ES2633732T3 - Procedimiento y kit para determinar in vitro el estado inmunitario de un individuo - Google Patents

Abstract

Procedimiento para determinar in vitro el estado inmunitario global de un individuo séptico para la implementación de una terapia lo mejor determinada posible en función de la respuesta inmunitaria establecida según la cual: a. se dispone de una muestra sanguínea del individuo, b. se dispone de al menos dos reactivos específicos de al menos dos productos de expresión de al menos dos genes dianas respectivamente seleccionados entre los genes dianas siguientes: HLA-DRA, S100A9, S100A8, IRAK-M, LY64, CIITA, TNF-alfa, IL-10, GBP1, MMP7, CXCL1, CXCL10, COX2, FCN1, TNFAIP6, CXCL7, CXCL5, PID1 y RHOU, c. se determina la expresión de dichos al menos dos genes dianas, y d. se compara la expresión de dichos al menos dos genes dianas respectivamente con una expresión de referencia, siendo una modificación en la expresión de dichos al menos dos genes dianas con respecto a su expresión de referencia un indicador de una modificación del estado inmunitario del individuo, y siendo una correlación entre la expresión de dichos al menos dos genes dianas con su expresión de referencia un indicador de una normalidad del estado inmunitario del individuo.

Description

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Por hibridación, se entiende el proceso durante el cual, en condiciones apropiadas, dos fragmentos nucleotídicos, tales como por ejemplo una sonda de hibridación y un fragmento nucleotídico diana, que tiene unas secuencias suficientemente complementarias son susceptibles de formar una doble hebra con unas uniones hidrógenos estables y específicos. Un fragmento nucleotídico “capaz de hibridarse” con un polinucleótido es un fragmento que puede hibridarse con dicho polinucleótido en condiciones de hibridación que pueden ser determinadas en cada caso de manera conocida. Las condiciones de hibridación son determinadas por la rigurosidad, es decir el rigor de las condiciones de realización. La hibridación es aún más específica a medida que se efectúa a mayor rigurosidad. La rigurosidad se define en particular en función de la composición en base de un dúplex sonda/diana, así como por el grado de desajuste entre dos ácidos nucleicos. La rigurosidad puede también depender de los parámetros de la reacción, tales como la concentración y el tipo de especies iónicas presentes en la solución de hibridación, la naturaleza y la concentración de agentes desnaturalizantes y/o la temperatura de hibridación. La rigurosidad de las condiciones en las que una reacción de hibridación debe ser realizada dependerá principalmente de las sondas de hibridación utilizadas. Todos estos datos son por supuesto conocidos y las condiciones apropiadas pueden ser determinadas por el experto en la materia. En general, según la longitud de las sondas de hibridación utilizadas, la temperatura para la reacción de hibridación está comprendida entre aproximadamente 20 y 70ºC, en particular entre 35 y 65ºC en una solución salina a una concentración de aproximadamente 0,5 a 1 M. Se realiza después una etapa de detección de la reacción de hibridación.

Por detección, se entiende o bien una detección directa por un método físico, o bien un método de detección con la ayuda de un marcador. Numerosos métodos de detección existen para la detección de los ácidos nucleicos [1, 2].

Por marcador, se entiende un trazador capaz de generar una señal. Una lista no limitativa de estos trazadores comprende las enzimas que producen una señal detectable, por ejemplo por colirometría, fluorescencia o luminescencia, como la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la -galactosidasa, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; los cromóforos como los compuestos fluorescentes, luminescentes o colorantes; los grupos de densidad electrónica detectables por microscopía electrónica o por sus propiedades eléctricas como la conductividad, por los métodos de amperometría o de voltametría, o por mediciones de impedancia; los grupos detectables por métodos ópticos como la difracción, la resonancia plasmón de superficie, la variación de ángulo de contacto o mediante unos métodos físicos como la espectroscopía de fuerza atómica, el efecto túnel, etc.; las moléculas radioactivas como 32P, 35S o 125I. Así, el polinucleótido puede ser marcado durante la etapa de amplificación enzimática, por ejemplo utilizando un nucleótido trifosfato marcado para la reacción de amplificación. El nucleótido marcado será un desoxirribonucleótido en los sistemas de amplificación que generan un ADN, como la PCR, o un ribonucleótido en las técnicas de amplificación que generan un ARN, como las técnicas TMA o NASBA. El polinucleótido puede también ser marcado después de la etapa de amplificación, por ejemplo hibridando una sonda marcada según la técnica de hibridación sándwich descrita en el documento WO-A-91/19812.

