KR20240045135A - Biomarker for detecting exosomes and a method for detecting exosomes using thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 엑소좀 검출용 바이오마커 및 이를 이용한 엑소좀 검출 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a biomarker for detecting exosomes and a method for detecting exosomes using the same.
Description
본 발명은 엑소좀 검출용 바이오마커 및 이를 이용한 엑소좀 검출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker for detecting exosomes and a method for detecting exosomes using the same.
엑소좀은 생물활성 물질을 수용자 세포로 전달하거나 표적세포의 신호전달 경로에 영향을 미침으로써 세포 간 통신에서 중요한 역할을 하는 세포 외 소포(EV)이다. 엑소좀은 다른 생물활성제보다 저장하기 쉽고 보다 큰 안정성을 나타내며, 생물학적 장벽을 극복할 수 있는 높은 능력을 갖고 있고, 특정 세포 유형을 표적화하는 표면 분자를 운반할 수 있다. 따라서, 오프-표적 효과(off-target effect)를 보다 적게 유발한다고 보고되고 있다. 이와 같이 목적 단백질을 포함하는 엑소좀은 생체 내에서 다양한 질환의 치료에 사용될 수 있는 바, 목적 단백질을 탑재한 엑소좀을 제작하는 기술이 연구되어 왔으나 이러한 엑소좀을 검출할 수 있는 기술은 아직 연구가 미비한 실정이다. 더욱이, 생체내 투여된 엑소좀을 확인하고 분석하는 기술은 치료용 엑소좀을 개발하는 과정에서 매우 중요하며 특히 약물 동태학 분석에 있어 필수적인 요소이다. 때문에 이를 위한 기술들이 다양한 연구를 통해 개발 및 보고되어 오고 있지만, 여전히 생체내 엑소좀을 추적하는 기술은 더욱 정밀하고 높은 검출능력을 필요로 하고 있다.Exosomes are extracellular vesicles (EVs) that play an important role in intercellular communication by delivering bioactive substances to recipient cells or influencing signaling pathways in target cells. Exosomes are easier to store than other bioactive agents, exhibit greater stability, have a high ability to overcome biological barriers, and can carry surface molecules that target specific cell types. Therefore, it is reported to cause fewer off-target effects. In this way, exosomes containing the target protein can be used to treat various diseases in vivo. Technology for producing exosomes loaded with the target protein has been studied, but technology to detect such exosomes has not yet been researched. is insufficient. Moreover, technology to identify and analyze exosomes administered in vivo is very important in the process of developing exosomes for treatment, and is especially an essential element in pharmacokinetic analysis. Therefore, although technologies for this purpose have been developed and reported through various studies, technology to track exosomes in vivo still requires more precision and higher detection ability.
본 발명의 목적은 엑소좀 검출용 바이오마커를 제공하는 것이다. The purpose of the present invention is to provide a biomarker for exosome detection.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커를 이용한 엑소좀 검출 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for detecting exosomes using the biomarker.
본 발명을 구현하는 하나의 양태는 엑소좀 검출용 조성물이다.One aspect embodying the present invention is a composition for detecting exosomes.
하나의 구체예에서, 본 발명은 RPL13, RPL9 및 ENO1으로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 엑소좀 검출용 조성물에 관한 것이다. In one embodiment, the present invention relates to a composition for detecting exosomes, comprising an agent capable of measuring the expression level of any one or more genes selected from the group consisting of RPL13, RPL9, and ENO1.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 엑소좀의 검출 방법이다.Another aspect embodying the present invention is a method for detecting exosomes.
하나의 구체예에서, 본 발명은 RPL13, RPL9 및 ENO1으로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 엑소좀 검출용 조성물을 이용하여 상기 유전자의 발현 수준을 측정하여 시료 내의 엑소좀을 검출하는 단계를 포함하는 엑소좀의 검출 방법에 관한 것이다.In one embodiment, the present invention uses a composition for detecting exosomes containing an agent capable of measuring the expression level of any one or more genes selected from the group consisting of RPL13, RPL9, and ENO1, to determine the expression level of the gene. It relates to a method for detecting exosomes, including the step of detecting exosomes in a sample by measuring .
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 엑소좀 검출용 프라이머 또는 프라이머-프로브 세트이다.Another aspect embodying the present invention is a primer or primer-probe set for exosome detection.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 RPL13, RPL9 및 ENO1으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 엑소좀 검출용 바이오마커 조성물이다. Another aspect embodying the present invention is a biomarker composition for detecting exosomes containing one or more proteins selected from the group consisting of RPL13, RPL9, and ENO1 or a gene encoding the same.
본 발명의 조성물을 이용하여 목적하는 엑소좀을 검출할 수 있다.Exosomes of interest can be detected using the composition of the present invention.
도 1은 HEK293 cell 유래 엑소좀 특이적 마커 발굴을 위해 수행한 NGS 실험 결과를 이용해 database 기반의 선별과정을 설명한 도면이다.
도 2은 Exosome 내 RNA를 extraction하여 cDNA로 합성, 이를 이용한 Real-time PCR 결과로 유의미한 발현양을 보이는 프라이머를 선정(파란 그래프)한 결과이다.
도 3는 Real-time PCR의 melt curve plot이다.
도 4는 Rat blood로부터 exosome을 분리해 내기위한 method이다.
도 5은 Rat blood를 활용한 exosome spiking 후 최적의 fraction 선정을 하기위한 실험결과이다.
도 6은 Rat blood에 exosome spiking 여부에 따른 발현양 차이를 비교 확인한 실험결과이다.
도 7은 도 6에서 진행한 실험에 추가 marker를 발굴하기 위한 실험결과이다.
도 8은 Rat blood에 투여된 exosome 농도에 따른 변화에 대한 분석법의 검출능력을 확인한 실험 결과이다.
도 9는 Hydrolysis Probe/Primer Set의 Exo-srIkB 엑소좀 marker 검출효과를 확인한 RT-qPCR 분석 결과이다.Figure 1 is a diagram explaining the database-based selection process using the results of NGS experiments performed to discover exosome-specific markers derived from HEK293 cells.
Figure 2 shows the results of extracting RNA from the exosome, synthesizing it into cDNA, and selecting primers showing significant expression as a result of real-time PCR using this (blue graph).
Figure 3 is a melt curve plot of real-time PCR.
Figure 4 shows a method for isolating exosomes from rat blood.
Figure 5 shows the results of an experiment to select the optimal fraction after exosome spiking using rat blood.
Figure 6 shows the results of an experiment comparing and confirming the difference in expression level depending on whether exosome spiking was performed in rat blood.
Figure 7 shows the results of an experiment to discover additional markers to the experiment conducted in Figure 6.
Figure 8 shows the results of an experiment confirming the detection ability of the analysis method for changes in exosome concentration administered to rat blood.
Figure 9 shows the results of RT-qPCR analysis confirming the Exo-srIkB exosome marker detection effect of the Hydrolysis Probe/Primer Set.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.This is explained in detail as follows. Meanwhile, each description and embodiment disclosed in the present invention may also be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of the various elements disclosed in the present invention fall within the scope of the present invention. Additionally, the scope of the present invention cannot be considered limited by the specific description described below.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.Additionally, those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific embodiments of the invention described herein. Additionally, such equivalents are intended to be encompassed by this invention.
또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Additionally, numerous papers and patent documents are referenced and citations are indicated throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to more clearly explain the content of the present invention and the level of technical field to which the present invention pertains.
본 발명의 하나의 양태는 엑소좀 검출용 조성물을 제공한다.One aspect of the present invention provides a composition for detecting exosomes.
