ES2613833T3 - Composición para el cultivo de embriones - Google Patents

Composición para el cultivo de embriones Download PDF

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ES2613833T3
ES2613833T3 ES12819778.7T ES12819778T ES2613833T3 ES 2613833 T3 ES2613833 T3 ES 2613833T3 ES 12819778 T ES12819778 T ES 12819778T ES 2613833 T3 ES2613833 T3 ES 2613833T3
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glutamine
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acid
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Tatsuma YAO
Yuta ASAYAMA
Akio Matsuhisa
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Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids

Abstract

Una composición para el cultivo de embriones, que tiene la constitución mostrada en la siguiente Tabla A.**Tabla** donde el derivado de la glutamina es glicil-L-glutamina, L-alanil-L-glutamina, L-leucil-L-glutamina, L-valil-L-glutamina o L-isoleucil-L-glutamina.

Description

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DESCRIPCION
Composicion para el cultivo de embriones Campo tecnico
La presente invencion se relaciona con una composicion para el cultivo de embriones segun definen las reivindicaciones.
Tecnica anterior
La fertilizacion in vitro, el cultivo de embriones y el trasplante de embriones y similares son tecnicas importantes en un amplio rango de campos, tales como la mejora y la produccion de animales de alto valor economico, la medicina regenerativa y la medicina reproductiva. En la fertilizacion in vitro y el cultivo de embriones, se tratan gametos o embriones in vitro. Hasta ahora, se han desarrollado diversos medios para el cultivo de embriones, tales como los medios de cultivo secuencial, que estan hechos para imitar los cambios en el ambiente de los fluidos corporales perifericos durante el desarrollo embrionario, medios de suero que estan suplementados con suero y medios simples libres de suero denominados “medio simple”, que pueden ser facilmente tratados. Cuando se usa un medio simple, el cambio de medio segun la fase de desarrollo de los embriones como medio de cultivo secuencial no es necesario. Cuando se usa un medio libre de suero, se pueden reducir los riesgos que aparecen en los medios de suero, tales como la variacion de la calidad y la contaminacion vmca debido a productos derivados de organismos.
Como medio simple libre de suero, se conoce el medio KSOM (Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104(36): 1428914293, y Manipulating the Mouse Embryo, Tercera Edicion 2005; 149-193). En embriones cultivados en el medio KSOM, el numero de celulas en blastocistos aumenta en comparacion con el de los embriones cultivados en un medio anterior a la aparicion del KSOM (Fertil Steril 2006; 86: 1252-1265); sin embargo, el numero no alcanza el numero de celulas en blastocistos que se desarrollan in vivo (Biol Reprod 1994; 50: 1027-1033, y Reproduction 2009; 137: 271-283).
Se sabe que los aminoacidos actuan como precursores biosinteticos, fuentes de energfa, osmolitos organicos, substancias tamponizantes del pH intracelular, antioxidantes, quelantes y similares, y la adicion de aminoacidos a medios para el cultivo de embriones actua de manera eficaz sobre el desarrollo embrionario (Semin Reprod Med 2000; 18(2): 205-218). El medio KSOM era un medio que contema solo glutamina como aminoacido. Se ha revelado, sin embargo, que el mdice de desarrollo de los blastocistos, el mdice de eclosion y el numero de celulas en los blastocistos mejoran gracias a la adicion de 20 tipos de aminoacidos al medio KSOM (Mol Reprod Dev 1995; 41(2): 232-238).
Cuando se desarrolla un medio para cultivar embriones humanos preimplantacion, se recomiendan las investigaciones que utilizan embriones de raton (Human Reproduction 1998; 13(4): 173-183, y Human Reproduction Update 2003; 9(6): 557-582). El medio KSOM o el medio KSOMaa al que se anaden 20 tipos de aminoacidos ha sido investigado usando embriones de raton (Biol Reprod 1994; 50: 1027-1033, y Mol Reprod Dev 1995; 41(2): 232238). Se ha verificado, sin embargo, que los medios son adecuados para cultivar no solo embriones humanos, sino tambien diversos embriones animales, tales como bovidos, conejo, mono rhesus, cerdo y rata, y actualmente los medios son ampliamente utilizados.
Divulgacion
Problemas que hay que resolver
El efecto de cada componente en un medio de cultivo depende de las concentraciones de otros componentes (Human Reproduction Update 2003; 9(6): 557-582), y por ello se requiere un gran numero de examenes para establecer las concentraciones adecuadas para el desarrollo embrionario combinando individualmente 20 tipos de aminoacidos. Ademas, en la investigacion de embriones en la fase de preimplantacion, dicho analisis amplio ha resultado diffcil debido a la escasez de muestras.
Por ello, la mayona de las concentraciones de aminoacidos anadidos a un medio de cultivo de embriones, tal como el medio KSOMaa, son concentraciones que se han decidido usando la capacidad de proliferacion de las celulas somaticas como mdice y no estan optimizadas para el desarrollo embrionario.
