌菌株Mortierella sp-E3在酵解水稻秸秆中的应用。
本发明进一步公开了所述的寒地秸秆腐熟真菌菌株Mortierella sp-E3在制备秸秆腐熟剂中的应用。
本发明进一步公开了所述的寒地秸秆腐熟真菌菌株Mortierella sp-E3在制备水稻秸秆腐熟剂中的应用。
本发明还公开了所述的寒地秸秆腐熟真菌菌株Mortierella sp-E3在制备寒地水稻秸秆腐熟剂中的应用。本发明所述寒地为低温地区，其温度范围为0℃至35℃。
本发明还公开了一种水稻秸秆腐熟剂，包括：本发明所述的寒地秸秆腐熟真菌菌株Mortierella sp-E3的发酵液。
本发明还公开了一种水稻秸秆腐熟剂，包括：本发明所述的寒地秸秆腐熟真菌菌株Mortierella sp-E3的发酵液和EM菌菌液。其中，所述寒地秸秆腐熟真菌菌株Mortierella sp-E3的发酵液与EM菌菌液按体积比1：1混合。
本发明所述寒地秸秆腐熟真菌菌株的发酵液的制备包括：将所述的寒地秸秆腐熟真菌菌株Mortierella sp-E3接种于液体培养基中进行培养，收集菌液，即得。
本发明采用无氮源的赫奇逊氏无机盐培养基作为基础培养基。其中，所述液体培养基的氮源为蛋白胨或酵母膏，氮源的添加量为0.2％(质量百分比)，液体培养基的初始pH值为3-9；按体积百分比计，所述接种的接种量为1-9％；所述培养的温度为10-40℃，培养的时间为3-18d。优选的，所述液体培养基的氮源为蛋白胨，氮源的添加量为0.2％(质量百分比)，液体培养基的初始pH值为7；按体积百分比计，所述接种的接种量为5％；所述培养的温度为25℃，培养的时间为9d。
本发明对所述EM菌菌液没有特殊限制，市售的EM菌菌液均适用于本发明。
本发明对所述寒地秸秆腐熟真菌菌株Mortierella sp-E3的发酵条件进行了优化。氮源优化结果表明，该菌株在以蛋白胨和酵母膏为氮源培养基上产纤维素酶的活性较高，而在添加硫酸铵或尿素作为氮源培养基上产生纤维素酶的活性较低，并且差异显著。本发明确定适合该寒地秸秆腐熟真菌发酵培养的最佳氮源为蛋白胨。接种量优化结果表明，在接种量3-9％的范围内该菌株具有较高纤维素酶活性，接种量为5％时具有最高的产酶活性，接种量超过5％后，酶活力开始下降。综合比较，确定该寒地秸秆腐熟真菌发酵的最佳接种量为5％。培养温度优化结果表明，该菌株在温度10-30℃时酶活力逐渐增加，到25℃时酶活力最高；随着温度继续升高，产酶活力显著下降，在40℃时菌株的产酶活力下降到最低。本发明确定该寒地秸秆腐熟真菌发酵的最佳温度为25℃。培养基初始pH值优化结果表明，初始pH值对寒地秸秆腐熟真菌Mortierella sp-E3菌株产CMC酶活力影响较大；在pH值为3时酶活性最低，几乎无法检出纤维素酶活性；培养基初始pH在6-8的范围内，菌株的CMC酶活力都表现为较高的水平，在初始pH为7时纤维素酶活性最高，当培养基初始pH升至8时，菌株的产酶活性呈下降趋势。因此，本发明确定寒地秸秆腐熟真菌的发酵最佳初始pH值为7，中性的溶液环境有利于其产酶。培养时间优化结果表明，寒地秸秆腐熟真菌Mortierella sp-E3菌株的产酶活性随着培养时间的延长，表现为先呈现快速上升，然后缓慢下降的趋势，在培养9d的时候，具有最好的产酶活性，12d后CMC酶活力逐渐降低，但仍具有较强的酶活。本发明确定该寒地秸秆腐熟真菌产纤维素酶的最佳培养时间为9d。
寒地秸秆腐熟菌的秸秆酵解效果分析结果表明，Mortierella sp-E3菌株可以有效的酵解水稻秸秆，在15d时秸秆分解率达到了48％以上。以上结果表明，本发明筛选的秸秆腐熟菌Mortierella sp-E3具有较好的秸秆酵解效果。
