ES2614742T3 - Derivados fotorreticulados del ácido hialurónico y el procedimiento de preparación y uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Derivados fotorreticulados del ácido hialurónico (AH) que consisten en AH, un espaciador bifuncional de polietilenglicol (PEG), que es trietilenglicol, y un compuesto fotorreactivo seleccionado de derivados de cumarina.

Description

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DESCRIPCION

Derivados fotorreticulados del acido hialuronico y el procedimiento de preparacion y uso de los mismos Sumario de la invencion

La presente invencion desvela derivados del acido hialuronico (AH) fotorreticulados que consisten en AH, un espaciador bifuncional de polietilenglicol (PEG) que es trietilenglicol y un compuesto fotorreactivo seleccionado de un derivado de cumarina.

Antecedentes tecnicos

Los hidrogeles y las esponjas son redes de polfmeros que se caracterizan por una estructura tridimensional, que es compacta en el caso de los hidrogeles y que tiene poros interconectados en el caso de las esponjas. Las esponjas normalmente absorben una gran cantidad de agua, aunque esta caractenstica (“hinchamiento”) puede ser menos marcada en los hidrogeles, dependiendo de la compacidad del hidrogel; un gel muy compacto absorbe menos agua que una que no es muy compacto.

Estos tipos de materiales se han estudiado durante algun tiempo; por ejemplo, los hidrogeles se utilizan en los campos de la administracion de farmacos, relleno de tejidos blandos y trastornos articulares que se benefician de la insercion en la articulacion de “cojinetes” que absorben las tensiones y los choques. Las esponjas se utilizan en particular en el campo de la ingeniena de tejidos, sobre todo por su capacidad para ser colonizadas por celulas. Las aplicaciones obviamente dependen totalmente de la naturaleza del polfmero de partida usado. Espedficamente en el caso de la presente invencion, el polfmero elegido es un polisacarido, es decir, acido hialuronico (AH), un heteropolisacarido que consiste en residuos alternantes de acido D-glucuronico y N-acetil-D-glucosamina. Es un polfmero de cadena lineal con un peso molecular de hasta 13 x 106 Da, dependiendo de la fuente de la que se obtiene y los procedimientos de preparacion utilizados. Esta ubicuamente presente y juega un papel importante en el organismo biologico, especialmente como un soporte mecanico para las celulas de muchos tejidos, tales como piel, tendones, musculos y cartflago. Tambien modula muchos procedimientos diferentes relativos a la fisiologfa y biologfa celular, tales como la proliferacion celular, la migracion y la diferenciacion y la angiogenesis (Weigel P. et al., J Theoretical Biol, 1986:219-234; Abatangelo G. et al., J Surg Res, 1983, 35:410-416; Goa K. et al., Drugs, 1994, 47:536-566) y tambien realiza otras funciones, como la hidratacion de los tejidos y la lubricacion de las articulaciones. En las articulaciones, el acido hialuronico contenido en el lfquido sinovial actua como un lubricante viscoso durante los movimientos lentos, mientras que durante los movimientos rapidos, debido a sus propiedades elasticas, absorbe cualquier traumatismo o microtraumatismo que afecte a la articulacion (Balazs EA. et al, J Rheumatol Suppl, 1993, 12:.75-82; Belcher C. et al., Annals of the Rheumatic Diseases, 1997, 56:299-307). La combinacion de estas propiedades, que son ampliamente reconocidas, ha sido explotada durante algun tiempo en la preparacion de apositos utilizados en el tratamiento de heridas, ulceras y lesiones de la piel de diversos ongenes y en dispositivos medicos disenados para su aplicacion intra-articular para el tratamiento de la artrosis, la degeneracion del cartflago, etc.

Se usan numerosos procedimientos para obtener hidrogeles con caractensticas espedficas a partir de diversos polisacaridos; el mas importante utilizado con exito en el acido hialuronico incluye la reticulacion qrnmica, el uso de moleculas (divinil sulfona, BDDE) que reaccionan espedficamente con los grupos funcionales dados, o la polimerizacion por radicales libres. Estos procedimientos, que suponen una modificacion qrnmica del AH que los hace adecuados para la reticulacion posterior o reaccion de polimerizacion (derivatizacion), dan lugar a hidrogeles con buenas caractensticas de compacidad, resistencia qrnmica y mecanica e hidratabilidad; sin embargo, como la derivatizacion y la reticulacion se llevan a cabo de forma simultanea, los residuos reactivos pueden conservar su estructura durante la formacion del gel, y son muy a menudo toxicos, ya que son diffciles de eliminar.

Otro sistema para la obtencion de la formacion de una reticulacion del polfmero es el uso de radiacion UV en polisacaridos previamente derivatizados con grupos funcionales adecuados para hacerlos fotorreactivos. La derivatizacion implica la union a las sustancias de polisacaridos que, cuando se activa por la radiacion UV, se unen entre sf, reticulando las diferentes cadenas de polfmero y creando de este modo la red. Dicho procedimiento es particularmente ventajoso porque permite la eliminacion facil y eficaz de residuos de reaccion indeseables o productos intermedios durante la etapa de derivatizacion y por lo tanto ayuda a que el producto final sea mas seguro. Se pueden utilizar numerosas sustancias fotorreactivas; por ejemplo, se conocen hidrogeles (EP0554898; US6602859) y esponjas (EP1666503) obtenidos a partir de AH derivatizado con acido cinamico o timina. En estos casos, el acido hialuronico esta unido al acido cinamico o al residuo de timina y luego se irradia para obtener el hidrogel; en el caso de la esponjas, el hidrogel se seca por congelacion o se congela y despues se somete a un segundo ciclo de irradiacion. Una sustancia fotorreactiva adicional que se puede utilizar es la propiofenona; se conocen geles obtenidos a partir de acido hialuronico o derivados del mismo que estan unidos a traves de enlaces ester a la propiofenona y que luego son irradiados (EP1519962). Otros fotorreactivos conocidos en la tecnica anterior son antraceno, riboflavina, cumarina y uracilo, adecuadamente derivatizados y sustituidos, para promover la union con el polisacarido, que normalmente es del tipo ester o amida y, por lo tanto, implica los grupos -OH, -COOH y -NH2 que normalmente estan presentes en el polisacarido. El polisacarido es a menudo derivatizado antes de la reaccion, por ejemplo, para proteger algunos grupos funcionales o para promover la formacion de la union deseada.

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Las caractensticas de los hidrogeles, tales como compacidad, hidratabilidad, resistencia mecanica, etc., se pueden variar mediante la modulacion de los diversos parametros (tipo de polisacarido, fotorreactivo, enlace entre las dos entidades, porcentaje de fotorreactivo en comparacion con polisacarido, la intensidad y duracion de la irradiacion).

En el ambito de la presente invencion, el solicitante ha descubierto sorprendentemente que el acido hialuronico unido a un fotorreactivo particular a traves de un espaciador espedfico produce, despues de la irradiacion UV adecuada, hidrogeles de excelente compacidad que son biodegradables, biocompatibles, no toxicos y que tienen propiedades de memoria de forma; en otras palabras, dichos hidrogeles mantienen la forma del recipiente en el que se prepararon y se pueden cortar conservando su estructura, o de otro modo manipular muy facilmente. Las mismas caractensticas tambien pertenecen a las esponjas reivindicadas en el presente documento y se obtienen de forma innovadora no a partir de un hidrogel, como se ha descrito hasta la fecha por la tecnica anterior, sino a partir de una solucion de acido hialuronico unido al espaciador y al fotorreactivo, posterior liofilizacion y finalmente irradiacion UV; a diferencia de las esponjas conocidas, por lo tanto, se requiere una unica etapa de irradiacion, lo que representa una ventaja considerable industrial. Las esponjas tambien poseen memoria de forma y por lo tanto pueden ser remojadas y apretadas varias veces, manteniendo las mismas caractensticas de forma y estructura, y requieren una sola irradiacion UV. El solicitante ha demostrado que este conjunto de caractensticas se asocia con el uso de un espaciador en particular, lo que hace que la invencion sea nueva e inventiva en comparacion con la tecnica anterior.