하나의 구현예에서 상기 엑소좀 검출용 조성물은 RPL13, RPL9 및 ENO1으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 엑소좀 검출용 바이오마커 조성물이다.In one embodiment, the composition for detecting exosomes is a biomarker composition for detecting exosomes including one or more proteins selected from the group consisting of RPL13, RPL9, and ENO1 or a gene encoding the same.
상기 "바이오마커"는 진단 마커로도 쓰일 수 있으며, 시료에서 엑소좀의 존재 여부를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 바이오마커에는 엑소좀을 투여하지 않은 개체로부터 수득한 생물학적 샘플에 비하여 엑소좀을 투여한 개체로부터 수득한 생물학적 샘플에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예를 들어, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(예를 들어, 단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등이 포함될 수 있다. 상기 바이오마커를 검출함으로써 목적하는 엑소좀을 검출할 수 있다. The “biomarker” can also be used as a diagnostic marker and refers to a substance that can confirm the presence of exosomes in a sample. The biomarkers include polypeptides or nucleic acids (e.g., mRNA, etc.), lipids, etc. that show an increase or decrease in biological samples obtained from individuals administered exosomes compared to biological samples obtained from individuals not administered exosomes. Organic biomolecules such as glycolipids, glycoproteins, or sugars (eg, monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.) may be included. By detecting the biomarker, the desired exosome can be detected.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예에서 상기 조성물은 RPL13, RPL9 및 ENO1으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함한다.In any one of the above-described embodiments, the composition comprises an agent capable of measuring the expression level of one or more genes selected from the group consisting of RPL13, RPL9, and ENO1.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 제제는 프라이머 및/또는 프로브를 포함한다. In any one of the preceding embodiments, the agent comprises a primer and/or probe.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 제제는 하기 표 1에서 선택된 1 이상의 프라이머 세트를 포함한다: In any one of the preceding embodiments, the agent comprises one or more primer sets selected from Table 1 below:
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 제제는 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트; 및 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트 중 1 이상의 프라이머 세트를 포함한다.In any one of the preceding embodiments, the agent comprises a primer set of SEQ ID NOs: 5 and 6; Primer sets of SEQ ID NOs: 13 and 14; and one or more primer sets among the primer sets of SEQ ID NOs: 19 and 20.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 제제는 서열번호 23으로 표시되는 염기서열, 서열번로 25로 표시되는 염기서열, 서열번호 28로 표시되는 염기서열, 서열번호 31로 표시되는 염기서열, 서열번호 33으로 표시되는 염기서열, 서열번호 35로 표시되는 염기서열, 서열번호 38로 표시되는 염기서열, 서열번호 41로 표시되는 염기서열, 서열번호 43으로 표시되는 염기서열, 서열번호 45로 표시되는 염기서열, 서열번호 48로 표시되는 염기서열 및 서열번호 51로 표시되는 염기서열 중 선택되는 프로브를 포함한다. In any one of the above-described embodiments, the agent has the base sequence shown in SEQ ID NO: 23, the base sequence shown in SEQ ID NO: 25, the base sequence shown in SEQ ID NO: 28, and the base shown in SEQ ID NO: 31. Sequence, nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 33, nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 35, nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 38, nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 41, nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 It includes a probe selected from the nucleotide sequence represented by, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 48, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 51.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 제제는 하기 표 2에서 선택되는 프라이머-프로브 세트를 포함한다:In any one of the preceding embodiments, the agent comprises a primer-probe set selected from Table 2 below:
프라이머forward
primer
프라이머reverse
primer
본 발명에서 "유전자 발현 수준을 측정할 수 있는 제제"는 유전자의 발현 수준뿐만 아니라, 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 측정할 수 있는 제제 역시 포함할 수 있다. 각각의 유전자가 코딩하는 단백질의 정보는 다음과 같이 NCBI에서 확인할 수 있다.In the present invention, “agent capable of measuring gene expression level” may also include an agent capable of measuring not only the expression level of a gene, but also the protein encoded by the gene. Information on the protein encoded by each gene can be found in NCBI as follows.
구체적인 예를 들면, 상기 제제는 유전자로부터 발현되는 mRNA에 결합될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 프라이머, 프로브, RNA 앱타머 등과 같은 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드, 항체, 상기 항체의 단편, 저분자 화합물 등을 포함할 수 있다.For specific examples, the agent may be a polynucleotide such as an antisense oligonucleotide, primer, probe, RNA aptamer, etc. that can bind to mRNA expressed from a gene, or a peptide that can specifically bind to a protein encoded by the gene. , antibodies, fragments of the antibodies, low molecular weight compounds, etc.
본 발명의 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.The term "probe" of the present invention refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA that is as short as a few bases or as long as several hundreds of bases that can specifically bind to a gene or mRNA, including an oligonucleotide probe, It can be manufactured in the form of a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, etc., and can be labeled for easier detection.
상기 프로브는 해당 염기서열의 5'과 3'말단에 각각 검출에 이용되는 표지를 포함할 수 있다. 일 예로, 본 발명의 프로브는 형광단 및 소광제(quencher)가 각각 5'과 3' 말단에 표지된 것일 수 있다. 다른 예로, 본 발명의 프로브는 형광단이 5'말단에, 소광제가 3' 말단에 표지되고, 추가로 서열 내부에 소광제(internal quencher)를 포함할 수 있다. 상기 형광단과 소광제는 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 형광 물질과 소광제로 제한 없이 사용될 수 있다. The probe may include labels used for detection at the 5' and 3' ends of the corresponding base sequence, respectively. As an example, the probe of the present invention may be one in which a fluorophore and a quencher are labeled at the 5' and 3' ends, respectively. As another example, the probe of the present invention may be labeled with a fluorophore at the 5' end and a quencher at the 3' end, and may further include an internal quencher within the sequence. The fluorophore and quencher may be used without limitation as fluorescent substances and quenchers commonly used in the field.
표지된 프로브를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 경우 증폭된 산물을 실시간으로 모니터링 할 수 있어 DNA와 RNA의 정확한 정량이 가능하고, 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하며 정확한 진단이 가능하다.When real-time polymerase chain reaction is performed using a labeled probe, the amplified product can be monitored in real time, enabling accurate quantification of DNA and RNA, and electrophoresis is not required, enabling rapid, simple, and accurate diagnosis.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(템플레이트; template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 단일 가닥 핵산 서열일 수 있다. 본 발명에서, 핵산은 뉴클레오티드 및 상기 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자가 중합되는 분자를 의미한다. The term "primer" of the present invention refers to a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxyl group that can form a base pair with a complementary template (template) and is used for copying the template strand. It may be a short single-stranded nucleic acid sequence that serves as a starting point. In the present invention, nucleic acid refers to a molecule in which a nucleotide and a molecule having the same function as the nucleotide are polymerized.
프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer and temperature.
본 발명에서, "프라이머 세트"는 목적하는 유전자를 증폭시킬 수 있는 2개 이상의 프라이머의 조합을 의미한다. 각각의 영역에 상응하는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 2개의 프라이머로 구성된 프라이머 세트는 프라이머 쌍으로 지칭할 수 있다.In the present invention, “primer set” refers to a combination of two or more primers capable of amplifying a target gene. A primer set consisting of two primers, a forward primer and a reverse primer, corresponding to each region may be referred to as a primer pair.