Las concentraciones de aminoacidos anadidas al medio KSOMaa, por ejemplo, son fijadas justamente a la mitad de cada concentracion espedfica de 13 aminoacidos pertenecientes al grupo de los aminoacidos esenciales (Science 1959; 130, 432-437) y otros 7 aminoacidos pertenecientes al grupo de los aminoacidos no esenciales, habiendose decidido esa concentracion espedfica usando la auxotroffa de las celulas somaticas como mdice por Eagle y otros. Ademas, en un lfquido de cultivo G1 o G2 desarrollado para el cultivo de embriones humanos, se usan directamente las concentraciones decididas usando la auxotroffa de las celulas somaticas como mdice por Eagle como las
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concentraciones de aminoacidos que se anaden a los medios de cultivo.
Por lo tanto, aun existe una demanda de desarrollo de medios de cultivo que tengan las concentraciones de aminoacidos adecuadas para el cultivo de embriones in vitro.
Medios para resolver los problemas
Considerando dicha demanda, los presentes inventores repitieron una intensiva investigacion y, como consecuencia, encontraron las concentraciones de aminoacidos adecuadas para el cultivo de embriones.
En un modo de la presente invencion, se proporciona una composicion para el cultivo de embriones como se define en las reivindicaciones, donde dicha composicion tiene la constitucion mostrada en la Tabla A siguiente, y donde el derivado de glutamina es glicil-L-glutamina, L-alanil-L-glutamina, L-leucil-L-glutamina, L-valil-L-glutamina o L- isoleucil-L-glutamina. [Tabla 1]
Tabla A
Componente
mM
L-Alanina
0,297 + 0,089
L-Asparraguina
0,015 + 0,005
Acido L-aspartico
0,120 + 0,036
Acido L-glutamico
0,550 + 0,165
Glicina
0,979 + 0,294
L(-)-Prolina
0,105 + 0,032
L-Serina
0,176 + 0,053
L(+)-Arginina
0,108 + 0,032
L(-)-Cistina
0,048 + 0,014
L-Histidina
0,053 + 0,016
L(+)-Isoleucina
0,036 + 0,011
L-leucina
0,081 + 0,024
L(+)-Lisina
0,176 + 0,053
L-Metionina
0,022 + 0,007
L(-)-Fenilalanina
0,045 + 0,013
L(-)-Treonina
0,109 + 0,033
L-Triptofano
0,018 + 0,005
L-Tirosina
0,048 + 0,014
L-Valina
0,108 + 0,032
L-Glutamina o derivado de glutamina
0,398 + 0,119
Taurina
1,412 + 0,424
En una realizacion de la presente invencion, se proporciona una composicion para el cultivo de embriones segun se define en las reivindicaciones, que ademas contiene al menos un componente seleccionado entre el grupo consistente en electrolitos, acidos organicos, carbohidratos, indicadores de pH, ajustadores de pH, tampones de pH, antibioticos, vitaminas, elementos metalicos traza, quelantes, hormonas, factores de crecimiento, lfpidos o constituyentes de los mismos, protemas de soporte, componentes de la matriz extracelular, substancias reductoras y polfmeros, ademas de los constituyentes mostrados en la Tabla A anterior.
En una realizacion de la presente invencion, se proporciona una composicion para el cultivo de embriones segun se define en las reivindicaciones, que contiene los constituyentes mostrados en la Tabla A anterior y electrolitos. En otra realizacion de la presente invencion, se proporciona una composicion para el cultivo de embriones segun se define en las reivindicaciones, que contiene los constituyentes mostrados en la Tabla A anterior, electrolitos y acidos organicos y/o carbohidratos. En aun otra realizacion de la presente invencion, tambien se proporciona una composicion para el cultivo de embriones segun se define en las reivindicaciones, que contiene los constituyentes mostrados en la Tabla A anterior, electrolitos y acidos organicos y/o carbohidratos, y que ademas contiene al menos un componente seleccionado entre el grupo consistente en indicadores de pH, ajustadores de pH, tampones de pH, antibioticos, vitaminas, elementos metalicos traza, quelantes, hormonas, factores de crecimiento, lfpidos o constituyentes de los mismos, protemas de soporte, componentes de la matriz extracelular, substancias reductoras y polfmeros.
Tal como se usa aqrn, el termino "composicion para el cultivo de embriones" significa una composicion para tratar gametos o embriones. Como tambien se describe aqrn, utilizando una composicion para el cultivo de embriones, se pueden cultivar huevos fertilizados o blastomeros hasta la obtencion de blastocistos o hasta la eclosion de los
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blastocistos. El termino "pueden cultivarse hasta la obtencion de blastocistos" incluye, por ejemplo, el cultivo de huevos fertilizados o de blastomeros hasta la obtencion de embriones de dos a ocho celulas o morulas, pero no se limita a ello.
Tambien se puede utilizar la composicion para el cultivo de embriones implicada en una realizacion de la presente invencion cuando se recogen esperma o celulas huevo, se maduran, se mantienen o se lavan, o cuando se fertilizan celulas huevo in vitro. Se puede recambiar la composicion para el cultivo de embriones implicada en una realizacion de la presente invencion con una composicion fresca para cultivo de embriones implicada en una realizacion de la presente invencion durante el cultivo de embriones, pero no se limita a ello.