En el sentido de la presente invención, la sonda de hibridación puede ser una sonda denominada de captura. En este caso, el fragmento nucleotídico diana puede ser previamente marcado mediante un marcador. La sonda denominada de captura está inmovilizada o puede ser inmovilizada sobre un soporte sólido mediante cualquier medio apropiado, es decir directa o indirectamente, por ejemplo por covalencia o adsorción. Se realiza entonces una reacción de hibridación entre dicha sonda de detección y el fragmento nucleotídico diana marcado.

La sonda de hibridación puede también ser una sonda denominada de detección. En este caso, la sonda de hibridación puede ser marcada mediante un marcador. Se realiza entonces una reacción de hibridación entre dicha sonda de captura y el fragmento nucleotídico diana.

Ya se use una sonda denominada de captura o una sonda denominada de detección, la reacción de hibridación puede ser realizada en un soporte sólido que incluye todos los materiales sobre los cuales se puede inmovilizar un ácido nucleico. Como soporte sólido se pueden utilizar unos materiales de síntesis o unos materiales naturales, eventualmente modificados químicamente, en particular los polisacáridos tales como los materiales a base de celulosa, por ejemplo papel, derivados de celulosa tales como el acetato de celulosa y la nitrocelulosa o el dextrano, unos polímeros, unos copolímeros, en particular a base de monómeros de tipo estireno, unas fibras naturales tales como el algodón, y unas fibras sintéticas tales como el nylon; unos materiales minerales tales como la sílice, el cuarzo, vidrios, cerámicas; látex; partículas magnéticas; derivados metálicos, geles, etc. El soporte sólido puede estar en forma de una placa de microtitulación, de una membrana como se describe en la solicitud WO-A-94/12670, de una partícula o de un biochip.

En la presente invención, la determinación de la expresión de un gen diana se puede analizar por la expresión de los ARNm que se transcriben en un tiempo dado. En este caso, el material biológico es un ácido nucleico, y el reactivo específico puede ser indiferentemente un cebador de amplificación o una sonda de hibridación tales como se han definido anteriormente.

Se puede determinar la expresión de un gen diana de la siguiente manera:

1) después de extraer los ARN totales de una muestra sanguínea o de PBMCs, se realiza una etapa de transcripción inversa, tal como se ha descrito anteriormente a fin de obtener los diferentes ADN complementarios de los diferentes

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ARN mensajeros inicialmente presentes en la muestra sanguínea o en los PBMCs (o ADNc),

2) se amplifican específicamente los ADNc. En este caso, el reactivo específico utilizado comprende al menos un cebador de amplificación específica del gen diana, tal como se ha definido anteriormente. Esta etapa se puede realizar en particular mediante una reacción de amplificación de tipo PCR o mediante cualquier otra técnica de amplificación apropiada,

3) se determina la expresión del gen diana cuantificando los ADNc. Los ADNc pueden ser cuantificados en particular por la utilización de un intervalo de cuantificación obtenida por una reacción de amplificación llevada a cabo hasta saturación. A fin de tener en cuenta la variabilidad de eficacia enzimática que puede observarse durante diferentes etapas (transcripción inversa, PCR cuantitativa, etc.), se puede normalizar la expresión del gen diana de los diferentes grupos de pacientes, mediante la determinación simultánea de la expresión de un gen denominado doméstico, cuya expresión es similar en los diferentes grupos de pacientes. Realizando una relación entre la expresión del gen diana y la expresión del gen doméstico, se corrige así cualquier variabilidad entre los diferentes experimentos. El experto en la materia podrá referirse en particular a las publicaciones siguientes: [3-4] Bustin SA Journal of molecular endocrinology, 2002, 29: 23-39; Giulietti A Methods, 2001, 25: 386-401.

