ES2636955T3 - Granulado que contiene una enzima y un polímero de (met)acrilato de alquilo - Google Patents

Granulado que contiene una enzima y un polímero de (met)acrilato de alquilo Download PDF

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ES2636955T3 ES15707155.6T ES15707155T ES2636955T3 ES 2636955 T3 ES2636955 T3 ES 2636955T3 ES 15707155 T ES15707155 T ES 15707155T ES 2636955 T3 ES2636955 T3 ES 2636955T3
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Thomas Hüller
Thomas DASSINGER
Oliver Thum
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Evonik Operations GmbH
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Abstract

Granulado que contiene A) al menos una enzima elegida de al menos uno de los grupos elegidos de transferasas de EC 2, hidrolasas de EC 3, liasas de EC 4 e isomerasas de EC 5, B) al menos un polímero elegido de polímero de acrilato de alquilo C1-C10, polímero de metacrilato de alquilo C1-C10 y copolímero de acrilato de alquilo C1-C10-metacrilato de alquilo C1-C10, preferiblemente copolímero de acrilato alquilo C1-C10-metacrilato de alquilo C1-C10 y C) al menos un material de soporte inorgánico.

Description

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DESCRIPCION
Granulado que contiene una enzima y un poftmero de (met)acrilato de alquilo Campo de la invencion
Objeto de la invencion es un granulado que contiene
A) al menos una enzima elegida de al menos uno de los grupos elegidos de transferasas de EC 2, hidrolasas de EC 3, liasas de EC 4 e isomerasas de EC 5,
B) al menos un poftmero elegido de poftmero de acrilato de alquilo C1-C10, poftmero de metacrilato de alquilo C1-C10 y copoftmero de acrilato de alquilo Ci-Cio-metacrilato de alquilo C1-C10, preferiblemente copoftmero de acrilato alquilo C1-C1o-metacrilato de alquilo C1-C10 y
C) al menos un material de soporte inorganico.
Estado de la tecnica
La isomerizacion de sacarosa con ayuda de celulas enteras inmovilizadas, extractos celulares o enzimas purificadas se describe repetidas veces en la bibliograffa (Sudzucker AG, documento DE3038219C2; Mitsui Sugar Co., documento US4386158). En lo que sigue se considera a modo de ejemplo la reaccion enzimatica para dar isomaltulosa, asf como los productos secundarios trehalulosa, glucosa, fructosa y pequenas proporciones de oligosacaridos. El uso de celulas libres activas conduce a costos incrementados de purificacion del producto y a bajos rendimientos (Landbauforschung Volkenrode (2002) SH 241:75-80). Por este motivo, habitualmente tiene lugar una inmovilizacion del material biocatalfticamente activo.
Casi todos los procedimientos de inmovilizacion conocidos se han descrito para la isomerizacion biocatafttica de sacarosa tal como, por ejemplo, la union por adsorcion de material biocatalfticamente activo a intercambiadores de calor (Danisco AS, documento EP0915986B1), la inclusion en diferentes poftmeros sinteticos (Bayer AG, documento DE3416140A1) o poftmeros naturales (Sudzucker AG, documento DE3038219C2; Mitsui Sugar Co., documento US4386158). Una perspectiva de procedimientos de inmovilizacion habituales se recoge en la bibliograffa (Topics in Current Chemistry, Vol. 200:95-126).
Para el proceso indicado se ha establecido, en particular, la inclusion de celulas intactas o bien de caldos de fermentacion no purificados en poftmeros de alginato (Sudzucker AG, documento DE3038219C2; Mitsui Sugar Co., documento US4386158). Los productos inmovilizados se preparan mediante el goteo de una suspension a base de material celular o enzimas purificadas, asf como una disolucion de alginato en una disolucion que contiene iones cloruro de calcio (Bioresource Technology (2009), Vol. 100:4252-4256). En este caso, se muestra desventajoso que los productos inmovilizados producidos de esta manera se compongan en una gran parte de agua. Un almacenamiento o bien una provision puede tener lugar solo en condiciones humedas por este motivo, dado que un secado conduce a danos irreversibles en la estructura del producto inmovilizado. Una provision humeda fomenta una carga con germenes extranos que no puede rebasar los ftmites establecidos segun la disposicion (EG) No. 178 / 2002 sobre contenidos maximos para determinadas contaminaciones en alimentos. Con contaminaciones extranas se ha de contar en el caso de una actividad del agua incrementada (valor aw > 0,65) (vease Schimmelpilze: Vorkommen, Gesundheitsgefahren, Schutzmassnahmen. Wolfgang Mucke, Chirsta Lemmen. 2004. Ecomed Medizin, Verlagsgruppe Huthig Jehle Rehm GmbH). Los productos inmovilizados de alginato se manifiestan, ademas como inestables, en particular bajo la influencia de concentraciones de cationes ya bajas tal como se presentan, p. ej., en disoluciones tamponadas (Focus on Biotechnology, Vol. 8B:375-405). Por este motivo, habitualmente se alcanza una estabilizacion mediante reticulacion adicional utilizando glutaraldetftdo y polietilenimina (Mitsui Sugar Co., documento US4386158; Bioresource Technology (2009), Vol. 100:4252-4256). En este caso, es desventajosa, en particular, una reduccion de la actividad enzimatica mediante el empleo de glutaraldetftdo (Process Biochemistry (2006) Vol. 41:2035-2040). Asimismo desventajosas son aplicaciones incrementadas de desecho (residuos peligrosos segun la Disposicion de la Lista de Residuos (AVV) (situacion 10.12.2001)) mediante el empleo de los reticulantes.
