BR112016020207B1 - Grânulos que compreendem isomaltulose sintase - Google Patents

Abstract

GRÂNULOS QUE COMPREENDEM ISOMALTULOSE SINTASE. A invenção proporciona grânulos que compreendem A) pelo menos uma enzima selecionada entre pelo menos um dos grupos selecionados entre transferases de EC 2, hidrolases de EC 3, liases de EC 4 e isomerases de EC 5, B) pelo menos um polímero selecionado entre polímero de acrilato de alquilo(C1-C10), polímero de metacrilato de alquilo(C1-C10) e copolímero de acrilato de alquilo(C1-C10)-metacrilato de alquilo(C1-C10) e, de preferência, copolímero de acrilato de alquilo(C1-C10)-metacrilato de alquilo(C1- C10) e C) pelo menos um veículo em material inorgânico.

Description

[001] Campo da invenção

[002] A invenção proporciona grânulos que compreendem A) pelo menos uma enzima selecionada entre pelo menos um dos grupos selecionados entre transferases de EC 2, hidrolases de EC 3, liases de EC 4 e isomerases de EC 5, B) pelo menos um polímero selecionado entre polímero de acrilato de alquilo(C1-C10), polímero de metacrilato de alquilo(C1-C10) e copolímero de acrilato de alquilo(C1-C10)-metacrilato de alquilo(C1-C10) e, de preferência, copolímero de acrilato de alquilo(C1-C10)-metacrilato de alquilo(C1-C10) e C) pelo menos um veículo em material inorgânico.

[003] Estado da técnica

[004] A isomerização de sacarose com o auxílio de células completas imobilizadas, extratos de células ou enzimas purificadas encontra-se descrita na literatura (Südzucker AG, DE3038219C2; Mitsui Sugar Co., US4386158). A título de exemplo, a reação enzimática para isomaltulose e também os produtos secundários tre-halulose, glicose, frutose e pequenas fracções de oligossacarídeos é a seguir considerada. A utilização de células livres ativas dá origem a custos aumentados de purificação de produtos e a rendimentos mais reduzidos (Landbauforschung Volkenrode (2002) SH 241: 75-80). Por esta razão, tem normalmente lugar uma imobilização do material biocataliticamente ativo.

[005] Virtualmente todos os métodos de imobilização conhecidos são descritos para a isomerização biocatalítica de sacarose, tais como por exemplo, a ligação adsortiva de material biocataliticamente ativo para permutadores de íons (Danisco AS, EP0915986B1), a inclusão em vários polímeros sintéticos (Bayer AG, DE3416140A1) ou polímeros naturais (Südzucker AG, DE3038219C2; Mitsui Sugar Co., US4386158). Uma revisão sobre métodos de imobilização convencionais é apresentada na literatura (Topics in Current Chemistry, Vol. 200: 95-126).

[006] Para o processo referido, foi estabelecido, em particular, a inclusão de células intactas ou licores de fermentação não purificados em polímeros de alginato (Südzucker AG, DE3038219C2; Mitsui Sugar Co., US4386158). Os imobilizados são produzidos por meio de uma adição gota a gota de uma suspensão de material celular ou de enzimas purificadas e uma solução de alginato a uma solução que compreende íons de cloreto de cálcio (Bioresource Technology (2009), Vol.100: 4252-4256). Uma desvantagem deste processo consiste no facto dos imobilizados produzidos deste modo serem constituídos numa grande parte de água. Por esta razão, o armazenamento ou a manutenção apenas pode ter lugar sob condições húmidas, já que a secagem dá origem a danos irreversíveis na estrutura de imobilizado. A manutenção de condições húmidas promove a contaminação com germes exógenos, os quais não deverão exceder os limites estipulados de acordo com a Regulação (EG) No. 178 / 2002, a qual diz respeito aos teores máximos de determinadas contaminações em alimentos. A contaminação exógena está associada a uma atividade aumentada em água (valor de aw > 0,65) (ver, Schimmelpilze: Vorkommen, Gesundheitsgefahren, Schutzmassnahmen. Wolfgang Mücke, Christa Lemmen. 2004. Ecomed Medizin, Verlagsgruppe Hüthig Jehle Rehm GmbH). Além disso, os imobilizados de alginato demonstraram ser instáveis, em particular, sob a influência de concentrações, mesmo pequenas, de cátions, tais como os presentes, v.g., em soluções tamponadas (Focus on Biotechnology, Vol.8B: 375-405). Por esta razão, uma estabilização por reticulação suplementar é normalmente alcançada utilizando glutaraldeído e polietilenoimina (Mitsui Sugar Co., US4386158; Bioresource Technology (2009), Vol.100: 4252-4256). Neste caso em particular, uma desvantagem consiste na redução da atividade da enzima como resultado da utilização de glutaraldeído (Process Biochemistry (2006) Vol.41: 2035-2040). Também são desvantajosos os custos aumentados com a remoção de resíduos (resíduos nocivos de acordo com Waste Classification Ordinance (AVV) (tal como a 10.12.2001) ), como resultado da utilização de reticuladores.

