ES2634623T3 - Uso de chaperonas moleculares para la producción potenciada de proteínas secretadas, recombinantes, en células de mamífero - Google Patents

Uso de chaperonas moleculares para la producción potenciada de proteínas secretadas, recombinantes, en células de mamífero Download PDF

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Abstract

Una célula huésped de mamífero para la expresión potenciada de un producto proteico recombinante, teniendo dicha célula de mamífero material genético que codifica la expresión de dicho producto proteico recombinante y transformado con al menos un vector de expresión que comprende ADN que codifica la proteína chaperona calnexina, en la que dicho producto proteico recombinante es Factor VIII.

Description

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unían fuera de los sitios de clonación múltiple del vector así como dentro de la secuencia de chaperona. Se realizó secuenciación usando el procedimiento de terminador Big Dye en termociclador de MJ Research y se analizó usando un analizador genético ABI 310. Las secuencias de ADNc de calnexina humana, clarreticulina y Erp57 se muestran en las Figuras 2A-2C.
El fragmento de ADNc de Hsp70 humano de longitud completa se obtuvo por RT-PCR usando ARN poliA+ de cerebro humano (CLONTECH Cat: 6516-1) y dos cebadores designados F-Hsp70 = 5’ AGG GAA CCG CAT GGC CAA AG y R-Hsp70 = 5’ GAA AGG CCCCTA ATC TAC CTC CTC A. Las secuencias de cebadores de Hsp70 se obtuvieron de la secuencia previamente publicada para el gen de la proteína de choque térmico humana (Hsp70) [9]. Los cebadores F-Hsp70 y R-Hsp70 incluyeron una secuencia EcoRI o XbaI respectivamente. El fragmento de PCR deseado se purificó por electroforesis en gel de agarosa y se confirmó por secuenciación de nucleótidos. El fragmento de ADNc de Hsp70 humano de longitud completa se insertó después en los sitios de clonación EcoRI y XbaI del vector pCI-neo para formar el vector pCI-neo-Hsp70. El vector pCI-neo-Hsp70 se propagó en E. coli seguido de aislamiento y purificación de las secuencias de vectores. Se secuenció el ADN del plásmido pCI-neo-Hsp70 mediante Analizador Genético ABI PRISM 310. La secuencia de Hsp70 humano se muestra en la Figura 2D.
Ejemplo 2. La producción de bikunina aumenta en células CHO después de transfección de una chaperona ER, tal como calnexina, calreticulina, Erp57 o Hsp70.
Se supertransfectó una línea celular CHO que secretaba la proteína recombinante Bikunina (Solicitud de Patente de Estados Unidos n.º de serie 09/441654) con diversas combinaciones de las chaperonas ER, calnexina (CNX), calreticulina (CRT), ERp57 o Hsp70 seguido de selección con G418. Se obtuvieron poblaciones y se exploraron por ensayo de calicreína (Solicitud de Patente de Estados Unidos n.º de Serie 09/441.654). Brevemente, se diluyeron en serie patrones de bikunina o fluido de cultivo y se incubaron con un volumen igual de calicreína a 37 ºC durante 30 minutos, después de lo cual se añadió un sustrato cromogénico, N-benzoil-Pro-Phe-Arg-pNA. La reacción se incubó durante 15 minutos antes de la adición de ácido acético al 50 %. La cantidad de p-nitroanilida liberada se midió a 405 nM. Las poblaciones que mostraban los mayores títulos de Bikunina se clonaron después a partir de una única célula y se cultivaron en expansión durante un periodo de varias semanas. Los clones que mostraban títulos de Bikunina uniformemente mayores (2-4x) en relación con las células de control CF9-20 se conservaron y se expandieron a matraces de agitación para análisis adicional. Estos clones se redujeron adicionalmente basándose en títulos de Bikunina y características de crecimiento demostradas mientras crecían en el ambiente del matraz de agitación. Se seleccionaron clones candidatos finales después de varios ciclos y análisis exhaustivo en el estadio de matraz de agitación.
La velocidad de producción de Bikunina específica para todas las líneas celulares se expresa como pg de Bikunina/célula/día (SPR). Cada día se recogieron células y se transfirieron a medio nuevo y se incubaron durante 24 horas a 37 ºC en matraces de agitación. Al día siguiente, las células se recogieron de nuevo, se contaron y se resuspendieron en medio nuevo del mismo volumen y se incubaron de forma similar durante otras 24 horas. Se realizaron mediciones de la actividad de bikunina (pg/célula/día) en muestras del medio gastado. El mismo procedimiento se repitió cada día hasta que el número y la viabilidad de las células comenzaron a reducirse.
El efecto de las proteínas chaperonas en la expresión de bikunina se muestra en las Figuras 3 y 4. La línea celular de control (CF9-20) expresa Bikunina pero no expresa ninguna de las proteínas chaperonas. El efecto de calnexina, calreticulina y Erp57 en la expresión de bikunina se resume adicionalmente en la Tabla 1.
Tabla 1. Los niveles de producción de Bikunina generales son 2-4 veces mayores en clones que se han supertransfectado con una chaperona
Clon Aumento de Bikunina en Relación con el Control Chaperona
X4/14:5 2-4 CNX X4/14:30 2-4 CNX X4/19:62 2-4 ERp57 T4/13:22 1,5-2 CRT
Las mediciones del factor de actividad son en relación con una línea celular de control que expresa Bikunina pero no expresa ninguna de las proteínas chaperonas. Las células se cultivaron en medio sin suero en cultivos de matraces de agitación.
Ejemplo 3. La producción de Factor VIII recombinante aumenta en células BHK después de la transfección con chaperonas ER.
Se transfectaron células productoras de Factor VIII estable (MWCB1) (Patente de Estados Unidos n.º 4.965.199, ATCC n.º CRL 8544) con vectores de expresión de chaperonas además de pPUR, un vector que contiene gen