La preparacion de granulados estables frente al secado y biocatalfticamente activos se describe repetidas veces en la bibliograffa. En Lipid Sci. Technol. -2003.-tomo 105.- pags. 318-321 se muestra un proceso para la inmovilizacion de la lipasa B de Candida antarctica para la produccion de esteres, el cual no obstante, en virtud de la eleccion del aglutinante (maltodextrina) no es estable en procesos acuosos. En Novo Nordisk AS, documento WO9522606 se describe el uso del aglutinante polivinilpirrolidona (Kollidon K25, BASF) para la granulacion enzimatica. No obstante, esta combinacion en disoluciones acuosas no es estable. Glatt Ingenieurtechnik GmbH, documento EP1595942A1, describe una preparacion con contenido en microorganismos que es provista subsiguientemente de un revestimiento protector mediante recubrimiento, por ejemplo mediante goma laca, para la estabilizacion. El sentido de este proceso de recubrimiento es proteger a los preparados frente a medios tales como, p. ej., agua u oxfgeno del aire.
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Por lo tanto, este tipo de preparados no son adecuados per se para uso en biotransformaciones en donde se debe alcanzar una intensa transferencia de sustancias entre el medio y el biocatalizador.
Por lo tanto, es mision de la invencion, la provision de nuevos preparados enzimaticos y procedimientos para la preparacion de los mismos que superen al menos uno de los inconvenientes antes mencionados del estado de la tecnica. En particular, la mision es la preparacion de preparados enzimaticos estables al almacenamiento e insensibles a la humedad con una elevada actividad enzimatica aparente y una estabilidad mecanica mejorada.
Descripcion de la invencion
Sorprendentemente, se encontro que mediante el uso de una mezcla a base de un material de soporte inorganico con una superficie preferiblemente hidrofilica tal como, p. ej., acidos silfcicos precipitados, un (co)polfmero de (met)acrilato de alquilo C1-C10, as^ como enzimas y utilizando procesos de granulacion conocidos tales como extrusion, se pueden preparar preparados con una elevada actividad biocatalitica.
Por consiguiente, objeto de la invencion es un granulado que contiene
A) al menos una enzima elegida de al menos uno de los grupos elegidos de transferasas de EC 2, hidrolasas de EC 3, liasas de EC 4 e isomerasas de EC 5,
B) al menos un polfmero elegido de polfmero de acrilato de alquilo C1-C10, polfmero de metacrilato de alquilo C1-C10 y copolfmero de acrilato de alquilo C1-C10-metacrilato de alquilo C1-C10, preferiblemente copolfmero de acrilato alquilo C1-C10-metacrilato de alquilo C1-C10 y
C) al menos un material de soporte inorganico.
Otro objeto de la presente invencion es un procedimiento para la preparacion de los granulados de acuerdo con la invencion.
Una ventaja de la presente invencion es que los granulados son estables al secado. Otra ventaja de la presente invencion es que los granulados son estables al almacenamiento. Todavfa otra ventaja de la presente invencion es que los granulados pueden ser provistos con poca contaminacion.
Otra ventaja de la presente invencion es que los granulados son mecanicamente estables.
Todavfa una ventaja de la presente invencion es que los granulados no requieren sustancias peligrosas para la reticulacion adicional tales como glutaraldetndo o polietilenimina. Otra ventaja de la presente invencion es que los granulados presentan una elevada estabilidad, tambien en medios acuosos.
La presente invencion se describe en lo que sigue a modo de ejemplo, sin que la invencion deba ser limitada a estas formas de realizacion a modo de ejemplo. Los numeros de acceso indicados en relacion con la presente invencion corresponden a las solicitudes del banco de datos ProteinBank de NCBI con fecha de 01.10.2013; por norma general, en la presente memoria el numero de version de la inscripcion se caracteriza por “cifras” tal como, por ejemplo, “1”.
Si en el marco de la presente descripcion se citan documentos, entonces su contenido debe pertenecer por completo al contenido de divulgacion de la presente invencion.
Todos los porcentajes (%) indicados, si no se indica de otro modo, son porcentajes en masa.
El granulado de acuerdo con la invencion es preferiblemente uno solido.