El "gameto" significa un espermatozoide o un ovulo. En la presente descripcion, el "embrion" incluye embriones reconstruidos, tales como un huevo fertilizado, un embrion temprano y un embrion de trasplante nuclear, e incluye embriones derivados de mairnferos, tales como humano, raton, bovido, conejo, mono rhesus, cerdo y rata, pero sin limitacion a estos. Los "mam^feros" pueden ser humanos, ratones, bovidos, conejos, monos rhesus, cerdos o ratas, pero no se limitan a estos.
El blastocisto indica un embrion tras la fase de escision en el desarrollo temprano de los mamnferos. El blastocisto consiste en una masa celular interna, un blastocele y un trofectodermo rodeado por una zona pelucida. La eclosion de los blastocistos indica una etapa de escape de los embriones desde la zona pelucida y es un proceso esencial para alcanzar la implantacion de los embriones.
Se sabe que, en embriones cultivados que tienen anormalidades en su estructura y sus funciones fisiologicas, la eclosion se retrasa o no se produce (Reprod Biomed Online 2003; 7: 228-234). Mientras tanto, se sabe que, por ejemplo, un blastocisto que eclosiona dentro de un penodo fijado de tiempo tiene un elevado mdice de implantacion en comparacion con un blastocisto que no eclosiona dentro de un penodo fijado de tiempo (Fertil Steril 2000; 74: 163-165).
Se sabe que el numero de celulas en los blastocistos guarda una correlacion positiva con el mdice de desarrollo fetal (J Reprod Fertil 1997; 109: 153-164) y una correlacion positiva con el mdice normal de cromosomas (Hum Reprod; 2010: 1916-1926).
Como metodos de evaluacion de la calidad de los embriones cultivados, existe un metodo para evaluar las caractensticas morfologicas de los embriones usando un microscopio, tales como la velocidad de desarrollo, el mdice de desarrollo de blastocistos y el mdice de eclosion desde la zona pelucida, un metodo de evaluacion por medicion del numero de celulas en los blastocistos por tincion nuclear y similares.
Entre estos metodos de evaluacion, el metodo de evaluacion basado en la eclosion es uno de los metodos de evaluacion favorables para seleccionar embriones cultivados de gran calidad. El numero de celulas en los blastocistos es tambien uno de los metodos de evaluacion importantes para evaluar la calidad de los embriones cultivados.
Los aminoacidos contenidos en una composicion para cultivo de embriones implicada en una realizacion de la presente invencion pueden estar en forma libre o en forma de una sal farmaceuticamente aceptable. Los aminoacidos contenidos en una composicion para cultivo de embriones implicada en otra realizacion de la presente invencion pueden tambien ser los que se pueden descomponer por hidrolisis y similar y convertirse en aminoacidos libres. Dichos aminoacidos pueden estar, por ejemplo, en forma de ester, en forma de N-acilo, de oligopeptido y similar.
La glutamina, por ejemplo, puede ser un derivado de glutamina. El derivado de glutamina es, segun la invencion, glicil-L-glutamina, L-alanil-L-glutamina, L-leucil-L-glutamina, L-valil-L-glutamina o L-isoleucil-L-glutamina. Estos derivados de glutamina pueden ser usados solos o se pueden usar dos o mas derivados de glutamina en combinacion. En una realizacion de la presente invencion, el derivado de glutamina es asf, por ejemplo, glicil-L- glutamina o L-alanil-L-glutamina. En otra realizacion de la presente invencion, el derivado de glutamina es glicil-L- glutamina. En otra realizacion de la presente invencion, el derivado de glutamina es L-alanil-L-glutamina.
Ademas, por ejemplo, en la cistina, una porcion de la misma o toda ella puede ser cistema.
En una realizacion de la presente invencion, la taurina contenida en una composicion para el cultivo de embriones puede estar en forma libre o en forma de una sal farmaceuticamente aceptable. En otra realizacion de la presente invencion, la taurina contenida en una composicion para el cultivo de embriones puede ser la que se puede convertir en taurina por deshidrogenacion y similares. Dicha taurina, por ejemplo, puede ser hipotaurina.
La composicion para el cultivo de embriones implicada en una realizacion de la presente invencion puede contener al menos un componente seleccionado entre el grupo consistente en electrolitos, acidos organicos, carbohidratos, indicadores de pH, ajustadores de pH, tampones de pH, antibioticos, vitaminas, elementos metalicos traza,
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quelantes, hormonas, factores de crecimiento, Kpidos o sus constituyentes, protemas de soporte, componentes de la matriz extracelular, substancias reductoras y poKmeros y similares, segun sea necesario.
Los electrolitos no estan limitados, e incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio, dihidrogeno fosfato de sodio, cloruro de calcio dihidrato, sulfato de magnesio heptahidrato, hidrogeno carbonato de sodio, cloruro de calcio, gluconato de calcio, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio e hidrogeno fosfato dipotasico y similares. Estos electrolitos pueden ser usados solos o se pueden usar dos o mas electrolitos en combinacion.
