ES2622165T3

ES2622165T3 - Método para la producción de una bebida láctea acidificada

Info

Publication number: ES2622165T3
Application number: ES08786770.1T
Authority: ES
Inventors: Jeppe Wegener Tams; Christel Thea Joergensen; Steffen Ernst; Per Munk Nielsen
Original assignee: Chr Hansen AS
Current assignee: Chr Hansen AS
Priority date: 2007-08-02
Filing date: 2008-08-01
Publication date: 2017-07-05
Anticipated expiration: 2028-08-01
Also published as: WO2009016257A2; EP2175737A2; DK2175737T3; CN101854806A; US20090061046A1; WO2009016257A3; AU2008281723A1; MX2010001073A; EP2175737B1; US20120258199A1; BRPI0814271A2

Abstract

Método para la producción de una bebida láctea acidificada, dicho método que comprende: a) proporcionar un sustrato de leche con un contenido de proteína superior al 5%; b) tratar el sustrato de leche con una enzima con actividad de transglutaminasa; c) fermentar el sustrato de leche con un microorganismo; y d) diluir el sustrato de leche fermentada al menos 1,5 veces para obtener la bebida láctea acidificada; donde la etapa b) se realiza antes, durante o después de la etapa c).

Description

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Metodo para la produccion de una bebida lactea acidificada LISTADO DE SECUENCIAS

[0001] La presente invencion comprende un listado de secuencias.

CAMPO TECNICO

[0002] La presente invencion se refiere a un metodo para la produccion de una bebida lactea acidificada que utiliza una enzima con actividad de transglutaminasa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0003] El mercado de las bebidas lacteas acidificadas, que incluye bebidas lacteas fermentadas y yogur lfquido, esta aumentando a nivel mundial y existe un interes en mejorar la calidad y economfa de este producto.

[0004] Las bebidas lacteas acidificadas se producen generalmente mediante la mezcla de leche acidificada con una solucion de jarabe, y sometiendo la mezcla a un tratamiento de homogeneizacion.

La acidificacion puede producirse a traves de la adicion de una sustancia qufmica, tal como glucono-delta-lactona (GDL), o puede ser provocada por la fermentacion de la leche con bacterias del acido lactico.

Sin embargo, cuando tales productos se almacenan, la casefna, un ingrediente de la leche, frecuentemente se precipita o se asocia y se agrega y, como resultado, las bebidas tienden separarse de modo que el suero de leche lfquido se acumula en la superficie. Este proceso, al que normalmente se le denomina sineresis, reduce la calidad de las bebidas lacteas acidificadas.

[0005] La pectina, el almidon, el almidon modificado, la CMC, etc., se usan frecuentemente como estabilizantes en las bebidas lacteas acidificadas pero, debido al coste relativamente alto de tales estabilizantes, existe un interes en encontrar soluciones diferentes y quizas aun mejores.

[0006] El uso de enzimas con actividad de transglutaminasa para la modificacion de protefnas alimentarias, incluyendo protefnas de productos lacteos, se conoce en el estado de la tecnica. Por ejemplo, JP2835940-B2 describe la fabricacion de una bebida acida que contiene protefna de la leche, y muestra que una bebida lactea que comprende leche desnatada en polvo disuelta tratada con transglutaminasa, seguida de una acidificacion qufmica, retiene una turbidez blanca opaca al ser sometida a esterilizacion termica debido a una menor precipitacion de protefna de la leche.

EP0671885 describe un metodo para la produccion de un producto analogo lacteo que comprende un tratamiento con transglutaminasa seguido de acidificacion.

En este caso, se muestra que un producto analogo lacteo tratado con transglutaminasa donde la acidificacion se realiza como una fermentacion biologica muestra la consistencia de un yogur semisolido.

Ademas, se muestra que un yogur reconstituido obtenido a partir de leche desnatada tratada con transglutaminasa tiene una consistencia mas homogenea en comparacion con un control no tratado.

[0007] Se sabe que el tratamiento con transglutaminasa durante la fabricacion de productos lacteos fermentados aumenta la viscosidad del producto. WO2007/060288 demuestra que la adicion de transglutaminasa durante la produccion de productos lacteos fermentados tales como yogur permite la reduccion del contenido de protefna del sustrato de leche para obtener igualmente un yogur con una alta viscosidad.

[0008] Lorenzen, P. C. et al. (2005): "Impact of enzymatic crosslinking of milk protein on the properties of stirred yogurt and stirred cultured milk products.", Kieler Milchwirtschaftliche Forschungsberichte 57 (2) 97-115, han descrito la preparacion de un producto lacteo fermentado que conlleva la adicion de leche en polvo tratada con transglutaminasa o de producto protefnico de suero de leche a leche baja en grasa y la fermentacion con un cultivo de leche agria.

[0009] En un proceso industrial para la fabricacion de una bebida lactea fermentada, serfa deseable concentrar el sustrato de leche antes de llevar a cabo la fermentacion, y luego diluir el sustrato de leche fermentado en una etapa posterior en el proceso de fabricacion para obtener una bebida lactea con el contenido deseado de solidos de leche.

La concentracion antes de la fermentacion y la dilucion posterior reduce el requisito de capacidad del tanque de fermentacion, y por lo tanto, reduce los costes de fabricacion.

Sin embargo, el estado de la tecnica ensena que el aumento del contenido de protefna en un sustrato de leche que se va a fermentar dara lugar a un producto fermentado con una viscosidad mas alta (vease, por ejemplo, WO2007/060288), y el tratamiento con transglutaminasa aumentara aun mas la viscosidad.

[0010] Un objeto de la presente invencion es proporcionar un metodo para la fabricacion de una bebida lactea

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fermentada estable, donde la sineresis durante el almacenamiento es reducida.

Tambien es un objeto proporcionar un metodo para la fabricacion, a partir de un sustrato de leche concentrada, de una bebida lactea fermentada estable, que sea potable, es decir un lfquido de flujo libre.

RESUMEN DE LA INVENCION

[0011] Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que una bebida lactea fermentada producida a partir de un sustrato de leche con un alto contenido de protefnas se puede estabilizar con transglutaminasa y seguir reteniendo la baja viscosidad que se desea para un producto que se va a consumir como bebida.

[0012] En consecuencia, la presente invencion se refiere a un metodo para la produccion de una bebida lactea acidificada, dicho metodo que comprende:

a) proporcionar un sustrato de leche con un contenido de protefnas superior al 5%;

b) tratar el sustrato de leche con una enzima con actividad de transglutaminasa;

c) fermentar el sustrato de leche con un microorganismo; y

d) diluir el sustrato de leche fermentada al menos 1,5 veces para obtener la bebida lactea acidificada; donde la etapa b) se realiza antes, durante o despues de la etapa c).

[0013] La bebida lactea acidificada producida mediante cualquier metodo de la presente invencion es potable, es decir, apta para ser consumida como bebida.

[0014] En una forma de realizacion preferida, el sustrato de leche fermentada se mezcla con un jarabe y la mezcla se somete a homogeneizacion para obtener la bebida lactea acidificada.

