ES2633732T3 - Procedure and kit to determine in vitro the immune status of an individual - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para determinar in vitro el estado inmunitario global de un individuo séptico para la implementación de una terapia lo mejor determinada posible en función de la respuesta inmunitaria establecida según la cual: a. se dispone de una muestra sanguínea del individuo, b. se dispone de al menos dos reactivos específicos de al menos dos productos de expresión de al menos dos genes dianas respectivamente seleccionados entre los genes dianas siguientes: HLA-DRA, S100A9, S100A8, IRAK-M, LY64, CIITA, TNF-alfa, IL-10, GBP1, MMP7, CXCL1, CXCL10, COX2, FCN1, TNFAIP6, CXCL7, CXCL5, PID1 y RHOU, c. se determina la expresión de dichos al menos dos genes dianas, y d. se compara la expresión de dichos al menos dos genes dianas respectivamente con una expresión de referencia, siendo una modificación en la expresión de dichos al menos dos genes dianas con respecto a su expresión de referencia un indicador de una modificación del estado inmunitario del individuo, y siendo una correlación entre la expresión de dichos al menos dos genes dianas con su expresión de referencia un indicador de una normalidad del estado inmunitario del individuo.Procedure to determine in vitro the overall immune status of a septic individual for the implementation of the best possible therapy based on the established immune response according to which: a. a blood sample of the individual is available, b. There are at least two specific reagents of at least two expression products of at least two target genes respectively selected from the following target genes: HLA-DRA, S100A9, S100A8, IRAK-M, LY64, CIITA, TNF-alpha, IL -10, GBP1, MMP7, CXCL1, CXCL10, COX2, FCN1, TNFAIP6, CXCL7, CXCL5, PID1 and RHOU, c. the expression of said at least two target genes is determined, and d. the expression of said at least two target genes respectively is compared with a reference expression, a modification in the expression of said at least two target genes with respect to their reference expression being an indicator of a modification of the individual's immune status, and being a correlation between the expression of said at least two target genes with their reference expression an indicator of a normality of the individual's immune status.
Description
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Por hibridación, se entiende el proceso durante el cual, en condiciones apropiadas, dos fragmentos nucleotídicos, tales como por ejemplo una sonda de hibridación y un fragmento nucleotídico diana, que tiene unas secuencias suficientemente complementarias son susceptibles de formar una doble hebra con unas uniones hidrógenos estables y específicos. Un fragmento nucleotídico “capaz de hibridarse” con un polinucleótido es un fragmento que puede hibridarse con dicho polinucleótido en condiciones de hibridación que pueden ser determinadas en cada caso de manera conocida. Las condiciones de hibridación son determinadas por la rigurosidad, es decir el rigor de las condiciones de realización. La hibridación es aún más específica a medida que se efectúa a mayor rigurosidad. La rigurosidad se define en particular en función de la composición en base de un dúplex sonda/diana, así como por el grado de desajuste entre dos ácidos nucleicos. La rigurosidad puede también depender de los parámetros de la reacción, tales como la concentración y el tipo de especies iónicas presentes en la solución de hibridación, la naturaleza y la concentración de agentes desnaturalizantes y/o la temperatura de hibridación. La rigurosidad de las condiciones en las que una reacción de hibridación debe ser realizada dependerá principalmente de las sondas de hibridación utilizadas. Todos estos datos son por supuesto conocidos y las condiciones apropiadas pueden ser determinadas por el experto en la materia. En general, según la longitud de las sondas de hibridación utilizadas, la temperatura para la reacción de hibridación está comprendida entre aproximadamente 20 y 70ºC, en particular entre 35 y 65ºC en una solución salina a una concentración de aproximadamente 0,5 a 1 M. Se realiza después una etapa de detección de la reacción de hibridación. By hybridization, the process is understood during which, under appropriate conditions, two nucleotide fragments, such as for example a hybridization probe and a target nucleotide fragment, which have sufficiently complementary sequences are capable of forming a double strand with hydrogen bonds Stable and specific. A nucleotide fragment "capable of hybridizing" with a polynucleotide is a fragment that can hybridize with said polynucleotide under hybridization conditions that can be determined in each case in a known manner. The hybridization conditions are determined by the rigor, that is to say the rigor of the conditions of realization. Hybridization is even more specific as it is performed more rigorously. The stringency is defined in particular as a function of the composition based on a probe / target duplex, as well as the degree of mismatch between two nucleic acids. The rigor may also depend on the parameters of the reaction, such as the concentration and type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and concentration of denaturing agents and / or the temperature of hybridization. The stringency of the conditions in which a hybridization reaction must be performed will depend mainly on the hybridization probes used. All these data are of course known and the appropriate conditions can be determined by the person skilled in the art. In general, depending on the length of the hybridization probes used, the temperature for the hybridization reaction is between about 20 and 70 ° C, in particular between 35 and 65 ° C in a saline solution at a concentration of about 0.5 to 1 M. A hybridization reaction detection stage is then performed.
Por detección, se entiende o bien una detección directa por un método físico, o bien un método de detección con la ayuda de un marcador. Numerosos métodos de detección existen para la detección de los ácidos nucleicos [1, 2]. By detection, it is understood either a direct detection by a physical method, or a detection method with the help of a marker. Numerous methods of detection exist for the detection of nucleic acids [1,2].
Por marcador, se entiende un trazador capaz de generar una señal. Una lista no limitativa de estos trazadores comprende las enzimas que producen una señal detectable, por ejemplo por colirometría, fluorescencia o luminescencia, como la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la -galactosidasa, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; los cromóforos como los compuestos fluorescentes, luminescentes o colorantes; los grupos de densidad electrónica detectables por microscopía electrónica o por sus propiedades eléctricas como la conductividad, por los métodos de amperometría o de voltametría, o por mediciones de impedancia; los grupos detectables por métodos ópticos como la difracción, la resonancia plasmón de superficie, la variación de ángulo de contacto o mediante unos métodos físicos como la espectroscopía de fuerza atómica, el efecto túnel, etc.; las moléculas radioactivas como 32P, 35S o 125I. Así, el polinucleótido puede ser marcado durante la etapa de amplificación enzimática, por ejemplo utilizando un nucleótido trifosfato marcado para la reacción de amplificación. El nucleótido marcado será un desoxirribonucleótido en los sistemas de amplificación que generan un ADN, como la PCR, o un ribonucleótido en las técnicas de amplificación que generan un ARN, como las técnicas TMA o NASBA. El polinucleótido puede también ser marcado después de la etapa de amplificación, por ejemplo hibridando una sonda marcada según la técnica de hibridación sándwich descrita en el documento WO-A-91/19812. A marker means a plotter capable of generating a signal. A non-limiting list of these tracers comprises enzymes that produce a detectable signal, for example by colyrometry, fluorescence or luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, -galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase; chromophores such as fluorescent, luminescent or dye compounds; electron density groups detectable by electron microscopy or by their electrical properties such as conductivity, by amperometry or voltammetry methods, or by impedance measurements; the groups detectable by optical methods such as diffraction, surface plasmon resonance, contact angle variation or by physical methods such as atomic force spectroscopy, tunnel effect, etc .; radioactive molecules such as 32P, 35S or 125I. Thus, the polynucleotide can be labeled during the enzymatic amplification step, for example using a labeled triphosphate nucleotide for the amplification reaction. The labeled nucleotide will be a deoxyribonucleotide in amplification systems that generate a DNA, such as PCR, or a ribonucleotide in amplification techniques that generate an RNA, such as TMA or NASBA techniques. The polynucleotide can also be labeled after the amplification step, for example by hybridizing a labeled probe according to the sandwich hybridization technique described in WO-A-91/19812.
