ES2633147T3 - Composiciones de hemoglobina y métodos de uso - Google Patents

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Abstract

Un método para producir una molécula híbrida de hemoglobina, útil para formar un sustituto de sangre estable, a partir de hemoglobina contenida en una solución de hemoglobina, que comprende las etapas de: a) desoxigenar dicha solución de hemoglobina; b) mezclar dicha solución de hemoglobina desoxigenada con un compuesto sulfhidrilo; c) mezclar dicha solución de compuesto sulfhidrilo y hemoglobina con un agente reticulante para formar una mezcla de reacción de polimerización; d) polimerizar la mezcla de reacción de polimerización, formando de ese modo una solución de hemoglobina polimerizada; e) hacer reaccionar dicha solución de hemoglobina polimerizada con agentes de unión convirtiendo de ese modo los grupos carboxilo en ésteres de Sulfo-NHS amina-reactivos que forman una molécula reactiva precursora; y f) hacer reaccionar dicha molécula reactiva precursora con un polisacárido, en el que el polisacárido es un derivado de pectina natural.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones de hemoglobina y metodos de uso Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a agentes de transporte de oxfgeno para la administracion a pacientes para el tratamiento de hipoxia y de afecciones relacionadas. Mas espedficamente, la invencion se refiere a una molecula hnbrida de hemoglobina que esta protegida por la adhesion de una molecula de carbohidrato para suministrar oxfgeno a celulas en un estado de hipoxia.
Antecedentes de la invencion
Un componente principal de morbilidad y de mortalidad atribuible a enfermedad cardiovascular se produce como consecuencia del bloqueo parcial o completo de los vasos que transportan sangre en la vasculatura coronaria y/o periferica. Cuando dichos vasos se ocluyen parcialmente, la ausencia de flujo sangumeo causa isquemia a los tejidos musculares abastecidos por dicho vaso, inhibiendo por consiguiente la contraccion muscular y la funcion apropiada. La oclusion total del flujo sangumeo causa necrosis del ejido muscular. La necrosis del tejido muscular causa formacion de cicatrices, conduciendo a remodelado e insuficiencia cardiaca.
Las oclusiones de los vasos sangumeos se tratan habitualmente potenciando mecanicamente el flujo sangumeo en los vasos afectados. Dichas potenciaciones mecanicas a menudo se proporcionan empleando tecnicas quirurgicas que adhieren conductos naturales o sinteticos proximales y distales a las areas de oclusion, proporcionando de ese modo injertos de derivacion, o revascularizacion por diversos medios para agrandar ffsicamente el lumen vascular en el sitio de oclusion. Estos procedimientos de revascularizacion implican dispositivos tales como globos, bistuns endovasculares y tornos endovasculares. Desafortunadamente, las estrategias quirurgicas estan acompanadas por una significativa morbilidad e incluso mortalidad, mientras que los procesos de tipo angioplastia se complican por estenosis recidivante en muchos casos.
En algunos individuos, la oclusion de los vasos sangumeos se compensa parcialmente por procesos naturales, en los que se forman nuevos vasos (llamado "angiogenesis") y se agrandan pequenos vasos (llamado "arteriogenesis") para remplazar la funcion de los vasos alterados. Estos nuevos vasos pueden facilitar la restauracion de flujo sangumeo al tejido privado, constituyendo de ese modo una "derivacion natural" alrededor de los vasos ocluidos. Sin embargo, algunos individuos son incapaces de generar suficientes vasos colaterales para compensar adecuadamente el disminuido flujo sangumeo causado por la enfermedad cardiovascular. Por consiguiente, sena deseable proporcionar una composicion para compensar la perdida de sangre debida a una oclusion en la arteria coronaria y las arterias perifericas para tratar la isquemia. La hemoglobina, como componente transportador natural del oxfgeno de la sangre, puede tener poco suministro en las areas de oclusion debido a estas oclusiones mecanicas que causan afecciones isquemicas. La necesidad de alguna forma de modificacion qmmica de la hemoglobina para hacerla mas adecuada para su uso como transportador mejorado del oxfgeno puede compensar el disminuido suministro de sangre en las afecciones isquemicas.
Sumario de la invencion
De acuerdo con la descripcion, se describe un metodo y una composicion para el tratamiento de hipoxia y afecciones relacionadas. Se contempla, dentro del alcance de la descripcion, que la isquemia, la anemia y el traumatismo pueden describirse como estado de hipoxia. Sin limitarse a teona particular alguna, se cree que la hipoxia induce activacion transcripcional de genes que alteran el metabolismo celular y promueven la neoangiogenesis.