[0015] En otra forma de realizacion preferida, el sustrato de leche se somete a pasteurizacion antes de la fermentacion y el tratamiento con transglutaminasa se lleva a cabo antes de la pasteurizacion

[0016] En otra forma de realizacion preferida, el sustrato de leche se somete a un tratamiento termico antes del tratamiento con transglutaminasa. Preferiblemente, tal tratamiento termico tiene como resultado una desnaturalizacion de mas del 50% de la protefna de suero de leche en el sustrato de leche.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Bebidas lacteas acidificadas

[0017] "Bebidas lacteas acidificadas" en el contexto de la presente invencion incluye cualquier producto potable basado en sustratos de leche acidificada, incluyendo, por lo tanto, bebidas lacteas fermentadas y bebidas de yogur lfquido. En los metodos de la presente invencion, la acidificacion se realiza como una fermentacion con un microorganismo.

[0018] Las bebidas lacteas acidificadas en el contexto de la invencion son potables en el sentido de que estan en forma lfquida y se consumen como bebidas, es decir, son adecuadas para ser bebidas en lugar de ser comidas con cuchara. "En forma lfquida" significa que los productos estan en el estado fluido de la materia, mostrando por lo tanto una disposicion caracterfstica a fluir. De este modo, la forma de un lfquido normalmente es determinada por el contenedor en el que se encuentra, a diferencia de, por ejemplo, una sustancia de tipo gel, que es blanda pero no fluye facilmente, tal como, por ejemplo, un yogur o pudin. Las bebidas lacteas acidificadas en el contexto de la invencion pueden tener una viscosidad que permita al consumidor beber los productos utilizando una pajita, si lo desea.

[0019] En un aspecto preferido, las bebidas lacteas acidificadas en el contexto de la invencion tienen una viscosidad medida como tiempo de descarga a partir de una pipeta de 10 ml que es sustancialmente la misma que el tiempo de descarga de una bebida lactea acidificada producida sin transglutaminasa.

En este contexto, un tiempo de descarga que es sustancialmente el mismo significa que es aumentado en menos de un 20%, preferiblemente aumentado en menos de un 15% y mas preferiblemente aumentado en menos de un 10%.

[0020] Una bebida lactea acidificada en el contexto de la presente invencion puede tener un pH inferior a 4.6, preferiblemente menos de 4.4, mas preferiblemente menos de 4.2 e incluso mas preferiblemente alrededor de pH 4 o menos. En un aspecto, la bebida lactea acidificada tiene un pH inferior a 3.8, por ejemplo inferior a 3.6.

[0021] Una bebida lactea acidificada en el contexto de la invencion puede tener un contenido de grasa de 0 a 2%, preferiblemente inferior al 1,5%, inferior al 1% o inferior al 0,5%, mas preferiblemente de aproximadamente 0,1% o menos. La bebida lactea acidificada puede tener un contenido de solido de leche no graso inferior al 20%, preferiblemente inferior al 8,5%, inferior al 8%, inferior al 7,5%, inferior al 7%, inferior al 6,5% o inferior al 6%, y mas preferiblemente de aproximadamente 5%.

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[0022] Una bebida lactea acidificada en el contexto de la invencion puede tener un contenido de protefna de entre 0,5 y 4%. En un aspecto preferido, la bebida lactea acidificada tiene un contenido de protefna inferior al 1%. En otro aspecto preferido, la bebida lactea acidificada tiene un contenido de protefna de entre 2% y 3%.

[0023] Una bebida lactea acidificada en el contexto de la invencion puede tener una vida util de mas de 7 dfas, preferiblemente mas de 14 dfas, mas preferiblemente mas de 28 dfas, como por ejemplo mas de 3 meses.

[0024] Una bebida lactea acidificada en el contexto de la presente invencion tiene una estabilidad aumentada.

La estabilidad se puede determinar despues de haber almacenado la bebida lactea acidificada durante un numero apropiado de dfas mediante la medicion de la altura del suero de leche acumulado en la superficie debido a la sineresis. Tambien se puede determinar despues de sineresis acelerada, tal como por centrifugacion.

Metodo para producir una bebida lactea acidificada

[0025] Como se ha mencionado anteriormente, el metodo para la produccion de una bebida lactea acidificada segun la presente invencion comprende:

a) proporcionar un sustrato de leche con un contenido de protefna superior al 5%;

c) fermentar el sustrato de leche con un microorganismo; y

[0026] "Sustrato de leche", en el contexto de la presente invencion, puede ser cualquier material lacteo crudo y/o procesado que se pueda someter a acidificacion segun el metodo de la invencion.

Asf, los sustratos de leche utiles incluyen, pero de forma no limitativa, soluciones/suspensiones de cualquier producto lacteo o analogo lacteo que comprenda protefna, tal como leche de grasa entera o baja en grasa, leche desnatada, suero de mantequilla, leche en polvo reconstituida, leche condensada, leche deshidratada, suero de leche, permeato de suero de leche, lactosa, lfquido madre de cristalizacion de lactosa, concentrado de protefna de suero de leche, o nata. Obviamente, el sustrato de leche puede proceder de cualquier mamffero.

[0027] El sustrato de leche es mas concentrado que la leche cruda, es decir, el contenido de protefna es superior que en la leche cruda.

El contenido de protefna es de mas del 5%, preferiblemente mas del 6%, por ejemplo mas del 7%, mas preferiblemente mas del 8%, por ejemplo mas del 9% o mas del 10%.

Preferiblemente, el contenido de lactosa tambien es superior que en la leche cruda, por ejemplo de mas del 7%, mas del 8%, mas del 9%, mas del 10%, mas del 11% o mas del 12%.

En una forma de realizacion preferida de este aspecto, el sustrato de leche es una solucion acuosa concentrada de leche desnatada en polvo con un contenido de protefna superior al 5% y un contenido de lactosa superior al 7%.

[0028] En el contexto de la presente invencion, los porcentajes que definen el contenido del sustrato de leche o el contenido de la bebida lactea acidificada son porcentajes de masa, es decir la masa de una sustancia (por ejemplo, protefna o lactosa) como un porcentaje de la masa de la solucion entera (sustrato de leche o bebida lactea acidificada). De este modo, en un sustrato de leche con un contenido de protefna superior al 5%, la masa de las protefnas constituye mas del 5% de la masa del sustrato de leche.

[0029] Preferiblemente, al menos parte de la protefna presente en el sustrato de leche son protefnas presentes de manera natural en la leche, tales como la casefna o la protefna de suero de leche.

Sin embargo, parte de la protefna pueden ser protefnas que no estan presentes de manera natural en la leche.

[0030] El termino "leche" debe ser entendido como la secrecion lactea obtenida mediante el ordeno de cualquier mamffero, tal como vacas, ovejas, cabras, bufalos o camellos. En una forma de realizacion preferida, la leche es leche de vaca.

[0031] Antes de la fermentacion, el sustrato de leche se puede homogeneizar y pasteurizar segun metodos conocidos en el estado de la tecnica.

