ES2620243T3

ES2620243T3 - Procedimiento de preparación de cristales de un derivado de cicloalqueno sustituido

Info

Publication number: ES2620243T3
Application number: ES11826892.9T
Authority: ES
Inventors: Nobuyuki Ohkawa; Kouki Iida; Takayoshi Nagasaki
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2010-09-24
Filing date: 2011-09-22
Publication date: 2017-06-28
Anticipated expiration: 2031-09-22
Also published as: JPWO2012039447A1; EP2620434A1; US8933117B2; TW201219034A; WO2012039447A1; EP2620434B1; EP2620434A4; US20130178521A1; JP5778161B2; US20140073689A9

Abstract

Un procedimiento de producción de un cristal de (2-cloro-4-fluorofenil){[(2R,3R,8R)-7-(etoxicarbonil)-2,3- bis(hidroximetil)-1,4-dioxaspiro[4.5]deca-6-en-8-il]sulfonil}azanida de potasio representado por la siguiente fórmula (1):**Fórmula** el cual muestra picos característicos en los ángulos de difracción 2θ (º) de 3,82, 7,64, 11,48, 19,06, 23,08, 25,22 y 26,98 (+- 2, respectivamente), en difracción de rayos X en polvo obtenida por irradiación con radiación Kα de cobre, caracterizado por la adición de una solución de 2-etilhexanoato de potasio hidrato en acetato de etilo gota a gota a una solución o suspensión de (2R,3R,8R)-8-[N-(2-cloro-4-fluorofenil)sulfamoil]-2,3-bis(hidroximetil)-1,4- dioxaspiro[4.5]deca-6-eno-7-carboxilato de etilo, disolviendo en acetato de etilo, calentando a reflujo y luego enfriando.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de preparacion de cristales de un derivado de cicloalqueno sustituido Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un procedimiento para preparar cristales de derivados de cicloalqueno sustituidos que tienen la actividad de suprimir la transduccion de senales intracelulares o la activacion celular en diversas celulas tales como monocitos, macrofagos y celulas endoteliales vasculares inducidas por endotoxina y de suprimir la produccion de un mediador inflamatorio tal como el TNF-a, causado por la transduccion de senales intracelulares o la activacion celular, y que son utiles como un agente profilactico y/o terapeutico para diversas enfermedades tales como septicemia (choque septico, coagulacion intravascular diseminada, insuficiencia de multiples organos, etc.).

Tecnica anterior

La endotoxina (lipopolisacarido: LPS), que es un componente de la membrana de las bacterias, actua sobre celulas tales como monocitos, macrofagos y celulas endoteliales vasculares, induce la sobreproduccion de diversos mediadores inflamatorios tales como TNF-a y similares, provoca hipotension subita, trastornos de la coagulacion de la sangre, trastornos circulatorios y similares, ademas de las respuestas inflamatorias sistemicas y, por lo tanto, desarrolla septicemia (vease, por ejemplo, el documento no de patente 2). El lipopolisacarido y el lfpido A, que corresponde a una estructura parcial del mismo, activan la transduccion de la senal intracelular via TLR4 (receptor tipo Toll 4), que es un receptor de superficie celular funcional, despues de unirse a CD14 (vease, por ejemplo, el documento no de patente 3), de modo que se inician varias respuestas celulares representadas por la produccion de mediadores inflamatorios. Por lo tanto, se considera que una sustancia capaz de suprimir la transduccion de senales intracelulares o la activacion celular inducida por endotoxina y diversas respuestas celulares, que son inducidas por tal transduccion de senales intracelulares o activacion celular y representadas por la sobreproduccion de mediadores inflamatorios tales como TNF-a, puede ser un agente profilactico y terapeutico eficaz para la septicemia (veanse, por ejemplo, los documentos no de patente 3 y 4 y los documentos de patente 1 y 2).

La transduccion de senales intracelulares o la activacion celular inducida por endotoxina y diversas respuestas celulares tales como la sobreproduccion de mediadores inflamatorios incluyendo TNF-a, etc., inducidas por la transduccion de senales intracelulares o la activacion celular, llevan al desarrollo y progreso de diversas enfermedades tales como trastorno cerebral isquemico, arteriosclerosis, mal pronostico despues de angioplastia coronaria, insuficiencia cardfaca, diabetes, complicaciones de la diabetes, artritis, osteoporosis, osteopenia, enfermedades autoinmunitarias, trastornos de los tejidos y rechazo despues del trasplante de organos, infeccion bacteriana, infeccion vmca, gastritis, pancreatitis, nefritis, neumoma, hepatitis y leucemia, ademas de la septicemia descrita anteriormente (por ejemplo, el documento no de patente 5 y el documento de patente 3).