La composicion de acuerdo con la descripcion es un agente de transporte de oxfgeno de hemoglobina modificada. De acuerdo con la descripcion, se describe un metodo y una composicion, donde la composicion consiste principalmente en una hemoglobina protegida por carbohidrato (CSH™) para suministrar oxfgeno en la fase de hipoxia. La composicion de acuerdo con la descripcion se basa en la qmmica de oxidacion que se cree que desempena tareas claves en isquemia y en anemia y tiene una estructura general como la siguiente:
CSH = A[x] - B[y] - C[z]
A. Hemoglobina estabilizada reticulada
B. Enlace
C. Derivado de pectina natural
La composicion de acuerdo con la descripcion es una hemoglobina protegida por carbohidrato (CSH™) donde [x] unida desde A estan unidas a [y] unida desde B y B esta unido a [z] unida desde C. A es una hemoglobina tetramerica y [x] es 1 y hasta 6 unidades tetramericas. C es un derivado natural de pectina y [z] es 1 y hasta 12 unidades. B es una entidad qmmica o ffsica o una combinacion de estas que une forma un puente entre A y C, y [y] es 2 y hasta 24 enlaces definidos.
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En un aspecto de la descripcion, la molecula tubrida de hemoglobina contiene carbohidratos para estabilizar la actividad catalttica de las subunidades tetramericas reticuladas de la protema hemoglobina como transportador universal de ox^geno.
En un aspecto adicional de la descripcion, la molecula tubrida de hemoglobina, que se inyecta por via iv, circula en la sangre recogiendo el oxfgeno de los pulmones y despues se dirige al organo hipoxico espedfico o al organo lesionado o al organo enfermo donde los biomarcadores o receptores presentados sobre la superficie de membrana inducen liberacion del oxfgeno al organo. Se contempla dentro del alcance de la descripcion que estan disponibles otras vfas de administracion.
En un aspecto adicional de la descripcion, los componentes A y C estan unidos por un puente a traves de puentes qmmicos y/o ffsicos a traves de multiples interacciones fuerzas ionicas y/o hidrofobas o de van der Waals [o interaccion de van der Waals]. Las fuerzas de union entre las moleculas de hemoglobina (o entre partes de la misma molecula) y los derivados de pectina natural debido a enlaces covalentes y/o a la interaccion electrostatica y/o van der Waals desempenan una funcion fundamental en la estabilidad superior y en la actividad catalftica (transporte de oxfgeno) de la hemoglobina tubrida.
En otro aspecto de la descripcion, la molecula tubrida de hemoglobina penetra en las celulas y libera el oxfgeno dentro de las celulas. Una vez que las celulas han quedado oxigenadas, se revertira su estado de hipoxia.
En otro aspecto adicional mas de la descripcion, la molecula tubrida de hemoglobina tiene un mecanismo de accion para intervencion directa de farmaco terapeutico para la hipoxia. La molecula de hemoglobina hfbrida de acuerdo con la descripcion tiene afinidad por oxfgeno que imita los globulos rojos humanos y tiene mayor capacidad de transporte de oxfgeno que los globulos rojos humanos y no causa ningun efecto adverso asociado con el desarrollo previo de hemoglobina modificada.
En otro aspecto de la descripcion, la molecula hfbrida de hemoglobina es compatible con todos los tipos de sangre y puede administrarse inmediatamente.
En un aspecto adicional de la descripcion, la molecula hfbrida de hemoglobina es una composicion estable que tiene una vida util de aproximadamente dos anos.
En otro aspecto de la descripcion, la molecula hibrida de hemoglobina puede almacenarse a temperatura ambiente sin degradacion sustancial de la afinidad de transporte de oxfgeno de la composicion.
En un aspecto adicional mas de la descripcion, la molecula modificada de hemoglobina puede adaptarse para eficacia terapeutica para tratamientos de enfermedades degenerativas asociadas con hipoxia.
En otro aspecto de la invencion, se cree que el crecimiento y la metastasis de tumores solidos depende de forma cntica de la angiogenesis tumoral. Un estfmulo principal para el reclutamiento de un tumor de vasos sangumeos adicionales es la hipoxia celular. La hipoxia induce activacion transcripcional de genes que alteran el metabolismo celular y promueven la neo-angiogenesis. Los tumores en la mayona de los pacientes con cancer en fase final estan en un estado de hipoxia y estan dividiendose lentamente y sin responder a la mayona de farmacos antineoplasicos. Por lo tanto, un aspecto de la invencion es proporcionar la composicion de acuerdo con la descripcion para prevenir la neo-angiogenesis y restaurar la division celular normal del cancer que permitira que un farmaco antineoplasico trabaje de forma mas eficaz.
En un aspecto adicional mas de la descripcion, la molecula hfbrida de hemoglobina se dirige a receptores espedficos sobre la superficie de membrana de celulas cancerosas, penetrando de ese modo en las celulas y liberando el oxfgeno dentro de las celulas cancerosas. Una vez que las celulas cancerosas han quedado oxigenadas y se ha revertido su estado de hipoxia, los farmacos antineoplasicos tendran una mayor tasa de eficacia.