En el sentido de la presente invención, la sonda de hibridación puede ser una sonda denominada de captura. En este caso, el fragmento nucleotídico diana puede ser previamente marcado mediante un marcador. La sonda denominada de captura está inmovilizada o puede ser inmovilizada sobre un soporte sólido mediante cualquier medio apropiado, es decir directa o indirectamente, por ejemplo por covalencia o adsorción. Se realiza entonces una reacción de hibridación entre dicha sonda de detección y el fragmento nucleotídico diana marcado. In the sense of the present invention, the hybridization probe may be a so-called capture probe. In this case, the target nucleotide fragment can be previously labeled by a marker. The so-called capture probe is immobilized or can be immobilized on a solid support by any appropriate means, that is directly or indirectly, for example by covalence or adsorption. A hybridization reaction is then performed between said detection probe and the labeled target nucleotide fragment.
La sonda de hibridación puede también ser una sonda denominada de detección. En este caso, la sonda de hibridación puede ser marcada mediante un marcador. Se realiza entonces una reacción de hibridación entre dicha sonda de captura y el fragmento nucleotídico diana. The hybridization probe may also be a so-called detection probe. In this case, the hybridization probe can be labeled by a marker. A hybridization reaction is then performed between said capture probe and the target nucleotide fragment.
Ya se use una sonda denominada de captura o una sonda denominada de detección, la reacción de hibridación puede ser realizada en un soporte sólido que incluye todos los materiales sobre los cuales se puede inmovilizar un ácido nucleico. Como soporte sólido se pueden utilizar unos materiales de síntesis o unos materiales naturales, eventualmente modificados químicamente, en particular los polisacáridos tales como los materiales a base de celulosa, por ejemplo papel, derivados de celulosa tales como el acetato de celulosa y la nitrocelulosa o el dextrano, unos polímeros, unos copolímeros, en particular a base de monómeros de tipo estireno, unas fibras naturales tales como el algodón, y unas fibras sintéticas tales como el nylon; unos materiales minerales tales como la sílice, el cuarzo, vidrios, cerámicas; látex; partículas magnéticas; derivados metálicos, geles, etc. El soporte sólido puede estar en forma de una placa de microtitulación, de una membrana como se describe en la solicitud WO-A-94/12670, de una partícula o de un biochip. Whether a so-called capture probe or a so-called detection probe is used, the hybridization reaction can be performed on a solid support that includes all the materials on which a nucleic acid can be immobilized. As solid support, synthetic materials or natural materials, possibly chemically modified, can be used, in particular polysaccharides such as cellulose-based materials, for example paper, cellulose derivatives such as cellulose acetate and nitrocellulose or dextran, polymers, copolymers, in particular based on styrene monomers, natural fibers such as cotton, and synthetic fibers such as nylon; mineral materials such as silica, quartz, glass, ceramics; latex; Magnetic particles; metal derivatives, gels, etc. The solid support may be in the form of a microtiter plate, of a membrane as described in application WO-A-94/12670, of a particle or of a biochip.
En la presente invención, la determinación de la expresión de un gen diana se puede analizar por la expresión de los ARNm que se transcriben en un tiempo dado. En este caso, el material biológico es un ácido nucleico, y el reactivo específico puede ser indiferentemente un cebador de amplificación o una sonda de hibridación tales como se han definido anteriormente. In the present invention, the determination of the expression of a target gene can be analyzed by the expression of mRNAs that are transcribed at a given time. In this case, the biological material is a nucleic acid, and the specific reagent can be indifferently an amplification primer or a hybridization probe as defined above.
Se puede determinar la expresión de un gen diana de la siguiente manera: The expression of a target gene can be determined as follows:
1) después de extraer los ARN totales de una muestra sanguínea o de PBMCs, se realiza una etapa de transcripción inversa, tal como se ha descrito anteriormente a fin de obtener los diferentes ADN complementarios de los diferentes 1) After extracting the total RNAs from a blood sample or PBMCs, a reverse transcription step is performed, as described above in order to obtain the different complementary DNAs of the different
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ARN mensajeros inicialmente presentes en la muestra sanguínea o en los PBMCs (o ADNc), Messenger RNAs initially present in the blood sample or in the PBMCs (or cDNA),
2) se amplifican específicamente los ADNc. En este caso, el reactivo específico utilizado comprende al menos un cebador de amplificación específica del gen diana, tal como se ha definido anteriormente. Esta etapa se puede realizar en particular mediante una reacción de amplificación de tipo PCR o mediante cualquier otra técnica de amplificación apropiada, 2) cDNAs are specifically amplified. In this case, the specific reagent used comprises at least one amplification primer specific to the target gene, as defined above. This step can be carried out in particular by a PCR amplification reaction or by any other appropriate amplification technique,
3) se determina la expresión del gen diana cuantificando los ADNc. Los ADNc pueden ser cuantificados en particular por la utilización de un intervalo de cuantificación obtenida por una reacción de amplificación llevada a cabo hasta saturación. A fin de tener en cuenta la variabilidad de eficacia enzimática que puede observarse durante diferentes etapas (transcripción inversa, PCR cuantitativa, etc.), se puede normalizar la expresión del gen diana de los diferentes grupos de pacientes, mediante la determinación simultánea de la expresión de un gen denominado doméstico, cuya expresión es similar en los diferentes grupos de pacientes. Realizando una relación entre la expresión del gen diana y la expresión del gen doméstico, se corrige así cualquier variabilidad entre los diferentes experimentos. El experto en la materia podrá referirse en particular a las publicaciones siguientes: [3-4] Bustin SA Journal of molecular endocrinology, 2002, 29: 23-39; Giulietti A Methods, 2001, 25: 386-401. 3) expression of the target gene is determined by quantifying the cDNAs. The cDNAs can be quantified in particular by the use of a quantification interval obtained by an amplification reaction carried out until saturation. In order to take into account the variability of enzymatic efficacy that can be observed during different stages (reverse transcription, quantitative PCR, etc.), the expression of the target gene of the different groups of patients can be normalized, by simultaneously determining the expression of a gene called domestic, whose expression is similar in different groups of patients. By making a relationship between the expression of the target gene and the expression of the domestic gene, any variability between the different experiments is corrected. The person skilled in the art may refer in particular to the following publications: [3-4] Bustin SA Journal of molecular endocrinology, 2002, 29: 23-39; Giulietti A Methods, 2001, 25: 386-401.