Se puede también determinar la expresión d'un gen diana de la siguiente manera:

1) después de extraer los ARN totales de una muestra sanguínea o de PBMCs, se realiza una etapa de transcripción inversa, tal como se ha descrito anteriormente, a fin de obtener los diferentes ADN complementarios de los diferentes ARN mensajeros inicialmente presentes en la muestra o los PBMCs (o ADNc)

2) se inmovilizan los ADNc sobre una membrana

3) se determina la expresión del gen diana hibridando los ADNc a unas sondas de hibridación específicas del gen diana previamente marcadas. Tales técnicas de hibridación son bien conocidas por el experto en la materia, y se puede citar en particular la técnica de transferencia Northern. Esta reacción de hibridación se puede realizar después de una etapa de amplificación específica de los ADN complementarios de los ARN mensajeros de un gen diana cuando en particular el gen está débilmente expresado.

La expresión de un gen diana se puede realizar también por la expresión de las proteínas codificadas por el gen diana. En este caso, el material biológico es una proteína y se pueden utilizar varias técnicas de detección con o sin ligando. La espectrometría de masa se puede utilizar como técnica de detección sin ligando. El reactivo específico puede ser un anticuerpo específico de la proteína codificada por el gen diana para un sistema de detección con ligando.

Los anticuerpos recombinantes, específicos de la proteína traducida del gen diana se pueden obtener según procedimientos clásicos conocidos por el experto en la materia, a partir de organismos procariotas, tales como bacterias, o a partir de organismos eucariotas, tales como levaduras, células de mamíferos, de plantas, de insectos

o de animales, o mediante sistemas de producción extra-celular.

Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados según las técnicas clásicas conocidas por el experto en la materia tales como la técnica de los hibridomas cuyo principio general se recuerda a continuación.

En un primer tiempo, se inmuniza un animal, generalmente un ratón, (o unas células en cultivo en el ámbito de inmunizaciones in vitro) con un antígeno diana de interés, cuyos linfocitos B son entonces capaces de producir unos anticuerpos contra dicho antígeno. Estos linfocitos productores de anticuerpos son después fusionados con unas células mielomatosas “inmortales” (murinas en el ejemplo) para dar lugar a unos hibridomas. A partir de la mezcla heterogénea de las células así obtenida, se efectúa entonces una selección de las células capaces de producir un anticuerpo particular y multiplicarse indefinidamente. Cada hibridoma se multiplica en forma de clon, conduciendo cada uno a la producción de un anticuerpo monoclonal cuyas propiedades de reconocimiento frente al antígeno de interés podrán ser ensayadas por ejemplo en ELISA, por inmunotransferencia en una o dos dimensiones, en inmunofluorescencia, o con la ayuda de un biosensor. Los anticuerpos monoclonales así seleccionados son después purificados en particular según la técnica de cromatografía de afinidad.

Se pueden obtener unos fragmentos de anticuerpos por ejemplo por proteólisis. Así, pueden ser obtenidos por digestión enzimática, resultando en fragmentos de tipo Fab (tratamiento con papaína [5] o de tipo F(ab)’2 (tratamiento con pepsina; [6]. Pueden también ser preparados por vía recombinante [7]. Otro fragmento de anticuerpo que conviene a los fines de la invención comprende un fragmento Fv que es un dímero constituido de la asociación no covalente del dominio variable ligero (VL) y del dominio variable pesado (VH) del fragmento Fab, por lo tanto la asociación de dos cadenas polipeptídicas. A fin de mejorar la estabilidad del fragmento Fv debido a la separación de dos cadenas polipeptídicas, este fragmento Fv puede ser modificado por ingeniería genética insertando un enlace peptídico adaptado entre el dominio VL y el dominio VH [8]. Se habla entonces de fragmento scFv (“single chain Fragment variable”) ya que está constituido de una sola cadena polipeptídica. La utilización de un enlace peptídico compuesto preferiblemente de 15 a 25 aminoácidos permite unir el extremo C-terminal de un

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presencia o no de inmunoestimulantes. La determinación se ha efectuado por un ensayo ELISA sobre sobrenadantes de cultivo obtenidos después de 45 horas. El eje de las ordenadas representa las concentraciones proteicas (pg/ml) de TNF- (figura 4A) y de IL-10 (figura 4B). Los histogramas negros representan las células estimuladas dos veces por LPS sin profármaco (control). Los histogramas blancos corresponden a las células estimuladas dos veces por LPS en presencia de IFN-1b (Imukin™, Boehringer, Ingelheim, Austria) a 100 ng/ml, los histogramas grises en presencia de 100 ng/ml de GM-CSF (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemnia) y los histogramas con rayas en presencia de 100 ng/ml de FLT3-L (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania). Los datos son representados en media +/-desviación estándar. Se ha realizado un ensayo con aparato Wicoxon para el análisis estadístico de los resultados corrigiendo por el número de ensayo efectuado: * significa que p<0,017 frente a células estimuladas dos veces con LPS sin profármaco.