Los presentes inventores realizaron estudios intensivos para resolver los problemas anteriores y, como resultado, encontraron que hay un grupo de compuestos que tienen un efecto deseado entre derivados de cicloalqueno sustituidos (documento de patente 4). Sin embargo, los derivados de cicloalqueno sustituidos (en la forma libre) son amorfos y tienen higroscopicidad. En vista de esto, los presentes inventores estudiaron sus sales farmacologicamente aceptables. Sin embargo, no fue facil encontrar cristales que tuvieran estabilidad en almacenamiento y durante la manipulacion y, por lo tanto, su industrializacion resultaba extremadamente diffcil.

Documentos de la tecnica anterior

Documentos de patente

Documento de patente 1: JP-A-2000-178246 Documento de patente 2: JP-A-2004-2370 Documento de patente 3: WO 2000/41698 Documento de patente 4: WO 2007/032362

Documentos no de patentes

Documento no de patente 1 Documento no de patente 2 Documento no de patente 3 Documento no de patente 4 Documento no de patente 5

Iqbal y col., Expert Opin. Emerging Drugs, Vol. 7, pagina 111,2002

Hawkins y col., Current Topics in Medicinal Chemistry, Vol. 4, pagina 1147, 2004

Beutler, Nature, Vol. 430, paginas 257-263, 2004

Kakutani y col., Inflammation Research, Vol. 48, pagina 461, 1999

Donald N. Cook y col., Nature Immunology, Vol. 5, paginas 975-979, 2004

Sumario de la invencion

Problemas a resolver mediante la invencion

Un objeto de la presente invencion es proporcionar cristales de derivados de cicloalqueno sustituidos que tengan una excelente estabilidad en almacenamiento y manipulacion.

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Medios para resolver los problemas

Es decir, la presente invencion se refiere a:

un procedimiento para producir un cristal de (2-cloro-4-fluorofenil){[(2R,3R,8R)-7-(etoxicarbonil)-2,3- bis(hidroximetil)-1,4-dioxaspiro[4.5]deca-6-en-8-il]sulfonil}azanida de potasio representado por la siguiente formula (1) :

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que muestra picos caractensticos en los angulos de difraccion 20 (°) de 3,82, 7,64, 11,48, 19,06, 23,08, 25,22 y 26,98 (+ 2, respectivamente) en difraccion de rayos X en polvo obtenida por irradiacion con radiacion Ka de cobre, caracterizado por la adicion de una solucion de 2-etilhexanoato de potasio hidrato en acetato de etilo gota a gota a una solucion o suspension de (2R,3R,8R)-8-[N-(2-cloro-4-fluorofenil)sulfamoil]-2,3-bis(hidroximetil)-1,4- dioxaspiro[4.5]deca-6-eno-7-carboxilato de etilo, disolviendo en acetato de etilo, calentando a reflujo y enfriando.

Ventajas de la invencion

De acuerdo con la presente invencion se pueden proporcionar cristales de derivados de cicloalqueno sustituidos con una excelente estabilidad en almacenamiento y manipulacion. Las sales de potasio (cristales) de derivados de cicloalqueno sustituidos suprimen la produccion de un mediador inflamatorio causada por la transduccion de senales intracelulares o la activacion celular inducida por endotoxina y son eficaces como agentes profilacticos y/o terapeuticos para la septicemia.

Breve descripcion de los dibujos

[Fig. 1] La Fig. 1 muestra un patron de difraccion de rayos X en polvo de un cristal obtenido en el ejemplo 1. En el dibujo, la ordenada indica la intensidad de difraccion en unidades de recuentos/s (cps) y la abscisa indica el valor del angulo de difraccion 20.

[Fig. 3] La Fig. 3 muestra las curvas de equilibrio de absorcion y desorcion de humedad de un compuesto (en forma libre) del Ejemplo Comparativo en un ensayo de absorcion de humedad. En el dibujo, la ordenada indica el peso de una muestra y la abscisa indica la medida de la humedad. El "Ciclo 1 de Sorb" representa "una curva de equilibrio de absorcion de humedad (en el primer ciclo)" y se traza un cambio en el peso frente a la humedad relativa en el momento de obtener un peso constante cuando la humedad se ha incrementado. El "Ciclo 1 de Desorb" representa una curva de equilibrio de desorcion de humedad (en el primer ciclo)" y se traza el cambio en el peso frente a la humedad relativa en el momento de obtener un peso constante cuando se ha disminuido la humedad.