한편 본 발명에서 '특정 서열번호의 뉴클레오티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드와 동일 혹은 상응하는 활성, 예컨대 동일한 유전자를 증폭할 수 있는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다.Meanwhile, even if in the present invention it is described as a 'nucleotide of a specific sequence number', if it has the same or corresponding activity as a polynucleotide composed of the nucleotide sequence of the sequence number, for example, if it can amplify the same gene, some sequences may be deleted, It is obvious that polynucleotides having modified, substituted or added nucleotide sequences can also be used in the present invention.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 조성물은 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR) 분석용 조성물일 수 있다. In any one of the above-described embodiments, the composition of the present invention may be a composition for real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) analysis.
본 발명에서 "실시간 중합효소 연쇄반응"은 PCR에 기반한 실험 방법으로, 검출하고자 하는 타겟 핵산 서열의 증폭 반응을 시간에 따라 모니터링하여 증폭 수준에 관련된 파라미터를 측정하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행할 수 있다. 실시간 중합효소 연쇄반응을 통해 타겟 핵산 서열의 증폭과 그 양의 측정을 동시에 할 수 있으며, 실시간으로 측정된 증폭값으로 수학적 regression을 수행하면 사이클 수에 따라 시료에 존재하였던 초기 주형 핵산량을 역으로 추정할 수 있다. In the present invention, "real-time polymerase chain reaction" is an experimental method based on PCR, which allows real-time polymerase chain reaction to be performed by monitoring the amplification reaction of the target nucleic acid sequence to be detected over time and measuring parameters related to the amplification level. there is. Through real-time polymerase chain reaction, it is possible to simultaneously amplify the target nucleic acid sequence and measure its amount. By performing mathematical regression on the amplification value measured in real time, the amount of initial template nucleic acid present in the sample can be reversed depending on the number of cycles. It can be estimated.
본 발명에서 "역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)"은 RNA로부터 역전사를 통해 만들어진 DNA인 cDNA를 주형으로 PCR 하는 것을 의미한다. 여기에서 역전사 (RT: Reverse Transcription)는, 단일가닥의 RNA가 이중가닥의 DNA보다 불안정한 물질이고, 시험관에서 RNA 자체를 증폭하여 사용할 수 없다는 한계점 때문에 RNA를 보다 안정적인 DNA로 역전환하는 과정을 의미한다.In the present invention, “reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)” refers to PCR using cDNA, which is DNA made through reverse transcription from RNA, as a template. Here, Reverse Transcription (RT: Reverse Transcription) refers to the process of reverse converting RNA into more stable DNA due to the limitation that single-stranded RNA is a more unstable substance than double-stranded DNA and the RNA itself cannot be amplified and used in a test tube. .
일 예로, 실시간 중합효소연쇄반응은 mRNA 또는 non-coding RNA를 수량화하기 위해 역전사 중합연쇄반응과 결합되어 행해질 수 있다. 이를 "실시간 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응"이라고 하며, 이때 총 RNA 또는 mRNA를 주형으로 하나의 튜브에서 역전사 반응과 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)이 연속적으로 수행될 수 있다. As an example, real-time polymerase chain reaction can be performed in combination with reverse transcription polymerase chain reaction to quantify mRNA or non-coding RNA. This is called “real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,” and in this case, reverse transcription reaction and real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) can be performed continuously in one tube using total RNA or mRNA as a template.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 실시간 중합효소 연쇄반응은 실시간 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 일 수 있다.In any one of the above-described embodiments, the real-time polymerase chain reaction may be a real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction.
증폭 반응을 모니터링하는 방법은, 이에 제한되지는 않으나 표적 유전자의 염기서열에 대해 상보적인 탐식유전자에 발광물질을 부착하고, 유전자 증폭의 초기에 유리되어 발광하는 형광을 측정함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어 SYBR Green과 같은 dsDNA-binding dye를 이용하거나, TaqMan probe, Beacons, Scorpions과 같은 Hydrolysis probe, 또는 Light Cycler와 같은 Hybridization probe를 이용해 형광 감도를 검출할 수 있다. 일 예로, 본 발명의 실시간 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응의 산물은 DNA에 결합하는 형광물질을 이용하거나, 또는 표지된 hydrolysis probe를 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. The method of monitoring the amplification reaction is not limited to this, but can be performed by attaching a luminescent material to a phagocytosis gene complementary to the base sequence of the target gene and measuring the fluorescence released and emitted at the beginning of gene amplification. For example, fluorescence sensitivity can be detected using a dsDNA-binding dye such as SYBR Green, a hydrolysis probe such as TaqMan probe, Beacons, or Scorpions, or a hybridization probe such as a light cycler. As an example, the product of the real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction of the present invention may be obtained using a fluorescent substance that binds to DNA, or may be performed using a labeled hydrolysis probe, but is not limited thereto.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 엑소좀은 엑소좀을 생산하는 HEK293 세포 유래 엑소좀일 수 있다.In any one of the above-described embodiments, the exosome may be an exosome derived from HEK293 cells that produce exosomes.
본 발명에서 용어, "엑소좀을 생산하는 HEK293 세포"는 엑소좀 또는 목적하는 엑소좀을 생산할 수 있는 HEK293(Human embryonic kidney 293 cells) 세포주를 의미한다. 상기 HEK293 세포는 형질감염 (Transfection)이 용이하여 단백질 발현 및 재조합 레트로바이러스 생산에 사용되는 세포주로, 일반적으로 부착배양되는 세포이나, 무혈청 배지를 이용한 부유배양으로의 적응이 가능하여 부유세포로 배양될 수 있으며, 상기 HEK293 세포는 HEK293세포, HEK293T 세포, HEK293E 세포, HEK293A 세포, HEK293H 세포, HEK293F 세포, Expi293F 세포 (Thermo Fisher), Expi293H 세포, 293-F (Thermo Fisher), 293-H (Thermo Fisher), Freestyle 293F 세포 (Thermo Fisher), 293 EBNA1 세포 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the term “HEK293 cells producing exosomes” refers to exosomes or a HEK293 (Human embryonic kidney 293 cells) cell line capable of producing exosomes of interest. The HEK293 cells are a cell line used for protein expression and recombinant retrovirus production due to their ease of transfection. They are generally adherently cultured cells, but can be adapted to suspension culture using serum-free medium and are cultured as suspension cells. It can be, the HEK293 cells are HEK293 cells, HEK293T cells, HEK293E cells, HEK293A cells, HEK293H cells, HEK293F cells, Expi293F cells (Thermo Fisher), Expi293H cells, 293-F (Thermo Fisher), 293-H (Thermo Fisher) ), Freestyle 293F cells (Thermo Fisher), 293 EBNA1 cells, or a combination thereof, but is not limited thereto.
일 구현예에서, 엑소좀을 생산할 수 있는 HEK293 세포주는 카고 단백질이 로딩된 엑소좀을 생산할 수 있게 유전적으로 변형된 HEK293 세포주일 수 있다. In one embodiment, the HEK293 cell line capable of producing exosomes may be a HEK293 cell line that has been genetically modified to produce exosomes loaded with cargo proteins.
일 구현예에서, 본 발명의 검출하고자 하는 엑소좀에 대하여 한국공개특허 10-2018-0036134 호의 내용을, 본 개시 내용의 엑소좀 및 상기 엑소좀 제조 방법을 제공하기 위해 참조에 의해 본원에 도입할 수 있다.In one embodiment, the contents of Korean Patent Publication No. 10-2018-0036134 regarding the exosome to be detected in the present invention are incorporated herein by reference to provide the exosome of the present disclosure and the method for producing the exosome. You can.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 조성물을 포함하는 엑소좀 검출용 키트를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a kit for detecting exosomes containing the composition.
본 발명의 다른 하나의 양태는 엑소좀 검출 방법이다. Another aspect of the present invention is a method for detecting exosomes.