Breve descripcion de los dibujos
Las realizaciones descritas en la presente descripcion se ilustran en las figuras de los dibujos adjuntos que se entiende que son ejemplares y no limitantes, en los que se pretende que referencias similares hagan referencia a partes similares o correspondientes, y en los que:
La figura 1 ilustra la estructura de la hemoglobina, incluyendo las posiciones de las subunidades alfa y beta. Descripcion detallada
La hemoglobina para su uso en la composicion de la presente descripcion es preferiblemente hemoglobina humana, derivada de globulos rojos. Sin embargo, la invencion es aplicable tambien a otros tipos de hemoglobina para formar la base de un agente de transporte de oxfgeno, tal como hemoglobina animal especialmente hemoglobina bovina y
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hemoglobina porcina y similares, y hemoglobina derivada de cultivo celular. La molecula h^brida de hemoglobina de acuerdo con la descripcion tiene una estructura general como la siguiente:
CSH = A[x] - B[y] - C[z]
A. Hemoglobina estabilizada reticulada
B. Enlace
C. Derivado de pectina natural
La composicion de acuerdo con la descripcion es una hemoglobina protegida por carbohidrato (CSH™) donde [x] unida desde A estan unidas a [y] unida desde B y B esta unido a [z] unida desde C. A es una hemoglobina tetramerica y [x] es 1 y hasta 6 unidades tetramericas. C es un derivado natural de pectina y [z] es 1 y hasta 12 unidades. B es una entidad qmmica o ffsica o una combinacion de estas que une forma un puente entre A y C, y [y] es 2 y hasta 24 enlaces definidos.
Componente A:
A es una estructura de hemoglobina estabilizada reticulada Estructura de hemoglobina
La protema hemoglobina transportadora de oxfgeno se descubrio por Hunefeld en 1840. En 1851, Otto Funke publico una serie de artmulos en los que describfa el crecimiento de cristales de hemoglobina por dilucion sucesiva de globulos rojos con un disolvente tal como agua pura, alcohol o eter, seguido por evaporacion lenta del disolvente de la solucion de protema resultante.
La oxigenacion reversible de la hemoglobina se describio unos pocos anos despues por Felix Hoppe-Seyler. La funcion de la hemoglobina en la sangre se dilucido por el fisiologo Claude Bernard. El nombre hemoglobina es una voz compuesta de hemo y globina, que refleja el hecho de que cada unidad de hemoglobina es una protema globular con un grupo hemo (o hem) incluido. Cada grupo hemo contiene un atomo de hierro que puede unirse a una molecula de oxfgeno a traves de fuerzas dipolares inducidas por iones. El tipo mas comun de hemoglobina en mairnferos contiene cuatro de dichas subunidades.
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En la mayona de los seres humanos, la molecula de hemoglobina es un ensamblaje de cuatro subunidades proteicas globulares. Cada subunidad esta compuesta de una cadena proteica fuertemente asociada con un grupo hemo no proteico. Cada cadena proteica se dispone en un conjunto de segmentos estructurales de alfa-helice conectados juntos en una disposicion de plegamiento de globina, asf llamado porque esta disposicion es el mismo motivo de plegamiento usado en otras protemas hemo/globina tales como mioglobina. Este patron de plegamiento contiene un bolsillo que se une fuertemente al grupo hemo.
Un grupo hemo consiste en union ion (atomo cargado) de hierro (Fe) mantenido en un anillo heterodclico, conocido como porfirina. El ion de hierro, que es el sitio de union del oxfgeno, se coordina con los cuatro nitrogenos en el centro del anillo, que todos descansan en un plano. El hierro tambien se une fuertemente a la protema globular a traves del anillo imidazol del resto de histidina F8 por debajo del anillo de porfirina. Una sexta posicion puede unirse de forma reversible al oxfgeno por un enlace covalente coordinado, completando el grupo octaedrico de seis ligandos. El oxfgeno se une en una geometna de "flexion longitudinal " donde un atomo de oxfgeno se une a Fe y el otro sobresale a un angulo. Cuando el oxfgeno no esta unido, una molecula de agua muy debilmente unida llena el sitio, formando un octaedro distorsionado.
El ion de hierro puede estar en estado Fe2+ o Fe3+, pero la ferrihemoglobina (metahemoglobina) (Fe3+) no puede
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unirse al ox^geno. En union, el oxfgeno oxida temporalmente (Fe2+) a (Fe3+), de modo que el hierro debe existir en el estado de oxidacion +2 para unirse al oxfgeno. La enzima metahemoglobina reductasa reactiva la hemoglobina encontrada en estado inactivo (Fe3+) reduciendo el centro de hierro.