En particular, el Ejemplo 8 y la Figura 8 ilustran los datos comparativos para el grado de hinchamiento entre hidrogeles preparados de acuerdo con el Ejemplo 2 de dicha patente anterior EP 1519962, propiedad del solicitante, y los hidrogeles preparados de acuerdo con el Ejemplo 15 de la presente solicitud de patente. Como estos ultimos hidrogeles absorben menos agua, son mas compactos y la reticulacion es por lo tanto mas eficiente.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion desvela y reivindica derivados del acido hialuronico (AH) fotorreticulados, su procedimiento de preparacion por reticulacion basada en la irradiacion UV de los compuestos intermedios fotorreticulables adecuadamente preparados, y el uso de dichos derivados fotorreticulados en el campo medico. Los derivados fotorreticulados descritos en el presente documento adoptan la forma de hidrogeles con diferentes grados de compacidad o esponjas, es decir, estructuras tridimensionales con poros interconectados. Son biocompatibles, biodegradables, no toxicos y, sobre todo, se puede modular su grado de compacidad o porosidad. Una caractenstica adicional de estas invenciones es la memoria de forma, es decir, la capacidad de mantener su forma incluso fuera del recipiente en el que se produjeron y, en el caso de las esponjas, despues de ser remojadas y apretadas repetidamente. Los productos de acuerdo con la presente invencion se pueden aplicar en numerosos campos medicos y biomedicos. Los hidrogeles, por ejemplo, se puede utilizar para:

• la liberacion de los principios activos encapsulados en o qmmicamente unidos a ellos; los diversos principios activos incluyen sustancias farmacologicamente y/o biologicamente activas, tales como factores troficos, antibioticos, antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, protemas, peptidos, hormonas y extractos de plaquetas;

• objetos de revestimiento para uso medico;

• encapsular materiales solidos tales como polvos de hueso, granulos de coral, materiales bioceramicos e hidroxiapatita, con los cuales se pueden modelar pastas para su uso en el campo de la cirugfa ortopedica, odontologfa, etc.;

• rellenar defectos de distintos tamanos en los tejidos blandos, tales como arrugas, cicatrices deprimidas y cavidades derivadas de la cirugfa;

• actuar como andamios para el crecimiento celular y la regeneracion de tejido, tal como hueso, tejido adiposo, piel, cartflago, tendones, ligamentos, musculos, tejido nervioso, tejido endotelial, tejido conjuntivo, etc. Las celulas, ya sea diferenciadas o indiferenciadas, pueden ser insertadas en el andamio antes de la implantacion y convenientemente cultivadas; opcionalmente, el andamio puede ser insertado en la lesion a tratar y se deja que sea colonizado por las celulas fisiologicamente presentes en el sitio de la lesion. Para este tipo de aplicacion puede ser particularmente util mezclar el acido hialuronico antes de la irradiacion con colageno, el cual, al permanecer ffsicamente atrapado en la malla de hidrogel formada, da al hidrogel mayor elasticidad y mejora su capacidad estructural y la adaptacion al sitio donde sera colocado;

• actuar como una barrera mecanica postoperatoria contra adherencias y proteger a los tejidos contra el dano inflamatorio;

• tratar la artrosis y/o dano del cartflago por inyeccion intra-articular. Una vez mas, el hidrogel puede contener celulas diferenciadas o no diferenciadas y/o sustancias farmacologicas o biologicamente activas, como se describe anteriormente.

Las esponjas son especialmente utiles en el campo de la ingeniena de tejidos (por ejemplo para la piel, hueso, cartflago, tejido adiposo, tendones, ligamentos, musculos, nervios, endotelio y tejido conjuntivo) debido a su capacidad para alojar celulas en sus poros; como en el caso de los hidrogeles, las celulas, ya sea diferenciadas o indiferenciadas, pueden ser insertadas en el andamio antes de la implantacion, y convenientemente cultivadas; opcionalmente, el andamio puede ser insertado en la lesion a tratar y dejar que sea colonizado por las celulas fisiologicamente presentes en el sitio de la lesion. Debido a su estructura, las esponjas son particularmente adecuadas para la reconstruccion de tejido en las lesiones cavitadas y profundas, tales como las formadas despues

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de la cirugfa ablativa mayor (eliminacion total y parcial de mama, melanoma o nevos de profundidad).

Las esponjas se pueden utilizar tambien, como los hidrogeles, como material de relleno para lesiones oseas o dentales, combinadas opcionalmente con sustancias farmacologicamente y/o biologicamente activas, y, finalmente, para el tratamiento intra-articular de la artrosis y el dano del cartflago. La adicion de colageno a las esponjas antes de la liofilizacion (que precede a la irradiacion) de nuevo les confiere mejores caractensticas estructurales de estabilidad y elasticidad y las hace particularmente adaptables a la forma y el tamano del sitio en el que se van a utilizar.

Los derivados a los que se refiere esta invencion consisten en:

• acido hialuronico;

• el espaciador de PEG bifuncional espedfico;

• un fotorreactivo, seleccionado de derivados de cumarina

los cuales, unidos como se describe a continuacion, forman intermedios fotorreticulables, que a su vez, despues de la irradiacion UV, dan lugar a derivados fotorreticulados en forma de los hidrogeles y esponjas descritos y reivindicados en el presente documento. Como se ha indicado, los derivados pueden contener opcionalmente colageno, para los fines descritos anteriormente.

Mas espedficamente, un primer objeto de la presente invencion son derivados fotorreticulados de acido hialuronico (AH) que consiste en AH, un espaciador bifuncional de polietilenglicol (PEG) que es trietilenglicol y un compuesto fotorreactivo seleccionado de derivados de cumarina.

Como se ha indicado, el polisacarido utilizado es el acido hialuronico, cuyas caractensticas principales ya se han descrito. En detalle, el AH utilizado en el presente documento puede derivar de cualquier fuente, tal como por extraccion de crestas de gallo (EP 138572), fermentacion (de Streptococcus equi o zooepidemicus) o biosrntesis (de Bacillus) y tienen un peso molecular medio que vana entre 10 kDa y 1.000 kDa, preferentemente entre 40k Da y 700 kDa, e incluso mas preferentemente entre 160 kDa y 220 kDa; esta ultima fraccion se abreviara en lo sucesivo como “AH con un PM medio de 200 kDa”. Cabe destacar que en la presente memoria, “peso molecular medio” significa el peso molecular promedio en peso, calculado por el procedimiento de “viscosidad intnnseca” (Terbojevich et al., Carbohydr Res, 1986, 363-377).

En cuanto a espaciadores, el polietilenglicol (PEG) es adecuado para los fines de la presente invencion. El PEG se obtiene por polimerizacion de oxido de etileno; consiste en una cadena lineal, y es ampliamente utilizado en la industria qmmica y farmaceutica por su versatilidad, y sobre todo por su falta de toxicidad. Tambien es un espaciador bifuncional, que puede unirse a diferentes moleculas en cada uno de los dos extremos de su cadena. Se puede tener un PM extremadamente variable, dependiendo del grado de polimerizacion; para los fines de la presente invencion, el PEG utilizado es trietilenglicol, que tiene un PM de 150 Da; por lo tanto, es una cadena formada sustancialmente por tres residuos.

Por lo que respecta a los fotorreactivos, entre los diversos tipos de derivados de cumarina disponibles (umbeliferona, esculetina, escopoletina, psoralenos, furanocumarina y dicumarol), se prefiere particularmente la 7-hidroxi cumarina, tambien conocida como umbeliferona.

Finalmente, con respecto al colageno, se puede utilizar el colageno nativo y/o colageno hidrolizado (gelatina) que deriva de la extraccion de todos los tipos de tejido, en particular, de tendon y piel equino, porcino, bovino y ovino. Ademas de los colagenos extrafdos, no deben descartarse los diversos tipos de colageno producidos por biotecnologfa (fermentativa o enzimatica). La relacion entre AH fotorreticulable y el colageno puede oscilar entre 5:1 y 1:5 peso/peso, dependiendo del tipo de la estructura final a obtener; se prefiere particularmente el colageno de tendon equino, en una proporcion de AH fotorreticulable/colageno que vana entre 1:1 y 1:4.

Un objeto adicional de la presente invencion es el intermedio de reaccion que consiste en la solucion isotonica reticulable que comprende acido hialuronico (AH), un espaciador bifuncional de polietilenglicol (PEG) que es trietilenglicol y un compuesto fotorreactivo seleccionado de derivados de cumarina, en los que el enlace entre el espaciador bifuncional y el AH es un enlace ester o amida y el enlace entre el compuesto fotorreactivo y el espaciador bifuncional es un enlace eter.

La presente invencion tambien se refiere a un dispositivo medico que contiene al menos un derivado de acido hialuronico fotorreticulado acuerdo con la presente invencion.

La presente invencion tambien se refiere al procedimiento para la preparacion de derivados en la forma de hidrogeles con memoria de forma, que comprende las etapas siguientes:

a) formar un enlace eter entre el PEG y el derivado de cumarina;

b) formar un enlace ester o amida entre el producto obtenido en la etapa a) y el AH, con un grado de derivatizacion final del AH que vana de 5 a 80 % en moles en el caso del enlace ester y con un grado de derivatizacion final del AH que vana de 1 a 50 % en moles en el caso del enlace amida;

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c) solubilizar el producto obtenido en la etapa b) e irradiar la solucion acuosa isotonica obtenida con rayos UV a una longitud de onda de entre 300 y 450 nm, preferentemente entre 320 y 380 nm, durante un tiempo de entre 1 minuto y 24 horas.

