ES2616790T3

ES2616790T3 - Proceso para producir ácidos dicarboxílicos empleando células fúngicas

Info

Publication number: ES2616790T3
Application number: ES12734871.2T
Authority: ES
Inventors: Mickel Leonardus August Jansen; Johannes Joseph Heijnen; René VERWAAL
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2011-07-01
Filing date: 2012-07-02
Publication date: 2017-06-14
Anticipated expiration: 2032-07-02
Also published as: BR112013033760A2; WO2013004670A1; CA2840773A1; PL2726624T4; CA2840773C; US9624514B2; PL2726624T3; BR112013033760B1; EP2726624A1; US20140342416A1; EP2726624B1

Abstract

Proceso para producir un ácido dicarboxílico, que comprende fermentar una célula fúngica en un recipiente que comprende un medio adecuado de fermentación, que comprende añadir un gas que comprende del 21 al 35% v/v de oxígeno y menos del 0,1% v/v de dióxido de carbono al medio de fermentación, y mantener una presión parcial promedio de dióxido de carbono de al menos 35 kPa (0,35 bar) en el medio de fermentación, y producir el ácido dicarboxílico, en el que el gas es aire enriquecido con oxígeno.

Description

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solicitud de patente WO2008/000632. Los genes sintéticos estaban bajo el control de (o unidos de forma funcional a) promotores fuertes de S. cerevisiae, es decir el promotor TDH3 que controla la expresión del gen MDH3, el promotor TPI1 que controla el gen FUMR y el promotor ENO1 que controla el gen SpMAE1. La terminación apropiada estaba controlada por secuencias terminadoras de S. cerevisiae, es decir, el terminador TDH3 que controla el gen MDH3, el terminador PMA1, presente en el plásmido pPWT006, que controla el gen PCKa, y el terminador ENO1 que controla el gen SpMAE1. La secuencia de promotor TDH3; gen MDH3; terminador TDH3 estaba rodeada por los sitios de enzimas de restricción únicos MluIy ApaI. La secuencia de promotor TPI1, gen FUMR estaba rodeada por los sitios de enzimas de restricción únicos ApaI, AscIy NotI en el extremo 5' y BsiWI en el extremo 3'. La secuencia de promotor ENO1; gen SpMAE1; terminador ENO1 estaba rodeada por los sitios de enzimas de restricción únicos MluI y ApaI. La clonación de la construcción sintética MDH3 en pPWT007 digerida con MluIy ApaI produjo el plásmido intermedio pPWT007-MDH3. La clonación de la construcción sintética FUMR en pPWT007-MDH3 digerida con ApaI y BsiWI produjo el plásmido pSUC046. La clonación de la construcción sintética SpMAE1 en pSUC046 digerida con AscIy NotI produjo el plásmido pSUC047 (SEQ ID NO: 2, figura 4).

El plásmido pBOL034 (figura 5), que consiste en una secuencia promotora YOL086C (ADH1) de 1000 pb (1000 pb directamente cadena arriba del codón de inicio de YOL086C), una secuencia terminadora YOL086C (ADH1) de 500 pb (500 pb directamente cadena abajo del codón de parada) y las secuencias génicas insertadas, se usó como vector hospedador para construir pSUC091 (figura 6). Se obtuvo un fragmento de PCR de promotor URA3; gen URA3; terminador URA3 usando el plásmido pRS416 como molde (Sikorski RS, Hieter P. 1989 mayo; 122(1):19-27). Los cebadores contenían sitios apropiados de enzimas de restricción, MluI para le cebador directo y BsrGI para el cebador inverso, para la subclonación adicional del fragmento de PCR. La secuencia génica que codifica la piruvato carboxilasa (PYC2) de S. cerevisiae, como se describe en la solicitud de patente WO2009/065780, se sintetizó por GeneArt (Regensburg, Alemania). Se sintetizó una secuencia específica de promotor; gen; terminador, incluyendo sitios de restricción apropiados. La secuencia génica se optimizó en los pares de codones para su expresión en S. cerevisiae como se describe en la solicitud de patente WO2008/000632. El gen sintético estaba bajo el control de (o unido de forma funcional a) un promotor fuerte de S. cerevisiae, es decir, el promotor PGK1 que controla la expresión del gen PYC2. La terminación apropiada estaba controlada por una secuencia terminadora de S. cerevisiae, es decir, el terminador PGK1 que controla el gen PYC2. La secuencia de promotor PGK1; gen PYC2; terminador PGK1 estaba rodeada por los sitios de enzimas de restricción únicos StuIy MluI. Después de la restricción de pBOL034 con BsrGI, PsiIy SnaBI, la restricción del fragmento de PCR URA3 con MluIy BsrGI y la secuencia de promotor PGK1, gen PYC2, terminador PGK1 con StuIy MluI, los tres fragmentos de ADN se ligaron por un ligamiento de 3 puntos para producir el plásmido pSUC091 (SEQ ID NO: 3, figura 6).