[Fig. 4] La Fig. 4 muestra las curvas de equilibrio de absorcion y desorcion de humedad de un compuesto del Ejemplo 1 en un ensayo de absorcion de humedad. En el dibujo, la ordenada indica el cambio de peso de una muestra y la abscisa indica el ajuste de medicion de la humedad. El "Ciclo 1 de Sorb" representa "una curva de equilibrio de absorcion de humedad (en el primer ciclo)" y se traza un cambio en el peso frente a la humedad relativa en el momento de obtener un peso constante cuando la humedad se ha incrementado. El "Ciclo 1 de Desorb" representa "una curva de equilibrio de desorcion de humedad (en el primer ciclo)" y se traza el cambio en el peso frente a la humedad relativa en el momento de obtener un peso constante cuando se ha disminuido la humedad.

Modo de realizacion de la invencion

La presente invencion se refiere a un procedimiento para producir un cristal de (2-cloro-4-fluorofenil){[(2R,3R,8R)-7- (etoxicarbonil)-2,3-bis(hidroximetil)-1,4-dioxaspiro[4.5]deca-6-en-8-il]sulfonil}azanida de potasio representado por la siguiente formula (1) (en lo sucesivo denominado a veces Compuesto (1) en la presente descripcion):

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Aqm, un cristal se refiere a un solido cuya estructura interna esta compuesta tridimensionalmente por una repeticion regular de atomos constituyentes (o de un grupo de ellos), y se distingue de un solido amorfo que no tiene una estructura interna regular de este tipo. Se puede examinar si un solido es o no un cristal mediante un procedimiento cristalografico conocido (tal como la medicion de difraccion de rayos X en polvo o el analisis calorimetrico de exploracion diferencial). Por ejemplo, un solido se somete a medicion de difraccion de rayos X en polvo usando rayos X obtenidos por irradiacion con radiacion Ka de cobre. Se determina que el solido es un cristal cuando se observan picos distintos en el patron de difraccion de rayos X, mientras que se determina que el solido es amorfo cuando no se observan picos distintos. Se determina que el solido es un cristal cuya cristalinidad es baja cuando los picos se pueden leer pero no son distintos (por ejemplo, anchos), y tal cristal cuya cristalinidad es baja esta tambien englobado dentro del cristal producido por la presente invencion.

El cristal producido por la presente invencion puede formar a veces un hidrato al permitir que el cristal permanezca en el aire para absorber agua, lo cual indica que se ha agregado agua, o calentando el cristal a de 25 a 150 °C en las condiciones atmosfericas habituales, etc. Ademas, el cristal de la presente invencion puede contener a veces un disolvente usado en el momento de la cristalizacion como un disolvente residual unido o un solvato.

En esta descripcion, el cristal producido por la presente invencion se representa sobre la base de datos de difraccion de rayos X en polvo. En la difraccion de rayos X en polvo, la medicion y el analisis se pueden realizar con procedimientos convencionalmente usados en este campo, y por ejemplo, la difraccion de rayos X en polvo se puede realizar usando el procedimiento descrito en los Ejemplos. Ademas, en general, en el caso de un cristal hidratado o deshidratado, la constante de red del mismo se cambia por la adicion o eliminacion de agua de cristalizacion y, por lo tanto, el angulo de difraccion (20) en la difraccion de rayos X en polvo a veces se puede cambiar. Ademas, la intensidad del pico a veces se puede cambiar debido a una diferencia en una superficie de crecimiento de cristal o similares (habito cristalino), etc. Por lo tanto, un cristal que tiene un angulo de difraccion de pico y un patron de difraccion de rayos X identico en la difraccion de rayos X en polvo, asf como tambien los cristales hidratados y deshidratados obtenidos a partir del cristal, estan abarcados dentro del alcance de la presente invencion.

En la medicion de difraccion en polvo usando una radiacion Ka de cobre, generalmente, una muestra es irradiada con radiacion Ka de cobre (en la que no se separan las radiaciones Ka1 y Ka2). Puede obtenerse un patron de difraccion de rayos X analizando la difraccion derivada de la radiacion Ka y tambien puede obtenerse analizando unicamente la difraccion derivada de la radiacion Ka1 obtenida de la difraccion derivada de la radiacion Ka. En la presente invencion, el patron de difraccion de rayos X en polvo obtenido por irradiacion con radiacion Ka incluye un patron de difraccion de rayos X obtenido analizando picos de difraccion derivados de la radiacion Ka y un patron de difraccion de rayos X obtenido analizando la difraccion derivada de Ka1, y es preferentemente un patron de difraccion de rayos X obtenido analizando la difraccion derivada de la radiacion Ka1.

El cristal producido por la presente invencion es un cristal de (2-cloro-4-fluorofenil){[(2R,3R,8R)-7-(etoxicarbonil)-2,3- bis(hidroximetil)-1,4-dioxaspiro[4.5]deca-6-en-8-il]sulfonil}azanida de potasio denominado Compuesto (1). El cristal del Compuesto (1) tiene el patron de difraccion de rayos X mostrado en la Fig. 1 en un patron de difraccion en polvo obtenido por irradiacion con radiacion Ka de cobre. Ademas, el cristal del Compuesto (1) tiene picos caractensticos en los angulos de difraccion 20 (°) de 3,82, 7,64, 11,48, 19,06, 23,08, 25,22 y 26,98. En este caso, el "pico caractenstico" se refiere a un pico que tiene una intensidad relativa de 9 o mas cuando la intensidad maxima de pico en la difraccion de rayos X en polvo es de 100.