El procedimiento para la preparacion de derivados de acuerdo con la presente invencion en la forma de esponjas con memoria de forma comprende las etapas siguientes:

a) formar un enlace eter entre el PEG y el derivado de cumarina;

b) formar un enlace ester o amida entre el producto obtenido en la etapa a) y el AH, con un grado de derivatizacion final del AH que vana de 5 a 80 % en moles en el caso del enlace ester y con un grado de derivatizacion final del AH que vana de 1 a 50 % en moles en el caso del enlace amida;

b') solubilizar el producto obtenido en la etapa b) en una solucion acuosa isotonica y liofilizar la solucion acuosa isotonica asf obtenida;

c) irradiar el producto obtenido en la etapa b') con rayos UV a una longitud de onda de entre 300 y 450 nm, preferentemente entre 320 y 380 nm, durante un tiempo de entre 1 minuto y 24 horas.

El procedimiento por el que los geles y las esponjas de acuerdo con la presente invencion se obtienen comprende, por lo tanto, un numero de etapas, que se pueden describir esquematicamente de la siguiente manera:

- para hidrogeles:

a) el fotorreactivo esta unido al espaciador bifuncional a traves de un enlace eter para formar un grupo fotorreticulable, capaz de reaccionar en una etapa posterior con AH;

b) el producto obtenido en la etapa a) se une al AH mediante un enlace ester o amida, que implica el carboxilo libre del residuo de acido glucuronico; el grado final de derivatizacion del AH vana entre 5 y 80 % en moles para el enlace ester y entre 1 y 50 % en moles para el enlace amida. El precipitado resultante es soluble en agua y/o solucion acuosa y esterilizable despues de la solubilizacion por filtracion a traves de un filtro de 0,22 pm;

c) el producto obtenido en la etapa b) se disuelve en solucion acuosa isotonica y se irradia con rayos UV a una longitud de onda de entre 300 y 450 nm, preferentemente entre 320 y 380 nm, durante entre 1 minuto y 24 horas y la sustancia resultante es el producto fotorreticulado final;

- para esponjas:

b) el producto obtenido en la etapa a) se une al AH mediante un enlace ester o amida, que implica el carboxilo libre del residuo de acido glucuronico; el grado final de derivatizacion del AH oscila entre 5 y 80 % en moles para el enlace ester y entre 1 y 50 % en moles para el enlace amida;

b') el producto obtenido en la etapa precedente b) se disuelve en solucion acuosa isotonica, y la solucion resultante se somete al procedimiento de liofilizacion, que consiste en tres etapas separadas: congelacion; sublimacion (o secado primario); y desorcion (o secado secundario);

c) el liofilizado obtenido de este modo se irradia con rayos UV a una longitud de onda de entre 300 y 450 nm, preferentemente entre 320 y 380 nm, durante entre 1 minuto y 24 horas;

La etapa mas compleja de todo el procedimiento es, naturalmente, la etapa b), porque la union entre el AH y el espaciador-fotorreactivo puede ser del tipo ester o amida, implicando por lo tanto diferentes funciones y que requieren diferentes condiciones; los geles y esponjas resultantes tendran diferentes caractensticas, dependiendo de la naturaleza del enlace.

En detalle, el solicitante presenta una ilustracion esquematica de la etapa b), en relacion con el tipo de enlace que se cree:

Preparacion de un derivado de ester (A) de AH y el grupo fotorreticulable

- Preparacion de una sal de amonio cuaternario de AH, a partir de la sal de sodio de AH que tiene un peso molecular que vana entre 40 kDa y 700 kDa, preferentemente entre 160 y 220 kDa.

- Reaccion de la sal de amonio cuaternario de AH en un disolvente aprotico polar (DMSO, DMF o NMP, preferentemente DMSO), a una concentracion de 1 a 200 mg/ml, con derivados de haluro (yoduros, bromuros o cloruros, preferentemente yoduros) de grupos fotorreticulables adecuadamente preparados y en una proporcion molar de haluro/AH que vana entre 0,05 y 0,8, preferentemente entre 0,2 y 0,5, a una T que vana entre 20 °C y 50 °C, mas preferentemente entre 35 °C y 45 °C, durante un tiempo comprendido que vana entre 4 y 72 horas, preferentemente entre 18 h 48 h.

- Aislamiento y purificacion del derivado de AH (A) esterificado con grupos fotorreticulables y en forma de sal de sodio por precipitacion y lavado en disolvente organico (etanol, acetato de etilo, acetona); el grado final de derivatizacion del AH oscila entre 5 y 80 % en moles:

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Preparacion de un derivado de amida (B) de AH y el grupo fotorreticulable

- Preparacion de una sal de amonio cuaternario de AH a partir de sal de sodio de AH que tiene un peso molecular que vana entre 40 kDa y 700 kDa, preferentemente entre 160 y 220 kDa.

- Activacion de la sal de amonio cuaternario de AH en un disolvente polar aprotico (DMSO, DMF o NMP, preferentemente DMSO) con un agente activante (CDI, CMPJ, EDC, hObT o NhS, preferentemente CDI), en una relacion molar agente activante/AH que vana entre 0,01 y 0,5, durante un tiempo comprendido entre 0,1 h y 3 h, a una T que vana entre 35 °C y 45 °C.

- La reaccion de AH activada con derivados de amina de los grupos fotorreticulables preparados adecuadamente en un disolvente aprotico polar (DMSO, DMF o NMP, preferentemente DMSO) en una relacion molar amina/AH que vana entre 0,0l y 1,5, a una T que vana entre 35 y 45 °C, durante un tiempo que vana entre 4 h y 30 h (preferentemente entre 12 h y 24 h). El grado de derivatizacion final del AH vana entre 1 y 50 % en moles.

- Aislamiento y purificacion del derivado de AH (B) amidado con grupos fotorreticulables y en la forma de una sal de sodio por precipitacion y lavado en disolvente organico (etanol, acetato de etilo, acetona).

En cuanto a los hidrogeles y esponjas, las etapas de los procedimientos de produccion correspondientes se muestran esquematicamente a continuacion:

Preparacion de un hidrogel a base de derivado de AH (A) esterificado con grupos fotorreticulables:

- Preparacion de una solucion acuosa isotonica de (A) en tampon fosfato, acetato o solucion salina

(preferentemente solucion salina), en una concentracion comprendida entre 5 y 70 mg/ml

- Esterilizacion por filtracion a traves de filtros de acetato de celulosa de 0,22 pm

- Alojamiento de la solucion esteril en recipientes transparentes a los rayos UV (por ejemplo, polietileno)

- Irradiacion de la solucion con una lampara de Wood y un haz de luz a una longitud de onda que vana entre 300 y 450 nm, mas preferentemente entre 320 nm a 380, durante un tiempo comprendido entre 1 minuto y 24 h;

Preparacion de un hidrogel a base de un derivado de AH (B) amidado con grupos fotorreticulables

- Preparacion de una solucion acuosa isotonica de (B) en tampon fosfato, acetato o solucion salina

(preferentemente tampon fosfato) a una concentracion que vana entre 1 y 40 mg/ml

- Esterilizacion por autolavado o filtracion a traves de filtros de acetato de celulosa de 0,22 pm

- Alojamiento de la solucion esteril en recipientes transparentes a los rayos UV (por ejemplo, polietileno)

- Irradiacion de la solucion con una lampara de Wood y un haz de luz a una longitud de onda que vana entre 300 y 370 nm, mas preferentemente entre 320 nm a 365, durante un tiempo comprendido entre 1 minuto y 24 h;

Preparacion de una esponja:

- Preparacion de una solucion acuosa isotonica (que contiene NaCl 0,9 % o manitol que vana de 1 a 20 %

peso/volumen o isopropanol que vana de 1 a 20 % volumen/volumen o glucosa que vana de 1 a 20 %

peso/volumen), preferentemente solo agua, de un ester o un derivado de AH de amida con un grupo fotorreticulable a una concentracion que vana entre 1 y 70 mg/ml.

- Liofilizacion en las siguientes etapas:

• congelacion: la solucion se vierte en bandejas adecuadas (para dar un espesor de entre 0,5 y 20 mm, preferentemente entre 2 y 7 mm) que descansa sobre las placas de liofilizacion y la T de enfriamiento de las placas se ajusta a -3 °C y se mantiene a esa temperatura hasta que la solucion alcanza 2 °C (entre 1 y 8 horas, preferentemente entre 4 y 5 horas). La T de las placas se reduce a -30 °C, y se mantiene el tiempo necesario hasta que la solucion alcanza una T de al menos -20 °C (entre 3 y 10 horas, preferentemente entre 4 y 7 horas);

• sublimacion (o secado primario): el condensador del aparato se ajusta a una T de al menos -30 °C, y con la bomba de vacfo, la presion en la camara de liofilizacion se reduce a un valor que vana entre 8x10-1 y 5x10-3 mbar, preferentemente entre 8x10-2 y 2x10-2 mbar. Las placas se calientan luego gradualmente (en un tiempo que vana entre 1 y 3 horas) a una T de entre -10 °C y 10 °C, preferentemente 0 °C; la T se mantiene estable durante al menos 12 horas, o hasta que el producto llega a la misma T que las placas, en igualdad de presion;

• desorcion (o secado secundario): las placas se calientan gradualmente (en un tiempo que vana entre 1 y 3 horas) a una T de entre 15 °C y 55 °C, preferentemente 25 °C, sin variar la presion aplicada. La T se

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mantiene estable durante al menos 8 horas, o hasta que el producto llega a la misma T que las placas. Despues de asegurarse de que la desorcion es completa, la presion se restablece en la camara de liofilizador mediante la inyeccion de nitrogeno deshidratado, microfiltrado;

- La irradiacion del solido liofilizado obtenido de la etapa anterior con un haz de luz que tiene una longitud de onda que vana entre 300 y 450 nm, preferentemente entre 320 y 380 nm, durante un tiempo de entre 1 minuto y 24 h.

