ES2615267T3

ES2615267T3 - Métodos para la síntesis y purificación de ácido desoxicólico

Info

Publication number: ES2615267T3
Application number: ES12800614.5T
Authority: ES
Inventors: Daniel J. GANLEY; Jeremy WILT
Original assignee: Kythera Biopharmaceuticals LLC
Current assignee: Kythera Biopharmaceuticals LLC
Priority date: 2011-06-16
Filing date: 2012-06-14
Publication date: 2017-06-06
Anticipated expiration: 2032-06-14
Also published as: EP2721047A4; EP2721047A2; HK1197069A1; TWI665211B; WO2012174229A3; WO2012174229A2; EP3138850B1; EP3138850A1; US20130085125A1; TWI572616B; EP3138850B8; TW201317258A; ES2746311T3; EP2721047B1; TW201716424A

Abstract

Un método para purificar ácido desoxicólico bruto o una de sus sales, cuyo método comprende: i) una primera recristalización del ácido desoxicólico bruto o una de sus sales en un alcohol de C1-3 en cloruro de metileno para proporcionar un producto; y ii) una segunda recristalización del producto de la etapa i) en una mezcla de agua desionizada y un alcohol de C1-3 para proporcionar ácido desoxicólico puro o una de sus sales.

Description

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DESCRIPCION

Metodos para la sfntesis y purificacion de acido desoxicolico Referenda cruzada a solicitud relacionada Antecedentes de la invencion

Campo de la invencion

Esta invencion se refiere a la sfntesis del acido desoxicolico y sus sales, asf como a intermedios utiles en la sfntesis del acido desoxicolico. Esta invencion proporciona ademas composiciones de acido desoxicolico purificado y metodos para su purificacion en los que el acido desoxicolico tiene una pureza de al menos 99%.

Estado de la tecnica

La eliminacion rapida de la grasa corporal es un ideal antiguo y muchas sustancias han asegurado obtener dichos resultados, aunque pocas han demostrado resultados. La “mesoterapia”, o el uso de inyectables para eliminar la grasa, no esta ampliamente aceptada entre los profesionales medicos debido a preocupaciones de seguridad y eficacia, aunque se han realizado declaraciones homeopaticas y cosmeticas desde los anos 1950. La mesoterapia se concibio originalmente en Europa como un metodo de utilizacion de inyecciones cutaneas que contienen una mezcla de compuestos para el tratamiento de estados locales medicos y cosmeticos. Aunque la mesoterapia se empleo tradicionalmente para el alivio del dolor, sus aplicaciones cosmeticas, particularmente la eliminacion de la grasa y la celulitis, han recibido atencion recientemente en los Estados Unidos. Uno de dichos tratamientos declarados para reduccion de la grasa localizada, que se popularizo en Brasil y usa inyecciones de fosfatidilcolina, ha sido considerado erroneamente equivalente a la mesoterapia. A pesar de su atraccion como renombrada inyeccion “disuelve grasa”, hay pocos datos sobre la seguridad y eficacia de estos tratamientos cosmeticos. Vease, Rotunda, A. M. y M. Kolodney, Dermatologic Surgery 32: 465-480 (2006) (“Mesotherapy and Phosphatidylcholine Injections: Historical Clarification and Review").

La bibliograffa publicada recientemente informa de que el acido biliar, acido desoxicolico, y sus sales, tienen propiedades eliminadoras de grasa cuando se inyectan en depositos de grasa in vivo. Veanse los documentos WO 2005/117900 y WO 2005/112942, asf como US2005/0261258; US2005/0267080; US2006/127468; y

US2006/0154906. El desoxicolato inyectado en el tejido graso degrada las celulas grasas mediante un mecanismo citolftico. Debido a que el desoxicolato inyectado en la grasa es rapidamente inactivado por exposicion a protefna y a continuacion vuelve rapidamente a los contenidos intestinales, sus efectos estan restringidos espacialmente. Como resultado de este efecto de atenuacion que confiere seguridad clfnica, las terapias de eliminacion de grasa necesitan habitualmente de 4-6 sesiones. Esta eliminacion de grasa localizada sin necesidad de cirugfa es beneficiosa no solo para el tratamiento terapeutico relacionado con los depositos de grasa localizada patologicos (p. ej. dislipidemias incidentes a una intervencion medica en el tratamiento del VIH), sino tambien para la eliminacion de grasa cosmetica sin el riesgo concomitante inherente en cirugfa (p. ej. liposuccion). Vease Rotunda et al., Dermatol. Surgery 30: 1001-1008 (2004) (“Detergent effects of sodium deoxycholate are a major feature of an injectable phosphatidylcholine formulation used for localized fat dissolution") y Rotunda et al., J. Am. Acad. Dermatol. (2005: 973-978) (“Lipomas treated with subcutaneous deoxycholate injections").