Figura 6: la figura 6 muestra la expresión de los genes de TNF alfa (A), IL-10 (B), HLA-DRA (C), CIITA (D), IRAK-M (E), ABIN-3 (F), LY64 (G), S100A9 (H), S100A8 (I), GBP1 (J), MMP7 (K), CXCL1 (L), CXCL10 (M), COX2 (N), FCN1 (O), TNFAIP6 (P), CXCL7 (Q), CXCL5 (R), PID1 (S) y RHOU (T) por PBMCs, procedentes de 7 voluntarios sanos, estimuladas dos veces por LPS (2 ng/ml después 100 ng/ml) en presencia o no de profármacos, y cuantificadas por biochip después de 45 horas. El eje de las ordenadas representa la intensidad de fluorescencia de cada una de las sondas de hibridación: (A) 207113_s_at para el TNFa; (B) 207433_at para IL-10; (C) 208894_at para HLA-DRA; (D) 205101_at para CIITA; (E) 213817_at para IRAK-M; (F) 220655_at para ABIN-3; (G) 206206_at para LY64; (H) 203535_at para S100A9; (I) 202917_s_at para S100A8;(J) 202269_x_at para GBP1; (K) 204259_art para MMP7; (L) 204470_at para CXCL1; (M) 204533_at para CXCL10; (N) 204748_at para COX2; (O) 205237_at para FCN1; (P) 206026_s_at para TNFAIP6; (Q) 214146_s_at para CXCL7; (R) 215101_s_at para CXCL5; (S) 219093_at para PID1 y (T) 223168_at para RHOU. Los histogramas negros representan las células estimuladas dos veces por LPS sin profármaco (control). Los histogramas blancos corresponden a las células estimuladas dos veces por LPS en presencia de IFN-1b a 100 ng/ml, los histogramas grises en presencia de 100 ng/ml de GM-CSF y los histogramas con rayas en presencia de 100 ng/ml de FLT3-L. Los datos son representados en media +/-desviación estándar. Se ha realizado un t-ensayo con aparato para el análisis estadístico de los resultados corrigiendo por el número de ensayo efectuado: * significa que p<0,05 frente a células estimuladas dos veces con LPS sin inmunoestimulante.

Figura 7: la figura 7 muestra la expresión de los genes de TNFa (A), IL-10 (B), HLA-DRA (C), CIITA (D), IRAK-M (E), ABIN-3 (F), LY64 (G), S100A9 (H) , S100A8 (I), GBP1 (J), MMP7 (K), CXCL1 (L), CXCL10 (M), COX2 (N), FCN1 (O), TNFAIP6 (P), CXCL7 (Q), CXCL5 (R), PID1 (S) y RHOU (T) por PBMCs, procedentes de 7 voluntarios sanos, estimuladas dos veces por LPS (2 ng/ml después 100 ng/ml) en presencia o no de profármacos, y cuantificadas por qRT-PCR después de 45 horas. El eje de las ordenadas representa los porcentajes de inducción de expresión de los genes citados anteriormente. Los histogramas negros representan las células estimuladas dos veces por LPS sin profármaco (control). Los histogramas blancos corresponden a las células estimuladas dos veces por LPS en presencia de IFN-1b a 100 ng/ml, los histogramas grises en presencia de 100 ng/ml de GM-CSF y los histogramas con rayas en presencia de 100 ng/ml de FLT3-L. Los datos son representados en media +/-desviación estándar. Se ha realizado un ensayo con aparato de Wilcoxon para el análisis estadístico de los resultados corrigiendo por el número de ensayo efectuado: * significa que p<0,05 frente a células estimuladas dos veces con LPS sin inmunoestimulante.