[007] A produção de grânulos biocataliticamente ativos, estáveis à secagem, é amplamente descrita na literatura. Lipid Sci. Technol. - 2003 - Vol. 105. - págs. 318-321 descreve um processo para a imobilização de Lipase B de Candida antarctica para a produção de éster, embora esta não seja estável em processos aquosos devido à seleção do aglutinante (maltodextrina). Novo Nordisk AS, WO9522606 descreve a utilização do aglutinante polivinilpirrolidona (Kollidon K25, BASF) para a granulação de enzimas. No entanto, esta combinação não é estável em soluções aquosas.

[008] Glatt Ingenieurtechnik GmbH, EP1595942A1, descreve uma preparação que contém microrganismos, à qual é subsequentemente proporcionado um revestimento protetor, por exemplo, por shellac, com o propósito de estabilização. O propósito deste processo de revestimento consiste em proteger contra o meio, tal como, v.g., água ou oxigénio atmosférico. Consequentemente, tais preparações são, per se, inadequadas para utilização em biotransformações em que tenha que ser alcançada uma transferência de massa intensiva entre o meio e o biocatalisador.

[009] Assim sendo, o objeto da invenção consiste em proporcionar novos tipos de preparações de enzimas e processos para a produção dos mesmos que ultrapassem pelo menos uma das desvantagens supramencionadas da técnica anterior. Em particular, o objeto consiste na produção de preparações de enzimas insensíveis à humidade e estáveis durante o armazenamento com uma atividade enzimática aparente elevada e uma estabilidade mecânica melhorada.

[010] Descrição da invenção

[011] De um modo surpreendente, concluiu-se que por meio da utilização de uma mistura de um veículo em material inorgânico, de preferência, com uma superfície hidrofílica, tal como, v.g., sílicas precipitadas, um (co)polímero de (met)acrilato de alquilo(C1-C10), e enzimas, é possível produzir preparações de enzimas com uma atividade biocatalítica elevada, utilizando processos de granulação conhecidos, tais como extrusão.

[012] Consequentemente, a invenção proporciona grânulos que compreendem 1) pelo menos uma enzima selecionada entre pelo menos um dos grupos selecionados entre transferases de EC 2, hidrolases de EC 3, liases de EC 4 e isomerases de EC 5, 8) pelo menos um polímero selecionado entre polímero de acrilato de alquilo(C1-C10), polímero de metacrilato de alquilo(C1-C10) e copolímero de acrilato de alquilo(C1-C10)-metacrilato de alquilo(C1-C10) e, de preferência, copolímero de acrilato de alquilo(C1-C10)-metacrilato de alquilo(C1-C10) e 9) pelo menos um veículo em material inorgânico.

[013] A presente invenção proporciona ainda um processo para a produção dos grânulos de acordo com a invenção.

[014] Uma vantagem da presente invenção consiste no facto dos grânulos serem estáveis a secagem.

[015] Outra vantagem da presente invenção consiste no facto dos grânulos serem estáveis ao armazenamento.

[016] Ainda outra vantagem da presente invenção consiste no facto dos grânulos poderem ser mantidos com uma contaminação baixa.

[017] Outra vantagem da presente invenção consiste no facto dos grânulos serem estáveis sob o ponto de vista mecânico.

[018] Ainda outra vantagem da presente invenção consiste no facto dos grânulos não requererem substâncias nocivas para reticulação adicional, tais como glutaraldeído ou polietilenoimina.

[019] Outra vantagem da presente invenção consiste no facto dos grânulos apresentarem uma estabilidade elevada, mesmo em meios aquosos.

[020] A seguir, a presente invenção é aqui descrita por meio de exemplos, sem, no entanto, limitar a invenção as tais variantes ilustrativas.

[021] Os números de adesão apresentados no contexto da presente invenção correspondem a entradas na base de dados de proteínas da NCBI à data de 01.10.2013; de um modo geral, no presente caso, o número da versão da entrada é identificado por “.número”, tal como, por exemplo, “.1”.

[022] No caso de documentos serem citados no contexto da presente descrição, então é aqui pretendido que a totalidade do seu conteúdo fala parte do conteúdo da descrição da presente invenção.

[023] Salvo quando indicado de outro modo, todas as percentagens (%) apresentadas são percentagens em peso.

[024] De preferência, os grânulos de acordo com a invenção são sólidos.

