ES2617151T3 - Módulo de cultivos celulares - Google Patents

Abstract

Un módulo de adherencia que comprende 2 compartimentos separados por una membrana semipermeable; presentando dicha membrana una capa de mucosidad artificial aplicada en su sitio luminal; y dicho módulo caracterizándose por tener condiciones anaeróbicas en su lado luminal y condiciones aeróbicas en su lado basal; en las que el compartimento basal del módulo comprende células viables y en las que uno o más microorganismos se pegan a dicha capa de mucosidad artificial.

Description

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DESCRIPCION

Modulo de cultivos celulares.

La presente invencion se refiere a modelos in vitro que permiten el crecimiento, la estabilizacion y el estudio de las comunidades microbianas que se adhieren y colonizan superficies relacionadas con el hospedante y que imitan el transporte de compuestos qmmicos a traves de superficies epiteliales y que permiten la adaptacion hospedante- microbiota y el intercambio de senales.

Antecedentes de la invencion

El cuerpo humano alberga una comunidad microbiana tremendamente diversa sobre las superficies hospedantes externas e internas tales como la piel, el tracto respiratorio, la boca, el tracto gastrointestinal, el tracto reproductor, el tracto urinario y los ojos. El numero total de celulas microbianas (1014) supera el numero de celulas hospedantes (1013) con un orden de magnitud y comprende miles de especies. Su enorme diversidad enzimatica, su capacidad para provocar respuestas inmunologicas del hospedante y la posibilidad de modular los procesos fisiologicos dentro del hospedante que estan relacionados con la etiologfa del cancer, la obesidad o las enfermedades cardiovasculares, hace de estos microorganismos asociados con un hospedante un factor de confusion en el estado de salud general de un individuo.

Mas en particular, el tracto gastrointestinal, que sigue siendo un ambiente externo al cuerpo del hospedante, es un sitio donde la implicacion microbiana en procesos del hospedante es altamente significativa. Hasta ahora, muchos estudios se han focalizado en la comunidad microbiana en el lumen del intestino al investigar su actividad fermentativa, potencias metabolicas y cambios en la composicion de comunidad debido a ciertos tratamientos. Sin embargo, las interacciones espedficas microbio-hospedante a menudo dependen de la capacidad de los microorganismos para adherirse a la superficie del intestino. Estudios previos emplearon experimentos de cultivos celulares, tales como Caco-2, T84, HT29, etc., para investigar la adherencia espedfica de microorganismos probioticos o patogenos a las celulas epiteliales. Sin embargo, por razones de citotoxicidad, los cultivos celulares son muy sensibles a la coincubacion con suspensiones microbianas mixtas, limitando asf el tiempo experimental a 2 horas como maximo. Por otra parte, el crecimiento de los cultivos celulares insume mucho tiempo y no es posible realizar pruebas de deteccion de alto rendimiento para evaluar muchas bacterias o componentes al mismo tiempo.

Se ha propuesto que la estructura y la composicion del ecosistema gastrointestinal refleja una seleccion natural tanto a nivel microbiano como a nivel hospedante. Dicho ecosistema requiere una serie de equilibrios evolucionados y anidados para lograr la homeostasis general, en analogfa con la teona de la Estrategia Estable Evolutiva. Las senales derivadas del hospedante y las senales derivadas del microbio pueden estar vinculadas o disociadas. Las senales vinculadas implican una presion selectiva que se basa y favorece la coevolucion (Blaser y Kirschner, 2007, Nature, 449: 843-849). La seleccion natural antes mencionada se produce principalmente a lo largo de superficies de mucosa mediante una interaccion hospedante-microbiota que conduce a la modulacion de la inmunidad del hospedante.

Las vfas de senalizacion inmunologicas espedficas se pueden desencadenar a partir del reconocimiento por parte del hospedante de los patrones de pared celular microbiana. Los microorganismos tienen una amplia variedad de patrones de membrana asociados a microbios (MAMP, por su sigla en ingles), que se pueden reconocer mediante receptores espedficos del hospedante en celulas epiteliales. Un ejemplo de este proceso de reconocimiento es la familia de Receptores tipo Toll (TLR, por su sigla en ingles), que reconocen adhesinas microbianas espedficas, tales como lipopolisacaridos (LPS), acidos lipoteicoicos, fimbrias, pili, etc. Sin embargo, en el epitelio intestinal, donde la interaccion entre el hospedante y la microbiota endogena es la mas alta, se puede regular la disminucion del TLR. Antes de la invasion microbiana de celulas epiteliales, los microorganismos necesitan alcanzar el epitelio. Sin embargo, no hay contacto directo entre las bacterias luminales y las superficies epiteliales. La superficie real que las bacterias encuentran cuando se aproximan al epitelio del hospedante, es la capa de mucosidad que cubre el epitelio. Por lo tanto, el estudio de la capacidad microbiana para adherirse a la capa de mucosidad intestinal es un prerrequisito importante al evaluar la capacidad de un microorganismo para interactuar con el hospedante. Si bien es posible provocar la produccion de mucosidad en, por ejemplo, las lmeas celulares HT29 (Novellvaux et al., 2006) asf como MKN1, MKN7 y MNK45 (Linden et al., 2007), no es posible monitorizar la colonizacion y persistencia de las comunidades microbianas mixtas en estas celulas por razones de citotoxicidad. Por lo tanto, los modelos in vitro que permiten el estudio de colonizacion de mucosidad microbiana durante un penodo mas extenso son, por tanto, muy necesarios.

Los principales componentes de la mucosidad son las mucinas, que suelen estar presentes en una concentracion que oscila entre 2% y 10% (p/v). Estas son glicoprotemas que contienen altas proporciones de carbohidratos, generalmente entre 70 % a 85 % (p/p). Las mucinas son glucoprotemas inusuales en cuanto a que la mayona de las cadenas laterales de carbohidratos estan unidas a la protema en residuos de serina y treonina a traves de un atomo de oxfgeno (es decir, son "O-glucosilados"), aunque tambien se produce W-glicosilacion. La estructura de una molecula de mucina tfpica consiste en una protema a la que estan unidas las cadenas laterales de carbohidratos mediante O-glicosilacion y/o W-glicosilacion. La estructura de la protema consiste en varios miles de residuos de aminoacidos (en el caso de MUC2, un tipo principal de mucina que se encuentra en el sistema gastrointestinal (TGI),

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el numero de aminoacidos es 5.179) y contiene regiones con muchas cadenas laterales de oligosacaridos y otras regiones sin dichas cadenas laterales. Las regiones ricas en oligosacaridos son resistentes a las proteasas, mientras que las otras regiones son sensibles a la proteasa. Las regiones que contienen oligosacaridos de la protema son ricas en serina, treonina y prolina. Las cadenas laterales suelen consistir en dos a doce residuos de un intervalo restringido de azucares, generalmente galactosa, fucosa, W-acetilglucosamina, A/-acetilgalactosamina, manosa y acidos sialicos.

Las estructuras de protema de las diversas mucinas producidas estan codificadas por una gran familia de genes MUC. El sitio del cuerpo espedfico determinara cuales de estos genes se expresan. Por lo tanto, MUC2 es el tipo principal de protema mucina producida en el tracto intestinal, mientras que la expresion de seis genes MUC se ha detectado en el cuello uterino con diferentes patrones de expresion en diferentes fases del ciclo menstrual. En la cavidad oral, se han identificado dos mucinas secretadas bien conocidas, la glicoprotema 1 de mucosidad (MG1) y la glicoprotema 2 de mucosidad (MG2). La MG1 de alto peso molecular consiste principalmente en el producto de gen MUC5B (Nielsen et al., 1997), mientras que la MG2 de bajo peso molecular es un producto del gen MUC7 (Bobek et al., 1993). Sin embargo, solo unos pocos investigadores han informado la expresion de mucinas asociadas a membranas en la cavidad bucal humana. Sengupta et al. (2001) informo que MUC1 se expreso en los conductos del salival menor. Liu et al. (2002) demostro que MUC1 y MUC4, pero no MUC3 y MUC13, se expresaron en las glandulas parotidas y submaxilares humanas. Recientemente, se ha demostrado que las capas epiteliales de mucosa oral humana estratificadas y cultivadas expresan las transcripciones para las mucinas asociadas a membrana, MUC1, MUC4 y MUC16, pero no MUC3, MUC12, MUC13, MUC15 y MUC17 (Hori et al., 2007; Hori et al., 2008).

Tambien existen diferencias con respecto a los patrones del glicosilacion de un tipo particular de protema mucina; por lo tanto, la composicion de las cadenas laterales de carbohidratos de una mucina con una estructura de protema MUC1 en los tractos respiratorios e intestinales sera diferente.

Ademas de la adherencia de mucosidad, algunas bacterias pueden invadir la capa de mucosidad y utilizar la mucina como Carbono, Nitrogeno y fuente de energfa. Los polfmeros de mucina necesitan hidrolizarse, antes de la asimilacion de los oligomeros de mucina, monomeros de mucina y aminoacidos. La complejidad estructural de los polfmeros de mucina implica que es improbable su completa degradacion mediante una sola especie microbiana. Dicha degradacion requiere la produccion de toda una gama de enzimas en un cierto orden porque las regiones de la molecula solo se hacen accesibles una vez que se hayan eliminado otras. Esto se logra mas facilmente mediante consorcios microbianos en lugar de especies individuales. El rango de enzimas necesarias para lograr la degradacion completa de mucina se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Enzimas necesarias para la degradacion completa de mucina

Tipo de enzima

Papel en la degradacion de la mucina

Sulfatasas

Eliminacion de residuos de sulfato finales que expone los azucares subyascentes haciendolos mas susceptibles a la accion de las glicosidasas.

Sialidasa (neuraminidasas)

Eliminacion de residuos terminales de acido sialico: esto expone azucares subyacentes a la accion de las glicosidasas: el acido sialico en sf se puede degradar aun mas por liasa de piruvato acetilneuraminato a W-acetilmannosamina que se puede utilizar como carbono y fuente de energfa por algunas bacterias.

Exoglicosidasas

Escindir los azucares desde las cadenas laterales (p. ej. p-D galactosidasa, W-acetil-p-D galactosaminidasa, a-fucosidasa, W-acetil-p-D glucosaminidasa).

Endoglicosidasas

Escindir toda la cadena lateral de la estructura del peptido o atacar la cadena lateral en sitios que no sean el residuo terminal. Esto puede ocurrir antes o despues de que la cadena lateral se haya escindido de la protema.

Peptidasas/proteasas

Escindir en regiones no glicosiladas: degradar la estructura de la protema despues de que se hayan eliminado las cadenas laterales.

Se ha detectado la capacidad de degradar mucina, total o parcialmente, en microbios o consorcios microbianos que habitan todos los sitios mucosos del cuerpo. La eliminacion de los carbohidratos y otros componentes de la glicoprotema compromete la funcion protectora en el intestino, especialmente cuando la tasa de degradacion de la mucosidad excede la tasa de produccion de la mucosidad. La composicion y la actividad metabolica de las comunidades microbianas mucosas son bastante diferentes de las comunidades microbianas luminales en el

intestino. Dada su importancia ecologica en cuanto a la composicion de la microbiota intestinal y su supuesto papel en la enfermedad inflamatoria intestinal tal como la colitis ulcerosa, es fundamental para comprender la colonizacion, la composicion y la actividad metabolica de la poblacion microbiana de la mucosa intestinal.

