ES2811926T3 - Transformante, procedimiento de producción del mismo y procedimiento de producción de ácido dicarboxílico C4 - Google Patents

Abstract

Un transformante que comprende uno o más genes extraños de uno o más tipos seleccionados del grupo que consiste en un gen de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y un gen de piruvato carboxilasa que se incorporan en un cromosoma de Schizosaccharomyces pombe como hospedador, en el que se ha eliminado o desactivado un gen que codifica piruvato descarboxilasa 2 en el hospedador, el gen de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 94 a 113, o un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia igual o superior al 80 % con una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 94 a 113 y tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, el gen de piruvato carboxilasa codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 16, o un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia igual o superior al 80 % con una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 16 y tiene actividad de piruvato carboxilasa, y se ha eliminado o desactivado adicionalmente un gen que codifica la enzima málica 2 en el hospedador.

Description

DESCRIPCIÓN

Transformante, procedimiento de producción del mismo y procedimiento de producción de ácido dicarboxílico C4 Campo técnico

[0001] La presente solicitud describe un transformante, un procedimiento para fabricar el mismo y un procedimiento para fabricar un ácido dicarboxílico que tiene 4 átomos de carbono (ácido dicarboxílico C4). Más específicamente, la presente solicitud describe un transformante, que se obtiene mediante la incorporación de uno o más genes extraños de uno o más tipos seleccionados del grupo que consiste en un gen de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (denominada en lo sucesivo PCK), un gen de la piruvato carboxilasa (denominada en lo sucesivo también PYC) y un gen de la malato deshidrogenasa (denominada en lo sucesivo también MDH) en Schizosaccharomyces pombe (denominada en lo sucesivo también S. pombe) y en el que algunos de los genes en un grupo de genes codificantes de la piruvato descarboxilasa (denominada en lo sucesivo, también PDC) y genes de la enzima málica (denominada en lo sucesivo, también MAE) se han sometido a eliminación o desactivación, un procedimiento para fabricar el transformante y un procedimiento para fabricar un ácido dicarboxílico C4 en el que el transformante se cultiva en una solución de cultivo y se obtiene un ácido dicarboxílico C4 de la solución de cultivo. Antecedentes de la técnica

[0002] El ácido málico (HOOCCH(OH)CH²COOH) es un ácido dicarboxílico que consiste en 4 átomos de carbono (ácido dicarboxílico C4). En general, el ácido málico se fabrica comercialmente mediante síntesis química a partir de materias primas derivadas del petróleo o mediante fermentación microbiana a partir de materias primas renovables.

[0003] Se sabe que muchos microorganismos naturales o genéticos recombinantes son capaces de producir ácido málico como los principales organismos fermentativos. Por ejemplo, como un procedimiento para utilizar microorganismos de tipo salvaje, se ha descrito un procedimiento para producir ácido málico mediante el cultivo de Aspergillus flavus (documento no relacionado con patentes 1) y Penicillium sclerotiorum (documento no relacionado con patentes 2).

[0004] Con respecto a un microorganismo cuya capacidad de producción de ácido málico mejora mediante recombinación génica, el documento de patente 1 describe que una capacidad de producción de ácido dicarboxílico C4 mejora mediante la introducción de un transportador de ácido dicarboxílico C4 en bacterias filamentosas tales como Aspergillus oryzae.

[0005] En el documento de patente 2, el ácido málico se produce mediante el uso de un transformante que se obtiene mediante la eliminación de un gen PDC de Saccharomyces cerevisiae y la introducción de un gen PYC o un gen de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (denominada en lo sucesivo también PCK), un gen MDH y un gen de la proteína transportadora de ácido málico en la Saccharomyces cerevisiae.

[0006] En el documento no relacionado con patentes 3, el ácido málico se produce usando un transformante que se obtiene eliminando un gen PDC de Saccharomyces cerevisiae e introduciendo un gen PYC, un gen MDH y un gen de la proteína transportadora de ácido málico en la Saccharomyces cerevisiae. En el documento de patente 3, el ácido málico se produce utilizando un transformante que se obtiene eliminando un gen enzimático PDC, un gen de la piruvato quinasa (PYK) y un gen de la hexoquinasa (HXK) de Saccharomyces cerevisiae e introduciendo un gen PYC, un gen MDH, un gen de la proteína transportadora de ácido málico y un gen PCK en la Saccharomyces cerevisiae.07 [0007] En el documento no relacionado con patentes 4, se fabrica un transformante cuya capacidad de producción de ácido málico mejora mediante la desactivación de una pluralidad de enzimas en E. coli que están implicadas en vías distintas a una vía a través de la cual se produce ácido málico a partir de ácido pirúvico. El documento no relacionado con patentes 4 describe que entre una cepa de eliminación de un gen de la enzima málica maeB y una cepa de no eliminación de este, la cepa de no eliminación del gen maeB tiene una mayor tasa de producción de ácido málico. El gen maeB de E. coli corresponde a un gen de la enzima málica mae2 de S. pombe. Lista de referencias

Bibliografía de patentes

[0008]

[Documento de patente 1] Traducción al japonés publicada n.° 2013-503631 de la publicación internacional PCT [Documento de patente 2] Traducción al japonés publicada n.° 2009-516526 de la publicación internacional PCT [Documento de patente 3] Publicación Internacional PCT n.° WO2009/011974

Bibliografía no relacionada con patentes

[Documento no relacionado con patentes 1] Battat y col., Biotechnology and Bioengineering, 1991, vol. 37, págs.

1108-1116.

[Documento no relacionado con patentes 2] Wang y col., Bioresource Technology, 2013, vol. 143, págs. 674-677.

[Documento no relacionado con patentes 3] Zelle y col., Applied and Environmental Microbiology, 2008, vol. 74, págs. 2766-2777.

[Documento no relacionado con patentes 4] Zhang y col., Applied and Environmental Microbiology, 2011, vol. 77, págs. 427-434.

Resumen de la invención

Problema técnico

[0010] Todos los transformantes descritos en los documentos de patente 1 a 3 y en los documentos no relacionados con patentes 3 y 4 tienen una tasa de producción de ácido málico inferior a 1,0 g/(lh). Por lo tanto, se desea el desarrollo de un microorganismo que tenga una mayor capacidad de producción de ácido málico.

[0011] Un objeto de la presente invención es proporcionar un transformante de Schizosaccharomyces pombe, que puede producir de manera excelente un ácido dicarboxílico C4 a través de fermentación microbiana a partir de materias primas renovables. También se describe un procedimiento para fabricar el transformante.

[0012] Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para fabricar un ácido dicarboxílico C4 que incluye ácido málico mediante el uso del transformante.

Solución al problema

[0013] Un transformante según la presente invención es un transformante que utiliza Schizosaccharomyces pombe como hospedador y, en el que se incorporan uno o más genes extraños de uno o más tipos seleccionados del grupo que consiste en un gen de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y un gen de la piruvato carboxilasa, y en el que algunos de los genes en un grupo de genes codificantes de la piruvato descarboxilasa del hospedador de Schizosaccharomyces pombe se han sometido a eliminación o desactivación. El gen de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO:94 a 113, un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos obtenida mediante la sustitución, adición o eliminación de uno o una pluralidad de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO:94 a 113 y tiene una actividad de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, o un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia igual o superior al 80 % con una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO:94 a 113 y tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, el gen de la piruvato carboxilasa codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO:1 a 16, un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos obtenida mediante la sustitución, adición o eliminación de uno o una pluralidad de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO:1 a 16 y tiene actividad de piruvato carboxilasa, o un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia de igual o superior al 80 % con una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO:1 a 16 y tiene actividad de piruvato carboxilasa, y los genes codificantes de la piruvato descarboxilasa que se han sometido a eliminación o desactivación son genes pdc2.

[0014] Es preferible que uno o más genes extraños de la malato deshidrogenasa se incorporen adicionalmente al transformante según la presente invención.

[0015] Es preferible que en el transformante, los genes de la malato deshidrogenasa sean genes que codifican un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO:17 a 21, un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos obtenida mediante la sustitución, adición o eliminación de uno o una pluralidad de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO:17 a 21 y tiene actividad de malato deshidrogenasa, o un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que comparte identidad de secuencia igual o superior al 80 % con una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO:17 a 21 y tiene actividad de malato deshidrogenasa.

[0016] Es preferible que, en el transformante, los genes de la enzima málica también se hayan sometido a eliminación o desactivación.

[0017] Es preferible que en el transformante se incorporen uno o más genes extraños de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa o uno o más genes extraños de la piruvato carboxilasa y uno o más genes extraños de la malato deshidrogenasa, y todos los genes pdc2 y el gen de la enzima málica se hayan sometido a eliminación o desactivación.

[0018] En el transformante según la presente invención, los genes extraños se incorporan en un cromosoma del hospedador.

[0019] Un procedimiento para fabricar un ácido dicarboxílico que tiene 4 átomos de carbono según la presente invención incluye cultivar el transformante en una solución de cultivo y obtener un ácido dicarboxílico que tiene 4 átomos de carbono del transformante cultivado o un sobrenadante de cultivo.

[0020] Es preferible que en el procedimiento para fabricar un ácido dicarboxílico que tiene 4 átomos de carbono según la presente invención, el ácido dicarboxílico que tiene 4 átomos de carbono sea ácido málico o ácido oxaloacético.

[0021] Es preferible que en el procedimiento para fabricar un ácido dicarboxílico que tiene 4 átomos de carbono según la presente invención, el cultivo continúe incluso después de que el pH de la solución de cultivo sea igual o inferior a 3,5. La invención está definida por las reivindicaciones.

Efectos ventajosos de la invención

[0022] El transformante de Schizosaccharomyces pombe según la presente invención puede producir un ácido dicarboxílico C4 que incluye ácido málico a una tasa de producción alta que no se logró en la técnica relacionada.

[0023] El transformante se puede obtener de una manera más simple mediante el procedimiento para fabricar un transformante.

[0024] El procedimiento para fabricar un ácido dicarboxílico C4 según la presente invención hace posible fabricar un ácido dicarboxílico c4 con mayor capacidad de producción mediante fermentación microbiana.

Breve descripción de los dibujos

[0025]

La figura 1 es una vista que muestra una constitución de un vector recombinante integrador monodentado pSMh. La figura 2 es una vista que muestra valores relativos de una cantidad de expresión de PYC de 16 tipos de transformante en los que se introduce un gen PYC.

La figura 3 es una vista que muestra la actividad de PYC relativa por líquido enzimático (mU/ml) de 8 tipos de transformante en los que se introduce un gen PYC.

La figura 4 es una vista que muestra valores relativos de una cantidad de expresión de MDH de 5 tipos de transformante en los que se introduce un gen MDH.

La figura 5 es una vista que muestra la actividad de MDH por líquido enzimático (mU/ml) de 3 tipos de transformante en los que se introduce un gen MDH.

La figura 6 es una vista que muestra cómo una concentración de glucosa (g/l), una concentración de etanol (g/l) y una concentración de ácido málico (g/l) de una cepa de tipo salvaje (cepa ARC010) cambian con el tiempo. La figura 7 es una vista que muestra cómo una concentración de glucosa (g/l), una concentración de etanol (g/l) y una concentración de ácido málico (g/l) de una cepa ASP4590 (Apdc2) cambian con el tiempo.

La figura 8 es una vista que muestra cómo una concentración de glucosa (g/l), una concentración de etanol (g/l) y una concentración de ácido málico (g/l) de una cepa ASP4491 (Apdc2, ScePYC, DacMDH) cambian con el tiempo.

La figura 9 es una vista que muestra cómo una concentración de glucosa (g/l), una concentración de etanol (g/l) y una concentración de ácido málico (g/l) de una cepa ASP4964 (Apdc2, Amae2, ScePYC, DacMDH) cambian con el tiempo.

La figura l0 es una vista que muestra cómo una concentración de glucosa (g/l), una concentración de etanol (g/l) y una concentración de ácido málico (g/l) de una cepa ASP4933 (Apdc2, Afuml, ScePYC, DacMDH) cambian con el tiempo.

La figura l1 es una vista de cómo una concentración de glucosa (g/l) y una concentración de ácido málico (g/l) de una solución de cultivo de cada una de una cepa ASP4491 y una cepa ASP4892 cambian con el tiempo.

La figura 12 es una vista que muestra valores relativos de una cantidad de expresión de PCK de 20 tipos de transformante en los que se introduce un gen PCK.

Descripción de las realizaciones

[Gen recombinante]

[0026] El transformante según lo descrito en esta invención es un transformante que utiliza Schizosaccharomyces pombe como hospedador, en el que se incorporan uno o más genes extraños seleccionados del grupo que consiste en un gen de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PCK) y un gen de la piruvato carboxilasa (PYC), y en el que algunos de los genes en genes codificantes de la piruvato descarboxilasa del grupo génico del hospedador de Schizosaccharomyces pombe se han sometido a eliminación o desactivación.

[0027] En la presente invención y la memoria descriptiva de la presente solicitud, un gen extraño significa un gen estructural que no es un gen estructural inherente a un hospedador (un gen estructural contenido en un cromosoma de un hospedador de tipo natural que no ha experimentado transformación) sino un gen estructural introducido en un hospedador a través de una operación de transformación o similar. Un gen inherente a un hospedador también se incluye en un gen extraño de la presente invención siempre y cuando el gen se introduzca en el hospedador a través de una operación de transformación o similar.

[0028] El ácido oxaloacético es una especie de ácido dicarboxílico C4. En S. pombe, el ácido oxaloacético es importante como materia prima para la síntesis de otros ácidos dicarboxílicos C4 tales como ácido málico. En S. pombe de tipo salvaje, el ácido oxaloacético se sintetiza principalmente a través de una vía en la que el ácido oxaloacético se sintetiza directamente a partir del ácido fosfoenolpirúvico mediante PCK y se sintetiza mediante PYC a través del ácido pirúvico. Por lo tanto, si se mejoran la actividad de PCK y la actividad de PYC, se podría aumentar una cantidad de ácido oxaloacético producido a partir de S. pombe.