[025] De um modo vantajoso, possuem um tamanho de partículas de valor médio d50 [μm] compreendido entre 100 e 2000 μm, em particular, compreendido entre 200 e 1500 μm e, especificamente, compreendido entre 700 e 1300 μm. De acordo com a definição, o valor d50 [μm] marca o ponto no qual a metade da quantidade de partículas investigada é superior ou inferior. Além disso, os valores d10 e d90 proporcionam o intervalo para o qual 10% ou 90%, respectivamente, são inferiores ou iguais a este tamanho de partículas. O tamanho de partículas de valor médio d50 [μm], bem como os valores d10 [μm] e d90 [μm] do conjunto de partículas, são aqui determinados com o auxílio de um Camsizer® da Retsch (Haan, Alemanha) ar do método de análise dinâmica de imagens com a seleção de parâmetros padrão (ISO 13322-2: 2006). O método de medição utilizado produz uma análise detalhado do tamanho de partículas do conjunto global de partículas, o qual é apresentada como uma função de distribuição de densidade. Na função de distribuição de densidade, o valor d50 é o valor da abcissa do máximo mais elevado.

[026] De preferência, deverá ser selecionado um conjunto de partículas com uma distribuição do tamanho de partículas estreita. Estes são caracterizados pelo facto do valor d10 [μm] do conjunto de partículas não ser inferior a 50% e pelo facto do valor d90 [μm] não ser superior a 150% do tamanho de partículas de valor médio d50 [μm].

[027] Ainda mais preferencialmente, os grânulos de acordo com a invenção compreendem pelo menos uma enzima selecionada entre pelo menos um dos conjuntos selecionados entre glicosiltransferases de EC 2.4, fructano β-fructosidases de EC 3.2.1.80, β-galactosidase de EC 3.2.1.23, invertases de EC 3.2.1.26, aspartato β-decarboxilase de EC 4.1.1.11, fumarato hidratases de EC 4.2.1.2, nitrilo hidratases de EC 4.2.1.84, aspartases de EC 4.3.1.1, xilose isomerases de EC 5.3.1.5 e isomaltulose sintases de EC 5.4.99.11.

[028] Ainda mais preferencialmente, os grânulos de acordo com a invenção compreendem pelo menos uma isomaltulose sintase de EC 5.4.99.11.

[029] Os grânulos preferidos de acordo com a invenção são caracterizados pelo facto da isomaltulose sintase ser selecionada entre o conjunto constituído pelas proteínas YP_002235756.1, WP_006325065.1, WP_012540141.1, WP_004157672.1, CCO82510.1, CCO82509.1, CCO78715.1, EKF64560.1, AAP57084.1, AAP57083.1, ACI12079.1 e ACF42098.1, e também proteínas com uma sequência de polipeptídeos na qual até 60%, de preferência, até 25%, mais preferencialmente, até 15% e, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são trocados em comparação com as sequências de referência supramencionadas por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação, e que possuem pelo menos 50%, de preferência, 65%, mais preferencialmente, 80% e, em particular, mais de 90% da atividade da proteína com a sequência de referência correspondente supramencionada, em que 100% de atividade da proteína de referência é entendido como significando a quantidade de material de sacarose que reage por unidade de tempo, com base na quantidade de enzima de referência utilizada, para a isomaltulose correspondente. A atividade pode ser determinada conforme descrito no exemplo 1.

[030] De acordo com a invenção, a isomaltulose sintase de EC 5.4.99.11 pode estar presente em qualquer forma concebível nos grânulos de acordo com a invenção, tal como, por exemplo, sob a forma de células completas, células desreguladas, extratos de células ou células purificadas.

[031] De acordo com a invenção, é preferido que a isomaltulose sintase esteja presente sob a forma de catalisadores de células completas.

[032] Em alternativa, de acordo com a invenção, é preferido que a isomaltulose sintase esteja presente sob a forma de células desreguladas.

[033] Os catalisadores de células completas adequados encontram-se descritos, por exemplo, no documento EP 0625578 como Protaminobacter rubrum (em particular, CBS 574.77), Serratia plymuthica (em particular, ATCC 15928), Serratia marescens (em particular, NCIB 8285), Leuconostoc mesenteroides (em particular, NRRL-B 512 F, em particular, ATCC 1083 a) e Erwinia rhapontici (em particular, NCPPB 1578), nos documentos EP 0392556 e EP1257638 como Klebsiella terrigena JCM 1687, Klebsiella sp. n°. 88 (FERM BP-2838) e Klebsiella singaporiensis LX3 e LX21 e no documento EP1328647 como Pantoea dispersa UQ68J.