Los acidos organicos no estan limitados, e incluyen acido piruvico, acido acetico, acido cftrico, acido succmico, acido malico, acido a-cetoglutarico, acido fumarico, acido oxaloacetico, acido isocftrico, acido oxalosuccmico, acido tartarico, acido ad^pico, acido lactico y sus sales. Estos acidos organicos pueden ser usados solos o se pueden usar dos o mas acidos organicos en combinacion.
Los carbohidratos no estan limitados, e incluyen glucosa, maltosa, fructosa, xilitol, sorbitol y trehalosa y similares. Estos carbohidratos pueden ser usados solos o se pueden usar dos o mas carbohidratos en combinacion.
Los indicadores de pH no estan limitados, e incluyen rojo fenol y similares.
Los ajustadores de pH no estan limitados, e incluyen acido clorhudrico, acido acetico, hidroxido de sodio y similares.
Los tampones de pH no estan limitados, e incluyen HEPES (acido W-2-hidroxietilpiperazino-W’-2-etanosulfonico), MOPS (acido 3-morfolinopropanosulfonico), tris[hidroximetil]aminometano, acido N-tris[hidroximetil]metil-2- aminoetanosulfonico y similares. Estos tampones de pH pueden ser usados solos o se pueden usar dos o mas tampones de pH en combinacion.
Los antibioticos no estan limitados, e incluyen penicilina, estreptomicina, kanamicina, gentamicina, eritromicina, anfotericina B, nistatina y similares. Estos antibioticos pueden ser usados solos o se pueden usar dos o mas antibioticos en combinacion.
Las vitaminas no estan limitadas, e incluyen vitamina A, grupo de las vitaminas B, vitamina C, grupo de las vitaminas D, vitamina E, acido nicotmico, biotina, acido folico y similares. Estas vitaminas pueden ser usadas solas o se pueden usar dos o mas vitaminas en combinacion.
Los elementos metalicos traza no estan limitados, e incluyen zinc, hierro, manganeso, cobre, yodo, selenio y cobalto. Estos elementos metalicos traza no estan limitados y pueden ser usados en forma libre o pueden ser usados como compuestos farmaceuticamente aceptables que contienen estos elementos metalicos traza. Estos elementos metalicos traza pueden ser usados solos o se pueden usar dos o mas elementos metalicos traza en combinacion.
Los quelantes no estan limitados, e incluyen EGTA (acido etilenglicol-bis-tetraacetico), EDTA (acido etilendiaminotetraacetico), EDDA (acido etilendiaminodiacetico) y DTPA (acido dietilentriaminopentaacetico) y similares. Estos quelantes pueden ser usados solos o se pueden usar dos o mas quelantes en combinacion.
Las hormonas no estan limitadas, e incluyen insulina, hidrocortisona, dexametasona, triyodotironina, gonadotropina, estrogeno, progesterona y similares. Estas hormonas pueden ser usadas solas o se pueden usar dos o mas hormonas en combinacion.
Los factores de crecimiento no estan limitados, e incluyen el factor de crecimiento epidermico, los factores de crecimiento de los fibroblastos, los factores de crecimiento derivados de plaquetas, los factores de crecimiento de tipo insulina, la hormona del crecimiento y similares. Estos factores de crecimiento pueden ser usados solos o se pueden usar dos o mas factores de crecimiento en combinacion.
Los lfpidos o sus constituyentes no estan limitados, e incluyen acidos grasos, tales como acido oleico, acido linoleico, acido linolenico, acido araquidonico, acido palmftico, acido oleico, acido palmitoleico, acido estearico, acido minstico y sus sales, o colesterol, etanolamina, colina, esfingomielina, cardiolipina y similares. Estos lfpidos o sus constituyentes pueden ser usados solos o se pueden usar dos o mas de ellos en combinacion.
Las protemas de soporte no estan limitadas, e incluyen albumina, transferrina, ceruloplasmina y similares. Estas protemas de soporte pueden ser usadas solas o se pueden usar dos o mas protemas de soporte en combinacion. La albumina no esta limitada, y puede ser seroalbumina bovina, seroalbumina humana, seroalbumina bovina recombinante o seroalbumina humana recombinante, o una mezcla de las mismas.
Los componentes de la matriz extracelular no estan limitados, e incluyen fibronectina, colageno, gelatina, hialuronano y similares. Estos componentes de la matriz extracelular pueden ser usados solos o se pueden usar dos o mas componentes de la matriz extracelular en combinacion.
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Las substancias reductoras no estan limitadas, e incluyen 2-mercaptoetanol, ditiotreitol, glutation reducido y similares. Estas substancias reductoras pueden ser usadas solas o se pueden usar dos o mas substancias reductoras en combinacion.
Los polfmeros no estan limitados, e incluyen PVP (polivinilpirrolidona), PVA (alcohol polivimlico), dextrano y similares. Estos polfmeros pueden ser usados solos o se pueden usar dos o mas polfmeros en combinacion.