[0029] El ácido pirúvico es importante en la fermentación de etanol. El ácido pirúvico se convierte en acetaldehído por la piruvato descarboxilasa, y a continuación el acetaldehído se convierte en etanol por la alcohol deshidrogenasa. Es decir, debido a que el ácido pirúvico se utiliza como materia prima de la fermentación de etanol, con el fin de aumentar una cantidad de ácido oxaloacético producido, no sólo es necesario mejorar la actividad de PCK y PYC, sino también la inhibición de la fermentación de etanol.

[0030] En el transformante según la presente invención, se incorpora al menos uno de los genes extraños que incluyen el gen PCK y el gen PYC. Además, en el transformante según la presente invención, al menos una de la actividad de PCK y la actividad de PYC se mejora, algunos o los genes en un grupo de genes codificantes de la piruvato descarboxilasa se han sometido a eliminación o desactivación y se reduce la eficiencia de fermentación de etanol.

[0031] Es decir, en el transformante según la presente invención, se inhibe la fermentación de etanol y se aumenta una cantidad de ácido pirúvico utilizable como matriz de PYC. Por lo tanto, el transformante tiene una excelente capacidad de producción de ácido oxaloacético y una excelente capacidad de producción de otros ácidos dicarboxílicos C4 sintetizados a partir de ácido oxaloacético.

[0032] En S. pombe de tipo salvaje, a través de una vía en la que el ácido pirúvico aeróbico se convierte en acetil CoA, ácido cítrico, ácido succínico y similares, el ácido málico se produce a través de la hidratación del ácido fumárico mediante la fumarato deshidratasa. El ácido oxaloacético es producido por la PYC anaeróbica, y el ácido málico se produce a partir del ácido oxaloacético por la malato deshidrogenasa (MDH). En el transformante según la presente invención, se aumenta una cantidad de ácido oxaloacético producido. Por lo tanto, el transformante también tiene una excelente capacidad de producción de ácido málico.

[0033] En el transformante según la presente invención, al menos un gen PCK o al menos un gen PYC debe introducirse como un gen extraño. El número de genes PYC a introducir no se limita a 1 y puede ser igual o superior a 2. Cuantos más genes extraños se introduzcan, mayor será la actividad de PYC del transformante obtenido.

[0034] En un caso en el que se introducen 2 o más genes PYC, se pueden introducir genes PYC del mismo tipo o se pueden introducir dos o más tipos de genes PYC. De manera similar, en el transformante según la presente invención, se puede introducir 1 gen PCK o se pueden introducir 2 o más genes PCK del mismo tipo o tipos diferentes.

[0035] Para provocar que el transformante según la presente invención tenga una capacidad de producción de ácido málico particularmente alta, es preferible inhibir la descomposición de ácido málico mediante la mejora de la actividad de MDH.

[0036] Específicamente, es preferible un transformante que se obtiene mediante la incorporación de al menos uno de los genes extraños que incluyen un gen PCK y un gen PYC y uno o más genes MDH extraños en S. pombe como hospedador, y en el que algunos de los genes en un grupo de genes codificantes de la piruvato descarboxilasa y genes de la enzima málica se han sometido a eliminación o desactivación. El transformante mencionado anteriormente es un transformante en el que se incorporan genes extraños tales como al menos el gen PCK o el gen PYC y los genes MDH, y en el que al menos la actividad de PCK o la actividad de PYC y la actividad de MDH se mejoran, algunos de los genes en un grupo de genes codificantes de la piruvato descarboxilasa se han sometido a eliminación o desactivación, y se reduce la eficiencia de fermentación de etanol. Es decir, en el transformante, la fermentación de ácido málico se acelera mientras que la fermentación de etanol se inhibe. Por lo tanto, el transformante tiene una excelente capacidad de producción de ácido málico.

[0037] En un caso en el que al menos 1 gen MDH se introduce como un gen extraño en el transformante según la presente invención, 1 gen MDH o 2 o más genes MDH del mismo tipo o tipos diferentes se pueden introducir en el transformante según la presente invención.

[0038] Es preferible que al menos 1 gen PCK, al menos 1 gen PYC y al menos 1 gen MDH se introduzcan como genes extraños en el transformante según la presente invención. Mediante la incorporación de genes extraños tales como el gen PCK, el gen PYC y el gen MDH, la capacidad de producción de ácido mélico mejora aún más. <S. pombe>

[0039] S. pombe utilizado como hospedador es la levadura (levadura de fisión) del género Schizosaccharomyces y es un microorganismo que tiene una resistencia ácida particularmente excelente en comparación con otras levaduras. Debido a que S. pombe tiene inherentemente un gen mae1 (transportador de ácido dicarboxílico C4), incluso en un caso en el que se aumenta una cantidad de ácido dicarboxílico C4 producido en las células microbianas, se inhibe que un exceso de ácido dicarboxílico C4 afecte el crecimiento o similares de las células microbianas. Por lo tanto, en comparación con otras levaduras que no tienen el gen Mae1, tales como Saccharomyces cerevisiae, S. pombe es adecuado para producir un ácido dicarboxílico C4.

[0040] Toda la secuencia de bases de un cromosoma de S. pombe ha sido publicada al aparecer como "Schizosaccharomyces pombe Gene DB (http://www.genedb.org/genedb/pombe/)" en la base de datos "Gene DB" del Instituto Sanger. Los datos de secuencia génica de S. pombe descritos en la presente memoria descriptiva se pueden obtener mediante la búsqueda por el nombre del gen o el nombre de la cepa mencionado anteriormente a partir de la base de datos descrita anteriormente.

<Gen codificante de la piruvato descarboxilasa>

[0041] El grupo de genes codificantes de la piruvato descarboxilasa (genes de la piruvato descarboxilasa, denominados en lo sucesivo también "genes PDC") en S. pombe consiste en 4 tipos de genes que incluyen un gen que codifica la piruvato descarboxilasa 1 (denominado en lo sucesivo "gen PDC1"), un gen que codifica la piruvato descarboxilasa 2 (denominado en lo sucesivo "gen PDC2"), un gen que codifica la piruvato descarboxilasa 3 (denominado en lo sucesivo "gen PDC3") y un gen que codifica de la piruvato descarboxilasa 4 (denominado en lo sucesivo "gen PDC4"). Entre ellos, el gen PDC2 y el

gen PDC4 son genes PDC que desempeñan un papel funcional clave en S. pombe.

[0042] El nombre de la cepa de cada uno de los genes PDC es el siguiente.

Gen PDC1 (pdc1); SPAC13A11. 06

Gen PDC2 (pdc2); SPAC1F8. 07c

Gen PDC3 (pdc3); SPAC186. 09

Gen PDC4 (pdc4); SPAC3G9. 11c

[0043] Los datos de la secuencia génica de PDC se pueden obtener a través de la búsqueda por el nombre del gen o el nombre de la cepa de la base de datos de genes de S. pombe mencionada anteriormente.

[0044] El transformante según la presente invención tiene un cromosoma en el que algunos de los genes en un grupo de genes codificantes de la piruvato descarboxilasa se han sometido a eliminación o desactivación. Debido a la eliminación o desactivación de algunos de los genes en el grupo de genes PDC del transformante, se reduce la eficiencia de fermentación de etanol del transformante y disminuye la cantidad de ácido pirúvico que se convertirá en etanol. Por lo tanto, se mejora la productividad de un ácido dicarboxílico C4 que incluye ácido málico. Aquí, si el grupo de genes PDC se elimina totalmente o se desactiva, la fermentación de etanol no se realiza en absoluto, y el crecimiento del transformante se inhibe. En consecuencia, sólo algunos de los genes en el grupo de genes PDC deben ser eliminados o desactivados.

[0045] Los genes PDC que se eliminarán o desactivarán son particularmente preferentemente genes PDC2. Los genes PDC2 son genes PDC que particularmente desempeñan un papel funcional clave. Una secuencia de aminoácidos de PDC2 (SpoPDC2) codificada por los genes p DC2 de S. pombe está representada por la SEQ ID NO:22.

[0046] Como se describió anteriormente, si todos los genes PDC se eliminan o desactivan, el transformante no realiza la fermentación de etanol y, por lo tanto, se dificulta el crecimiento del transformante. Por lo tanto, la eliminación o desactivación de los genes PDC debe realizarse manteniendo una capacidad de fermentación de etanol necesaria para el crecimiento con el fin de obtener una cantidad suficiente de transformante y simultáneamente disminuyendo la capacidad de fermentación de etanol con el fin de mejorar la eficiencia de fermentación de un ácido dicarboxílico C4.

[0047] Para eliminar o desactivar los genes PDC como se describió anteriormente, los inventores de la presente invención llevaron a cabo una investigación. Como resultado, descubrieron que si los genes PDC2 se eliminan o desactivan, los genes PDC4 se activan en cierta medida, y la capacidad de fermentación de etanol suficiente para obtener una cantidad suficiente de transformante y la producción de un ácido dicarboxílico C4 con alta eficiencia de fermentación se puede lograr simultáneamente.

<Gen de la enzima málica>

[0048] Un gen codificante de la enzima málica (gen de la enzima málica, denominado en lo sucesivo también "gen mae") en S. pombe es un gen que codifica la enzima málica 2 (denominado en lo sucesivo "gen mae2"). El nombre de la cepa del gen mae2 es el siguiente.

Gen mae2 (mae2); SPCC794. 12c

[0049] Los datos de la secuencia génica de mae2 se pueden obtener a través de la búsqueda por el nombre del gen o el nombre de la cepa de la base de datos de genes de S. pombe mencionada anteriormente. Una secuencia de aminoácidos de mae2 (Spomae2) codificada por el gen mae2 de S. pombe está representada por la SEQ ID NO:23.

[0050] En la S. pombe. de tipo salvaje, algunos de los ácidos málicos producidos se convierten en ácido pirúvico por mae2. En el transformante según la presente invención en el que el gen mae2 se ha sometido a eliminación o desactivación, el ácido málico producido en el transformante no se convierte en ácido pirúvico y, por lo tanto, la cantidad de ácido málico producido aumenta significativamente.

<Eliminación o desactivación del gen>

[0051] La eliminación o desactivación de los genes PDC y los genes mae2 se puede realizar mediante un procedimiento conocido. Por ejemplo, utilizando un procedimiento de Latour (descrito en la revista Nucleic Acids Research, 2006, vol. 34, p. e11, la publicación internacional PCT n.° WO2007/063919 y similares), los genes PDC y similares se pueden eliminar.

[0052] Además, a través de la eliminación, inserción, sustitución o adición inducida en una porción de una secuencia de bases de los genes PDC y similares, los genes PDC y similares se pueden desactivar. Solo se puede inducir una de las mutaciones que incluyen eliminación, inserción, sustitución y adición, o se pueden inducir dos o más mutaciones entre las anteriores.

[0053] Como procedimiento para introducir la mutación en una porción de los genes PDC y similares, se puede usar un procedimiento conocido.

[0054] Por ejemplo, se puede usar un procedimiento de separación por mutación usando un mutágeno (Experimental Method of Yeast Molecular Genetics, 1996, Gakkai Shuppan Center) y un procedimiento de mutación aleatoria usando una reacción en cadena de la polimerasa (RCP) (la revista PCR Methods Application, vol. 2, págs.

28-33, 1992).

[0055] Los genes PDC que portan la mutación introducida en una porción de los mismos pueden ser genes que expresan piruvato descarboxilasa tipo mutante sensible a la temperatura. La piruvato descarboxilasa mutante sensible a la temperatura es una enzima que muestra actividad equivalente a la actividad de la piruvato descarboxilasa de tipo salvaje a una temperatura de cultivo determinada, pero experimenta la pérdida o el deterioro de la actividad a una temperatura igual o superior a una temperatura de cultivo específica.

[0056] Una cepa mutante que expresa la piruvato descarboxilasa de tipo mutante se puede obtener seleccionándose de cepas cuya tasa de crecimiento es equivalente a la tasa de crecimiento de la levadura de tipo salvaje en las condiciones en las que la actividad no está limitada por la temperatura, pero que se reduce en gran medida en condiciones de temperatura específicas en las que la actividad está limitada.

[0057] De manera similar, los genes mae2 que portan la mutación introducida en una porción de los mismos pueden ser genes que expresan mae2 de tipo mutante sensible a la temperatura.

[0058] La eliminación o desactivación de genes no significa sólo la eliminación o desactivación de genes estructurales. No sólo un caso en el que se eliminan genes estructurales, sino también un caso en el que incluso si una proteína está codificada por un gen estructural y el gen estructural se expresa, la proteína no es una enzima que tiene actividad significa que los genes están desactivados.

[0059] En un caso en el que incluso si un dominio estructural de un gen codifica una enzima que tiene actividad, una proteína del dominio estructural del gen no se expresa debido a la eliminación de genes que codifican un dominio regulador o la mutación de la secuencia de los genes, significa que los genes se "eliminan o desactivan". Por lo tanto, los genes PDC o los genes mae2 que se eliminarán o desactivarán pueden ser uno o ambos de un dominio estructural y un dominio regulador de los genes PDC o los genes mae2.

<Gen PYC>

[0060] Los genes PYC introducidos como genes extraños en el transformante según la presente invención deben ser genes estructurales que puedan expresar una proteína que realiza actividad de PYC en un caso en el que los genes estructurales se introducen en S. pombe y pueden derivarse de cualquiera de las bioespecies.

[0061] Los ejemplos de PYC codificada por los genes PYC introducidos como genes extraños incluyen PYC derivada de Aspergillus niger (AniPYC) (n.° de ac.: CAC19838. 1.) (SEQ ID NO:1), PYC derivada de Brevibacillus brevis (BbrPYC) (SEQ ID NO:2), PYC derivada de Debaryomyces hansenii(DhaPYC) (n.° de ac.: CAG86153.2.) (SEQ ID NO:3), PYC derivada de Kluyveromyces lactis (KlaPYC) (SEQ ID NO:4), PYC derivada deLachancea thermotolerans (LthPYC) (SEQ ID NO:5), PYC derivada de Loddderomyces elongisporus (LelPYC) (SEQ ID NO:6), PYC derivada de Saccharomyces cerevisiae (ScePYC) (SEQ ID NO:7), PYC derivada de Candida orthopsilosis (CorPYC) (n.° de ac.: CCG23801. 1.) (SEQ ID NO:8), PYC derivada de Candida tropicalis (CtrPYC) (n.° de ac.: EER35520. 1.) (SEQ ID NO:9), PYC derivada de Naumovozyma castellii (NcaPYC) (n.° de ac.: CCC71457. 1.) (SEQ ID NO:10), PYC derivada de Naumovozyma dairenensis (NdaPYC) (n.° de ac.: CCD26740. 1.) (SEQ ID NO:11), PYC derivada de Saccharomyces kudriavzevii (SkuPYC) (n.° de ac. : EJT41260. 1.) (SEQ ID NO:12), PYC derivada de S. pombe (SpoPYC) (n.° de ac. : BAA11239. 1., CAB52809. 1.) (SEQ ID NO:13), PYC derivada de Tetrapisispora blattae (TblPYC) (n.° de ac. : CCH58779. 1.) (SEQ ID NO: 14), PYC derivada de Torulaspora delbrueckii (TdePYC) (n.° de ac. : CCE93722. 1.) (SEQ ID NO: 15), Y PYC derivada de Zygosaccharomyces rouxii (ZroPYC) (n.° de ac. : CAR26934.