En seres humanos adultos, el tipo de hemoglobina mas comun es un tetramero (que contiene 4 protemas de subunidad) llamado hemoglobina A, que consiste en dos subunidades a y dos subunidades p unidas no covalentemente, cada una compuesta de 141 y 146 restos de aminoacido, respectivamente. Esto se indica como a2p2. Las subunidades son estructuralmente similares y de aproximadamente el mismo tamano. Cada subunidad tiene un peso molecular de aproximadamente 17.000 dalton, para un peso molecular total del tetramero de aproximadamente 68.000 dalton (64.458 g/mol). 1 g/dl = 0,6206 mmol/l. La hemoglobina A es la mas intensivamente estudiada de las moleculas de hemoglobina.
Las cuatro cadenas polipeptidicas se unen entre sf por puentes salinos, enlaces de hidrogeno e interacciones hidrofobas. Hay dos tipos de contactos entre las cadenas a y p: a-ip1 y a-ip2.
La oxihemoglobina se forma durante la respiracion cuando el oxfgeno se une al componente hemo de la protema hemoglobina en los globulos rojos. Este proceso se produce en los capilares pulmonares adyacentes a los alveolos de los pulmones. El oxfgeno entonces viaja a traves del torrente sangumeo para soltarse en las celulas donde se utiliza en la glucolisis aerobica y en la produccion de ATP por el proceso de fosforilacion oxidativa. No ayuda, sin embargo, a contrarrestar una disminucion en el pH sangumeo. La ventilacion, o la respiracion, puede revertir este estado eliminando el dioxido de carbono, causando por tanto un desplazamiento en el pH.
La desoxihemoglobina es la forma de hemoglobina sin el oxfgeno unido. Los espectros de absorcion de la oxihemoglobina y la desoxihemoglobina difieren. La oxihemoglobina tiene una absorcion significativamente inferior de la longitud de onda de 660 nm que la desoxihemoglobina, mientras que a 940 nm su absorcion es ligeramente mayor. Esto justifica el color rojo de la hemoglobina y el color azul de la desoxihemoglobina. Esta diferencia se usa para la medicion de la cantidad de oxfgeno en la sangre del paciente por un instrumento llamado oxfmetro de pulso.
Las matrices de protemas conectadas qmmicamente tienen aplicaciones diversas significativas incluyendo la produccion de sustitutos de globulos rojos, suministro de farmacos bioconjugados y terapias de protemas. (Vease, Efficient generation of dendritic arrays of cross-linked hemoglobin: symmetry and redundancy, Dongxin Hu y Ronald Kluger).
Para preparar materiales de estructura definida, existe la necesidad de reactivos eficaces y accesibles. Aunque la reticulacion qmmica con una protema de multiples subunidades puede conseguirse en alto rendimiento, la conexion de las protemas entre sf en un ensamblaje dendntico junto con la reticulacion simultanea ha tenido un exito limitado. Ahora se ha superado a traves del diseno e implementacion de un reactivo facilmente preparado con sitios de reaccion anadidos que compensan la hidrolisis de competicion. Se diseno y se sintetizo N,N',N"-Tris[bis(metil fosfato sodico)isoftalil]-1,3,5-bencenotricarboxamida (1), una tris-amida de hexaquis(fosfato de metilo) isoftalil trimesoMo, en alto rendimiento en tres fases a partir de un nucleo de trimesoflo reactivo.
Este material tiene tres pares de sitios de reaccion de reticulacion co-planares en una matriz simetrica. La presencia de tres conjuntos de sitios aumenta enormemente la probabilidad de que al menos dos conjuntos produzcan reticulaciones dentro de los tetrameros de hemoglobina (en competicion con la hidrolisis) y de ese modo conecta dos tetrameros reticulados en el mismo sitio. La reaccion de 1 con desoxihemoglobina a pH 8,5 da un material que contiene dos tetrameros de hemoglobina reticulados conectados entre sf y a un dfmero ap constituyente. Los productos se caracterizaron por SDS-PAGE, MS, digestion enzimatica y HPLc. La hemoglobina dendntica aislada con 2,5 componentes tetramericos tiene la misma afinidad por oxfgeno que la hemoglobina nativa (P50 = 5,0 Torr) y retiene la cooperatividad (n50 = 2,0). El analisis de los espectros de dicrofsmo circular indica que el ensamblaje retiene el plegamiento apropiado de las cadenas de globina mientras que los hemo estan en un entorno alterado.