En el patron de difraccion de rayos X en polvo mostrado en la Fig. 1, la ordenada indica la intensidad de difraccion [recuentos/s (cps)], y la abscisa indica el angulo de difraccion 20 (°). El angulo 20 puede ser ligeramente cambiado en su posicion e intensidad relativa dependiendo de las condiciones de medicion y similares, por lo tanto, incluso cuando 20 esta ligeramente cambiado, la identificacion de la forma cristalina debe determinarse apropiadamente segun la referencia al patron de todo el espectro. El lfmite de tal error esta generalmente dentro del intervalo de + 2, preferentemente dentro del intervalo de + 1, mas preferentemente dentro del intervalo de + 0,5, incluso mas preferentemente dentro del intervalo de + 0,2.

Ademas, como es bien conocido en el campo de la cristalograffa, las intensidades de los respectivos picos de difraccion tambien pueden cambiarse por diversos factores (incluyendo la orientacion preferida que se da en una forma cristalina espedfica y el efecto de tamano de grano) y, por lo tanto, las intensidades relativas de los picos principales descritos anteriormente para identificar el cristal de la presente invencion tambien pueden cambiarse y estos cristales estan tambien englobados dentro del cristal de la presente invencion.

El Compuesto (1) producido por la presente invencion tiene actividad para suprimir la produccion de un mediador inflamatorio causada por transduccion de senales intracelulares o activacion celular inducida por endotoxina, y posee asimismo una excelente estabilidad en almacenamiento y manipulacion, y por lo tanto es util como producto farmaceutico. Ademas, tal producto farmaceutico se usa preferentemente para animales de sangre caliente, mas preferentemente para seres humanos.

En el caso en que se usa el Compuesto (1) como un agente terapeutico o un agente profilactico para las enfermedades descritas anteriormente, el compuesto per se o como una mezcla con un excipiente, diluyente o

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similares farmacologicamente aceptable apropiado, se puede administrar por v^a oral en forma de un comprimido, una capsula, un granulo, un polvo, un jarabe o similares o por via parenteral en forma de una inyeccion, un supositorio o similares.

Estas preparaciones farmaceuticas se preparan de acuerdo con procedimientos conocidos usando aditivos tales como un excipiente (por ejemplo, se puede usar un excipiente organico tal como un derivado de azucar tal como lactosa, sacarosa, glucosa, manitol o sorbitol; un derivado de almidon, tal como almidon de mafz, almidon de patata, almidon pregelatinizado o dextrina; un derivado de celulosa, tal como celulosa cristalina; goma arabiga; dextrano; o pululano, o un excipiente inorganico, tal como un derivado de silicato tal como anddrido silfcico ligero, silicato de aluminio sintetico, silicato de calcio o aluminometasilicato de magnesio; un fosfato, tal como hidrogeno fosfato calcico; un carbonato, tal como carbonato calcico; o un sulfato, tal como sulfato calcico), un lubricante (por ejemplo, se puede usar acido estearico, una sal metalica de acido estearico tal como estearato de calcio o estearato de magnesio; talco; una cera tal como cera de abejas o espermaceti; acido borico; acido adfpico; un sulfato tal como sulfato sodico; glicol; acido fumarico; benzoato sodico; D- o L-leucina; un laurilsulfato tal como laurilsulfato de sodio o laurilsulfato de magnesio; un acido silfcico tal como anddrido silfcico o silicato hidrato; o cualquiera de los derivados de almidon anteriormente descritos), un aglutinante (por ejemplo, se puede usar hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, macrogol o un compuesto similar a cualquiera de los excipientes descritos anteriormente), un disgregante (por ejemplo, se puede usar un derivado de celulosa tal como hidroxipropilcelulosa de baja sustitucion, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa de calcio o carboximetilcelulosa sodica reticulada internamente; un polfmero soluble en agua qmmicamente modificado como carboximetilalmidon, carboximetilalmidon sodico o polivinilpirrolidona reticulada; o cualquiera de los derivados de almidon descritos anteriormente), un emulsionante (por ejemplo, se puede usar una arcilla coloidal como bentonita o veegum, un hidroxido metalico como hidroxido de magnesio o hidroxido de aluminio; un tensioactivo anionico como laurilsulfato de sodio o estearato calcico; un tensioactivo cationico tal como cloruro de benzalconio; o un tensioactivo no ionico, como un eter alqrnlico de polioxietileno, un ester de acido graso de polioxietilensorbitan o un ester de acido graso de sacarosa), un estabilizante (por ejemplo, se puede usar un ester de acido paraoxibenzoico, como metilparabeno o propilparabeno; un alcohol como clorobutanol, alcohol bendlico o alcohol feniletilico; cloruro de benzalconio; un fenol tal como fenol o cresol; timerosal; acido deshidroacetico; o acido sorbico) y un corrector (por ejemplo, se puede usar un edulcorante, acidificante, aroma o similares, de uso comun) o un diluyente.