Presenta ventajosamente un tamano medio de partfculas d50 [pm] en el intervalo de 100 a 2000 pm, en particular en el intervalo de 200 a 1500 pm y especialmente en el intervalo de 700 a 1300 pm. El valor de d50 [pm] marca conforme a la definicion el punto en el que la mitad de la cantidad de partfculas investigada es mayor o bien menor. Ademas, el valor d50 y el valor d10 indican el intervalo en el que 10% o bien 90% es menor o igual a este tamano de partfculas. El tamano de partfculas de valor medio d50 [pm], asf como el valor de d10 [pm] y el valor de d90 [pm] del colectivo de partfculas se determinan en este caso con ayuda de un aparato Camsizers® de la razon social Retsch (Haan, Alemania) a traves del procedimiento del analisis dinamico de imagenes bajo la eleccion de ajustes estandares (norma ISO 13322-2:2006). El proceso de medicion aplicado proporciona un analisis detallado del tamano de partfculas de todo el colectivo de partfculas que se representa como funcion de densidad de distribucion. En la funcion de densidad de distribucion, el valor d50 se puede deducir como valor de abscisas del maximo mayor. Preferiblemente, se han de elegir colectivos de partfculas de una distribucion estrecha del tamano de partfculas. Estos se caracterizan porque el valor d10 [pm] del colectivo de partfculas no es menor que 50%, y el d90 [pm] no es mayor que 150% el tamano medio de partfculas d50 [pm].
El granulado de acuerdo con la invencion contiene de manera muy particularmente preferida al menos una enzima elegida de al menos uno de los grupos elegidos de glicosiltransferasas de EC 2.4, fructan-p-fructosidasas de EC 3.2.1.80, p-galactosidasa de EC 3.2.1.23, invertasas de EC 3.2.1.26, aspartato-p-descarboxilasa de EC 4.1.1.11,
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fumarato-hidratasas de EC 4.2.I.2., nitril-hidratasas de EC 4.2.1.84, aspartasas de EC 4.3.1.1, xilosa-isomerasas de EC 5.3.1.5 e isomaltulosa sintasas de EC 5.4.99.11.
El granulado conforme a la invencion contiene de manera muy particularmente preferida al menos una isomaltulosa sintasa de EC 5.4.99.11.
Granulados preferidos conforme a la invencion se caracterizan porque la isomaltulosa sintasa se elige del grupo de las protemas YP_002235756.1, WP_006325065.1, WP_012540141.1, WP_004157672.1, CCO82510.1,
CCO82509.1, CCO78715.1, EKF64560.1, AAP57084.1, AAP57083.1, ACI12079.1 y ACF42098.1, asf como protemas con una secuencia de polipeptidos en la que hasta el 60%, preferiblemente hasta el 25%, de manera particularmente preferida hasta el 15%, en particular hasta el 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% de los restos aminoacido estan modificados frentes a las secuencias de referencia antes mencionadas mediante delecion, insercion, sustitucion o una combinacion de las mismas y los cuales poseen todavfa al menos el 50%, preferiblemente el 65%, de manera particularmente preferida el 80%, en particular mas del 90% de la actividad de la protema con la secuencia de referencia correspondiente antes mencionada, entendiendose por el 100% de actividad de la protema de referencia la cantidad de sustancia de sacarosa que ha reaccionado por unidad de tiempo, referida a la cantidad de enzima de referencia empleada para formar la correspondiente isomaltulosa. La actividad puede determinarse tal como se describe en el Ejemplo 1.
La isomaltulosa sintasa de EC 5.4.99.11 puede estar contenida, conforme a la invencion, en cualquier forma imaginable en los granulados de acuerdo con la invencion, asf como, por ejemplo, en forma de celulas enteras, celulas disgregadas, extractos celulares, o purificada. Conforme a la invencion se prefiere que la isomaltulosa sintasa este contenida en forma de catalizadores de celulas enteras.
Conforme a la invencion se prefiere alternativamente que la isomaltulosa sintasa este contenida en forma de celulas disgregadas.
Catalizadores de celulas enteras adecuados se describen, por ejemplo, en el documento EP 0625578 como Protaminobacter rubrum (en particular CBS 574.77), Serratia plymuthica (en particular ATCC 15928), Serratia marescens (en particular NCIB 8285), Leuconostoc mesenteroides (en particular NRRL-B 512 F, en particular ATCC 1083 a) y Erwinia rhapontici (en particular NCPPB 1578), en el documento EP 0392556 y el documento EP 1257638 como Klebsiella terrigena JCM 1687, Klebsiella sp. No. 88 (FERM BP-2838) y Klebsiella singaporiensis LX3 y LX21 en el documento EP1328647 como Pantoea dispersa UQ68J.
El granulado conforme a la invencion contiene al menos un polfmero elegido de polfmero de acrilato de alquilo C1- C10, polfmero de metacrilato de alquilo C1-C10 y copolfmero de acrilato de alquilo C1-C10-metacrilato de alquilo C1- C10, pudiendo quedar abarcados los mencionados grupos de sustancias por la nomenclatura “(co-)polfmero de (met)acrilato de alquilo C1-C10”. El polfmero contenido ejerce en el granulado de acuerdo con la invencion preferiblemente una funcion como aglutinante.