[0032] La "homogenizacion" como se utiliza en este caso significa una mezcla intensiva para obtener una suspension o emulsion soluble. Si la homogeneizacion se realiza antes de la fermentacion, se puede realizar para dividir la grasa lactea en tamanos menores de modo que ya no se separe de la leche. Esto se puede lograr haciendo pasar la leche a alta presion por pequenos orificios

[0033] "Pasteurizar", como se utiliza en este caso, significa el tratamiento del sustrato de leche para reducir o eliminar la presencia de organismos vivos, tales como microorganismos. Preferiblemente, la pasteurizacion se realiza manteniendo una temperatura especffica durante un periodo de tiempo especffico. La temperatura

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especffica normalmente se logra por calentamiento. La temperature y duracion se pueden seleccionar para matar o inactivar ciertas bacterias, tales como bacterias nocivas. Una etapa de enfriamiento rapido se puede realizar a continuacion.

[0034] En los metodos de la presente invencion, el sustrato de leche se acidifica mediante fermentacion con un microorganismo. Opcionalmente, tal acidificacion por fermentacion se combina con acidificacion qufmica del sustrato de leche.

[0035] "Fermentacion" en los metodos de la presente invencion significa la conversion de carbohidratos en alcoholes o acidos a traves de la accion de un microorganismo. Preferiblemente, la fermentacion en los metodos de la invencion comprende la conversion de lactosa en acido lactico.

[0036] En el contexto de la presente invencion, "microorganismo" puede incluir cualquier bacteria u hongo capaz de fermentar el sustrato de leche.

[0037] Los microorganismos usados para la mayorfa de productos lacteos fermentados se seleccionan del grupo de bacterias generalmente denominadas bacterias del acido lactico. Como se utiliza en este caso, el termino "bacteria de acido lactico" designa una bacteria grampositiva microaerofflica o anaerobica, que fermenta azucares con la produccion de acidos incluyendo acido lactico como el acido predominantemente producido, acido acetico y acido propionico. Las bacterias del acido lactico mas utiles industrialmente se encuentran en el orden "Lactobacillales" que incluye Lactococcus, spp. Streptococcus, spp. Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus, spp. Brevibacterium, spp. Enterococcus spp. y Propionibacterium spp. Adicionalmente, las bacterias productoras de acido lactico que pertenecen al grupo de las bacterias anaerobicas estrictas, bifidobacteria, por ejemplo Bifidobacterium spp., generalmente estan incluidas en el grupo de las bacterias del acido lactico. Estas se usan frecuentemente como cultivos alimenticios solos o en combinacion con otras bacterias del acido lactico,

[0038] Las bacterias del acido lactico normalmente se suministran a la industria lactea o bien como cultivos congelados o liofilizados para la propagacion de iniciadores o como los cultivos denominados "Direct Vat Set" (SVD), destinados a la inoculacion directa en un deposito o cuba de fermentacion para la produccion de un producto lacteo, tal como una bebida lactea acidificada. Tales cultivos en general se denominan "cultivos iniciadores" o "iniciadores".

[0039] Las cepas de cultivo iniciador de bacterias del acido lactico usadas comunmente se dividen generalmente en organismos mesofflicos, que tienen temperaturas de crecimiento optimo en alrededor de 30°C, y organismos termofflicos, que tienen temperaturas de crecimiento optimo en el rango de aproximadamente 40 a aproximadamente 45°C. Los organismos tfpicos que pertenecen al grupo mesofflico incluyen Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pseudoleuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subesp. Lactis biovar. diacetilactis, Lactobacillus casei subesp. casei y Lactobacillus paracasei subesp. paracasei. Las especies bacterianas de acido lactico termofflico incluyen como ejemplos Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subesp. acidophilus y Lactobacillus bulgaricus.

[0040] Las bacterias anaerobicas estrictas que pertenecen al genero Bifidobacterium, incluyendo Bifidobacterium bifidum y Bifidobacterium longum, tambien se usan comunmente como cultivos iniciadores lacteos y generalmente se incluyen en el grupo de las bacterias del acido lactico. Adicionalmente, especies de Propionibacteria se usan como cultivos lacteos iniciadores, en particular en la produccion de queso. Adicionalmente, organismos pertenecientes al genero Brevibacterium se usan comunmente como cultivos iniciadores alimenticios.

[0041] Otro grupo de cultivos iniciadores microbianos son los cultivos fungicos, incluyendo cultivos de levadura y cultivos de hongos filamentosos, que se usan particularmente en la produccion de ciertos tipos de queso y bebida.

Los ejemplos de hongos incluyen Penicillium roqueforti, Penicillium candidum, Geotrichum candidum, Torula kefir, Saccharomyces kefir y Saccharomyces cerevisiae.

[0042] En una forma de realizacion preferida, el microorganismo usado para la fermentacion del sustrato de leche es Lactobacillus casei o una mezcla de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subesp. bulgaricus.

[0043] Opcionalmente, el sustrato de leche fermentada se puede someter a tratamiento termico para inactivar el microorganismo.

[0044] Los procesos de fermentacion para ser usados en la produccion de bebidas lacteas acidificadas son ampliamente conocidos y el experto en la tecnica sabra como seleccionar condiciones adecuadas del proceso,

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tales como temperatura, oxfgeno, cantidad y caracterfsticas del/de los microorganismo(s) y tiempo del proceso. Obviamente, las condiciones de fermentacion se seleccionan para contribuir al logro de la presente invencion, es decir, para obtener un producto de leche fermentada adecuado en la produccion de una bebida lactea acidificada.

[0045] Asimismo, la persona experta conocera si, y cuando, los aditivos tales como, por ejemplo, carbohidratos, aromas, minerales, enzimas (por ejemplo cuajo, lactasa y/o fosfolipasa) se deben usar en la produccion de bebidas lacteas acidificadas segun la invencion.

[0046] El sustrato de leche fermentada se diluye para obtener la bebida lactea acidificada.

El sustrato de leche fermentada se diluye al menos 1,5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, al menos 2,5 veces o al menos 3 veces. Se puede diluir con agua o una solucion acuosa de cualquier tipo. "Se diluye al menos 1,5 veces" en el contexto de la presente invencion significa que el sustrato de leche fermentada se diluye de modo que su volumen aumenta en al menos un 50 %.

[0047] En una forma de realizacion, se anade un jarabe al sustrato de leche fermentada.

[0048] "Jarabe" en el contexto de la presente invencion es cualquier ingrediente aditivo adicional que aporta sabor y/o dulzor al producto final, es decir, la bebida lactea acidificada.

Puede ser una solucion que comprende, por ejemplo, azucar, sacarosa, glucosa, azucar lfquido de fructosa, aspartamo, alcohol de azucar, concentrado de fruta, zumo de naranja, zumo de fresa y/o zumo de limon.

[0049] La mezcla del sustrato de leche fermentada y el jarabe se puede homogeneizar utilizando cualquier metodo conocido en la tecnica. La homogeneizacion se puede realizar para obtener una solucion homogenea lfquida que es fluida y estable. La homogeneizacion de la mezcla del sustrato de leche acidificada y el jarabe se puede realizar mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, como por ejemplo haciendo pasar la leche a alta presion a traves de pequenos orificios.