本发明在低温条件下，采用真菌Mortierella sp-E3与EM菌配合(1：1混合)进行水稻秸秆的酵解试验，结果低温酵解水稻秸秆30d，秸秆酵解效率提高了47.5％。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明从高寒地带冬季EM菌酵解水稻秸秆的腐熟物中，进行寒地水稻秸秆腐熟真菌菌株的分离，筛选获得一株能够在低温条件下腐熟水稻秸秆的高效菌株Mortierellasp-E3。该菌株为耐冷菌，具有较好的水稻秸秆酵解效果。本发明为增加寒地水稻秸秆腐熟菌剂的菌种组成及秸秆腐熟剂的应用提供实践基础和理论依据。
附图说明
图1为腐熟真菌E3的形态学鉴定；其中，A为E3菌株的菌落形态；B为E3菌株显微形态；
图2为菌株E3基于ITS序列同源性构建的系统发育树；
图3为E3菌株的温度生长特性；
图4为不同氮源对寒地秸秆腐熟真菌Mortierella sp-E3菌株产酶的影响；
图5为不同接种量对寒地秸秆腐熟真菌Mortierella sp-E3产酶的影响；
图6为不同温度对寒地秸秆腐熟真菌Mortierella sp-E3产酶的影响；
图7为初始pH对寒地秸秆腐熟真菌Mortierella sp-E3产酶的影响；
图8为不同培养时间对寒地秸秆腐熟真菌Mortierella sp-E3产酶的影响；
图9为寒地秸秆腐熟真菌Mortierella sp-E3对秸秆的失重率的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1寒地秸秆腐熟菌的分离鉴定
1、试验材料与方法
1.1试验材料
本发明中所使用EM菌菌液由黑龙江省农科院提供。水稻秸秆采自东北农业大学试验田。
2.2试验方法
2.2.1寒地秸秆EM菌腐熟
2016年12月份，在黑龙江省哈尔滨东北农业大学试验田，室外温度在零下12℃至25℃之间，将粉碎水稻秸秆与EM菌液混合物埋于深沟中，采用未处理的秸秆及塑料布覆盖，腐熟分解60d。取出的秸秆腐熟物呈腐烂状态，偶见条状或小碎片状未完全腐熟的秸秆碎块。
2.2.2寒地秸秆腐熟真菌的分离
2.2.2.1秸秆腐熟物中菌株的分离、初筛和保存
(1)腐熟物中菌株的分离：称取5g秸秆腐熟物于锥形瓶中加入50mL无菌水，37℃在摇床上培养24h。用接菌环蘸取腐熟物悬浮上清液在菌株分离培养基上划线，分离出真菌单菌落后，接在PDA培养基上。
(2)低温条件下腐熟物中菌株的初筛：利用寒地秸秆腐熟菌能够在低温条件下生长，利用不同温度对富集分离的菌株进行初筛。采用4℃、10℃、15℃、25℃和37℃等温度条件，培养所分离的菌株，观察菌株生长情况，筛选出能在低温条件下正常生长的菌株。
(3)菌株的保存：将分离出真菌接在马铃薯葡萄糖水培养基(PD)中28℃培养36-48h待菌丝长出，4℃条件下保存。
2.2.2.2寒地秸秆腐熟菌的复筛
以低温筛选获得微生物是否具有分解纤维素的能力作为依据，对寒地秸秆腐熟菌进行复筛。将初筛获得的可以在低温条件下生长的真菌，接种于液体滤纸培养基中，15℃培养7d，观察菌株对滤纸分解的情况，滤纸边缘卷曲膨胀记为(+)；滤纸不定型状态记为(++)；滤纸成为团糊状记为(+++)；滤纸成为半清状液体记为(++++)，确定真菌分解纤维素的能力。
2.2.3寒地秸秆腐熟菌的鉴定
2.2.3.1寒地秸秆腐熟菌的形态学鉴定
复筛到的真菌菌株分别接种于PD培养基和PDA培养基中，28℃培养3-4d，待菌丝长出后，观察菌落及菌斑的形状和外观，利用光学显微镜观察菌丝及分生孢子形态。
2.2.3.2寒地秸秆腐熟菌的分子鉴定
从PDA平板培养基上接种已经纯化好的单菌落到30mL马铃薯葡萄糖水培养基(PD)中，培养箱28℃培养3-4d，取菌丝，采用CTAB法提取DNA。利用真菌鉴定的ITS序列通用引物ITS1/ITS4作为寒地秸秆腐熟真菌的分子鉴定引物，进行PCR扩增，将PCR产物至哈尔滨博仕生物技术有限公司进行测序。将测序获得的序列输入GenBank中，利用BLAST比对，进行序列同源性分析，并采用MEGA5.0软件构建系统发育树，对真菌的种属进行分子鉴定。
2.2.4寒地秸秆腐熟菌的耐冷性鉴定