Granulados preferidos conforme a la invencion se caracterizan porque el polfmero presenta un peso molecular medio ponderal de aproximadamente 100000 a 1500000 g/mol, preferiblemente 500000 a 1000000 g/mol.
El peso molecular medio ponderal se determina mediante cromatograffa de permeacion en gel (GPC). La caracterizacion de las muestras tuvo lugar en tetrahidrofurano como eluyente y frente a poliestireno como patron segun la norma DIN 55672-1.
En polfmeros y copolfmeros de (met)acrilato de alquilo preferiblemente contenidos, el grupo alquilo presenta 1 a 4 atomos de carbono.
Preferiblemente, el granulado conforme a la invencion contiene como polfmero al menos un copolfmero de acrilato de alquilo C1-C10-metacrilato de alquilo C1-C10.
Granulados particularmente preferidos conforme a la invencion se caracterizan porque el polfmero es un copolfmero de acrilato de etilo/metacrilato de metilo o copolfmero de metacrilato de alquilo/acrilato de etilo, siendo particularmente preferido un copolfmero de acrilato de etilo/metacrilato de metilo, en particular poli(acrilatos de etilo- co-metacrilatos de metilo) 2:1.
Copolfmeros de acrilato de etilo/metacrilato de metilo se comercializan, por ejemplo, bajo los nombres comerciales Kollicoat EMM 30D por BASF AG o bajo el nombre comercial Eudragit NE o Eudragit NM de Evonik Industries.
El granulado conforme a la invencion contiene al menos un material de soporte inorganico. Como materiales de soporte adecuados entran en consideracion todos los materiales de soporte inorganicos conocidos por el experto en la materia y adecuados para la preparacion de granulados. Preferiblemente, estos tienen una superficie hidrofilica. Representantes a modo de ejemplo de materiales de soporte de este tipo se describen en Linqiu Cao 2006, Carrier- bound Immobilized Enzymes: Principles, Application and Design, Capftulo 1, Introduccion: Immobilized Enzymes: Past, Present and Prospects; Wiley.
Granulados preferidos conforme a la invencion se caracterizan porque el material de soporte inorganico se elige de acidos silicicos, en particular acidos silicicos precipitados, y silicatos de aluminio, en particular zeolitas, siendo particularmente preferidos acidos silicicos precipitados.
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Como zeolitas pueden emplearse, por ejemplo, zeolita A, zeolita P, zeolita X o mezclas de las mismas. Zeolitas adecuadas abarcan, por ejemplo, productos comerciales tales como Wessalith® (Evonik Industries), Zeolith MAP® (ex Crosfield) o VEGOBON AX® (ex SASOL).
Acidos si^cicos adecuados son comercializados, por ejemplo, por Evonik Industries como Aerosil® o Sipernat®, por ejemplo Sipernat 320.
Acidos silfcicos que se adecuan como cargas se pueden adquirir en el comercio bajo el nombre Aerosil® o Sipernat® (Evonik Industries).
Granulados preferidos conforme a la invencion se caracterizan porque B) referido al granulado total, estan contenidos en una cantidad de 0,1% en peso a 80% en peso, preferiblemente de 1% en peso a 50% en peso, de manera particularmente preferida de 5% en peso a 35% en peso, y C) en una cantidad de 99,5% en peso a 20% en peso, preferiblemente de 99% en peso a 30% en peso, de manera particularmente preferida de 90% en peso a 40% en peso.
Granulados preferidos de acuerdo con la invencion se caracterizan porque estos presentan una actividad espedfica de 1 a 1000 U/g, preferiblemente de 5 a 100 U/g, de manera particularmente preferida de 10 a 40 U/g. La actividad espedfica (U/g) define en este caso la actividad de la sacarosa isomerasa, referido al producto principal (isomaltulosa en pmol) que es formada por minuto bajo condiciones definidas (40% de sacarosa (educto), TA, pH 6, 100 RPM), por parte de 1 g de granulado.
Un procedimiento adecuado para la medicion de la actividad se describe en el Ejemplo 2. La actividad espedfica de los granulados puede controlarse, por ejemplo, mediante el aumento o la reduccion del contenido en isomaltulosa sintasa en el granulado.
Otro objeto de la presente invencion es un procedimiento para la preparacion de un granulado, que comprende las etapas de procedimiento
1) provision de al menos una isomaltulosa sintasa de EC 5.4.99.11, al menos de un polfmero elegido de polfmero de acrilato de alquilo C1-C10, polfmero de metacrilato de alquilo C1-C10 y copolfmero de acrilato de alquilo C1-C10- metacrilato de alquilo C1-C10, preferiblemente copolfmero de acrilato de alquilo C1-C10-metacrilato de alquilo C1-C10, y al menos un material de soporte inorganico,
2) preparacion de una pasta que contiene los componentes de la etapa 1) del procedimiento y
3) granulacion de la pasta.