Ejemplos

A continuacion, la presente invencion se describira con mas detalle haciendo referencia a los Ejemplos y a los Ejemplos de Ensayo.

(Ejemplo 1)

(2-cloro-4-fluorofenil){[(2R,3R,8R)-7-(etoxicarbonil)-2,3-bis(hidroximetil)-1,4-dioxaspiro[4.5]deca-6-en-8- il]sulfonil}azanida de potasio

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100 mg (0,208 mmoles) de (2R,3R,8R)-8-[N-(2-cloro-4-fluorofenil)sulfamoil]-2,3-bis(hidroximetil)-1,4- dioxaspiro[4.5]deca-6-eno-7-carboxilato de etilo [un compuesto descrito como un compuesto de baja polaridad (primer pico) del Ejemplo 162 en el documento WO 2007/032362] se disolvio en 1 ml de acetato de etilo y 2 ml de una solucion que contema 38 mg (0,208 mmoles) de 2-etilhexanoato de potasio hidrato en acetato de etilo se anadieron a esto con agitacion a temperatura ambiente. La solucion de reaccion resultante se concentro a presion reducida y al residuo se le anadio eter dietflico. Se obtuvo un solido precipitado por filtracion y se lavo con eter dietflico, con lo que se obtuvieron 92 mg de un producto en bruto en forma de un solido amorfo. A continuacion, el producto en bruto se disolvio en acetato de etilo y la solucion resultante se calento a reflujo a 130 °C durante 2 horas. Despues de enfriar la mezcla resultante, se obtuvo un solido precipitado por filtracion y se lavo con acetato de etilo, con lo que se obtuvo el compuesto del tttulo en forma de un cristal blanco.

Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 ppm:

7,40 (1H, dd, J = 9 Hz, 6 Hz), 7,07-6,97 (1H, m), 6,84-6,75 (1H, m), 6,46 (1H, s), 4,98 (1H, t, J = 6 Hz), 4,82 (1H, t, J = 6Hz), 4,11-4,02 (1H, m), 4,02-3,93 (1H, m), 3,93-3,80 (3H, m), 3,63-3,41 (4H, m), 2,78-2,65 (1H, m), 2,342,25 (1H, m), 1,87-1,74 (1H, m), 1,65-1,58 (1H, m), 1,14 (3H, t, J = 7 Hz)

El patron de difraccion de rayos X en polvo se muestra en la Fig. 1.

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Se disolvieron 300 mg (0,625 mmoles) de (2R,3R,8R)-8-[N-(2-cloro-4-fluorofenil)sulfamoil]-2,3-bis(hidroximetil)-1,4- dioxaspiro[4.5]deca-6-eno-7-carboxilato de etilo en 2 ml de acetato de etilo y 4 ml de una solucion que contema 114 mg (0,625 mmoles) de 2-etilhexanoato de potasio hidrato en acetato de etilo se anadieron con agitacion a temperatura ambiente. La solucion de reaccion resultante se concentro a presion reducida y al residuo se le anadio eter dietflico. Se obtuvo un solido precipitado por filtracion y se lavo con eter dietilico, con lo que se obtuvo un producto en bruto en forma de un solido amorfo. Despues, el producto en bruto se disolvio en 3 ml de acetato de etilo y a esto se anadio un germen cristalino obtenido por el procedimiento descrito anteriormente y la mezcla resultante se calento a reflujo a 100 °C durante 5 minutos. Despues de enfriar la mezcla resultante, se obtuvo un solido precipitado por filtracion y se lavo con acetato de etilo, con lo que se obtuvieron 236 mg del compuesto del tttulo en forma de un cristal blanco (rendimiento: 73 %).

(Ejemplo 3)

Medicion de Difraccion de rayos X en Polvo

Se uso un Rint TTR-III (provisto de un tubo contador de centelleo y una ranura larga para eliminar las radiaciones Kp) fabricado por Rigaku Corporation. Se coloco una muestra uniformemente sobre un portamuestras no reflectante y se realizo la medicion en las siguientes condiciones:

Tipos de rayos X: Cu-Ka (longitud de onda: 1,54 A), tension del tubo: 50 kV, corriente del tubo: 300 mA, velocidad de escaneo: 2°/min, paso: 0,02°, alcance del escaneo (2q): 2° a 60°, ranura de divergencia: 0,5 mm, ranura de dispersion: 0,5 mm, ranura de recepcion: 0,5 mm

En la Fig. 1 se muestra el patron de difraccion de rayos X en polvo obtenido midiendo el cristal del compuesto obtenido en el Ejemplo 1 de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. En la Tabla 1 se muestran picos que tienen una intensidad relativa de 9 o mas cuando la intensidad maxima de pico en la Fig. 1 es de 100.