Una vez que los microorganismos intestinales se pueden adherir a la mucosa, tienen la oportunidad de formar una 5 biopelfcula en la mucosa dentro del penodo en que el epitelio del hospedante renueva su capa de mucosidad. Se considera que las biopelfculas reflejan el estado estable mas usual para el crecimiento bacteriano (Costerton, 1995) con la biopelfcula microbiana intestinal que constituye un factor determinante en el establecimiento y mantenimiento de la comunidad microbiana espacialmente diversificada (Hooper y Gordon, 2001). Una caractenstica especial de las biopelfculas de mucosa es la presencia de oxfgeno en la base, debido a la difusion del flujo de sangre del 10 hospedante a traves del epitelio. Las concentraciones de oxfgeno luminales en el colon incluso pueden aumentar a 30 mm Hg. Esto comprometena la colonizacion y el crecimiento de anaerobios estrictos, tales como las Fusobacterias sesiles que se encuentra que tienen una importante funcion de "puente" dentro de las biopelfculas, formando puentes de coagregacion/coadherencia entre los primeros y ultimos colonizadores y contribuyendo asf hacia el establecimiento y acumulacion de biopelfculas (Kolenbrander et al., 2000). Sin embargo, es factible el 15 crecimiento de las Fusobacterias en la biopelfcula de la mucosidad debido a su asociacion local con aerobios y anaerobios facultativos, que localmente agotan la capa de mucosidad de oxfgeno. La presencia de oxfgeno en la capa de mucosidad tambien permite la produccion de especies reactivas de oxfgeno tales como O2 -, H2O2 y OH de origen bacteriano. Por ejemplo, se ha demostrado que el Enterococcus faecalis forma radicales de hidroxilo mediante la hidroxilacion aromatica, provocando asf estres oxidativo hacia el epitelio (Huycke y Moore, 2002).

20 Se han utilizado diferentes enfoques in vitro para evaluar la influencia de sustancias y organismos en el sistema gastrointestinal y su flora que incluyen sistemas de cultivo por lotes y continuos.

Fermentadores por lotes

Los sistemas de cultivo por lotes a corto plazo permiten una prueba de deteccion rapida y un diseno flexible para evaluar, por ejemplo, la variabilidad interindividual. Sin embargo, en este ambiente simplificado, no es posible 25 controlar las condiciones cambiantes y solo se pueden realizar experimentos a corto plazo.

Fermentadores continuos de una sola fase

Los fermentadores continuos de una sola fase ofrecen un mejor modelo para las regiones espedficas del tracto gastrointestinal en condiciones controladas. No obstante, no siempre es posible que la comunidad microbiana en estudios a largo plazo sea estable.

30 El simulador de lectura

El simulador de Lectura (Macfarlane y Macfarlane, 2007) simula el intestino utilizando un cultivo continuo de 3 fases con tres recipientes de cristal (220 ml, 320 ml y 320 ml) y un pH diferente en cada recipiente (5,8, 6,2 y 6,8), que imita el colon proximal, transverso y distal humano, respectivamente. Cada recipiente se inocula con 100 ml de 20 % (p/v) de heces humanas. El sistema se ejecuta por 14 dfas para alcanzar una condicion de estado estable en los 35 recipientes, luego por 3 semanas para evaluar un compuesto espedfico y, por ultimo, para un penodo de lavado (2 semanas) para determinar durante cuanto tiempo aun se pueden medir los cambios inducidos por la sustancia de prueba en ausencia del substrato en sf.

El simulador de colon EnteroMix

El modelo EnteroMix tiene cuatro unidades paralelas, comprendiendo cada una cuatro recipientes de cristal, 40 permitiendo que se ejecuten cuatro simulaciones simultaneamente con el mismo inoculo fecal (Makivuokko et al., 2006). Los recipientes del modelo EnteroMix 1, 2, 3 y 4 tienen volumenes de trabajo pequenos (6, 8, 10 y 12 ml, respectivamente). Se controlan los niveles de pH. La simulacion comienza con tres horas de incubacion de 10 ml del inoculo fecal y a continuacion se bombean 3 ml del medio simulador nuevo con (tres canales de prueba) o sin una sustancia de prueba (un canal de control) al primer recipiente. El medio se fermenta en el primer recipiente durante 45 tres horas, despues de que se transfieren 3 ml del medio fermentado al segundo recipiente, y se bombean 3 ml del medio nuevo al primer recipiente. La fermentacion dura 48 horas, despues de las cuales se recogen las muestras de cada recipiente y se termina la simulacion.

En los dos ultimos sistemas, la parte superior del tracto gastrointestinal (estomago e intestino delgado) esta totalmente ausente. Por otra parte, en el simulador EnteroMix de colon, los volumenes son pequenos en 50 comparacion con la situacion in vivo, no hay estabilizacion de la comunidad microbiana y solo se pueden realizar experimentos cortos.

Modelos in vitro del sistema gastrointestinal (TGI)

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Actualmente, hay dos modelos completos in vitro del TGI disponibles en los que se pueden realizar estudios y trabajos, se reducen el tiempo y los costes en comparacion con los estudios in vivo, sin limitaciones eticas. En estos dos sistemas, la cinetica del intestino se simula mediante el control de las concentraciones de las enzimas gastricas, del intestino delgado y pancreaticas, bilis, pH, temperatura, composicion del alimento, tiempo de transito en el TGI y el ambiente anaerobico con relevancia fisiologica.

TIM 1 y 2 (modelo intestinal del TNO)

El primer modelo del TGI in vitro es el modelo gastrointestinal del TNO (TIM). En realidad, este modelo comprende dos partes complementarias; los sistemas 1 y 2 presentados por Minekus et al. en 1995 y 1999 (US55255305 y Minekus et al., 1999) y WO1994009895. El sistema TIM 1 contiene cuatro camaras controladas por ordenador que simula las condiciones del estomago, duodeno, yeyuno e fleon. El sistema TIM 2 consiste en cuatro modulos de cristal que imitan el colon proximal de animales monogastricos. En estos modelos dinamicos el transporte de fluido de recipiente a recipiente pasa a traves de la valvula-bombas peristalticas y hay una constante, aunque pasiva, absorcion de agua y productos de fermentacion a traves de membranas de dialisis. Para la simulacion de la absorcion intestinal TiM 1 tiene dos membranas de dialisis integradas de 5 kDa, junto a los modulos del yeyuno e fleon. TIM 2 tiene una membrana de fibra hueca (valor de corte de la masa molecular 50 kDa) en la parte luminal del sistema. Los valores de pH se monitorizan en cada compartimento. En una simulacion de TIM 2 el modelo se inocula con 200 ml del inoculo fecal. Se permite que la microbiota se adapte a las condiciones durante 16 horas, sin embargo no hay ninguna estabilizacion a largo plazo de la comunidad microbiana y los volumenes en las diferentes camaras son pequenos en comparacion con las situaciones in vivo.

El Simulador del ecosistema microbiano intestinal humano (SHIME)

El segundo modelo del TGI in vitro es el Simulador del Ecosistema Microbiano Intestinal Humano (SHIME, por su sigla en ingles). El SHIME convencional es un modelo dinamico del intestino humano que comprende 5 compartimentos respectivamente que simulan el estomago, el intestino delgado y el colon ascendente, transverso y descendente. Los compartimentos del estomago y del intestino delgado imitan el ambiente enzimatico y fisicoqmmico mediante el control del pH y del tiempo de residencia y la dosificacion de un medio nutritivo adecuado, las enzimas y las sales biliares. Al controlar el pH, el potencial redox y los tiempos de residencia, cada uno de los diferentes compartimentos del colon albergan una comunidad microbiana que corresponde a la de la situacion in vivo en cuanto a la actividad metabolica y la composicion de la comunidad. En este modelo, se siguen un penodo de estabilizacion tfpico de tres semanas y un penodo basal de dos semanas por tratamiento y penodos de lavado.

Modelo de simulacion de biopelfculas (Lacroix, Suiza)

Todos los modelos presentados hasta ahora no tienen en cuenta un aspecto importante en el tracto gastrointestinal: la adherencia de microorganismos a la capa de mucosidad, la formacion de biopelfculas y su papel potencial en la fisiologfa del hospedante y la estructuracion de la comunidad microbiana y en interaccion. Las solicitudes de patente US2005186633 y US20040101906 de Lacroix et al. (2005) abordaron la cuestion de la formacion de biopelfculas en el tracto gastrointestinal. Reivindicaron un sistema que utiliza la inmovilizacion celular en cultivos de flujo continuo anaerobico para modelar el sistema gastrointestinal. Los microbios de las muestras fecales nuevas se inmovilizan en un gel mixto de gellan y xantano en perlas y luego se introducen en un quimiostato de una sola fase o varias fases (sistema de cultivo continuo) que simulan la biopelfcula que se forma tfpicamente en el tracto gastrointestinal. Este sistema permite que se adhieran los microorganismos. Al mismo tiempo, sin embargo, carece del aspecto importante que caracteriza espedficamente la biopelfcula de la mucosa, a saber, las condiciones anaerobicas imperantes en la parte superior de la biopelfcula y las condiciones microaerofflicas imperantes en la base de la biopelfcula.

Probert y Gibson (2004) proporcionaron un dispositivo similar con un marco de perlas de mucina cubiertas dentro de una membrana de dialisis. El sistema se inocula con muestras fecales y el agua y los metabolitos se eliminan por osmosis utilizando una disolucion de glicol de polietileno.

Por ultimo, Macfarlane et al. (2005) desarrollo un sistema de cultivo continuo de dos fases, simulando el colon proximal y distal, y utilizo los geles de mucina porcina esteril en tubos de cristal pequenos para determinar como las bacterias intestinales colonizan y degradan la mucosidad. Estos tubos se pueden colocar en un fermentador que simula un area espedfica del tracto gastrointestinal y se eliminan en un penodo de 48 horas para realizar analisis adicionales de la biopelfcula.

Estos sistemas permiten que los microorganismos se adhieran, pero no ofrecen la oportunidad de estudiar la formacion de biopelfculas del intestino (Lebeer et al., 2007) y la interaccion hospedante-microbiano en condiciones continuas simuladas.

Simulacion de la interaccion hospedante-bacterias

Ninguno de los modelos antes mencionados que simulan el tracto gastrointestinal tiene un dispositivo adecuado para estudiar los mecanismos de adherencia bacteriana en respuesta a las senales del hospedante y la interaccion

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redproca. Los estudios previos utilizan animales libres de germenes (principalmente roedores y, mas recientemente, peces zebra - Cheesman y Guillemin, 2007) o experimentos de cultivos celulares (principalmente celulas Caco-2 o HT29).

Los estudios en animales demostraron que los vertebrados poseen una amplia escala de interacciones conservadas con los microbios con los que evolucionan conjuntamente (Cheesman y Guillemin, 2007) en particular al mantener la homeostasis epitelial intestinal; sin embargo, los estudios mecanicistas no son siempre posibles.

El uso de lmeas celulares in vitro se puede limitar por el hecho de que estas celulas no producen una capa de mucosidad (celulas Caco-2) o por el hecho de que los cultivos microbianos puros o solo se puede evaluar una mezcla de algunas cepas, por razones de citotoxicidad. Los cultivos celulares son muy sensibles a la incubacion con suspensiones microbianas mixtas, limitando asf el tiempo de incubacion y la adaptacion del hospedante y el metabolismo microbiano.