En la etapa 1) del procedimiento de acuerdo con la invencion se emplean preferiblemente las isomaltulosas sintasas, polfmeros y materiales de soporte que estan preferiblemente contenidos en granulados conforme a la invencion preferidos.
En la etapa 2) del procedimiento de acuerdo con la invencion se homogenefzan los componentes.
Preferiblemente, la pasta en la etapa 2) del procedimiento contiene, referido a la pasta total B) en una cantidad de 0,1% en peso a 80% en peso, preferiblemente de 1% en peso a 50% en peso, de manera particularmente preferida de 5% en peso a 35% en peso y C) en una cantidad de 99,5% en peso a 20% en peso, preferiblemente de 99% en peso a 30% en peso, de manera particularmente preferida de 90% en peso a 40% en peso. Junto a los componentes antes mencionados, la pasta puede contener agua en una cantidad que garantice una homogeneizacion suficiente de los componentes que forman la pasta.
En la etapa 3) del procedimiento, la granulacion puede tener lugar basicamente de manera arbitraria. Por ejemplo, la pasta y eventualmente otros componentes tales como agua, tampon, sales de metales estabilizadoras, se elaboran de manera en si conocida para formar un granulado mediante extrusion, granulacion con mezcladora, granulacion en lecho fluido, aglomeracion en disco, aglomeracion por pulverizacion, granulacion por pulverizacion o compactacion. En una forma de realizacion preferida, la granulacion comprende, en una primera etapa, la extrusion de la pasta con contenido en agua que comprende los componentes A), B) y C) y, eventualmente, otros componentes tales como tampon, sales de metales estabilizadoras. En este caso, el agua esta contenida en una cantidad que garantiza una consistencia suficiente (plastificacion) de la pasta para la extrusion.
La cantidad de agua requerida para ello puede determinarse de manera en si conocida por un experto en la materia en el sector de la formulacion de enzimas. La proporcion de agua en la pasta se encuentra, al comienzo de la granulacion, tfpicamente en el intervalo de 10% en peso a 80% en peso, en particular en el intervalo de 15% en peso a 70% en peso y especialmente en el intervalo de 20% en peso a 60% en peso, referido al peso total de la pasta.
La preparacion de la pasta en esta forma de realizacion preferida tiene lugar en la etapa 2) del procedimiento, de manera en si conocida, mediante mezcladura de los componentes que forman la pasta en un dispositivo mezclador adecuado, por ejemplo en una mezcladora o amasadora habitual. Para ello, el o bien los solidos, p. ej., el material de
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soporte, se mezclan intensamente con una fase l^quida, por ejemplo agua, una disolucion acuosa de aglutinante o un concentrado acuoso enzimatico. Por norma general, el soporte se incorpora en forma de un solido en el mezclador y se mezclara con un concentrado enzimatico acuoso, asf como con el polfmero, preferiblemente en forma de una disolucion acuosa separada, o disuelto en el concentrado enzimatico acuoso, asf como eventualmente, con sal estabilizadora, preferiblemente en forma de una disolucion o suspension acuosa separada, en particular disuelto o suspendido en el concentrado enzimatico acuoso. Eventualmente, se anadira agua adicional para ajustar la consistencia deseada de la pasta.
Preferiblemente, durante la mezcladura a fondo no se rebasara una temperatura de 60°C, en particular de 40°C. De manera particularmente preferida, la temperatura de la pasta durante la mezcladura asciende a 10 a 30°C Eventualmente, por lo tanto, el dispositivo mezclador se enfriara durante la preparacion de la pasta.
La pasta obtenida de esta manera, en esta forma de realizacion preferida en la etapa 3) del procedimiento, se sometera a continuacion a una extrusion, preferiblemente a una extrusion a baja presion. La extrusion, en particular la extrusion a baja presion, tiene lugar por norma general en un aparato en el que la masa (pasta) a extrudir es comprimida a traves de una matriz. El diametro de los agujeros de la matriz determina el diametro de las partfculas y, por norma general, se encuentra en el intervalo de 0,3 a 2 mm y, en particular, en el intervalo de 0,4 a 1,0 mm. Extrusoras adecuadas son, p. ej., extrusoras de cupula o extrusoras de cesta que son comercializadas, entre otros, por razones sociales tales como Caleva, Fitzpatrick o Bepex. En el caso de una consistencia correcta de la masa a granular, resulta en este caso solo un ligero aumento de la temperatura al paso por la matriz (hasta aprox. 20°C). Preferiblemente, la extrusion tiene lugar bajo el control de la temperatura, es decir, la temperatura de la pasta no debena rebasar durante la extrusion una temperatura de 70°C, en particular 60°C. En particular, la temperatura de la pasta durante la extrusion se encuentra en el intervalo de 10 a 40°C.