Se puede también determinar la expresión d'un gen diana de la siguiente manera: The expression of a target gene can also be determined as follows:
1) después de extraer los ARN totales de una muestra sanguínea o de PBMCs, se realiza una etapa de transcripción inversa, tal como se ha descrito anteriormente, a fin de obtener los diferentes ADN complementarios de los diferentes ARN mensajeros inicialmente presentes en la muestra o los PBMCs (o ADNc) 1) after extracting the total RNAs from a blood sample or from PBMCs, a reverse transcription step is performed, as described above, in order to obtain the different complementary DNAs of the different messenger RNAs initially present in the sample or PBMCs (or cDNA)
2) se inmovilizan los ADNc sobre una membrana 2) cDNAs are immobilized on a membrane
3) se determina la expresión del gen diana hibridando los ADNc a unas sondas de hibridación específicas del gen diana previamente marcadas. Tales técnicas de hibridación son bien conocidas por el experto en la materia, y se puede citar en particular la técnica de transferencia Northern. Esta reacción de hibridación se puede realizar después de una etapa de amplificación específica de los ADN complementarios de los ARN mensajeros de un gen diana cuando en particular el gen está débilmente expresado. 3) the expression of the target gene is determined by hybridizing the cDNAs to a previously labeled target gene hybridization probes. Such hybridization techniques are well known to those skilled in the art, and the Northern transfer technique can be cited in particular. This hybridization reaction can be performed after a specific amplification step of the complementary DNAs of the messenger RNAs of a target gene when in particular the gene is weakly expressed.
La expresión de un gen diana se puede realizar también por la expresión de las proteínas codificadas por el gen diana. En este caso, el material biológico es una proteína y se pueden utilizar varias técnicas de detección con o sin ligando. La espectrometría de masa se puede utilizar como técnica de detección sin ligando. El reactivo específico puede ser un anticuerpo específico de la proteína codificada por el gen diana para un sistema de detección con ligando. The expression of a target gene can also be performed by the expression of the proteins encoded by the target gene. In this case, the biological material is a protein and several detection techniques can be used with or without ligand. Mass spectrometry can be used as a detection technique without ligand. The specific reagent may be a protein specific antibody encoded by the target gene for a ligand detection system.
Los anticuerpos recombinantes, específicos de la proteína traducida del gen diana se pueden obtener según procedimientos clásicos conocidos por el experto en la materia, a partir de organismos procariotas, tales como bacterias, o a partir de organismos eucariotas, tales como levaduras, células de mamíferos, de plantas, de insectos Recombinant antibodies, specific to the translated protein of the target gene can be obtained according to classical procedures known to those skilled in the art, from prokaryotic organisms, such as bacteria, or from eukaryotic organisms, such as yeasts, mammalian cells, of plants, of insects
o de animales, o mediante sistemas de producción extra-celular. or of animals, or through extra-cellular production systems.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados según las técnicas clásicas conocidas por el experto en la materia tales como la técnica de los hibridomas cuyo principio general se recuerda a continuación. Monoclonal antibodies can be prepared according to the classical techniques known to those skilled in the art such as the hybridoma technique whose general principle is recalled below.
En un primer tiempo, se inmuniza un animal, generalmente un ratón, (o unas células en cultivo en el ámbito de inmunizaciones in vitro) con un antígeno diana de interés, cuyos linfocitos B son entonces capaces de producir unos anticuerpos contra dicho antígeno. Estos linfocitos productores de anticuerpos son después fusionados con unas células mielomatosas “inmortales” (murinas en el ejemplo) para dar lugar a unos hibridomas. A partir de la mezcla heterogénea de las células así obtenida, se efectúa entonces una selección de las células capaces de producir un anticuerpo particular y multiplicarse indefinidamente. Cada hibridoma se multiplica en forma de clon, conduciendo cada uno a la producción de un anticuerpo monoclonal cuyas propiedades de reconocimiento frente al antígeno de interés podrán ser ensayadas por ejemplo en ELISA, por inmunotransferencia en una o dos dimensiones, en inmunofluorescencia, o con la ayuda de un biosensor. Los anticuerpos monoclonales así seleccionados son después purificados en particular según la técnica de cromatografía de afinidad. Initially, an animal, usually a mouse, (or cells in culture in the field of in vitro immunizations) is immunized with a target antigen of interest, whose B lymphocytes are then capable of producing antibodies against said antigen. These antibody producing lymphocytes are then fused with "immortal" myelomatous cells (murine in the example) to give rise to hybridomas. From the heterogeneous mixture of the cells thus obtained, a selection is then made of the cells capable of producing a particular antibody and multiplying indefinitely. Each hybridoma is multiplied in the form of a clone, each leading to the production of a monoclonal antibody whose recognition properties against the antigen of interest may be tested for example in ELISA, by immunoblotting in one or two dimensions, in immunofluorescence, or with the Help from a biosensor. The monoclonal antibodies so selected are then purified in particular according to the affinity chromatography technique.