Laube et al. (2000) ha desarrollado un modelo interesante para simular el metabolismo secuencial de sustancias qmmicas por el dgado y la microbiota intestinal. Aqm, en un sistema de doble camara, los hepatocitos se cultivan como una monocapa sobre una membrana mientras que, en el compartimento anaerobico, la microbiota fecal esta presente en suspension. El intercambio de metabolitos se puede producir a traves de la membrana permeable.

Parlesak et al. (2004) ha llevado a cabo otro estudio, que investiga la interaccion entre los leucocitos y enterocitos mononucleares humanos durante el reto con una sola especie bacteriana utilizando sistemas de cultivo celular Transwell compartimentados.

Linden et al (2007) tambien ha utilizado el sistema de cultivo celular Transwell, en el que lmeas celulares epiteliales gastrointestinales humanas (p. ej., MKN1, MKN7, Caco-2,...) crecen en el lado apical de un Transwell y posteriormente, se cocultivan con diferentes cepas microbianas.

Aunque los sistemas antes descritos son muy utiles para los experimentos a corto plazo, generalmente no son adecuados para estudiar las propiedades complejas de la microflora intestinal en estudios a largo plazo, debido a la citotoxicidad de las celulas microbianas hacia la capa de celulas humanas.

Modelo in vitro de la presente invencion

Una prueba in vitro que no representa la complejidad real in vivo sera poco fiable cuando los resultados se extrapolan a una situacion in vivo del TGI (Pedersen y Tannock, 1989). Las comunidades bacterianas de la mucosa en el tracto gastrointestinal son diffciles de estudiar in vivo y las biopsias se suelen obtener de individuos enfermos. En consecuencia, los datos disponibles no pueden proporcionar una indicacion real de una diversidad de mucosa normal (Macfarlane y Dillon, 2007). Ademas, un dispositivo adecuado para estudiar los mecanismos de adherencia bacteriana en respuesta a las senales del hospedante y sus interacciones redprocas aun no esta disponible.

Por lo tanto, hay una necesidad de modelos in vitro que

- reflejen la situacion del tracto gastrointestinal (TGI) in vivo,

- imiten las condiciones ambientales relevantes de una capa de mucosa,

- se puedan adaptar a un sistema continuo

- permitan el estudio de la adherencia, colonizacion, composicion y actividad metabolica de la poblacion microbiana de mucosa en un marco de tiempo mas extenso,

- permitan la formacion de una biopelmula de mucosa con condiciones espedficas (en particular anaerobicas o aerobicas) imperantes en la parte superior de la biopelmula y las condiciones microaerofflicas imperantes en la base de la biopelmula,

- proporcionen la posibilidad de realizar experimentos con monocultivos y con las comunidades microbianas mixtas y, por lo tanto, mas relevantes, y/o

- permitan evaluar la interaccion hospedante-microbiota y la consiguiente adaptacion redproca.

La presente invencion describe diferentes modelos para estudiar la adherencia microbiana a superficies de mucosa. En particular, los modelos de la presente invencion comprenden 2 compartimentos separados por una membrana semipermeable. Dicha membrana, en el lado luminal que esta recubierto con una capa de mucosidad artificial a la que se permite que se adhieran los microorganismos aplicados en el compartimento luminal. El uso de dichas capas de mucosidad artificial es conveniente en comparacion con el uso de capas de mucosidad formadas por celulas epiteliales, ya que se evita la interaccion directa, y como tal, tambien la citotoxicidad entre los microorganismos y las

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celulas epiteliales, permitiendo analisis a largo plazo. Sin embargo, las celulas epiteliales y/u otros tipos de celulas pueden hacerse crecer en el compartimento basal del modulo y se permite que los productos de secrecion de estas celulas, as^ como de los microorganismos, se esparzan a traves de la membrana y la capa de mucosidad artificial en ambas direcciones. Ademas, el uso de dos compartimentos separados permite el establecimiento de las presiones de oxfgeno diferentes en ambos lados de la membrana. Mediante la regulacion de la presion de oxfgeno en los compartimentos individuales, se pueden establecer las condiciones optimas para las celulas epiteliales aerobicas en el compartimento basal, asf como para el microorganismo anaerobico en el compartimento luminal. Como sera evidente en los sucesivos ejemplos, el gradiente de oxfgeno a traves de la membrana semipermeable da lugar a condiciones microaerofflicas en el lado luminal de la capa de mucosidad artificial que imitan con esmero la situacion correspondiente in vivo para la adherencia de microorganismos a dicha capa. Por ultimo, los modelos permiten un establecimiento de tension de corte en el compartimento que contiene los microorganismos, que es muy importante para imitar la situacion in vivo. La combinacion de estas caractensticas claramente diferencia el modelo de la presente invencion de los modelos descritos en la tecnica anterior y ofrece un modelo novedoso del tracto gastrointestinal que imita con esmero la situacion correspondiente in vivo.

Compendio de la invencion

La presente invencion se refiere a un modulo de adherencia que se puede utilizar en un modelo del TGI in vitro, que comprende 2 compartimentos separados por una membrana semipermeable, presentando dicha membrana una capa de mucosidad artificial aplicada en su sitio luminal, y dicho modulo caracterizandose por condiciones anaerobicas en su lado luminal y condiciones aerobicas en su lado basal. Dicha capa de mucosidad comprende al menos un tipo de mucina y el espesor de la capa oscila entre 1 y 1000 pm. Las condiciones aerobicas en el compartimento basal del modulo pueden comprender un suministro de oxfgeno en el lado basal de la capa de mucosidad que oscila entre 1 y 150 mmHg, en particular entre 1 y 45 mmHg de presion parcial.

La membrana semipermeable permite el transporte de los componentes entre 0 y 100.000 Da, en particular entre 0 y 10.000 Da. El material de la membrana semipermeable es policarbonato, poli(cloruro de dialildimetilamonio), tereftalato de polietileno o poliamida (nailon). El modulo de adherencia puede incluir ademas una capa porosa de apoyo en el lado basal de la membrana semipermeable. El material de la capa porosa de apoyo es poli(cloruro de dialildimetilamonio), poli(acido acnlico) o combinaciones de los mismos.

El compartimento basal del modulo comprende celulas viables. Las celulas pueden ser celulas Caco-2 y/o celulas HT29. Las celulas pueden crecer en una monocapa con su lado apical hacia la membrana semipermeable. El lado apical de las celulas se puede cubrir opcionalmente con una malla protectora.

En otra realizacion de la invencion el modulo comprende perlas, que tiene desde adentro hacia afuera, una capa de apoyo interna, una membrana semipermeable y una capa de mucosidad artificial. Dichas perlas tienen un radio entre 500 pm y 1 cm, en particular entre 500 pm y 5 mm. La capa de apoyo interna puede comprender componentes de oxfgeno de liberacion lenta de bioqmmicos. Por otra parte, la capa de apoyo interna puede estar cubierta con una capa intermedia que contiene componentes de oxfgeno de liberacion lenta de bioqmmicos.

La superficie de la capa de mucosidad artificial es aproximadamente 1 cm2 y 200 m2, en particular entre 1 cm2 y 1000 cm2, en particular entre 1 cm2 y 100 cm2. Uno o mas microorganismos se pueden pegar a la capa de mucosidad y opcionalmente formar colonias o una biopelfcula.

Otro aspecto se refiere a un sistema in vitro que comprende el modulo de adherencia antes descrito. El sistema in vitro puede ser un modelo gastrointestinal in vitro, un modelo del tracto reproductor femenino in vitro, un modelo del epitelio blando de la boca in vitro o un modelo del tracto respiratorio in vitro. Este sistema in vitro puede ser un modelo gastrointestinal in vitro que comprende una combinacion de un compartimento del estomago, un compartimento del intestino delgado, un compartimento del colon ascendente, un compartimento del colon transverso y un compartimento del colon descendente. El compartimento del intestino delgado se puede reemplazar por un compartimento del duodeno, un compartimento del yeyuno y un compartimento del fleon. El modulo de adherencia de la invencion se puede poner en paralelo y/o en serie con uno de los compartimentos.

Sin embargo, otro aspecto se refiere a un metodo para determinar el efecto de un elemento en el modulo de adherencia antes descrito, dicho metodo que comprende: (a) introducir dicho elemento en dicho modulo o dicho sistema; y (b) determinar si se produce cualquier cambio en cualquier caractenstica o funcion de interes de dicho modulo o dicho sistema en presencia de dicho elemento o despues de la introduccion de dicho elemento en dicho modulo o dicho sistema, en el que dicho cambio indica que dicho elemento tiene un efecto en el modulo o el sistema. Asf, esta realizacion de la invencion tambien se refiere al uso del modulo de adherencia o del sistema in vitro como se describe anteriormente para el estudio del efecto de un elemento. Esta realizacion de la invencion tambien se refiere al uso del modulo de adherencia o del sistema in vitro como se describe anteriormente para el estudio y la modulacion de la senalizacion molecular y la adaptacion entre las celulas hospedantes y el microorganismo opcionalmente despues de la incorporacion de un elemento y para el estudio y la modulacion de la fisiologfa, la actividad metabolica o las caractensticas probioticas o patogenas de su flora opcionalmente despues de la incorporacion de un elemento.

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El elemento se selecciona del grupo de:

(a) un microorganismo;

(b) un sustrato;

(c) una sustancia qmmica;

(d) una celula; y

(e) cualquier combinacion de (a) a (d).

Sin embargo, otro aspecto se refiere al uso del modulo de adherencia o del sistema in vitro como se describe anteriormente para el estudio y el tratamiento de un trastorno relacionado con una barrera de la mucosa deteriorada, en particular con una adherencia de la mucosa deteriorada. El trastorno se puede asociar con la invasion de antigenos que causan reacciones alergicas, se puede asociar con la adherencia de la mucosa y la invasion de patogenos, un trastorno metabolico o una enfermedad cronica del colon.

Breve descripcion de las figuras

FIGURA 1. Prueba MTT llevada a cabo en celulas Caco-2 para evaluar la viabilidad de las celulas en diferentes condiciones.

FIGURA 2. Esquema de los modulos de adherencia que comprenden dos camaras. 1A: un modulo de adherencia con una capa funcional que comprende una capa de mucosidad, una membrana semipermeable y una capa de apoyo. 1B: un modulo de adherencia con una capa funcional que comprende una capa de mucosidad y una membrana semipermeable en el que en la camara basal las celulas crecen en una monocapa con su lado apical hacia la capa de mucosidad.

FIGURA 3: Espesor de la mucosidad a lo largo de las distintas zonas del tracto gastrointestinal (Atuma et al., 2001).

FIGURA 4: Esquema de perlas recubiertas de mucosidad que comprenden una perla de apoyo interna, una capa intermedia que comprende material de liberacion lenta de oxfgeno, una membrana semipermeable y una capa de mucosidad.

FIGURA 5: Representacion esquematica del SHIME convencional.

FIGURA 6: Efecto de la presencia (+M) o ausencia (-M) de la capa de mucosidad sobre la viabilidad de celulas orales TR146 despues de 55 horas de tratamiento en presencia o ausencia de bacterias orales.

Descripcion detallada

El modulo de adherencia de la presente invencion comprende 2 compartimentos separados por una membrana semipermeable, presentando dicha membrana una capa de mucosidad artificial aplicada en su lado luminal, y dicho modulo caracterizandose por tener condiciones anaerobicas en su lado luminal y condiciones aerobicas en su lado basal.

El termino "modulo" o "modulo de adherencia" se refiere a un excipiente (p. ej., un recipiente o un contenedor) en el que se imitan las condiciones ambientales de una capa de mucosa.