[0050] En otra forma de realizacion, se anade agua al sustrato de leche fermentada, y la mezcla de sustrato de leche fermentada y agua se homogeneiza.

[0051] Los metodos de la presente invencion comprenden el tratamiento del sustrato de leche con una enzima con actividad de transglutaminasa. El tratamiento enzimatico se puede realizar antes de la fermentacion, por ejemplo antes de la inoculacion con el microorganismo. El tratamiento enzimatico se puede realizar a la vez que la fermentacion. En una forma de realizacion, la enzima se anade antes, durante o despues de la inoculacion del sustrato de leche con un microorganismo, y la reaccion enzimatica en el sustrato de leche tiene lugar esencialmente a la vez que la fermentacion.

[0052] Alternativamente, el tratamiento enzimatico se puede realizar despues de la fermentacion.

Si el sustrato de leche acidificada se mezcla y opcionalmente se homogeneiza con el jarabe, el tratamiento enzimatico se puede realizar antes o despues de esto. La enzima se puede anadir al mismo tiempo o despues que el jarabe, pero antes de la homogeneizacion, o se puede anadir despues de que el sustrato de leche acidificada y el jarabe se hayan mezclado y homogeneizado.

[0053] En una forma de realizacion preferida, el tratamiento enzimatico se realiza antes o durante la fermentacion.

En una forma de realizacion mas preferida, el sustrato de leche se somete a pasteurizacion antes de la fermentacion, y el tratamiento enzimatico se realiza antes de la pasteurizacion. La pasteurizacion puede asf inactivar la enzima.

[0054] En otra forma de realizacion preferida, el sustrato de leche se somete a tratamiento termico, tal como pasteurizacion, antes del tratamiento con transglutaminasa.

El tratamiento termico se puede realizar de modo que mas del 50%, preferiblemente mas del 60%, mas del 70% o mas del 80%, de la protefna de suero de leche en el sustrato de leche se desnaturaliza.

En el contexto de la presente invencion, la protefna de suero de leche se desnaturaliza cuando sedimenta a pH 4.5.

En una forma de realizacion mas preferida, el sustrato de leche se somete a tratamiento termico seguido de homogenizacion antes del tratamiento con transglutaminasa.

[0055] En otra forma de realizacion preferida, se anade extracto de levadura o un agente reductor tal como glutation al sustrato de leche antes del tratamiento con transglutaminasa.

[0056] Otro tratamiento termico, tal como una pasteurizacion, se puede realizar despues del tratamiento enzimatico para inactivar la enzima.

[0057] La enzima con actividad de transglutaminasa se anade en una cantidad adecuada para conseguir el grado

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deseado de modificacion de las protefnas bajo las condiciones de reaccion elegidas. La enzima se puede anadir a una concentracion de entre 0,0001 y 1 g/L de sustrato de leche, preferiblemente entre 0,001 y 0,1 g/L de sustrato de leche.

[0058] El tratamiento enzimatico en los metodos de la invencion se puede llevar a cabo anadiendo la enzima al sustrato de leche y permitiendo que la reaccion enzimatica se produzca en un tiempo de retencion apropiado a una temperatura apropiada. El tratamiento enzimatico se puede realizar bajo condiciones elegidas para adaptarlo a la enzima modificadora de protefnas seleccionada segun principios ampliamente conocidos en la tecnica. El tratamiento tambien se puede llevar a cabo poniendo en contacto el sustrato de leche con una enzima que ha sido inmovilizada.

[0059] El tratamiento enzimatico se puede llevar a cabo a cualquier pH adecuado, tal como, por ejemplo, en el rango de pH 2-10, por ejemplo a un pH de 4-9 o 5-7.

Puede ser preferible dejar que la enzima actue al pH natural del sustrato de leche, o, si la acidificacion se obtiene debido a la fermentacion, la enzima puede actuar al pH natural del sustrato de leche durante el proceso de la fermentacion, es decir el pH disminuira gradualmente desde el pH natural del sustrato de leche no fermentada hasta el pH del sustrato de leche fermentada.

[0060] El tratamiento enzimatico se puede llevar a cabo a cualquier temperatura apropiada, por ejemplo en el rango de 1-80°C, por ejemplo 2-70°C.

En una forma de realizacion de la presente invencion, el tratamiento enzimatico puede ser llevado a cabo preferiblemente a una temperatura en el rango de 40-50°C.

En otra forma de realizacion, el tratamiento enzimatico puede ser llevado a cabo preferiblemente a una temperatura de por debajo de 10°C.

[0061] Opcionalmente, despues de que se haya dejado a la enzima actuar en el sustrato de leche, la protefna enzimatica se puede eliminar, reducir y/o inactivar mediante cualquier metodo conocido en el estado de la tecnica, tal como por tratamiento termico y/o reduccion de pH.

[0062] Opcionalmente, se pueden anadir otros ingredientes a la bebida lactea acidificada, tales como color; estabilizantes, por ejemplo pectina, almidon, almidon modificado, CMC, etc.; o acidos grasos poliinsaturados, por ejemplo acidos grasos omega-3. Tales ingredientes se pueden anadir en cualquier momento durante el proceso de produccion, es decir, antes o despues de la fermentacion, antes o despues del tratamiento enzimatico, y antes o despues de la adicion opcional de jarabe. En una forma de realizacion preferida, el tratamiento con transglutaminasa se combina con la adicion de CMC.

[0063] En un aspecto de la presente invencion, el nivel de oxfgeno disuelto del sustrato de leche se reduce a menos del 80% del nivel de saturacion. Preferiblemente, el nivel de oxfgeno disuelto se reduce a menos del 70%, mas preferiblemente a menos del 60% e incluso mas preferiblemente a menos del 50% del nivel de saturacion.

[0064] La concentracion de oxfgeno disuelto en el sustrato de leche es la cantidad de oxfgeno hallada en la solucion.

Se puede medir en miligramos por litro de sustrato (mg/1) o una unidad equivalente, partes por millon de oxfgeno a agua (ppm). Depende de varios factores, tales como la temperatura, la presion y las cantidades de varios solidos disueltos o suspendidos en el sustrato de leche. Se puede medir con una sonda de oxfgeno disuelto tal como un sensor de oxfgeno.

[0065] El nivel de oxfgeno disuelto es una medida relativa de la cantidad de oxfgeno que esta disuelto en el sustrato o llevado por este. Se calcula como el porcentaje de concentracion de oxfgeno disuelto en el sustrato de leche con respecto al de cuando el sustrato de leche esta saturado completamente a la misma temperatura y a la misma presion.

[0066] El porcentaje de saturacion se calcula mediante la division de la concentracion de oxfgeno disuelto medido entre el nivel de saturacion bajo las mismas condiciones y multiplicandolo por 100.