[034] Os grânulos de acordo com a invenção compreendem pelo menos um polímero selecionado entre polímero de acrilato de alquilo(C1-C10), polímero de metacrilato de alquilo(C1-C10) e copolímero de acrilato de alquilo(C1-C10) - metacrilato de alquilo(C1-C10), em que os grupos supramencionados de substâncias podem ser abrangidos pela nomenclatura “(co)polímero de (met)acrilato de alquilo(C1-C10)”. De preferência, o polímero presente exerce uma função como aglutinante nos aglutinantes de acordo com a invenção.

[035] De acordo com a invenção, os grânulos preferidos são caracterizados pelo facto do polímero ter um peso molecular médio em massa compreendido entre cerca de 100000 e 1500000 g/mol e, de preferência, entre 500000 e 1000000 g/mol.

[036] O peso molecular médio em massa é determinado por cromatografia de permeação em gel (GPC). As amostras foram caracterizadas em tetra- hidrofurano como eluente e contra poliestireno como padrão de acordo com a norma DIN 55672-1.

[037] Nos polímeros e copolímeros de (met)acrilato de alquilo presentes preferíveis, o grupo alquilo tem entre 1 e 4 átomos de carbono.

[038] De preferência, os grânulos de acordo com a invenção, compreendem, enquanto polímero, pelo menos um copolímero de acrilato de alquilo(C1-C10)-(met)acrilato de alquilo(C1-C10).

[039] Mais preferencialmente, os grânulos de acordo com a invenção são caracterizados pelo facto do polímero ser um copolímero de acrilato de etilo/metacrilato de metilo ou um copolímero de acrilato de metilo/acrilato de etilo, em que o copolímero de acrilato de etilo/metacrilato de metilo, em particular, poli(acrilato de etilo-co-metacrilato de metilo) a 2:1, é particularmente preferido.

[040] Os copolímeros de acrilato de etilo/metacrilato de metilo são comercializados, por exemplo, sob a designação comercial Kollicoat EMM 30D da BASF AG ou sob a designação comercial Eudragit NE ou Eudragit NM da Evonik Industries.

[041] Os grânulos de acordo com a invenção compreendem pelo menos um veículo em material inorgânico.

[042] Como materiais veículo adequados contemplados refere-se todos os materiais veículo inorgânicos adequados para a produção de grânulos e conhecidos pelos especialistas na matéria. De preferência, estes possuem uma superfície hidrofílica. Exemplos ilustrativos de tais materiais veículo encontram- se descritos em Linqiu Cao, 2006; Carrier-bound Immobilized Enzymes: Principles, Application and Design, Chapter 1. Introduction: Immobilized Enzymes: Past, Present and Prospects; Wiley.

[043] Os grânulos preferidos de acordo com a invenção são caracterizados pelo facto do veículo em material inerte ser selecionado entre sílicas, em particular, sílicas precipitadas, e silicatos de alumínio, em particular, zeólitos, sendo particularmente preferidas as sílicas precipitadas.

[044] Como zeólitos que é possível utilizar refere-se, por exemplo, zeólito A, zeólito P, zeólito X ou suas misturas. Como zeólitos adequados refere-se, por exemplo, produtos comerciais tais como Wessalith® (Evonik Industries), Zeolith MAP® (ex Crosfield) ou VEGOBOND AX® (ex SASOL).

[045] As sílicas adequadas são comercializadas, por exemplo, pela Evonik Industries como Aerosil® ou Sipernat®, por exemplo, Sipernat 320.

[046] As sílicas que são adequadas como cargas encontram-se comercialmente disponíveis sob a designação comercial Aerosil® ou Sipernat® (Evonik Industries).

[047] Os grânulos preferidos de acordo com a invenção são caracterizados pelo facto de B) estar presente, com base nos grânulos totais, numa quantidade compreendida entre 0,1% em peso e 80% em peso, de preferência, entre 1% em peso e 50% em peso e, mais preferencialmente, entre 5% em peso e 35% em peso, e pelo facto de C) estar presente numa quantidade compreendida entre 99,5% em peso e 20% em peso, de preferência, entre 99% em peso e 30% em peso e, mais preferencialmente, entre 90% e peso e 40% em peso.

[048] Os grânulos preferidos de acordo com a invenção são caracterizados pelo facto destes terem uma atividade específica compreendida entre 1 e 1000 U/g, de preferência, entre 5 e 100 U/g e, mais preferencialmente, entre 10 e 40 U/g. Aqui, a atividade específica (U/g) define a atividade da sacarose isomerase, com base no produto principal (isomaltulose em μmol), que é formada por 1 g de grânulos por minuto sob condições definidas (40% de sacarose (material de partida), TA, pH 6, 100 r.p.m.).

[049] Um método adequado para a medição da atividade encontra-se descrito no exemplo 2.