La composicion para el cultivo de embriones implicada en una realizacion de la presente invencion puede ser producida combinando los constituyentes mediante un metodo convencional. Una composicion para el cultivo de embriones, por ejemplo, puede ser producida o suministrada en forma de solucion esteril, en forma de solucion concentrada esteril de tipo dilucion o en forma de un producto liofilizado esteril de tipo disolucion mediante un metodo convencional.
Por lo tanto, la composicion para el cultivo de embriones implicada en una realizacion de la presente invencion puede estar en forma de solucion esteril, en forma de solucion concentrada esteril o en forma de producto liofilizado esteril. Cuando la composicion para el cultivo de embriones implicada en una realizacion de la presente invencion esta en forma de solucion concentrada esteril o en forma de producto liofilizado esteril como se ha descrito anteriormente, diluyendo o disolviendo la composicion con agua esteril antes de su uso se puede obtener una composicion para el cultivo de embriones en forma de solucion esteril, pero no se limita a esto.
Ejemplos
Ejemplo 1
Constitucion del medio
La Tabla 2 muestra, en la constitucion del medio KSOMaa (Ejemplo comparativo 1) como control y la constitucion del medio del Ejemplo 1, los nombres de los componentes contenidos en el medio, los pesos moleculares (P.M.) y sus contenidos desde la columna de la izquierda.
Tabla 2
Nombre del componente
P.M. Ejemplo comparativo 1 Ejemplo 1
mM
g/l mM g/l
L-Alanina
89,09 0,050 0,004 0,297 0,026
L-Asparraguina monohidrato
150,13 0,050 0,008 0,015 0,002
Acido L-aspartico
133,10 0,050 0,007 0,120 0,016
Acido L-glutamico
147,13 0,050 0,007 0,550 0,081
Glicina
75,07 0,050 0,004 0,979 0,073
L(-)-Prolina
115,13 0,050 0,006 0,105 0,012
L-Serina
105,09 0,050 0,005 0,176 0,018
L(+)-Arginina clorhidrato
210,66 0,300 0,063 0,108 0,023
L(-)-Cistina
240,30 0,050 0,012 0,048 0,012
L-Histidina clorhidrato monohidrato
209,63 0,100 0,021 0,053 0,011
L(+)-Isoleucina
131,17 0,200 0,026 0,036 0,005
L-Leucina
131,17 0,200 0,026 0,081 0,011
L(+)-Lisina clorhidrato
182,65 0,200 0,037 0,176 0,032
L-Metionina
149,21 0,050 0,007 0,022 0,003
L(-)-Fenilalanina
165,19 0,100 0,017 0,045 0,007
L(-)-Treonina
119,12 0,200 0,024 0,109 0,013
L-Triptofano
204,23 0,025 0,005 0,018 0,004
L-Tirosina
181,19 0,100 0,018 0,048 0,009
L-Valina
117,15 0,200 0,023 0,108 0,013
Glicil-L-glutamina monohidrato
221,21 1,000 0,221 0,398 0,088
Taurina
125,15 - - 1,412 0,177
Cloruro de sodio
58,44 95,000 5,552 114,718 6,704
Cloruro de potasio
74,55 2,500 0,186 5,200 0,388
Dihidrogeno fosfato de potasio
136,09 0,350 0,048 0,300 0,041
Cloruro de calcio dihidrato
147,01 1,710 0,251 1,117 0,164
Sulfato de magnesio heptahidrato
246,48 0,200 0,049 0,467 0,115
Hidrogeno carbonato de sodio
84,01 25,000 2,100 25,000 2,100
D-Glucosa
180,16 0,200 0,036 2,998 0,540
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Piruvato de sodio
110,04 0,200 0,022 0,183 0,020
L-Lactato de sodio
112,06 10,000 2,186 4,540 0,992
Citrato trisodico dihidrato
294,10 - - 0,127 0,037
EDTA2Na
372,24 0,010 0,004 - -
Rojo fenol
354,38 0,003 0,001 0,003 0,001
Sulfato de gentamicina
- - 0,010 - 0,010
Recogida de esperma
Tras el sacrificio de ratones ICR machos (Japan SLC, Inc.), se corto la cola del epidfdimo. Se recogio una masa de esperma obtenida por incision del conducto del epidfdimo en el centro de la cola del epidfdimo en 300 |il de medio TYH suplementado con un 0,4% de seroalbumina bovina preparado bajo aceite mineral. Se precultivo la masa de esperma recogida en condiciones de 37°C y 6% de CO2 durante una hora.
Recogida de ovulos
Se administraron a ratones ICR hembras (Japan SLC, Inc.) 7,5 unidades internacionales de PMSG (gonadotropina serica de hembras gestantes, ASKA Pharmaceutical Co., Ltd., SEROTROPIN (Marca Registrada)) por via intraperitoneal. Despues de 48 horas, se administraron 7,5 unidades internacionales de hCG (gonadotropina corionica humana, ASKA Pharmaceutical CO., Ltd., GONATROPIN (Marca Registrada)) por via intraperitoneal para inducir superovulacion, y se sacrifico a dichos ratones 15 horas tras la administracion de hCG. Se corto el conducto uterino inmediatamente despues del sacrificio. Se recogieron de la ampolla del conducto uterino complejos cumulo- oocito en 300 |il de medio TYH suplementado con un 0,4% de seroalbumina bovina preparado con aceite mineral. Se cultivaron los complejos cumulo-oocito recogidos en condiciones de 37°C y 6% de CO2 hasta la fertilizacion in vitro.