将前期筛选和鉴定获得秸秆腐熟真菌分别接种于PDA培养基，记录菌株在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的培养条件下的生长状况，确定筛选的秸秆腐熟菌的耐冷性。
2.2.5寒地秸秆腐熟菌的发酵条件优化
2.2.5.1培养基不同的氮源对腐熟菌发酵的影响
为了研讨培养基不同氮源的对腐熟菌发酵的影响，本试验采用无氮源的赫奇逊氏无机盐培养基作为基础培养基，在此基础上添加不同的氮源，添加的氮源是蛋白胨、酵母膏、硫酸铵和尿素，添加量为0.2％(质量百分比)，每个处理4瓶，设3个重复。在25℃培养7d时，取菌液0.2mL，用于纤维素酶活性测定，测定方法为DNS法。
2.2.5.2菌种接种量对腐熟菌发酵的影响
为了研讨不同菌种接种量对腐熟菌发酵的影响，本试验设计不同的菌种接种量。设置1％、3％、5％、7％、9％五个接种量(体积百分比)处理。在以蛋白胨为氮源的液体发酵培养基中接种，培养基初始pH值为7.0，25℃培养，每个处理5瓶，设3个重复。在培养7d时，分别取菌液0.2mL，用于纤维素酶活性测定。
2.2.5.3培养温度对腐熟菌发酵的影响
为了研讨不同培养温度对腐熟菌纤维素酶活性的影响，本试验设计不同的菌株培养温度。设置了10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃共7个培养温度处理。在以蛋白胨为氮源的液体发酵培养基中分别以5％的接种量接种，培养基初始pH值为7.0，每个处理7瓶，设3个重复。在培养7d时，分别取菌液0.2mL，用于纤维素酶活性测定。
2.2.5.4培养基初始pH值对腐熟菌发酵的影响
为了研讨不同培养基初始pH值对腐熟菌发酵的影响，本试验设计不同的培养基初始pH值。设置了3、4、5、6、7、8、9共7个不同培养基初始pH值处理。以蛋白胨为氮源的液体发酵培养基为基础培养基，调节培养基初始pH，以5％的接种量接种，25℃培养，每个处理7瓶，设3个重复。在培养7d时，分别取菌液0.2mL，用于纤维素酶活性测定。
2.2.5.5培养时间对腐熟菌发酵的影响
为了研讨不同培养时间对腐熟菌发酵的影响，本试验设计不同的培养时间。设置3d、6d、9d、12d、15d、18d共6个不同培养时间处理。以蛋白胨为氮源的液体发酵培养基，培养基初始pH值为7，以5％的接种量接种，细菌试验每个处理7瓶，真菌试验每个处理6瓶，分别设3个重复。按实验设计的培养时间培养后，分别取菌液0.2mL，用于纤维素酶活性测定。
2.2.6寒地秸秆腐熟菌酵解试验
2.2.6.1秸秆酵解试验
研究秸秆腐熟菌对秸秆的酵解效果。以5％秸秆腐熟菌发酵液的接种量接种于秸秆液体培养基(秸秆发酵液体培养基：称取KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.3g，NaNO3 2.5g，NaCl0.1g，CaCl2 0.1g，FeCl3 0.01g于锥形瓶中加入1000mL蒸馏水中，调节pH值至7.2左右，加入处理好的水稻秸秆粉，高温蒸汽灭菌后备用)，15℃培养，在第3d、6d、9d、12d和15d分别取样测定秸秆失重率。秸秆失重率的测定方法与滤纸失重率的测定方法相同，将发酵液滤纸过滤，残留物置于烘箱中80℃烘干至恒重，进而测定秸秆失重率。
2.2.6.2低温高效酵解秸秆真菌与EM菌复配酵解秸秆试验
采用发酵后的低温高效酵解秸秆真菌发酵液与EM菌菌液1:1(体积比)混合，在4℃条件下酵解水稻秸秆。水稻秸秆的处理方法：用2mol/L的NaOH溶液浸泡水稻秸秆段24h，水洗至pH＝7，干燥箱80℃烘干，烘干后的秸秆段粉碎100目过筛备用。发酵的组成，根据发酵水稻秸秆的量添加5％EM菌菌液，5％低温高效酵解秸秆真菌发酵液，1％红糖，湿度控制在35％-65％之间，发酵30d，以EM菌菌液为对照。酵解结束后，测定秸秆的失重率，测定方法同滤纸失重率方法相同。
3、试验结果
3.1寒地秸秆腐熟真菌的分离
3.1.1寒地秸秆腐熟菌的初筛