Se pueden obtener unos fragmentos de anticuerpos por ejemplo por proteólisis. Así, pueden ser obtenidos por digestión enzimática, resultando en fragmentos de tipo Fab (tratamiento con papaína [5] o de tipo F(ab)’2 (tratamiento con pepsina; [6]. Pueden también ser preparados por vía recombinante [7]. Otro fragmento de anticuerpo que conviene a los fines de la invención comprende un fragmento Fv que es un dímero constituido de la asociación no covalente del dominio variable ligero (VL) y del dominio variable pesado (VH) del fragmento Fab, por lo tanto la asociación de dos cadenas polipeptídicas. A fin de mejorar la estabilidad del fragmento Fv debido a la separación de dos cadenas polipeptídicas, este fragmento Fv puede ser modificado por ingeniería genética insertando un enlace peptídico adaptado entre el dominio VL y el dominio VH [8]. Se habla entonces de fragmento scFv (“single chain Fragment variable”) ya que está constituido de una sola cadena polipeptídica. La utilización de un enlace peptídico compuesto preferiblemente de 15 a 25 aminoácidos permite unir el extremo C-terminal de un Antibody fragments can be obtained for example by proteolysis. Thus, they can be obtained by enzymatic digestion, resulting in Fab type fragments (treatment with papain [5] or type F (ab) '2 (treatment with pepsin; [6]. They can also be prepared recombinantly [7] Another antibody fragment that is suitable for the purposes of the invention comprises an Fv fragment which is a dimer constituted of the non-covalent association of the light variable domain (VL) and the heavy variable domain (VH) of the Fab fragment, hence the association of two polypeptide chains In order to improve the stability of the Fv fragment due to the separation of two polypeptide chains, this Fv fragment can be engineered by inserting an adapted peptide bond between the VL domain and the VH domain [8]. There is talk of a scFv fragment ("single chain Fragment variable") since it is made up of a single polypeptide chain, the use of a peptide bond preferably composed of 15 to 25 amino acids allows to join the C-terminal end of a
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presencia o no de inmunoestimulantes. La determinación se ha efectuado por un ensayo ELISA sobre sobrenadantes de cultivo obtenidos después de 45 horas. El eje de las ordenadas representa las concentraciones proteicas (pg/ml) de TNF- (figura 4A) y de IL-10 (figura 4B). Los histogramas negros representan las células estimuladas dos veces por LPS sin profármaco (control). Los histogramas blancos corresponden a las células estimuladas dos veces por LPS en presencia de IFN-1b (Imukin™, Boehringer, Ingelheim, Austria) a 100 ng/ml, los histogramas grises en presencia de 100 ng/ml de GM-CSF (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemnia) y los histogramas con rayas en presencia de 100 ng/ml de FLT3-L (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania). Los datos son representados en media +/-desviación estándar. Se ha realizado un ensayo con aparato Wicoxon para el análisis estadístico de los resultados corrigiendo por el número de ensayo efectuado: * significa que p<0,017 frente a células estimuladas dos veces con LPS sin profármaco. presence or not of immunostimulants. The determination was made by an ELISA test on culture supernatants obtained after 45 hours. The axis of the ordinates represents the protein concentrations (pg / ml) of TNF- (Figure 4A) and IL-10 (Figure 4B). Black histograms represent cells stimulated twice by LPS without prodrug (control). The white histograms correspond to cells stimulated twice by LPS in the presence of IFN-b1b (Imukin ™, Boehringer, Ingelheim, Austria) at 100 ng / ml, the gray histograms in the presence of 100 ng / ml of GM-CSF ( Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemnia) and the histograms with stripes in the presence of 100 ng / ml of FLT3-L (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany). The data are represented on average +/- standard deviation. A test with Wicoxon apparatus was performed for the statistical analysis of the results, correcting for the test number performed: * means that p <0.017 against cells stimulated twice with LPS without prodrug.
Figura 6: la figura 6 muestra la expresión de los genes de TNF alfa (A), IL-10 (B), HLA-DRA (C), CIITA (D), IRAK-M (E), ABIN-3 (F), LY64 (G), S100A9 (H), S100A8 (I), GBP1 (J), MMP7 (K), CXCL1 (L), CXCL10 (M), COX2 (N), FCN1 (O), TNFAIP6 (P), CXCL7 (Q), CXCL5 (R), PID1 (S) y RHOU (T) por PBMCs, procedentes de 7 voluntarios sanos, estimuladas dos veces por LPS (2 ng/ml después 100 ng/ml) en presencia o no de profármacos, y cuantificadas por biochip después de 45 horas. El eje de las ordenadas representa la intensidad de fluorescencia de cada una de las sondas de hibridación: (A) 207113_s_at para el TNFa; (B) 207433_at para IL-10; (C) 208894_at para HLA-DRA; (D) 205101_at para CIITA; (E) 213817_at para IRAK-M; (F) 220655_at para ABIN-3; (G) 206206_at para LY64; (H) 203535_at para S100A9; (I) 202917_s_at para S100A8;(J) 202269_x_at para GBP1; (K) 204259_art para MMP7; (L) 204470_at para CXCL1; (M) 204533_at para CXCL10; (N) 204748_at para COX2; (O) 205237_at para FCN1; (P) 206026_s_at para TNFAIP6; (Q) 214146_s_at para CXCL7; (R) 215101_s_at para CXCL5; (S) 219093_at para PID1 y (T) 223168_at para RHOU. Los histogramas negros representan las células estimuladas dos veces por LPS sin profármaco (control). Los histogramas blancos corresponden a las células estimuladas dos veces por LPS en presencia de IFN-1b a 100 ng/ml, los histogramas grises en presencia de 100 ng/ml de GM-CSF y los histogramas con rayas en presencia de 100 ng/ml de FLT3-L. Los datos son representados en media +/-desviación estándar. Se ha realizado un t-ensayo con aparato para el análisis estadístico de los resultados corrigiendo por el número de ensayo efectuado: * significa que p<0,05 frente a células estimuladas dos veces con LPS sin inmunoestimulante. Figure 6: Figure 6 shows the expression of TNF alpha (A), IL-10 (B), HLA-DRA (C), CIITA (D), IRAK-M (E), ABIN-3 (F ), LY64 (G), S100A9 (H), S100A8 (I), GBP1 (J), MMP7 (K), CXCL1 (L), CXCL10 (M), COX2 (N), FCN1 (O), TNFAIP6 (P ), CXCL7 (Q), CXCL5 (R), PID1 (S) and RHOU (T) by PBMCs, from 7 healthy volunteers, stimulated twice by LPS (2 ng / ml after 100 ng / ml) in the presence or not of prodrugs, and quantified by biochip after 45 hours. The axis of the ordinates represents the fluorescence intensity of each of the hybridization probes: (A) 207113_s_at for TNFa; (B) 207433_at for IL-10; (C) 208894_at for HLA-DRA; (D) 205101_at for CIITA; (E) 213817_at for IRAK-M; (F) 220655_at for ABIN-3; (G) 206206_at for LY64; (H) 203535_at for S100A9; (I) 202917_s_at for S100A8; (J) 202269_x_at for GBP1; (K) 204259_art for MMP7; (L) 204470_at for CXCL1; (M) 204533_at for CXCL10; (N) 204748_at for COX2; (O) 205237_at for FCN1; (P) 206026_s_at for TNFAIP6; (Q) 214146_s_at for CXCL7; (R) 215101_s_at for CXCL5; (S) 219093_at for PID1 and (T) 223168_at for RHOU. Black histograms represent cells stimulated twice by LPS without prodrug (control). The white histograms correspond to cells stimulated twice by LPS in the presence of IFN-b1b at 100 ng / ml, the gray histograms in the presence of 100 ng / ml of GM-CSF and the histograms with stripes in the presence of 100 ng / ml of FLT3-L. The data are represented on average +/- standard deviation. A t-test was carried out with an apparatus for the statistical analysis of the results, correcting for the test number carried out: * means that p <0.05 against cells stimulated twice with LPS without immunostimulant.