[Tabla 1]

20: valor d Intensidad relativa

3,82: 23,11 24

7,64: 11,56 100

11,48: 7,70 9

19,06: 4,65 12

23,08: 3,85 12

25,22: 3,53 9

26,98: 3,30 30

(Ejemplo 4) Prueba de Absorcion de Humedad

Se peso una muestra en un vaso de muestra de vidrio y se midio su peso en las siguientes condiciones. <Condiciones de medicion>

Dispositivo de medicion: DVS Advantage, fabricado por Surface Measurement System Ltd.

Medicion de la humedad: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 50, 40, 30, 25, 20 y 10 % de HR

Medicion de la temperatura: 25 °C, tiempo de exposicion mmimo: 15 min, tiempo de exposicion maximo: 120 min, condicion de transicion de paso: dentro de 0,006 % en peso

Se confirmo la apariencia de la muestra en el momento de la finalizacion de la medicion.

Como se muestra en la Tabla 4 y en las Figs. 3 y 4, el (2R,3R,8R)-8-[N-(2-cloro-4-fluorofenil)sulfamoil]-2,3-

bis(hidroximetil)-1,4-dioxaspiro[4.5]deca-6-eno-7-carboxilato de etilo (un compuesto en forma libre descrito como un compuesto de baja polaridad (primer pico) del Ejemplo 162 en el documento WO 2007/032362) usado como compuesto del ejemplo comparativo mostro alta higroscopicidad a cada medida de humedad (vease la Fig. 3), sin embargo, el compuesto del ejemplo 1 no mostro higroscopicidad (vease la Fig. 4). En particular, el compuesto del 5 Ejemplo 1 no mostro higroscopicidad ante ninguna medida de humedad de manera consistente (vease la Fig. 4).

(Ejemplo 5) Ensayo de solubilidad

150 mg del compuesto del Ejemplo 1 y del Ejemplo Comparativo 1 fueron disueltos en 5 ml de una solucion acuosa de fosfato que contema cloruro de sodio (conteniendo NaCl 150 mM y NaH2PO3'2H2O 10 mM). Despues de agitar 10 la mezcla resultante durante 30 minutos mientras se media el pH de la mezcla, una porcion de 0,5 ml de la suspension resultante se tomo y filtro mediante un filtro de jeringa. Una porcion de 100 |il del filtrado obtenido se trasfirio a un matraz aforado de 10 ml y se diluyo a 10 ml con una solucion acuosa de 50 % de MeCN, con lo que se preparo una solucion de muestra. A la suspension se anadio gota a gota HCl concentrado para ajustar su pH a aproximadamente 7,5.

15 La medicion se realizo usando HPLC en siguientes condiciones.

Sistema HPLC: Water's Alliance

Columna: XTerra MS C18 3,5 |im, Medidas de la Columna: 4,6 x 100 mm Temperatura de la columna: 40 °C, Caudal: 1,2 ml/min 20 Disolvente A: 0,1 % de acido fosforico en agua, Disolvente B: 0,1 % acido fosforico en MeCN

Tabla de gradiente:

[Tabla 3]

Tiemp o: Flujo total % de A % de B Curva

0: 1,2 95 5

15: 1,2 5 95 6

15,01: 1,2 95 5 11

20: 1,2 95 5 6

25 <Resultados de las Mediciones>

Como se muestra en la Tabla 4, el compuesto (en la forma libre) del Ejemplo Comparativo tema baja solubilidad. Mientras tanto, el compuesto del Ejemplo 1 mostro una solubilidad de 13,8 mg/ml y 9,6 mg/ml, respectivamente.

(Ejemplo 6) Ensayo de estabilidad de la solucion

30 Cada uno de los compuestos (Ejemplo 1 y Ejemplo Comparativo) se peso con precision y se coloco en un matraz aforado de 10 ml y se disolvio en PBS a pH 6. A continuacion, se le anadio HCl 1 N para ajustar la solucion del compuesto del Ejemplo 1 a pH 6 y la solucion del compuesto del Ejemplo Comparativo a pH 8. Los matraces anteriores tal cual estaban y los matraces cubiertos con papel de aluminio para protegerlos de la luz como controles se colocaron en un probador de luz a 25 °C. Despues de un dfa, cada solucion se diluyo a 10 ml con 50 % de MeCN. 35 La concentracion de cada solucion se calculo realizando HPLC en las mismas condiciones que se usaron en el ensayo de solubilidad descrito anteriormente, y se calculo el cambio en la concentracion con respecto al control.