Para esponjas, como para los hidrogeles, la duracion de la irradiacion es muy variable, estando fuertemente influenciada por la selectividad de la longitud de onda, la intensidad de la emision de la lampara UV, el espesor del material y los procedimientos de irradiacion. Este ultimo puede variar de acuerdo con el tipo de lampara utilizado; si se utiliza una unica lampara, la muestra se gira de manera que la totalidad de su superficie se expone a los rayos UV. No se requiere rotacion si se utiliza un multilampara, ya que al mismo tiempo irradia toda la superficie expuesta. Tambien hay que senalar que mediante la modulacion de los parametros que intervienen (concentracion de la solucion inicial, el tipo de disolvente utilizado, las condiciones de liofilizacion y las condiciones de irradiacion), puede establecerse a priori el grado de porosidad de las esponjas y la compacidad del hidrogel. Este aspecto es de vital importancia teniendo en cuenta que las esponjas en particular, pero tambien los hidrogeles, son colonizables por las celulas. Las celulas, ya sean diferenciadas o indiferenciadas, se pueden insertar en la esponja o hidrogel antes de la implantacion y ser adecuadamente cultivadas; opcionalmente, la esponja o el hidrogel se pueden implantar en la lesion a tratar, lo que le permite ser colonizadas por las celulas fisiologicamente presentes en el sitio de la lesion.

Como se ha indicado, el solicitante ha descubierto sorprendentemente que las caractensticas espedficas de los hidrogeles y esponjas reivindicados en el presente documento dependen en una medida decisiva de la longitud de la cadena del espaciador utilizado (PEG), asf como de su naturaleza qmmica. Se ha demostrado a traves de numerosas pruebas que los espaciadores con cadenas largas impiden la gelificacion homogenea y compacta del material, el cual ya no se puede definir mas como “memoria de forma”; un resultado similar se obtiene eliminando el espaciador. Estas caractensticas tambien se encuentran en las esponjas, las cuales se vuelven muy fragiles y totalmente incapaces de mantener su forma, no solo despues de haber sido empapadas y exprimidas, sino tambien despues de ser simplemente colocadas en solucion acuosa. En particular, el solicitante ha encontrado inesperadamente que una cadena de PEG que consiste en tres residuos da los materiales descritos en el presente documento con las caractensticas ya discutidas. En vista de todos estos factores, el solicitante tambien ha sintetizado algunos derivados fotorreticulables similares sin separadores, para comparar los productos resultantes.

Algunos ejemplos de preparacion de los hidrogeles y esponjas descritos y reivindicados en el presente documento se exponen a continuacion de acuerdo con los procedimientos ilustrados.

Los fotorreactivos utilizados son 7-hidroxicumarina (umbeliferona) o propiofenona (por comparacion), los cuales deben ser tratados de manera adecuada para que se unan al espaciador bifuncional (trietilenglicol) o reaccionen directamente con AH, para dar los productos de comparacion. Los ejemplos siguen el esquema que figura a continuacion:

- Ejemplos 1, 2 y 3: umbeliferona-trietilenglicol que se une a AH mediante un enlace ester;

- Ejemplo 4: umbeliferona derivatizada que se une a AH con un enlace ester (directo);

- Ejemplos 5 y 6: umbeliferona-trietilenglicol que se une a AH a traves de un enlace amida;

- Ejemplos 7 y 8: propiofenona-trietilenglicol que se une a AH con un enlace ester (indirecto; para la comparacion).

Ejemplo 1: Sintesis de 4-metilbencenosulfonato de 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etilo (1).

Se introducen 180 ml de CH2Cl2 anhidro, 10,0 ml de (2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etanol, 10,55 ml de trietilamina (Et3N) y 16,8 g de N,N'dimetilaminopiridina (DMAP) en un matraz de dos bocas, equipado con agitacion magnetica, flujo de argon y bano de hielo. A continuacion se anaden 14,43 g de cloruro de tosilo (TsCl), disuelto en 60 ml de CH2Cl2 anhidro, manteniendo la T a 0 °C bajo un flujo de argon. La reaccion se dejo transcurrir a 0 °C durante 1 h 30 min, y luego a temperatura ambiente durante 3 h 30 min. La fase organica se lava con agua, HCl 1 N, NaHCO3 acuoso saturado y NaCl acuoso saturado y se seco sobre MgSO4 y el disolvente se elimina a continuacion a baja presion. El analisis de RMN de 1H detecta la presencia del producto deseado, que no requiere mas purificacion.

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Ejemplo 2: Sintesis de 7-(2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etoxi)-2H-cromen-2-ona (2).

Se introducen 18,3 g de umbeliferona, 200 ml de acetona y 39,0 g de 4-metilbencenosulfonato de 2-(2-(2- cloroetoxi)etoxi)etilo (1), extrafdo con acetona (600 ml), 93,6 g de K2CO3 y 18-corona-6 en cantidad catalftica, en un matraz de dos bocas, equipado con agitacion magnetica, bano de aceite, refrigerante y flujo de argon. La reaccion se deja proceder a reflujo bajo agitacion durante 24 h; la mezcla de reaccion enfriada se filtra a continuacion a traves de un embudo de Gooch con celite, y el disolvente se elimina a baja presion. La naturaleza del producto obtenido se confirmo por analisis de RMN de 1H (solido blanco cristalino).

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Ejemplo 3: Sintesis de 7-(2-(2-(2-yodoetoxi)etoxi)etoxi)-2H-cromen-2-ona (3).

Se introducen 2,5 g de 7-(2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etoxi)-2H cromen-2-ona (2) y acetona (50 ml) en un matraz de dos bocas, equipado con agitacion magnetica, bano de aceite y refrigerante. A continuacion se anade yoduro de sodio (8,35 g) y la mezcla se deja proceder a reflujo bajo agitacion durante 48 h. El procesamiento se lleva a cabo dejando enfriar la mezcla, filtrandola a traves de un embudo de Gooch y de celite y despues eliminando el disolvente a baja presion. La naturaleza del producto final se confirma por el analisis espectroscopico de RMN de 1H (solido blanco cristalino) descrito en la Figura 1.

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En la Figura 1: RMN de 1H de (3) en CDCla, 400 MHz, 8 (ppm): 7,63 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 7,37 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,89-6,84 (m, 2H), 6,26 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,24-4,15 (m, 2H), 3,95-3,88 (m, 2H), 3,80-3,66 (m, 6H), 3,26 (t, J = 6,9 Hz, 2H).

Ejemplo 4: Sintesis de 7-bromometil cumarina (4).

Se introducen 7-metil-cumarina (3,0 g), N-bromosuccinimida (3,34 g) y tetracloruro de carbono (80 ml) en un matraz de dos bocas, equipado con bano de aceite, agitacion magnetica y refrigerante. Se introduce AIBN (31 mg) con agitacion y la mezcla se deja proceder a reflujo (106 °C) bajo agitacion durante 1 h 30 min. La mezcla se enfna a temperatura ambiente, se elimina el disolvente con un evaporador rotatorio y la bomba mecanica; el residuo se recoge a continuacion con agua y la reaccion se deja proceder durante 2 h con agitacion. La mezcla se filtra a traves de un embudo de Gooch y el precipitado se recoge con agua y se deja proceder bajo agitacion durante una hora mas. La mezcla se filtra a traves de un embudo de Gooch y el disolvente se elimina a continuacion con una bomba mecanica. Se obtiene el producto deseado y su naturaleza es confirmada por analisis de RMN de H.

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Ejemplo 5: Sintesis de 7-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)-2H-cromen-2-ona (5).

Se introduce 4,0 g de 7-(2-(2-(2-yodoetoxi)etoxi)etoxi)-2H-cromen-2-ona (3) (obtenida como se describe en el ejemplo 3), 1,93 g de NaN3 y 30 ml de agua destilada en un matraz de dos bocas, equipado con agitacion magnetica, bano de aceite y refrigerante. La reaccion se deja proceder a reflujo bajo agitacion durante la noche y despues se extrae con CH2Cl2, se seca sobre MgSO4 y se filtra a traves de un embudo de Gooch. El disolvente se elimina a baja presion. El producto se purifica por cromatograffa instantanea (eluyente ciclohexano/AcOEt 2:1). Se obtiene un aceite transparente de color amarillo palido, cuya naturaleza se confirma por analisis de RMN de 1H.