1.) (SEQ ID NO:16).

[0062] Los genes PYC pueden ser genes que codifican un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos obtenida mediante la sustitución, adición o eliminación de uno o una pluralidad de aminoácidos en secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO:1 a 16) de las PYC anteriores y tiene actividad de PYC.

[0063] Los genes PYC pueden ser genes que codifican un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia igual o superior al 80 %, preferentemente igual o superior al 85 %, más preferentemente igual o superior al 90 %, e incluso más preferentemente igual o superior al 95 % con las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO:1 a 16) de las PYC anteriores y tiene actividad de PYC.

[0064] En la memoria descriptiva de la presente solicitud, "n.° de ac." significa un número de acceso de una base de datos GenBank of National Center for Biotechnology Information (NCBI).

[0065] En la presente invención y la memoria descriptiva de la presente solicitud, "pluralidad de aminoácidos" significan de 2 a 20 aminoácidos y son preferentemente de 2 a 10 aminoácidos.

[0066] Los genes PYC introducidos en el transformante según la presente invención son preferentemente genes que codifican PYC que es la misma que BbrPYC, KlaPYC, LelPYC, ScePYC, SpoPYC o TblPYC o tiene una secuencia de aminoácidos similar a la de las PYC anteriores.

[0067] Específicamente, los genes PYC son preferentemente genes que codifican un polipéptido que incluye secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO:2, 4 a 7 y 12 a 14, un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos obtenida mediante la sustitución, adición o eliminación de uno o una pluralidad de aminoácidos en secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO:2, 4 a 7 y 12 a 14 y tiene actividad de PYC, o un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia igual o superior al 80 % con secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO:2, 4 a 7 y 12 a 14 y tiene actividad de PYC.

[0068] Los genes PYC son más preferentemente un polipéptido que está representado por la SEQ ID NO:7, un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos obtenida mediante la sustitución, adición o eliminación de uno o una pluralidad de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 7 y tiene actividad de PYC, o un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia igual o superior al 80 % con una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO:7 y tiene actividad de PYC. Los genes PYC son incluso más preferentemente un polipéptido que está representado por la SEQ ID NO:7 o un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos obtenida mediante la sustitución, adición o eliminación de uno o una pluralidad de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO 7 y tiene actividad de PYC. <Gen MDH>

[0069] Los genes MDH introducidos como genes extraños en el transformante según la presente invención deben ser genes estructurales que puedan expresar una proteína que realiza actividad de MDH en un caso en el que los genes estructurales se introducen en S. pombe y pueden derivarse de cualquier bioespecie.

[0070] Los ejemplos de MDH codificada por los genes MDH introducidos como genes extraños incluyen MDH derivada de Archaeoglobus fulgidus (AfuMDH) (SEQ ID NO:17), MDH derivada de Congregibacter litoralis (CliMDH) (SEQ ID NO:18), MDH derivada de Delftia acidovorans (DacMDH) (SEQ ID NO:19), MDH derivada de Halomonas elongata (HelMDH) (SEQ ID NO:20) y MDH derivada de Shewanella putrefaciens (SpuMDH) (SEQ ID NO:21).

[0071] Los genes MDH pueden ser genes que codifican un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos obtenida mediante la sustitución, adición o eliminación de uno o una pluralidad de aminoácidos en secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO:17 a 21) de las MDH anteriores y tiene actividad de MDH. Además, los genes MDH pueden ser genes que codifican un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia igual o superior al 80 %, preferentemente igual o superior al 85 %, más preferentemente igual o superior al 90 %, e incluso más preferentemente igual o superior al 95 % con secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO:17 a 21) de las MDH anteriores y tiene actividad de MDH.

[0072] Los genes MDH introducidos en el transformante según la presente invención son preferentemente genes que codifican MDH que es la misma que CliMDH, DacMDH o HelMDH o tiene una secuencia de aminoácidos similar a la de las MDH anteriores.

[0073] Específicamente, los genes MDH son preferentemente genes que codifican un polipéptido que incluye secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO:18 a 20, un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos obtenida mediante la sustitución, adición o eliminación de uno o una pluralidad de aminoácidos en secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO:18 a 20 y tiene actividad de MDH, o un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia igual o superior al 80 % con secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO:18 a 20 y tiene actividad de MDH.

[0074] Los genes de MDH son más preferentemente genes que codifican un polipéptido representado por la SEQ ID NO:19, un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos obtenida mediante la sustitución, adición o eliminación de uno o una pluralidad de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO:19 y tiene actividad de MDH, o un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia igual o superior al 80 % con una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO:19 y tiene actividad de MDH. Los genes de MDH son incluso más preferentemente un polipéptido representado por la SEQ ID NO:19 o un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos obtenida mediante la sustitución, adición o eliminación de uno o una pluralidad de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO:19 y tiene actividad de M^d H.

<Genes PCK>

[0075] Los genes PCK introducidos como genes extraños en el transformante según la presente invención deben ser genes estructurales que pueden expresar una proteína que realiza actividad de PCK en un caso en el que los genes estructurales se introducen en S. pombe y pueden derivar de cualquier bioespecie.

[0076] Los ejemplos de PCK codificada por los genes PCK introducidos como genes extraños incluyen PCK derivada de Candida glabrata (CglPCK) (n.° de ac. : CAG60017. 1) (SEQ ID NO:94), PCK derivada de Citrobacter koseri (CkoPCK) (n.° de ac. : KGY18702. 1) (SEQ ID NO:95), PCK derivada de Cronobacter sakazakii (CsaPCK) (n.° de ac. : EGL73852. 1) (SEQ ID NO:96), PCK derivada de Debaryomyces hansenii (DhaPCK) (n.° de ac. : CAG88379. 1) (SEQ ID NO:97), PCK derivada de Escherichia fergusonii (EfePCK) (n.° de ac. : EGC96802. 1) (SEQ ID NO:98), PCK derivada de Edwardsiella tarda (EtaPCK) (n.° de ac. : GAC66070. 1) (SEQ ID NO:99), PCK derivada de Kluyveromyces lactis (KlaPCK) (n.° de ac. : AAC27661. 1) (SEQ ID NO:100), PCK derivada de Lodderomyces elongisporus (LelPCK) (n.° de ac. : EDK41877. 1) (SEQ ID NO:101), PCK derivada de Pectobacterium carotovorum (PcaPCK) (n.° de ac. : ACT14911. 1) (SEQ ID NO:102), PCK derivada de Photobacterium leiognathi (PlePCK) (n.° de ac. : GAA03015. 1) (SEQ ID NO:103), PCK derivada de Providencia rettgeri (PrePCK) (n.° de ac. : EFE52670. 1) (SEQ ID NO:104), PCK derivada de Saccharomyces cerevisiae (ScePCK) (n.° de ac. : CAA31488. 1) (SEQ ID NO:105), PCK derivada de Serratia odorifera (SodPCK) (n.° de ac. : EFE97343. 1) (SeQ ID NO:106), PCK derivada de Vibrio orientalis (VorPCK) (n.° de ac. : EGU52194. 1) (SEQ ID NO:107), PCK derivada de Vanderwaltozyma polyspora (VpoPCK) (n.° de ac. : EDO17884. 1) (SEQ ID NO:108), PCK derivada de Vibrio tubiashii (VtuPCK) (n.° de ac. : EIF04922. 1) (SEQ ID NO:109), PCK derivada de Yersinia bercovieri (YbePCK) (n.° de ac. : EEQ07887. 1) (SEQ ID NO:110), PCK derivada de Yarrowia lipolytica (YliPCK) (n.° de ac. : cAg 82248. 1) (SEQ ID NO:111), PCK derivada de Yersinia rohdei (YroPCK) (n.° de ac. : AJJ11585. 1) (SEQ ID NO:112), y PCK derivada de Zygosaccharomyces rouxii (ZroPCK) (n.° de ac. : CAR26716. 1) (SEQ ID NO:113).

[0077] Los genes de PCK pueden ser genes que codifican un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos obtenida mediante la sustitución, adición o eliminación de uno o una pluralidad de aminoácidos en secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO:94 a 113) de las PCK anteriores y tiene actividad de PCK. Además, los genes PCK pueden ser genes que codifican un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia igual o superior al 80 %, preferentemente igual o superior al 85 %, más preferentemente igual o superior al 90 % e incluso más preferentemente igual o superior al 95 % con secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO:94 a 113) de las PCK anteriores y tiene actividad de PCK.

[0078] Dado que PCK, PYC y MDH tienen alta actividad, se conocen la PCK derivada de Escherichia coli (EcoPCK) (n.° de ac.: AAA58200. 1) (SEQ ID NO:154), la PYC derivada de Gallus gallus (GglPYC) (n.° de ac.: AAM92771. 1.) (SEQ ID NO:155), y la MDH derivada de Escherichia coli (EcoMDH) (n.° de ac.: AAA58038. 1) (SEQ ID NO:156).

[Fabricación del transformante]

[0079] El transformante según la presente invención se obtiene mediante el uso de S. pombe, en el que algunos de los genes en un grupo de genes PDC se han sometido a eliminación o desactivación, como hospedador e introduciendo al menos uno de los genes extraños que incluyen un gen PCK y un gen PYC en el hospedador mediante un procedimiento de ingeniería genética. Además, el transformante según la presente invención también se puede obtener mediante la eliminación o desactivación de algunos de los genes en un grupo de genes PDC de un transformante que se obtiene mediante la introducción de al menos uno de los genes extraños que incluyen un gen PCK y un gen PYC en S. pombe utilizado como hospedador mediante un procedimiento de ingeniería genética.

[0080] El transformante según la presente invención en el que se introducen genes MDH extraños y en el que los genes mae2 se han sometido a eliminación o similares puede obtenerse mediante el uso de S. pombe, en el que algunos de los genes en un grupo de genes PDC se han sometido a eliminación o desactivación, como hospedador, introduciendo al menos uno de los genes extraños que incluyen un gen PCK y un gen PYC y al menos un gen MDH extraño en el hospedador mediante un procedimiento de ingeniería genética, y eliminando o desactivando un gen mae2 del hospedador.

[0081] Además, S. pombe en el que algunos de los genes en un grupo de genes PDC se han sometido a eliminación o desactivación puede utilizarse como hospedador, un gen mae2 del hospedador puede eliminarse o desactivarse y a continuación al menos uno de los genes extraños que incluyen un gen PCK y un gen PYC y al menos un gen MDH extraño puede incorporarse al hospedador mediante un procedimiento de ingeniería genética.

[0082] Además, el transformante según la presente invención también se puede obtener mediante la eliminación o desactivación de algunos de los genes en un grupo de genes PDC y un gen mae2 de un transformante que se obtiene mediante la introducción de al menos uno de los genes extraños que incluyen un gen PCK y un gen PYC y al menos un gen MDH extraño en S. pombe utilizado como hospedador mediante un procedimiento de ingeniería genética. En un caso en el que se introduce una pluralidad de genes extraños, todos los genes extraños pueden introducirse en el hospedador al mismo tiempo o introducirse secuencialmente en el hospedador (en orden aleatorio).

[0083] El procedimiento para fabricar el transformante se describirá en función, por ejemplo, de un procedimiento de uso de S. pombe, en el que algunos de los genes en un grupo de genes PDC se han sometido a eliminación o desactivación, como hospedador, introduciendo un gen PYC y un gen MDH en el hospedador, y a continuación eliminando o desactivando un gen mae2.

<Hospedador>

[0084] La S. pombe utilizada como hospedador puede ser un tipo salvaje o un tipo mutante en el que genes específicos se han sometido a eliminación o desactivación según la finalidad. Como un procedimiento para eliminar o desactivar los genes específicos, se puede usar un procedimiento conocido. Específicamente, mediante el uso del procedimiento de Latour descrito anteriormente, los genes se pueden eliminar.

[0085] Además, mediante un procedimiento de separación por mutación que utiliza un mutágeno (Experimental Method of Yeast Molecular Genetics, 1996, Gakkai Shuppan Center), un procedimiento de mutación aleatoria que utiliza RCP (la revista PCR Methods Application, vol. 2, págs. 28-33, 1992) y similares, se introduce una mutación en algunos de los genes, desactivando así los genes. El hospedador de levadura del género Schizosaccharomyces en el que se han eliminado o desactivado genes específicos se describe, por ejemplo, en la publicación internacional PCT n.° WO2002/101038 y la publicación internacional PCT n.° WO2007/015470.

[0086] La porción en la que se realiza la eliminación o desactivación de genes específicos puede ser una porción de marco de lectura abierto (ORF, por sus siglas en inglés) o una porción de secuencia reguladora de expresión. Es particularmente preferible utilizar un procedimiento de eliminación o desactivación mediante un procedimiento de recombinación homóloga mediado por RCP (la revista Yeast, vol. 14, págs. 943-951, 1998) en el que una porción de ORF de un gen estructural se sustituye con un gen marcador.

[0087] Un mutante en el que los genes PDC se han sometido a eliminación o desactivación puede usarse preferentemente como hospedador para fabricar el transformante según la presente invención. Además, la S. pombe, en la que los genes PDC y genes específicos distintos de los genes PDC se han sometido a eliminación o desactivación, también puede usarse como hospedador. Mediante la eliminación o desactivación de un gen de proteasa y similares, se puede mejorar la eficiencia de expresión de proteínas heterólogas, y si el hospedador obtenido de esta manera se utiliza como hospedador en la presente invención, se podría mejorar la eficiencia de producción de un ácido dicarboxílico C4 tal como ácido málico.