Fertilizacion in vitro
Se anadio al medio TYH que contema los complejos cumulo-oocito recogidos el esperma precultivado, de manera que hubiera 150 espermatozoides/^l. Tras fertilizacion in vitro en condiciones de 37°C y 6% de CO2 durante 6 horas, se escogio un ovulo en el que se podfan observar el segundo cuerpo polar y dos pronucleos como huevo fertilizado y se uso directamente para el siguiente experimento.
Prueba de cultivo de embriones
Usando el medio del Ejemplo 1 y el medio del Ejemplo comparativo 1, se preparo una gota de 100 |il de cada medio suplementado con un 0,1% de seroalbumina bovina en una placa de cultivo de un diametro de 60 mm bajo aceite mineral y se dejo reposar en condiciones de 37°C, 5% de O2 y 6% de CO2 durante la noche para que se equilibrara.
Se transfirio un huevo fertilizado a la gota de cada medio tras la equilibracion. Se lavo el huevo fertilizado moviendo para obtener varias gotas. Se transfirio el huevo fertilizado lavado a una gota fresca de cada medio y se cultivo en condiciones de 37°C, 5% de O2 y 6% de CO2 durante 4 dfas. Se observo el embrion en el 4° dfa de cultivo con un microscopio y se calculo el porcentaje de embriones que evolucionaron de huevos fertilizados a blastocistos o la fase de eclosion. En la Tabla 3 se muestran los resultados obtenidos.
[Tabla 3]
Medio
Numero de huevos indice de desarrollo de blastocistos (%)
fertilizados cultivados (frecuencia de repeticion) Total Eclosion
Ejemplo comparativo 1
104 (6) 95,8+2,2 72,8+3,0
Ejemplo 1
104 (6) 98,1+1,3 87,8+2,9*
Valor medio + error estandar
* Diferencia significativa en
comparacion con el medio del Ejemplo comparativo 1 (p = 0,0065, prueba de Wilcoxon)
Se tineron fluorescentemente los blastocistos obtenidos el 4° dfa de cultivo usando DAPI (diclorhidrato de 4',6- diamidino-2'-fenilindol) (Roche Diagnostics K.K.) y se midio el numero de celulas en los blastocistos. En la Tabla 4 se muestran los resultados obtenidos.
[Tabla 4]
Medio
Numero de blastocistos analizados Numero total de celulas
Ejemplo comparativo 1
98 80,2+1,5
Ejemplo 1
94 90,2+2,0**
Valor medio + error estandar ** Diferencia significativa en comparacion con el medio del Ejemplo comparativo 1 (p = 0,0003, prueba de Wilcoxon)
Tal como se muestra en la Tabla 3
y en la Tabla 4, en el grupo cultivado en el medio del Ejemplo 1 el mdice de
5 eclosion mejoraba significativamente y el numero de celulas de los blastocistos era significativamente mayor en comparacion con los del grupo cultivado en el medio del Ejemplo comparativo 1. Este resultado muestra que el medio del Ejemplo 1 implicado en una realizacion de la presente invencion es mas excelente en cuanto a ser capaz de ejercer una accion estimulatoria y una mejora de la calidad sobre el desarrollo embrionario que el medio del Ejemplo comparativo 1.
10
Ejemplo 2
Se preparo un medio (Ejemplo 2) substituyendo la constitucion de aminoacidos del medio del Ejemplo comparativo 1 mostrada en la Tabla 2 anterior con la constitucion de aminoacidos que incluye taurina del medio del Ejemplo 1 15 mostrada en la Tabla 2 (Tabla 5).