본 발명의 검출 방법은 시료에서 추출된 RNA를 주형으로 RPL13, RPL9 및 ENO1으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 qRT-PCR을 이용해 증폭하는 것 일 수 있다.The detection method of the present invention may be to amplify one or more genes selected from the group consisting of RPL13, RPL9, and ENO1 using RNA extracted from a sample as a template using qRT-PCR.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 엑소좀 검출 방법은 시료에서 추출된 RNA를 주형으로, 프라이머 세트를 이용하여 qRT-PCR 증폭을 수행하는 단계; 및 상기 qRT-PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 엑소좀 검출 방법으로, 상기 프라이머 세트는, 전술한 표 1에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.In any one of the above-described embodiments, the exosome detection method includes performing qRT-PCR amplification using RNA extracted from a sample as a template and a primer set; And in the exosome detection method comprising the step of analyzing the qRT-PCR amplification product, the primer set may be any one or more selected from Table 1 described above.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 엑소좀 검출 방법은 시료에서 추출된 RNA를 주형으로, 프라이머-프로브 세트를 이용하여 qRT-PCR 증폭을 수행하는 단계; 및 상기 qRT-PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 엑소좀 검출 방법으로, 상기 프라이머 세트는, 전술한 표 2에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.In any one of the above-described embodiments, the exosome detection method includes performing qRT-PCR amplification using RNA extracted from a sample as a template and a primer-probe set; And in the exosome detection method comprising the step of analyzing the qRT-PCR amplification product, the primer set may be any one or more selected from Table 2 described above.
일 예로, 본 발명의 엑소좀 검출 방법은 in vitro, ex vivo, 또는 in vivo로 엑소좀을 검출하는 것일 수 있다. As an example, the exosome detection method of the present invention may detect exosomes in vitro, ex vivo, or in vivo.
일 예로, 상기 시료는 세포, 세포배양물, 조직, 혈액, 혈장, 혈청, 타액 및 소변으로부터 유래한 시료가 제한 없이 포함될 수 있다. 일 예로, 상기 시료는 엑소좀 생산 세포 또는 상기 세포의 세포배양물로부터 유래한 핵산일 수 있다. 상기 시료가 엑소좀 생산 세포 또는 상기 세포의 세포배양물로부터 유래한 시료일 경우, 본 발명의 조성물을 이용하여 목적하는 엑소좀의 생산 여부를 확인할 수 있다.For example, the sample may include samples derived from cells, cell cultures, tissues, blood, plasma, serum, saliva, and urine without limitation. As an example, the sample may be a nucleic acid derived from an exosome-producing cell or a cell culture of the cell. If the sample is a sample derived from an exosome-producing cell or a cell culture of the cell, the production of the desired exosome can be confirmed using the composition of the present invention.
일 예로, 상기 시료는 엑소좀이 투여된 개체로부터 분리된 시료를 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 시료는 엑소좀이 투여된 개체로부터 분리된 시료로부터 유래한 핵산일 수 있다. 상기 시료가 엑소좀이 주입된 개체로부터 분리된 시료일 경우, 본 발명의 조성물을 이용하여 개체에 목적하는 엑소좀이 주입되었는지 확인할 수 있으며, 상기 엑소좀은 주입된 개체 내에서 약물동태학적 분석이 가능하다. As an example, the sample may include a sample isolated from an individual to which exosomes were administered. As an example, the sample may be nucleic acid derived from a sample isolated from an individual to which exosomes were administered. If the sample is a sample isolated from an individual injected with exosomes, the composition of the present invention can be used to confirm whether the desired exosome has been injected into the individual, and the exosome can be subjected to pharmacokinetic analysis in the injected individual. possible.
본 발명의 다른 하나의 양태는 엑소좀에 대한 약물동태학적 분석을 위한 정보제공방법이다. 상기 방법은 엑소좀이 투여된 개체로부터 분리된 시료로부터 본 발명의 조성물을 이용하여 유전자 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 유전자는 RPL13, RPL9 및 ENO1으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 조성물에 대해서는 전술한 바와 같다.Another aspect of the present invention is a method of providing information for pharmacokinetic analysis of exosomes. The method may include measuring the level of gene expression using the composition of the present invention from a sample isolated from an individual to which exosomes were administered. As an example, the gene may be any one or more selected from the group consisting of RPL13, RPL9, and ENO1. The composition is the same as described above.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples and experimental examples. However, these examples and experimental examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples and experimental examples.
실시예 1: HEK293 cell 유래 엑소좀 특이적 마커 선정Example 1: Selection of exosome-specific markers derived from HEK293 cells
인간세포 중 HEK293 cell은 유전자 변형이나 배양이 쉬워 단백질 치료제, 항체 치료제, 엑소좀 치료제 등 다양한 생물학적 치료제를 생산 개발하는데 널리 쓰인다. 이를 이용하여 다양한 염증성 질환에 대한 치료용 엑소좀을 개발하기 위해 HEK 293 cell에 plasmid DNA를 삽입하여 원하는 치료효과를 가진 엑소좀을 생산할 수 있는 엑소좀 생산세포를 제작했다. 삽입된 plasmid를 안정적으로 발현할 수 있는 세포주는 항생제 처리를 통해 단일클론세포로 선별이 되었고, 이후 다양한 추가 선정과정을 거쳐 최적의 단일 클론을 생산세포로 확정하였다. 선정된 생산세포는 특정조건하에 배양되며 이때 세포가 분출한 엑소좀이 포함된 배양액으로부터 원하는 엑소좀을 생산, 분리, 정제하였다. 엑소좀에 존재하는 핵산, 단백질, 지질과 같은 생물학적 성분들에 대한 분석을 위해 차세대 염기서열 분석을 수행하여 인간 세포 중 하나인 HEK293 cell에서 유래한 엑소좀에 존재하는 전체 핵산을 분석하였다. 상기 과정을 위하여 HEK293 세포 유래 엑소좀으로 한국공개특허 10-2018-0036134호와 같이 제조된, super-repressor-IκB가 탑재된 엑소좀(Exo-srIkB)을 사용하였다. Among human cells, HEK293 cells are easy to genetically modify and culture, so they are widely used to produce and develop various biological treatments such as protein treatments, antibody treatments, and exosome treatments. Using this, in order to develop exosomes for treatment of various inflammatory diseases, plasmid DNA was inserted into HEK 293 cells to create exosome-producing cells that can produce exosomes with the desired therapeutic effect. Cell lines capable of stably expressing the inserted plasmid were selected as monoclonal cells through antibiotic treatment, and after various additional selection processes, the optimal single clone was confirmed as the production cell. The selected production cells were cultured under specific conditions, and the desired exosomes were produced, separated, and purified from the culture medium containing the exosomes released by the cells. To analyze biological components such as nucleic acids, proteins, and lipids present in exosomes, next-generation sequencing was performed to analyze the total nucleic acids present in exosomes derived from HEK293 cells, one of the human cells. For the above process, exosomes loaded with super-repressor-IκB (Exo-srIkB) prepared from HEK293 cell-derived exosomes as described in Korean Patent Publication No. 10-2018-0036134 were used.