[0088] Como S. pombese utiliza como hospedador, es preferible usar aquellos que tienen un marcador para seleccionar un transformante. Por ejemplo, es preferible usar un hospedador que esencialmente requiere un componente nutricional específico para el crecimiento debido a la falta de determinados genes. En un caso en el que un transformante se prepara mediante transformación usando un vector que incluye una secuencia génica diana, si el gen faltante (marcador auxotrófico complementario) se incorpora de antemano en el vector, la auxotrofia del hospedador desaparece en el transformante. Por la diferencia de auxotrofia entre el hospedador y el transformante, es posible hacer una diferenciación entre un hospedador y un transformante y obtener un transformante.

[0089] Por ejemplo, mediante el uso de S. pombe, que se convierte en uracilo auxotrófico debido a la eliminación o desactivación de un gen de orotidina fosfato descarboxilasa (gen ura4), como hospedador, realizando la transformación utilizando un vector que tiene un gen ura4 (marcador auxotrófico complementario), y a continuación seleccionando un transformante en el que ha desaparecido la auxotrofia de uracilo, se puede obtener un transformante en el que se incorpora el vector. El gen faltante que hace auxotrófico al hospedador no se limita al gen ura4 siempre y cuando el gen se pueda usar para seleccionar un transformante, y puede ser un gen de isopropilmalato deshidrogenasa (gen leu1) o similar.

[0090] Además, la S. pombe en la que un grupo de genes PDC no se han sometido a eliminación o desactivación se puede utilizar como hospedador para la fabricación de un transformante. En este caso, como hospedador, es posible utilizar un hospedador en el que el gen mencionado anteriormente (un marcador auxotrófico, un gen de proteasa o similares) distinto de los genes PDC se ha sometido a eliminación o desactivación. Al fabricar un transformante mediante el uso del hospedador y a continuación eliminar o desactivar algunos de los genes en un grupo de genes PDC del transformante obtenido, se puede obtener el transformante según la presente invención. <Procedimiento de introducción de genes extraños>

[0091] Como un procedimiento para introducir genes extraños en un hospedador mediante un procedimiento de ingeniería genética, se puede usar un procedimiento conocido. Como un procedimiento en el que se utiliza S. pombe como hospedador y se introducen genes estructurales de proteínas heterólogas en el hospedador, por ejemplo, es posible utilizar los procedimientos descritos en la solicitud de patente japonesa no examinada, primera publicación n .° H05-15380, la publicación internacional PCT n.° WO95/09914, la solicitud de patente japonesa no examinada, primera publicación n.° H10-234375, la solicitud de patente japonesa no examinada, primera Publicación n.° 2000­ 262284, la solicitud de patente japonesa no examinada, primera Publicación n.° 2005-198612, la publicación internacional PCT n.° WO2011/021629, y similares.

<Casete de expresión>

[0092] Un casete de expresión es una combinación de ADN necesaria para expresar una proteína diana e incluye un gen estructural que codifica la proteína diana y un promotor y un terminador que funcionan en un hospedador. Un casete de expresión utilizado para fabricar el transformante según la presente invención incluye al menos un gen PYC o un gen MDH, así como un promotor y un terminador que funcionan en S. pombe.

[0093] El casete de expresión puede incluir uno o más dominios entre un dominio no traducido 5' y un dominio no traducido 3'. Además, el casete puede incluir el marcador auxotrófico complementario mencionado anteriormente. Una pluralidad de genes extraños puede estar presente en un casete de expresión simple. El número de genes extraños en un casete de expresión simple es preferentemente de 1 a 8, y más preferentemente de 1 a 5.

[0094] En un caso en el que se incluye una pluralidad de genes extraños en un casete de expresión simple, el casete puede incluir dos o más tipos de genes extraños. Como casete de expresión, es preferible un casete de expresión que incluye uno o una pluralidad de genes PYC y genes MDH, un promotor, un terminador, un dominio 5' no traducido, un dominio 3' no traducido y un marcador auxotrófico complementario.

[0095] En la fabricación del transformante según la presente invención, los genes PYC y los genes MDH se pueden introducir en el hospedador mediante casetes de expresión diferentes o mediante un casete de expresión simple. Como el casete de expresión que incluye los genes PYC y los genes MDH, por ejemplo, es preferible un casete de expresión que incluye un promotor, genes PYC, una secuencia de escisión, un marcador auxotrófico complementario (por ejemplo, un gen Ura4), genes MDH y un terminador desde el lado terminal 5'.

[0096] Como secuencia génica de los genes PYC o los genes MDH incluidos en el casete de expresión, se puede usar un gen codificado por un tipo salvaje tal como está. Para aumentar la cantidad de expresión en S. pombe utilizada como hospedador, la secuencia génica del tipo salvaje puede modificarse en un codón utilizado a alta frecuencia en S. pombe.

[0097] El promotor y el terminador que funciona en S. pombe deben ser capaces de funcionar en un transformante y mantener la expresión de una proteína codificada por genes extraños, incluso si se crea una condición ácida (pH igual o inferior a 6) debido a la acumulación de un ácido dicarboxílico C4 por el transformante según la presente invención. Como el promotor que funciona en S. pombe, es posible utilizar un promotor (preferentemente un promotor que tiene actividad de inicio de transcripción elevada) inherente a S. pombe o un promotor (tal como un promotor derivado de un virus) que no es inherente a S. pombe. En esta invención, dos o más tipos de promotor pueden estar presentes en un vector.

[0098] Los ejemplos del promotor inherente a S. pombe incluyen un promotor génico de la alcohol deshidrogenasa, un promotor génico nmt1 involucrado en el metabolismo de la tiamina, el promotor génico de la fructosa-1,6-bisfosfatasa involucrada en el metabolismo de la glucosa, un promotor génico de la invertasa involucrada en la represión por catabolitos (véase la publicación internacional PCT n.° WO99/23223), un promotor génico de la proteína de choque térmico (véase la publicación internacional PCT n.° WO2007/26617) y similares.

[0099] Los ejemplos del promotor que no es inherente a S. pombe incluyen promotores derivados de virus de células animales, descritos en la solicitud de patente japonesa no examinada, primera publicación n .° H05-15380, la solicitud de patente japonesa no examinada, primera publicación n.° H07-163373, y la solicitud de patente japonesa no examinada, primera publicación n.° H10-234375. Como tales promotores, son preferibles un promotor de hCMV y un promotor de SV40.

[0100] Como el terminador que funciona en S. pombe, es posible utilizar un terminador inherente a S. pombe o un terminador que no es inherente a S. pombe. En esta invención, dos o más tipos de terminador pueden estar presentes en un vector.

[0101] Los ejemplos del terminador incluyen terminadores derivados de seres humanos, descritos en la solicitud de patente japonesa no examinada, primera publicación n.° H05-15380, la solicitud de patente japonesa no examinada, primera publicación n.° H07-163373, y la solicitud de patente japonesa no examinada, primera publicación n.° H10-234375. Como tales terminadores, es preferible un terminador de lipocortina I humana.

<Vector>

[0102] El transformante descrito en esta invención tiene un casete de expresión, que incluye genes extraños, en un cromosoma o tiene un casete de expresión como un gen extracromosómico. Tener el casete de expresión en un cromosoma significa un estado en el que el casete de expresión se incorpora en uno o más sitios en un cromosoma de la célula hospedadora. Tener el casete de expresión como un gen extracromosómico significa un estado en el que el transformante tiene un plásmido que incluye el casete de expresión en una célula. El transformante que tiene cada casete de expresión se obtiene transformando S. pombe como hospedador mediante el uso de un vector que incluye cada casete de expresión.

[0103] El vector se puede fabricar mediante la incorporación del casete de expresión en un vector que tiene una estructura de ADN cíclico o una estructura de ADN lineal. En un caso en el que se prepara un transformante en el que se retiene el casete de expresión como un gen extracromosómico en una célula hospedadora, el vector es preferentemente un plásmido que incluye una secuencia que se replica en la célula hospedadora, es decir, una secuencia de replicación autónoma (ARS, por sus siglas en inglés).

[0104] Por el contrario, en un caso en el que se prepara un transformante en el que se incorpora el casete de expresión en un cromosoma de una célula hospedadora, el vector es preferentemente un vector que tiene una estructura de ADN lineal, no tiene ARS y se introduce en la célula hospedadora. Por ejemplo, el vector puede ser un vector que consiste en ADN lineal o un vector que tiene una estructura de ADN cíclico que tiene una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción para cortar y abrir el vector en ADN lineal cuando se introduce en el hospedador. En un caso en el que el vector es un plásmido que tiene ARS, se puede establecer una estructura de ADN lineal mediante la eliminación de la porción de ARS o mediante la desactivación de la función de ARS mediante la escisión de la porción de ARS, y a continuación el vector se puede introducir en un hospedador.

[0105] El vector preferentemente tiene un marcador para seleccionar un transformante. Los ejemplos del marcador incluyen un gen ura4 (marcador auxotrófico complementario) y un gen de la isopropilmalato deshidrogenasa (gen leul).

[0106] Cada gen extraño se introduce preferentemente en un cromosoma de S. pombe. Mediante la introducción del gen extraño en el cromosoma, se obtiene un transformante que se mantiene excelentemente estable en un pasaje. Además, se puede introducir una pluralidad de genes extraños en el cromosoma. En el transformante según la presente invención, el número de genes PYC incorporados en un cromosoma es preferentemente de 1 a 20 y particularmente preferentemente de 1 a 8. Además, el número de genes MDH incorporados en un cromosoma del transformante es preferentemente de 1 a 20 y particularmente preferentemente de 1 a 8.

[0107] Como procedimiento para introducir genes extraños en un cromosoma, se puede usar un procedimiento conocido. Por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en la solicitud de patente japonesa no examinada, primera publicación n.° 2000-262284, se puede introducir una pluralidad de genes extraños en un cromosoma. Por el mismo procedimiento, se puede introducir un único gen extraño en un cromosoma. Además, como se describirá más adelante, uno o una pluralidad de genes extraños se pueden introducir en una pluralidad de sitios de un cromosoma.

[0108] Como un procedimiento para introducir genes extraños en un cromosoma de S. pombe, es preferible un procedimiento en el que los genes extraños se introducen mediante un procedimiento de recombinación homóloga mediante el uso de un vector que tiene un casete de expresión, que tiene los genes extraños, y un sitio de recombinación.

[0109] El sitio de recombinación de un vector es un sitio que tiene una secuencia de bases que puede causar recombinación homóloga con un sitio diana de recombinación homóloga en un cromosoma de S. pombe. El sitio diana es un sitio en el que se incorpora un casete de expresión en un cromosoma de S. pombe. El sitio diana se puede establecer libremente mediante el diseño de la secuencia de bases del sitio de recombinación del vector de modo que el sitio de recombinación pueda causar recombinación homóloga con el sitio diana.

[0110] La secuencia de bases del sitio de recombinación y la secuencia de bases del sitio diana deben compartir identidad igual o superior al 70 %. Además, en vista de facilitar la aparición de la recombinación homóloga, la identidad compartida entre la secuencia de bases del sitio de recombinación y la secuencia de bases del sitio diana es preferentemente igual o superior al 90 %, y más preferentemente igual o superior al 95 %. Mediante el uso del vector que tiene el sitio de recombinación descrito anteriormente, se puede incorporar un casete de expresión en el sitio diana mediante recombinación homóloga.

[0111] La longitud (número de bases) del sitio de recombinación es preferentemente de 20 pb a 2.000 pb. Si la longitud del sitio de recombinación es igual o superior a 20 pb, se produce fácilmente una recombinación homóloga. Si la longitud del sitio de recombinación es igual o inferior a 2.000 pb, es fácil evitar un caso en el que el vector se hace demasiado largo y, por lo tanto, la recombinación homóloga no se produce fácilmente. La longitud del sitio de recombinación es más preferentemente igual o superior a 100 pb, e incluso más preferentemente igual o superior a 200 pb. Además, la longitud del sitio de recombinación es más preferentemente igual o inferior a 800 pb, e incluso más preferentemente igual o inferior a 400 pb.

[0112] El vector puede tener otros dominios de ADN además del casete de expresión y el sitio de recombinación mencionados anteriormente. Los ejemplos de los dominios de ADN incluyen un dominio de inicio de replicación llamado "ori" que es necesario para la replicación en E. coli y un gen de resistencia a antibióticos (un gen de resistencia a neomicina o similares). Estos son genes generalmente necesarios en un caso en el que un vector se construye usando E. coli. En este caso, es preferible que el dominio de inicio de replicación se elimine cuando el vector se incorpora en un cromosoma de un hospedador como se describirá más adelante.

[0113] En un caso en el que los genes extraños se incorporan en un cromosoma, el vector preferentemente tiene una estructura de ADN lineal cuando se introduce en una célula de S. pombe. Es decir, en un caso en el que el vector tiene una estructura de ADN cíclico tal como ADN de plásmido que se usa generalmente, es preferible que el vector se introduzca en la célula de S. pombe después de ser cortado y abierto para volverse lineal por una enzima de restricción.

[0114] En este caso, una posición en la que el vector que tiene una estructura de ADN cíclico se corta y abre se encuentra en el sitio de recombinación. Como resultado, en cada uno de los dos extremos del vector cortado y abierto, el sitio de recombinación está parcialmente presente, y a través de la recombinación homóloga, la totalidad del vector se incorpora en un sitio diana de un cromosoma.

[0115] Siempre que se pueda establecer una estructura lineal de ADN para el vector de manera que una porción del sitio de recombinación esté presente en cada uno de sus dos extremos, el vector se puede construir mediante un procedimiento distinto al procedimiento de cortar y abrir el vector que tiene una estructura cíclica de ADN.

[0116] Como vector, por ejemplo, los plásmidos derivados de E. coli, tales como pBR 322, pBR 325, pUC 118, pUC 119, pUC 18 y pUC 19, se pueden usar adecuadamente.

[0117] En este caso, es preferible que un dominio de inicio de replicación llamado "ori" necesario para la replicación en E.coli se elimine del vector plásmido utilizado en el momento de la recombinación homóloga. De esta manera, cuando el vector anteriormente mencionado se incorpora en un cromosoma, se puede mejorar la eficiencia de incorporación.