Los cordones de pasta extrudidos que abandonan la extrusora se rompen en cortas partmulas a modo de granulado o pueden romperse eventualmente con ayuda de dispositivos de corte adecuados. Las partfculas de granulado, obtenidas de esta manera, presentan tfpicamente un tamano de grano homogeneo, es decir, una estrecha granulometna. Ademas, se ha manifestado ventajoso redondear el granulado todavfa humedo antes de llevar a cabo el secado, es decir, de esferonizarle. En este caso, se reduce, en particular, la formacion de porciones de polvo indeseadas en el producto final.
Dispositivos adecuados para el redondeamiento de los granulados humedos son los denominados esferonizadores que presentan esencialmente un disco rotatorio horizontal sobre el que se comprimen a la pared los pequenos cordones a traves de la fuerza centnfuga. Los pequenos cordones se rompen en las micromuescas previamente establecidas por el proceso de extrusion, de modo que forman partfculas cilmdricas con una relacion de diametro a longitud de aproximadamente 1:1,3 a 1:3. Mediante la solicitacion mecanica en el esferonizador, las partmulas cilmdricas se redondean en principio algo.
De este modo se obtiene un granulado con un contenido en agua relativamente elevado que, por norma general, no es mayor que 15% en peso, por ejemplo esta en el intervalo de 15 a 50% en peso, en particular en el intervalo de 20 a 45% en peso, referido al peso total del granulado humedo. Conforme a la invencion, se procedera, por lo tanto, preferiblemente a un secado de manera que su contenido en agua no ascienda a mas de 30% en peso y preferiblemente se encuentre en el intervalo de 1 a 12% en peso, en particular en el intervalo de 3 a 10% en peso y especialmente en el intervalo de 5 a 9% en peso.
La confeccion comprende de manera correspondiente, por norma general, una etapa de secado.
Esta tiene lugar preferiblemente en un secador de lecho fluido. En este caso, un gas preferiblemente calentado, por norma general aire o una corriente de gas nitrogenado, es conducido desde abajo a traves de la capa de producto. La cantidad de gas se ajusta habitualmente de manera que las partmulas sean fluidizadas y se arremolinen. Mediante la transferencia de calor gas/partmula se evapora el agua. Dado que los granulados con contenido en enzimas son por norma general estables a la temperatura, se tendra que tener cuidado de que la temperatura del granulado no ascienda demasiado, es decir, por norma general, a no mas de 80°C y preferiblemente a no mas de 70°C. En particular, la temperatura del granulado se encuentra durante el secado en el intervalo de 10 a 40°C. La temperatura de secado puede controlarse de manera sencilla a traves de la temperatura de la corriente gaseosa. La temperatura de la corriente gaseosa se encuentra tfpicamente en el intervalo de 140 a 40°C y, en particular, en el intervalo de 120 a 60°C. El secado puede tener lugar de manera continua o discontinua.
Despues del secado, el granulado puede fraccionarse todavfa mediante un tamiz. Material tosco y fino puede molerse y devolverse a la mezcladora para el amasado de la masa de granulacion.
En los ejemplos que se recogen en lo que sigue se describe a modo de ejemplo la presente invencion, sin que esta, cuya gama de aplicacion resulta de toda la descripcion y de las reivindicaciones, deba limitarse a las formas de realizacion mencionadas en los ejemplos.
Las siguientes figuras son componente de los Ejemplos:
Figura 1: actividad espedfica (U/g) referida al producto principal (isomaltulosa en pmol) que se forma por minuto, bajo condiciones definidas (40% de sacarosa (educto), TA, pH 6, 100 RPM) mediante 1 g de granulado o mediante un caldo de fermentacion con contenido en P. rubrum, con una biomasa equivalente al granulado.
Figura 2: representacion de la distribucion del tamano de partfculas del preparado conforme a la invencion (no tratado o bien despues de incubacion en un agitador a 400 rPm) como funcion de la densidad de distribucion.
Figura 3: representacion de la distribucion del tamano de partfculas del preparado no de acuerdo con la invencion (no tratado o ben despues de incubacion en un agitador a 400 RPM) como funcion de la densidad de distribucion.
5 Figura 4: representacion de la conversion de sacarosa en fructosa y glucosa.
Ejemplos:
Ejemplo 1: Preparacion de un preparado conforme a la invencion.
100 ml de una dispersion al 30% en peso de un copolfmero de acrilato de etilo/metacrilato de metilo (Eudragit NM, Evonik Industries AG) se homogenefzan en una amasadora con 130 ml de un caldo de fermentacion de P. rubrum al 10 6% en peso de masa seca y 62 g de material de soporte consistente en Sipernat 320 (Evonik Industries AG). La
mezcla homogenea se extrude a continuacion con una extrusora (Extruder 20, Caleva) y se granula con un esferonizador (Spheronizer 250, Caleva).
El granulado obtenido se seca a temperatura ambiente durante la noche y se ajusta una humedad residual de 30% (p/p), determinada mediante balanza para medicion de la humedad.
15 Referido al peso en seco total, las partfculas contienen 30% en peso de copolfmero de acrilato de etilo/metacrilato de metilo, 8% en peso de masa seca de fermentacion y 62% en peso de Sipernat.