도 1과 같은 과정으로 Exo-srIkB 로부터 분리된 mRNA와 small RNA를 차세대 염기서열 분석을 통해 이들의 종류와 발현 정도를 분석하였고, 단계적 선별과정을 통해 인간세포 유래 엑소좀 특이적인 유전자를 선정하였다. 설치류, 영장류, 개의 유전자 데이터베이스와 비교하는 점진적 과정을 거쳐 최종적으로 설치류, 영장류, 개에는 존재하지 않고 Exo-srIkB 에만 존재하는 10개의 유전자를 하기와 같이 최종 선정하였다.In the same process as shown in Figure 1, the type and expression level of mRNA and small RNA isolated from Exo-srIkB were analyzed through next-generation sequencing, and human cell-derived exosome-specific genes were selected through a stepwise selection process. Through a gradual process of comparing with the genetic databases of rodents, primates, and dogs, 10 genes that do not exist in rodents, primates, and dogs but exist only in Exo-srIkB were finally selected as follows.
실시예 2: dsDNA-binding dye를 이용한Example 2: Using dsDNA-binding dye 실시간 정량 중합효소 연쇄반응 프라이머 개발Development of real-time quantitative polymerase chain reaction primers
실시예 2-1. 프라이머 고안과 제작Example 2-1. Primer design and production
본 발명자들은 선정된 마커를 이용하여 Exo-srIkB가 동물에 투입된 후 수행하게 될 약물동태학 분석의 높은 검출능력을 확보하기 위해 마커의 신호를 증폭시킬 수 있는 실시간 정량 중합효소 연쇄 반응 방법을 적용하였다. 이를 위해 가장 분석 효율이 좋은 프라이머 선정이 필요하여, 차세대 염기서열 분석 중 다 회에 걸쳐 중복되어 관측된 유전자 내 특정 구간과 그 구간 내에서 염기서열이 명확히 일치하는 하위 구간에 대한 정보를 확인 및 확보하였다. 앞서 확인된 10개의 유전자들에 대해 NGS 진행 시 fully matched 된 부분을 확인하고, 이에 대한 프라이머를 각 유전자 별 총 3 쌍으로 고안 및 제작하였다.The present inventors applied a real-time quantitative polymerase chain reaction method that can amplify the signal of the marker to ensure high detection ability of the pharmacokinetic analysis to be performed after Exo-srIkB is administered to the animal using the selected marker. . For this purpose, it is necessary to select primers with the highest analysis efficiency, so as to confirm and secure information on specific sections within the gene that were observed multiple times during next-generation sequencing and subsections whose base sequences clearly match within that section. did. For the 10 genes previously identified, fully matched regions were confirmed during NGS, and a total of 3 pairs of primers for these were designed and produced for each gene.
실시예 3: 프라이머의 마커 검출 효과 확인Example 3: Confirmation of marker detection effect of primers
실시예 3-1. 검출을 위한 유전자와 최적의 프라이머 선택 및 검증Example 3-1. Selection and verification of genes and optimal primers for detection
High-throughput 분석과 database 기반의 분석을 통해 선정된 프라이머 들은 모두 실제 적용 가능한지에 대한 실험적 평가가 필요하다. 이에 제작된 프라이머 들을 이용한 실시간 정량 중합효소 연쇄반응 실험을 수행하여 Exo-srIkB에서 상기 유전자들의 검출여부를 확인하였다. 이를 위해 엑소좀 시료로부터 핵산을 추출하는 작업을 먼저 진행하였으며 miRNeasy plasma/serum kit(Qiagen, # 217184)를 이용하여 다음의 방법에 따라 RNA를 추출하였다. 1ml의 엑소좀으로부터 각 200ul를 취해 새로운 1.5ml 튜브 5개에 나눠 담았다. 200μl씩 나뉘어져 있는 시료에 1ml의 QIAzol을 넣고, fume hood 안에서 5분동안 상온 정치를 진행하였다. 시료와 QIAzol을 넣은 튜브에 200μl chloroform을 추가하고 vortex를 통해 잘 섞어준 후 fume hood에서 2~3분, 상온에서 정치하였다. 정치를 마친 시료는 원심분리기를 이용하여 15분, 12000 g, 4℃에서 원심분리를 하고, 3개의 층으로 나뉜 샘플 튜브에서 최 상층액(RNA phase) 600μl만을 취하여 새로운 튜브로 옮겼다. 다섯 개의 튜브 모두에서 상층액 600μl씩을 취해 새로운 15ml 튜브로 모으고, 전체 볼륨의 1.5배인 4.5ml 100 % 에탄올을 넣은 후 vortex 해준다. Vortex 후, 전체 중 750μl를 취해 RNeasy MinElute spin column in 2 ml collection 튜브 하나에 5번에 나누어 넣고 필터를 통과시키는 작업을 수행하였다. (RNeasy MinElute spin column in 2ml collection 튜브를 사용하여 750μl씩 5회에 걸쳐 8,000g로 30초간 원심분리를 하여 시료를 튜브내 필터를 통과시켰다.) 이후 washing 과정은 제품의 매뉴얼에 따라 진행하였다. 마지막으로 RNeasy MinElute spin column만을 새로운 1.5ml 튜브에 넣어서 Nuclease-free water를 적당량(약 14μl)를 넣고 3분간 정치 후 12,000g로 1분간 원심분리를 하여 RNA를 용출하였다. 정제가 완료된 RNA를 cDNA로 합성하기 위해 High-Capacity RNA-to-cDNA Kit(Thermo, #4387406)를 이용하였고 제품 매뉴얼에 따라 cDNA를 확보하였다. 최종적으로 확보된 cDNA는 4℃ 로 온도를 낮춘 후 사용하거나 -20℃에 보관한 후 필요할 때 다시 사용하였다. 실시간 정량 중합효소 연쇄반응은 합성된 cDNA와 프라이머, 2X SYBR Green mix(Applied Biosystems, #4364344), Nuclease-free water는 해당 제품 kit 매뉴얼에 기재되어 있는 비율로 배합하여 사용하였다. 그 후, Quantstudio 장비와 Quantstudio software를 이용하여 실시간 정량 중합효소 연쇄반응 실험은 표 5와 같이 수행하고 Melt curve 확인 조건은 표 6과 같이 수행하였다.All primers selected through high-throughput analysis and database-based analysis require experimental evaluation to determine whether they can be applied in practice. Accordingly, a real-time quantitative polymerase chain reaction experiment using the prepared primers was performed to confirm the detection of the above genes in Exo-srIkB. For this purpose, nucleic acid was first extracted from the exosome sample, and RNA was extracted using the miRNeasy plasma/serum kit (Qiagen, # 217184) according to the following method. 200 ul each was taken from 1 ml of exosomes and divided into 5 new 1.5 ml tubes. 1ml of QIAzol was added to each 200μl sample and left to stand at room temperature for 5 minutes in a fume hood. 200 μl chloroform was added to the tube containing the sample and QIAzol, mixed well with a vortex, and left in a fume hood for 2 to 3 minutes at room temperature. After settling, the sample was centrifuged at 4°C for 15 minutes at 12000 g using a centrifuge, and only 600 μl of the supernatant (RNA phase) was taken from the sample tube divided into three layers and transferred to a new tube. Take 600 μl of supernatant from all five tubes, collect them into a new 15 ml tube, add 4.5 ml of 100% ethanol (1.5 times the total volume), and vortex. After vortexing, 750 μl of the total was taken and divided into 5 RNeasy MinElute spin column in 2 ml collection tubes and passed through a filter. (Using an RNeasy MinElute spin column in 2ml collection tube, 750μl each was centrifuged 5 times at 8,000g for 30 seconds and the sample passed through the filter in the tube.) The washing process was then carried out according to the product manual. Finally, only the RNeasy MinElute spin column was placed in a new 1.5ml tube, an appropriate amount of Nuclease-free water (approximately 14μl) was added, allowed to stand for 3 minutes, and then centrifuged at 12,000g for 1 minute to elute RNA. To synthesize the purified RNA into cDNA, the High-Capacity RNA-to-cDNA Kit (Thermo, #4387406) was used, and cDNA was obtained according to the product manual. The cDNA finally obtained was used after lowering the temperature to 4°C or stored at -20°C and used again when needed. For real-time quantitative polymerase chain reaction, synthesized cDNA, primers, 2X SYBR Green mix (Applied Biosystems, #4364344), and Nuclease-free water were mixed in the ratio described in the product kit manual. Afterwards, real-time quantitative polymerase chain reaction experiments were performed using Quantstudio equipment and Quantstudio software as shown in Table 5, and melt curve confirmation conditions were performed as shown in Table 6.