[0118] Un procedimiento para construir un vector, del cual se ha eliminado el dominio de inicio de replicación, no está particularmente limitado, pero es preferible utilizar el procedimiento descrito en la solicitud de patente japonesa no examinada, primera publicación n .° 2000-262284. Es decir, es preferible usar un procedimiento para construir de antemano un vector precursor en el que se inserta un dominio de inicio de replicación en un sitio de escisión en un sitio de recombinación de modo que el vector tenga la estructura de ADN lineal descrita anteriormente y se corte el dominio de inicio de replicación. Mediante este procedimiento, se puede obtener fácilmente un vector del cual se ha eliminado un dominio de inicio de replicación.

[0119] Además, también es preferible utilizar un procedimiento en el que se construye un vector precursor que tiene un casete de expresión y un sitio de recombinación mediante el uso del vector de expresión descrito en la solicitud de patente japonesa no examinada, primera publicación n.° H05-15380, la solicitud de patente japonesa no examinada, primera publicación n.° H07-163373, la publicación internacional PCT n.° WO96/23890, la solicitud de patente japonesa no examinada, primera publicación n.° H10-234375, y similares o usando el procedimiento de construcción de los mismos, y un dominio de inicio de replicación se elimina del vector precursor mediante un procedimiento de ingeniería genética general para obtener un vector utilizado para la recombinación homóloga.

<Sitio diana>

[0120] El sitio diana en el que se incorpora el vector puede estar presente solo en un sitio o dos o más sitios en un cromosoma de S. pombe. En un caso en el que dos o más sitios diana están presentes, el vector se incorpora en dos o más sitios de un cromosoma de S. pombe. En un caso en el que se incluye una pluralidad de genes extraños en un casete de expresión simple, la pluralidad de genes extraños se puede incorporar en un sitio diana.

[0121] Además, mediante el uso de dos o más tipos de vector que tienen un sitio de recombinación correspondiente a cada uno de los sitios diana, el casete de expresión puede incorporarse en dos o más tipos de sitio diana. Mediante este procedimiento, se puede incorporar una pluralidad de genes extraños en un cromosoma de S. pombe. Como resultado, se puede aumentar una cantidad de expresión de PYC o MDH codificada por los genes extraños y se puede mejorar la productividad de un ácido dicarboxílico C4.

[0122] Por ejemplo, mediante la incorporación de un casete de expresión que incluye un gen PYC en un vector que tiene un primer sitio diana, la incorporación de un casete de expresión que incluye un gen MDH en un vector que tiene un segundo sitio diana, la realización de la transformación mediante el uso de los vectores y S. pombe, en la que algunos de los genes en un grupo de genes PDC se han sometido a eliminación o desactivación, como hospedador, y a continuación la eliminación o desactivación de genes mae2 del transformante obtenido, se obtiene el transformante descrito en esta invención.

[0123] En un caso en el que un casete de expresión se incorpora en un sitio diana, por ejemplo, es posible utilizar el sitio diana que se muestra en el procedimiento descrito en la solicitud de patente japonesa no examinada, primera publicación n.° 2000-262284. Mediante el uso de dos o más tipos de vector que tienen diferentes sitios de incorporación, los vectores se pueden incorporar en diferentes sitios diana, respectivamente. Sin embargo, el procedimiento anterior es complicado para incorporar vectores en dos o más sitios de un cromosoma.

[0124] Siempre que una pluralidad de porciones, que está presente en un cromosoma y tiene secuencias de bases sustancialmente iguales entre sí, se pueden utilizar como sitios diana, y un vector se puede incorporar en cada uno de la pluralidad de sitios diana, el vector se puede incorporar en dos o más sitios en el cromosoma mediante el uso de un tipo de vector.

[0125] Las secuencias de bases sustancialmente iguales entre sí significan que las secuencias comparten una identidad igual o superior al 90 %. La identidad compartida entre los sitios diana es preferentemente igual o superior al 95 %. La longitud de cada una de las secuencias de bases sustancialmente iguales entre sí es una longitud que incluye el sitio de recombinación del vector mencionado anteriormente, que es preferentemente igual o mayor que 1.000 pb.

[0126] En un caso en el que los genes extraños se incorporan en una pluralidad de sitios diana en un estado disperso, incluso si se incorpora el mismo número de genes extraños en los sitios diana, un fenómeno en el que los genes extraños se separan todos a la vez de un cromosoma cuando el transformante crece se produce menos que en un caso en el que una pluralidad de genes extraños se incorpora en un único sitio diana. Por lo tanto, el transformante se mantiene de forma más estable en el pasaje.

[0127] Como la pluralidad de sitios diana presentes en un cromosoma, es preferible un gen de transposón Tf2. Tf2 es un gen de transposón presente en un total de 13 sitios en cada cromosoma de triple cadena (monoploide) de S. pombe. Se sabe que la longitud (número de bases) de este es de aproximadamente 4.900 pb, y se sabe que la identidad de secuencia de base compartida entre sus genes es de 99,7 % (véanse los siguientes documentos).

[0128] Nathan J. Bowen y col, "Retrotransposons and Their Recognition of pol II Promoters: A Comprehensive Survey of the Transposable Elements from the Complete Genome Sequence of Schizosaccharomyces pombe", Genome Res. 200313: 1984-1997

[0129] Es posible incorporar un vector en solo uno de los Tf2 presentes en 13 sitios en un cromosoma. En este caso, mediante la incorporación de un vector que tiene dos o más genes extraños, se puede obtener un transformante que tiene dos o más genes extraños. Además, mediante la incorporación de un vector en dos o más Tf2, se puede obtener un transformante que tiene dos o más genes extraños. En este caso, al incorporar el vector que tiene dos o más genes extraños, se puede obtener un transformante que tiene más genes extraños. Si se incorpora un vector en todos los 13 Tf2, se puede imponer demasiada carga sobre la supervivencia o el crecimiento del transformante. Por lo tanto, el vector se incorpora preferentemente en 8 o menos de los 13 Tf2, y más preferentemente se incorpora en 5 o menos Tf2.

<Procedimiento de transformación>

[0130] Como procedimiento de transformación, se puede usar cualquiera de los procedimientos de transformación conocidos. Los ejemplos del procedimiento de transformación incluyen los procedimientos conocidos en la técnica relacionada, tales como un procedimiento de acetato de litio, un procedimiento de electroporación, un procedimiento de esferoplasto y un procedimiento de perla de vidrio, y el procedimiento descrito en la solicitud de patente japonesa no examinada, primera publicación n .° 2005-198612. Además, se pueden usar kits de transformación de levadura disponibles en el mercado.

[0131] Como procedimiento para transformar el hospedador S. pombe mediante un procedimiento de recombinación homóloga, se puede usar un procedimiento de recombinación homóloga conocido. Como procedimiento de transformación en el momento de fabricar el transformante según la presente invención, es preferible un procedimiento donde S. pombe en la que algunos de los genes en un grupo de genes PDC descritos anteriormente se han sometido a eliminación o desactivación se utiliza como hospedador, y un casete de expresión se incorpora en un cromosoma de S. pombe a través de recombinación homóloga mediante el uso del vector descrito anteriormente.

[0132] En el momento de la fabricación del transformante, generalmente, después de realizar la recombinación homóloga, se selecciona el transformante obtenido. Como procedimiento de selección, por ejemplo, se puede usar el siguiente procedimiento. Mediante el uso de un medio que permite seleccionar transformantes mediante el uso del marcador auxotrófico mencionado anteriormente, se lleva a cabo el cribado, seleccionando así una pluralidad de transformantes de la colonia obtenida.

[0133] A continuación, cada uno de los transformantes se somete individualmente a cultivo líquido. Posteriormente, se investiga una cantidad de expresión de una proteína heteróloga en cada solución de cultivo y se seleccionan transformantes que muestran una mayor cantidad de expresión de la proteína heteróloga. A través de un procedimiento de electroforesis en gel de campo de pulso, se realiza un análisis genómico en los transformantes seleccionados y, de esta manera, se investiga el número de vectores o casetes de expresión incorporados en un cromosoma.

[0134] El número de vectores incorporados en un cromosoma se puede ajustar en cierta medida mediante el ajuste de las condiciones de incorporación o similares. Se considera que la eficiencia de incorporación o el número de vectores incorporados pueden variar con el tamaño (número de bases) o la estructura del vector.

[0135] El transformante según la presente invención tiene una capacidad de producción de ácido málico que es mejor que nunca. Una tasa de producción de ácido málico del transformante es preferentemente igual o superior a 2,0 g/( h), más preferentemente igual o superior a 5,0 g/(l h), incluso más preferentemente igual o superior a 10 g/(l h), y particularmente preferentemente de 15 g/(lh) a 30 g/(lh).

[Procedimiento de fabricación de ácido dicarboxílico C4]

[0136] Un procedimiento para fabricar un ácido dicarboxílico C4 según la presente invención incluye cultivar el transformante según la presente invención en una solución de cultivo y obtener un ácido dicarboxílico C4 de la solución de cultivo.

[0137] Mediante el cultivo del transformante según la presente invención en una solución de cultivo que contiene azúcar, se produce ácido oxaloacético a partir del ácido pirúvico obtenido a partir del azúcar mediante un sistema glicolítico con la ayuda de PYC o se produce a partir del ácido fosfoenolpirúvico con la ayuda de PCK. A partir del ácido oxaloacético producido, se produce ácido málico con la ayuda de MDH, y a partir del ácido málico producido, también se producen otros ácidos dicarboxílicos C4.

[0138] Aunque los ácidos dicarboxílicos C4, incluido el ácido málico producido, se acumulan en la célula microbiana, algunos de ellos se liberan a un sobrenadante de cultivo debido a Mae1 (transportador de ácido dicarboxílico C4). Al obtener ácidos dicarboxílicos C4 del transformante cultivado o el sobrenadante de cultivo, es posible fabricar ácidos dicarboxílicos C4. Los ejemplos de ácidos dicarboxílicos C4 fabricados a partir del transformante incluyen ácido oxaloacético, ácido málico, ácido fumárico, ácido succínico y similares, y entre estos, es preferible el ácido oxaloacético o el ácido málico.

[0139] Como la solución de cultivo utilizada para fabricar un ácido dicarboxílico C4, se puede usar un medio de cultivo conocido que contiene azúcar para levadura. Además, el medio de cultivo debe contener una fuente de nitrógeno, sales inorgánicas y similares que S. pombe puede utilizar y debe permitir que S. pombe se cultive eficientemente. Como solución de cultivo, se puede usar un medio natural o un medio sintético.

[0140] Los ejemplos del azúcar como fuente de carbono incluyen azúcares tales como glucosa, fructosa, sacarosa y maltosa. Los ejemplos de la fuente de nitrógeno incluyen amoníaco, una sal de amonio de un ácido inorgánico u orgánico, tal como cloruro de amonio o acetato de amonio, peptona, casaminoácido, extracto de levadura y similares. Los ejemplos de sales inorgánicas incluyen fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro de sodio y similares. También es posible añadir adicionalmente un factor de aceleración de la fermentación tal como proteolípido.

[0141] En el procedimiento para fabricar un ácido dicarboxílico C4 según la presente invención, es preferible usar una solución de cultivo que contenga particularmente glucosa o sacarosa como azúcar. Una concentración de glucosa o sacarosa en la solución de cultivo (100 % en masa) en la etapa inicial del cultivo es preferentemente igual o superior al 1 % en masa, más preferentemente del 1 % en masa al 50 % en masa, e incluso más preferentemente del 2 % en masa al 16 % en masa. Después de que la concentración de glucosa o la concentración de sacarosa se reduce debido al cultivo, es preferible continuar el cultivo añadiendo glucosa según sea necesario. En la etapa final del cultivo, la concentración de glucosa o similares puede llegar a ser igual o inferior al 1 % en masa.

[0142] En un caso en el que el cultivo continuo se realiza haciendo circular la solución de cultivo en un estado de separación de un ácido dicarboxílico C4, es preferible mantener la concentración de glucosa o similar. Si se establece que la concentración de glucosa es igual o superior al 2 % en masa, la productividad de un ácido dicarboxílico C4 mejora aún más. Además, si se establece que la concentración de glucosa o sacarosa en la solución de cultivo es igual o inferior al 16 % en masa, se mejora aún más la eficiencia de producción de un ácido dicarboxílico C4.

[0143] Para mejorar la productividad de la fabricación de un ácido dicarboxílico C4, es preferible realizar un cultivo de alta densidad. Durante el cultivo de alta densidad, la concentración inicial de células microbianas del transformante en la solución de cultivo, expresada en términos de un peso de células microbianas secas, se establece preferentemente en 0,1 g/l a 100 g/l. La concentración inicial de células microbianas del transformante en la solución de cultivo, expresada en términos de un peso de células microbianas secas, se establece más preferentemente en 20 g/l a 60 g/l. Si se establece que la concentración inicial de células microbianas es alta, se puede lograr una alta productividad en un corto período de tiempo. Además, si la concentración inicial de células microbianas es demasiado alta, puede producirse un problema tal como la agregación de células microbianas o la reducción de la eficiencia de purificación.

[0144] La concentración de células microbianas descrita en los ejemplos y similares, que se describirá más adelante, es un valor convertido a partir de una absorbancia (DO⁶⁶⁰) de luz que tiene una longitud de onda de 660 nm medida por un espectrómetro ultravioleta visible V550 fabricado por JASCO Corporation. El valor de 1 que es igual a DO⁶⁶⁰ a 660 nm corresponde a un peso seco de 0,2 g y a un peso húmedo de 0,8 g de levadura de fisión.

[0145] Para el cultivo, se puede usar un procedimiento de cultivo de levadura conocido. Por ejemplo, se puede realizar cultivo de agitación o cultivo de agitación.

[0146] La temperatura de cultivo es preferentemente de 23 °C a 37 °C, y el tiempo de cultivo se puede determinar adecuadamente.