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SH esta compuesto de hemoglobina bovina (de vaca) reticulada qmmicamente estabilizada situada en una solucion salina. Se contempla dentro del alcance de la descripcion que pueden usarse otras fuentes de hemoglobina
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incluyendo hemoglobina humana, hemoglobina de cultivo celular y hemoglobina derivada de otros animales. La hemoglobina por s^ misma es toxica para los rinones porque contiene lfpidos estromaticos, que estan contaminados con endotoxinas. Si se eliminan los ifpidos estromaticos, sin embargo, entonces la hemoglobina tiene una afinidad demasiado alta por el oxfgeno, que significa menor descarga de oxfgeno a los tejidos. Para asegurar que la hemoglobina no es toxica, pero es aun terapeuticamente util, debe estabilizarse. La estabilizacion puede conseguirse por reticulacion de la hemoglobina. Esto se hace reticulando las dos subunidades alfa y las dos subunidades beta. Esto entonces estabiliza los dfmeros alfa-beta, que a su vez hace que la molecula de hemoglobina sea mas estable, y tambien reduce su afinidad por el oxfgeno, haciendo que sea mas facil suministrar oxfgeno a los tejidos. La estructura de la hemoglobina se representa en la figura 1, incluyendo las posiciones de las subunidades alfa y beta.
Medidas de seguridad
Como la hemoglobina estabilizada usada de acuerdo con la descripcion se obtiene de vacas, la presente molecula de hemoglobina hnbrida pasa por extensos periodos para asegurarse de que esta: libre de patogenos, agentes infecciosos (BSE) y es qmmicamente pura, incluyendo: el uso solamente de rebanos muy controlados, donde el pafs de origen, el suministro de alimentos y la salud se supervisan estrechamente; el uso de expertos externos que regulan estrechamente el proceso estricto de fabricacion de la molecula hnbrida de hemoglobina para determinar la capacidad de eliminar los patogenos potenciales; y la observacion estricta de la industria global y las normas reguladoras.
Ventajas de la molecula hibrida de hemoglobina frente a RBC
Las ventajas de la molecula hnbrida de hemoglobina de acuerdo con la descripcion sobre las de la fuente tradicional de globulos rojos (RBC) como agente de transporte de oxfgeno se muestran en la tabla 1 a continuacion:
Tabla 1
caracterJsticas
MOLECULAS HIBRIDAS DE HEMOGLOBINA
GLOBULOS ROJOS
ALMACENAMIENTO
Temperatura ambiente (de 2° a 30°C) Refrigerados
VIDA UTIL
56 meses 42 dfas
PREPARACION
Listas para su uso Ensayo, tipado y compatibilidad
COMPATIBILIDAD
Universal Espedficos de tipo
EFICACIA
Suministro de oxfgeno inmediato Dependiente de la duracion de almacenamiento
PUREZA
Procesadas Ensayados y explorados para agentes infecciosos
MATERIAS PRIMAS
Son abundantes en hemoglobina, fuente controlada Disponibilidad limitada, no controlada
La molecula hnbrida de hemoglobina de acuerdo con la descripcion es de tamano mas pequeno (hasta aproximadamente 1000 veces mas pequena que un globulo rojo tfpico) y tiene menos viscosidad que los globulos rojos humanos (que contienen hemoglobina). Esto significa que puede transportar mas oxfgeno a una presion sangumea inferior que los globulos rojos. Ademas, a causa de su tamano mas pequeno, puede transportar oxfgeno a traves de vasos sangumeos parcialmente obstruidos o restringidos, donde las RBC no pueden alcanzar.
La oxigenacion tisular inadecuada resultante de las arterias ocluidas puede provocar ataque al corazon, angina o ataque isquemico transitorio, que es un precursor de apoplejfa. Tradicionalmente, estas afecciones se han tratado por transfusiones de sangre, pero las rBc a menudo son demasiado grandes para pasar a traves de la oclusion, que es por lo que la molecula hnbrida de hemoglobina de acuerdo con la descripcion puede ser potencialmente beneficiosa terapeuticamente.
Un vertebrado, que tiene una reduccion localizada, regional o sistemica en el flujo de RBC, puede tener sistemas de transporte de oxfgeno que sean por lo demas normales, o pueden tener anomalfas adicionales que pueden afectar de forma perjudicial al transporte de oxfgeno y transferencia en una parte del organismo, o por todo el organismo como conjunto.
Ademas, en este metodo, el vertebrado tiene un volumen de sangre normovolemico antes de la administracion de la hemoglobina. Un volumen de sangre normovolemico se define como un volumen de sangre dentro del sistema circulatorio del vertebrado que no provocara choque hipovolemico, tal como puede producirse por una hemorragia masiva o una gran perdida de fluidos despues de vomitos, diarrea, quemaduras o deshidratacion. Tfpicamente, un volumen de sangre normovolemico incluye al menos aproximadamente un 90% del volumen normal de sangre para ese vertebrado. En algunos casos, un volumen normovolemico puede contener tan poco como aproximadamente un 80% del volumen de sangre normal sin provocar choque hipovolemico.
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Ademas, la sangre que constituye el volumen de sangre normovolemico, contiene al menos aproximadamente una concentracion normal de RBC. Por ejemplo, la sangre en un volumen de sangre normovolemico de un ser humano tipicamente tiene hematocrito en vasos principales de al menos aproximadamente un 30%.