La combinacion de la capa de mucosidad y la membrana semipermeable, para dividir el modulo de adherencia en 2 compartimentos, en lo sucesivo tambien denominado la capa funcional. Dicha capa funcional puede ser una capa doble, triple o multiple, pero consiste en al menos dos capas en las que la primera capa, es decir, la capa superior o la capa en contacto directo con el compartimento luminal, es la capa de mucosidad artificial y la segunda capa es la membrana semipermeable. El termino "compartimento luminal" se refiere al compartimento que simula el lumen del tracto del hospedante. El termino "compartimento basal" se refiere al compartimento en el extremo opuesto de la capa funcional en comparacion con el compartimento luminal. El termino "lado luminal de la capa de mucosidad" se refiere al lado de la capa de mucosidad en contacto con el lumen simulado del hospedante. El termino "lado basal de la capa de mucosidad" o "lado basal de la capa funcional" se refiere al lado opuesto del lado luminal.

La capa funcional puede tener distintos objetivos que incluyen, pero no se limitan al transporte de fluido, sustancias y/o gases y al apoyo de los microorganismos.

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Cuando la capa funcional consiste en una capa doble, una capa es la capa de mucosidad y la otra capa es una membrana semipermeable.

La capa de mucosidad siempre se encuentra en el lado luminal del modulo de adherencia. La membrana semipermeable siempre se encuentra en el lado basal de la capa de mucosidad. Cuando la capa funcional es una capa triple o multiple, puede comprender una capa de mucosidad, una membrana semipermeable y una capa de apoyo, ya sea la membrana semipermeable o la capa porosa de apoyo pueden estar junto a la capa de mucosidad, preferiblemente la capa semipermeable esta junto a la capa de mucosidad.

Por lo tanto, la capa funcional comprende una membrana semipermeable, que permite el transporte de oxfgeno desde el compartimento basal hasta el compartimento luminal y el transporte de metabolitos microbianos de bajo peso molecular o los componentes alimenticios digeridos desde el compartimento luminal hasta el compartimento basal del modulo y viceversa. El suministro de oxfgeno desde el lado basal hasta el lado luminal es crucial para establecer las condiciones microaerofflicas imperantes en la interfaz entre la biopelfcula y la capa de mucosidad.

Con "condicion microaerofflica" se hace referencia a la condicion que se obtiene cuando la condicion aerobica en el compartimento basal del modulo deriva en una presion de oxfgeno parcial, en el lado basal de la capa de mucosidad entre 1 y 150 mm Hg y preferiblemente entre 1 y 45 mm Hg, que esta en consonancia con los valores caractensticos para la situacion in vivo.

La vida comun para la mayona de las especies animales y plantas requiere la presencia de oxfgeno. Con "condicion aerobica" se hace referencia a la condicion necesaria para el crecimiento o metabolismo en el que dichos organismos reciben suficiente oxfgeno. Por ejemplo, varios generos de bacterias tienen diferentes necesidades de oxfgeno. Algunos, como Clostridium, encuentran que el oxfgeno es toxico y generalmente no crecen en el aire. Otros pueden crecer solamente cuando el oxfgeno esta presente. Dependiendo de la relacion con el oxfgeno, las bacterias se pueden clasificar en los siguientes grupos en base a su crecimiento en los tubos de mezcla de glucosa (GST, por su sigla en ingles);

• AA = anaerobios estrictos: Clostridium, Sarcina y muchos generos desde el rumen del ganado vacuno, intestinos y sitios similares. Los anaerobios estrictos solo crecen cuando no hay oxfgeno. Algunos son mas sensibles al oxfgeno que otros. Algunas especies, especialmente las del rumen y de los intestinos, mueren rapidamente cuando se exponen al oxfgeno. Muchas especies de Clostridium no se mueren por dicha exposicion breve, pero no pueden crecer en el oxfgeno. Algunas especies de Clostridium pueden crecer lentamente en presencia de aire. Ninguna especie de Clostridium puede producir esporas cuando el oxfgeno libre (sin combinar) esta presente;

• FA = anaerobios facultativos: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Proteus crecen mejor en oxfgeno, pero pueden crecer en ausencia de oxfgeno robando oxfgeno de los alimentos tales como nitratos, azucares y otros "oxfgenos honorarios". El resultado de esto es la produccion de nitrito, acidos organicos (acido lactico, acido formico, etc.) y otras sustancias que a menudo tienen olor nauseabundo. Los tubos que contienen anaerobios facultativos presentan un crecimiento total cuando las bacterias se distribuyen de manera uniforme, pero suele haber un mayor crecimiento en la superficie del agar porque estas crecen mejor en el aire;

• MA = microaerofflicos: Azospirillum, Aquaspirillum, Cytophaga requieren oxfgeno, pero crecen mejor bajo la superficie del agar, donde el oxfgeno es reducido. Este tipo de bacterias es relativamente infrecuente en los laboratorios porque algunas no creceran en GST ni en otros medios comunes. Es diffcil encontrar una especie que crezca en una banda bien definida de un milfmetro o similar por debajo de la superficie para producir una banda debajo de la superficie como se observa aqrn. A menudo la banda esta tan cerca de la superficie que se las puede confundir por especies aerobicas; sin embargo, no crecen profusamente en la superficie del agar como las especies aerobicas;

• A = aerobios estrictos: Acetobacter, Arthrobacter, Azomonas, Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Xanthomonas crecen solamente en la superficie del agar donde consiguen mucho oxfgeno. La mayona producen un fuerte crecimiento por encima del agar que puede ser un lfquido. Algunas bacterias producen babaza o capsulas y estas producen un crecimiento profuso excepcional sobre el agar y pueden penetrar en el agar suavemente. Las celulas que contienen lfquido pueden caen entre las paredes del tubo y el tapon del agar, pero no se debe confundir esto con crecimiento; e

• I = indiferente: Lactobacilos, algunos estreptococos y la mayona de otros organismos en la leche crecen igual de bien en la superficie y en el agar porque son indiferentes al nivel de oxfgeno. Tenga en cuenta que las bacterias crecen uniformemente sobre la superficie y en la parte inferior del tubo siempre que las celulas que esten distribuidas uniformemente. El crecimiento es similar al de los anaerobios facultativos excepto que los FA tienen un fuerte crecimiento de bacterias en la superficie. En la superficie, las bacterias indiferentes pueden tener un crecimiento de las celulas apenas perceptible. Los autores de la invencion saben que pueden crecer en la superficie porque lo hacen cuando se propagan en una placa de petri. En

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realidad, muchas de estas bacterias requieren vitaminas, aminoacidos, y otros factores de crecimiento y las colonias pueden ser diminutas incluso en los medios mas adecuados para ellas.

Como tal, "condicion anaerobica" se refiere a la condicion necesaria para el crecimiento o metabolismo de un organismo que no requiere oxfgeno, tales como las bacterias AA antes mencionadas. En una realizacion particular de la presente invencion las "condiciones anaerobicas" corresponden a una concentracion de ox^geno por debajo de 0,5 mg/L.

Con el termino "membrana semipermeable" se hace referencia a una membrana que permite el transporte de componentes que oscilan entre 0 y 100.000 Da, en particular entre 1-10.000 Da, en particular entre 0 y 5.000 Da, incluso mas en particular, entre 0 y 1.000 Da. Un ejemplo del material de membrana para la membrana semipermeable incluye, pero no se limita al policarbonato (PC), poli(cloruro de dialildimetilamonio) (PDDA), poliamida (PA) o tereftalato de polietileno. La funcion de la membrana semipermeable es distinguir entre los compuestos que pueden o no pueden transportarse a traves de la membrana. Cuando la capa funcional consiste en una capa de mucosidad y una capa semipermeable solamente, entonces la capa semipermeable tambien puede apoyar la capa de mucosidad y opcionalmente una biopelmula.

Los ejemplos del material para la capa de apoyo incluyen, pero no se limitan a, poli(cloruro de dialildimetilamonio) (PDDA), poli(acido acnlico) (PAA) o combinaciones de los mismos. Con el termino "capa porosa de apoyo" se hace referencia a una capa que permite el transporte de cualquier tipo de compuesto, ya que su funcion es solamente de apoyo de, por ejemplo, la membrana semipermeable anterior y la capa de mucosidad y opcionalmente una biopelmula.

El termino "mucina" se utiliza en la presente memoria para referirse a una protema obtenida como resultado de la expresion de un gen de mucina. Los genes de mucina humanos incluyen, pero no se limitan a, mucl, muc2, muc3, muc4, muc5, muc6, muc7, muc8 y muc9 y sus subclases relativas tales como, pero no limitados a, muc5B y muc5AC. Dentro del sentido de este termino, la mucina abarca todas las protemas codificadas por un gen muc, sus mutantes, sus protemas de empalme alternativas y sus protemas glicosiladas. Ademas, tal como se usa en la presente, el termino "mucina" incluye los analogos de mucina y los homologos de mucina y los analogos de otros animales. Los ejemplos de homologos y analogos de mucina incluyen, pero no se limitan a los dos tipos discretos de protemas de mucina que existen en el intestino del raton; Muc2 secretora y Muc3 ligado a la membrana, asf como Muc1 de raton en la vesmula biliar, o Muc2 en el pollo.

La capa de mucosidad artificial esta determinada por 2 parametros: el tipo de mucina y el espesor de la capa de mucosidad. Ambos parametros pueden depender del sitio y del estado de ser del organismo a simular. La capa de mucosidad permite la adherencia de las celulas microbianas, la formacion de agregados y las colonias y la posterior colonizacion de una biopelmula.

Los ejemplos de tipos de mucina incluyen, pero no se limitan a:

- las protemas Muc2 gelatinosas y Muc1 no gelatinosas cuando se simula el intestino,

- seis productos diferentes del gen Muc en el cuello uterino cuando se simulan diferentes fases del ciclo menstrual en el cuello uterino,

- Muc5B y Muc7 secretadas y a las mucinas asociadas con la membrana, Muc1, Muc4 y Muc16 en la cavidad oral,

- las estructuras de la protema Muc1 con cadenas laterales de carbohidratos diferentes dependiendo de la simulacion del tracto respiratorio o intestinal.

El espesor de la capa de mucosidad puede variar entre 1 pm y 1.000 pm (Figura 2). Esta capa de mucosidad puede ser ligeramente adherente o firmemente adherente dependiendo del tipo de mucina (mucinas gelatinosas y no gelatinosas) y concentracion de agua. Preferiblemente el espesor de la capa de mucosidad (Figura 2);

• esta entre 178 y 200 pm, incluso mas preferiblemente entre 75 y 85 pm para la capa de mucosidad firmemente adherente y entre 97 y 121 pm para la capa de mucosidad ligeramente adherente, al simular el corpus,

• esta entre 233 y 315 pm, incluso mas preferiblemente entre 138 y 170 pm para la capa de mucosidad firmemente adherente y entre 82 y 158 pm para la capa de mucosidad ligeramente adherente, al simular el antro,

• esta entre 132 y 208 pm, incluso mas preferiblemente entre 13 y 19 pm para la capa de mucosidad firmemente adherente y entre 115 y 193 pm para la capa de mucosidad ligeramente adherente, al simular el duodeno,

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• esta entre 119 y 127 pm, incluso mas preferiblemente entre 13 y 17 pm para la capa de mucosidad firmemente adherente y entre 103 y 113 pm para la capa de mucosidad ligeramente adherente, al simular el yeyuno,

• esta entre 433 y 527 pm, incluso mas preferiblemente entre 24 y 34 pm para la capa de mucosidad firmemente adherente y entre 400 y 494 pm para la capa de mucosidad ligeramente adherente, al simular el Aeon,

• esta entre 720 y 940 pm, incluso mas preferiblemente entre 65 y 167 pm para la capa de mucosidad firmemente adherente y entre 605 y 823 pm para la capa de mucosidad ligeramente adherente, al simular el colon,

• esta entre 5 y 150 pm en el sistema respiratorio,

• esta entre 150 y 470 pm en la cavidad oral, y

• esta entre 100 y 250 pm en el tejido vaginal.