[0147] El cultivo puede ser cultivo por lotes o cultivo continuo. Por ejemplo, después de que se realiza el cultivo por lotes, al separar las células microbianas de la solución de cultivo, se puede obtener una solución de cultivo que contiene un ácido dicarboxílico C4. Además, los ejemplos del procedimiento de cultivo continuo incluyen un procedimiento para realizar de forma continua el cultivo mediante la repetición de un procedimiento para extraer una parte de la solución de cultivo de un tanque de cultivo en el que se realiza el cultivo, separar un ácido dicarboxílico C4 de la solución de cultivo tomada y recuperar el sobrenadante de cultivo, agregar glucosa o una nueva solución de cultivo al sobrenadante de cultivo y devolver el sobrenadante de cultivo al tanque de cultivo. Al realizar el cultivo continuo, la productividad de un ácido dicarboxílico C4 mejora aún más.

[0148] El transformante según la presente invención tiene una resistencia ácida particularmente excelente. Por lo tanto, incluso a un pH bajo (aproximadamente pH 2 a 4) resultante de la acumulación de un ácido dicarboxílico C4, el transformante puede producir

un ácido dicarboxílico C4 sin ser sometido a neutralización. Por consiguiente, incluso después de que el pH de la solución de cultivo resulte igual o inferior a 3,5, es posible fabricar un ácido dicarboxílico C4 mediante cultivo continuo en el que se continúa el cultivo. El pH de la última etapa del cultivo y el pH durante el cultivo continuo son preferentemente iguales o inferiores a 3,5 y particularmente preferentemente de 2,3 a 3,5. En algunos casos, el cultivo se puede terminar antes de que el pH de la solución de cultivo sea igual o inferior a 3,5.

[0149] Se puede obtener un ácido dicarboxílico C4 de la solución de cultivo mediante un procedimiento conocido. Los ejemplos del procedimiento incluyen un procedimiento en el que las células microbianas se separan por centrifugación de la solución de cultivo después del final del cultivo, y se extrae un ácido dicarboxílico C4 usando éter dietílico o acetato de etilo después de que el pH resulte igual o menor que 1; un procedimiento en el que la solución de cultivo se absorbe en una resina de intercambio iónico y se lava, y a continuación se eluye un ácido dicarboxílico C4; un procedimiento en el que las impurezas se eliminan usando carbón activado; un procedimiento en el que la solución de cultivo se hace reaccionar con alcohol en presencia de un catalizador ácido y a continuación se somete a destilación; y un procedimiento en el que un ácido dicarboxílico C4 se separa usando una membrana de separación.

[0150] Además, en algunos casos, al neutralizar un ácido dicarboxílico C4 en la solución de cultivo y a continuación separar una sal de ácido dicarboxílico C4 de la solución de cultivo, se puede obtener un ácido dicarboxílico C4. Por ejemplo, mediante un procedimiento para convertir un ácido dicarboxílico C4 en la solución de cultivo en una sal de calcio o una sal de litio y cristalizar la sal neutralizada, también se puede obtener un ácido dicarboxílico C4.

[0151] El procedimiento para fabricar un ácido dicarboxílico C4 según la presente invención descrito anteriormente hace posible fabricar un ácido dicarboxílico C4 con alta productividad de una manera simple mediante el uso de un transformante que utiliza S. pombe como hospedador. Según el procedimiento de fabricación, una tasa de producción de un ácido dicarboxílico C4 resulte fácilmente igual o superior a 5 g/l/h y, en algunos casos, la tasa de producción de un ácido dicarboxílico C4 resulte igual o superior a 15 g/l/h. El procedimiento para fabricar un ácido dicarboxílico C4 según la presente invención también es adecuado para un cultivo de alta densidad que se realiza en presencia de glucosa de alta concentración mediante el uso de un transformante de alta concentración.

[Ejemplos]

[0152] En lo sucesivo, la presente invención se describirá específicamente al mostrar ejemplos y ejemplos comparativos. En los presentes ejemplos, a menos que se especifique lo contrario, "%" significa "% en masa".

<Preparación de la cepa de eliminación del gen PDC2de S. pombe>

[0153] Una cepa ARC019 auxotrófica de uracilo de S. pombe (genotipo: h-, leu1-32, ura4-D18, Ade6-M216) (nombre de la cepa: JY741, NBRPID: FY7512) se transformó según un procedimiento de Latour (descrito en la revista Nucleic Acids Research, 2006, vol. 34, p. e11 y la publicación internacional PCT n.° WO2007/063919), preparando así una cepa de eliminación (cepa IGF836) de la que se eliminaron los genes PDC2 (nombre de la cepa: SPAC1F8. 07c).

[0154] Para preparar un fragmento de eliminación, se utilizó como plantilla el ADN genómico total preparado a partir de una cepa A^rC032 de S. pombe (genotipo: h-) (véase la publicación internacional PCT n.° WO2007/015470) mediante el uso de DNeasy (fabricado por QUlAGEN), y se utilizaron 8 tipos de ADN oligo sintético (fabricado por Operon Biotechnologies) que tienen las secuencias de bases mostradas en la tabla 1.

[Tabla 1]

[0155] Específicamente, mediante un procedimiento RCP usando KOD-Dash (fabricado por TOYOBO CO., LTD.), se preparó un dominio UP usando UF y UR, se preparó un dominio OL usando OF y OR, y se preparó un dominio DN usando DF y DR. A continuación, mediante el uso de estos como plantillas, se preparó un fragmento de eliminación de longitud completa mediante el mismo procedimiento de RCP usando FF y ^fR respectivamente. En el momento de preparar el fragmento de eliminación de longitud completa, se utilizaron 2 tipos de ADN oligo sintético (fabricado por Operon Biotechnologies) que tienen las secuencias de bases mostradas en la tabla 2, y se utilizó como plantilla el ADN genómico total preparado a partir de la cepa ARC032 de la misma manera que anteriormente. Además, un fragmento de un dominio de un marcador auxotrófico de uracilo ura4 de S. pombe (nombre de la cepa enumerada en GeneDB: SPCC330.05c, gen orotidina-5'-fosfato descarboxilasa) preparado mediante el mismo procedimiento de RCP también se utilizó en combinación como plantilla.

[0156] Mediante el uso de un fragmento de ADN obtenido mediante el tratamiento de un vector pSHh con una enzima de restricción PmaCI, se transformó la cepa de eliminación del gen PDC2 obtenida de S. pombe (cepa IGF836, h- leu1-32 ura4-D18 ade6-M216 pdc2-D23), obteniéndose así una cepa ASP4590 en la que se restauraron la auxotrofia de uracilo y la auxotrofia de adenina.

[Ejemplo 2]

<Preparación de la cepa de introducción de genes extraños>

[0157] Se prepararon transformantes de pombe (tabla 24) en los que se introdujo PYC derivada de Aspergillus niger (AniPYC) (SEQ ID NO:1), PYC derivada de Brevibacillus brevis (BbrPYC) (SEQ ID NO:2), PYC derivada de Debaryomyces hansenii (DhaPYC) (SEQ ID NO:3), PYC derivada de Kluyveromyces lactis (KlaPYC) (SEQ ID NO:4), PYC derivada de Lachancea thermotolerans (LthPYC) (SEQ ID NO:5), ^pY^c derivada de Lodderomyces elongisporus (LelPYC) (SEQ ID NO:6), PYC derivada de Saccharomyces cerevisiae (ScePYC) (SEQ ID NO:7), PYC derivada de Candida orthopsilosis (CorPYC) (SEQ ID NO:8), PYC derivada de Candida tropicalis (CtrPYC) (SEQ ID NO:9), PYC derivada de Naumovozyma castellii (NcaPYC) (SEQ ID NO:10), PYC derivada de Naumovozyma dairenensis (NdaPYC) (SEQ ID NO:11), PYC derivada de Saccharomyces kudriavzevii (SkuPYC) (SEQ ID NO:12), PYC derivada de S. pombe (SpoPYC) (SEQ ID NO:13), PYC derivada de Tetrapisispora blattae (TblPYC) (SEQ ID NO:14), PYC derivada de Torlaspora delbrueckii (TdePYC) (SEQ ID NO:15), PYC derivada de Zygosaccharomyces rouxii (ZroPYC) (SEQ ID NO:16), MDH derivada de Archaeoglobus fulgidus (AfuMDH) (SEQ ID NO:17), MDH derivada de Congregibacterlitralis (CliMDH) (SEQ ID NO:18), MDH derivada de Delftia acidovorans (DacMDH) (SEQ ID NO:19), MDH derivada de Halomonas elongata (HelMDH) (SEQ ID NO:20) o MDH derivada de Shewanella putrefaciens (SpuMDH) (SEQ ID NO:21).

[0158] Específicamente, la cepa IGF836 (cepa de eliminación génica de S. pombe) preparada en el ejemplo 1 se transformó según el procedimiento de Bahler y col. (la revista Yeast, 1998, vol 14, págs. 943-951) mediante el uso de un digesto de una enzima de restricción BsiWI de un vector recombinante integrador monodentado pSLh-AniPYC que retiene un casete de expresión génica AniPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-BbrPYC que retiene un casete de expresión génica BbrPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-DhaPYC que retiene un casete de expresión génica DhaPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-KlaPYC que retiene un casete de expresión génica KlaPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-LthPYC que retiene un casete de expresión génica LthPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-LelPYC que retiene un casete de expresión génica LelPYC casete, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-ScePYC que retiene un casete de expresión génica ScePYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-CorPYC que retiene un casete de expresión génica CorPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-CtrPYC que retiene un casete de expresión génica CtrPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-NcaPYC que retiene un casete de expresión génica NcaPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-NdaPYC que retiene un casete de expresión génica NdaPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-SkuPYC que retiene un casete de expresión génica SkuPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-SpoPYC que retiene un casete de expresión génica SpoPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-TblPYC que retiene un casete de expresión génica TblPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-TdePYC que retiene un casete de expresión génica TdePYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-ZroPYC que retiene un casete de expresión génica ZroPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSMh AfuMDH que retiene un casete de expresión génica AfuMDH, un vector recombinante integrador monodentado pSMh-CliMDH que retiene un casete de expresión génica CliMDH, o un vector recombinante integrador monodentado pSMh-DacMDH que retiene un casete de expresión génica DacMDH, un vector recombinante integrador monodentado pSMh-HelMDH que retiene un casete de expresión génica HelMDH, o un vector recombinante integrador monodentado pSMh-SpuMDH que retiene un casete de expresión génica SpuMDH.

[0159] El vector recombinante integrador monodentado pSMh se puede preparar a través del siguiente procedimiento. En primer lugar, un fragmento obtenido por digestión de un fragmento de ADN (Fr. 1), que se preparó mediante la síntesis total de ADN y tenía una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO:34, con una enzima de restricción BsiWI y un fragmento de ADN, que se obtuvo mediante la digestión de un vector pSE con una enzima de restricción BsiWI y la digestión doble del digesto obtenido con las enzimas de restricción Kpnl y SnaBI, se sometieron a ligadura, preparando así pSMh (8.849 pb, figura 1) con una secuencia de bases (5'^-3', cíclica) representada por la SEQ ID NO:35.

[0160] pSLh-AniPYC se preparó a través del siguiente procedimiento. En primer lugar, mediante el uso de ADN genómico total preparado por DNeasy (fabricado por QUIAGEN) a partir del cultivo de S. Aspergillus niger como plantilla y mediante el uso de 2 tipos de ADN oligo sintético (AniPYC-F y AniPYC-R fabricado por Operon Biotechnologies) descrito en la tabla 3, se obtuvo un fragmento de ORF de un gen AniPYC mediante un procedimiento de RCP utilizando KOD-Dash (fabricado por TOYOBO CO., LTD.). El fragmento de ORF codificaba AniPYC (SEQ ID NO:1).

[Tabla 3]

[0161] Mediante el uso de un kit de clonación HD In-Fusion (marca registrada) (fabricado por Clontech Laboratories, Inc.), el fragmento amplificado obtenido se incorporó en pSLh, preparando así pSLh-AniPYC. El procedimiento In-Fusion se realizó según el manual incluido en el kit. Es decir, el producto de RCP obtenido se purificó usando una columna de centrifugación, se agregó a una solución de reacción In-Fusion junto con pSLh y se hizo reaccionar durante 15 minutos a 50 °C.

[0162] Mediante el mismo procedimiento que se describió anteriormente, se prepararon un vector recombinante integrador monodentado pSLh-BbrPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-DhaPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-KlaPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-LthPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-LelPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-ScePYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-CorPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-CtrPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-NcaPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-NdaPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-SkuPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-SpoPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-TblPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-TdePYC, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-ZroPYC, un vector recombinante integrador monodentado pSMh-AfuMDH, un vector recombinante integrador monodentado pSMh-CliMDH, un vector recombinante integrador monodentado pSMh-DacMDH, un vector recombinante integrador monodentado pSMh-HeIMDH y un vector recombinante integrador monodentado pSMh-SpuMDH. A continuación, se enumerarán los conjuntos de cebadores que utilizan los vectores respectivos.

[0163] La cepa ASP4590 se transformó usando el vector recombinante integrador monodentado pSLh-ScePYC y el vector recombinante integrador monodentado pSMh-DacMDH, obteniendo así una cepa ASP4491 en la que se introdujeron un gen ScePYC y un gen DacMDH.

Tabla 4

Tabla 5

continuación

[Tabla 6]

Tabla 7

Tabla 8

Tabla 9

Tabla 10

Tabla 11

Tabla 12

Tabla 13

Tabla 14

Tabla 15

Tabla 16

Tabla 17

[Tabla 18]

T l 1

T l 2

T l 21

Tabla 22

Tabla 23

[0164] El nombre y el hospedador de cada uno de los transformantes fabricados y el nombre del gen extraño introducido se muestran en la tabla 24.

T l 24

<Confirmación de la expresión de PYC>

[0165] Para 16 tipos de transformante en los que solo se introdujo el gen PYC, se confirmó una cantidad de expresión de PYC. Específicamente, cada uno de los transformantes se cultivó con agitación durante 44 horas en 20 ml de un medio YPD6, y las células microbianas cultivadas a continuación se recogieron y pulverizaron usando un amortiguador de múltiples perlas. El lisado de células microbianas obtenido se purificó según un protocolo mediante el uso de gel de afinidad de agarosa al M1 de ANTI-FLAG (marca registrada) (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC.). La SDS-PAGE se realizó usando un líquido enzimático purificado, y la banda detectada se digitalizó usando un dispositivo de análisis de imágenes LAS 4000, calculando así una cantidad de expresión relativa. Los resultados de la cantidad de expresión de PYC (valores relativos) para cada uno de los transformantes se muestran en la figura 2. Los resultados muestran que la expresión de PYC se confirmó en todos los transformantes.