]Tabla 5]
Nombre del componente
P.M. Ejemplo comparativo 1 Ejemplo 2
mM
g/l mM g/l
L-Alanina
89,09 0,050 0,004 0,297 0,026
L-Asparraguina monohidrato
150,13 0,050 0,008 0,015 0,002
Acido L-aspartico
133,10 0,050 0,007 0,120 0,016
Acido L-glutamico
147,13 0,050 0,007 0,550 0,081
Glicina
75,07 0,050 0,004 0,979 0,073
L(-)-Prolina
115,13 0,050 0,006 0,105 0,012
L-Serina
105,09 0,050 0,005 0,176 0,018
L(+)-Arginina clorhidrato
210,66 0,300 0,063 0,108 0,023
L(-)-Cistina
240,30 0,050 0,012 0,048 0,012
L-Histidina clorhidrato monohidrato
209,63 0,100 0,021 0,053 0,011
L(+)-Isoleucina
131,17 0,200 0,026 0,036 0,005
L-Leucina
131,17 0,200 0,026 0,081 0,011
L(+)-Lisina clorhidrato
182,65 0,200 0,037 0,176 0,032
L-Metionina
149,21 0,050 0,007 0,022 0,003
L(-)-Fenilalanina
165,19 0,100 0,017 0,045 0,007
L(-)-Treonina
119,12 0,200 0,024 0,109 0,013
L-Triptofano
204,23 0,025 0,005 0,018 0,004
L-Tirosina
181,19 0,100 0,018 0,048 0,009
L-Valina
117,15 0,200 0,023 0,108 0,013
Glicil-L-glutamina monohidrato
221,21 1,000 0,221 0,398 0,088
Taurina
125,15 - - 1,412 0,177
Cloruro de sodio
58,44 95,000 5,552 95,000 5,552
Cloruro de potasio
74,55 2,500 0,186 2,500 0,186
Dihidrogeno fosfato de potasio
136,09 0,350 0,048 0,350 0,048
Cloruro de calcio dihidrato
147,01 1,710 0,251 1,710 0,251
Sulfato de magnesio heptahidrato
246,48 0,200 0,049 0,200 0,049
Hidrogeno carbonato de sodio
84,01 25,000 2,100 25,000 2,100
D-Glucosa
180,16 0,200 0,036 0,200 0,036
Piruvato de sodio
110,04 0,200 0,022 0,200 0,022
L-Lactato de sodio
112,06 10,000 2,186 10,000 2,186
Citrato trisodico dihidrato
294,10 - - - -
EDTA2Na
372,24 0,010 0,004 0,010 0,004
Rojo fenol
354,38 0,003 0,001 0,003 0,001
Sulfato de gentamicina
- - 0,010 - 0,010
Usando el medio del Ejemplo comparativo 1 y el medio del Ejemplo 2, se realizo la prueba de cultivo de embriones en las mismas condiciones que en la prueba de cultivo de embriones descrita en el Ejemplo 1. En la Tabla 6 se
muestran los resultados obtenidos.
[Tabla 6]
Medio
Numero de blastocistos analizados Numero total de celulas
Ejemplo comparativo 1
131 86,2+1,4
Ejemplo 2
131 90,2+1,6*
Valor medio + error estandar
* Diferencia significativa en comparacion con el medio del Ejemplo comparativo 1 (p = 0,0467, prueba de Wilcoxon)
5
Tal como se muestra en la Tabla 6, en el grupo cultivado en el medio del Ejemplo 2 implicado en una realizacion de la presente invencion, el numero de celulas en los blastocistos era significativamente mayor en comparacion con el del grupo cultivado en el Ejemplo comparativo 1. Como se ha descrito anteriormente, la constitucion de aminoacidos que incluye taurina de una composicion para el cultivo de embriones implicada en una realizacion de la presente 10 invencion ejerce una accion de estimulacion del desarrollo de embriones independientemente de constituciones de medio distintas de la anterior constitucion.
Ejemplos 3 y 4
15 Se prepararon un medio que tema una constitucion con 0,7 veces la concentracion de la constitucion de aminoacidos que inclrna taurina contenida en el medio del Ejemplo 1 mostrada en la Tabla 2 (Ejemplo 3) y un medio que tema una constitucion con 1,3 veces su concentracion (Ejemplo 4) (Tabla 7).
20
[Tabla 7]
Nombre del componente
Ejemplo 1 Ejemplo 3 Ejemplo 4
mM
mM
mM
L-Alanina
0,297 0,208 0,386
L-Asparraguina monohidrato
0,015 0,011 0,020
Acido L-aspartico
0,120 0,084 0,156
Acido L-glutamico
0,550 0,385 0,715
Glicina
0,979 0,685 1,273
L(-)-Prolina
0,105 0,074 0,137
L-Serina
0,176 0,123 0,229
L(+)-Arginina clorhidrato
0,108 0,076 0,140
L(-)-Cistina
0,048 0,034 0,062
L-Histidina clorhidrato monohidrato
0,053 0,037 0,069
L(+)-Isoleucina
0,036 0,025 0,047
L-Leucina
0,081 0,057 0,105
L(+)-Lisina clorhidrato
0,176 0,123 0,229
L-Metionina
0,022 0,015 0,029
L(-)-Fenilalanina
0,045 0,032 0,059
L(-)-Treonina
0,109 0,076 0,142
L-Triptofano
0,018 0,013 0,023
L-Tirosina
0,048 0,034 0,062
L-Valina
0,108 0,076 0,140
Glicil-L-glutamina monohidrato
0,398 0,279 0,517
Taurina
1,412 0, 988 1,836
Cloruro de sodio
114,718 114,718 114,718
Cloruro de potasio
5,200 5,200 5,200
Dihidrogeno fosfato de potasio
0,300 0,300 0,300
Cloruro de calcio dihidrato
1,117 1,117 1,117
Sulfato de magnesio heptahidrato
0,467 0,467 0,467
Hidrogeno carbonato de sodio
25,000 25,000 25,000
D-Glucosa
2,998 2,998 2,998
Piruvato de sodio
0,183 0,183 0,183
L-Lactato de sodio
4,540 4,540 4,540
Citrato trisodico dihidrato
0,127 0,127 0,127
EDTA2Na
- - -
Rojo fenol
0,003 0,003 0,003
Sulfato de gentamicina
0,010 (g/l) 0,010 (g/l) 0,010 (g/l)
5
10
15
20
25
30
En la Tabla 7, la unidad de concentracion de cada componente es mM, a menos que se describa algo diferente.