El grado de colonizacion se ve afectado por las fuerzas de corte de la suspension intestinal a lo largo de la capa de mucosidad. Con el termino "fuerza de corte" se hace referencia a: una tension que se aplica de manera paralela o tangencial a una cara de un material, en contraposicion a una tension normal que se aplica de manera perpendicular. Las fuerzas de corte estan influenciadas por los movimientos peristalticos y el tiempo de residencia hidraulico. Por ejemplo, el movimiento peristaltico alto en el intestino superior (duodeno, yeyuno) crea fuerzas de corte altas de 15 a 40 dinas/cm2 asf como un tiempo de residencia (1 a 4 h), que son demasiado cortos para que los microorganismos colonicen eficientemente la mucosa correspondiente. En cambio, el movimiento peristaltico en el fleon terminal es mucho menor asf como las fuerzas de corte (por debajo de 10 dinas/cm2), creando asf un tiempo de residencia (5 a 8 h) que permite que las bacterias colonicen el tracto eficientemente. Por ultimo, en el colon las fuerzas de corte disminuyen a valores de 2,5 dinas/cm2.

Preferiblemente, las fuerzas de corte y los tiempos de residencia son:

• de 15 a 20 dinas/cm2 con un tiempo de residencia de 1 hora cuando se simula la parte superior del intestino delgado,

• de 8 a 12 dinas/cm2 con un tiempo de residencia de 2 horas cuando se simula la parte inferior del intestino delgado,

• de 4 a 6 dinas/cm2 con un tiempo de residencia de 10 horas cuando se simula la parte superior del colon,

• de 2 a 3 dinas/cm2 con un tiempo de residencia de 24 horas cuando se simula la parte inferior del colon,

• de 0,5 a 3 dinas/cm2 cuando se simula el tracto respiratorio en respiracion en reposo (puede llegar a 1700

dinas/cm2 con tos y broncoespasmo).

Al utilizar una configuracion de celda de flujo, se pueden modificar el caudal y la velocidad del flujo y, por lo tanto, la fuerza de corte sobre la capa de mucosidad.

Como la superficie de esta capa de mucosidad puede estar bastante limitada (aprox. 100 cm2) cuando se presenta en una capa funcional, la suspension intestinal se recicla varias veces para aumentar el tiempo de residencia a los valores relevantes para el compartimento intestinal de interes y aumentar la eficiencia en la absorcion del modulo. El numero de ciclos puede variar entre 1 y 100.

El compartimento basal del modulo puede comprender celulas viables.

Con el termino "celula" se hace referencia a cualquier celula primaria o lmea celular derivada de todo tipo de tejidos. La realizacion con celulas en el compartimento basal permite la interaccion indirecta y continua entre la biopelmula en crecimiento y las celulas, con el intercambio de moleculas de senal.

Los ejemplos de una celula incluyen, pero no se limitan a, enterocitos, celulas endoteliales, celulas dendnticas, monocitos, macrofagos, celulas vaginales o epiteliales orales (queratinocitos) y/o linfocitos.

Preferiblemente, la celula primaria o la lmea celular es un enterocito. Las celulas en el compartimento basal simulan el hospedante, tal y como, por ejemplo, el epitelio del tracto gastrointestinal del hospedante, por lo tanto, el compartimento basal puede incluir un ambiente artificial para estudiar las interacciones hospedante-microbiota. Un ejemplo de lmeas celulares para la simulacion del hospedante incluye, pero no se limita a, las lmeas celulares Caco- 2 o HT29.

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Las celulas diferentes se pueden mezclar y combinar en diferentes proporciones. Preferiblemente, la proporcion de las celulas Caco-2 frente a las celulas HT29 es 1 a 3 (Nollevaux et al., 2006). Las celulas pueden crecer hasta formar una monocapa o agregados, en una suspension o en perlas. Cuando las celulas crecen en monocapas, pueden crecer en la parte inferior de la camara basal o en una membrana semipermeable o en una capa de apoyo. Cuando las celulas crecen en una superficie o una perla, estas superficies o perlas se pueden recubrir con colageno tipo I con el fin de mejorar la adherencia (Straubb et al., 2007). Cuando las celulas estan presentes en una membrana semipermeable y/o en una capa porosa de apoyo, pueden formar una segunda capa independiente, que puede ser una capa funcional. Las celulas tambien pueden ser parte de la capa funcional que divide el modulo de adherencia en un compartimento luminal y basal. Las celulas pueden crecer con su lado apical hacia la capa funcional o lejos de la capa funcional. Preferiblemente, las celulas crecen con su lado apical hacia la capa funcional. El lado apical de las celulas se puede cubrir con una malla protectora para proteger las celulas contra, por ejemplo, el flujo o la fuerza de corte.

Para evitar fenomenos de citotoxicidad o para poder detectar ciertos elementos que incluyen, pero no se limitan a las moleculas de senal, se puede aplicar un flujo continuo o semicontinuo de medio nuevo en el compartimento basal dentro de un plazo pertinente. Con el termino "semicontinuo" se hace referencia a que en momentos bien definidos y dentro de penodos de tiempo bien definidos, se eliminan las cantidades del medio celular y se reemplazan por el medio nuevo. El volumen total del medio que se debe reemplazar puede ser entre 0,5 y 50 mL.

La superficie de la capa de mucosidad en el modulo de adherencia con una camara luminal y una camara basal puede ser entre 1 y 1.000 cm2 en particular entre 1 cm2 y 100 cm2.

En otra realizacion de la invencion el modulo de adherencia comprende perlas, que tiene desde adentro hacia afuera, una perla de apoyo interna, una membrana semipermeable y una capa de mucosidad artificial (Figura 3). La patente de Estados Unidos US25186633 describe un reactor de biopelfcula en el que las perlas de gel se utilizan en un reactor de biopelfcula.

Para tener concentraciones de oxfgeno relevantes en la base de la biopelfcula, las perlas utilizadas en la presente realizacion de la invencion se caracterizan por un material de liberacion lenta de oxfgeno. En estas perlas se libera oxfgeno en una cantidad como se describe anteriormente. En una realizacion de la invencion, las perlas se forman a partir de una perla de apoyo interna que comprende componentes de oxfgeno de liberacion lenta de bioqmmicos. La perla de apoyo interna tambien se puede cubrir con una capa intermedia que contiene componentes de oxfgeno de liberacion lenta de bioqmmicos. El oxfgeno se libera en una cantidad como se describe anteriormente.

La perla de apoyo interna que comprende los componentes de oxfgeno de liberacion lenta de bioqmmicos o la capa intermedia que contiene los componentes de oxfgeno de liberacion lenta de bioqmmicos, se cubre con una membrana semipermeable y una capa de mucosidad externa que comprende las mucinas como se describe anteriormente. La perla de apoyo interna que comprende los componentes de oxfgeno de liberacion lenta de bioqmmicos o la capa intermedia liberadora de oxfgeno, ademas se puede separar de la membrana semipermeable y de la capa de mucosidad externa por una capa de apoyo permeable al oxfgeno.

En una realizacion alternativa de las perlas antes mencionadas, la perla de apoyo interna no esta presente y el material de liberacion lenta de oxfgeno se encuentra en cambio dentro de una perla porosa.

Cuando el modulo de adherencia de la invencion comprende perlas, con el termino "el lado luminal de dicho modulo" se hace referencia al ambiente interno del modulo de adherencia que se encuentra en contacto directo con la superficie exterior de la perla y con el termino "el lado basal de dicha capa de mucosidad" se hace referencia al lado de la capa de mucosidad que se da internamente al centro de las perlas.

El radio de las perlas utilizadas en el reactor de biopelfculas se encuentra entre 500 pm y 1 cm, mas en particular, entre 500 y 5 mm. Por ejemplo, 1.000 perlas de un radio de 5 mm resultanan en una superficie espedfica de alrededor de 3.140 cm2, que es mas relevante para abordar valores de superficie amplios como se describe en la situacion in vivo.

En el modulo de adherencia antes descrito, la superficie de la capa de mucosidad puede ser entre 1 cm2 y 200 m2. Uno o mas microorganismos se pueden pegar a la capa de mucosidad y opcionalmente formar colonias o una biopelfcula.

Los terminos "modelo in vitro de la invencion" y "sistema in vitro de la invencion" son intercambiables y se utilizan en la presente memoria para indicar un modelo y/o sistema que comprende un modulo de adherencia, tal y como se describe anteriormente.

El modulo de adherencia de la presente invencion se puede incluir en un modelo gastrointestinal in vitro, un modelo del tracto reproductor femenino in vitro, un modelo del tracto respiratorio in vitro, un modelo de la mucosa oral in vitro o cualquier otro modelo que comprenda un epitelio blando cubierto por una capa de mucosidad

El modulo de adherencia de la presente invencion se puede incluir, poner en paralelo o poner en serie con los diferentes compartimentos en diferentes modelos in vitro. Uno, dos o mas modulos de adherencia se pueden

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implementar en los diferentes modelos in vitro. Preferiblemente, un modulo de adherencia se pone en paralelo con uno de los compartimentos de un sistema in vitro.

Los ejemplos de los diferentes compartimentos que permiten la implementacion del modulo de adherencia de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a modelos que simulan los compartimentos del tracto reproductor femenino, del epitelio blando de la boca o del tracto respiratorio.

Ademas, el modulo de adherencia de la presente invencion se puede colocar en paralelo con o entre los diferentes compartimentos del SHIME - el Simulador del Ecosistema Microbiano Intestinal Humano. El modulo de adherencia continuo se puede implementar en, junto a o despues del:

• compartimento del estomago,

• compartimento del intestino delgado,

• compartimento del colon ascendente,

• compartimento del colon transverso, o

• compartimento del colon descendente.

El SHIME ademas se puede desarrollar para simular mejor la situacion in vivo. En la situacion in vivo, el fleon terminal se considera el lugar donde se produce la colonizacion significativa de los microorganismos (>7 log UFC/g). Asf, se puede realizar una extension del SHIME donde se imitan por separado el duodeno, yeyuno e Aeon. Una correccion gradual de pH con NaHCO3, una secrecion mas precisa de las enzimas pancreaticas y sales biliares y un control de los tiempos de retencion caracterizan a los procesos digestivos y las condiciones en el duodeno. Esta digestion enzimatica del intestino delgado ademas se mantiene en el compartimento del yeyuno. La extension del modelo SHIME radica en la incorporacion de un componente microbiologico en el compartimento del Aeon. Una comunidad microbiana crece aqu a traves de la colonizacion inicial de reflujo desde el colon ascendente. Los tiempos de residencia mas cortos, las concentraciones de enzimas y sal biliar mas altas en el compartimento del fleon conduciran a una comunidad microbiana adaptada que representa tanto en composicion como en actividad metabolica la del fleon terminal in vivo.

As^ el modulo de adherencia de la presente invencion tambien se puede implementar en los diferentes compartimentos del SHIME extendido. El modulo de adherencia continuo se puede implementar en, junto a o despues del:

• compartimento del duodeno,

• compartimento del yeyuno, o

• compartimento del Aeon.