<Confirmación de la actividad de PYC>

[0166] Entre los 16 tipos de transformante en los que solo se introdujo el gen PYC, se investigaron ⁸ tipos de transformante que provocaron la expresión de BbrPYC, KluPYC, LthPYC, LelPYC, ScePYC, SkuPYC, SpoPYC o TblPYC con respecto a la actividad de PYC. Específicamente, el líquido enzimático purificado mencionado anteriormente se mezcló con una solución de reacción mantenida

a 30 °C (Tris-HCl 100 mM (pH 7,5), ATP 2 mM, MgCh 100 mM, KCl 100 mM, ácido pirúvico 5 mM, NaHCOa 5 mM, acetil-CoA 0,1 mM, NADH 0,15 mM), y a continuación se midió a lo largo del tiempo mediante el uso de un absorptómetro que tiene una función de mezcla. A partir del cambio temporal de absorbancia obtenido, se calculó una actividad relativa (mU/ml) por líquido enzimático. Los resultados de la actividad de PYC por líquido enzimático calculados para cada uno de los transformantes se muestran en la figura 3. Los resultados muestran que la actividad de PYC se confirmó en todos los transformantes.

<Confirmación de la expresión de MDH>

[0167] Para 5 tipos de transformante en los que solo se introdujo el gen MDH, se confirmó una cantidad de expresión de MDH. Específicamente, cada uno de los transformantes se cultivó de la misma manera que se describe en, <Confirmación de la expresión de PYC>, se preparó un líquido enzimático purificado, se realizó la SDS-PAGE usando el líquido enzimático y se calculó una cantidad de expresión relativa. Los resultados de la cantidad de expresión de MDH (valores relativos) para cada uno de los transformantes se muestran en la figura 4. Los resultados muestran que la expresión de MDH se confirmó en todos los transformantes. <Confirmación de la actividad de MDH>

[0168] Entre los 5 tipos de transformadores en los que solo se introdujo el gen MDH, se investigaron 3 tipos de transformante que provocaron la expresión de CliMDH, DacMDH o HelMDH con respecto a la actividad de MDH. Específicamente, el líquido enzimático purificado mencionado anteriormente se mezcló con una solución de reacción mantenida a 30 °C (Tris-HCl 90 mM (pH 9,0), oxaloacetato 0,5 mM, NADH 0,25 mM) y a continuación se midió a lo largo del tiempo mediante el uso de un absorptómetro que tiene una función de mezcla. A partir del cambio temporal de absorbancia obtenido, se calculó una actividad relativa (mU/ml) por líquido enzimático. Los resultados de la actividad de MDH por líquido enzimático calculados para cada uno de los transformantes se muestran en la figura 5. Los resultados muestran que la actividad de MDH se confirmó en todos los transformantes.

[Ejemplo 3] Preparación de la cepa de eliminación de mae2

[0169] Al eliminar un gen mae2 de la cepa ASP4491 en la que se introdujeron un gen ScePYC y un gen DacMDH, se preparó una cepa de eliminación (cepa ASP4964). Un procedimiento para preparar un fragmento de eliminación de mae² fue el mismo que el procedimiento para preparar el fragmento de eliminación del que se eliminó pdc².

[0170] La cepa ASP4491 (genotipo: Ir, leu1-32, ura4-D18, Ade6-M216, Apdc2, ScePYC, DacMDH) de S. pombe se transformó según el procedimiento de Latour, preparando así una cepa ASP4964 de la que se eliminó un gen mae² (nombre de la cepa:SPCC794. ¹² c).

[0171] Para preparar un fragmento de eliminación, se utilizó como plantilla el ADN genómico total preparado a partir de una cepa ARC032 de S. pombe mediante el uso de DNeasy (fabricado por QUIAGEN), y se utilizaron ⁸ tipos de ADN oligo sintético (fabricado por Operon Biotechnologies) con las secuencias de bases mostradas en la tabla 25.

[Ejemplo 4] Preparación de la cepa de eliminación de fuml

[0172] Al eliminar un gen fuml de la cepa ASP4491 en la que se introdujeron un gen ScePYC y un gen DacMDH, se preparó una cepa de eliminación (cepa ASP4933). Fum1 es una enzima que produce ácido fumárico mediante el uso de ácido málico como matriz. Un procedimiento para preparar un fragmento de eliminación de fum1 es el mismo que el procedimiento para preparar el fragmento de eliminación del que se eliminó pdc².

[0173] La cepa ASP4491 de S. pombe se transformó según el procedimiento de Latour, preparando así una cepa ASP4933 de la que se eliminó un gen fum¹ (nombre de la cepa:SPCC18. 18c/SPCC290. ⁰¹ c).

[0174] Para preparar un fragmento de eliminación, se utilizó como plantilla el ADN genómico total preparado a partir de una cepa ARC032 de S. pombe mediante el uso de DNeasy (fabricado por QUIAGEN), y se utilizaron ⁸ tipos de ADN oligo sintético (fabricado por Operon Biotechnologies) con las secuencias de bases mostradas en la tabla 26.

Tabla 26

<Confirmación de la capacidad de producción de ácido málico>

[0175] Para una cepa salvaje (cepa ARC010) de S. pombe, la cepa de eliminación del gen PDC2 (cepa ASP4590, APDC2), la cepa ASP449l obtenida mediante la introducción de un gen ScePYC y un gen DacMDH en la cepa ASP4590, la cepa ASP4964 (APDC2, Amae2, ScePYC, DacMDH) obtenida mediante la eliminación de un gen mae2 de la cepa ASP4491 y la cepa ASP4933 (APDC2, Afuml, ScePYC, DacMDH) obtenida mediante la eliminación de un gen fuml de la cepa ASP4491, se investigó una tasa de producción de ácido málico.

[0176] Específicamente, las células microbianas se sembraron en una placa YES y se cultivaron durante 96 horas a 30 °C, obteniendo así una colonia. La colonia obtenida se subcultivó en 5 ml de un medio YES (tubo de ensayo) y se cultivó con agitación durante 24 horas a 30 °C. La solución microbiana obtenida se subcultivó en 100 ml de un medio YPD⁶ (matraz Sakaguchi) y se cultivó con agitación durante 44 horas a 30 °C.

[0177] Las células microbianas obtenidas de esta manera se recogieron, se agregaron a 3 ml de un medio de fermentación (100 g/l de glucosa, 111 g/l de carbonato de calcio) en el tubo de ensayo para proporcionar 36 g (peso de células microbianas secas)/l y se fermentaron a 30 °C en condiciones de agitación. Se recogió una muestra en el tiempo del líquido fermentado.

[0178] Para la muestra obtenida, se midieron una concentración de glucosa y una concentración de etanol usando un biosensor BF-7 (fabricado por Oji Scientific Instruments) basado en un procedimiento de electrodo enzimático, y se midió una concentración de ácido málico mediante HPLC. Durante la medición de HPLC, se utilizó un cromatógrafo líquido de alto rendimiento Prominence (fabricado por Shimadzu Corporation), se utilizó Aminex HPX-87H 30037,8 mm (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) como columna, se estableció un volumen de inyección a 10 ml, se utilizó H²SO⁴ 10 mM como disolvente, se estableció un caudal a 0,6 ml/min, se estableció un tiempo de medición a 35 minutos, se estableció una temperatura de medición a 60 °C y se utilizó un detector de matriz de diodos (210 nm) y un detector refractométrico diferencial para la detección. Cada concentración es una concentración por solución de cultivo o líquido fermentado.

[0179] Los resultados medidos de la concentración de glucosa (g/l), la concentración de etanol (g/l) y una concentración de ácido málico (g/l) se muestran en las figuras ⁶ a 10. Los resultados muestran que la producción de ácido málico se confirmó solo en la cepa ASP4964 (APDC2, Amae2,+ScePYC, DacMDH).

<Medición de la tasa de producción de ácido málico>

[0180] Para la cepa ASP4491 (APDC2, ScePYC, DacMDH) y la cepa ASP4892 (APDC2, Amae² ,+ScePYC,+DacMDH), se midió una tasa de producción de ácido málico.

[0181] Específicamente, cada cepa se fermentó de la misma manera que en, <Confirmación de la capacidad de producción de ácido málico>, se recogió una muestra en el tiempo del líquido fermentado y se midieron una concentración de glucosa y una concentración de ácido málico. Los resultados medidos se muestran en la figura 11. En la figura 11, "Glu-4892" y "Glu-4491" muestran un cambio temporal de una concentración de glucosa de la cepa ASP4892 y la cepa ASP4491 respectivamente, y "MA-4892" y "MA-4491" muestran un cambio temporal de una concentración de ácido málico de la cepa ASP4892 y la cepa ASP4491 respectivamente. Como resultado, se confirmó que en un momento en el que transcurrió ¹ hora desde el inicio de la fermentación, una concentración de ácido málico del líquido fermentado de la cepa ASP4892 superó los 20 g/l, y una tasa de producción de ácido málico de la misma fue igual o superior a 20 g/(l h). Además, en un momento en el que transcurrieron 2 horas, una concentración de ácido málico del líquido fermentado se convirtió en 28,9 g/l. En contraste, en el líquido fermentado de la cepa ASP4491, una concentración de ácido málico fue de 3,9 g/l en un momento en el que transcurrieron 2 horas.

[Ejemplo 5] Preparación de la cepa de introducción de PCK

[0182] Se prepararon transformantes de pombe (tabla 47) en los que se introdujo PCK derivada de Candida glabrata (CglPCK) (SEQ ID NO:94), PCK derivada de Citrobacterkoseri (CkoPCK) (SEQ ID NO:95), PCK derivada de Cronobacter sakazakiir (CsaPCK) (SEQ ID NO:96), PCK derivada de Debaryomyces hansenii (DhaPCK) (SEQ ID NO:97), PCK derivada de Escherichia fergusonii (EfePCK) (SEQ ID NO:98), PCK derivada de Edwardsiella tarda (EtaPCK) (SEQ ID NO:99), PCK derivada de Kluyveromyces lactis (KlaPCK) (SEQ ID NO:100), PCK derivada de Lodderomyces elongisporus (LelPCK) (SEQ ID NO:101), PCK derivada de Pectobacterium carotovorum (PcaPCK) (SEQ ID NO:102), PCK derivada de Photobacterium leiognathi (PlePCK) (SEQ ID NO:103), PCK derivada de Providencia rettgeri (Pre-PCK) (SEQ ID NO:104), PCK derivada de Saccharomyces cervisiae (ScePCK) (SEQ ID NO:105), PCK derivada de Serratia odorífera (SodPCK) (SEQ ID NO:106), PCK derivada de Vibrio orientalis (VorPCK) (SEQ ID NO:107), PCK derivada de Vanderwaltozyma polyspora (VpoPCK) (SEQ ID NO:108), PCK derivada de Vibrio tubiashii (VtuPCK) (SEQ ID NO:109), PCK derivada de Yersinia bercovieri(YbePCK) (SEQ ID NO:110), PCK derivada de Yarrowia lipolytica (YliPCK) (SEQ ID NO:111), PCK derivada de Yersinia rohdei (YroPCK) (SEQ ID NO:112) o PCK derivada de Zygosaccharomyces rouxii (ZroPCK) (SEQ ID NO:113).

[0183] Específicamente, la cepa IGF836 (cepa de eliminación génica de S. pombe) preparada en el ejemplo 1 se transformó según el procedimiento de Bahler y col. (la revista Yeast, 1998, vol. 14, págs. 943-951) mediante el uso de un digesto de una enzima de restricción BsiWI de cada vector recombinante integrador monodentado que retiene cada casete de expresión del gen PCK descrito en la tabla 47.

[0184] pSLh-CglPCK se preparó a través del siguiente procedimiento. En primer lugar, mediante el uso de ADN genómico total preparado por DNeasy (fabricado por QUIAGEN) a partir del cultivo de Candida glabrata como plantilla y el uso de 2 tipos de ADN oligo sintético (CglPCK-F y CglPCK-R, fabricado por Operon Biotechnologies) descrito en la tabla 27, se obtuvo un fragmento de o Rf de un gen CglPCK mediante un procedimiento de RCP utilizando KOD-Dash (fabricado por TOYOBO CO., LTD.). El fragmento de ORF codificaba CglPCK (SEQ ID NO:94).

Tabla 27

[0185] Mediante el mismo procedimiento que se describió anteriormente, se prepararon un vector recombinante integrador monodentado pSLh-CkoPCK, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-CsaPCK, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-DhaPCK, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-EfePCK, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-EtaPCK, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-KlaPCK, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-LelPCK, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-PcaPCK, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-PlePCK, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-PrePCK, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-ScePCK, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-SodPCK, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-VorPCK, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-VpoPCK, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-VtuPCK, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-YbePCK, un vector recombinante integrador monodentado pSMh-YliPCK, un vector recombinante integrador monodentado pSMh-YroPCK y un vector recombinante integrador monodentado pSMh-ZroPCK. A continuación, se enumerarán los conjuntos de cebadores que utilizan los vectores respectivos.

T l 2

Tabla 29

Tabla 30

(continuación)

Tabla 31

T l 2

[Tabla 33]

(continuación)

Tabla 34

Tabla 35

Tabla 36

Tabla 37

Tabla 38

Tabla 39

Tabla 40

Tabla 41

Tabla 42

(continuación)

Tabla 43

T l 44

Tabla 45

T l 4

T l 47

<Confirmación de la expresión de PCK>

[0186] Para 20 tipos de transformante en los que solo se introdujo el gen PCK, se confirmó una cantidad de expresión de PCK. Específicamente, cada uno de los transformantes se cultivó con agitación durante 44 horas en 20 ml de un medio YPD⁶ , y las células microbianas cultivadas a continuación se recogieron y pulverizaron usando un amortiguador de múltiples perlas. El lisado de células microbianas obtenido se purificó según un protocolo mediante el uso de gel de afinidad de agarosa al M1 de ANTI-FLAG (marca registrada) (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC.). La SDS-PAGE se realizó usando un líquido enzimático purificado, y la banda detectada se digitalizó usando un dispositivo de análisis de imágenes LAS 4000, calculando así una cantidad de expresión relativa. Los resultados de la cantidad de expresión de PCK (valor relativo) calculada para cada uno de los transformantes se muestran en la figura 12. Los resultados muestran que la expresión de PCK se confirmó en todos los transformantes.