Ademas, muchos esteroides importantes tienen un sustituyente 12-a-hidroxi en el anillo C del esteroide. Dichos compuestos incluyen, como ejemplo, los acidos biliares tales como el acido desoxicolico, acido colico, acido litocolico y similares. Hasta este momento, dichos compuestos se recuperaron habitualmente de fuentes bovinas y ovinas que proporcionaban una fuente facil de acidos biliares en cuanto a rentabilidad. Sin embargo, con el reciente descubrimiento de que patogenos tales como los priones pueden contaminar dichas fuentes, metodos alternativos para la sfntesis de acidos biliares a partir de fuentes vegetales o materiales iniciales sinteticos se han vuelto cada vez mas importantes. Por ejemplo, el acido desoxicolico de animales en Nueva Zelanda es una fuente de acidos biliares para uso humano bajo el regimen reglamentario de Estados Unidos, con tal de que los animales sigan permaneciendo aislados y en caso contrario libres de patogenos observables. Dichas condiciones estrictas imponen una limitacion a la cantidad de acidos biliares obtenidos de mamfferos adecuados y no excluye la posibilidad de que el acido biliar este libre de dichos patogenos. Ademas, el documento De Sanctis et al., Acta Cryst. 34: 1928-1933 (1978) describe la fase hexagonal del canal 3:2:1 complejo entre el acido desoxicolico, etanol y agua, el documento GB-A-716670 describe metodos de sfntesis y purificacion del acido desoxicolico, el documento CN-A-101148468 describe un metodo para extraer acido colico, acido desoxicolico y bilirrubina, el documento US-A-2891972 describe procedimientos de separacion del acido desoxicolico de una mezcla de acidos biliares brutos o sus sales y el documento GB-A-695504 describe un metodo para aislar y purificar los acidos colico y desoxicolico.

Sigue habiendo una necesidad de cantidades adecuadas de acidos biliares eficaces, tales como el acido desoxicolico que se conozca desde el principio que este libre de restos de origen animal (o restos patogenicos capaces de actuar en un animal, particularmente en un mamffero, y para uso humano, que tengan un efecto perjudicial en humanos) y otros agentes nocivos tales como metabolitos animales o microbianos, toxinas, incluyendo las toxinas bacterianas tales como pirogenos, para uso como medicamentos en humanos.

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Ademas, hay una necesidad de preparar una composicion de un acido biliar libre de otros acidos biliares. A este respecto, se sabe que el acido desoxicolico obtenido a partir de mairnferos esta contaminado con acido colico. A su vez, se sabe ademas que el acido colico es un componente esencial en la formacion de calculos biliares. Consecuentemente, hay una necesidad continua de proporcionar metodos para preparar y purificar acido desoxicolico cuyos metodos no produzcan contaminacion con otros acidos biliares.

Compendio de la invencion

Segun un primer aspecto de esta invencion, se proporciona un metodo para purificar acido desoxicolico bruto o una de sus sales, cuyo metodo comprende:

i) una primera recristalizacion del acido desoxicolico bruto o una de sus sales en un alcohol de C1-3 en cloruro de metileno para proporcionar un producto; y

ii) una segunda recristalizacion del producto de la etapa i) en una mezcla de agua desionizada y un alcohol de C1-3 para proporcionar acido desoxicolico o una de sus sales.

En un modo de realizacion de esta invencion, el metodo comprende:

a)

con hidrogeno y Pd/C en condiciones de hidrogenacion que comprenden hidrogeno y Pd sobre carbon en un autoclave mantenido a elevada presion, seguido opcionalmente por oxidar cualquiera de los grupos 12- hidroxilo formados durante la hidrogenacion con clorocromato de piridinio en condiciones de oxidacion para proporcionar el compuesto 2:

imagen1

b) hacer reaccionar el compuesto 2 con hidruro de litio tri-t-alcoxialuminio en condiciones reductoras para

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una de sus sales; antes de la etapa i).

En uno de sus aspectos de composicion, esta invencion se refiere a composiciones que comprenden acido desoxicolico o una de sus sales y una mezcla de uno o mas alcohol(es) de C1-3 y cloruro de metileno.

En otro de sus aspectos de composicion, esta invencion se refiere a composiciones que comprenden acido desoxicolico o una de sus sales y una mezcla de uno o mas alcohol(es) de C1-3 y agua desionizada.

En un modo de realizacion, la pureza del acido desoxicolico puro o una de sus sales es al menos 99%. En otro modo de realizacion, la pureza es al menos 99,5%. En otro modo de realizacion, la pureza es al menos 99,75%.