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Ejemplo 6: Sintesis de 7-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etoxi)-2H-cromen-2-ona (6).

Se disuelven 2,02 g de 7-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)-2H-cromen-2-ona (5) en 25 ml de THF anhidro en un matraz de dos bocas, equipado con agitacion magnetica, bano de hielo y flujo de argon. A 0 °C se introducen 1,742 g de trifenilfosfina y la reaccion se deja reposar a temperatura ambiente, siempre bajo agitacion, durante 18 h. Se introducen 3 ml de H2O destilada y la reaccion se deja proceder bajo agitacion durante la noche a temperatura ambiente. El disolvente se elimina a baja presion, y el producto se purifica a continuacion por cromatograffa instantanea. La naturaleza del producto obtenido se confirma por analisis de RMN de 1H. El espectro de RMN de 1H de (6) en CDCl3 se muestra en la Figura 2.

Ejemplo 7: Sintesis de 1-(4-(2-(2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)fenil) -2-hidroxi-2-metil-1-ona (7).

Se introducen 31,2 g de 2-hidroxi-1-(4-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-metilpropan-1-ona, 400 ml de acetona y 39,0 g de 4- metilbencenosulfonato de 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etilo, sintetizado como se indica en el ejemplo 1 y recogido con acetona (600 ml), 93,6 g de K2CO3 y 18-corona-6 en una cantidad catalftica, en un matraz de dos bocas equipado con agitacion mecanica, bano de aceite, refrigerante y flujo de argon. La reaccion se deja proceder a reflujo bajo

agitacion durante 24 h; la mezcla de reaccion enfriada se filtra a continuacion a traves de un embudo de Gooch con celite y el disolvente se elimina a baja presion. La naturaleza del producto obtenido se confirma por analisis de RMN de 1H (solido blanco cristalino).

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5 Ejemplo 8: Sintesis de 2-hidroxi-1-(4-(2-(2-(2-(2-yodoetoxi)etoxi)etoxi) etoxi)fenil)-2-metilpropan-1-ona (8).

Se introducen 4,0 g de 1-(4-(2-(2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)fenil)-2-hidroxi-2-metilpropan-1-ona (7) y acetona (80 ml) en un matraz de dos bocas, equipado con agitacion magnetica, bano de aceite y refrigerante. A continuacion se anade yoduro de sodio (8,35 g) y la mezcla se deja proceder a reflujo bajo agitacion durante 48 h. El procesamiento se lleva a cabo dejando enfriar la mezcla, filtrandola a traves de un embudo de Gooch y de celite y 10 despues eliminando el disolvente a baja presion. La naturaleza del producto final se confirma por analisis espectroscopico de RMN de 1H (solido blanco cristalino).

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Los fotorreactivos obtenidos como se describe anteriormente se hacen reaccionar con AH de la siguiente manera:

- Ejemplos 9 y 10: umbeliferona-trietilenglicol que se une a AH mediante un ester;

15 - Ejemplos 11 y 12: umbeliferona que se une a AH con un ester;

- Ejemplos 13 y 14: umbeliferona-trietilenglicol que se une a AH a traves de una amida;

- Ejemplo 15: propiofenona-trietilenglicol que se une a AH a traves de un ester.

Ejemplo 9: Sintesis de un derivado de ester de AH con 7-(2-(2-(2-yodoetoxi)etoxi)etoxi)-2H-cromen-2-ona (9) - Funcionalizacion final 30 %.

20 En un reactor de vidrio equipado con una camisa de glicol termostatizable y agitacion magnetica, se disuelven 2,0 g de HATBA en 240 ml de DmSO anhidro y se anade 521 mg de 7-(2-(2-(2-yodoetoxi)etoxi)etoxi)-2H cromen-2-ona (3) (521 mg), preparado como se indica en el ejemplo 3. La reaccion transcurre durante 48 horas a 40 °C; se anade una solucion saturada de NaBr a continuacion, con agitacion, y la precipitacion se efectua anadiendo gota a gota EtOH. El producto se purifica por lavado en EtOH/H2O 95:5 y EtOH absoluto, despues se seca a alto vado. El producto asf 25 obtenido es analizado por FTIR, RP-HPLC y RMN de 1H, mostrando una funcionalizacion del 32 % y un rendimiento del 92 %. La Figura 3 muestra el espectro de FTIR de (9) y la Figura 4 muestra el espectro de rMn de 1H de (9) (lmea A) en comparacion con HANa (lmea B) en D2O.

Ejemplo 10: Sintesis de un derivado de ester de AH con 7-(2-(2-(2-yodoetoxi)etoxi)etoxi)-2H-cromen-2-ona (10) - Funcionalizacion final 50 %.

30 En un reactor de vidrio equipado con una camisa de glicol termostatizable y agitacion magnetica, se disuelve 2,0 g de HATBA en 240 ml de DMSO anhidro y se anade 521 mg de 7-(2-(2-(2-yodoetoxi)etoxi)etoxi)-2H-cromen-2-ona (1,0241 g), preparado como se indica en el ejemplo 3. La reaccion transcurre durante 48 horas a 40 °C; se anade una solucion saturada de NaBr a continuacion, con agitacion, y la precipitacion se efectua anadiendo gota a gota EtOH. El producto se purifica por lavado en EtOH/H2O 95:5 y EtOH absoluto, despues se seca a alto vado. El 35 producto asf obtenido es analizado por FTIR, RP-HPLC y RMN de 1H, demostrando una funcionalizacion de 49 % y un rendimiento de 86 %.

Ejemplo 11 (comparativo): Sintesis de un derivado de ester de AH con 7-(bromometil)-2H-cromen-2-ona (11)

- Funcionalizacion final 40 %.

Se disuelve 2,0 g de HATBA en 240 ml de DMSO en un reactor de vidrio, equipado con camisa de glicol 40 termostatizable y agitacion magnetica. A continuacion se anade 308 g de 7-bromometil-2H-cromen-2-ona (4), preparado como se indica en el ejemplo 4 y la reaccion se deja proceder durante 72 horas a 40 °C. Se anade una solucion saturada de NaBr con agitacion, seguido de precipitacion con EtOH al 96 %. El producto se purifica por lavado en EtOH 96 %/H2O 8:2 y EtOH absoluto. Se obtiene un compuesto blanco en polvo, que se deja secar bajo alto vado.

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Ejemplo 12: Sintesis de un derivado de ester de AH con 7-(bromometil)-2H-cromen-2-ona (12) - Funcionalizacion final 90 %.

Se disuelve 2,0 g de HATBA en 240 ml de DMSO en un reactor de vidrio, equipado con camisa de glicol termostatizable y agitacion magnetica. A continuacion se anade 1,011 g de 7-bromometil-2H-cromen-2-ona (4), preparado como se indica en el ejemplo 4 y la reaccion se deja proceder durante 72 horas a 40 °C. Se anade una solucion saturada de NaBr con agitacion, seguido de precipitacion con EtOH al 96 %. El producto se purifica por lavado en EtOH 96 %/H2O 8:2 y EtOH absoluto. Se obtiene un compuesto blanco en polvo, que se deja secar bajo alto vado. El producto se analiza mediante FTIR, RP-HPLC y RMN de 1H, demostrando una funcionalizacion de 91 %. El espectro FTIR de (8) se muestra en la Figura 5.

Ejemplo 13: Sintesis de un derivado amida de AH con 7-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etoxi)-2H-cromen-2-ona (13) - Funcionalizacion final 20 %.

Se disuelve 2,0 g de HATBA en 200 ml de DMSO en un reactor de vidrio, equipado con camisa de glicol termostatizable y agitacion magnetica. A continuacion se anaden 63 pl de acido metanosulfonico y 0,1145 g de carbonildiimidazol y la reaccion se deja proceder durante 1 ha 42 °C. A continuacion se anade 0,7208 g de 7-(2-(2- (2-aminoetoxi)etoxi)etoxi)-2H-cromen-2-ona (6), preparada como se indica en el ejemplo 6 y se deja en agitacion a 40 °C durante 24 h. Se anade una solucion saturada de NaBr con agitacion, seguido de precipitacion con EtOH 96 %. El producto se purifica por lavado en EtOH 96 %/H2O 8:2 y EtOH absoluto. Se obtiene un compuesto blanco en polvo, que se deja secar bajo alto vado.

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Ejemplo 14: Sintesis de un derivado amida de AH con 7-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etoxi)-2H-cromen-2-ona (14) - Funcionalizacion final 40 %.