[0067] El nivel de oxfgeno disuelto del sustrato de leche se puede reducir mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Se puede reducir por inyeccion de nitrogeno o por inyeccion de dioxido de carbono o utilizando una enzima secuestrante de oxfgeno, preferiblemente una oxidorreductasa, tal como una carbohidrato oxidasa, una celobiosa oxidasa, una glucosa oxidasa, una hexosa oxidasa o una lactosa oxidasa. Una enzima con actividad de catalasa se puede anadir con la oxidorreductasa.

[0068] El nivel de oxfgeno disuelto del sustrato de leche se puede reducir antes o al mismo tiempo que el tratamiento con la transglutaminasa. Se puede reducir antes o a la vez que la fermentacion. Y si el sustrato de leche se pasteuriza, el nivel de oxfgeno disuelto se puede reducir antes o despues de la pasteurizacion.

Enzima con actividad de transglutaminasa

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[0069] En los metodos de la presente invencion, una enzima con actividad de transglutaminasa se usa en la produccion de bebidas lacteas acidificadas, disminuyendo asf la sineresis durante el almacenamiento.

[0070] En el contexto de la presente invencion, una enzima con actividad de transglutaminasa puede ser una enzima que cataliza la transferencia de acilo entre el grupo gamma-carboxilamida de glutamina unida a un peptido (donador de acilo) y aminas primarias (aceptor de acilo), por ejemplo lisina unida a un peptido.

Las amidas de acidos y los aminoacidos libres tambien reaccionan. Las protefnas y peptidos pueden reticularse de esta manera. La transglutaminasa tambien puede, por ejemplo, si las aminas estan ausentes, catalizar la desaminacion de residuos de glutamina en protefnas con H2O como el aceptor de acilo.

[0071] A una transglutaminasa segun la invencion tambien se puede hacer referencia como, por ejemplo, protefna glutamina-gamma-glutamil transferasa, Factor Xllla, fibrinoligasa, factor estabilizante de fibrina, glutaminil-peptido gamma-glutamiltransferasa, transglutaminasa de poliamina, transglutaminasa tisular, o R- glutaminil-peptido:amina gamma glutamil transferasa. El grupo de las transglutaminasas comprende pero no se limita a las enzimas asignadas a la subclase EC 2.3.2.13. En el contexto de la presente invencion, tambien se puede hacer referencia a la transglutaminasa como TGasa.

[0072] Una transglutaminasa para ser usada segun la invencion preferiblemente es purificada. El termino "purificado" como se utiliza en este caso cubre preparaciones de protefna enzimatica donde la preparacion se ha enriquecido para la protefna enzimatica en cuestion. Dicho enriquecimiento podrfa ser, por ejemplo: la eliminacion de las celulas del organismo de las que se ha producido una protefna enzimatica, la eliminacion de material no protefnico por la precipitacion de una protefna especffica o el uso de un procedimiento cromatografico donde la protefna enzimatica en cuestion es selectivamente adsorbida y elufda a partir de una matriz cromatografica.

La transglutaminasa se puede purificar hasta un punto en el que solo estan presentes cantidades mfnimas de otras protefnas. La expresion "otras protefnas" refiere en particular a otras enzimas.

Una transglutaminasa para ser usada en el metodo de la invencion puede ser "sustancialmente pura", es decir, sustancialmente libre de otros componentes del organismo donde se ha producido, que pueden ser o bien un microorganismo de origen natural o bien un microorganismo huesped modificado geneticamente para la produccion recombinante de la transglutaminasa.

[0073] Sin embargo, para los usos segun la invencion, la transglutaminasa no necesita ser tan pura. Puede, por ejemplo, incluir otras enzimas.

[0074] En un aspecto preferido, la transglutaminasa para usar en el metodo de la invencion ha sido purificada para contener al menos 20%, preferiblemente al menos 30%, al menos 40% o al menos 50%, (p/p) de transglutaminasa respecto a la protefna total. La cantidad de transglutaminasa se puede calcular a partir de una medicion de actividad de la preparacion dividida entre la actividad especffica de la transglutaminasa (actividad/mg de PE), o se puede cuantificar por SDS-PAGE o cualquier otro metodo conocido en la tecnica. La cantidad de protefna total puede, por ejemplo, ser medida por medio de analisis de aminoacidos.

[0075] En una forma de realizacion de los metodos de la invencion, la enzima con actividad de transglutaminasa se produce de manera recombinante.

[0076] En algunos aspectos de la presente invencion, la enzima con actividad de transglutaminasa puede ser de origen animal, vegetal o microbiano.

Las enzimas preferidas se obtienen de fuentes microbianas, en particular de un hongo filamentoso o levadura, o a partir de una bacteria. Para los fines de la presente invencion, el termino "se obtiene(n) de" como se utiliza en el presente documento en relacion con una fuente dada significara que la enzima se origina a partir de la fuente. La enzima se puede producir a partir de la fuente o a partir de una cepa en la que la secuencia de nucleotidos que codifica la enzima ha sido insertada, es decir, una cepa recombinante. En una forma de realizacion preferida, el polipeptido obtenido a partir de una fuente dada se secreta extracelularmente.

[0077] La enzima puede, por ejemplo, obtenerse a partir de una cepa de Agaricus, por ejemplo A. Bisporus; Ascovaginospora; Aspergillus, por ejemplo A. Niger, A. Awamori, A. Foetidus, A., japonicus A. Oryzae; Chaetomium; Chaetotomastia; Dictyostelium, por ejemplo D. Discoideum; Mucor, por ejemplo M. Javanicus, M. Mucedo, M. Subtilissimus; Neurospora, por ejemplo N. Crassa; Rhizomucor, por ejemplo R. pusillus; Rhizopus, por ejemplo R. arrhizus, R., japonicus R. stolonifer Sclerotinia, por ejemplo S. libertiana; Trichophyton, por ejemplo T. rubrum; Whetzelinia, por ejemplo W. sclerotiorum; Bacillus, por ejemplo B. megaterium, B. subtilis, B. pumilus, B. stearothermophilus, B. thuringiensis; Chryseobacterium; Citrobacter, por ejemplo C. freundii; Enterobacter, por ejemplo E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, por ejemplo E. herbicola; Escherichia, por ejemplo E. Coli; Klebsiella, por ejemplo K. pneumoniae; Miriococcum; Myrothesium; Mucor; Neurospora, por ejemplo N. crassa; Phytophthora, por ejemplo P. Cactorum; Proteus, por ejemplo P. vulgaris; Providencia, por ejemplo P. stuartii; Pycnoporus, por ejemplo Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus; Salmonella, por ejemplo S. typhimurium; Serratia, por ejemplo S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, por

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ejemplo S. flexneri; Streptomyces, por ejemplo S. antibioticus, S. castaneoglobisporus, S. lydicus, S. mobaraensis, S. violeceoruber Streptoverticilium, por ejemplo S. mobaraensis; Trametes; Trichoderma, por ejemplo T. reesei, T. viride; Yersinia, por ejemplo Y. enterocolitica.

[0078] En una forma de realizacion preferida, la enzima es una transglutaminasa obtenida a partir de una bacteria, por ejemplo un Actinobacterium de la clase Actinobacteria, como por ejemplo de la subclase Actinobacteridae, como por ejemplo del orden Actinomycetales de orden, como por ejemplo del suborden Streptomycineae, como por ejemplo de la familia Streptomycetaceae, como por ejemplo de una cepa de Streptomyces, como por ejemplo S. lydicus o S. mobaraensis.