Descripcion detallada de la invencion

Como se usa en la presente memoria, algunos terminos pueden tener los siguientes significados definidos. Como se usa en la descripcion y en las reivindicaciones la forma “un”, “uno(una)” y “el(ella)” incluyen referencias en singular y en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

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poner en contacto el compuesto 1:

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A menos que se indique de otra forma, todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reaccion, etc. usados en la descripcion y en las reivindicaciones, deben entenderse como modificadas en todos los casos por el termino “aproximadamente”. Consecuentemente, a menos que se indique lo contrario, los parametros numericos descritos en la siguiente descripcion y en las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones. Cada parametro numerico debe ser interpretado al menos teniendo en cuenta los dfgitos significativos citados y aplicando las tecnicas habituales de redondeo.

Como se usa en la presente memoria, se pretende que el termino “comprende” significa que los compuestos y metodos incluyen los elementos citados pero sin excluir otros. La expresion “consiste esencialmente en” cuando se usa para definir composiciones y metodos, debe significar que excluye otros elementos con cualquier importancia esencial para los compuestos o metodos. La expresion “consiste en” debe significar excluyendo mas que elementos traza de otros ingredientes para los compuestos y etapas esenciales del metodo reivindicados. Los modos de realizacion definidos por cada uno de estos terminos transicionales estan dentro del alcance de esta invencion. Consecuentemente, se pretende que los metodos y compuestos pueden incluir etapas y componentes adicionales (comprenden) o alternativamente incluyen etapas y compuestos adicionales sin importancia (consisten esencialmente en) o alternativamente, pretenden ser solo las etapas del metodo o los compuestos indicados (consisten en).

El termino “agente oxidante” se refiere a un reactivo que puede aceptar electrones en una reaccion de oxidacion - reduccion. De esta forma, se puede anadir oxfgeno a una molecula o se puede eliminar hidrogeno de una molecula. Los agentes oxidantes incluyen, solo como ejemplo, el reactivo de Jones, hidroperoxido de terc-butilo, hipoclorito de sodio, clorocromato de piridinio y CrO3. En un ejemplo, el agente oxidante es especffico para alcoholes vecinales (1,2) e incluyen compuestos de peryodato. Dichos agentes oxidantes se denominan a veces “agentes oxidantes de alcohol vecinal”.

El termino “agente reductor” se refiere a un reactivo que puede donar electrones en una reaccion de oxidacio n- reduccion, permitiendo que se anada hidrogeno a una molecula. Agentes reductores adecuados incluyen hidruro de litio y aluminio, borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio y similares.

El termino “condiciones de hidrogenacion” se refiere a condiciones y catalizadores adecuados para introducir H2 en uno o mas enlaces dobles. Los catalizadores de hidrogenacion incluyen los basados en metales del grupo del platino (platino, paladio, rodio y rutenio), tales como Pd/C y PtO2.

El termino “sal farmaceuticamente aceptable” o “una de sus sales” se refiere a las sales farmaceuticamente aceptables del acido desoxicolico, cuyas sales se obtienen a partir de varios contraiones organicos e inorganicos bien conocidos en la tecnica y que incluyen, solo como ejemplo, sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio y tetraalquilamonio.

La numeracion del esqueleto esteroideo como se usa en la presente memoria sigue la convencion general:

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Se debe entender que, a menos que se especifique de otra forma, los esqueletos solo representan la posicion de los atomos de carbono. Uno o mas enlaces entre dos atomos de carbono adyacentes pueden ser un doble enlace y uno o mas atomos de carbono pueden estar opcionalmente sustituidos.

El termino “acido desoxicolico bruto o una de sus sales” se refiere al acido desoxicolico con una pureza de menos de 98% (determinada por HPLC).

El termino “acido desoxicolico puro o una de sus sales" se refiere al acido desoxicolico con una pureza de al menos 99% (determinada por HPLC). Se entiende que el termino “puro” no significa que las impurezas esten totalmente excluidas de la composicion. Algunas impurezas estan presentes, pero la cantidad total de impurezas no es mas de 1%.

Procedimientos de sfntesis

Los diversos materiales iniciales, intermedios y compuestos de los modos de realizacion preferidos pueden ser aislados y purificados cuando sea apropiado usando tecnicas convencionales tales como precipitacion, filtracion, cristalizacion, evaporacion, destilacion y cromatograffa. La caracterizacion de estos compuestos se puede realizar

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usando metodos convencionales, tales como punto de fusion, espectro de masas, resonancia magnetica nuclear y otros varios analisis espectroscopicos.

En un modo de realizacion, esta invencion proporciona la sfntesis del acido desoxicolico a partir del compuesto 1. La sfntesis del compuesto 1 ha sido descrita en el documento WO2011/075701.

Metodos

i) una primera recristalizacion del acido desoxicolico bruto o una de sus sales en un alcohol de C1-3 en cloruro de metileno; y

ii) una segunda recristalizacion del producto de la etapa i) en una mezcla de agua desionizada y un alcohol de C1-3 para proporcionar acido desoxicolico puro o una de sus sales.