En este metodo, un vertebrado tambien tiene una resistencia vascular sistemica normal o mayor que la normal en el sistema circulatorio, antes de la administracion de la hemoglobina. Una resistencia vascular sistemica normal es una resistencia vascular que no producina choque distributivo, tal como choque septico en el vertebrado.
El flujo reducido de globulos rojos incluye cualquier reduccion en el flujo de RBC, localizado, regionalizado y/o sistemico, por debajo de los niveles normales de flujo de RBC, incluyendo un estado de "ausencia de flujo de RBC". El flujo de RBC localizado consiste en RBC que fluyen a traves de uno o mas capilares dentro de un lecho capilar, donde dichos capilares normalmente proporcionanan un flujo de RBC para oxigenar un area tisular localizada. El flujo regionalizado de RBC proporciona flujo de RBC para oxigenar un area tisular mayor, tal como una extremidad o un organo. El flujo sistemico de RBC es el flujo a traves de los sistemas circulatorios principales del organismo, proporcionando por tanto RBC para oxigenar el organismo como conjunto.
En una realizacion ilustrativa del metodo de la descripcion, se administra la molecula hnbrida de hemoglobina (HHM) a un vertebrado que tiene, o tendra, una obstruccion parcial del sistema circulatorio, tal como una estenosis o un bloqueo vascular, en una cantidad que reduce o imposibilita el flujo de RBC pasada la obstruccion parcial, pero por la que puede fluir al menos algo de plasma. La administracion de HHM aumenta la oxigenacion tisular en el tejido distal a una obstruccion parcial localizada o regionalizada y/o aumenta la oxigenacion tisular en todo el organismo para tratar una obstruccion parcial sistemica.
Las RBC son significativamente mas grandes que la molecula tnbrida de hemoglobina de acuerdo con la descripcion, siendo tfpicamente de 7-10 micrometros de diametro, por lo tanto, requiriendo aberturas vasculares significativamente mayores que HHM, para fluir pasada una obstruccion parcial.
Las obstrucciones parciales pueden producirse en todas las localizaciones tisulares y en todos los vasos sangumeos, tales como arterias, venas y capilares. Ademas, las valvulas dentro del sistema circulatorio, tales como la valvula aortica, mitral y tricuspide, tambien pueden obstruirse parcialmente. Ademas, la camara o las secciones del corazon pueden obstruirse parcialmente, tal como flujos de salida ventricular y la abertura ventricular a la arteria pulmonar.
Una obstruccion parcial del sistema circulatorio puede ser temporal, permanente o recurrente. Una obstruccion parcial del sistema circulatorio puede estar causada por diversos medios, tales como defectos de la pared del vaso, enfermedad, lesion, agregacion de componentes sangumeos, neoplasias, lesiones que ocupan el espacio, infecciones, cuerpos foraneos, compresion, farmacos, dispositivos mecanicos, vasoconstriccion y vasoespasmos.
Una estenosis del sistema circulatorio, como se define en este documento, es un estrechamiento de cualquier canal o lumen en el sistema circulatorio. Tfpicamente, una estenosis puede producirse por enfermedad, tal como aterosclerosis; una anomalfa de la pared del vaso, tal como una lmea de sutura desde un injerto arterial, un punto de union de adhesion para un injerto o una endoprotesis, un ensortijamiento o una deformidad en un vaso, injerto o endoprotesis, tejido curado o cicatrizado de una lesion o de un procedimiento invasivo (por ejemplo, cateterizacion, angioplastia, colocacion de endoprotesis vascular, injerto vascular con protesis, tejido alogenico y/o tejido autologo); una protesis vascular tal como una valvula o vaso artificial; compresion, tal como por una masa neoplasica, hematoma o medio mecanicos (por ejemplo, pinzamiento, torniquete o dispositivo de manguito); envenenamiento qrnmico o efectos secundarios de farmacos; vasoconstriccion; y vasoespasmos.
Componente B:
B es el "conector" "puente" entre A y C.
En una realizacion ilustrativa, los componentes A y C se unen por las varias tecnologfas de union comunes que incluyen, aunque sin limitacion, Sulfo-NHS de Thermo Scientific Pierce (W-hidroxisulfosuccinimida) y su analogo no cargado NHS (W-hidroxisuccinimida) que son reactivos de modificacion qrnmica para convertir grupos carboxilo en esteres de Sulfo-NHS amina-reactivos para su aplicacion en una diversidad de metodos de bioconjugacion y reticulacion.