Figura 7: la figura 7 muestra la expresión de los genes de TNFa (A), IL-10 (B), HLA-DRA (C), CIITA (D), IRAK-M (E), ABIN-3 (F), LY64 (G), S100A9 (H) , S100A8 (I), GBP1 (J), MMP7 (K), CXCL1 (L), CXCL10 (M), COX2 (N), FCN1 (O), TNFAIP6 (P), CXCL7 (Q), CXCL5 (R), PID1 (S) y RHOU (T) por PBMCs, procedentes de 7 voluntarios sanos, estimuladas dos veces por LPS (2 ng/ml después 100 ng/ml) en presencia o no de profármacos, y cuantificadas por qRT-PCR después de 45 horas. El eje de las ordenadas representa los porcentajes de inducción de expresión de los genes citados anteriormente. Los histogramas negros representan las células estimuladas dos veces por LPS sin profármaco (control). Los histogramas blancos corresponden a las células estimuladas dos veces por LPS en presencia de IFN-1b a 100 ng/ml, los histogramas grises en presencia de 100 ng/ml de GM-CSF y los histogramas con rayas en presencia de 100 ng/ml de FLT3-L. Los datos son representados en media +/-desviación estándar. Se ha realizado un ensayo con aparato de Wilcoxon para el análisis estadístico de los resultados corrigiendo por el número de ensayo efectuado: * significa que p<0,05 frente a células estimuladas dos veces con LPS sin inmunoestimulante. Figure 7: Figure 7 shows the expression of the TNFa (A), IL-10 (B), HLA-DRA (C), CIITA (D), IRAK-M (E), ABIN-3 (F) genes , LY64 (G), S100A9 (H), S100A8 (I), GBP1 (J), MMP7 (K), CXCL1 (L), CXCL10 (M), COX2 (N), FCN1 (O), TNFAIP6 (P) , CXCL7 (Q), CXCL5 (R), PID1 (S) and RHOU (T) by PBMCs, from 7 healthy volunteers, stimulated twice by LPS (2 ng / ml after 100 ng / ml) in the presence or absence of prodrugs, and quantified by qRT-PCR after 45 hours. The axis of the ordinates represents the percentages of induction of expression of the genes mentioned above. Black histograms represent cells stimulated twice by LPS without prodrug (control). The white histograms correspond to cells stimulated twice by LPS in the presence of IFN-b1b at 100 ng / ml, the gray histograms in the presence of 100 ng / ml of GM-CSF and the histograms with stripes in the presence of 100 ng / ml of FLT3-L. The data are represented on average +/- standard deviation. A Wilcoxon apparatus test was performed for the statistical analysis of the results, correcting for the test number performed: * means that p <0.05 against cells stimulated twice with LPS without immunostimulant.
Figura 8: las figuras 8A y 8B representan respectivamente las concentraciones de TNF- y de IL-10 producidas por células de la sangre total, procedentes de 5 pacientes en choque séptico extraídos entre D1 y D3, y 5 voluntarios sanos, estimuladas o no (control) por LPS a 100 ng/ml +/-100 ng/ml de IFN-1b. Las determinaciones proteicas se han realizado por un ensayo ELISA sobre sobrenadantes de cultivo obtenidos después de 15 horas. El eje de las ordenadas representa las concentraciones proteicas (pg/ml) de TNF- (figura 6A) y de IL-10 (figura 6B). Los histogramas negros representan los pacientes en choque séptico y los histogramas en blanco representan los voluntarios sanos. Los datos son representados en medio +/-desviación estándar. Figure 8: Figures 8A and 8B respectively represent the concentrations of TNF- and IL-10 produced by whole blood cells, from 5 patients in septic shock extracted between D1 and D3, and 5 healthy volunteers, stimulated or not (control) by LPS at 100 ng / ml +/- 100 ng / ml of IFN-1b. Protein determinations have been performed by an ELISA assay on culture supernatants obtained after 15 hours. The axis of the ordinates represents the protein concentrations (pg / ml) of TNF- (Figure 6A) and IL-10 (Figure 6B). Black histograms represent patients in septic shock and blank histograms represent healthy volunteers. The data is represented by means +/- standard deviation.
Figura 9: La figura 9 representa la expresión de los genes de TNF-α (A), IL-10 (B), HLA-DRA (C), CIITA (D), GBP1 (E), CXCL10 (F), COX2 (G), TNFAIP6 (H) y CXCL5 (I) por unas células de la sangre total, procedentes de 5 pacientes en choque séptico extraídos entre D1 y D3 y 5 voluntarios sanos, estimuladas o no (controles) por LPS a 100 ng/ml +/-100 ng/ml de IFN-1b. La cuantificación de estos genes se ha efectuado por qRT-PCR sobre los residuos celulares obtenidos después de 15 horas. El eje de las ordenadas representa los porcentajes de inducción de expresión de los genes citados anteriormente. Los histogramas negros representan los pacientes en choque séptico y los histogramas en blanco representan los voluntarios sanos. Figure 9: Figure 9 represents the expression of the TNF-α (A), IL-10 (B), HLA-DRA (C), CIITA (D), GBP1 (E), CXCL10 (F), COX2 genes (G), TNFAIP6 (H) and CXCL5 (I) by whole blood cells, from 5 patients in septic shock extracted between D1 and D3 and 5 healthy volunteers, stimulated or not (controls) by LPS at 100 ng / ml +/- 100 ng / ml of IFN-1b. The quantification of these genes has been carried out by qRT-PCR on the cellular residues obtained after 15 hours. The axis of the ordinates represents the percentages of induction of expression of the genes mentioned above. Black histograms represent patients in septic shock and blank histograms represent healthy volunteers.
Ejemplos Examples
Los ejemplos siguientes se dan a título ilustrativo y no tienen ningún carácter limitativo. Permiten comprender mejor la invención. The following examples are given by way of illustration and have no limitation. They allow a better understanding of the invention.