En un modo de realizacion de esta invencion, el alcohol de C1-3 en la etapa i) comprende metanol. En un modo de realizacion adicional, el alcohol de C1-3 en la etapa i) comprende metanol 1% molar-5% molar en cloruro de metileno. En un modo de realizacion, el alcohol de C1-3 en la etapa i) comprende metanol 1% molar; alternativamente metanol 2% molar; alternativamente metanol 3% molar; alternativamente metanol 4% molar; y alternativamente metanol 5% molar. En otro modo de realizacion, el alcohol de C1-3 en la etapa i) comprende metanol 2% molar en cloruro de metileno. En otro modo de realizacion, la etapa i) comprende ademas una temperatura de aproximadamente 32- 42°C; alternativamente aproximadamente 34-40°C; y alternativamente aproximadamente 35-37°C. En otro modo de realizacion, la etapa i) comprende ademas una temperatura de aproximadamente 35-37°C.

En otro modo de realizacion, esta invencion proporciona un metodo para purificar acido desoxicolico bruto o una de sus sales, cuyo metodo comprende:

i) una primera recristalizacion del acido desoxicolico bruto o una de sus sales en MeOH 2% molar en Ch^Ch a una temperatura de aproximadamente 35-37°C; y

En otro modo de realizacion el alcohol de C1-3 en la etapa ii) comprende etanol. En otro modo de realizacion, la etapa ii) comprende una segunda recristalizacion del producto de la etapa i) en una mezcla de agua desionizada al 5% en etanol; alternativamente agua desionizada al 10% en etanol; y alternativamente, agua desionizada al 15% en etanol. En otro modo de realizacion, la etapa ii) comprende una segunda recristalizacion del producto de la etapa i) en una mezcla de agua desionizada al 10% en etanol.

i) una primera recristalizacion del acido desoxicolico bruto o una de sus sales en metanol 2% molar en cloruro de metileno a una temperatura de aproximadamente 35-37°C; y

ii) una segunda recristalizacion del producto de la etapa i) en una mezcla de agua desionizada al 10% en etanol para proporcionar acido desoxicolico puro o una de sus sales.

En otro modo de realizacion, esta invencion proporciona un metodo para preparar acido desoxicolico o una de sus sales, cuyo metodo comprende:

a) poner en contacto el compuesto 1:

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con hidrogeno y Pd/C en condiciones de hidrogenacion que comprenden hidrogeno y Pd sobre carbon en un autoclave mantenido a elevada presion opcionalmente seguido por oxidar cualquiera de los grupos 12- hidroxilo formados durante la hidrogenacion con clorocromato de piridinio en condiciones de oxidacion para proporcionar el compuesto 2:

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b)

c)

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hacer reaccionar el compuesto 2 con hidruro de litio y trialcoxialuminio en condiciones de reduccion para

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una de sus sales;

antes de la etapa i)

En otro modo de realizacion, esta invencion proporciona un metodo para preparar acido desoxicolico puro o una de sus sales, cuyo metodo comprende:

a) poner en contacto el compuesto 1:

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b) hacer reaccionar el compuesto 2 con hidruro de litio y trialcoxialuminio en condiciones de reduccion para proporcionar el compuesto 3:

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c) exponer al compuesto 3 a condiciones de desproteccion e hidrolisis para formar acido desoxicolico bruto o una de sus sales; y

d) purificar el acido desoxicolico bruto o una de sus sales por un metodo que comprende:

En la presente memoria se describen composiciones que comprenden acido desoxicolico o una de sus sales y una

mezcla de una o mas alcohol(es) de C1-3 y cloruro de metileno. En un modo de realizacion, el alcohol de C1-3 comprende metanol. En otro modo de realizacion, el alcohol de C1-3 comprende metanol 1% molar-5% molar. En otro modo de realizacion, la composicion comprende metanol 2% molar. En otro modo de realizacion, la invencion comprende composiciones en las que dicho acido desoxicolico o una de sus sales son sinteticos.

5 En la presente memoria tambien se describen composiciones que comprenden acido desoxicolico sintetico o una de sus sales y una mezcla de uno o mas alcohol(es) de C1-3 y agua desionizada. En un modo de realizacion, el alcohol de C1-3 comprende etanol. En otro modo de realizacion, la composicion comprende una mezcla de agua desionizada al 5% en etanol; alternativamente, agua desionizada al 10% en etanol; y alternativamente, agua desionizada al 15% en etanol. En otro modo de realizacion, la composicion comprende una mezcla de agua desionizada al 10% en 10 etanol. En otro modo de realizacion, la invencion comprende composiciones, en las que dicho acido desoxicolico o una de sus sales son sinteticos.

Ejemplos

En los ejemplos siguientes y en cualquier otro lugar en la memoria descriptiva, las siguientes abreviaturas tienen los significados indicados. Si la abreviatura no esta definida, tiene su significado generalmente aceptado.