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그 결과, 도 2와 같이 각 유전자 별로 Ct 값이 가장 낮은 프라이머로 RPL9의 3번째(RPL9-3), RPL13의 2번째(RPL13-2), RPL8의 첫번째(RPL8-1), RPS15의 2번째(RPS15-2) 프라이머를 선택하였다. 상기 프라이머들은 각각의 melt curve plot을 분석 결과, 도 3과 같이 일관된 peak를 보이는 것으로 확인됨에 따라, 상기 프라이머들의 유전자 발현 측정 값은 정확히 표적 유전자만을 증폭시키는 것임이 확인되었다.As a result, as shown in Figure 2, the primers with the lowest Ct value for each gene were the 3rd of RPL9 (RPL9-3), the 2nd of RPL13 (RPL13-2), the 1st of RPL8 (RPL8-1), and the 2nd of RPS15. (RPS15-2) primer was selected. As a result of analyzing the melt curve plot of each of the primers, it was confirmed that they showed consistent peaks as shown in Figure 3. As a result, it was confirmed that the gene expression measurements of the primers accurately amplified only the target gene.
실시예 3-2. 혈액 내 엑소좀 분리 및 분석에 적합한 fraction 선정Example 3-2. Selection of appropriate fraction for separation and analysis of exosomes in blood
앞선 실험에서 확인된 프라이머가 혈액내 존재하는 Exo-srIkB 검출에 사용될 수 있는지를 확인하기 위해, 도 4와 같은 과정으로 실험동물 rat으로부터 분리된 혈액에 Exo-srIkB를 주입하여 음성 대조군과 비교하는 실험을 수행하였다. 혈액 시료가 응고되는 것을 방지하기 위해 모든 시료는 4℃ 상태에서 보관을 유지하며 실험을 진행하였으며 음성대조군은 실험동물 혈액 4ml에 PBS 2 mL을 처리하였고, 실험군에는 실험동물 혈액 4 mL에 Exo-srIkB 2 mL을 처리한 후, vortex 하여 상온에서 30분간 정치하는 과정을 거쳐 실험동물의 혈액내 전체 엑소좀을 정제하기 위한 시료를 준비하였다. 혈중 엑소좀 정제는 혈액에서 혈장을 분리하는 작업을 우선적으로 필요로 하여 준비된 모든 시료는 원심분리(4℃, 2500g, 15 분)를 수행하였다. 원심분리가 완료된 시료는 혈장성분이 있는 상층액만 취하였고, 이중 엑소좀만을 분리하기 위해 size exclusion chromatography(SEC)을 수행하였다. 컬럼은'Izon Science'의 qEV column을 사용하였으며, 제품 매뉴얼에 따라 전처리 작업을 거쳐 컬럼 사용 준비를 하였다. 준비가 완료된 컬럼의 디스크 표면 가운데에 4 mL의 혈장시료를 흘려주어 미리 준비된 1.5mL 튜브에 각 1ml의 fraction 총 10개를 수득하여 #1부터 #10으로 명명하였다. 이 때 컬럼 아래쪽에서 분리된 시료 수득이 어려울 경우에는 이동상인 PBS를 15 mL 정도 추가하여 잔여 fraction을 회수하였다. 분리가 완료된 fraction #1부터 #10까지의 샘플 중 최적의 시료 선택을 위해 각각의 핵산을 추출하였다. 핵산 추출은 실시예 3-1과 동일한 방법으로 진행하였다. 엑소좀으로부터 핵산을 추출하여 앞서 선정된 4종의 프라이머를 이용하여 실시예 3-1와 동일한 방법에 따라 실시간 정량 중합효소 연쇄반응을 수행하였고, 유의미한 유전자 검출 효과를 보인 최적의 fraction으로 도 5와 같이 fraction #4를 선정하였다.In order to confirm whether the primers identified in the previous experiment can be used to detect Exo-srIkB present in the blood, an experiment was conducted in which Exo-srIkB was injected into the blood isolated from the laboratory animal rat through the same process as shown in Figure 4 and compared with the negative control group. was carried out. To prevent blood samples from coagulating, all samples were stored at 4°C and the experiment was conducted. The negative control group was treated with 2 mL of PBS in 4 mL of experimental animal blood, and the experimental group was treated with Exo-srIkB in 4 mL of experimental animal blood. After processing 2 mL, vortexed and left at room temperature for 30 minutes to prepare a sample for purifying all exosomes in the blood of experimental animals. Purification of blood exosomes first requires separation of plasma from blood, so all prepared samples were centrifuged (4°C, 2500g, 15 minutes). For samples after centrifugation was completed, only the supernatant containing plasma components was taken, and size exclusion chromatography (SEC) was performed to isolate only exosomes. The column used was a qEV column from 'Izon Science', and the column was prepared for use after pretreatment according to the product manual. 4 mL of plasma sample was flowed onto the center of the disc surface of the prepared column, and a total of 10 fractions of 1 mL each were obtained in previously prepared 1.5 mL tubes, which were named #1 to #10. At this time, if it was difficult to obtain the sample separated at the bottom of the column, approximately 15 mL of PBS, a mobile phase, was added to recover the remaining fraction. To select the optimal sample among the separated samples from fractions #1 to #10, each nucleic acid was extracted. Nucleic acid extraction was performed in the same manner as Example 3-1. Nucleic acids were extracted from exosomes, and real-time quantitative polymerase chain reaction was performed using the four types of primers selected previously according to the same method as in Example 3-1, and the optimal fraction showing a significant gene detection effect was shown in Figure 5. Likewise, fraction #4 was selected.
실시예 3-3. 분석에 적합한 바이오마커 및 프라이머 선정Example 3-3. Selection of biomarkers and primers suitable for analysis
혈액내 주입된 Exo-srIkB를 구분해 내는 바이오마커를 선정하기 위해서는 Exo-srIkB가 주입되지 않은 혈액 대비 유의미하게 증가된 발현양을 보이며 또한 음성 대조군인 GFP와 bncr 프라이머와 대비해서 유의미한 발현량 차이를 보이는 유전자(바이오마커)와 프라이머 세트가 선정되어야 한다. 이에 본 발명자들은 fraction #4를 이용하여 Exo-srIkB가 투여되거나 투여되지 않은 두 조건하에 앞선 실험에서 확인된 프라이머가 해당 유전자 발현양 차이를 검출할 수 있는지 여부를 확인하기위해 Exo-srIkB가 주입되지 않은 혈액에서는 발현이 낮고, 주입된 경우 발현이 유의미한 증가를 보이는 프라이머를 선별하는 실험을 수행하였다. 선별 조건으로 Exo-srIkB가 투여된 시료에서는 Ct value가 35보다 높지 않으며 투여되지 않은 시료와 유의미한 차이를 보이는 것으로 정하였다. In order to select a biomarker that distinguishes Exo-srIkB injected into the blood, Exo-srIkB shows a significantly increased expression level compared to blood that was not injected, and also shows a significant difference in expression level compared to the negative control GFP and bncr primers. Visible genes (biomarkers) and primer sets must be selected. Accordingly, the present inventors used fraction #4 to determine whether the primers identified in the previous experiment can detect differences in gene expression levels under two conditions with or without Exo-srIkB administered. An experiment was conducted to select primers that showed low expression in raw blood and a significant increase in expression when injected. As a selection condition, it was determined that in samples administered Exo-srIkB, the Ct value was not higher than 35 and showed a significant difference from the samples not administered.