[050] A atividade específica dos grânulos pode ser controlada, por exemplo, aumentando ou reduzindo o teor de isomaltulose sintase nos grânulos.

[051] A presente invenção proporciona ainda um processo para a produção de grânulos, o qual compreende os passos de processo 10) provisão de pelo menos uma isomaltulose sintase de EC 5.4.99.11, pelo menos um polímero selecionado entre polímero de acrilato de alquilo(C1- C10), polímero de metacrilato de alquilo(C1-C10) e copolímero de acrilato de alquilo(C1-C10)-metacrilato de alquilo(C1-C10), de preferência, copolímero de acrilato de alquilo(C1-C10)- metacrilato de alquilo(C1-C10), e pelo menos um veículo em material inorgânico, 11) produção de uma pasta que contém os componentes do passo 1) de processo e 12) granulação da pasta.

[052] No passo 1) de processo de acordo com a invenção, é preferida a utilização de isomaltulose sintases, polímeros e materiais veículo que estejam, de preferência, presentes nos grânulos preferidos de acordo com a invenção.

[053] No passo 2) de processo de acordo com a invenção, os componentes são homogeneizados.

[054] De preferência, a pasta no passo 2) de processo compreende, com base na pasta total, B) numa quantidade compreendida entre 0,1% em peso e 80% em peso, de preferência, entre 1% em peso e 50% em peso e, mais preferencialmente, entre 5% em peso e 35% em peso, e C) numa quantidade compreendida entre 99,5% em peso e 20% em peso, de preferência, entre 99% em peso e 30% em peso e, mais preferencialmente, entre 90% em peso e 40$ em peso. Para além dos constituintes supramencionados, a pasta pode compreender água numa quantidade que garanta uma homogeneização adequada dos constituintes que formam a pasta.

[055] No passo 3) de processo, a granulação pode, em princípio, ser efetuada de um modo qualquer desejado. Por exemplo, a pasta e, facultativamente, mais componentes, tais como a água, tampões, sais de metais estabilizadores, podem ser processados para se obter grânulos por meio de extrusão, granulação numa misturadora, granulação em leito fluidificado, aglomeração numa misturadora com mandíbulas, aglomeração por pulverização, granulação por pulverização ou compactação, de um modo conhecido per se.

[056] De acordo com uma variante preferida, num primeiro passo, a granulação compreende a extrusão da pasta que contém água, a qual compreende os componentes A), B) e C) e, facultativamente, outros componentes, tais como tampões, sais metálicos estabilizadores. Aqui, a água está presente numa quantidade que garante uma consistência adequada (plastificação) da pasta para extrusão.

[057] A quantidade de água necessária para este propósito pode ser determinada de um modo conhecido per se por um especialista na matéria de formulação de enzimas. A fracção em água na pasta no início da granulação está compreendida, tipicamente, entre 10% em peso e 80% em peso, em particular, está compreendida entre 15% em peso e 70% em peso e, especificamente, está compreendida entre 20% em peso e 60% em peso, com base no peso total da pasta.

[058] A produção da pasta nesta variante preferida é efetuada no passo 2) de processo de um modo conhecido per se, por mistura dos constituintes que formam a pasta num dispositivo de mistura adequado, por exemplo, numa misturadora ou amassadeira convencional. Para este propósito, o sólido ou sólidos, v.g., o veículo em material, são misturados intensivamente com uma fase líquida, por exemplo, água, uma solução aquosa de aglutinante ou um concentrado de enzima aquoso. Como regra, o veículo é introduzido na misturadora sob a forma de um sólido e misturado com um concentrado de enzima aquoso e também com o polímero, de preferência, sob a forma de uma solução aquosa em separado ou dissolvido no concentrado de enzima aquoso, e também, facultativamente, com um sal de estabilização, de preferência, sob a forma de uma solução ou suspensão aquosa em separado, em particular, dissolvido ou em suspensão no concentrado de enzima aquoso. Facultativamente, é adicionada mais água para se estabelecer a consistência desejada da pasta.

[059] De preferência, durante a mistura, não é excedida uma temperatura de 60°C e, em particular, de 40°C. Mais preferencialmente, a temperatura da pasta é de 10°C a 30°C durante a mistura. Facultativamente, o dispositivo de mistura será então submetido a arrefecimento durante a produção da pasta.