Como se muestra en la Tabla 4, los valores para la estabilidad de la solucion despues del almacenamiento durante 1 dfa fueron de 99,4 % en el caso del compuesto (en la forma libre) del Ejemplo Comparativo, de 99,9 % en el caso 40 del compuesto del Ejemplo 1.

(Ejemplo 7) Evaluacion para la estabilidad qmmica

5

10

15

20

25

30

En una habitacion con baja humedad (25 °C, 30 % de HR) se peso una muestra con precision en una taza de muestra de cuarzo y se coloco en un matraz aforado de 10 ml. A continuacion, el matraz se dejo en un desecador que contema gel de s^lice durante 3 dfas, manteniendo abierta la boca del matraz. Despues, el matraz se almaceno de forma adicional en un entorno a una temperatura de 25 °C y una humedad del 30 % durante 4 semanas mientras se segrna manteniendo abierta la boca del matraz. A continuacion, la cantidad residual se midio mediante el uso de HPLC en las mismas condiciones que se usaron en el ensayo de solubilidad en el Ejemplo 5.

Como se muestra en la Tabla 4, fue imposible realizar este ensayo para el compuesto (en la forma libre) del Ejemplo Comparativo porque el compuesto es higroscopico, sin embargo, el compuesto del Ejemplo 1 mostro una cantidad residual de 98,9 %, lo que revelo que el Compuesto del Ejemplo 1 es estable.

[Tabla 4]

: Ejemplo comparativo Ejemplo 1

Forma libre o sal de potasio: Forma libre Sal de potasio

Forma cristalina: Amorfo Cristalino

Higroscopicida d: Con higroscopicidad 2,6 % (humedad relativa 10^ 80 %) cambiado a forma de tipo caramelo Sin higroscopicidad < 0,1 % (humedad relativa 10^ 80 %) no hay cambios de apariencia

Solubilidad (PBS pH 7,5): Dado que el compuesto se transforma en un solido viscoso en una solucion acuosa, fue imposible medir la concentracion de una manera reproducible. 13,8 mg/ml

Estabilidad de la solucion (25 °C, 1 dfa): 99,4 % tampon Mcllvaine pH 8 99,9 % PBS pH 6

Estabilidad qmmica (25 °C, 4 semanas): Debido a la alta higroscopicidad, fue imposible realizar esta prueba. 98,9 % (humedad relativa 30 %)

(Ejemplo Prueba 1) Efecto Supresor sobre la Produccion de TNF-a en celulas estimuladas con endotoxina (in vitro)

Para el compuesto de la presente invencion se determino la tasa de supresion de la produccion de TNF-a cuando la lmea de celulas monodticas humanas U937 se estimulo con endotoxina. Espedficamente, a un medio RPMI-1640 que contiene 10 % (% en volumen) de suero bovino de recien nacido inactivado se anadio 12-0-tetradecanoilforbol- 13-acetato para dar una concentracion final de 30 ng/ml. Las celulas U937 se suspendieron en el medio y se sembraron en una placa de cultivo de 96 pocillos (Sumilon) de manera que el numero de celulas por pocillo/volumen fue de 2x3 104/0,1 ml y la placa de cultivo se incubo a continuacion durante 3 dfas a 37 °C en un incubador de dioxido de carbono con un 5 % de CO2 y un 100 % de humedad. Tras la finalizacion de la incubacion se retiro el sobrenadante del cultivo. Se anadio el compuesto de la presente invencion a cada pocillo a diferentes concentraciones y tambien se anadio lipopolisacarido (LPS) (E. coli 0111:B4, Sigma) para dar una concentracion final de 30 ng/ml. Despues de incubar nuevamente la placa de cultivo en el incubador de dioxido de carbono durante 4,5 horas, se recogio el sobrenadante del cultivo. Usando una placa negra de media area de 384 pocillos (Greiner) y un kit de determinacion cuantitativa HTRF fabricado por Cisbio International, la concentracion de TNF-a en el sobrenadante del cultivo se midio como fluorescencia resuelta en el tiempo por Discovery (Packard). A partir del valor medido en ausencia de LPS (X), el valor medido en ausencia del compuesto de la presente invencion (Y) y el valor medido en presencia del compuesto de la presente invencion (Z), la tasa de supresion de la produccion de TNF-a se obtuvo segun la siguiente formula de calculo [I].