En otro aspecto, se describe un sistema in vitro que comprende el modulo de adherencia de la invencion.

En otro aspecto, la invencion ademas proporciona un metodo para determinar el efecto de un elemento en el modulo de adherencia o el sistema in vitro, comprendiendo dicho metodo: (a) introducir dicho elemento en dicho modulo o dicho sistema; y (b) determinar si se produce cualquier cambio en cualquier caractenstica o funcion de interes de dicho modulo o dicho sistema en presencia de dicho elemento o despues de la introduccion de dicho elemento en dicho modulo o dicho sistema, en el que dicho cambio indica que dicho elemento tiene un efecto en el modulo o el sistema.

El termino "cambio en cualquier caractenstica o funcion de interes de dicho modulo" incluye, pero no se limita a una modulacion del;

a) crecimiento y/o actividad de uno o un numero limitado de microorganismos no patogenos o beneficiosos. Los ejemplos de microorganismos no patogenos o beneficiosos incluyen, pero no se limitan a, lactobacilos, bifidobacterias, bacterias que producen butirato y/o propionato,

b) crecimiento y/o actividad de uno o un numero de microorganismos patogenos. Ejemplos de microorganismos patogenos incluyen, pero no se limitan a Bacillus cereus, Candida albicans, Clostridium perfringens o C. difficile,

c) crecimiento y/o actividad de una o un numero de celulas y lmeas celulares derivadas de las mismas. Los ejemplos de los tipos de celula incluyen, pero no se limitan a enterocitos, celulas epiteliales, celulas endoteliales, celulas dendnticas, monocitos, macrofagos, celulas T y/o celulas B.

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d) sujecion de microorganismos beneficiosos, no patogenos o patogenos a la mucosa de los sistemas antes mencionados,

e) absorcion o liberacion de las moleculas de senalizacion que incluyen, pero no se limitan a los antfgenos, moleculas proinflamatorias y antiinflamatorias, receptores, productos de microorganismos y/o celulas que simulan el hospedante. Los ejemplos de dichas moleculas de senalizacion incluyen, pero no se limitan a anticuerpos, hormonas, citoquinas, lipopolisacarido bacteriano, proglucagon, GLP-1, gLP-2 y/o FIAF,

f) regulacion hacia arriba y hacia abajo de los genes en el nivel de ADN, ARN o protemas por microorganismos y/o celulas que simulan el hospedante,

g) produccion de metabolitos bacterianos espedficos tales como pero que no se limitan a propionato y/o butirato, y/o

h) adaptacion redproca de los tipos de celulas que simulan el hospedante y/o los microorganismos.

El termino "modulacion" incluye, pero no se limita a, un aumento, un estfmulo, una disminucion, una inhibicion o una reduccion.

El termino "senalizacion molecular" incluye, pero no se limita a, cualquier caractenstica, funcion descrita en (e), (f) y (g) anteriormente.

El termino "adaptacion" incluye, pero no se limita a, cualquier cambio en cualquier caractenstica/funcion de interes descrita en (a) a (g) que se produce en una celula, lmea celular y/o microorganismo en respuesta a un cambio en cualquier caractenstica o funcion de interes descrita en (a) a (g) que se produce en cualquier otra celula, lmea celular y/o microorganismo.

El termino "respuesta celular del hospedante" incluye, pero no se limita a cualquier cambio en cualquier caractenstica/funcion de interes descrita en (a) a (g) que se produce en una celula en la camara basal del modulo.

Un elemento como se describe anteriormente o a continuacion se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un microorganismo;

(b) un sustrato;

(c) una sustancia qrnmica;

(d) una celula; y

(e) cualquier combinacion de (a) a (d).

Un ejemplo de un microorganismo incluye, pero no se limita a un virus, una bacteria (probiotica, comensal o patogena), una levadura o un hongo. Un ejemplo de un sustrato incluye, pero no se limita a un producto alimenticio, un prebiotico, un simbiotico o una fibra dietetica. Un ejemplo de una sustancia qrnmica incluye, pero no se limita a una pequena molecula (p. ej., un antibiotico), un peptido, una hormona, una citoquina, un producto proinflamatorio y antiinflamatorio, un producto bacteriano o metabolito o un constituyente vmco. Un ejemplo de una celula incluye, pero no se limita a un enterocito, una celula epitelial, una celula endotelial, una celula dendntica, un monocito, un macrofago y/o un linfocito.

Otro aspecto proporciona el uso del modulo de la invencion o el sistema de la invencion para el estudio y la modulacion de la senalizacion molecular y la adaptacion entre el hospedante simulado y el microorganismo opcionalmente despues de la incorporacion de un elemento.

Otro aspecto proporciona el uso del modulo de la invencion o el sistema de la invencion para el estudio del efecto de un elemento en la flora, en particular en la adherencia de la flora.

Otro aspecto proporciona el uso del modulo de la invencion o el sistema de la invencion para el estudio de la composicion, actividad y adherencia de la flora en diferentes condiciones ambientales.

Otro aspecto proporciona el uso del modulo de la invencion o el sistema de la invencion para el control y la modulacion de la fisiologfa, actividad metabolica o caractensticas probioticas o patogenas de la flora.

Otro aspecto proporciona un metodo que comprende el cultivo de microorganismos en el modulo o sistema antes mencionado y el control o ajuste de las condiciones de cultivo en relacion con el elemento o aspecto funcional y su

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efecto en la flora, en particular en la adherencia de la flora.

Otro aspecto proporciona un metodo que comprende el cultivo de microorganismos y celulas en el modulo o sistema antes mencionado y permite la adaptacion para estudiar el efecto redproco, en particular la adherencia de la flora, y/o la respuesta celular detectable mediante la produccion de un peptido, una hormona, una citoquina y/o un producto proinflamatorio o antiinflamatorio.

Asf, el modulo de adherencia de la invencion cuando se implementa en, por ejemplo, el SHIME o el SHIME extendido se puede utilizar para estudiar los efectos de diferentes factores sobre la composicion, actividades metabolicas y adherencia de la flora gastrointestinal y las celulas hospedantes. Se puede utilizar para estudiar las poblaciones bacterianas mixtas del intestino grueso. Puede proporcionar una referencia reproducible para estudiar la ecologfa del ecosistema intestinal, particularmente los cambios inducidos en la adherencia despues de la perturbacion de la flora por dietas, farmacos y una gran variedad de productos y sustancias qmmicas y los efectos respectivos en cuanto a la respuesta celular del hospedante. Este modulo de adherencia de la invencion cuando se implementa en el SHIME o en el SHIME extendido se puede utilizar para el desarrollo y prueba de alimentos probioticos, prebioticos o simbioticos y sus efectos en la microflora gastrointestinal, en particular sus efectos en la adherencia y en la respectiva respuesta celular del hospedante. Tambien se puede utilizar para evaluar la flora intestinal muestreada de un animal enfermo (p. ej., un mairnfero [p. ej., un humano]) o flora desequilibrada.

Asf, se puede utilizar el modulo de adherencia de la invencion cuando se implementa en el SHIME o el SHIME extendido para mantener una poblacion microbiana que puede servir como inoculo para experimentos de cultivo por lotes de poco tiempo para evaluar, por ejemplo, las caractensticas de la adherencia, la cinetica del crecimiento o la produccion de toxinas de muestras microbianas y para evaluar la respuesta celular del hospedante al retar las celulas in vitro con comunidades microbianas mixtas.

Otro aspecto proporciona el uso del modulo de la invencion o el sistema de la invencion para el estudio del efecto de un elemento en el modulo o el sistema, en particular para evaluar el efecto de diferentes tratamientos que se podnan utilizar para modular la adherencia de su flora, o la respuesta celular del hospedante, y eventualmente tratar al paciente.

Otro aspecto proporciona el uso del modulo de la invencion o el sistema de la invencion para el estudio y el tratamiento de trastornos relacionados con una barrera de mucosa deteriorada, en particular con una adherencia de mucosa deteriorada.

Otro aspecto proporciona un metodo que comprende el cultivo de microorganismos en el modulo o sistema antes mencionado y el control o ajuste de las condiciones de cultivo en relacion con el elemento o aspecto funcional y su efecto en el modulo o el sistema, en particular con respecto a la adherencia de su flora y la respuesta celular del hospedante y su efecto en el modulo o el sistema.

Otro aspecto proporciona un metodo que comprende el cultivo de microorganismos en el modulo o sistema antes mencionado para evaluar el efecto de diferentes tratamientos que se podnan utilizar para modular una barrera de mucosa deteriorada, en particular con una adherencia de mucosa deteriorada y eventualmente tratar al paciente.

El termino "que trata" o "tratamiento" tal como se usa en la presente memoria cubre cualquier tratamiento de una enfermedad y/o afeccion en un animal, especialmente un ser humano, e incluye: (i) prevenir una enfermedad y/o afeccion que ocurre en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad y/o afeccion, pero aun no se le ha diagnosticado que la tiene; (ii) inhibir la enfermedad y/o afeccion, es decir, detener su evolucion; (iii) aliviar la enfermedad y/o afeccion, es decir, provocar la regresion de la enfermedad o afeccion.

La invasion realizada por los antfgenos que causan reacciones alergicas se asocia con una barrera de la mucosa deteriorada. Dichos alergenos pueden comprender ciertas sustancias alimenticias, productos qmmicos y otras moleculas. Asf, en otra realizacion, la presente invencion proporciona el uso del sistema o modulo de adherencia de la invencion en el estudio y el tratamiento de afecciones asociadas con la invasion de antfgenos que provocan reacciones alergicas (p. ej., alergias alimenticias, asma, eczema).

El sistema o modulo de adherencia de la invencion se puede utilizar para evaluar la sujecion de la mucosa y la invasion de los patogenos, tales como ciertas especies de Clostridium, Escherichia, Salmonella, Shigella y Pseudomonas, asf como levaduras tales como Candida albicans y la respuesta celular del hospedante consecuente. Asf, en otra realizacion, la presente invencion proporciona el uso del sistema o modulo de adherencia de la presente invencion en el estudio y tratamiento de afecciones asociadas con la adherencia de mucosa y la invasion de patogenos (p. ej., infecciones vaginales, oculares, auditivas y de las vfas respiratorias, diarrea adquirida y diarrea del turista).

La microbiota intestinal afecta la homeostasis energetica y metabolica del hospedante, es decir, el control de la ingesta alimentaria y energetica, el metabolismo de los alimentos y energetico, el desarrollo de la masa grasa y los trastornos metabolicos asociados, tales como obesidad y diabetes tipo 2 (Cani y Delzenne, 2007). Por lo tanto, una realizacion adicional de la presente invencion proporciona el uso del sistema o modelo de adherencia de la invencion para el estudio y tratamiento de los trastornos metabolicos.

Tambien la enfermedad inflamatoria del intestino (EII) se asocia con una barrera de la mucosa gastrointestinal deteriorada. Generalmente, se acepta que en la EII, la lesion de la mucosa gastrointestinal con una resolucion deteriorada de las lesiones es uno de los elementos clave que conducen a esta indicacion cronica. La EII tambien conocida como "enfermedades cronicas del colon", tal como se usa en la presente incluyen cualquier afeccion 5 caracterizada por lesiones de la mucosa persistentes en diferentes niveles del tracto gastrointestinal, y la reaccion excesiva consiguiente del hospedante, tal como, por ejemplo, el smdrome del intestino irritable, mucositis, ulceras gastricas, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, cancer colorrectal y pouchitis. Por consiguiente, es otra realizacion de la presente invencion proporcionar el uso del modelo de adherencia del sistema de la invencion para el estudio y el tratamiento de enfermedades cronicas del colon.