En una realizacion ilustrativa, los componentes A y C se unen por puentes ffsicos ademas de a traves de multiples interacciones de naturalezas ionica y/o hidrofobica o de fuerzas de van der Waals (o interaccion de van der Waals). La fuerza de atraccion o de repulsion entre las moleculas (o entre partes de la misma molecula) diferentes a las debidas a enlaces covalentes o a la interaccion electrostatica de iones entre sf o con moleculas neutras. El termino incluye: fuerza entre un dipolo permanente y un dipolo inducido correspondiente instantaneo de dipolo inducido- dipolo inducido (fuerza de dispersion de London). Estas fuerzas pueden desempenar una funcion fundamental en la actividad catalftica biologica de la hemoglobina hnbrida y la estabilidad del polfmero.
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Los enlaces qmmicos se sintetizan facilmente mezclando la Sulfo-NHS con una molecula que contiene carboxilo y un agente deshidratante tal como la carbodiimida EDC (EDAC). El metodo es la base para generar muchos tipos de reactivos de marcaje de protemas, incluyendo colorantes fluorescentes amina-reactivos, marcas de afinidad por biotina y compuestos de pegilacion.
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EUructmt at tot reactive* ae nxxMcacton qunwa NKS y SUBO-NKS
En una realizacion ilustrativa adicional, se usa un agente de reticulacion no escindible, impermeable a la membrana, soluble en agua como agente de union. Este agente de union es del siguiente modo:
Bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3) es un reticulante homobifuncional, soluble en agua no escindible e impermeable a membrana. Contiene un ester de W-hidroxisulfosuccinimida (NHS) amina-reactivo en cada extremo de un brazo espaciador de 8-carbonos. Los esteres de NHS reaccionan con aminas primarias a pH 7-9 para formar enlaces amida estables, junto con la liberacion del grupo saliente N-hidroxisulfosuccinimida. Las protemas, incluyendo los anticuerpos, generalmente tienen varias aminas primarias en la cadena lateral de restos de lisina (K) y el extremo N- terminal de cada polipeptido que esta disponible como dianas para reactivos de reticulacion de ester de NHS.
Como contiene el resto sulfonilo hidrofilo, el reticulante BS3 es soluble hasta ~10 mM en agua y muchos tampones habitualmente usados, evitando de ese modo el uso de disolventes organicos que pueden alterar la estructura proteica. DSS, el analogo no soluble en agua de BS3 tambien esta disponible para aplicaciones que requieren un reticulante menos hidrofilo (por ejemplo, para lograr la reticulacion intracelular). DSS y BS3 tienen actividad reticulante esencialmente identica hacia aminas primarias.
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Componente C: derivado de pectina natural
La estructura caractenstica de la pectina natural es una cadena lineal de acido D-galacturonico a-(1-4)-unido que forma la estructura de pectina, un homogalacturonano. La pectina es un polisacarido que actua como un material de cimentacion en las paredes celulares de todos los tejidos vegetales. La parte blanca de la corteza de los limones y de las naranjas contiene aproximadamente un 30% de pectina. La pectina natural es el ester metilado del acido poligalacturonico, que consiste en cadenas de 300 a 1000 unidades de acido galacturonico con enlaces 1a^4. El grado de esterificacion (DE) afecta a las propiedades gelificantes de la pectina. La estructura mostrada aqm tiene tres formas de ester metflico (-COOCH3) por cada dos grupos carboxilo (-COOH), por tanto tiene un grado de esterificacion de un 60%, normalmente llamado pectina DE-60.
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La pectina es un polfmero de un acido a-galacturonico con una cantidad variable de grupos de ester metflico.
En esta estructura, hay regiones donde el acido galacturonico esta remplazado por L-ramnosa (1-2)-unida. A partir de los restos de ramnosa, las cadenas laterales de diversos azucares neutros se ramifican. Este tipo de pectina se llama ramnogalacturonano I. Hasta cada 25.° acido galacturonico en la cadena principal esta remplazado con ramnosa. Algunos tramos consisten en acido galacturonico y ramnosa alternos - "regiones pilosas", otras con
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densidad inferior de ramnosa - "regiones suaves". Los azucares neutros son principalmente D-galactosa, L- arabinosa y D-xilosa, variando los tipos y proporciones de azucares neutros con el origen de la pectina.
Un tercer tipo estructural de pectina es ramnogalacturonano II, que es un polisacarido altamente ramificado y complejo menos frecuente.
La pectina natural aislada tiene un peso molecular de tipicamente hasta 400.000 g/mol, variando con el origen y las condiciones de extraccion.
En la naturaleza, aproximadamente un 80% de los grupos carboxilo del acido galacturonico estan esterificados con metanol. Esta proporcion disminuye mas o menos durante la extraccion de la pectina. La relacion de acido galacturonico esterificado a no esterificado determina el comportamiento de la pectina en aplicaciones alimenticias. Esto es por lo que las pectinas se clasifican como pectinas de alto ester frente a bajo ester - o en pectinas cortas HM frente a LM, con mas o menos de la mitad de todo el acido galacturonico esterificado.