Materiales y métodos Materials and methods
Preparación de PBMCs y parámetros experimentales del modelo de tolerancia a la endotoxina (ET) Preparation of PBMCs and experimental parameters of the endotoxin tolerance (ET) model
5 5
10 10
15 fifteen
20 twenty
25 25
30 30
35 35
40 40
45 Four. Five
Tabla Table
- Gen Gen
- nº de acceso GenBank Cebadores SEQ ID NO GenBank accession number Primers SEQ ID NO
- IL-10 IL-10
- NM_000572.2 5'-AATAAGGTTTCTCAAGGGGCT-3' sentido 1 NM_000572.2 5'-AATAAGGTTTCTCAAGGGGCT-3 ' sense one
- 5'-AGAACCAAGACCCAGACATCAA-3' 5'-AGAACCAAGACCCAGACATCAA-3 '
- anti-sentido 2 anti-sense 2
- HLA-DRA HLA-DRA
- NM_019111.4 5'-GCCAACCTGGAAATCATGACA-3' sentido 3 NM_019111.4 5'-GCCAACCTGGAAATCATGACA-3 ' sense 3
- 5'-AGGGCTGTTCGTGAGCACA-3' 5'-AGGGCTGTTCGTGAGCACA-3 '
- anti-sentido 4 anti-sense 4
- CIITA APPOINTMENT
- NM_000246.3 5'-GCTGGGATTCCTACACAATGC-3' sentido 5 NM_000246.3 5'-GCTGGGATTCCTACACAATGC-3 ' sense 5
- 5'-CGGGTTCTGAGTAGAGCTCAATCT-3' 5'-CGGGTTCTGAGTAGAGCTCAATCT-3 '
- anti-sentido 6 anti-sense 6
- IRAK-M IRAK-M
- NM_007199.2 5'-TTTGAATGCAGCCAGTCTGA-3' sentido 7 NM_007199.2 5'-TTTGAATGCAGCCAGTCTGA-3 ' sense 7
- NM_001142523.1 NM_001142523.1
- 5'-GCATTGCTTATGGAGCCAAT-3' anti-sentido 8 5'-GCATTGCTTATGGAGCCAAT-3 ' anti-sense 8
- ABIN-3 ABIN-3
- NM_024873.4 5'-GAATTCCCAGATAAAAGCTTGT-3' sentido 9 NM_024873.4 5'-GAATTCCCAGATAAAAGCTTGT-3 ' sense 9
- NM 001128843.1 NM 001128843.1
- 5'-GACAGTCTGGTGGGTGCTC-3' anti-sentido 10 5'-GACAGTCTGGTGGGTGCTC-3 ' anti-sense 10
- S100A9 S100A9
- NM_002965.3 5'-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3' sentido 11 NM_002965.3 5'-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3 ' sense eleven
- 5'-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3' 5'-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3 '
- anti-sentido 12 anti-sense 12
- S100AB S100AB
- NM_002964.4 5'-ATTTCCATGCCGTCTACAGG-3' sentido 13 NM_002964.4 5'-ATTTCCATGCCGTCTACAGG-3 ' sense 13
- 5'-CACCAGAATGAGGAACTCCT-3' 5'-CACCAGAATGAGGAACTCCT-3 '
- anti-sentido 14 anti-sense 14
- LY64 LY64
- NM_005582.2 5'-GCATTGAGAAAGAAGCCAACAA-3' sentido 15 NM_005582.2 5'-GCATTGAGAAAGAAGCCAACAA-3 ' sense fifteen
- 5'-GAAAAGTGTCTTCATGTATCC-3' 5'-GAAAAGTGTCTTCATGTATCC-3 '
- anti-sentido 16 anti-sense 16
Enfoque transcripcional sobre biochip en pacientes en choque séptico Transcriptional approach to biochip in patients in septic shock
Varias muestras de sangre recogidas directamente en tubos PAXgeneTM (PreAnalytiX a Qiagen/BD Company) se obtuvieron a partir de 19 pacientes en choque séptico en el momento del diagnóstico de choque (es decir en las 2 horas tras el inicio del tratamiento vasopresor) y 48 horas después, como se ha descrito anteriormente [9]. El ARN total se ha extraído con la ayuda del kit PAXgene Blood RNA kit™ (PreAnalytix). Una etapa de digestión con DNAsa (Qiagen) se ha efectuado durante la extracción a fin de eliminar cualquier traza de ADN. La integridad y la calidad de los ARN se verificaron por electroforesis capilar sobre el bioanalizador 2100 AgilentTM (Agilent). Los biochips se realizaron según las instrucciones del fabricante (Affymetrix). La reacción de transcripción inversa de los ARNm se ha realizado con el protocolo de Affymetrix a partir de 3 g de ARN total. Se ha utilizado un cebador oligonucleotídico polyT para determinar únicamente los ARNm contenidos en la solución de los ARN totales durante la transcripción inversa. El conjunto de las etapas se ha realizado con el kit Affymetrix -GeneChip® One-Cycle Target Labeling and Control Reagents. Los productos de la transcripción inversa (ANDc) se utilizaron después para la síntesis del ARNc marcado por la biotina durante 16 horas a 37ºC. Después de la etapa de purificación del ARNc para quitar los dNTP no incorporados, los ARNc se cuantificaron y fragmentaron. El control de la fragmentación se realiza por electroforesis capilar (Agilent). La hibridación del ARNc se realiza con el biochip GeneChipHuman Genome U133 Plus 2 antes de la etapa de amplificación de la señal por la incubación con la mezcla SAPE que contiene Straptavidina Phycoerytrhine después los anticuerpos IgG de cabra anti-estreptavidina mezclados con el anticuerpo biotinilado anti-IgG de cabra. Esta última etapa utiliza la plataforma Fluidic FS450. El análisis de los datos Affymetrix empieza por la captura de la imagen del biochip por el escáner GeneChip 3000 de Affymetrix. Los datos se normalizaron después por RMA (Robust Multiple -Array Average) (Irizarry RA, Biostatistics 2003). Todos los datos basados en la intensidad de la señal se utilizaron después de la normalización. Several blood samples collected directly in PAXgeneTM tubes (PreAnalytiX to Qiagen / BD Company) were obtained from 19 patients in septic shock at the time of shock diagnosis (i.e. within 2 hours after the start of vasopressor treatment) and 48 hours later, as described previously [9]. Total RNA has been extracted with the help of PAXgene Blood RNA kit ™ (PreAnalytix). A step of digestion with DNAse (Qiagen) has been carried out during the extraction in order to eliminate any trace of DNA. The integrity and quality of the RNAs were verified by capillary electrophoresis on the AgilentTM 2100 bioanalyzer (Agilent). The biochips were made according to the manufacturer's instructions (Affymetrix). The reverse transcription reaction of the mRNAs has been performed with the Affymetrix protocol from 3 µg of total RNA. A polyT oligonucleotide primer has been used to determine only mRNAs contained in the solution of total RNAs during reverse transcription. All the stages have been carried out with the Affymetrix -GeneChip® One-Cycle Target Labeling and Control Reagents kit. Reverse transcription products (ANDc) were then used for the synthesis of biotin-labeled cRNA for 16 hours at 37 ° C. After the cRNA purification step to remove unincorporated dNTPs, the cRNAs were quantified and fragmented. Fragmentation control is performed by capillary electrophoresis (Agilent). The cRNA hybridization is performed with the GeneChipHuman Genome U133 Plus 2 biochip before the signal amplification stage by incubation with the SAPE mixture containing Straptavidin Phycoerytrhine after the goat anti-streptavidin IgG antibodies mixed with the biotinylated anti-biotinylated antibody Goat IgG This last stage uses the Fluidic FS450 platform. The analysis of the Affymetrix data begins with the capture of the biochip image by the Affymetrix GeneChip 3000 scanner. The data were then normalized by RMA (Robust Multiple -Array Average) (Irizarry RA, Biostatistics 2003). All data based on the signal strength were used after normalization.