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aumento de 2-4 en el título general y un factor de aumento de 2-3 en la productividad específica en todos los clones de células individuales en comparación con el grupo o la línea parental.
Tabla 3. Productividad de células productoras de IL2SA
Título (μg/ml)
Densidad celular (106/ml) SPR (pg/c/d) GS Hsp70
Línea parental 49-19H42
18,78 3,51 2,67 (-) (-)
49-19H42 GShsp70-SC n.º 12
33,87 2,63 6,44 +++ +++
49-19H42 GShsp70-SC n.º 14
22,08 1,83 6,03 +++ +++
49-19H42 GShsp70-SC n.º 17
64,00 3,05 10,50 +++ +++
49-19H42 GShsp70-grupo
10,59 1,74 3,04 +++ +
Las células se sembraron a 1 millón por ml el día 0 en 15 ml de medio completo (para la línea parental) o medio sin glutamina. Se tomaron muestras a los 2 días después de la siembra y se analizaron usando ELISA. Para expresión de GS y Hsp70, las células se fijaron con EtOH 70 %, se marcaron con anticuerpos apropiados y se analizaron por FACS. +++ = todas las células expresaron GS o Hsp70; + = 30 % de las células expresaron GS o Hsp70; (-) = sin expresión.
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54.
El procedimiento de acuerdo con la realización 49, en el que dicha selección se produce en presencia de G418.
55.
Un procedimiento para potenciar el rendimiento del factor VIII recombinante en una línea celular de riñón de cría de hámster (BHK), en el que se ha introducido previamente material genético que codifica la expresión de dicho Factor VIII recombinante en una primera línea celular BHK, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
insertar al menos un vector de expresión de proteína chaperona en dicha primera línea celular BHK para formar una línea celular BHK modificada; y
seleccionar de dicha línea celular BHK modificada al menos una segunda línea celular que muestra rendimiento potenciado del producto de Factor VIII recombinante.
56.
El procedimiento de acuerdo con la realización 55, en el que el material genético que codifica la expresión de dicho Factor VIII recombinante se integra en el ADN de la primera célula BHK.
57.
El procedimiento de acuerdo con la realización 55, en el que dicha segunda línea celular se transforma adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína glutamina sintetasa.
58.
El procedimiento de acuerdo con la realización 55, en el que al menos una segunda línea celular se produce a partir de dicha primera línea celular seleccionando una parte de dicha primera línea celular que muestra integración del vector de expresión de proteína chaperona en ADN del huésped.
59.
El procedimiento de acuerdo con la realización 55, en el que dicho vector de expresión de proteína chaperona comprende ADN que codifica una proteína chaperona seleccionada del grupo que consiste en calnexina, calreticulina, Erp57, Hsp40 o Hsp70.
60.
El procedimiento de acuerdo con la realización 55, en el que dicha célula BHK se transfecta adicionalmente con un vector que incluye un gen resistente a puromicina.
61.
El procedimiento de acuerdo con la realización 55, en el que la selección se produce en presencia de puromicina.
62.
Un procedimiento para potenciar el rendimiento de proteínas IL2SA recombinantes en una línea celular CHO, en la que se ha introducido previamente material genético que codifica la expresión de dicho IL2SA recombinante en una primera línea celular CHO, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
insertar al menos un vector de expresión de proteína chaperona en dicha primera línea celular CHO para formar una línea celular CHO modificada; y seleccionar de dicha línea celular CHO modificada al menos una segunda línea celular que muestra rendimiento potenciado de la proteína IL2SA recombinante.
63.
El procedimiento de acuerdo con la realización 62, en el que el material genético que codifica la expresión de dicho IL2SA recombinante se integra en el ADN de la primera célula CHO.
64.
El procedimiento de acuerdo con la realización 63, en el que la segunda línea celular se transforma adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína glutamina sintetasa.
65.
El procedimiento de acuerdo con la realización 62, en el que dicho vector de expresión de proteína chaperona comprende ADN que codifica una proteína chaperona seleccionada del grupo que consiste en calnexina, calreticulina, Erp57, Hsp40 y Hsp70.
66.
Un procedimiento para potenciar el rendimiento de una bikunina recombinante o fragmento en una línea celular CHO que comprende introducir material genético que codifica bikunina o fragmento de la misma en una línea celular CHO que muestra expresión de proteína chaperona potenciada.
67.
El procedimiento de acuerdo con la realización 66, en el que la línea celular CHO se transforma adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína glutamina sintetasa.
68.
Un procedimiento para potenciar el rendimiento de un Factor VIII recombinante o fragmento del mismo en una línea celular BHK que comprende introducir material genético que codifica dicho Factor VIII o fragmento del mismo en una línea celular BHK que muestra expresión de proteína chaperona potenciada.
69.
El procedimiento de acuerdo con la realización 68, en el que la línea celular BHK se transforma adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína glutamina sintetasa.
70.
Un procedimiento para potenciar el rendimiento de un IL2SA recombinante o fragmento del mismo en una línea celular CHO que comprende introducir material genético que codifica dicho IL2SA en una línea celular CHO
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