10 Otro aspecto proporciona un sistema que comprende 3 compartimentos: un lado luminal con la comunidad microbiana, un compartimento basal con las lmeas de celulas hospedantes y, a continuacion de este ultimo, un tercer compartimento que simula el flujo de sangre. Este modulo se puede utilizar para investigar la tasa de absorcion de p. ej. compuestos activos, siguiendo el metabolismo microbiano y la difusion a traves de la capa de mucosidad y la superficie intestinal simulada.

15 Si bien se describen varias realizaciones de la invencion en la presente memoria, se pueden realizar muchas adaptaciones y modificaciones dentro del alcance de la invencion segun el conocimiento general comun de los expertos en esta tecnica. Dichas modificaciones incluyen la sustitucion de equivalentes conocidos para cualquier aspecto de la invencion con el fin de lograr el mismo resultado en substancialmente la misma forma. Los intervalos numericos incluyen los numeros que definen el intervalo. En las reivindicaciones y la descripcion, los terminos "que 20 comprende" y cada ejemplo dado se utilizan como un termino indefinido, sustancialmente equivalente a la frase "que incluye, pero no se limita a".

Los siguientes ejemplos ilustran diferentes aspectos de la invencion y no limitan los aspectos generales de la invencion como se describe en la presente memoria.

Parte experimental

25 1. Configuracion del modelo del TGI

El modulo mas basico de adherencia segun la presente invencion consiste en una camara luminal (compartimento superior) que contiene el medio de cultivo y la/las cepa/cepas bacteriana/bacterianas inoculada/inoculadas y una camara basal (compartimento inferior) en que la presion de oxfgeno se puede regular y del que se permite que se difunda el oxfgeno a traves de una capa de separacion en la camara luminal. La capa de separacion es una 30 membrana semipermeable, que permite la difusion de oxfgeno y las moleculas senal y que en su lado luminal se cubre con una capa de mucosidad artificial, relevante para la region especffica del tracto gastrointestinal. Dicha capa de mucosidad es una capa de mucina-agar de cierto espesor, vertida sobre la parte superior de la membrana utilizando un Aplicador automatico de biopelfculas (Elcometer 4340).

2. Resistencia de la mucosidad a una tension de corte

35 En una primera prueba del modelo del TGI segun la invencion, se evaluo la capacidad de la capa de mucosidad para adherir firmemente a la membrana y ofrecer resistencia a la eliminacion mecanica mediante una tension de corte. Se probaron tres tipos de material de membrana: policarbonato hidrofflico, poliamida y policaprolactona. El ultimo se descarto inmediatamente porque era muy complejo de manejar durante los procedimientos posteriores. Se vertio una capa de mucina-agar de 200 pm en la parte superior de la membrana utilizando un Aplicador automatico de 40 biopelfculas (Elcometer 4340). Se agrego FITC-dextrano (4 KDa) a la capa de mucosidad para su posterior analisis de la integridad de la mucosidad por medio de Microscopfa optica confocal (LSCM, por su sigla en ingles). La capa doble funcional asf formada a continuacion se incorporo en el modulo de adherencia y se aplicaron dos tensiones de corte diferentes (es decir, 10 y 20 dinas/cm2) durante un penodo de 5 horas (T5). El analisis mediante LSCM de la capa de mucosidad en una seccion vertical y la comparacion de T0 con T5 condujo a las siguientes conclusiones: el 45 95 % de la capa de mucosidad original estaba todavfa presente despues de 5 horas en tension de corte media (10

dinas/cm2) y 45 % en tension de corte elevada (20 dinas/cm2) para el policarbonato hidrofflico y la poliamida.

3. Permeacion de los compuestos a traves de la capa doble funcional

La segunda prueba se realizo para evaluar la permeacion a traves de la capa doble funcional (membrana y capa de mucosidad artificial) de diferentes compuestos, simulando posibles metabolitos (de origen procariotico o eucariotico) 50 de diferentes dimensiones y radio molecular. Se utilizaron como compuestos modelo FITC-dextranos- conjugados de 4 kDa, 20 kDa y 150 kDa. Se creo una curva estandar en base a la concentracion molar para cada compuesto. Se evaluo la permeabilidad utilizando una capa doble funcional con una membrana de poliamida (tamano del poro: 0,5 mm) y una membrana de policarbonato (tamano del poro: 0,4 mm). La tabla 2 ofrece los resultados para los diferentes compuestos en el modulo de adherencia con ambos tipos de membrana con y sin una capa de mucosidad 55 de 200 pm.

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Se calculo el coeficiente de permeabilidad segun la siguiente formula

imagen1

donde Cuo.5 y Cu4 son las concentraciones de FITC-dextrano- conjugado en la camara inferior en 0,5 y 4 horas, respectivamente, V* es el volumen de la camara, A es la superficie de la membrana expuesta, C0 es la concentracion inicial en la camara superior y t es la duracion del flujo de estado estable (3,5 horas).

Tabla 2: Permeacion de compuestos a traves de la capa doble funcional. Los datos (coeficiente de permeabilidad) se expresan en cm/seg. NE = no evaluado

Membrana de poliamida Membrana de policarbonato

FITC-dextrano

Sin mucosidad Mucosidad Sin mucosidad Mucosidad

4 kDa

1,5 10'b 3,55 10'6 6,64 10'b 3,96 10'5

20 kDa

NE NE 3,08 10'b 2,55 10'5

150 kDa

4,05 10'6 4,46 10'8 2,53 10'5 4,91 10'6

4. Establecimiento de condiciones microaerofflicas en la capa doble funcional

El modulo de adherencia se construyo con una capa doble funcional separando la camara superior completamente anaerobica (95 % de N2-5 % de CO2) de la camara inferior aerobica (95 % de O2-5 % de CO2). Se midio la concentracion de oxfgeno en la camara superior por medio de una sonda luminiscente de oxfgeno LDO de Hach Lange. Los experimentos se realizaron a temperatura ambiente con una capa de mucosidad de 200 pm de espesor utilizando un policarbonato o una membrana de poliamida. Los datos del aumento de la concentracion de oxfgeno en la camara superior, recopilados en los primeros 30 minutos, se utilizaron para calcular la permeabilidad relativa (Pm02). PMo2 para la membrana de policarbonato resulto ser 4,910-4 cm/seg con un coeficiente de difusion relativa (Do2) de 9,810-6 cm2/seg; y para la poliamida, Pmo2 = 2,5 ■ 10-4 cm/seg, Do2 = 5,0 ■ 10-6 cm2/seg.

5. Potencial de adherencia de cultivos bacterianos puros vs comunidades microbianas mixtas

Un primer objetivo de trabajar con el modulo de adherencia in vitro es explorar el potencial de adherencia de cultivos puros de microorganismos intestinales vs comunidades microbianas mixtas en una capa cubierta de mucosidad. Un cultivo de Lactobacillus rhamnosus GG se cultivo en un medio relevante y se inoculo en la camara luminal del modulo de adherencia. La camara luminal de un segundo sistema se inoculo con una comunidad microbiana adaptada in vitro originada en el colon ascendente de un reactor de Simulador del ecosistema microbiano intestinal humano (SHIME). El modulo de adherencia consistfa en una camara luminal que contiene el medio de crecimiento y la cepa bacteriana inoculada y una camara basal de la que se podna difundir oxfgeno a traves de una membrana de policarbonato semipermeable, que se cubrio en su lado luminal con una capa de mucina, relevante para la region espedfica del tracto gastrointestinal. El tiempo de contacto entre las bacterias inoculadas y la capa funcional se establecio en 1,5 h. A continuacion, se elimino la suspension luminal y se eliminaron las bacterias no adheridas de la capa de mucosidad al enjuagar la capa funcional dos veces con PBS. Posteriormente, el lado luminal de la capa funcional se enjuago con Triton X-100 para eliminar las bacterias adheridas. La suspension obtenida se analizo en cuanto a concentracion microbiana utilizando recuentos por placa espedficos para diferentes grupos bacterianos. Los Lactobacillus rhamnosus GG se adhirieron fuertemente a la capa de mucina-agar, siendo la adherencia porcentual (15,7 ± 3,2 %) un factor 6,19 superior respecto del de adherencia al agar libre de mucina. Con respecto a la compleja comunidad microbiana del reactor SHIME, la adherencia difirio sustancialmente entre las bacterias y disminuyo de lactobacilos totales (27,0 ± 4,1 %) sobre coliformes fecales (18,3 ± 3,6 %), bifidobacterias totales (12,9 ± 1,5%) y clostridios totales (1,8 ± 0,3 %) a anaerobios totales (0,6 ± 0,1%). Si bien no se hizo un analisis adicional en ese momento, tambien se pueden obtener muestras del medio y las celulas opcionalmente presentes de la camara basal y se puede llevar a cabo diversos analisis para estimar la respuesta celular simulada del hospedante.

6. Supervivencia de la lmea celular

Se formo un modulo de adherencia con dos camaras separadas por una membrana semipermeable (es decir, policarbonato, tamano de poro: 0,4 pm) en el que se vertio la capa de mucosidad. Se inoculo el compartimento superior con una comunidad bacteriana del colon ascendente de un simulador dinamico in vitro del tracto gastrointestinal. En el compartimento inferior se permitio que creciera una monocapa pura de celulas Caco-2. El 5 modulo permitio la interaccion indirecta y continua entre la biopelfcula en crecimiento y la monocapa de enterocitos. La membrana semipermeable entre las dos camaras permitio el intercambio de moleculas de senalizacion entre la biopelfcula y las celulas epiteliales, asf como la difusion de O2 hacia la parte inferior de la biopelfcula microbiana.

En una segunda configuracion, se permitio el contacto directo entre la comunidad microbiana derivada del TGI y la lmea celular. Se comparo la viabilidad celular entre ambas configuraciones por medio de la prueba colorimetrica de 10 MTT ((bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) despues de 48 h de incubacion para la primera configuracion y despues de 2 h en la segunda configuracion. Para evaluar posibles fenomenos de citotoxicidad en la camara de enterocitos, se han evaluado diferentes configuraciones (por triplicado): a) incorporacion de una suspension bacteriana no diluida; b) aplicacion de una suspension bacteriana diluida 1:4. Estas dos condiciones en combinacion con: 1) flujo semi-continuo del medio nuevo cada 24 h; 2) flujo semi-continuo del medio nuevo cada 5 h. 15 Como control negativo se volvio a hacer circular una suspension esterilizada con filtro del inoculo bacteriano en el compartimento superior.

Como se muestra en la figura 1, en las condiciones de prueba la viabilidad celular despues de 48 h de incubacion no fue significativamente diferente del control, mientras que, por contacto directo, la viabilidad disminuyo considerablemente ya despues de 2 h. Tambien se evaluo la morfologfa de las celulas por microscopfa de contraste 20 de fase comparando el control con las celulas tratadas despues de 48 h de incubacion, sin embargo, no hubo diferencias entre los controles y las celulas tratadas (no se muestran los datos).