Se disuelve 2,0 g de HATBA en 200 ml de DMSO en un reactor de vidrio, equipado con camisa de glicol termostatizable y agitacion magnetica. A continuacion se anaden 63 pl de acido metanosulfonico y 0,2389 g de carbonildiimidazol y la reaccion se deja proceder durante 1 ha 42 °C. A continuacion se anade 1,4015 g de 7-(2-(2- (2-aminoetoxi)etoxi)etoxi)-2H-cromen-2-ona (6), obtenido como se indica en el ejemplo 6 y la reaccion se deja proceder bajo agitacion a 40 °C durante 24 h. A continuacion se anade una solucion saturada de NaBr con agitacion, seguido de precipitacion con EtOH 96 %. El producto se purifica por lavado en EtOH 96 %/H2O 8:2 y EtOH absoluto. Se obtiene un compuesto blanco en polvo, que se deja secar bajo alto vado.

Ejemplo 15 (comparativo): Sintesis de un derivado ester de AH con 2-hidroxi-1-(4-(2-(2-(2-(2- yodoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)fenil)-2-metil-propan-1-ona (15) - Funcionalizacion final 50 %.

En un reactor de vidrio equipado con una camisa de glicol termostatizable y agitacion magnetica, se disuelve 2,0 g de HATBA en 240 ml de DmSO anhidro y se anade 751 mg de 2-hidroxi-1-(4-(2-(2-(2-(2- yodoetoxi)etoxi)etoxi) etoxi)fenil)-2-metilpropan-1-ona (8), preparado como se indica en el ejemplo 8. La reaccion transcurre durante 48 horas a 40 °C; a continuacion se anade una solucion saturada de NaBr, con agitacion y la precipitacion se efectua anadiendo gota a gota EtOH. El producto se purifica por lavado en EtOH/H2O 95:5 y EtOH absoluto y despues se seca a alto vado. El producto asf obtenido se analiza por RP-HPLC y RMN de 1H, demostrando una funcionalizacion de 45 % y un rendimiento de 89 %.

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Los compuestos obtenidos de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente se ensayaron para determinar la solubilidad y la capacidad de filtracion en un filtro esteril, como se describe en el siguiente ejemplo.

Ejemplo 16: Ensayo de solubilizacion y posterior gelificacion de los compuestos preparados como se describe en los Ejemplos 9 y 11.

Las soluciones con una concentracion conocida que vana de 10 a 40 mg/ml se prepararon disolviendo los productos obtenidos mediante las smtesis descritas en los ejemplos 9 y 11 en un disolvente acuoso (solucion salina de NaCl 0,9 %, tampon fosfato, etc.). Las soluciones obtenidas de este modo aparecen transparentes y no muy viscosas; para evaluar la posibilidad de filtracion a traves de filtros esterilizantes de celulosa regenerada (CR) de 0,2 pm, los espectros UV de las soluciones se registraron antes y despues de la filtracion, comparando las absorbancias a 320 pm. Los valores registrados indican que el producto puede ser filtrado de esta forma con una recuperacion del 97 %. La Figura 6 muestra el espectro UV de una solucion de (9), llamado HA019, a la concentracion de 30 mg/ml, antes y despues de la filtracion a traves de CR de 0,22 pm.

Este aspecto es de vital importancia, ya que una solucion filtrable a traves de un filtro esteril puede ser esterilizada antes de pasar a las siguientes etapas del procedimiento, y por lo tanto liberarse de todas las impurezas. Por otra parte, la perdida de producto en la etapa de esterilizacion es minima, por lo que el procedimiento descrito es, sin duda economico desde el punto de vista industrial.

Las pruebas de gelificacion se realizaron en los mismos productos (como se describe en los Ejemplos 9 y 11), previamente disueltos en solucion salina a una concentracion que vana entre 10 y 40 mg/ml. Despues de filtrarse a traves de filtros de 0,2 pm, las soluciones se colocaron en recipientes y se irradiaron durante un tiempo t que vana entre 1 y 20 minutos, con un haz de luz que tiene una longitud de onda de 300 a 380 nm a temperatura ambiente o a 37 °C (no hay variaciones significativas). En el caso del producto obtenido como se describe en el ejemplo 9, se forma un hidrogel en todas las concentraciones ensayadas; cuanto mayor es la concentracion de la solucion de partida o el tiempo de irradiacion, mayor es la compacidad. El producto obtenido tal como se describe en el ejemplo 11, incluso despues de una prolongada irradiacion de las soluciones a diferentes concentraciones, no produce un hidrogel de la misma consistencia que el producto (9).

En particular, el producto (9) tiene una estructura con memoria de forma compacta incluso a la concentracion de 10 mg/ml, despues de solo 5 minutos de irradiacion. Como se ha indicado, la compacidad del gel aumenta con el tiempo de irradiacion, en igualdad de concentracion, de modo que a la concentracion de 30 mg/ml despues de solo 5 minutos de irradiacion y aun mas despues de 10, 15 o 20 minutos, se forman hidrogeles extremadamente compactos que pueden resistir el corte, las presiones y las manipulaciones sin ninguna alternancia en su estructura.

Por el contrario, el producto (11), a la concentracion de 30 mg/ml, solo alcanza un modesto grado de compacidad despues de 15 minutos de irradiacion; despues de 5 y 10 minutos el gel no puede mantener la forma del recipiente y menos aun para resistir la compresion o corte.

Por tanto, es evidente que el hidrogel obtenido por irradiacion de una solucion de umbeliferona unida a trietilenglicol y posteriormente a AH mediante un enlace ester tiene caractensticas sorprendentes de compacidad, elasticidad y resistencia mecanica.

Ejemplo 17: Estudios de hinchamiento de (9) de acuerdo con el tiempo de irradiacion.

Las pruebas de hinchamiento (SW) se llevaron a cabo en los hidrogeles derivados de compuestos que pertenecen a

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la clase (9), despues de 10 o 20 minutos de la irradiacion, respectivamente. El hinchamiento implica la inmersion de los hidrogeles en agua destilada durante un tiempo determinado y la comparacion de los pesos iniciales con el aumento de peso con el tiempo (debido a la absorcion de agua). Los valores SW se calculan segun la formula:

SjV= PeS02A h~Pes0 Initial P6S0 inicjai

La Figura 7 muestra los diagramas relacionados con el grado de hinchamiento de los hidrogeles preparados como se muestra en el Ejemplo 9, obtenidos con los valores de peso registrados. El analisis de los graficos confirma lo que se ha indicado anteriormente, a saber, que, la concentracion en igualdad de condiciones, la duracion de la irradiacion hace que el hidrogel sea mas compacto, por lo que absorbe menos agua, y por el contrario, en igualdad de tiempos de irradiacion, la compacidad del hidrogel aumenta con la concentracion de la solucion de partida.

Ejemplo 18: Preparacion de esponjas a partir de soluciones con una concentracion conocida de (9).

Se disuelve 462,3 mg de derivado de ester de AH, obtenido como se describe en el Ejemplo 9, en 23 ml de agua Milli-Q, para obtener una solucion con una concentracion de 20 mg/ml. Cuando la solubilizacion se haya completado, la solucion se vierte en una bandeja de vidrio circular con un diametro de 7,7 cm.

Liofilizacion: la bandeja se transfirio a las placas de un liofilizador, las cuales se enfnan a -3 °C. Las placas se mantienen a dicha temperatura durante 4 horas, hasta que la solucion alcanza la temperatura de al menos 2 °C. Las placas se enfnan luego a -35 °C, y dicha temperatura se mantiene durante 6 horas, hasta que la solucion esta completamente congelada. Despues de enfriar el condensador a una temperatura de menos de -35 °C, la bomba de vado se conecta y se deja funcionando hasta que la presion en la camara alcanza un valor inferior a 1 x 10-1 mbar. Las placas se calientan gradualmente a -5 °C en un penodo de 2 horas. Cuando se ha alcanzado la temperatura fijada, se mantiene durante 24 horas. Despues de ese tiempo, las placas se calentaron a 25 °C, y la temperatura asf alcanzado se mantiene durante 6 horas. La muestra obtenida se inserta en una placa de Petri de poliestireno para proteger de la humedad.

Irradiacion: la muestra se coloca bajo una lampara de Wood con un espectro de emision de entre 330 y 380 nm durante 12 horas. Cada 3 horas la placa se invierte para permitir la irradiacion de toda la superficie de la muestra.

La esponja asf obtenida es uniformemente porosa y carente de laminillas; cuando se sumerge en 30 ml de solucion salina durante 24 horas, tanto su forma como su textura se mantienen sin cambios. La esponja se sometio tambien a una pluralidad de ciclos de apretado y saturacion (al menos 4): incluso en esta situacion de estres, la esponja retuvo su forma, estructura, elasticidad y porosidad sin cambios y, por lo tanto, posee memoria de forma.

A continuacion, la misma esponja se comparo con una similar preparada como se describe en el Ejemplo 18 pero sin irradiar; la esponja no irradiada se desintegro tan pronto como entro en contacto con el agua.