[060] De acordo com esta variante preferida, no passo 3) de processo, a pasta obtida deste modo é então submetida a uma extrusão, de preferência, uma extrusão a pressão baixa. A extrusão, em particular, a extrusão a pressão baixa, é efetuada normalmente num aparelho em que a massa que se pretende submeter à extrusão (pasta) é submetida a compressão através de uma fieira. O diâmetro do orifício da fieira determina o diâmetro das partículas e está normalmente compreendido entre 0,3 e 2 mm e, em particular, compreendido entre 0,4 e 1,0 mm. Como extrusoras adequadas refere-se, v.g., extrusoras de campânula ou extrusoras de cesto, as quais são comercializadas, inter alia, por empresas tais como Caleva, Fitzpatrick ou Bepex. Caso a consistência da massa que se pretende granular seja a correta, então observa-se apenas um ligeiro aumento de temperatura à medida que passa pela fieira (até cerca de 20°C). De preferência, a extrusão é efetuada com controlo de temperatura, v.g., a temperatura da pasta não deve exceder uma temperatura de 70°C e, em particular, 60°C, durante a extrusão. Em particular, a temperatura da pasta durante a extrusão está compreendida entre 10°C e 40°C.

[061] Os fios de pasta extrudida que saem da extrusora partem-se em pequenas partículas semelhantes a grânulos ou podem, de igual modo, ser partidos com o auxílio de dispositivos de corte adequados. As partículas de grânulos obtidas deste modo apresentam, tipicamente, um tamanho de grão homogéneo, isto é, uma distribuição de tamanho do grão estreita.

[062] Além do mais, demonstrou-se ser vantajoso arredondar, isto é, transformar em esferas, os grânulos ainda molhados antes de serem submetidos a secagem. Em particular, tal reduz a formação de partículas de pó indesejadas no produto final.

[063] Os dispositivos adequados para arredondar os grânulos húmidos são designados aparelhos formadores de esferas (em inglês spheronizers), que possuem essencialmente um disco com rotação horizontal sobre os quais os extrudados são comprimidos como resultado da força centrífuga sobre a parede. Os extrudados partem-se nos micro-entalhes pré-fornecidos pelo processo de extrusão, tais partículas cilíndricas com uma proporção entre diâmetro e comprimento de 1:1,3 a 1:3 são formadas. Como resultado da carga mecânica no spheronizer, as partículas inicialmente cilíndricas assumem uma forma arredondada.

[064] Deste modo, os grânulos são obtidos com um teor em água comparativamente elevado, o qual é geralmente superior a 15% em peso, por exemplo, no intervalo compreendido entre 15% e 50% em peso, em particular, no intervalo compreendido entre 20% em peso e 45% em peso, com base no peso total dos grânulos húmidos. De acordo com a invenção, estes são assim preferencialmente secos de um modo tal que o seu teor em água não seja superior a 30% em peso e esteja, de preferência, compreendido entre 1% e 12% em peso, em particular, compreendido entre 3% e 10% em peso e, especificamente, compreendido entre 5% e 9% em peso.

[065] Assim sendo, a produção compreende normalmente um passo de secagem. Tal, tem preferencialmente lugar num secador de leito fluidificado. Aqui, de preferência, faz-se passar um gás aquecido, como regra, ar ou uma corrente de azoto, através da camada de produto vindo de baixo. A quantidade de gás é normalmente ajustada de um modo tal que as partículas sejam fluidificadas e envolvidas num turbilhão. Como resultado da transição térmica gás/partícula, a água é evaporada. Uma vez que os grânulos que contêm enzimas são normalmente lábeis a temperatura, é garantido que a temperatura dos grânulos não aumenta demasiado, isto é, como regram não exceda 80°C e, de preferência, não exceda 70°C. Em particular, a temperatura dos grânulos durante a secagem está compreendida entre 10°C e 40°C. A temperatura de secagem pode ser controlada de um modo simples através da temperatura da corrente de gás. A corrente da temperatura de gás está tipicamente compreendida entre 140°C e 40°C e, em particular, compreendida entre 120°C e 60°C. A secagem pode ser efetuada de um modo contínuo ou descontínuo.

[066] Após a secagem, os grânulos também podem ser fraccionados por meio de um crivo. O material grosseiro e os finos podem ser moídos e retornados à misturadora com o propósito de separar a massa de granulação.

[067] A presente invenção é descrita de um modo exemplificativo nos exemplos a seguir citados, sem que a invenção, no âmbito de aplicação que resulta da descrição completa e das reivindicações, esteja limitada às variantes mencionadas nos exemplos.

[068] As figuras seguintes são um componente dos exemplos.

[069] Figura 1: atividade específica (U/g) com base no produto principal (isomaltulose em μmol), que é formado por minuto sob condições definidas (40% de sacarose (material de partida), TA, pH 6, 100 r.p.m.), por 1 g de grânulos ou por um licor de fermentação que compreende P. rubrum com uma biomassa equivalente aos grânulos.

[070] Figura 2: gráfico da distribuição do tamanho de partículas da preparação de acordo com a invenção (não tratada ou após incubação num agitador a 400 r.p.m.) como função da densidade de distribuição.