El plásmido pSUC111 usado para la integración de los genes sintéticos de la isocitrato liasa y malato sintasa, se construyó del siguiente modo. El plásmido p417-CYC (vector lanzadera de levadura-E. coli que contiene un marcador KanMX funcional en levadura, Dualsystems Biotech AG, Schlieren, Suiza) se restringió con XbaIlEcoRV, en que se ligó una construcción sintética de INT5'-repetición-LoxP-Amds (parcial) restringida con XbaI/SwaI, produciendo el plásmido pBOL267 (figura 7). La construcción sintética se sintetizó por GeneArt (Regensburg, Alemania).

Los genes que codifican la isocitrato liasa (KIICL1) de Kluyveromyces lactis y la malato sintasa (MLS1) de S. cerevisiae como se describe en la solicitud de patente WO2009/101180, se sintetizaron por Sloning (Puchheim, Alemania). Se sintetizaron las secuencias específicas de promotor; gen; terminador, incluyendo sitios de restricción apropiados. Las secuencias se optimizaron en los pares de codones para su expresión en Saccharomyces cerevisiae como se describe en la solicitud de patente WO2008/000632. Los genes sintéticos estaban bajo el control de (o unidos de forma funcional a) promotores fuertes de S. cerevisiae, es decir, el promotor TDH1 que controla la expresión del gen KIICL1, y el promotor TDH3 que controla la expresión del gen MLS1. La terminación apropiada estaba controlada por una secuencia terminadora de S. cerevisiae, es decir, el terminador TDH1 que controla el gen KIICL1 y el terminador TDH3 que controla la expresión del gen MLS1.

Las construcciones de los genes sintéticos KIICL1 y MLS1 se ligaron en el plásmido pBOL267 produciendo el plásmido pSUC111 (SEQ ID NO: 4, figura 8).

El plásmido pBOL268 (SEQ ID NO: 5, figura 9) también es necesario para integrar las construcciones de los genes sintéticos KIICL1 y MLS1 en el locus INT. Los plásmidos pSUC111 y pBOL268 contienen una secuencia amdS parcial que quedará funcional después de la transformación con la parte restante de una secuencia amdS parcial, como se explica en la sección 1.2 y en la figura 11. Para obtener un gen amdS funcional, y para permitir la selección del crecimiento en acetamida como única fuente de nitrógeno, el plásmido restringido pSUC111 tiene que transformarse con el plásmido restringido pBOL268. El plásmido pBOL268 se construyó del siguiente modo. El plásmido p417-CYC (vector lanzadera de levadura-E. coli que contiene un marcador KanMX funcional en levaduras, Dualsystems Biotech AG, Schlieren, Suiza) se restringió con SalI/SmaI, en que se ligó una construcción sintética de Amds (parcial)-LoxP-repetición-INT3' restringida con SalI/Swal, produciendo el plásmido pBOL268 (figura 9). La construcción sintética se sintetizó por GeneArt (Regensburg, Alemania).

Para remplazar el gen sintético SpMAE1 integrado en el ADN genómico por la secuencia DCT_02, se creó el plásmido pSUC174. La secuencia DCT_02 codifica un transportador putativo de ácido dicarboxílico (SEQ ID NO: 6)

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siembra de 20 metros cúbicos, que se prepara en un medio con la composición de la tabla 2. Para obtener la semilla para la fermentación de 20 metros cúbicos, se realiza una fermentación de 2 metros cúbicos desde una fermentación en matraz de agitación.