[0079] En otra forma de realizacion, la enzima es una transglutaminasa obtenida a partir de un hongo, por ejemplo de la clase Oomycetes, como por ejemplo del orden Peronosporales, como por ejemplo de la familia Pythiaceae, como por ejemplo del genero Pythium o Phytophthora, como por ejemplo de una cepa de Phytophthora cactorum.

Una enzima preferida en esta forma de realizacion es una transglutaminasa con una secuencia que es al menos 50%, por ejemplo al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o al menos 90% identica a la SEQ ID NO: 3 o a un fragmento activo de transglutaminasa de la misma.

[0080] Para todos los aspectos de la presente invencion, una enzima preferida es una transglutaminasa con una secuencia que es al menos 50%, por ejemplo al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o al menos 90% identica a la SEQ ID NO: 1 o a un fragmento activo de transglutaminasa de la misma.

Otra enzima preferida es una transglutaminasa con una secuencia que es al menos 50%, por ejemplo al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o al menos 90% identica a la SEQ ID NO: 2 o a un fragmento activo de transglutaminasa de la misma.

[0081] Segun la presente invencion, la actividad de transglutaminasa se puede determinar mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, tal como por incubacion de la enzima con un grupo gamma-carboxamida de glutamina unida a una protefna o unida a un peptido y un grupo amina, por ejemplo protefna o lisina unida a un peptido, en un tampon a varios pH y temperaturas, por ejemplo 50 mM de MES a pH 6.5 a 37°C durante 30 minutos.

La deteccion de actividad enzimatica puede ir seguida de la liberacion de amonfaco (por ejemplo, kit obtenido de Roche NH3-11877984) o de la utilizacion de hidroxilamina como donador de grupo amina (la cantidad de acido glutamico gamma-hidroxamato formada en la reaccion se detecta como un complejo rojo con iones ferricos bajo condiciones acidas medidas a 510 nm) o por determinacion de la epsilon-(gamma-glutamil)lisina por analisis de aminoacidos.

EJEMPLO 1

Preparacion de muestras de bebida lactea acidificada y medicion de la sineresis Solucion de SKMP (solucion de leche desnatada en polvo)

[0082] 600 ml de agua + 135 g de leche desnatada en polvo (dispersabilidad instantanea de Kerry, Irlanda) se incubaron a 50°C durante 10 min antes del uso, y de este modo se obtuvo una solucion homogenea.

Solucion de azucar

[0083]

33 g de sacarosa 105 g de glucosa

[0084] Estos azucares se anadieron a 460 ml 20 mM de tampon de acido lactico, pH 4.0 y se incubaron a 90°C durante 5 min con agitacion y luego se enfriaron hasta 5°C.

Solucion de azucar con pectina

[0085]

33 g de sacarosa

2,25 g de pectina (Geno pectin YM-115-I de CP Kelco)

105 g de glucosa

[0086] Estos azucares se anadieron a 460 ml 20 mM de tampon de acido lactico, pH 4.0 y se incubaron a 90°C durante 5 min con agitacion y luego se enfriaron hasta 5°C.

Enzima

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[0087] Activa TG (transglutaminasa de Streptomyces mobaraensis de Ajinomoto, Japon), 1620 TGHU/g, se diluyo para proporcionar las concentraciones finales indicadas en las tablas. (TGHU = unidades TransGlutaminasa Hidroxamato).

Procedimiento

[0088] 25 ml de solucion de SKMP se transfirieron a un tubo graduado de 100 ml. 2 ml de enzima o agua (control) se anadieron y se llevo a cabo una incubacion durante 120 min a 50°C.

[0089] La solucion se incubo a 85°C durante 30 min al bano maria y despues se incubo a 43°C (bano maria) durante 10 min con agitacion magnetica. 3 ml 4 U/I de YF-3331 (cultivo de cepas mixto que contiene Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subesp. Bulgaricus de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) se anadieron y se llevo a cabo una incubacion durante 16 horas a 43°C.

[0090] Despues, las muestras se incubaron en un bano de hielo/agua a 0-5°C durante 20 min. 60 ml de solucion de azucar con o sin pectina (0-5°C, bano de hielo) se anadieron y homogeneizaron con ultrasonido (7 x 5 seg con pausa de 9 seg) en bano de hielo.

[0091] Las muestras se pusieron a 5°C durante 4 dfas y se midio la sineresis.

[0092] Se midio la altura de la sineresis y se calculo la sineresis relativa de la altura total de la bebida lactea.

Mediciones de la sineresis

: Sineresis (% de altura total)

: %

1800 TGHU/I: 1,4

1800 TGHU/I: 1,8

450 TGHU/I: 0,8

450 TGHU/I: 1,6

180 TGHU/I: 4,9

180 TGHU/I: 4,5

sin TGasa: 5,9

sin TGasa: 6,2

sin TGasa + pectina: 0,0

sin TGasa + pectina: 0,0

EJEMPLO 2

Medicion de la viscosidad de preparaciones de bebida lactea acidificada

[0093] La viscosidad de la preparacion de bebida lactea acidificada del Ejemplo 1 se midio, en seg, como el tiempo de descarga de una pipeta de 10 ml.

Mediciones de viscosidad:

: promedio de tres mediciones desv. est.

: seg seg

1800 TGHU/I: 9,16 0,04

1800 TGHU/I: 9,04 0,04

450 TGHU/I: 8,82 0,40

450 TGHU/I: 8,86 0,21

180 TGHU/I: 8,52 0,02

180 TGHU/I: 8,61 0,38

sin TGasa: 8,34 0,21

sin TGasa + pectina: 9,46 0,10

sin TGasa + pectina: 9,30 0,12

EJEMPLO 3

El efecto de la eliminacion de oxfgeno durante el tratamiento con transglutaminasa Solucion SKMP

[0094] 600 ml de agua + 135 g de leche desnatada en polvo (dispersabilidad instantanea de Kerry, Irlanda) se

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incubaron a 50°C durante 10 min antes del uso, y de este modo se obtuvo una solucion homogenea. Solucion de azucar

[0095]

33 g de sacarosa 105 g de glucosa

[0096] Estos azucares se anadieron a 460 ml 20 mM de tampon de acido lactico, pH 4.0 y se incubaron a 90°C durante 5 min con agitacion y luego se enfriaron hasta 5°C.

Enzima

[0097] Activa TG (transglutaminasa de Streptomyces mobaraensis de Ajinomoto, Japon), 1620 TGHU/g, se diluyo para proporcionar las concentraciones finales indicadas en la Tabla.

Procedimiento

[0098] 375 microlitros de solucion SKMP se transfirieron a un tubo Eppendorf de 2 ml. 30 microlitros de enzima o de agua (control) se anadieron e inyectaron con N2 durante 30 seg (control sin inyeccion de N2), y despues se llevo a cabo una incubacion durante 120 min a 40°C.