Ejemplo 2: Actividad aparente
Determinacion de la actividad aparente del preparado conforme al Ejemplo 1.
La determinacion de la actividad tiene lugar en tres tandas separadas. En este caso, se anaden a un tubito de 20 reaccion de 15 ml en cada caso 1 g de los granulados secados y se cargan con 10 ml de una disolucion de sacarosa al 40% (p/p). La incubacion tiene lugar en un agitador con 100 RPM a TA y un valor del pH de 6. La actividad espedfica U/g se determino despues de un tiempo de incubacion de 120 min mediante la determinacion de la concentracion del producto. Esta se determino con ello en cada caso con ayuda de analttica de HPLC. La actividad espedfica del caldo de fermentacion contenido en P. rubrum se determino analogamente, con una biomasa 25 equivalente contenida en los granulados. Los resultados se representan en la Figura 1.
Ejemplo 3: Estabilidad mecanica
La evaluacion de la estabilidad mecanica del preparado conforme al Ejemplo 1 tiene lugar mediante la determinacion del valor d10 [pm], d50 [pm] asf como del valor d90 [pm] de la distribucion del tamano de partfculas a partir de la funcion de densidad de distribucion. Esta se determino opticamente bajo condiciones estandares con ayuda de un 30 aparato Camsizers de Retsch. La determinacion de la distribucion del tamano de partfculas tiene lugar de manera no tratada, asf como despues de 30 o bien 60 minutos de incubacion en un recipiente de reaccion de 50 ml, en cada caso con 25 g de granulado y 25 g de medio en un agitador (400 rpm) en medio y subsiguiente secado. En particular, mediante el valor d10 [pm] casi no modificado, el cual se puede deducir de la funcion de densidad de distribucion, resulta claro que el preparado es estable y no se forman fragmentos de partfculas. Segun ello, el 10% 35 de las partfculas del colectivo de partfculas antes de la incubacion tiene un diametro menor que 881 pm y despues de 60 minutos de incubacion, un diametro menor que 866 pm.
Distribucion del tamano de particulas - preparado conforme a la invencion
Preparado conforme a la invencion
d10 rpml d50 rpml d90 [pm]
Muestra 1
en medio - 0 min 881 1017 1267
Muestra 2
en medio - 30 min agitador, 400 RPM 818 980 1160
Muestra 3
en medio - 60 min agitador, 400 RPM 866 983 1183
Ejemplo 4: Preparacion de un preparado conforme a la invencion que contiene Saccharomyces cerevisiae con la 40 enzima invertasa (EC 3.2.1.26)
La preparacion del preparado tiene lugar conforme al Ejemplo 1, utilizandose en su lugar como componente biocatalttico activo 130 ml de una suspension al 6% en peso de masa seca de Saccharomyces cerevisiae usual en el comercio. Las celulas enteras de Saccharomyces cerevisiae contienen, entre otros, la enzima invertasa (EC 3.2.1.26) del grupo de las hidrolasas de EC 3, que disocia hidrolfticamente sacarosa en fructosa y glucosa. Para 45 investigar la actividad aparente, el preparado se anadio a un reactor de lecho fijo que dispone de tabiques laterales para la toma de muestras. Como educto se utilizo una disolucion de sacarosa al 40% (p/p), que se ajusto a un valor
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del pH de 6. La alimentacion del educto tuvo lugar con una LHSV [h-1] de 0,2, la cual se forma por el cociente a base del caudal [m3/h] y el volumen de catalizador [m3] utilizado. Con el fin de alcanzar el estado estacionario en el reactor de lecho fijo, la toma de muestras tuvo lugar tras una fase de alimentacion de 72 h. Dado que la toma de muestras tuvo lugar a lo largo de la longitud del reactor, la conversion del educto se puede vigilar a traves de la 5 longitud adimensional del reactor x/X [-]. La composicion de la muestra se determino en cada caso con ayuda de analftica de HPLC. Los resultados estan representados en la Figura 4.
Ejemplo Comparativo 1 (no de acuerdo con la invencion): Preparacion de un preparado no de acuerdo con la invencion.
Preparacion de un preparado conforme al documento WO95/22606 (Novo Nordisk A/S): Method for production of an 10 immobilized enzyme preparation and use of the immobilized enzyme preparation.
65 g de Celkate T-21 se anadieron en forma de polvo a una mezcladora de alta velocidad. Para ello, se aportaron al polvo de forma continua y con el propulsor en funcionamiento 25 g de caldo de fermentacion lfquido que contema sacarosa isomerasa. A continuacion, se anaden otros 50 g de caldo de fermentacion lfquido que contema sacarosa isomerasa mezclado con polivinilpirrolidona Kollidon K25 al 3% (p/p) (BASF). El granulado resultante se seco 15 durante la noche a temperatura ambiente y se tamizo. El contenido en humedad residual se ajusta a 10%.