Efecto de IFN- en un modelo de sangre total de pacientes en choque séptico Effect of IFN- in a total blood model of patients in septic shock
La sangre de 5 pacientes en choque séptico se ha recogido en tubo EDTA, entre D1 y D3 según el inicio del choque, así como en 5 voluntarios sanos. Después de la centrifugación y extracción del plasma, se han diluido 3 ml de sangre al ½ en 3 ml de medio RPMI 1640 (Eurobio, Courtaboeuf, Francia) después se cultivaron en presencia o en ausencia (grupo control) de 100 ng/ml de LPS +/-100 ng/ml de IFN-1b (Imukin) durante una noche a 37ºC y un 5% de CO2 (15 horas). Para cada condición, los sobrenadantes así como los residuos celulares se recuperaron y conservaron a -80ºC para la determinación ELISA de TNF- y de IL-10 y a -20ºC para la extracción ARN y la cuantificación por qRT-PCR, como se ha descrito anteriormente. The blood of 5 patients in septic shock has been collected in EDTA tube, between D1 and D3 according to the onset of the shock, as well as in 5 healthy volunteers. After centrifugation and plasma extraction, 3 ml of ½ blood have been diluted in 3 ml of RPMI 1640 medium (Eurobio, Courtaboeuf, France) then grown in the presence or absence (control group) of 100 ng / ml of LPS +/- 100 ng / ml of IFN-1b (Imukin) overnight at 37 ° C and 5% CO2 (15 hours). For each condition, supernatants as well as cell debris were recovered and stored at -80 ° C for the ELISA determination of TNF- and IL-10 and at -20 ° C for RNA extraction and quantification by qRT-PCR, as described previously.
Análisis estadísticas Statistical analysis
Los resultados son expresados en media desviación estándar (SD). El análisis estadístico se ha realizado mediante el ensayo con aparato de Wilcoxon. The results are expressed as mean standard deviation (SD). The statistical analysis was carried out by the Wilcoxon apparatus test.
Resultados Results
Descripción del modelo de ET ET Model Description
Los modelos de ET se caracerizan por una reducción de la producción de TNF- asociada a un aumento de la secreción de IL-10 tras una segunda estimulación por LPS. La producción de estas citoquinas se midió por lo tanto ET models are characterized by a reduction in TNF- production associated with an increase in IL-10 secretion after a second stimulation by LPS. The production of these cytokines was therefore measured
5 5
10 10
15 fifteen
20 twenty
25 25
30 30
35 35
40 40
45 Four. Five
50 fifty
55 55
60 60
65 65
en el sobrenadante de cultivo de PBMCs tras una o dos estimulaciones por LPS. Como se muestra en la figura 1A, las células estimuladas dos veces por LPS producen bajas cantidades de TNF- (58,5 68,3 pg/ml) comparadas con las células estimuladas únicamente una vez (1208 594 pg/ml). Por el contrario, como se muestra en la figura 1B, estas mismas células segregan más fuertes concentraciones de IL-10 (63,2 58,2 pg/ml) en comparación con las células estimuladas una vez (8,4 6,9 pg/ml). En respuesta a una segunda estimulación endotoxínica, las células ya estimuladas liberan menos TNF- (58,5 ± 68,3 pg/ml) que las células estimuladas una sola vez (1208 ± 594 pg/ml) y producen más IL-10 (63,2 ± 58,2 frente a 8,4 ± 6,9 pg/ml) que las células estimuladas una vez). Estos resultados son confirmados a nivel ARNm ya que una disminución significativa de la expresión de TNF- (figura 2A) acoplada con un aumento de la expresión génica de IL-10 (figura 2B) en las células estimuladas dos veces por LPS se han observado en comparación con PBMCs estimuladas una sola vez. in the culture supernatant of PBMCs after one or two stimulations by LPS. As shown in Figure 1A, cells stimulated twice by LPS produce low amounts of TNF- (58.5 68.3 pg / ml) compared to cells stimulated only once (1208 594 pg / ml) . On the contrary, as shown in Figure 1B, these same cells secrete stronger concentrations of IL-10 (63.2 58.2 pg / ml) compared to cells stimulated once (8.4 6, 9 pg / ml). In response to a second endotoxin stimulation, cells already stimulated release less TNF- (58.5 ± 68.3 pg / ml) than cells stimulated once (1208 ± 594 pg / ml) and produce more IL-10 (63.2 ± 58.2 versus 8.4 ± 6.9 pg / ml) than cells stimulated once). These results are confirmed at mRNA level since a significant decrease in TNF- expression (Figure 2A) coupled with an increase in IL-10 gene expression (Figure 2B) in cells stimulated twice by LPS has been observed. compared to stimulated PBMCs only once.
Un análisis de la expresión génica de PBMCs sometidas a una o dos estimulaciones con LPS se ha realizado en biochip Affymetrix. Los genes cuya expresión difiere más entre una o dos estimulaciones con LPS (p<0,05 y diferencia de expresión >2) así como unos genes conocidos en la bibliografía por estar implicados en este estado refractario de ET o la fase de inmunosupresión inducida por los estados sépticos severos son representados en la figura 2. La segunda estimulación por endotoxina bacteriana está acompañada por un aumento de la expresión de ARNm de IL-10 (B), HLA-DRA (C), CIITA (D), IRAK-M (E), ABIN-3 (F) mientras que la expresión de TNF alfa (A) y de LY64 (G) está disminuida. La expresión génica de las alarminas S100A9 (H) y S100A8 (I), de las quemoquinas CXCL1 (L), CXCL5 (R), et CXCL7 (Q), de MMP7 (K), FCN1 (O), PID1 (S) y RHOU (T) aumentan también tras una segunda estimulación con LPS. Finalmente, la expresión de los genes inducidos por el interferón GBP1 (J) y CXCL10 (M) así como de TNFAIP6 (P) disminuye. An analysis of the gene expression of PBMCs subjected to one or two stimulations with LPS has been performed in Affymetrix biochip. Genes whose expression differs more between one or two stimulations with LPS (p <0.05 and difference in expression> 2) as well as genes known in the literature for being involved in this refractory state of ET or the immunosuppression phase induced by Severe septic states are represented in Figure 2. The second bacterial endotoxin stimulation is accompanied by an increase in mRNA expression of IL-10 (B), HLA-DRA (C), CIITA (D), IRAK-M (E), ABIN-3 (F) while the expression of TNF alpha (A) and LY64 (G) is diminished. Gene expression of alarms S100A9 (H) and S100A8 (I), of chemokines CXCL1 (L), CXCL5 (R), et CXCL7 (Q), of MMP7 (K), FCN1 (O), PID1 (S) and RHOU (T) also increase after a second stimulation with LPS. Finally, the expression of interferon-induced genes GBP1 (J) and CXCL10 (M) as well as TNFAIP6 (P) decreases.