Figura 8: las figuras 8A y 8B representan respectivamente las concentraciones de TNF- y de IL-10 producidas por células de la sangre total, procedentes de 5 pacientes en choque séptico extraídos entre D1 y D3, y 5 voluntarios sanos, estimuladas o no (control) por LPS a 100 ng/ml +/-100 ng/ml de IFN-1b. Las determinaciones proteicas se han realizado por un ensayo ELISA sobre sobrenadantes de cultivo obtenidos después de 15 horas. El eje de las ordenadas representa las concentraciones proteicas (pg/ml) de TNF- (figura 6A) y de IL-10 (figura 6B). Los histogramas negros representan los pacientes en choque séptico y los histogramas en blanco representan los voluntarios sanos. Los datos son representados en medio +/-desviación estándar.

Figura 9: La figura 9 representa la expresión de los genes de TNF-α (A), IL-10 (B), HLA-DRA (C), CIITA (D), GBP1 (E), CXCL10 (F), COX2 (G), TNFAIP6 (H) y CXCL5 (I) por unas células de la sangre total, procedentes de 5 pacientes en choque séptico extraídos entre D1 y D3 y 5 voluntarios sanos, estimuladas o no (controles) por LPS a 100 ng/ml +/-100 ng/ml de IFN-1b. La cuantificación de estos genes se ha efectuado por qRT-PCR sobre los residuos celulares obtenidos después de 15 horas. El eje de las ordenadas representa los porcentajes de inducción de expresión de los genes citados anteriormente. Los histogramas negros representan los pacientes en choque séptico y los histogramas en blanco representan los voluntarios sanos.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se dan a título ilustrativo y no tienen ningún carácter limitativo. Permiten comprender mejor la invención.

Materiales y métodos

Preparación de PBMCs y parámetros experimentales del modelo de tolerancia a la endotoxina (ET)

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Tabla

Gen

nº de acceso GenBank Cebadores SEQ ID NO

IL-10

NM_000572.2 5'-AATAAGGTTTCTCAAGGGGCT-3' sentido 1

5'-AGAACCAAGACCCAGACATCAA-3'

anti-sentido 2

HLA-DRA

NM_019111.4 5'-GCCAACCTGGAAATCATGACA-3' sentido 3

5'-AGGGCTGTTCGTGAGCACA-3'

anti-sentido 4

CIITA

NM_000246.3 5'-GCTGGGATTCCTACACAATGC-3' sentido 5

5'-CGGGTTCTGAGTAGAGCTCAATCT-3'

anti-sentido 6

IRAK-M

NM_007199.2 5'-TTTGAATGCAGCCAGTCTGA-3' sentido 7

NM_001142523.1

5'-GCATTGCTTATGGAGCCAAT-3' anti-sentido 8

ABIN-3

NM_024873.4 5'-GAATTCCCAGATAAAAGCTTGT-3' sentido 9

NM 001128843.1

5'-GACAGTCTGGTGGGTGCTC-3' anti-sentido 10

S100A9

NM_002965.3 5'-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3' sentido 11

5'-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3'

anti-sentido 12

S100AB

NM_002964.4 5'-ATTTCCATGCCGTCTACAGG-3' sentido 13

5'-CACCAGAATGAGGAACTCCT-3'

anti-sentido 14

LY64

NM_005582.2 5'-GCATTGAGAAAGAAGCCAACAA-3' sentido 15

5'-GAAAAGTGTCTTCATGTATCC-3'