[071] Figura 3: gráfico da distribuição do tamanho de partículas da preparação não de acordo com a invenção (não tratada ou após incubação num agitador a 400 r.p.m.) como função da densidade de distribuição

[072] Figura 4: gráfico da conversão de sacarose em frutose e glicose.

[073] Exemplos

[074] Exemplo 1: produção de uma preparação de acordo com a invenção

[075] Submete-se a homogeneização 100 mL de uma dispersão a 30% em peso de um copolímero de acrilato de etilo/metacrilato de metilo (Eudragit NM, Evonik Industries AG) com 130 mL de massa seca de licor de fermentação a 6% em peso de P. rubrum e 62 g de veículo em material, constituído por Sipernat 320 (Evonik Industries AG), numa amassadora. Submete-se então a mistura homogénea a extrusão utilizando uma extrusora (Extruder 20, Caleva) e granula-se utilizando um spheronizer (Spheronizer 250, Cavela).

[076] Seca-se os grânulos resultantes de um dia para o outro à temperatura ambiente e ajusta-se a uma humidade residual de 30% (p/p), determinada por pesagem a seco.

[077] Com base no peso seco total, as partículas compreendem 30% em peso de copolímero de acrilato de etilo/metacrilato de metilo, 8% em peso de massa seca de fermentação e 62% em peso de sipernat.

[078] Exemplo 2: atividade aparente

[079] Determinação da atividade aparente da preparação de acordo com o exemplo 1.

[080] A determinação da atividade é efetuada em três misturas de lotes separados. Para tal, coloca-se, em cada caso, 1 g dos grânulos secos num tubo de reação de 15 mL e introduz-se 10 mL de uma solução a 40% (p/p) de sacarose. A incubação é efetuada num misturador com 100 r.p.m. à TA e um pH de 6. A atividade específica U/g foi determinada após um período de incubação de 120 minutos, determinando a concentração em produto. Tal foi determinado aqui, em cada caso, com o auxílio de análise por HPLC. A atividade específica do licor de fermentação que contém P. rubrum foi determinada de um modo análogo, com uma biomassa equivalente aos grânulos presentes.

[081] Os resultados são apresentados na figura 1.

[082] Exemplo 3: estabilidade mecânica

[083] A estabilidade mecânica da preparação de acordo com o exemplo 1 é avaliada por meio da determinação dos valores de d10 [μm], d50 [μm] e d90 [μm] da distribuição do tamanho das partículas a partir da função de densidade de distribuição. Tal foi determinado visualmente sob condições padrão, com o auxílio de um Retsch Camsizer.

[084] A determinação da distribuição do tamanho de partículas é efetuada antes do tratamento, e também após incubação durante 30 e 60 minutos num vaso de reação de 50 mL, utilizando, em cada caso, 25 g de grânulos e 25 g de meio num misturador (400 r.p.m.) no meio e subsequente secagem. É evidente, em particular como resultado do valor de d10 [μm] virtualmente inalterado, o qual será deduzido da função de densidade de distribuição, que a preparação é estável e que não são formados fragmentos de partículas. Assim sendo, 10% das partículas do conjunto de partículas antes da incubação apresente um diâmetro inferior a 881 μm e, após incubação durante 60 minutos, um diâmetro inferior a 866 μm.

[085] Distribuição do tamanho de partículas - preparação de acordo com a invenção Exemplo 4: produção de uma preparação de acordo com a invenção que compreende Saccharomyces cerevisiae com a enzima invertase (EC 3.2.1.26)

[086] A produção da preparação é efetuada tal como no exemplo 1, exceto pelo facto do componente biocataliticamente ativo utilizado ser 130 mL de uma massa seca de uma suspensão a 6% em peso que compreende Saccharomyces cerevisiae comercial padrão. As células completas de Saccharomyces cerevisiae contêm, inter alia, a enzima invertase (EC 3.2.1.26) do conjunto de hidrolases de EC 3, que clivam hidroliticamente a sacarose em frutose e glicose. Para se investigar a atividade aparente, colocou-se a preparação num reator de leito fixo que tem septos laterais para recolha de amostras. O material de partida utilizado foi uma solução a 40% (p/p) de sacarose, que foi ajustada até um pH de 6. O material de partida foi alimentado num LHSV [h-1] de 0,2, que é formado pelo quociente do volume da corrente [m3/h] e pelo volume de catalisador [m3] utilizados. Para se obter um estado estacionário no reator de leito fixo, a recolha de amostras foi efetuada após uma fase de ciclo de 72 horas. Uma vez que a recolha de amostras foi efetuada ao longo do comprimento do reator, a conversão do material de partida pode ser monitorizada pelo comprimento do reator sem dimensões x/X [-]. A composição da amostra foi determinada, em cada caso, com o auxílio da análise por HPLC. Os resultados são apresentados na figura 4.