Ac: Acetilo

ADC: Acido desoxicolico

DCM (CH2Cl2): Diclorometano

ELSD: Deteccion evaporativa de dispersion de luz

EtOH: Etanol

EtOAc: Acetato de etilo

g: Gramos

H o h: Hora

HCl: Acido clorhfdrico

HPLC: Cromatograffa lfquida de alta presion

Hz: Hercio

LiAl(OtBu)3H: Hidruro de litio y tri-terc-butoxialuminio

PAS: Perdidas al secar

Me: Metil

MeOH: Metanol

MHz: Megahercio

Min: Minutos

mL: Mililitro

mmol: Milimol

Mol
Mol

Na2SO4: Sulfato de sodio

NaOH: Hidroxido de sodio

NMD: No mas de

Pd/C: Paladio sobre carbon

PtO2: Oxido de platino

ATF: Acido trifluoroacetico

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THF: Tetrahidrofurano

TLC: Cromatograffa en capa fina

UV: Ultravioleta

p: Peso

General: Todas las manipulaciones de materiales sensibles al oxfgeno y a la humedad se realizaron con matraces de dos bocas convencionales secados a la llama en atmosfera de argon o de nitrogeno. La cromatograffa en columna se realizo usando gel de sflice (malla 60-120). La cromatograffa en capa fina (TLC) analftica se realizo en placas Merck Kiesinger 60 F254 (0,25 mm). La visualizacion de las manchas fue bien con luz UV (254 nm) o bien carbonizandolas con una disolucion de acido sulfurico (5%) y p-anisaldehfdo (3%) en etanol.

Dispositivos: Los espectros de resonancia magnetica nuclear de proton y de carbono 13 (RMN de 1H y RMN de 13C) se registraron en un espectrometro Varian Mercury-Gemini 200 (RMN de 1H, 200 MHz, RMN de 13C, 50 MHz) o Varian Mercury-Inova 500 (RmN de 1H, 500 MHz, RMN de 13C, 125 MHz) con las resonancias del disolvente como patrones internos (RMN de 1H, CHCh a 7,23 ppm o DMSO a 2,5 ppm y DMSO-H2O a 3,33 ppm; RMN de 13C, CDCh a 77,0 ppm o DMSO a 39,5 ppm). Los datos de RMN de 1H se dan como sigue: desplazamiento qufmico (6, ppm), multiplicidad (s = singlete, d = doblete, t = triplete, q = cuartete, br = amplio, m = multiplete), constantes de acoplamiento (Hz) e integracion. Los espectros de infrarrojo (FT-IR) se realizaron en un modelo JASCO-460+. Los espectros de masas se obtuvieron con un espectrometro Perkin Elmer API-2000 usando modo ES+. Los puntos de fusion se determinaron usando un dispositivo de medida del punto de fusion LAB-INDIA y no estan corregidos. Los cromatogramas de HPLC se registraron usando un modelo SHIMADZU-2010 con un detector PDA. Las rotaciones opticas especfficas se determinaron usando un dispositivo JASCO-1020 a 589 nm y no estan corregidos.

Productos qufmicos: A menos que se indique de otro modo, se usaron reactivos disponibles comercialmente sin purificacion. El dietil eter y el THF se destilaron en sodio/benzofenona. Se usaron DMF anhidro de grado laboratorio, DCM, acetato de etilo y hexano disponibles comercialmente.

Ejemplo 1

En el esquema 1 siguiente, se proporciona un esquema para la sfntesis y purificacion del acido desoxicolico a partir del compuesto 1.

Esquema 1

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La hidrogenacion del compuesto 1 en una escala de 10,0 g usando Pd/C seco al 10% (15% en peso) en acetato de etilo (20 partes) se anadio y se aplicaron aproximadamente 3,447 bares (50 psi) de presion de hidrogeno y la temperatura aumento hasta 70°C. Despues de alcanzar la temperatura de 70°C, se observo un aumento de la presion de hidrogeno a aproximadamente 4,137 bares (60 psi), se mantuvieron estas condiciones durante 60 h. Despues de 60 horas, se observaron todavfa 0,6% de compuesto 2 y 2,75% de alcohol alflico, por lo que se agito adicionalmente durante 12 h adicionales (se observo 0,16% de alcohol alflico y 0,05% de compuesto 2). Despues de finalizacion, la reaccion proporciono 9,5 g de residuo.

Otra reaccion de hidrogenacion con 25 g de compuesto 1 con las condiciones anteriores durante 76 h proporciono 24,5 g de residuo.