Estos datos se han confirmado después por qRT-PCR (figura 3) en el que se ha observado el mismo perfil que aquel obtenido sobre los biochip. En respuesta a un segundo reto endotoxínico, la incapacidad para producir y expresar TNF- combinada al aumento de la producción y de la expresión de IL-10, de las células que se han previamente expuesto a una primera dosis de LPS, indica claramente el desarrollo de un estado de ET. These data have been confirmed later by qRT-PCR (Figure 3) in which the same profile as that obtained on the biochips has been observed. In response to a second endotoxin challenge, the inability to produce and express TNF- combined with the increased production and expression of IL-10, of cells that have previously been exposed to a first dose of LPS, clearly indicates the development of a state of ET.
Análisis de la expresión de los genes en pacientes en choque séptico Analysis of gene expression in patients in septic shock
A fin de ilustrar la pertinencia clínica del modelo, la expresión de estos genes en pacientes en choque séptico se ha estudiado retrospectivamente, en el momento del diagnóstico del choque y 48 horas más tarde. La expresión de los genes se ha evaluado por un enfoque sobre biochip en una cohorte de 19 pacientes descrita anteriormente [9] y 9 voluntarios sanos. Como se observa en el modelo de ET, los resultados muestran un aumento de la expresión de IL10, IRAK-M, CXCL7 y RHOU (figuras 4A, B, M y O), acoplada con una disminución de la expresión de Ly64, GBP1 y CXCL10 (figuras 4 F, G e I) en los pacientes en choque séptico en el momento del diagnóstico e incluso 48 horas más tarde comparado con los voluntarios sanos. En paralelo, una ligera disminución de la expresión de TNF- se observa en los pacientes (figura 4E). In order to illustrate the clinical relevance of the model, the expression of these genes in patients in septic shock has been studied retrospectively, at the time of shock diagnosis and 48 hours later. Gene expression has been evaluated by a biochip approach in a cohort of 19 patients described previously [9] and 9 healthy volunteers. As observed in the ET model, the results show an increase in the expression of IL10, IRAK-M, CXCL7 and RHOU (Figures 4A, B, M and O), coupled with a decrease in the expression of Ly64, GBP1 and CXCL10 (Figures 4 F, G and I) in patients in septic shock at the time of diagnosis and even 48 hours later compared to healthy volunteers. In parallel, a slight decrease in TNF-expresión expression is observed in patients (Figure 4E).
En su conjunto, los datos clínicos confirman las modificaciones ARNm observadas ex vivo en el modelo de ET y subrayan la pertinencia clínica de este modelo. Taken together, the clinical data confirm the mRNA modifications observed ex vivo in the ET model and underline the clinical relevance of this model.
IFN- y GM-CSF mejoran significativamente la producción de TNF- en PBMCs desactivadas por LPS IFN- and GM-CSF significantly improve the production of TNF- in PBMCs deactivated by LPS
Como se indica en la figura 1, las PBMCs estimuladas una primera vez con LPS presentan una disminución marcada de su capacidad de producción en TNF- en respuesta a una segunda exposición a la endotoxina. A continuación, se ha investigado, en 7 experimentos sucesivos, si una incubación de 24 horas en presencia de diferentes profármacos inmunomoduladores (IFN-, GM-CSF y Flt3-L) podían restaurar esta síntesis en TNF- y disminuir la de IL-10. IFN- y GM-GSF alcanzan este objetivo induciendo a un aumento de la producción en TNF- (figura 5A). Es interesante señalar que los profármacos ensayados tienen impacto sólo sobre el refuerzo del lado pro-inflamatorio, pero quedan sin efecto sobre la disminución de producción de IL-10 (figura 5 B). As indicated in Figure 1, PBMCs stimulated for the first time with LPS show a marked decrease in their production capacity in TNF- in response to a second exposure to endotoxin. Next, it has been investigated, in 7 successive experiments, if a 24-hour incubation in the presence of different immunomodulatory prodrugs (IFN-, GM-CSF and Flt3-L) could restore this synthesis in TNF- and decrease that of IL -10. IFN- and GM-GSF achieve this goal by inducing an increase in TNF- production (Figure 5A). It is interesting to note that the prodrugs tested have an impact only on the reinforcement of the pro-inflammatory side, but remain without effect on the decrease in IL-10 production (Figure 5B).
Monitorización ARNm del efecto de los profármacos inmunoestimulantes durante ET MRNA monitoring of the effect of immunostimulatory prodrugs during ET
A continuación, en estos mismos experimentos que muestran un efecto beneficioso de IFN- y de GM-CSF sobre la restauración de la síntesis de TNF- en respuesta a una segunda estimulación con LPS, la modulación de expresión de un panel de genes se ha estudiado por biochip (figura 6) después validada por qRT-PCR (figura 7). Next, in these same experiments that show a beneficial effect of IFN- and GM-CSF on the restoration of TNF-síntesis synthesis in response to a second stimulation with LPS, the expression modulation of a panel of genes is has studied by biochip (figure 6) then validated by qRT-PCR (figure 7).
Se observa una inducción significativa de la expresión ARNm de TNF- en presencia de IFN- comparado con los valores controles (figura 6A). La adición de los profármacos induce una ligera disminución de la expresión ARNm de IL10 (figura 6B). En paralelo, un aumento significativo de la expresión génica de HLA-DRA y CIITA se observa cuando las células pretratadas con LPS se incuban con IFN- (figura 6C, 6D). En cuanto a los reguladores negativos de la vía de señalización de LPS, la expresión de ABIN-3 disminuye significativamente en presencia de IFN- (figura 6E, 6F). La expresión de los genes LY64 y IRAKM disminuyen también en presencia de IFN- (figura 5G). Los tres profármacos disminuyen la expresión ARNm de las alarminas S100A9 y S100A8 (figura 6H, 6I). Además, la presencia de IFN- aumenta significativamente la expresión de los genes GBP1 (J), CXCL10 (M), COX 2 (N), A significant induction of TNF- mRNA expression is observed in the presence of IFN- compared to the control values (Figure 6A). The addition of prodrugs induces a slight decrease in mRNA expression of IL10 (Figure 6B). In parallel, a significant increase in gene expression of HLA-DRA and CIITA is observed when cells pretreated with LPS are incubated with IFN- (Figure 6C, 6D). As for the negative regulators of the LPS signaling pathway, ABIN-3 expression decreases significantly in the presence of IFN- (Figure 6E, 6F). The expression of the LY64 and IRAKM genes also decreases in the presence of IFN- (Figure 5G). The three prodrugs decrease the mRNA expression of alarms S100A9 and S100A8 (Figure 6H, 6I). In addition, the presence of IFN-significativamente significantly increases the expression of the GBP1 (J), CXCL10 (M), COX 2 (N) genes,
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