그 결과, 실시예 3-1에서 선별한 마커 중에서는 도 6과 같이 RPL9-3, RPL13-2가 상기 조건을 충족하는 적합한 마커임이 확인되었다. 상기 결과를 바탕으로 확인된 프라이머 선별법을 이용하여 더 많은 마커를 확보하기 위해 실시예 2-1에서 제작한 유전자 및 프라이머 후보들에 대해 추가적으로 검증하였다. 앞선 실험에서 확인된 유전자와 프라이머 조합에 더하여 낮은 ct 값을 나타내고 Melt curve에서 일관된 피크를 보이는 RPL9-1, RPL13-3, ENO1-2를 추가하여 동일한 방법으로 유전자와 프라이머 세트를 확인하였다. 그 결과, 도 7과 같이 RPL13-2, RPL9-1, ENO1-2 를 적합한 유전자와 프라이머 세트로 선정하였다..As a result, among the markers selected in Example 3-1, it was confirmed that RPL9-3 and RPL13-2 were suitable markers that satisfied the above conditions, as shown in FIG. 6. In order to secure more markers using the primer selection method confirmed based on the above results, the genes and primer candidates produced in Example 2-1 were additionally verified. In addition to the genes and primer combinations identified in the previous experiment, RPL9-1, RPL13-3, and ENO1-2, which showed low ct values and consistent peaks in the melt curve, were added and the genes and primer sets were confirmed using the same method. As a result, RPL13-2, RPL9-1, and ENO1-2 were selected as appropriate genes and primer sets, as shown in Figure 7.
실시예 3-4. 투여 농도에 따른 발현양 변화 감지 여부 확인Example 3-4. Check whether change in expression level is detected according to administration concentration
앞선 실험에서 선정된 프라이머들이 엑소좀 특이적 마커로 활용할 수 있는 충분한 민감성을 보유하고 있는지 확인하기 위해 엑소좀 농도 의존적으로 검출 값의 변화를 나타내는지 확인하였다. 엑소좀을 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012의 총 4단계 농도로 혈액 시료에 투여하였고, 이후 실시예 3-1 및 실시예 3-2와 동일한 방법으로 혈장분리, 엑소좀 분리 순으로 정제를 거친 후 유전자 발현 분석을 진행하였다. To check whether the primers selected in the previous experiment had sufficient sensitivity to be used as exosome-specific markers, it was confirmed whether the detection value changes depending on exosome concentration. Exosomes were administered to blood samples at four levels of concentration: 1x10 9 , 1x10 10 , 1x10 11 , and 1x10 12 , and then separated from plasma and separated into exosomes in the same manner as Examples 3-1 and 3-2. After purification, gene expression analysis was performed.
그 결과, 도 8과 같이 RPL13-2, RPL9-1, ENO1-2가 혈액내 투여된 Exo-srIkB의 농도 검출에 적합한 것을 확인하였다. 이에 아래의 표 7의 프라이머 세트를 dsDNA-binding dye를 이용한 실시한 정량 중합효소 연쇄반응 프라이머로 선정하였다. .As a result, as shown in Figure 8, it was confirmed that RPL13-2, RPL9-1, and ENO1-2 were suitable for detecting the concentration of Exo-srIkB administered in the blood. Accordingly, the primer set in Table 7 below was selected as the primer for the quantitative polymerase chain reaction conducted using dsDNA-binding dye. .
실시예 4. Hydrolysis Probe를 이용한Example 4. Using Hydrolysis Probe 실시간 정량 중합효소 연쇄반응 개발Development of real-time quantitative polymerase chain reaction
4-1. Hydrolysis Probe-based PCR을 위한 프라이머/Probe Design4-1. Primers/Probe Design for Hydrolysis Probe-based PCR
프라이머/Probe의 Design을 위해 먼저, RPL9-1, RPL13-2, ENO1-2의 실시예 3의 dsDNA-binding dye용 프라이머에 대하여 Hydrolysis Probe를 제작하여 set 1을 준비하였고 이들의 Target Sequence가 포함된 Sequence를 IDT사 프라이머Quest™ Tool을 이용해 Design한 후, NCBI 프라이머 BLAST를 이용해 NGS분석시 제외했던 Macaca Fascicularis, Callithrix Jacchus, Canis Lupus Familiaris, Rattus Norvegicus, Mus Musculus와 유사성이 적은 기준으로 3개의 프라이머/probe Set(Set 2~4)를 추가 제작하여 표 8과 같이 총 4개 Set을 준비하였다. Probe는 IDT사의 FAM Dye-Zen™/Iowa Black™ FQ로 제작하였다. FAM Dye-Zen™/Iowa Black™ FQ는 5'말단 Dye(FAM Dye)와 3' 말단 Quencher(Iowa Black™ FQ)사이에 Zen™ Quencher를 추가한 Double-Quenched Probe 방식으로 Quenching 효율을 증가시켜 Background를 낮추는 효과가 있다.For the design of primers/probes, set 1 was prepared by manufacturing Hydrolysis Probes for the dsDNA-binding dye primers of Example 3 of RPL9-1, RPL13-2, and ENO1-2, and their Target Sequence was included. After designing the sequence using IDT's Primer Quest™ Tool, three primers/probes were selected based on low similarity to Macaca Fascicularis, Callithrix Jacchus, Canis Lupus Familiaris, Rattus Norvegicus, and Mus Musculus, which were excluded during NGS analysis using NCBI primer BLAST. Additional sets (Sets 2 to 4) were produced, and a total of 4 sets were prepared as shown in Table 8. The probe was manufactured with IDT's FAM Dye-Zen™/Iowa Black™ FQ. FAM Dye-Zen™/Iowa Black™ FQ is a double-quenched probe method that adds Zen™ Quencher between the 5' end dye (FAM Dye) and the 3' end quencher (Iowa Black™ FQ) to increase quenching efficiency and increase background quenching efficiency. It has the effect of lowering.
4-2. 프라이머/Probe Set 검출 효과 확인4-2. Check primer/probe set detection effect
실시예 3-1의 Method에 따라 Exo-srIkB RNA 추출하고, cDNA를 합성하였다. cDNA와 프라이머/Probe, PrimeTime™ Gene expression Master Mix는 IDT PrimeTime™ Gene Expression Master Mix Protocol에 기재된 비율로 배합하여 Probe-based PCR를 진행하였다. PrimeTime™ Gene expression Master Mix에는 Mix 1 mL당 Reference Dye 4 μL를 추가하여 PCR Reaction의 Well간 발생할 수 있는 오차를 보정하였다. Quantstudio 장비와 Quantstudio Software의 TaqMan® Reagent Chemistry를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 진행하였으며, PCR 조건은 표 9와 같다. Exo-srIkB RNA was extracted according to the method in Example 3-1, and cDNA was synthesized. Probe-based PCR was performed by mixing cDNA, primer/Probe, and PrimeTime™ Gene expression Master Mix in the ratio described in the IDT PrimeTime™ Gene Expression Master Mix Protocol. To PrimeTime™ Gene expression Master Mix, 4 μL of Reference Dye was added per 1 mL of Mix to correct errors that may occur between wells of PCR Reaction. Real-time polymerase chain reaction was performed using Quantstudio equipment and Quantstudio Software's TaqMan® Reagent Chemistry, and PCR conditions are shown in Table 9.