Metodo A

Se anadio Pd/C al 10% (900 mg) a una disolucion del compuesto 1 (2,0 g, 4,5 mmoles) en EtOAc (150 mL) y la lechada resultante se hidrogeno en un dispositivo de Parr (3,447 bares = 50 psi) a 50°C durante 16 h. En este punto, se determino por TLC que la reaccion habfa finalizado. La mezcla se filtro a traves de un pequeno tapon de Celita® y 5 el disolvente se elimino a vacfo proporcionando el compuesto 2 (1,6 g, rendimiento de 80%) como un solido blanco.

TLC: carbonizacion con p-anisaldehfdo, Rf de 2 = 0,36.

Fase movil de TLC: EtOAc al 20% en hexanos

RMN de 1H (500 MHz, CDCla): 6 = 4,67-4,71 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 2,45-2,50 (t, J = 15 Hz, 2H), 2,22-2,40 (m, 1H), 2,01 (s, 3H), 1,69-1,96 (m, 9H), 1,55 (s, 4H), 1,25-1,50 (m, 8H), 1,07-1,19 (m, 2H), 1,01 (s, 6H), 0,84-0,85 (d, J = 7,0 10 Hz, 3H).

RMN de 13C (125 MHz, CDCla): 6 = 214,4, 174,5, 170,4, 73,6, 58,5, 57,4, 51,3, 46,4, 43,9, 41,2, 38,0, 35,6, 35,5, 35,2, 34,8, 32,0, 31,2, 30,4, 27,4, 26,8, 26,2, 25,9, 24,2, 22,6, 21,2, 18,5, 11,6.

Masa (m/z) = 447,0 [M+ + 1], 464,0 [M+ + 18].

IR (KBr) = 3445, 2953, 2868, 1731, 1698, 1257, 1029 cm'1.

15 P. F. = 142,2 - 144,4 QC (en mezcla de EtOAc/hexanos).

[a]D = +92 (c = 1% en CHCl3).

Pureza por ELSD: 96,6%: Tiempo de retencion = 9,93 (Inertsil ODS 3V, 250 x 4,6 mm, 5 um, ACN: TFA al 0,1% en agua (90:10).

Metodo B

20 Se anadio una lechada de Pd/C al 10% (9 g en 180 mL de acetato de etilo) a una disolucion del compuesto 1 (36 g, 81 mmoles) en EtOAc (720 mL) y la lechada resultante se trato con gas hidrogeno (3,447 bares = 50 psi) a 45-50°C durante 16 h. (Se usaron un total de 1.080 mL de disolvente). En este punto se determino que la reaccion habfa finalizado por HPLC (NMD 1% de compuesto 1). La mezcla se filtro a traves de Celita® (10 g) y se lavo con acetato de etilo (900 mL). El filtrado se concentro a 50% de su volumen por destilacion a vacfo por debajo de 50°C. A la 25 disolucion concentrada se anadio clorocromato de piridinio (20,8 g) a 25-35°C y la mezcla se agito durante 2 h a 25- 35°C, cuando la reaccion aparecio completa por HPLC (el contenido de alcohol alflico es NMD 1%).

Los siguientes procedimientos pueden ser realizados si el contenido de compuesto 1 es mas de 5%. Se filtro la masa de reaccion a traves de Celita® (10 g) y se lavo con acetato de etilo (360 mL). Se lavo el filtrado con agua (3 x 460 mL) y a continuacion con salmuera saturada (360 mL). Se seco la fase organica sobre sulfato de sodio (180 g), 30 se filtro y se lavo con acetato de etilo (180 mL). Se concentro el volumen al 50% por destilacion a vacfo por debajo de 50°C. Se transfirio la disolucion a un autoclave limpio y seco. Se anadio la lechada de paladio al 10% sobre carbon (9 g en 180 mL de acetato de etilo). Se presurizo a 3,447 bares (50 psi) con hidrogeno y se agito la mezcla de reaccion a 45-50°C durante 16 h.

Despues del consumo total del compuesto 1 determinado por HPLC (siendo el contenido de compuesto 1 NMD 1%), 35 la mezcla de reaccion se filtro a traves de Celita® (10 g) y la torta de filtracion se lavo con acetato de etilo (900 mL). El disolvente se concentro a vacfo por destilacion a vacfo por debajo de 50°C. Se anadio metanol (150 mL) y se concentro a sequedad por destilacion a vacfo por debajo de 50°C. Se anadio metanol (72 mL) al residuo y la mezcla se agito durante 15-20 min a 10-15°C, se filtro y la torta de filtracion se lavo con metanol (36 mL). El solido blanco se seco en un secador de aire caliente a 45-50°C durante 8 h para PAS) siendo NMD 1% para proporcionar el 40 compuesto 2 (30 g, rendimiento de 83,1%).