5 Durante la fermentación 3) se rocían 0,039 vvm de aire al fermentador (volumen de partida 200 m3). Durante la fermentación 4) se rocían 0,027 vvm de aire enriquecido con oxígeno (O2 al 10%, aire al 90%) al fermentador (volumen de partida 200 m3). Durante la fermentación 3) se asume una presión del espacio vacío de 150 kPa (1,5 bar) absoluta; durante la fermentación 4) se asume una presión del espacio vacío de 250 kPa (2,5 bar) absoluta.

10 Durante las cuatro fermentaciones, la pO2 se controla al 5% ajustando la velocidad del agitador.

Resultados

Se calculó que el rendimiento de ácido succínico (Yps) en atmósfera de aire (el gas de entrada es aire) con presión

15 aumentada (presión promedio absoluta de 300 kPa (3,0 bar) en el fermentador) y en atmósfera de oxígeno aumentado (aire enriquecido con oxígeno) combinada con presión aumentada (presión promedio absoluta de 200 kPa (2,0 bar) en el fermentador) es casi el doble de elevado en comparación con el rendimiento en aire al 100%, y similar al rendimiento en condiciones de CO2 al 50% v/v (fermentación 2, tabla 4).

20 La fermentación 1) y 2) se basan en resultados experimentales, la fermentación 3) y 4) se basan en cálculos teóricos.

Los resultados muestran que una presión parcial de dióxido de carbono (pCO2) suficiente es necesaria para un rendimiento apropiado de ácido succínico (Yps). La pCO2 se calcula basándose en la fracción de oxígeno convertida

25 (recogida por las células y convertida a CO2 en cantidades equimolares) en el gas entrante multiplicada por la presión local presente. Se asumen que la captación de oxígeno por las células está en el mismo intervalo que la transferencia de oxígeno al caldo de fermentación. La transferencia de oxígeno se calcula basándose en la geometría del fermentador (relación de altura sobre diámetro) y el agitador, la composición del gas y el flujo del gas entrante, y la potencia de entrada del agitador.

30 Tabla 4. Efecto de la composición del flujo entrante de gas sobre el rendimiento de producción de ácido succínico (Yps), medido después de 42 h de fermentación.

Fermentación: Condición %de O2 en el gas entrante Presión promedio en el fermentador (kPa (bar) absoluta) pCO2 (kPa (bar)) Yps (g/g)

Experimental

1: Aire al 100% 21 100 (1) 4 (0,04) 0,24

2: Aire al 50%, CO2 al 50% 10,5 100 (1) 50 (0,50) 0,41

Calculado teóricamente

3: Aire al 100% 21 300 (3,0) 47 (0,47) 0,4

4: Aire al 90%, O2 al 10% 28 200 (2,0) 46 (0,46) 0,4

Ejemplo 3: Producción de ácido succínico por levaduras en presencia de flujo de gas de diferentes 35 composiciones y diferentes presiones

La cepa de levadura SUC-632 construida como se ha descrito anteriormente, se cultivó en un recipiente de acero inoxidable (6 kg) durante 4 días a 30ºC (colocado en baño de agua). Para la aireación y la mezcla apropiada, se suministraron 18 Nl/min de aire al recipiente. El medio estaba basado en medio Verduyn (Verduyn C, Postma E,

40 Scheffers WA, Van Dijken JP. Yeast, 1992 julio; 8(7):501-517), pero se hicieron modificaciones en la fuente de carbono y nitrógeno como se describe en este documento a continuación.