[087] Exemplo 1 de comparação (não de acordo com a invenção): produção de uma preparação não de acordo com a invenção

[088] Produção de uma preparação de acordo com o documento WO95/22606 (Novo Nordisk A/S): ‘Method for production of an immobilized enzyme preparation and use of the immobilized enzyme preparation’.

[089] Adiciona-se 65 g de Celkate T-21, sob a forma de um pó, a um misturador de alta velocidade. A este, adiciona-se 25 g de licor de fermentação líquido que compreende sacarose isomerase ao pó continuamente e com um ventilador em funcionamento. A seguir, adiciona-se mais 50 g de licor de fermentação líquido que compreende sacarose isomerase, combinado com 3% (p/p) de Kollidon K25 polivinilpirrolidona (BASF). Seca-se os grânulos resultantes de um dia para o outro à temperatura ambiente e submete-se a peneiração. Ajusta-se o teor em humidade residual a 10%.

[090] Exemplo 2 de comparação (não de acordo com a invenção): estabilidade mecânica

[091] Determinação da estabilidade mecânica da preparação de acordo com o exemplo 1 de comparação. A medição foi efetuada de um modo análogo ao exemplo 1. Os resultados são apresentados na figura 3. Um desvio considerável no valor de d10 [μm] mostra que antes da incubação, 10% do conjunto de partículas era inferior a 784 e após incubação era inferior a 389 μm. Tal significa que a preparação não de acordo com a invenção se desintegra em fragmentos de partículas menores como resultado da força mecânica no misturador.

Claims (9)

1. Grânulos caracterizados por compreenderem A) pelo menos uma enzima selecionada entre isomaltulose sintases de EC 5.4.99.11 ou invertases de EC 3.2.1.26, B) pelo menos um polímero selecionado entre polímero de acrilato de alquilo(C1-C10), polímero de metacrilato de alquilo(C1-C10) e copolímero de acrilato de alquilo(C1-C10)-metacrilato de alquilo(C1-C10) e, de preferência, copolímero de acrilato de alquilo(C1-C10)-metacrilato de alquilo(C1-C10) e C) pelo menos um veículo em material inorgânico selecionado entre sílicas, em particular, sílicas precipitadas e silicatos de alumínio, em particular, zeólitos, sendo preferidas as sílicas precipitadas.

2. Grânulos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados por a isomaltulose sintase ser selecionada entre o conjunto constituído por YP_002235756.1, WP_006325065.1, WP_012540141.1, WP_004157672.1, CCO82510.1, CCO82509.1, CCO78715.1, EKF64560.1, AAP57084.1, AAP57083.1, ACI12079.1 e ACF42098.1.

3. Grânulos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizados por a isomaltulose sintase estar presente sob a forma de catalisador de células completas ou sob a forma de células desreguladas.

4. Grânulos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizados por o polímero ter um peso molecular média em massa compreendido entre cerca de 100000 e 1500000 g/mol e, de preferência, entre 500000 e 1000000 g/mol.

5. Grânulos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizados por o polímero ser um copolímero de acrilato de etilo/metacrilato de metilo e, de preferência, poli(acrilato de etilo-co-metacrilato de metilo) a 2: 1.

6. Grânulos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizados por, com base nos grânulos totais, B) estar presente numa quantidade compreendida entre 0,1% em peso e 80% em peso e C) estar presente numa quantidade compreendida entre 20% em peso e 95% em peso.

7. Grânulos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizados por terem uma atividade específica de 1 a 1000 U, com base no peso total dos grânulos.

8. Processo para a produção de grânulos, caracterizado por compreender os seguintes passos 1) provisão de pelo menos uma isomaltulose sintase de EC 5.4.99.11, pelo menos um polímero selecionado entre polímero de acrilato de alquilo(C1-C10), polímero de metacrilato de alquilo(C1-C10) e copolímero de acrilato de alquilo(C1-C10)-metacrilato de alquilo(C1-C10) e, de preferência, copolímero de acrilato de alquilo(C1-C10)-metacrilato de alquilo(C1-C10) e pelo menos um veículo em material inorgânico, 2) produção de uma pasta por homogeneização em uma amassadora que contém os componentes do passo 1) do processo, 3) granulação da pasta, e 4) de secagem dos grânulos e ajuste de sua umidade residual, com as características de temperatura e tempo e que o ajuste residual é feito para 30% (p/p), determinada por pesagem a seco.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por no passo 3) de processo a granulação ser efetuada por extrusão, granulação numa misturadora, granulação em leito fluidificado, aglomeração numa misturadora com mandíbulas, aglomeração por pulverização, granulação por pulverização ou compactação.