[0099] La solucion se incubo a 85°C durante 30 min al bano maria y despues se incubo a 43°C (bano maria) durante 10 min con mezcla (1000 r.p.m.) en un termomezclador Eppendorf. 45 Microlitros 4 U/I de YF-3331 (cultivo de cepas mixto que contiene Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subesp. Bulgaricus de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) solubilizado en 9% de SKMP se anadieron y se llevo a cabo una incubacion durante 16 horas a 43°C.

[0100] Despues, las muestras se incubaron a 0-5°C en bano de hielo/agua durante 20 min.

[0101] 900 microlitros de solucion de azucar (0-5°C, bano de hielo) se anadieron y homogeneizaron con ultrasonido (6 x 5 seg con 9 seg de pausa) en bano de hielo.

[0102] Las muestras se pusieron a 5°C durante 7 dfas y se midio la sineresis.

[0103] Se midio la altura de la sineresis y se calculo la sineresis relativa de la altura total de la bebida lactea.

[0104] Las determinaciones dobles se muestran en la tabla siguiente.

Mediciones de la sineresis

: % de sineresis relativa en comparacion con altura total % de sineresis relativa en comparacion con altura total

880 TGHU/I: 10 11

150 TGHU/I: 21 22

control: 22 21

880 TGHU/I + N2: 5,0 5,0

150 TGHU/I + N2: 15 17

control + N2: 17 19

EJEMPLO 4

El efecto del tratamiento con transglutaminasa antes de la pasteurizacion usando varias concentraciones de SKMP

Solucion de SKMP

[0105] 231 ml de agua + 69 g de leche desnatada en polvo (dispersabilidad instantanea de Kerry, Irlanda) se incubaron a 50°C durante 10 min antes del uso, y de este modo se obtuvo una solucion homogenea.

Solucion de azucar

[0106]

5,66 g de sacarosa 18,0 g de glucosa

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[0107] Estos azucares se anadieron a 46 ml 20 mM de tampon de acido lactico, pH 4.0 y se incubaron a 90°C durante 5 min con agitacion y luego se enfriaron hasta 5°C.

Enzima

[0108] Activa TG (transglutaminasa de Streptomyces mobaraensis de Ajinomoto, Japon), 1620 TGHU/g, se diluyo para proporcionar las concentraciones finales indicadas en la tabla.

Procedimiento

[0109] 293 microlitros de solucion SKMP + 0 microlitros, 82 microlitros, 189 microlitros y 457 microlitros de agua para la muestra 1, 2,3 y 4, respectivamente, fueron transferidos a un tubo Eppendorf de 2 ml . 30 microlitros de enzima o agua (control) se anadieron y se incubaron durante 120 min a 40°C.

[0110] La solucion se incubo a 85°C durante 30 min al bano maria y se incubo a 43°C (bano maria) durante 10 min con la mezcla (1000 r.p.m.) en un termomezclador Eppendorf.

Despues, 457 microlitros, 375 microlitros, 268 microlitros y 0 microlitros de agua se anadieron a la muestra 1, 2, 3, y 4, respectivamente. 45 Microlitros 4 U/I de YF-3331 (cultivo de cepas mixto que contiene Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subesp. Bulgaricus de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) solubilizados en 9% de SKMP se anadieron e incubaron durante 16 horas a 43°C.

[0111] Despues, las muestras se incubaron a 0-5°C bano de hielo/agua durante 20 min.

[0112] 525 microlitros de solucion de azucar (0-5°C, bano de hielo) se anadieron y se homogeneizaron con ultrasonido (6 x 5 seg con 9 seg de pausa) en bano de hielo.

[0113] Las muestras se pusieron a 5°C durante 4 dfas y se midio la sineresis.

[0114] Se midio la altura de la sineresis y se calculo la sineresis relativa de la altura total de la bebida lactea.

[0115] Las determinaciones dobles se muestran en la tabla siguiente. La concentracion enzimatica se muestra por litro de bebida lactea acidificada.

Mediciones de la sineresis

Conc. de TGasa.: Conc. de SKMP antes de la pasteurizacion Sineresis relativa de la altura total (%) Sineresis relativa de la altura total (%)

TGHU/I: % % %

900: 16,6 8 9

0: 16,6 48 48

900: 13,2 8 10

0: 13,2 50 50

900: 8,6 10 10

0: 8,6 50 54

900: 20,9 9 8

0: 20,9 52 51

EJEMPLO 5

Combinacion de tratamiento con TGasa y grasa lactea o CMC con tratamiento termico final Leche

[0116] Se uso leche de Arla express obtenida de un supermercado (Bagsvaerd; Dinamarca): leche desnatada: 3,5% de protefnas, 4,7% de carbohidratos y 0,1% de grasa;

leche semidesnatada: 3,4% de protefnas, 4,7% de carbohidratos y 1,5% de grasa; y leche entera: 3,4% de protefnas, 4,7% de carbohidratos y 3,5% de grasa.

[0117] La leche se incubo a 95°C durante 5 min antes de usarla.

Soluciones de azucar

[0118]

18% de sacarosa, 20 mM de acido lactico, pH 4.0.

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0,75% de CMC, 18% de sacarosa, 20 mM de acido lactico, pH 4.0.

0,375% de CMC, 18% de sacarosa, 20 mM de acido lactico, pH 4.0.

0,15% de CMC, 18% de sacarosa, 20 mM de acido lactico, pH 4.0.

Enzima

[0119] 25 mg/ml de TGasa de S. Mobaraensis (SM) purificada modificada geneticamente se diluyeron para proporcionar las concentraciones finales indicadas en la tabla que figura a continuacion.

Procedimiento

[0120] 375 microlitros de leche se transfirieron a un tubo Eppendorf de 2 ml. 30 microlitros de enzima o de agua (control) se anadieron, y despues se llevo a cabo una incubacion durante 120 min a 40°C.

[0121] La solucion se incubo a 85°C durante 30 min al bano maria y se incubo despues a 43°C (bano maria) durante 10 min con la mezcla (1000 r.p.m.) en un termomezclador Eppendorf.

[0122] 45 microlitros 4 U/I de YF-3331 (cultivo de cepas mixto que contiene Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subesp. Bulgaricus de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) solubilizados en leche desnatada se anadieron y se incubaron durante 16 horas a 43°C.

[0123] Despues las muestras se incubaron a 0-5°C en bano de hielo/agua durante 20 min.

[0124] 900 microlitros de solucion de azucar (0-5°C, bano de hielo) se anadieron y homogeneizaron con ultrasonido (6 x 5 seg, 50% de amplitud, con 9 seg de pausa) en bano de hielo. Esta solucion se incubo a 80°C durante 5 min y se enfrio a 25°C con la mezcla (1000 r.p.m.) en un termomezclador Eppendorf. Una homogeneizacion adicional se realizo con ultrasonido (6 x 5 seg, 50% de amplitud, con 9 seg de pausa) en bano de hielo.

Las muestras se pusieron a temperatura ambiente de 20- 24°C durante 10 dfas y se midio la sineresis.