Tabla 5. Composición del medio precultivo

Materia prima: Concentración (g/l)

Galactosa: C6H12O6 · H2O 20,0

Urea: (NH2)2CO 2,3

Dihidrogenofosfato potásico: KH2PO4 3,0

Sulfato de magnesio: MgSO4 · 7H2O 0,5

Solución de elementos trazaa: 1

Solución de vitaminasb: 1

aSolución de elementos traza

Componente: Fórmula Concentración (g/kg)

EDTA: C10H14N2Na2O8 · 2H2O 15,00

Sulfato de zinc · 7H2O: ZnSO4 · 7H2O 4,50

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Cloruro de manganeso · 2H2O: MnCl2 · 2H2O 0,84

Cloruro de cobalto (II) · 6H2O: CoCl2 · 6H2O 0,30

sulfato de cobre (II) · 5H2O: CuSO4 · 5H2O 0,30

Sodio molibdeno · 2H2O: Na2MoO4 · 2H2O 0,40

Cloruro cálcico · 2H2O: CaCl2 · 2H2O 4,50

Sulfato de hierro · 7H2O: FeSO4 · 7H2O 3,00

Ácido bórico: H3BO3 1,00

Yoduro potásico: KI 0,10

bSolución de vitaminas

Componente: Fórmula Concentración (g/kg)

Biotina (D-): C10H16N2O3S 0,05

Pantotenato de Ca D(+): C18H32CaN2O10 1,00

Ácido nicotínico: C6H5NO2 1,00

Mio-inositol: C6H12O6 25,00

Clorhidrato de cloruro de tiamina: C12H18Cl2N4OS · xH2O 1,00

Clorhidrato de piridoxol: C8H12ClNO3 1,00

Ácido p-aminobenzoico: C7H7NO2 0,20

Posteriormente, se transfirió el contenido del recipiente de acero inoxidable a un fermentador de siembra (volumen de partida 4,0 m3), que contenía el siguiente medio:

Tabla 6. Composición del medio del fermentador de siembra

Materia prima: Concentración (g/l)

Sulfato de amonio: (NH4)2SO4 1,0

Dihidrogenofosfato potásico: KH2PO4 10

Sulfato de magnesio: MgSO4 · 7H2O 5,0

Solución de elementos traza: 8,0

Solución de vitaminas: 8,0

El pH se controló a 5,0 por la adición de amoniaco al 20%. La temperatura se controló a 30ºC. La pO2 se controló al 10 20% ajustando la velocidad del agitador. La concentración de glucosa se mantuvo limitada por el suministro controlado al fermentador (se aplicó un exponente de 0,1).

Después de 70 horas de fermentación se transfirieron 4,7 m3 del fermentador de siembra a un fermentador de producción (volumen de partida 55 m3), que contenía el siguiente medio: 15 Tabla 7. Composición del medio del fermentador de producción

Materia prima: Concentración (g/l)

Urea: (NH2)2CO 1,0

Dihidrogenofosfato potásico: KH2PO4 3:0

Sulfato de magnesio: MgSO4 · 7H2O 0,5

Solución de elementos traza: 1

Carbonato cálcico: CaCO3 4

Biotina: 0,001

Sulfato de hierro: FeSO4 · 7H2O 0,006

No se aplicó control del pH durante toda la fermentación. El CaCO3 añadido causó tamponación inicial del pH a aproximadamente 5-5,5. Posteriormente, el pH bajó por acidificación natural hacia un pH de 3 al final de la 20 fermentación. La temperatura se controló a 30ºC. La concentración de glucosa se mantuvo limitada por el suministro controlado al fermentador (0-24 h: 3,0 g/l/h; >24 h: 2,1 g/l/h o se adapta si es necesario).

Se realizaron tres fermentaciones de producción diferentes como se ha descrito anteriormente en presencia de diferentes flujos de gas y composiciones:

25 Durante la fermentación 1) se rociaron 0,035 vvm de gas total (concentración del 30% de O2) al fermentador, se aplicó sobrepresión extra de 40 kPa (0,4 bar) (140 kPa (1,4 bar) absoluta) sobre el espacio vacío. Durante la fermentación 2) se rociaron 0,018 vvm de gas total (concentración del 41% de O2) al fermentador, se aplicó sobrepresión extra de 40 kPa (0,4 bar) (140 kPa (1,4 bar) absoluta) sobre el espacio vacío.

30 Durante la fermentación 3) se rociaron 0,031 vvm de gas total (concentración del 29% de O2) al fermentador, se aplicó sobrepresión extra de 90 kPa (0,9 bar) (190 kPa (1,9 bar) absoluta) sobre el espacio vacío.

Durante las cuatro fermentaciones, la pO2 se controla al 5% ajustando la velocidad del agitador.

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Claims

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