anti-sentido 16

Enfoque transcripcional sobre biochip en pacientes en choque séptico

Varias muestras de sangre recogidas directamente en tubos PAXgeneTM (PreAnalytiX a Qiagen/BD Company) se obtuvieron a partir de 19 pacientes en choque séptico en el momento del diagnóstico de choque (es decir en las 2 horas tras el inicio del tratamiento vasopresor) y 48 horas después, como se ha descrito anteriormente [9]. El ARN total se ha extraído con la ayuda del kit PAXgene Blood RNA kit™ (PreAnalytix). Una etapa de digestión con DNAsa (Qiagen) se ha efectuado durante la extracción a fin de eliminar cualquier traza de ADN. La integridad y la calidad de los ARN se verificaron por electroforesis capilar sobre el bioanalizador 2100 AgilentTM (Agilent). Los biochips se realizaron según las instrucciones del fabricante (Affymetrix). La reacción de transcripción inversa de los ARNm se ha realizado con el protocolo de Affymetrix a partir de 3 g de ARN total. Se ha utilizado un cebador oligonucleotídico polyT para determinar únicamente los ARNm contenidos en la solución de los ARN totales durante la transcripción inversa. El conjunto de las etapas se ha realizado con el kit Affymetrix -GeneChip® One-Cycle Target Labeling and Control Reagents. Los productos de la transcripción inversa (ANDc) se utilizaron después para la síntesis del ARNc marcado por la biotina durante 16 horas a 37ºC. Después de la etapa de purificación del ARNc para quitar los dNTP no incorporados, los ARNc se cuantificaron y fragmentaron. El control de la fragmentación se realiza por electroforesis capilar (Agilent). La hibridación del ARNc se realiza con el biochip GeneChipHuman Genome U133 Plus 2 antes de la etapa de amplificación de la señal por la incubación con la mezcla SAPE que contiene Straptavidina Phycoerytrhine después los anticuerpos IgG de cabra anti-estreptavidina mezclados con el anticuerpo biotinilado anti-IgG de cabra. Esta última etapa utiliza la plataforma Fluidic FS450. El análisis de los datos Affymetrix empieza por la captura de la imagen del biochip por el escáner GeneChip 3000 de Affymetrix. Los datos se normalizaron después por RMA (Robust Multiple -Array Average) (Irizarry RA, Biostatistics 2003). Todos los datos basados en la intensidad de la señal se utilizaron después de la normalización.

Efecto de IFN- en un modelo de sangre total de pacientes en choque séptico

La sangre de 5 pacientes en choque séptico se ha recogido en tubo EDTA, entre D1 y D3 según el inicio del choque, así como en 5 voluntarios sanos. Después de la centrifugación y extracción del plasma, se han diluido 3 ml de sangre al ½ en 3 ml de medio RPMI 1640 (Eurobio, Courtaboeuf, Francia) después se cultivaron en presencia o en ausencia (grupo control) de 100 ng/ml de LPS +/-100 ng/ml de IFN-1b (Imukin) durante una noche a 37ºC y un 5% de CO2 (15 horas). Para cada condición, los sobrenadantes así como los residuos celulares se recuperaron y conservaron a -80ºC para la determinación ELISA de TNF- y de IL-10 y a -20ºC para la extracción ARN y la cuantificación por qRT-PCR, como se ha descrito anteriormente.

Análisis estadísticas

Los resultados son expresados en media  desviación estándar (SD). El análisis estadístico se ha realizado mediante el ensayo con aparato de Wilcoxon.

Resultados

Descripción del modelo de ET

Los modelos de ET se caracerizan por una reducción de la producción de TNF- asociada a un aumento de la secreción de IL-10 tras una segunda estimulación por LPS. La producción de estas citoquinas se midió por lo tanto

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en el sobrenadante de cultivo de PBMCs tras una o dos estimulaciones por LPS. Como se muestra en la figura 1A, las células estimuladas dos veces por LPS producen bajas cantidades de TNF- (58,5  68,3 pg/ml) comparadas con las células estimuladas únicamente una vez (1208  594 pg/ml). Por el contrario, como se muestra en la figura 1B, estas mismas células segregan más fuertes concentraciones de IL-10 (63,2  58,2 pg/ml) en comparación con las células estimuladas una vez (8,4  6,9 pg/ml). En respuesta a una segunda estimulación endotoxínica, las células ya estimuladas liberan menos TNF- (58,5 ± 68,3 pg/ml) que las células estimuladas una sola vez (1208 ± 594 pg/ml) y producen más IL-10 (63,2 ± 58,2 frente a 8,4 ± 6,9 pg/ml) que las células estimuladas una vez). Estos resultados son confirmados a nivel ARNm ya que una disminución significativa de la expresión de TNF- (figura 2A) acoplada con un aumento de la expresión génica de IL-10 (figura 2B) en las células estimuladas dos veces por LPS se han observado en comparación con PBMCs estimuladas una sola vez.

Un análisis de la expresión génica de PBMCs sometidas a una o dos estimulaciones con LPS se ha realizado en biochip Affymetrix. Los genes cuya expresión difiere más entre una o dos estimulaciones con LPS (p<0,05 y diferencia de expresión >2) así como unos genes conocidos en la bibliografía por estar implicados en este estado refractario de ET o la fase de inmunosupresión inducida por los estados sépticos severos son representados en la figura 2. La segunda estimulación por endotoxina bacteriana está acompañada por un aumento de la expresión de ARNm de IL-10 (B), HLA-DRA (C), CIITA (D), IRAK-M (E), ABIN-3 (F) mientras que la expresión de TNF alfa (A) y de LY64 (G) está disminuida. La expresión génica de las alarminas S100A9 (H) y S100A8 (I), de las quemoquinas CXCL1 (L), CXCL5 (R), et CXCL7 (Q), de MMP7 (K), FCN1 (O), PID1 (S) y RHOU (T) aumentan también tras una segunda estimulación con LPS. Finalmente, la expresión de los genes inducidos por el interferón GBP1 (J) y CXCL10 (M) así como de TNFAIP6 (P) disminuye.