La importancia tanto de los ingredientes como del procedimiento seguido en la presente memoria se confirma ademas por el hecho de que otra esponja se preparo de acuerdo con el Ejemplo 18, pero invirtiendo las etapas de irradiacion y liofilizacion. Por consiguiente, la solucion obtenida se irradio, y el gel resultante se seco por congelacion, en condiciones identicas a las descritas en el Ejemplo 18; la esponja resultante se disuelve cuando se coloca en agua, dando lugar a un gel compacto.

Al igual que en los hidrogeles, las esponjas con memoria de forma obtenidas se compararon con otras similares preparadas a partir de AH unido a umbeliferona mediante un enlace ester, es decir, sin un espaciador, como en el Ejemplo 11.

Ejemplo 19: Preparacion de esponjas a partir de soluciones con una concentracion conocida de (11).

Se disuelve 462,3 mg de derivado de ester de AH, obtenido como se describe en el Ejemplo 11, en 23 ml de agua Milli-Q para obtener una solucion a la concentracion de 20 mg/ml. Cuando la solubilizacion se haya completado, la solucion se vierte en una bandeja de vidrio circular con un diametro de 7,7 cm.

La solucion se somete a liofilizacion e irradiacion, exactamente como en el Ejemplo 18, y la esponja resultante se sumerge en 30 ml de solucion salina; esta se disuelve despues de un tiempo muy corto en contacto con la solucion acuosa.

Como ya se ha indicado para los hidrogeles, tambien se demostro para las esponjas que sorprendentemente adquieren las propiedades de memoria de forma (estructura, elasticidad y porosidad) solo si se utiliza un espaciador para separar el AH y la umbeliferona, y solo siguiendo el esquema de procedimiento preciso detallado mas arriba.

Ejemplo 20: Estudios de hinchamiento de (15) en comparacion con un derivado equivalente preparado como se describe en el Ejemplo 2 del documento EP1519962.

Los ensayos de hinchamiento (SW) se llevaron a cabo en los hidrogeles preparados a partir del compuesto

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sintetizado como se describe en el ejemplo 15, y a partir del compuesto sintetizado como se describe en el Ejemplo 2 de la patente EP1519962, a la concentracion de 30 mg/ml y despues de 20 minutos de irradiacion. El compuesto sintetizado como se describe en el Ejemplo 2 del documento EP1519962 es un derivado en el que los grupos fotorreticulables de la propiofenona se unen directamente al AH mediante un enlace ester, en un porcentaje similar a (15), es decir, aproximadamente el 50 %.

Mediante la comparacion de los pesos iniciales con el aumento de peso debido a la absorcion de agua, los valores de SW se calcularon como se describe en el ejemplo 17. La Figura 8 muestra los diagramas obtenidos con los valores de peso registrados con el tiempo.

El analisis de la grafica confirma que, el grado de sustitucion en igualdad de condiciones, la presencia del espaciador de trietilenglicol entre el AH y el grupo fotorreticulacion produce hidrogeles que absorben menos agua, y por lo tanto son mas compactos; la reticulacion es por lo tanto mas eficiente. El producto obtenido tal como se describe en el Ejemplo 2 del documento EP1519962 ha absorbido casi 50% mas agua que (15) despues de solo una hora y esa tendencia continua en el tiempo. Por tanto, el hidrogel tiene una textura muy diferente de la obtenida usando el espaciador de trietilenglicol entre AH y el grupo de fotorreticulacion, como se describe en la presente invencion. En ausencia de un espaciador, no se mantienen las caractensticas de compacidad, elasticidad y resistencia mecanica capaces de resistir la compresion y corte y la memoria de forma.

Ejemplo 21: Caracterizacion reologica de los hidrogeles preparados a partir de (9).

Las mediciones reologicas se realizaron a 25 °C, en un regimen oscilante; en particular, solo se midio el modulo de elasticidad G ', que expresa la compacidad del hidrogel, y por lo tanto es el parametro fundamental. G' (modulo de elasticidad) se midio en Pa de 0,07 a 90,0 rad/s, con un valor de fuerza del 10 %. Los valores, obtenidos a partir de muestras gelificadas despues de la irradiacion con una lampara UV de baja potencia, se correlacionaron directamente con el porcentaje de reticulacion, calculado por analisis de HPLC-MS, suponiendo que el porcentaje de fotopolimerizacion era nulo en t 0.

Como se vera a partir del diagrama (Figura 9), la tendencia del modulo de elasticidad G' (expresado en Pa a 0628 rad/s), es proporcional a la del grado de reticulacion; las soluciones irradiadas durante un tiempo mas largo son por lo tanto mas reticuladas, y por consiguiente, presentan mejores propiedades elasticas, con mayores valores de G'.

Ejemplo 22: Evaluacion de la proliferacion celular en cultivos de fibroblastos humanos en presencia de los hidrogeles preparados a partir de (9).

El protocolo estandar para la evaluacion de la proliferacion celular implica el uso del ensayo de MTT. En resumen, dicho ensayo mide cuantitativamente la presencia de actividad succinato deshidrogenasa en celulas cultivadas; dichas actividades, que estan solo presentes en las mitocondrias de celulas viables, normalmente se utilizan como marcadores para comprobar la actividad metabolica, la viabilidad y por lo tanto el crecimiento de las celulas cultivadas. El ensayo se basa en la conversion del colorante azolium MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)bromuro de 2,5 difeniltetrazolio) de amarillo a azul, por la succinato deshidrogenasa. La cantidad de colorante azul (formazan) determinada espectrofotometricamente es proporcional a la presencia de succinato deshidrogenasa en el cultivo celular y, por lo tanto, proporcional al numero de celulas viables.

Los fibroblastos humanos (FH), en suspension en un medio de cultivo adecuado, se sembraron en placas multipocillo de 24 pocillos en presencia de (9) en solucion a la concentracion de 20 mg/ml o 30 mg/ml, y en concentraciones crecientes (20 , 50, 100 jl) o, en el caso del control, con solamente el medio. Las celulas (FH) se incubaron con una solucion de 0,5 mg/ml de MTT durante 3 horas a 37 °C. Al final de la incubacion, el colorante se extrae de los FH con una solucion de extraccion (90 % de isopropanol, 10 % de DMSO) y se lee a la longitud de onda de 570 nm (DO, densidad optica).

Los valores de DO a 570 nm se detectan despues de 24 h (Figura 10).

La Figura 10 muestra que las soluciones de derivado de AH preparadas de este modo no son toxicas, incluso en cantidades gradualmente crecientes, y mantienen la viabilidad celular.

Ejemplo 23: Evaluacion de la proliferacion de fibroblastos humanos en las esponjas preparadas como se describe en el Ejemplo 19.

Se sembraron suspensiones de fibroblastos humanos (FH) en esponjas preparadas como se describe en el ejemplo 19 y se transfirieron a placas de 24 pocillos. Una hora despues de la siembra, se deposito 1 ml de medio de cultivo; el ensayo de MTT se llevo a cabo despues de 3 y 7 dfas de cultivo (Figura 11).

El control consistio en una cantidad igual de FH sembrados en placas multipocillo de 24 pocillos y se trataron con solo el medio de cultivo.

Como puede verse de la tabla (Figura 11), los fibroblastos humanos sembrados sobre las esponjas estan vivos, son viables y proliferan despues de 3 y 7 dfas de cultivo. Su viabilidad es tal como para inducir mayor proliferacion que la

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del control; la proliferacion es mejor en terminos de porcentaje despues de 3 d^as, pero tambien considerable despues de 7 dfas. Estos resultados demuestran claramente que las esponjas preparadas como se describe en la presente invencion no solo no poseen toxicidad para las celulas, sino que en realidad promueven la proliferacion celular. Debe tenerse en cuenta que durante la siembra en esponjas y posterior transferencia a los pocillos, se pierde un numero de celulas, por lo que los valores de proliferacion mostrados en la Figura 11 son aun mas sorprendentes.

Ejemplo 24: Preparacion de hidrogeles derivados de soluciones de (9), con la adicion de colageno en la relacion p/p de 1:1.

Se disuelve 600 mg de derivado de ester de AH, obtenido como se describe en el Ejemplo 9, en 20 ml de solucion salina para obtener una solucion a la concentracion de 30 mg/ml. Despues de finalizada la solubilizacion, el pH se ajusta a valores debilmente acidos (pH“4) mediante la adicion gradual de HCl 0,05 M en un bano de hielo. A continuacion se anade 10 ml de solucion acida de colageno de tendon equino, pre-preparada a una concentracion de 60 mg/ml. Despues de finalizada la mezcla, la solucion se microfiltra a traves de un filtro de 0,2 pm, en un recipiente y se irradia durante un tiempo t que vana entre 3 y 15 minutos con un haz de luz que tiene una longitud de onda de 300-380 nm a temperatura ambiente.

Se obtiene un hidrogel compacto capaz de mantener su forma despues del corte o la manipulacion.

Ejemplo 25: Preparacion de esponjas a partir de soluciones con una concentracion conocida de (9), con la adicion de colageno en la relacion p/p de 1:1.