7. Potencial de adherencia de comunidades microbianas mixtas en respuesta a un tratamiento prebiotico a corto plazo

Un segundo objetivo de trabajar con el modulo de adherencia in vitro es explorar el potencial de adherencia de 25 cultivos microbianos seleccionados en presencia de una compleja comunidad microbiana para el fleon terminal y colon respectivamente y evaluar la respuesta celular del hospedante hacia esta comunidad. Para ello, se obtuvieron muestras de y se inoculo una suspension del compartimento del colon ascendente de un sistema SHIME en el compartimento luminal del modulo de adherencia en presencia de inulina con un grado de polimerizacion entre 2 y 20 y arabinoxilanos (AX) con un grado de sustitucion de 0,7 y un grado muy variable de polimerizacion (en promedio 30 200). Se evaluo el efecto a corto plazo de estos alimentos funcionales. AX disminuyo la capacidad de adherencia de

todos los grupos investigados, mientras que la inulina tuvo menos influencia o ninguna influencia (no se muestran los datos).

8. Medir la biodisponibilidad de metabolitos procarioticos y eucarioticos

La configuracion experimental del modulo de adherencia que incorpora una membrana semipermeable ademas de la 35 capa de mucosidad permite no solo la difusion de oxfgeno desde el lado basal hasta el lado luminal, sino tambien el transporte de compuestos espedficos de interes desde el lado luminal hasta el lado basal. En principio, medir estos compuestos de interes en la suspension basal dana una estimacion de la biodisponibilidad de esos compuestos. En este estudio, los autores de la invencion caracterizan los metabolitos procarioticos y eucarioticos en la suspension serosa por medio de la tecnica GC-MS 24 h despues de la inoculacion del dispositivo con una suspension bacteriana 40 que se origina en el colon ascendente de un sistema SHIME (lado luminal) y con celulas Caco-2 (camara inferior). La presencia y la ausencia de bacterias en el compartimento luminal indujeron un perfil metabolico claramente diferente en el compartimento seroso (no se muestran los datos).

9. Evaluacion in vitro durante un penodo mas largo de los compuestos prebioticos en la comunidad microbiana asociada con la pared intestinal humana

45 El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de compuestos prebioticos conocidos (inulina y arabinoxilano-AX) en la microbiota asociada con la pared intestinal en diferentes areas del tracto gastrointestinal y en condiciones representativas a largo plazo. Para ello, se utilizo el modulo de adherencia junto con un modelo gastrointestinal debidamente validado: el Simulador del ecosistema microbiano intestinal humano (SHIME). Claramente, la potencia de adherencia inherente, la tasa de crecimiento espedfico, el estado de la capa de mucosidad y la interaccion con 50 microorganismos endogenos (adheridos o en suspension) determinaron la potencia microbiana para colonizar el epitelio intestinal.

9.1 El SHIME

La configuracion del reactor se adapta desde el sistema, representando el tracto gastrointestinal del humano adulto, tal como lo describe Molly et al. (1993). El SHIME consiste en una sucesion de cinco reactores que simulan las 55 diferentes partes del tracto gastrointestinal humano. Los dos primeros reactores son del principio de llenado y

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drenaje para simular diferentes etapas en la absorcion y la digestion de alimentos, con bombas peristalticas que agregan una cantidad definida de alimentacion SHIME (140 mL 3xMa) y lfquido pancreatico y bilis 60 mL (3xMa), respectivamente al compartimento del estomago (VI) y duodeno (V2) y que vadan los respectivos reactores despues de los intervalos especificados. Los ultimos tres compartimentos son reactores que se revuelven continuamente con volumen constante y control de pH. El tiempo de retencion y el pH de los diferentes recipientes se eligen con el fin de parecerse a las condiciones in vivo en las diferentes partes del tracto gastrointestinal. El tiempo total de residencia de los ultimos tres recipientes, simulando el intestino grueso, es 76 h. Tras la inoculacion con microbiota fecal, estos reactores simulan el colon ascendente (V3), transverso (V4) y descendente (V5). Possemiers et al (2004) describieron previamente la preparacion del inoculo, el tiempo de retencion, el pH, los ajustes de temperatura y la composicion de alimentacion del reactor. En el TWINSHIME, se ejecutan en paralelo dos sistemas con identicas condiciones ambientales (pH y control de la temperatura identicos). Las capacidades investigativas del SHIME luego se expanden con la conexion de dos modulos de adherencia de biopelfculas en paralelo a cada compartimento del intestino delgado. Por ultimo, se agregan 21 perlas liberadoras de oxfgeno, cubiertas con una capa de mucosidad a cada uno de los compartimentos del colon.

9.2. Diseno del experimento para el SHIME:

Penodo de estabilizacion, Los compartimentos del colon de los reactores SHIME primero se inoculan con una comunidad microbiana fecal aislada de un voluntario sano seleccionado. El reactor SHIME funciona en condiciones nominales para estabilizar la comunidad microbiana y para dejar que adapte su actividad metabolica y composicion de comunidad a las condiciones imperantes en los compartimentos respectivos del colon. Este penodo de estabilizacion dura 3 semanas.

Penodo basal: Durante el penodo basal, el reactor SHIME funciona en condiciones nominales. Los parametros tales como la produccion de acido graso de cadena corta (AGCC) y la produccion de amonio se determinan 3 veces/semana y los analisis de recuento por placa se realizan una vez por semana para grupos bacterianos seleccionados ((an)aerobios totales, clostridios totales, lactobacilos, bifidobacterias, coliformes totales, estafilococos). Los resultados de estos analisis sirven como valores de fondo que se utilizaran para comparar los parametros medidos del penodo de tratamiento. Los modulos de adherencia se conectan a los recipientes del intestino delgado y se agregan las perlas en los recipientes del colon. El penodo basal dura 2 semanas.

Penodo de tratamiento: Durante el penodo de tratamiento, el reactor SHIME funciona en condiciones nominales, pero con una dieta modificada que contiene una menor cantidad de almidon en el medio en comparacion con la del penodo basal y se evalua el efecto de un compuesto espedfico (inulina o arabinoxilano - 2,5 g/L). La produccion de AGCC y amonio se determina 3 veces/semana y se realiza el analisis del recuento por placa una vez por semana. Por lo general, este penodo de tratamiento dura 3 semanas.

Penodo de lavado: Durante el penodo de lavado, el reactor SHIME funciona en condiciones nominales, con la dieta inicial. La produccion de SCFA y amonio se determina 3 veces/semana y se realiza el analisis del recuento por placa una vez por semana. El analisis de estos parametros microbianos permite evaluar si los posibles cambios del penodo de tratamiento se normalizan nuevamente para llegar a los niveles del penodo basal.

9.3 Resultados sobre la formacion de biopelfculas:

Cada modulo de adherencia se conecto en paralelo con los reactores del colon ascendente y se sustituyo por uno nuevo cada 24 h (exposicion maxima por membrana = 48 h). Se permitio que el contenido del colon ascendente circule en la capa funcional con un caudal de 10 mL/min. Se evaluo el efecto de los productos evaluados por medio del llamado fndice prebiotico relacionado con la adherencia (AR-PI, por su sigla en ingles) para la comunidad microbiana adherida a la mucina. Los recuentos en placa (realizados antes y despues del tratamiento) sobre los medios espedficos para los lactobacilos, bifidobacterias, clostridios, coliformes fecales y anaerobios totales indicaron que la inulina y AX (arabinoxilano) ejercieron un efecto prebiotico sobre la microbiota adherida a la mucina del SHIME (AR-PI de 14 y 70, respectivamente). AX fue particularmente potente para estimular los lactobacilos adheridos. La electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacion (DGGE, por su sigla en ingles) espedfica para las bifidobacterias demostro que diferentes especies dominaban este grupo microbiano en la fraccion luminal o adherida. En general, el efecto de AX sobre las bacterias luminales y las bacterias asociadas con la mucina fue mas fuerte y mas permanente en comparacion con el de la inulina.

10. Formacion de biopelfculas en el modelo de la mucosa oral

Se formo un modulo de adherencia con dos camaras separadas por una membrana semipermeable (es decir, policarbonato, tamano de poro: 0,4 pm) y sobre la parte superior se vertio la capa de mucosidad y se permitio que creciera la biopelfcula oral. Se inoculo el compartimento superior con una suspension bacteriana obtenida de un exudado bucal de la mejilla interna. En el compartimento inferior se permitio que creciera una monocapa de celulas TR146 epiteliales orales. El modulo permitio la interaccion indirecta y continua entre el la biopelfcula en crecimiento y la monocapa epitelial. La membrana semipermeable entre las dos camaras permitio el intercambio de moleculas de senalizacion entre la biopelfcula y las celulas epiteliales, asf como la difusion de O2 hacia la parte inferior de la

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biopelfcula microbiana. Se evaluo la viabilidad de la monocapa de TR146 en presencia o ausencia de la biopelfcula oral por medio de la prueba colorimetrica de MTT ((bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio). La figura 6 muestra que la presencia de la capa de mucina es cntica para la supervivencia a largo plazo (55 horas de tratamiento) del epitelio oral en presencia de la biopelfcula oral.

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Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Un modulo de adherencia que comprende 2 compartimentos separados por una membrana semipermeable; presentando dicha membrana una capa de mucosidad artificial aplicada en su sitio luminal; y dicho modulo caracterizandose por tener condiciones anaerobicas en su lado luminal y condiciones aerobicas en su lado basal; en las que el compartimento basal del modulo comprende celulas viables y en las que uno o mas microorganismos se pegan a dicha capa de mucosidad artificial.
2. 2. El modulo de la reivindicacion 1 en el que la capa de mucosidad comprende al menos una mucina y el espesor de la capa es entre 1 y 1000 pm.
3. 3. El modulo de la reivindicacion 1 o 2 en el que las condiciones aerobicas en el compartimento basal del modulo deriva en una presion parcial de oxfgeno, en el lado basal de la capa de mucosidad entre 1 y 150 mmHg, en particular entre 1 y 45 mmHg.
4. 4. El modulo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la membrana semipermeable permite el transporte de los componentes entre 1-100.000 Da, en particular entre 1-10.000 Da.
5. 5. El modulo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el material de la membrana semipermeable es policarbonato, poli(cloruro de dialildimetilamonio), tereftalato de polietileno o poliamida (nailon).
6. 6. El modulo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que ademas comprende una capa porosa de apoyo en el lado basal de dicha membrana semipermeable.
7. 7. El modulo de la reivindicacion 6 en el que el material de la capa porosa de apoyo es poli(cloruro de dialildimetilamonio), poli(acido acnlico) o combinaciones de los mismos.
8. 8. El modulo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que las celulas comprenden las celulas Caco-2 y/o las celulas HT29.
9. 9. El modulo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que las celulas crecen en una monocapa con su lado apical hacia la membrana semipermeable.
10. 10. El modulo como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que el lado apical de las celulas esta cubierto con una malla protectora.
11. 11. El modulo como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el que el modulo comprende perlas, que tiene desde adentro hacia afuera, una perla de apoyo interna, una membrana semipermeable y una capa de mucosidad artificial.
12. 12. El modulo segun la reivindicacion 11, en el que las perlas tienen un radio entre 500 pm y 1 cm, en particular entre 500 pm y 5 mm.
13. 13. El modulo de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12 en el que la capa interna de apoyo comprende componentes de oxfgeno de liberacion lenta de bioqmmicos o en el que la capa interna de apoyo esta cubierta con una capa intermedia que contiene componentes de oxfgeno de liberacion lenta de bioqmmicos.
14. 14. El modulo como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la superficie de la capa de mucosidad artificial es entre 1 cm2 y 200 cm2.
15. 15. El modulo como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la superficie de la capa de mucosidad artificial es entre 1 cm2 y 1000 cm2, en particular entre 1 cm2 y 100 cm2.