Conversion del compuesto 2 al compuesto 3

Metodo A

Se anadio gota a gota una disolucion en THF de hidruro de litio y tri-terc-butoxialuminio (1M, 22,4 mL, 22,4 mmoles) a una disolucion del compuesto 2 (2,5 g, 5,6 mmoles) en THF (25 mL) a temperatura ambiente. Despues de agitar 45 durante 4-5 h adicionales, se determino que la reaccion habfa finalizado por TLC. Se detuvo la reaccion anadiendo HCl acuoso (1M, 10 mL) y se diluyo la mezcla con EtOAc (30 mL). Se separaron las fases y la fase organica se lavo secuencialmente con agua (15 mL) y disolucion saturada de salmuera (10 mL). La fase organica se seco a continuacion sobre Na2SO4 anhidro (3 g) y se filtro. El filtrado se concentro a vacfo y el solido resultante se purifico por cromatograffa en columna [29 mm (A) x 500 mm (L), sflice de malla 60-120, 50 g], eluyendo con EtOAc/hexano 50 (2:8) [fracciones de 5 mL, monitorizado por TLC con carbonizacion con p-anisaldehfdo]. Las fracciones que

contenfan el producto se combinaron y se concentraron a vacfo para dar el compuesto 3 (2,3 g, 91%) como un solido blanco.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

TLC: carbonizacion con p-anisaldehfdo, Rf para 3 = 0,45 y Rf para 2 = 0,55.

Fase movil de TLC: EtOAc al 30% en hexanos.

RMN de 1H (500 MHz, CDCla): 6 = 4,68-4,73 (m, 1H), 3,98 (s, 1H), 3,66 (s, 3H), 2,34-2,40 (m, 1H), 2,21-2,26 (m, 1H), 2,01 (s, 3H), 1,75-1,89 (m, 6H), 1,39-1,68 (m, 16H), 1,00-1,38 (m, 3H), 0,96-0,97 (d, J = 5,5 Hz, 3H), 0,93 (s, 3H), 0,68 (s, 3H).

RMN de 13C (125 MHz, CDCla): 8 = 174,5, 170,5, 74,1, 72,9, 51,3, 48,1, 47,2, 46,4, 41,7, 35,8, 34,9, 34,7, 34,0, 33,5, 32,0, 30,9, 30,8, 28,6, 27,3, 26,8, 26,3, 25,9, 23,4, 22,9, 21,3, 17,2, 12,6.

Masa (m/z) = 449,0 [M+ + 1], 466,0 [M+ + 18].

IR (KBr) = 3621, 2938, 2866, 1742, 1730, 1262, 1162, 1041, cm'1.

P. F. = 104,2-107,7°C (en EtOAc).

[a]D = +56 (c = 1% en CHCl3).

Pureza por ELSD : 97,0%. Tiempo de retencion = 12,75 (Inertsil ODS 3V, 250 x 4,6 mm, 5 um, ACN: agua (60:40). Metodo B

Se anadio durante 1 h una disolucion en THF de hidruro de litio y tri-terc-butoxialuminio (1M, 107,6 mL, 107,6 mmoles) a una disolucion del compuesto 2 (30,0 g, 67 mmoles) en THF seco (300 mL) a 0-5°C. Despues de agitar durante 4 h adicionales a 5-10°C, se determino que la reaccion habfa finalizado por HPCL (NMD 1% del compuesto 2). La mezcla de reaccion se enfrio a 0-5°C y se detuvo anadiendo HCl 4N (473 mL). Se separaron las fases. La fase acuosa se extrajo con DCM (2 x 225 mL) y las fases organicas combinadas de lavaron secuencialmente con agua (300 mL) y disolucion de salmuera saturada (300 mL). A continuacion se concentro a sequedad la fase organica por destilacion a vacfo por debajo de 50°C. Se anadio metanol (150 mL) al residuo y se concentro a sequedad por destilacion a vacfo por debajo de 50°C. A continuacion se anadio agua (450 mL) al residuo y la mezcla se agito durante 15-20 min, se filtro y la torta de filtracion se lavo con agua (240 mL). El solido blanco se seco en un secador de aire caliente a 35-40°C durante 6 h para proporcionar el compuesto 3 (30 g, 99,6%).

Conversion del compuesto 3 en ADC bruto:

A una disolucion de 3 en MeOH (4 vol.) y THF (4 vol.) se le anadio una disolucion de NaOH (4,0 equiv.) en agua DI (5M) manteniendo la temperatura por debajo de 20°C. El analisis por HPLC despues de 20 horas a 20-25°C indico <0,5% AUC de 3 y que permanecfan los dos intermedios. Se considero que la reaccion habfa finalizado, se diluyo con agua DI (10 vol.) y se concentro a ~10 volumenes. Se preparo un azeotropo de la muestra con 2-MeTHF (2 x 10 vol.) y se analizo por RMN de 1H para comprobar que ya no habfa MeOH. La fase acuosa rica se lavo con 2-MeTHF (2 x 10 vol.) y se analizo por HPLC para determinar que quedaba 0,3% AUC de impureza de alcohol. La fase acuosa se diluyo con 2-MeTHF (10 vol.) y se ajusto a pH = 1,7-2,0 usando HCl 2M (~4 vol.) Se separaron las fases y la fase de 2MeTHF se lavo con agua DI (2 x 10 vol.). La fase de 2MeTHF se filtro sobre celita y la torta de filtracion se lavo con 2-MeTHF (2 vol.). El filtrado de 2-MeTHF se destilo a ~10 volumenes y se preparo un azeotropo con n-heptano que contenfa Statsafe™ 5000 (3 x 10 vol.) hasta ~10 vol. Se analizo la mezcla por RMN de 1H para determinar que quedaba <5% molar de 2-MeTHF con respecto al n-heptano. La lechada se mantuvo durante un mfnimo de 2 horas a 20-25°C y se filtro. La torta de filtracion se lavo con n-heptano (2 x 10 vol.) y se acondiciono a vacfo en el filtro Nutsche con N2 durante un mfnimo de 1 hora para obtener el ADC bruto como solido blanco. Pureza = 94,6% (por HPLC). Analisis por HPLC para DS-ADC (NMD 5% AUC).

Recristalizacion del acido desoxicolico (ADC)

Se diluyo el ADC bruto con MeOH 2% molar en CH2Cl2 (25 vol.) y se calento a 35-37°C durante 1 hora. Se dejo enfriar la lechada a 28-30°C y se filtro. La torta de filtracion se lavo con CH2Cl2 (5 vol.) y se seco a vacfo a 40°C para obtener el ADC. Analisis por HPLC para DS-ADC (NMD 0,15% AUC).

El ADC se disolvio en agua DI 10%/EtOH (12 vol.), se realizo filtrado/pulido sobre celita y se lavo con agua DI 10%/EtOH (3 vol.). El filtrado de 15 vol. resultante se anadio agua DI (30 vol.) y se obtuvo una lechada blanca fina. La lechada se mantuvo durante 24 horas, se filtro, se lavo con agua DI (20 vol.) y se seco a vacfo a 40°C para obtener ADC puro. Se realizo el analisis de OVI (impurezas volatiles organicas, por sus iniciales en ingles) para CH2Cl2, EtOH, n-heptano, MeOH y MeTHF para asegurar que cada disolvente estaba por debajo de las directrices de la ICH. Se realizo el analisis KF (NMD 2,0%). Pureza = 99,75% (por HPLC). Rendimiento a partir del ADC bruto = 59%.

Claims

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10

15

20

25

30

35

REIVINDICACIONES

1. - Un metodo para purificar acido desoxicolico bruto o una de sus sales, cuyo metodo comprende:

i) una primera recristalizacion del acido desoxicolico bruto o una de sus sales en un alcohol de C1-3 en cloruro de metileno para proporcionar un producto; y

ii) una segunda recristalizacion del producto de la etapa i) en una mezcla de agua desionizada y un alcohol de C1-3 para proporcionar acido desoxicolico puro o una de sus sales.
2. - El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el alcohol de C1-3 en la etapa i) comprende metanol, tal como metanol 1% molar-5% molar en cloruro de metileno, por ejemplo metanol 2% molar en cloruro de metileno.
3. - El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa i) comprende ademas una temperatura de aproximadamente 35-37°C.
4. - El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa i) comprende una primera recristalizacion en metanol 2%molar en cloruro de metileno a una temperatura de aproximadamente 35-37°C.
5. - El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el alcohol de C1-3 en la etapa ii) comprende etanol.
6. - El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa ii) comprende una segunda recristalizacion en una mezcla de agua desionizada al 10% en etanol.
7. - El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el metodo comprende:

i) una primera recristalizacion del acido desoxicolico bruto o una de sus sales en metanol 2% molar en cloruro de metileno a una temperatura de aproximadamente 35-37°C; y

ii) una segunda recristalizacion del producto de la etapa i) en una mezcla de agua desionizada al 10% en etanol.
8. - El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el cual comprende:

a) poner en contacto el compuesto 1:

imagen1

con hidrogeno y Pd/C en condiciones de hidrogenacion que comprenden hidrogeno y Pd sobre carbon en un autoclave mantenido a presion elevada seguido opcionalmente por oxidar cualquiera de los grupos 12- hidroxilo formados durante la hidrogenacion con clorocromato de piridinio en condiciones de oxidacion para proporcionar el compuesto 2:

imagen2

b) hacer reaccionar el compuesto 2 con hidruro de litio y tri-t-alcoxialuminio en condiciones reductoras para proporcionar el compuesto 3:

imagen3

c) exponer el compuesto 3 a condiciones de desproteccion e hidrolisis para formar acido desoxicolico bruto o una de sus sales;

antes de la etapa i).