[0125] Se midio la altura de la sineresis y se calculo la sineresis relativa de la altura total de la bebida lactea.

[0126] Las determinaciones dobles se muestran en la tabla siguiente. DM es la desviacion media. La concentracion enzimatica se muestra por litro de bebida lactea acidificada.

: Altura de la sineresis % DM

SM 20 mg/l, 1% de grasa: 0 0

SM 4 mg/l, 1% de grasa: 0 0

1% de grasa: 67,7 7,0

SM 20 mg/l, 0,4% de grasa: 20,8 4,4

SM 4 mg/l, 0,4% de grasa: 26,2 2,5

0,4% de grasa: 73,3 0,39

SM 20 mg/l, 0,03% de grasa, 0,5% de CMC: 0 0

SM 20 mg/l, 0,03% de grasa, 0,25% de CMC: 10,5 0,26

SM 20 mg/l, 0,03% de grasa, 0,1% de CMC: 63,8 2,8

0,03% de grasa, 0,5% de CMC: 63 28

0,03% de grasa, 0,25% de CMC: 90,8 0,54

0,03% de grasa, 0,1% de CMC: 57,4 1,1

EJEMPLO 6

Combinacion de tratamiento con TGasa y grasa lactea o CMC sin tratamiento termico final Leche

[0127] Se uso leche de Arla express obtenida de un supermercado (Bagsvaerd; Dinamarca):

leche desnatada: 3,5% de protefnas, 4,7% de carbohidratos y 0,1% de grasa; leche semidesnatada: 3,4% de protefnas, 4,7% de carbohidratos y 1,5% de grasa; y leche entera: 3,4% de protefnas, 4,7% de carbohidratos y 3,5% de grasa.

[0128] La leche se incubo a 95°C durante 5 min antes de usarse.

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Soluciones de azucar

[0129]

18% de sacarosa, 20 mM de acido lactico, pH 4.0.

0,75% de CMC, 18% de sacarosa, 20 mM de acido lactico, pH 4.0. 0,375% de CMC, 18% de sacarosa, 20 mM de acido lactico, pH 4.0. 0,15% deCMC, 18% de sacarosa, 20 mM de acido lactico, pH 4.0.

Enzima

[0130] 25 mg/ml de TGasa de S. Mobaraensis (SM) purificada modificada geneticamente se diluyeron para proporcionar las concentraciones finales indicadas en la tabla que figura a continuacion.

Procedimiento

[0131] 375 microlitros de leche se transfirieron a un tubo Eppendorf de 2 ml. 30 microlitros de enzima o de agua (control) se anadieron, y despues se llevo a cabo una incubacion durante 120 min a 40°C.

[0132] La solucion se incubo a 85°C durante 30 min al bano maria y despues se incubo a 43°C (bano maria) durante 10 min con mezcla (1000 r.p.m.) en un termomezclador Eppendorf. 45 Microlitros 4 U/I de YF-3331 (cultivo de cepas mixto que contiene Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subesp. Bulgaricus de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) solubilizada en leche desnatada se anadieron e incubaron durante 16 horas a 43°C.

[0133] Despues las muestras se incubaron a 0-5°C en bano de hielo/agua durante 20 min.

[0134] 900 microlitros de solucion de azucar (0-5°C, bano de hielo) se anadieron y homogeneizaron con ultrasonido (6 x 5 seg, 50% de amplitud, con 9 seg de pausa) en bano de hielo. Las muestras se pusieron a 5°C durante 14 dfas y se midio la sineresis.

[0135] Se midio la altura de la sineresis y se calculo la sineresis relativa de la altura total de la bebida lactea.

[0136] Las determinaciones dobles se muestran en la tabla siguiente. DM es la desviacion media. La concentracion enzimatica se muestra por litro de bebida lactea acidificada.

: % de altura de la sineresis DM

SM 20 mg/l, 1% de grasa: 0 0

SM 4 mg/l, 1% de grasa: 1,5 1,5

1% de grasa: 8,6 3,4

SM 20 mg/l, 0,4% de grasa: 11,0 1,4

SM 4 mg/l, 0,4% de grasa: 12,6 7,2

0,4% de grasa: 45,0 0,8

SM 20 mg/l, 0,03% de grasa, 0,5% de CMC: 0 0

SM 20 mg/l, 0,03% de grasa, 0,25% de CMC: 5,3 2,9

SM 20 mg/l, 0,03% de grasa, 0,1% de CMC: 8,0 2,7

0,03% de grasa, 0,5% CMC: 27,9 0,9

0,03% de grasa, 0,25% de CMC: 89,1 0,5

0,03% de grasa, 0,1% de CMC: 47,2 0,4

EJEMPLO 7

Comparacion de tres TGasas diferentes Leche

[0137] Se uso leche desnatada de Arla express obtenida de un supermercado (Bagsvaerd; Dinamarca). La leche se incubo a 95°C durante 5 min antes de usarse.

Soluciones de azucar

[0138] 18% de sacarosa, 20 mM de acido lactico, pH 4.0. Enzima

[0139] 25 mg/ml de TGasa de Streptomyces Mobaraensis (SM) purificada, 28 mg/ml de TGasa de Streptomyces

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

REIVINDICACIONES

1. Metodo para la produccion de una bebida lactea acidificada, dicho metodo que comprende:

a) proporcionar un sustrato de leche con un contenido de protema superior al 5%;

b) tratar el sustrato de leche con una enzima con actividad de transglutaminasa;

c) fermentar el sustrato de leche con un microorganismo; y

d) diluir el sustrato de leche fermentada al menos 1,5 veces para obtener la bebida lactea acidificada; donde la etapa b) se realiza antes, durante o despues de la etapa c).
2. Metodo segun la reivindicacion 1, donde el nivel de oxfgeno disuelto del sustrato de leche se reduce a por debajo del 80% del nivel de saturacion.
3. Metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sustrato de leche se somete a pasteurizacion antes de la fermentacion y el tratamiento enzimatico se realiza antes de la pasteurizacion.
4. Metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sustrato de leche se somete a tratamiento termico antes del tratamiento con la enzima con actividad de transglutaminasa.
5. Metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde se anade glutation al sustrato de leche antes del tratamiento con la enzima con actividad de transglutaminasa.
6. Metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el microorganismo es una bacteria de acido lactico.
7. Metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sustrato de leche fermentada se mezcla con un jarabe y la mezcla se somete a homogeneizacion.
8. Metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la bebida lactea acidificada se consume como una bebida.
9. Metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la bebida lactea acidificada tiene un contenido sin grasa de solido de leche inferior al 8%.
10. Metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la bebida lactea acidificada tiene un contenido de grasa inferior al 2%.
11. Metodo segun la reivindicacion 10, donde la bebida lactea acidificada tiene un contenido de grasa inferior al 0,5%.
12. Metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la enzima con actividad de transglutaminasa se produce de manera recombinante.
13. Metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la enzima con actividad de transglutaminasa se obtiene a partir de una bacteria del genero Streptomyces.
14. Metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la enzima tiene al menos 50% de identidad para SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o para un fragmento activo de transglutaminasa de cualquiera de estas.