RT-qPCR로 생성된 Product가 Target사이즈가 맞는지 확인하기 위하여 2% Agarose Gel에 PCR Product 10 uL와 6 X Loading Dye 2 uL를 섞어 135 V에서 Electrophoresis를 진행하여 Band를 확인하였다.To confirm that the product generated by RT-qPCR was the target size, 10 uL of PCR Product and 2 uL of 6
그 결과, 도 9와 같이 프라이머/Probe Set의 검출 효율을 나타내는 Ct 값들이 35 이하로 확인되었으며, Electrophoresis 결과 뚜렷한 band가 확인됨에 따라, 상기 실시예 4-1에서 디자인한 프라이머/Probe Set는 표적 유전자만을 효과적으로 증폭시키는 것이 확인되었다. As a result, as shown in Figure 9, Ct values indicating the detection efficiency of the primer/probe set were confirmed to be 35 or less, and as a distinct band was confirmed as a result of electrophoresis, the primer/probe set designed in Example 4-1 was used to detect the target gene. It was confirmed that it amplifies effectively.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention can be implemented in other specific forms without changing its technical idea or essential features. In this regard, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as including the meaning and scope of the patent claims described below rather than the detailed description above, and all changes or modified forms derived from the equivalent concept thereof are included in the scope of the present invention.
Claims (12)
A composition for detecting exosomes, comprising an agent capable of measuring the expression level of one or more genes selected from the group consisting of RPL13, RPL9, and ENO1.
The composition according to claim 1, wherein the agent is a primer or probe capable of detecting one or more genes selected from the group consisting of RPL13, RPL9, and ENO1.
서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 17 및 서열번호 18으로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 19 및 서열번호 20로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 21 및 서열번호 22로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 24 및 서열번호 26으로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 27 및 서열번호 29로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 30 및 서열번호 32로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 34 및 서열번호 36으로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 40 및 서열번호 42로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 44 및 서열번호 46으로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 47 및 서열번호 49로 표시되는 프라이머 세트; 및
서열번호 50 및 서열번호 52로 표시되는 프라이머 세트; 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 조성물.
The method of claim 2, wherein the primer is
Primer sets represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 26;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 29;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 32;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 36;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 42;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 46;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 49; and
Primer sets represented by SEQ ID NO: 50 and SEQ ID NO: 52; A composition, characterized in that it is a set of at least one primer selected from the group consisting of.
The method of claim 2, wherein the probe is a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 25, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 31, and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 33. nucleotide sequence, nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 35, nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 38, nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 41, nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 43, nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 45, sequence A composition, characterized in that it is selected from the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 48 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 51.
상기 프라이머-프로브 세트는 하기에서 선택되는 어느 하나 이상 것을 특징으로 하는, 조성물:
서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 23의 프로브;
서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 33의 프로브;
서열번호 19 및 서열번호 20로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 43의 프로브;
서열번호 24 및 서열번호 26으로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 25의 프로브;
서열번호 27 및 서열번호 29로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 28의 프로브;
서열번호 30 및 서열번호 32로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 31의 프로브;
서열번호 34 및 서열번호 36으로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 35의 프로브;
서열번호 40 및 서열번호 42로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 41의 프로브;
서열번호 44 및 서열번호 46으로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 45의 프로브;
서열번호 47 및 서열번호 49로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 48의 프로브; 및
서열번호 50 및 서열번호 52로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 51의 프로브.
The method of claim 1, wherein the agent comprises a set of primers and probes capable of detecting one or more genes selected from the group consisting of RPL13, RPL9, and ENO1,
The primer-probe set is characterized in that one or more compositions selected from the following:
Primer sets represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, and a probe of SEQ ID NO: 23;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, and a probe of SEQ ID NO: 33;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20, and a probe of SEQ ID NO: 43;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 26, and a probe of SEQ ID NO: 25;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 29, and a probe of SEQ ID NO: 28;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 32, and a probe of SEQ ID NO: 31;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 36, and a probe of SEQ ID NO: 35;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 42, and a probe represented by SEQ ID NO: 41;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 46, and a probe of SEQ ID NO: 45;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 49, and a probe of SEQ ID NO: 48; and
Primer sets represented by SEQ ID NO: 50 and SEQ ID NO: 52, and a probe of SEQ ID NO: 51.
The composition according to claim 1, wherein the exosome is an exosome derived from HEK293 cells producing exosomes.
The method of claim 6, wherein the HEK293 cells producing the exosomes are HEK293 cells, HEK293T cells, HEK293E cells, HEK293A cells, HEK293H cells, HEK293F cells, Expi293F cells, Expi293H cells, 293-F, 293-H, Freestyle 293F cells. , 293 EBNA1 cells or a combination thereof.
서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 17 및 서열번호 18으로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 19 및 서열번호 20로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 21 및 서열번호 22로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 24 및 서열번호 26으로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 27 및 서열번호 29로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 30 및 서열번호 32로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 34 및 서열번호 36으로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 40 및 서열번호 42로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 44 및 서열번호 46으로 표시되는 프라이머 세트;
서열번호 47 및 서열번호 49로 표시되는 프라이머 세트; 및
서열번호 50 및 서열번호 52로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는, 엑소좀 검출용 프라이머 세트.
Primer sets represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 26;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 29;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 32;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 36;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 42;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 46;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 49; and
A primer set for exosome detection selected from the group consisting of primer sets represented by SEQ ID NO: 50 and SEQ ID NO: 52.
서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 33의 프로브;
서열번호 19 및 서열번호 20로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 43의 프로브;
서열번호 24 및 서열번호 26으로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 25의 프로브;
서열번호 27 및 서열번호 29로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 28의 프로브;
서열번호 30 및 서열번호 32로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 31의 프로브;
서열번호 34 및 서열번호 36으로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 35의 프로브;
서열번호 40 및 서열번호 42로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 41의 프로브;
서열번호 44 및 서열번호 46으로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 45의 프로브;
서열번호 47 및 서열번호 49로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 48의 프로브; 및
서열번호 50 및 서열번호 52로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 51의 프로브로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 엑소좀 검출용 프라이머-프로브 세트.
Primer sets represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, and a probe of SEQ ID NO: 23;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, and a probe of SEQ ID NO: 33;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20, and a probe of SEQ ID NO: 43;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 26, and a probe of SEQ ID NO: 25;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 29, and a probe of SEQ ID NO: 28;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 32, and a probe of SEQ ID NO: 31;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 36, and a probe of SEQ ID NO: 35;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 42, and a probe represented by SEQ ID NO: 41;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 46, and a probe of SEQ ID NO: 45;
Primer sets represented by SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 49, and a probe of SEQ ID NO: 48; and
A primer-probe set for exosome detection, which is at least one selected from the group consisting of a primer set represented by SEQ ID NO: 50 and SEQ ID NO: 52, and a probe represented by SEQ ID NO: 51.
상기 qRT-PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 엑소좀 검출 방법.
Performing qRT-PCR amplification using the RNA extracted from the sample as a template and the primer set of Clause 8 or the primer-probe set of Clause 9; and
Exosome detection method comprising the step of analyzing the qRT-PCR amplification product.
The method of claim 10, wherein the sample is selected from the group consisting of cells, cell cultures, tissues, blood, plasma, serum, saliva, and urine.
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