Estos datos se han confirmado después por qRT-PCR (figura 3) en el que se ha observado el mismo perfil que aquel obtenido sobre los biochip. En respuesta a un segundo reto endotoxínico, la incapacidad para producir y expresar TNF- combinada al aumento de la producción y de la expresión de IL-10, de las células que se han previamente expuesto a una primera dosis de LPS, indica claramente el desarrollo de un estado de ET.

Análisis de la expresión de los genes en pacientes en choque séptico

A fin de ilustrar la pertinencia clínica del modelo, la expresión de estos genes en pacientes en choque séptico se ha estudiado retrospectivamente, en el momento del diagnóstico del choque y 48 horas más tarde. La expresión de los genes se ha evaluado por un enfoque sobre biochip en una cohorte de 19 pacientes descrita anteriormente [9] y 9 voluntarios sanos. Como se observa en el modelo de ET, los resultados muestran un aumento de la expresión de IL10, IRAK-M, CXCL7 y RHOU (figuras 4A, B, M y O), acoplada con una disminución de la expresión de Ly64, GBP1 y CXCL10 (figuras 4 F, G e I) en los pacientes en choque séptico en el momento del diagnóstico e incluso 48 horas más tarde comparado con los voluntarios sanos. En paralelo, una ligera disminución de la expresión de TNF- se observa en los pacientes (figura 4E).

En su conjunto, los datos clínicos confirman las modificaciones ARNm observadas ex vivo en el modelo de ET y subrayan la pertinencia clínica de este modelo.

IFN- y GM-CSF mejoran significativamente la producción de TNF- en PBMCs desactivadas por LPS

Como se indica en la figura 1, las PBMCs estimuladas una primera vez con LPS presentan una disminución marcada de su capacidad de producción en TNF- en respuesta a una segunda exposición a la endotoxina. A continuación, se ha investigado, en 7 experimentos sucesivos, si una incubación de 24 horas en presencia de diferentes profármacos inmunomoduladores (IFN-, GM-CSF y Flt3-L) podían restaurar esta síntesis en TNF- y disminuir la de IL-10. IFN- y GM-GSF alcanzan este objetivo induciendo a un aumento de la producción en TNF- (figura 5A). Es interesante señalar que los profármacos ensayados tienen impacto sólo sobre el refuerzo del lado pro-inflamatorio, pero quedan sin efecto sobre la disminución de producción de IL-10 (figura 5 B).

Monitorización ARNm del efecto de los profármacos inmunoestimulantes durante ET

A continuación, en estos mismos experimentos que muestran un efecto beneficioso de IFN- y de GM-CSF sobre la restauración de la síntesis de TNF- en respuesta a una segunda estimulación con LPS, la modulación de expresión de un panel de genes se ha estudiado por biochip (figura 6) después validada por qRT-PCR (figura 7).

Se observa una inducción significativa de la expresión ARNm de TNF- en presencia de IFN- comparado con los valores controles (figura 6A). La adición de los profármacos induce una ligera disminución de la expresión ARNm de IL10 (figura 6B). En paralelo, un aumento significativo de la expresión génica de HLA-DRA y CIITA se observa cuando las células pretratadas con LPS se incuban con IFN- (figura 6C, 6D). En cuanto a los reguladores negativos de la vía de señalización de LPS, la expresión de ABIN-3 disminuye significativamente en presencia de IFN- (figura 6E, 6F). La expresión de los genes LY64 y IRAKM disminuyen también en presencia de IFN- (figura 5G). Los tres profármacos disminuyen la expresión ARNm de las alarminas S100A9 y S100A8 (figura 6H, 6I). Además, la presencia de IFN- aumenta significativamente la expresión de los genes GBP1 (J), CXCL10 (M), COX 2 (N),

Claims (1)

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