5

10

15

20

25

30

35

Tasa de supresion de produccion de TNF-a (%) = {1 -(Z-X) / (Y-X)} x 100 [I]

[Tabla 5]

< Efecto Supresor sobre la Produccion de TNF-a (in vitro)>

Compuesto de ensayo: Alcance de supresion de produccion of TNF-a [%] (concentracion del compuesto de ensayo: 100 nM)

Compuesto del Ejemplo 1: 89

Como se muestra en la Tabla 5, en este ensayo el compuesto de la presente invencion mostro un efecto supresor excelente sobre la produccion de TNF-a en celulas estimuladas con endotoxina.

(Ejemplo de ensayo 2) Efecto Supresor sobre Aumento del nivel en Sangre de TNF-a (in vivo)

Se estudio el efecto supresor del compuesto de la presente invencion sobre la elevacion del nivel en sangre de TNF- a. Se realizo un ensayo para la elevacion del nivel de TNF-a en sangre de acuerdo con el procedimiento de Parant y col. descrito en Journal of Leukocyte Biology, vol. 47, pagina 164 (1990).

En ensayo se usaron de 3 a 4 ratas macho Sprague Dawley (8 a 9 semanas de edad) para cada grupo.

Cuatro horas antes de la administracion de LPS, se administro dipeptido de muramilo disuelto en solucion salina fisiologica (1 mg/ml) a cada rata a traves de la vena de la cola en una dosis de 1 ml/kg. 0,5 horas antes de la administracion de LPS, las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital (40 mg/kg) y se administro a cada rata a traves de la vena femoral derecha, en una dosis de 1 ml/kg, el compuesto de la presente invencion disuelto en una solucion de 5 % de dimetilacetamida/95 % de polietilenglicol 400. Al grupo de control se le administro una solucion de 5 % de dimetilacetamida/95 % de polietilenglicol 400 a una dosis de 1 ml/kg. Se administro LPS disuelto en solucion salina fisiologica (3 pg/ml) a cada rata a traves de la vena femoral izquierda a una dosis de 1 ml/kg. 2 horas despues de la administracion de LPS se recogio la sangre usando una solucion de citrato sodico al 3,8 % (p/v) como anticoagulante y el plasma sangumeo se separo por centrifugacion (10.000 g, 5 minutos, 4 °C). El nivel plasmatico de TNF-a se determino usando un kit de determinacion cuantitativa de TNF-a (BioSource International, Inc.). A partir del nivel de TNF-a en sangre en el grupo de control (X) y del nivel de TNF-a en sangre en el grupo al que se habfa administrado el compuesto de la presente invencion (Y) se calculo la tasa de supresion de la produccion de TNF-a de acuerdo con la siguiente formula de calculo [II].

Tasa de supresion de produccion de TNF-a (%) = {1-Y/X)} x 100 [II]

< Efecto Supresor sobre la Produccion de TNF-a (in vivo)>

[Tabla 6]

< Efecto Supresor sobre la Produccion de TNF-a (in vivo)>

Compuesto de ensayo: Tasa de supresion de la produccion de TNF-a [%] (concentracion del compuesto de ensayo: 0,3 mg/kg)

Compuesto del Ejemplo 1: 96

Como se muestra en la Tabla 6, en este ensayo, el compuesto producido por la presente invencion mostro un excelente efecto supresor sobre la elevacion del nivel de TNF-a en sangre.

Aplicabilidad Industrial

De acuerdo con la presente invencion se pueden obtener cristales de derivados de cicloalqueno sustituidos que tienen una excelente estabilidad en almacenamiento y manipulacion. Las sales de potasio de los derivados de cicloalqueno sustituidos de la presente invencion suprimen la produccion de un mediador inflamatorio causada por la transduccion de senales intracelulares o la activacion celular inducida por endotoxina y, por tanto, son eficaces como un agente profilactico y/o terapeutico para la septicemia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de produccion de un cristal de (2-cloro-4-fluorofenil){[(2R,3R,8R)-7-(etoxicarbonil)-2,3- bis(hidroximetil)-1,4-dioxaspiro[4.5]deca-6-en-8-il]sulfonil}azanida de potasio representado por la siguiente formula (1):

5

imagen1

el cual muestra picos caractensticos en los angulos de difraccion 20 (°) de 3,82, 7,64, 11,48, 19,06, 23,08, 25,22 y 26,98 (+ 2, respectivamente), en difraccion de rayos X en polvo obtenida por irradiacion con radiacion Ka de cobre, caracterizado por la adicion de una solucion de 2-etilhexanoato de potasio hidrato en acetato de etilo gota a gota a una solucion o suspension de (2R,3R,8R)-8-[N-(2-cloro-4-fluorofenil)sulfamoil]-2,3-bis(hidroximetil)-1,4- 10 dioxaspiro[4.5]deca-6-eno-7-carboxilato de etilo, disolviendo en acetato de etilo, calentando a reflujo y luego enfriando.