Las unidades no esterificadas de acido galacturonico pueden ser acidos libres (grupos carboxilo) o sales con sodio, potasio o calcio. Las sales de pectinas parcialmente esterificadas se llaman pectinatos, si el grado de esterificacion es por debajo de un 5% las sales se llaman pectatos, la forma de acido insoluble, acido pectico.
La pectina amidada es una forma modificada de pectina. Aqrn, parte del acido galacturonico se convierte con amoniaco en amida de acido carboxflico. Estas pectinas son mas tolerantes a concentraciones variables de calcio que se producen en uso.
Las pectinas de alto ester sedimentan a temperaturas mayores que las pectinas de bajo ester. Sin embargo, las reacciones de gelificacion con calcio aumentan segun cae el grado de esterificacion. Asimismo, valores de pH inferiores o solidos solubles mayores (normalmente azucares) aumentan la velocidad de gelificacion.

Claims (13)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para producir una molecula hnbrida de hemoglobina, util para formar un sustituto de sangre estable, a partir de hemoglobina contenida en una solucion de hemoglobina, que comprende las etapas de:
    a) desoxigenar dicha solucion de hemoglobina;
    b) mezclar dicha solucion de hemoglobina desoxigenada con un compuesto sulfhidrilo;
    c) mezclar dicha solucion de compuesto sulfhidrilo y hemoglobina con un agente reticulante para formar una mezcla de reaccion de polimerizacion;
    d) polimerizar la mezcla de reaccion de polimerizacion, formando de ese modo una solucion de hemoglobina polimerizada;
    e) hacer reaccionar dicha solucion de hemoglobina polimerizada con agentes de union convirtiendo de ese modo los grupos carboxilo en esteres de Sulfo-NHS amina-reactivos que forman una molecula reactiva precursora; y
    f) hacer reaccionar dicha molecula reactiva precursora con un polisacarido, en el que el polisacarido es un derivado de pectina natural.
  2. 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicha solucion de hemoglobina comprende hemoglobina de mairnfero.
  3. 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicha solucion de hemoglobina de mai^ero se forma a partir de hemoglobina seleccionada de un grupo que consiste en hemoglobina humana, hemoglobina bovina, hemoglobina ovina, hemoglobina porcina.
  4. 4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la solucion de hemoglobina desoxigenada tiene un contenido de oxihemoglobina de menos de aproximadamente un 10%.
  5. 5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el polisacarido es un acido ramnogalacturonico sustancialmente metoxilado.
  6. 6. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho compuesto sulfhidrilo se selecciona del grupo que consiste en N-acetil-L-cistema, D,L-cistema, glutation, gamma-glutamil-cistema, 2,3-dimercapto-1-propanol, tioglicolato y 1,4-butanoditiol, o una formula general tiol-[CHO]n-tiol, para formar una solucion del compuesto sulfhidrilo y dicha hemoglobina.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha molecula hnbrida de hemoglobina es una hemoglobina estabilizada protegida por carbohidrato.
  8. 8. Uso de una molecula tnbrida de hemoglobina, preparada por el metodo de la reivindicacion 1, para tratar un organo hipoxico, que tiene heterogeneidad de oxfgeno debido a proliferacion incontrolada.
  9. 9. Uso de una molecula hnbrida de hemoglobina, preparada por el metodo de la reivindicacion 1, para aumentar la oxigenacion tisular y, por consiguiente, aumentar la funcion organica de un vertebrado, mientras el organo tiene suministro reducido de oxfgeno debido a al menos una obstruccion parcial de un vaso sangumeo dentro del sistema circulatorio del vertebrado, y en el que el vertebrado tiene un volumen de sangre normovolemico y al menos una resistencia vascular sistemica normal.
  10. 10. El uso de la reivindicacion 8, en el que dicha molecula hnbrida de hemoglobina es una hemoglobina estabilizada protegida por carbohidrato.
  11. 11. El uso de la reivindicacion 8, en el que el organo es un organo con traumatismo seleccionado del grupo que consiste en musculo, corazon, cerebro, pulmon y piel.
  12. 12. El uso de la reivindicacion 11, en el que el corazon tiene una estenosis parcial seleccionada del grupo que consiste en una estenosis del vaso sangumeo, una estenosis de valvula, una estenosis de una abertura en el corazon y una estenosis de una camara del corazon.
  13. 13. Uso de una molecula hnbrida de hemoglobina, preparada por el metodo de la reivindicacion 1, para aumentar la oxigenacion tisular y, por consiguiente, aumentar la funcion organica de un vertebrado, mientras el organo tiene suministro reducido de oxfgeno debido a al menos una obstruccion parcial de un vaso sangumeo dentro del sistema circulatorio del vertebrado, y en el que el vertebrado tiene un hematocrito de vasos principales de al menos aproximadamente un 30% y al menos una resistencia vascular sistemica normal.
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