通过对寒地秸秆腐熟物中的微生物进行6次分离和纯化，共获得了23个菌株。在不同温度培养条件下，对分离的菌株进行培养，观察其生长情况，进行低温秸秆腐熟菌的初筛。结果表明，筛选出的能够在15℃低温条件下正常生长的真菌菌株共有7株，分别为A1、E3、A12、B2、C4、F6和E6。
3.1.2寒地秸秆腐熟真菌的复筛
将初筛到的低温真菌接种在滤纸液体培养基上，在28℃条件下培养10d。通过检查液体培养基中滤纸破损程度进行寒地秸秆腐熟真菌的复筛，试验结果见表1所示。通过真菌滤纸分解效果可以看出，低温真菌菌株E3的液体培养滤纸具有较大的破损程度，菌株E3液体培养10d后，滤纸分解呈半清状，这些结果表明该菌株对纤维素的分解能力较强。将复筛到的E3菌株在固体培养基上28℃条件下培养，观察菌株的生长状况和滤纸破损程度，结果表明，培养10d后，菌株生长良好，滤纸被作为菌株生长的营养物质被分解，滤纸分解腐烂很均匀。以上结果表明，筛选出来的真菌菌株E3具有较强的纤维素分解能力。
表1菌株的滤纸分解效果
注：滤纸边缘卷曲膨胀记为(+)；滤纸不定型状态记为(++)；滤纸成为团糊状记为(+++)；滤纸成为半清状液体记为(++++)。
3.2寒地秸秆腐熟菌的形态学观察
将筛选出的秸秆腐熟真菌E3在固体培养基上培养，观察菌落及菌体形态。结果表明在培养基上都形成单一的真菌菌落。菌株E3的菌落形态较大，菌丝体白色絮状，质地致密，外观干燥，对菌丝进行观察发现，其营养菌丝为一种透明管状的细丝，为无隔膜菌丝，分生孢子为球形(见图1)，初步判断E3为霉菌。
3.3寒地秸秆腐熟菌的分子鉴定
通过真菌ITS序列分析，对筛选获得的腐熟菌进行分子生物学鉴定，菌株E3扩增获得的ITS序列片段长度为609bp。对获得的序列进行BLAST比对及系统发育树构建，结果如图2所示。根据系统发育树的结果，E3为被孢霉菌(Mortierella sp)，这个结果同前面的形态学鉴定具有一致性，将该菌株定名为Mortierella sp-E3。
本发明将分离的Mortierella sp-E3菌株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.15188。
3.4寒地秸秆腐熟菌的耐冷性鉴定
对筛选获得的菌株进行耐冷性鉴定。将筛选的腐熟真菌菌株E3在PDA培养基上接种，在不同温度下进行培养，观察其菌株生长情况，菌株生长情况如图3所示。结果表明，该菌株在5℃时可以正常生长，在15℃培养7d后菌株直径达到其最大直径的64％，在低温环境中生长较好，耐冷性强。Morita指出耐冷微生物具有的特征为在0-5℃能够生长繁殖，最适生长温度在15℃以上，最高生长温度高于20℃。本试验筛选获得的腐熟菌株为耐冷微生物，可以在中国北方低温地区正常生长。
3.5寒地秸秆腐熟菌发酵条件优化
3.5.1最佳氮源确定
对筛选的寒地秸秆腐熟真菌Mortierella sp-E3的发酵的最佳氮源进行筛选。结果如图4所示，由结果可以看出，该菌株在以蛋白胨和酵母膏为氮源培养基上产纤维素酶的活性较高，而在添加硫酸铵和尿素作为氮源培养基上产生纤维素酶的活性较低，并且差异很显著。综合比较结果，适合于该寒地秸秆腐熟真菌发酵培养的最佳氮源为蛋白胨。
3.5.2接菌量对发酵的影响
对筛选的寒地秸秆腐熟真菌Mortierella sp-E3发酵培养的最佳接种量进行筛选，结果如图5所示。由结果可以看出，接种量的不同会影响筛选获得真菌产纤维素酶的活性，随着接种量的增加，秸秆腐熟真菌产纤维素酶的活性呈现急剧上升，然后缓慢下降的趋势，在接种量3～9％的范围内该菌株具有较高纤维素酶活性，接种量为5％时，具有最高的产酶活性，接种量超过5％后，酶活力开始下降。综合比较结果，该寒地秸秆腐熟真菌发酵的最佳接种量为5％。
3.5.3温度对发酵的影响