[Ejemplo ⁶ ] Preparación de la cepa de introducción EcoPCK, la cepa de introducción GglPYC y la cepa de introducción EcoMDH

[0187] Se prepararon transformantes de pombe en los que se introdujeron PCK derivada de Escherichia coli (EcoPCK) (SEQ ID NO:154), PYC derivada de Gallus gallus (GglPYC) (SEQ ID NO:155) y MDH derivada de Escherichia coli (EcoMDH) (SEQ ID NO:156).

[0188] Específicamente, la cepa IGF836 (cepa de eliminación génica de S. pombe) preparada en el ejemplo 1 se transformó según el procedimiento de Bahler y col. (la revista Yeast, 1998, vol. 14, págs. 943-951) mediante el uso de un digesto de una enzima de restricción BsiWI de un vector recombinante integrador monodentado pSNh-EcoPCK que retiene un casete de expresión génica EcoPCK, un vector recombinante integrador monodentado pSLh-GglPYC que retiene un casete de expresión génica GglPYC, o un vector recombinante integrador monodentado pSMh-EcoMDH que retiene un casete de expresión génica EcoMDH.

[0189] pSNh-EcoPCK se preparó a través del siguiente procedimiento. En primer lugar, mediante el uso de Ad N genómico total preparado por DNeasy (fabricado por QUiAg EN) a partir del cultivo de Escherichia coli como plantilla y mediante el uso de 2 tipos de A^d N oligo sintético (EcoPCK-F y EcoPCK-R, fabricado por Operon Biotechnologies) descrito en la tabla 48, se obtuvo un fragmento de Or F de un gen EcoPCK mediante un procedimiento de RCP utilizando KOD-Dash (fabricado por TOYOBO CO., LTD.). El fragmento de ORF codificaba EcoPCK (SEQ ID NO:154).

[Tabla 48]

[0190] Mediante el uso de un kit de clonación HD In-Fusion (marca registrada) (fabricado por Clontech Laboratories, Inc.), el fragmento amplificado obtenido se incorporó en pSNh, preparando así pSNh-EcoPCK. El procedimiento In-Fusion se realizó según el manual incluido en el kit. Es decir, el producto de RCP obtenido se purificó usando una columna de centrifugación, se agregó a una solución de reacción In-Fusion junto con pSNh y se hizo reaccionar durante 15 minutos a 50 °C.

[0191] Mediante el mismo procedimiento que se describió anteriormente, se prepararon un vector recombinante integrador monodentado pSLh-GalPYC y un vector recombinante integrador monodentado pSMh-EcoMDH. A continuación, se enumerarán los conjuntos de cebadores que utilizan los vectores respectivos.

Tabla 49

Tabla 50

(continuación)

[0192] El nombre y el hospedador de cada uno de los transformantes fabricados y el nombre de los genes extraños introducidos se muestran en la tabla 51.

T l 1

Confirmación de la expresión de PCK, PYC, o MDH>

[0193] Para 3 tipos de transformante en los que solo se introdujo el gen PCK, el gen PYC o el gen MDH, se confirmó una cantidad de expresión de PCK, PYC o MDH. Específicamente, cada uno de los transformantes se cultivó con agitación durante 44 horas en 20 ml de un medio YPD⁶ , y las células microbianas cultivadas a continuación se recogieron y pulverizaron usando un amortiguador de múltiples perlas. El lisado de células microbianas obtenido se purificó según un protocolo mediante el uso de gel de afinidad de agarosa al M1 de ANTI-FLAG (marca registrada) (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC.). La SDS-PAGE se realizó usando un líquido enzimático purificado. Como resultado, no se detectó ninguna banda en ninguno de los líquidos enzimáticos. Este resultado muestra que incluso si el gen EcoPCK, el gen GglPYC o el gen EcoMDH se introducen en S. pombe, estas enzimas no se expresan y, por lo tanto, no se obtiene actividad eficaz.

[Ejemplo 7] Preparación de la cepa de producción de ácido málico

[0194] Según el procedimiento descrito en los ejemplos 2, 3 y 5, se prepararon los transformantes mostrados en la tabla 52.

T l 2

(continuación)

[Ejemplo ⁸ ] Confirmación del efecto resultante de la eliminación de mae2

[0195] Para confirmar el efecto resultante de la eliminación de mae2, se realizó la producción fermentativa de ácido mélico utilizando la cepa ASP4491, la cepa ASP4964, la cepa ASP4933 y la cepa ASP5127.

[0196] Específicamente, las células microbianas se sembraron en una placa YES y se cultivaron durante 96 horas a 30 °C, obteniendo así una colonia. La colonia obtenida se subcultivó en 5 ml de un medio YES (tubo de ensayo) y se cultivó con agitación durante 24 horas a 30 °C. La solución microbiana obtenida se subcultivó en 100 ml de un medio YPD⁶ (matraz Sakaguchi) y se cultivó con agitación durante 44 horas a 30 °C.

[0197] Las células microbianas obtenidas de esta manera se recogieron, se agregaron a 3 ml de un medio de fermentación (100 g/l de glucosa, 111 g/l de carbonato de calcio) en el tubo de ensayo para proporcionar 36 g (peso de células microbianas secas)/l y se fermentaron a 30 °C en condiciones de agitación. Se recogió una muestra en el tiempo del líquido fermentado.

[0198] Para la muestra obtenida, se midieron una concentración de glucosa y una concentración de etanol usando un biosensor BF-7 (fabricado por Oji Scientific Instruments) basado en un procedimiento de electrodo enzimático, y se midió una concentración de ácido mélico mediante HPLC. Durante la medición de HPLC, se utilizó un cromatógrafo líquido de alto rendimiento Prominence (fabricado por Shimadzu Corporation), se utilizó Aminex HPX-87H 30037,8 mm (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) como columna, se estableció un volumen de inyección a 10 ml, se utilizó H²SO⁴ 10 mM como disolvente, se estableció un caudal a 0,6 ml/min, se estableció un tiempo de medición a 35 minutos, se estableció una temperatura de medición a 60 °C y se utilizó un detector de matriz de diodos (210 nm) y un detector refractométrico diferencial para la detección. Cada concentración es una concentración por solución de cultivo o líquido fermentado. Los resultados se muestran en la tabla 53.

[0199] Como resultado, en la cepa ASP4964 de la que se eliminó mae2, la cantidad de ácido mélico producido aumentó adicionalmente en aproximadamente 10 veces que en la cepa ASP4491. En contraste, en la cepa ASP4933 obtenida mediante la eliminación de fum¹ , que utiliza ácido málico como una matriz al igual que mae² , de la cepa ASP4491, la cantidad de ácido málico producido prácticamente no aumentó. Además, en la cepa ASP5127 de la que solo se eliminaron mae2 y pdc2 y en la que no se introdujeron PYC y MDH, se confirmó la producción de ácido málico en una cantidad de aproximadamente 5 g/l.

[Ejemplo 9] Confirmación del efecto resultante de la introducción de PCK

[0200] Para confirmar el efecto resultante de la introducción de PCK, se realizó la producción fermentativa de ácido málico utilizando la cepa ASP5126, la cepa ASP5087, la cepa ASP5088 y la cepa ASP5089.

[0201] La producción fermentativa de ácido málico se realizó de la misma manera que en el ejemplo 7. Los resultados se muestran en la tabla 54.

[0202] Se confirmó que en la cepa ASP5087 en la que se introdujo PCK derivada de Saccharomyces cerevisiae (ScePCK), la cepa ASP5088 en la que se introdujo PCK derivada de Photobacterium leiognathi (PlePCK), y la cepa ASP5089 en la que se introdujo ^pC^k derivada de Yersinia bercovieri (YbePCK), se mejoró aún más una tasa de producción de ácido málico y una concentración final de ácido málico que en la cepa ASP5126 en la que no se introdujo PCK ni PYC.

[Ejemplo 10] Confirmación del efecto resultante de la introducción de PYC

[0203] Para confirmar el efecto resultante de la introducción de PYC, se realizó la producción fermentativa de ácido málico utilizando la cepa ASP5126, la cepa ASP4964, la cepa ASP5132 y la cepa ASP5135.

[0204] La producción fermentativa de ácido málico se realizó de la misma manera que en el ejemplo 7. Los resultados se muestran en la tabla 55.

T l

(continuación)

[0205] Se confirmó que en la cepa ASP4964 en la que se introdujo PYC derivada de Saccharomyces cerevisiae, la cepa ASP5132 en la que se introdujo PYC derivada de Kluyveromyces lactis (KlaPYC), y la cepa ASP5135 en la que se introdujo PYC derivada de S. pombe (SpoPYC), se mejoró aún más una tasa de producción de ácido málico y una concentración final de ácido málico que en la cepa ASP5126 en la que no se introdujo ninguno de PCK y PYC.

[Ejemplo 11] Confirmación del efecto resultante de la introducción de MDH

[0206] Para confirmar el efecto resultante de la introducción de MDH, se realizó la producción fermentativa de ácido málico utilizando la cepa ASP5125, la cepa ASP5215, la cepa ASP5216, la cepa a Sp 5127, la cepa ASP4964, la cepa ASP5129 y la cepa ASP5131.

[0207] La producción fermentativa de ácido málico se realizó de la misma manera que en el ejemplo 7. Los resultados se muestran en la tabla 56.

(continuación)

[0208] Se confirmó que en la cepa ASP5215 en la que se introdujeron CliMDH y PCK, la cepa ASP5216 en la que se introdujeron HelMDH y PCK, la cepa ASP5217 en la que se introdujeron SpuMDH y PCK, la cepa ASP4964 en la que se introdujeron HelMDH y PYC, la cepa ASP5129 en la que se introdujeron CliMDH y PYC, y la cepa ASP5131 en la que se introdujeron SpuMDH y PYC, se mejoró aún más una tasa de producción de ácido málico y una concentración final de ácido málico que en la cepa ASP5125 en la que no se introdujo MDH pero se introdujo PYC.

[Ejemplo 12] Confirmación del efecto resultante del aumento del número de copias de genes introducidos [0209] Para confirmar el efecto resultante del aumento del número de copias de los genes introducidos, se realizó la producción fermentativa de ácido málico usando la cepa ASP4964 y la cepa ASP5235.

[0210] La producción fermentativa de ácido málico se realizó de la misma manera que en el ejemplo 7. Los resultados se muestran en la tabla 57.

[0211] Se confirmó que en la cepa ASP5235 en la que se introdujeron 2 copias de PYC y 2 copias de MDH, se mejoró aún más una tasa de producción de ácido málico y una concentración final de ácido málico que en la cepa ASP4964 en la que se introdujeron una copia de PYC y una copia de MDH.

[Ejemplo 13] Producción fermentativa de ácido málico en condiciones de no neutralización

[0212] Para confirmar la producción de ácido málico en condiciones de no neutralización, la producción fermentativa de ácido málico se realizó utilizando la cepa ASP4964 y la cepa ASP5235.

[0213] Específicamente, se agregaron células microbianas cultivadas mediante el mismo procedimiento que en el ejemplo 7 a 3 ml de un medio de fermentación (100 g/l de glucosa) en un tubo de ensayo para proporcionar 36 g (peso de células microbianas secas)/l y se fermentaron a 30 °C en condiciones de agitación. Se recogió una muestra en el tiempo del líquido fermentado.

[0214] La muestra obtenida se midió de la misma manera que en el ejemplo 7. Los resultados se muestran en la tabla 58. Como resultado, se confirmó que todas las cepas producían ácido málico en condiciones de no neutralización. El pH de la muestra de cepa ASP4964 que se recogió después de que se realizó la fermentación durante 1 hora fue de 3,5, y el pH de la muestra que se recogió después de que se realizó la fermentación durante 2 horas fue de 3,0. Además, el pH de la muestra de cepa ASP5235 que se recogió después de que se realizó la fermentación durante 1 hora fue de 3,0, y el pH de la muestra que se recogió después de que se realizó la fermentación durante 2 horas fue de 2,8.

[0215] La prioridad se reivindica en la solicitud de patente japonesa n.° 2014-135043, depositada el 30 de junio de 2014.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un transformante que comprende uno o más genes extraños de uno o más tipos seleccionados del grupo que consiste en un gen de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y un gen de piruvato carboxilasa que se incorporan en un cromosoma de Schizosaccharomyces pombe como hospedador,

en el que se ha eliminado o desactivado un gen que codifica piruvato descarboxilasa 2 en el hospedador, el gen de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 94 a 113, o un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia igual o superior al 80 % con una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 94 a 113 y tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa,

el gen de piruvato carboxilasa codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 16, o un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia igual o superior al 80 % con una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 16 y tiene actividad de piruvato carboxilasa, y

se ha eliminado o desactivado adicionalmente un gen que codifica la enzima málica 2 en el hospedador.

2. El transformante según la reivindicación 1, en el que uno o más genes extraños de la malato deshidrogenasa se incorporan adicionalmente en el mismo.

3. El transformante según la reivindicación 2, en el que los genes de la malato deshidrogenasa codifican un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 17 a 21, o un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia igual o superior al 80 % con una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 17 a 21 y tiene actividad de malato deshidrogenasa.

4. El transformante según la reivindicación 1, en el que uno o más genes extraños de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa o uno o más genes extraños de la piruvato carboxilasa y uno o más genes extraños de la malato deshidrogenasa se incorporan en el cromosoma del hospedador.

5. Un procedimiento de fabricación de un ácido dicarboxílico que tiene 4 átomos de carbono, que comprende: cultivar el transformante, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en una solución de cultivo; y obtener un ácido dicarboxílico que tiene 4 átomos de carbono del transformante cultivado o un sobrenadante de cultivo.

6. El procedimiento de fabricación de un ácido dicarboxílico que tiene 4 átomos de carbono, según la reivindicación 5, en el que el ácido dicarboxílico que tiene 4 átomos de carbono es ácido málico o ácido oxaloacético.

7. El procedimiento de fabricación de un ácido dicarboxílico que tiene 4 átomos de carbono, según la reivindicación 5 o 6, en el que el cultivo continúa incluso después de que el pH de la solución de cultivo resulte igual o inferior a 3,5.