Se disuelve 400,0 mg de derivado de ester de AH, obtenido como se describe en el Ejemplo 9, en 20 ml de agua Milli-Q para obtener una solucion a la concentracion de 20 mg/ml. Despues de finalizada la solubilizacion, el pH se ajusta a valores debilmente acidos (pH“4) mediante la adicion gradual de HCl 0,05 M en un bano de hielo. A continuacion se anade 10 ml de solucion acida de colageno de tendon equino, pre-preparada a una concentracion de 40 mg/ml. Despues de finalizada la mezcla, la solucion se microfiltra a traves de un filtro de 0,2 pm y se vierte en una bandeja de vidrio circular con un diametro de 5,0 cm.

La solucion se liofiliza y se irradia como se describe en el Ejemplo 19. La esponja resultante, sumergida en 30 ml de solucion salina, no se disuelve ni se desintegra, incluso despues de un prolongado contacto (72 a 96 h) con la solucion acuosa y posee propiedades de memoria de forma similares a las de las esponjas descritas en el Ejemplo 20.

Ejemplo 26: Preparacion de esponjas a partir de soluciones con una concentracion conocida de (9), con la adicion de colageno en la relacion p/p de 1:4.

Se disuelve 400,0 mg de derivado de ester de AH, obtenido como se describe en el Ejemplo 9, en 20 ml de agua Milli-Q para obtener una solucion a la concentracion de 20 mg/ml. Despues de finalizada la solubilizacion, el pH se ajusta a valores debilmente acidos (pH“4) mediante la adicion gradual de HCl 0,05 M en un bano de hielo. A continuacion se anade 10 ml de solucion acida de colageno de tendon equino, pre-preparada a una concentracion de 160 mg/ml. Despues de finalizada la mezcla, la solucion se microfiltra a traves de un filtro de 0,2 pm y se vierte en una bandeja de vidrio circular con un diametro de 5,0 cm.

La solucion se liofiliza y se irradia como se describe en el Ejemplo 19. La esponja resultante, sumergida en 30 ml de solucion salina, no se disuelve ni se desintegra, incluso despues de un prolongado contacto (72-96 h) con la solucion acuosa.

La esponja conserva la memoria de forma de las esponjas descritas en el Ejemplo 20, conservando su estructura y elasticidad incluso despues de tensiones mecanicas. En vista de los factores descritos y demostrados en el presente documento, el solicitante tiene la intencion de reivindicar hidrogeles y esponjas, ambos con memoria de forma, que consisten en umbeliferona o propiofenona unido a PEG a traves de un enlace eter y el producto resultante, unido a su vez al acido hialuronico a traves de un enlace ester o amida; tambien tienen la intencion de reivindicar el procedimiento de preparacion del hidrogel que implica la solubilizacion de los compuestos y la posterior irradiacion de las soluciones obtenidas y el procedimiento de preparacion de las esponjas que implica la solubilizacion de los compuestos de partida, la liofilizacion de las soluciones y la posterior irradiacion. Tanto los hidrogeles como las esponjas son adecuados para su uso en los campos medico, cosmetico y dermocosmetico, ya sea utilizados solos o en combinacion con sustancias farmacologicamente y/o biologicamente activas o con las celulas. En particular, ambos son adecuados para su uso en las siguientes aplicaciones espedficas:

- tratamiento intra-articular de la artrosis y del dano del cartflago,

- liberacion de principios activos,

- revestimiento de objetos de uso medico,

- relleno de tejidos blandos,

- en la prevencion de adherencias postoperatorias y el relleno de lesiones cavitadas profundas despues de la cirugfa.

Claims (19)

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   REIVINDICACIONES

   1. Derivados fotorreticulados del acido hialuronico (AH) que consisten en AH, un espaciador bifuncional de polietilenglicol (PEG), que es trietilenglicol, y un compuesto fotorreactivo seleccionado de derivados de cumarina.
2. 2. Derivados de acuerdo con la reivindicacion 1, en los que el derivado de cumarina se selecciona de umbeliferona, esculetina, escopoletina, psoralenos, furanocumarina y dicumarol, y es preferentemente umbeliferona.
3. 3. Derivados de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que el enlace entre el compuesto fotorreactivo y el espaciador bifuncional es un enlace de eter.
4. 4. Derivados de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que el enlace entre el espaciador bifuncional y el AH es un enlace ester o amida.
5. 5. Derivados de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que el AH tiene un PM promedio en peso de entre 40 kDa y 700 kDa, preferentemente entre 160 y 220 kDa.
6. 6. Derivados de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la forma de hidrogeles con memoria de forma o esponjas con memoria de forma.
7. 7. Derivados de acuerdo con la reivindicacion 6, que comprenden tambien sustancias farmacologicamente y/o biologicamente activas, tales como factores troficos, antibioticos, farmacos antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, protemas, peptidos, hormonas, extractos de plaquetas o celulas diferenciadas y/o no diferenciadas.
8. 8. Derivados segun la reivindicacion 6, que tambien contienen colageno, preferentemente colageno nativo y/o hidrolizado.
9. 9. Solucion isotonica reticulable que comprende acido hialuronico (AH), un espaciador bifuncional de polietilenglicol (PEG), que es trietilenglicol, y un compuesto fotorreactivo seleccionado de derivados de cumarina, en la que el enlace entre el espaciador bifuncional y el AH es un enlace ester o amida y en la que el enlace entre el compuesto fotorreactivo y el espaciador bifuncional es un enlace eter.
10. 10. Procedimiento de preparacion de derivados de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la forma de hidrogeles con memoria de forma, que comprende las etapas siguientes:

    a. formar un enlace eter entre el trietilenglicol y el derivado de cumarina;

    b. formar un enlace ester o amida entre el producto obtenido en la etapa a) y el AH, con un grado de

    derivatizacion final del AH que vana de 5 a 80 % en moles en el caso del enlace ester y con un grado de

    derivatizacion final del AH que vana de 1 a 50 % en moles en el caso del enlace amida;

    c. solubilizar el producto obtenido en la etapa b) e irradiar la solucion acuosa isotonica resultante con luz UV a una longitud de onda de entre 300 y 450 nm, preferentemente entre 320 y 380 nm, durante un tiempo de entre 1 minuto y 24 horas.
11. 11. Procedimiento de preparacion de derivados de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la forma de esponjas con memoria de forma, que comprende las etapas siguientes:

    a. formar un enlace eter entre el tritetilenglicol y el derivado de cumarina;

    b. formar un enlace ester o amida entre el producto obtenido en la etapa a) y el AH, con un grado de

    derivatizacion final del AH que vana de 5 a 80 % en moles en el caso del enlace ester y con un grado de

    derivatizacion final del AH que vana de 1 a 50 % en moles en el caso del enlace amida;

    b') solubilizar el producto obtenido en la etapa b) en una solucion acuosa isotonica y liofilizar la solucion acuosa isotonica asf obtenida;

    c. irradiar el producto liofilizado obtenido en la etapa b') con luz UV a una longitud de onda de entre 300 y 450 nm, preferentemente entre 320 y 380 nm, durante un tiempo de entre 1 minuto y 24 horas.
12. 12. Procedimiento de preparacion de derivados segun se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 10-11, que incluye ademas la etapa de adicion de colageno antes de la etapa de irradiacion del AH.
13. 13. Derivados fotorreticulados del acido hialuronico en la forma de hidrogeles con memoria de forma de acuerdo con las reivindicaciones 1-8 para su uso en el tratamiento intra-articular de la artrosis y el dano del cartflago.
14. 14. Derivados fotorreticulados del acido hialuronico en la forma de hidrogeles con memoria de forma de acuerdo con las reivindicaciones 1-8 para su uso en la liberacion de principios activos, revestimiento de objetos de uso medico, relleno de tejidos blandos y prevencion de adherencias postquirurgicas.
15. 15. Derivados fotorreticulados del acido hialuronico en la forma de hidrogeles con memoria de forma como se reivindica en las reivindicaciones 1-8, para su uso en el llenado de lesiones postoperatorias cavitadas profundas.
16. 16. Derivados fotorreticulados del acido hialuronico en la forma de esponjas con memoria de forma de acuerdo con las reivindicaciones 1-8 para su uso en el tratamiento intra-articular de la artrosis y el dano del cartflago.
17. 17. Derivados fotorreticulados del acido hialuronico en la forma de esponjas con memoria de forma, de acuerdo con las reivindicaciones 1-8, para su uso en la liberacion de principios activos, revestimiento de objetos de uso medico,

    5 relleno de tejidos blandos y prevencion de adherencias post-quirurgicas.
18. 18. Derivados fotorreticulados del acido hialuronico en la forma de esponjas con memoria de forma como se reivindica en las reivindicaciones 1-8, para su uso en el relleno de lesiones postoperatorias cavitadas profundas.
19. 19. Dispositivo medico que comprende al menos un derivado fotorreticulado acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

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