对不同培养温度对筛选的寒地秸秆腐熟真菌Mortierella sp-E3发酵的影响进行了研究，结果如图6所示。由结果可以看出，该菌株在温度10-30℃时酶活力逐渐增加，到25℃时酶活力最高。随着温度升高，产酶活力显著下降，在40℃时菌株的产酶活力下降到最低。综合比较结果，确定该寒地秸秆腐熟真菌发酵的最佳温度为25℃。
3.5.4初始pH对发酵的影响
由图7可看出，液体培养的培养基初始pH值对寒地秸秆腐熟真菌Mortierella sp-E3菌株产CMC酶活力影响较大。过酸或过碱的环境CMC酶活力都很低，在pH值为3时，酶活性最低，几乎无法检出纤维素酶活性。培养基初始pH在6～8的范围内，菌株的CMC酶活力都表现为较高的水平，在初始pH为7时，纤维素酶活性最高，当培养基初始pH升至8时，菌株的产酶活性呈下降趋势。这些结果表明，本试验筛选的寒地秸秆腐熟真菌的发酵最佳初始pH值为7，中性的溶液环境有利于其产酶。
3.5.5培养时间对发酵的影响
由图8可以看出，寒地秸秆腐熟真菌Mortierella sp-E3菌株的产酶活性随着培养时间的延长，表现为先呈现快速上升，然后缓慢下降的趋势，在培养9d的时候，具有最好的产酶活性，12d后CMC酶活力逐渐降低，但仍具有较强的酶活。综合比较结果，确定该寒地秸秆腐熟真菌产纤维素酶的最佳培养时间为9d。
3.6寒地秸秆腐熟菌的秸秆酵解效果分析
3.6.1腐熟真菌对秸秆的分解效果
将本试验筛选的腐熟真菌接种于秸秆液体培养基中，确定该菌株秸秆酵解效果，试验结果如图9所示。由结果可以看出，随着酵解时间的延长，该菌株可以有效的酵解秸秆，在15d的时候，秸秆分解率达到了48％以上。以上结果表明，本试验筛选的秸秆腐熟菌具有较好的秸秆酵解效果。
3.6.2低温高效酵解秸秆真菌与EM菌配合酵解秸秆试验
在低温条件下，采用真菌Mortierella sp-E3与EM菌配合进行水稻秸秆的酵解试验，在30d的时候，两种处理中，秸秆出现了失重和变黑现象，但是在添加了低温高效酵解秸秆真菌组合中，秸秆失重和变黑的程度更大，测定水稻秸秆的失重率，添加了低温高效酵解秸秆真菌组合的失重率为59％，而只用EM菌菌液的处理，秸秆的失重率为40％，秸秆酵解效果提高了47.5％，并且在秸秆腐熟过程中添加了低温高效酵解秸秆真菌，发酵30d时，秸秆腐烂的程度较好，易于破碎。

Claims (10)

1.一株分离的寒地秸秆腐熟真菌被孢霉(Mortierella sp)菌株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.15188。
2.权利要求1所述的寒地秸秆腐熟真菌被孢霉菌株在酵解水稻秸秆中的应用。
3.权利要求1所述的寒地秸秆腐熟真菌被孢霉菌株在制备秸秆腐熟剂中的应用。
4.权利要求1所述的寒地秸秆腐熟真菌被孢霉菌株在制备水稻秸秆腐熟剂中的应用。
5.权利要求1所述的寒地秸秆腐熟真菌被孢霉菌株在制备寒地水稻秸秆腐熟剂中的应用。
6.一种水稻秸秆腐熟剂，其特征在于，包括：权利要求1所述寒地秸秆腐熟真菌被孢霉菌株的发酵液。
7.一种水稻秸秆腐熟剂，其特征在于，包括：权利要求1所述寒地秸秆腐熟真菌被孢霉菌株的发酵液和EM菌菌液。
8.按照权利要求7所述的水稻秸秆腐熟剂，其特征在于：所述寒地秸秆腐熟真菌被孢霉菌株的发酵液与EM菌菌液按体积比1：1混合。
9.按照权利要求6或7所述的水稻秸秆腐熟剂，其特征在于：所述寒地秸秆腐熟真菌菌株的发酵液的制备包括：将权利要求1所述的寒地秸秆腐熟真菌菌株接种于液体培养基中进行培养，收集菌液，即得。
10.按照权利要求9所述的水稻秸秆腐熟剂，其特征在于：所述液体培养基的氮源为蛋白胨或酵母膏，液体培养基的初始pH值为3-9；按体积百分比计，所述接种的接种量为1-9％；所述培养的温度为10-40℃，培养的时间为3-18d；
优选的，所述液体培养基的氮源为蛋白胨，液体培养基的初始pH值为7；按体积百分比计，所述接种的接种量为5％；所述培养的温度为25℃，培养的时间为9d。
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