Ejemplo Comparativo 2 (no de acuerdo con la invencion): Estabilidad mecanica
Determinacion de la estabilidad mecanica del preparado conforme al Ejemplo Comparativo 1. La medicion tuvo lugar analogamente al Ejemplo 1. Los resultados estan representados en la Figura 3. El claro desplazamiento del valor d10 [pm] demuestra que antes de la incubacion el 10% del colectivo de partfculas es menor que 784 pm y despues 20 de la incubacion es menor que 389 pm. Esto explica el que el preparado no de acuerdo con la invencion se descomponga en pequenos fragmentos de partfculas mediante la solicitacion mecanica en el agitador.
Preparado no conforme a la invencion
d10 rpml d50 rpml d90 [pm]
Muestra 1
en medio - 0 min 784 1024 1355
Muestra 2
en medio - 30 min agitador, 400 RPM 695 1004 1290
Muestra 3
en medio - 60 min agitador, 400 RPM 389 874 1092

Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Granulado que contiene
    A) al menos una enzima elegida de al menos uno de los grupos elegidos de transferasas de EC 2, hidrolasas de EC 3, liasas de EC 4 e isomerasas de EC 5,
    B) al menos un polfmero elegido de polfmero de acrilato de alquilo C1-C10, poUmero de metacrilato de alquilo C1-C10 y copoKmero de acrilato de alquilo Ci-Cio-metacrilato de alquilo C1-C10, preferiblemente copoUmero de acrilato alquilo C1-C1o-metacrilato de alquilo C1-C10 y
    C) al menos un material de soporte inorganico.
  2. 2. Granulado segun la reivindicacion 1, caracterizado por que al menos una enzima se elige de al menos uno de los grupos elegidos de glicosiltransferasas de EC 2.4, fructan-p-fructosidasas de EC 3.2.1.80, p-galactosidasa de EC 3.2.1.23, invertasas de EC 3.2.1.26, aspartato-p-descarboxilasa de EC 4.1.1.11, fumarato-hidratasas de EC 4.2.1.2., nitril-hidratasas de EC 4.2.1.84, aspartasas de EC 4.3.1.1, xilosa-isomerasas de EC 5.3.1.5 e isomaltulosa sintasas de EC 5.4.99.11.
  3. 3. Granulado segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que la isomaltulosa sintasa se elige del grupo
    YP_002235756.1, WP_006325065.1, WP_012540141.1, WP_004157672.1, CCO82510.1, CCO82509.1,
    CCO78715.1, EKF64560.1, AAP57084.1, AAP57083.1, ACI12079.1 y ACF42098.1, asf como protemas con una secuencia de polipeptidos en la que hasta el 60% de los restos aminoacido estan modificados frentes a las secuencias de referencia antes mencionadas mediante delecion, insercion, sustitucion o una combinacion de las mismas.
  4. 4. Granulado segun al menos una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la isomaltulosa sintasa esta contenida en forma de catalizadores de celulas enteras o en forma de celulas disgregadas.
  5. 5. Granulado segun al menos una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el polfmero presenta un peso molecular medio ponderal de aproximadamente 100000 a 1500000 g/mol, preferiblemente 500000 a 1000000 g/mol.
  6. 6. Granulado segun al menos una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el polfmero es un copolfmero de acrilato de etilo/metacrilato de metilo, preferiblemente poli(acrilatos de etilo-co-metacrilatos de metilo) 2:1.
  7. 7. Granulado segun al menos una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el material de soporte inorganico se elige de acidos silicicos, en particular acidos silfcicos precipitados, y silicatos de aluminio, en particular zeolitas, siendo particularmente preferidos acidos silfcicos precipitados.
  8. 8. Granulado segun al menos una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que referido al granulado total B) esta contenido en una cantidad de 0,1% en peso a 80% en peso, y C) en una cantidad de 20% en peso a 95% en peso.
  9. 9. Granulado segun al menos una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que presenta una actividad espedfica de 1 a 1000 U, referido al peso del granulado total.
  10. 10. Procedimiento para la preparacion de un granulado, que comprende las etapas de procedimiento
    1) provision de al menos una isomaltulosa sintasa de EC 5.4.99.11, al menos un polfmero elegido de polfmero de acrilato de alquilo C1-C10, polfmero de metacrilato de alquilo C1-C10 y copolfmero de acrilato de alquilo C1-C10- metacrilato de alquilo C1-C10, preferiblemente copolfmero de acrilato de alquilo C1-C10-metacrilato de alquilo C1-C10, y al menos un material de soporte inorganico,
    2) preparacion de una pasta que contiene los componentes de la etapa 1) del procedimiento y
    3) granulacion de la pasta.
  11. 11. Procedimiento segun la reivindicacion 10, caracterizado por que en la etapa 3) del procedimiento, la granulacion tiene lugar mediante extrusion, granulacion con mezcladora, granulacion en lecho fluido, aglomeracion en disco, aglomeracion por pulverizacion, granulacion por pulverizacion o compactacion.
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