Usando el medio del Ejemplo 1, el medio del Ejemplo 3 y el medio del Ejemplo 4, se realizo la prueba de cultivo de embriones en las mismas condiciones que la prueba de cultivo de embriones descrita en el Ejemplo 1. En la Tabla 8 y la Tabla 9 se muestran los resultados obtenidos.
[Tabla 8]
Medio
Numero de huevos indice de desarrollo de blastocistos (%)
fertilizados cultivados (frecuencia de repeticion) Total Eclosion
Ejemplo 1
150 (15) 92,7+3,0 72,7+3,6
Ejemplo 3
150 (15) 94,0+2,4 74,7+4,1
Ejemplo 4
150 (15) 94,0+2,4 72,0+3,9
Valor medio + error estandar
No habfa diferencias significativas entre los grupos (prueba de Steel-Dwass).
[Tabla 9]
Medio
Numero de blastocistos analizados Numero total de celulas
Ejemplo 1
124 102,1+2,0
Ejemplo 3
142 99,4+1,4
Ejemplo 4
137 101,4+1,6
Valor medio + error estandar
No habfa diferencias significativas entre los grupos (prueba de Steel-Dwass).
Tal como se muestra en la Tabla 8 y la Tabla 9, incluso con el medio que tema la constitucion con 0,7 veces la concentracion de la constitucion de aminoacidos que inclrna taurina del medio del Ejemplo 1 (Ejemplo 3) y el medio que tema la constitucion con 1,3 veces su concentracion (Ejemplo 4), no se observaron diferencias significativas en cuanto a validez. Esto revela que la validez de la constitucion de aminoacidos que incluye taurina del medio del Ejemplo 1, que es la composicion para cultivo de embriones implicada en la presente realizacion, no se pierde dentro de un rango de concentracion de al menos 0,7 a 1,3 veces.
Ejemplo 5
El Ejemplo 5 es un ejemplo de referencia que no forma parte de la invencion tal como la definen las reivindicaciones. Prueba de cultivo de embriones humanos
La Tabla 10 muestra, en la constitucion de un medio del Ejemplo 5, los nombres de los componentes contenidos en el medio, los pesos moleculares (P.M.) y sus contenidos desde la columna de la izquierda.
[Tabla 10]
Nombre del componente
P.M. Ejemplo 5
mM
g/l
L-Alanina
89,09 0,297 0,026
L-Asparraguina monohidrato
150,13 0,015 0,002
Acido L-aspartico
133,10 0,120 0,016
Acido L-glutamico
147,13 0,550 0,081
Glicina
75,07 0,979 0,073
L(-)-Prolina
115,13 0,105 0,012
L-Serina
105,09 0,176 0,018
L(+)-Arginina clorhidrato
210,66 0,108 0,023
L(-)-Cistina
240,30 0,048 0,012
L-Histidina clorhidrato monohidrato
209,63 0,053 0,011
L(+)-Isoleucina
131,17 0,036 0,005
L-Leucina
131,17 0,081 0,011
L(+)-Lisina clorhidrato
182,65 0,176 0,032
L-Metionina
149,21 0,022 0,003
L(-)-Fenilalanina
165,19 0,045 0,007
L(-)-Treonina
119,12 0,109 0,013
L-Triptofano
204,23 0,018 0,004
L-Tirosina
181,19 0,048 0,009
L-Valina
117,15 0,108 0,013
Glicil-L-glutamina monohidrato
221,21 0,398 0,088
Taurina
125,15 1,412 0,177
Cloruro de sodio
58,44 114,718 6,704
Cloruro de potasio
74,55 5,200 0,388
Dihidrogeno fosfato de potasio
136,09 0,300 0,041
Cloruro de calcio dihidrato
147,01 1,117 0,164
Sulfato de magnesio heptahidrato
246,48 0,467 0,115
Hidrogeno carbonato de sodio
84,01 25,000 2,100
D-Glucosa
180,16 2,998 0,540
Piruvato de sodio
110,04 0,183 0,020
L-Lactato de sodio
112,06 4,540 0,992
Citrato trisodico dihidrato
294,10 0,127 0,037
EDTA2Na
372,24 0,010 0,004
Rojo fenol
354,38 0,003 0,001
Sulfato de gentamicina
- - 0,010
Se preparo una gota de 20 |il del medio del Ejemplo 5 al que se anadio un 0,05% de albumina humana recombinante en una placa de cultivo de 35 mm de diametro bajo aceite mineral y se dejo reposar en condiciones de 37°C, 4% de O2 y 6% de CO2 durante la noche para que se equilibrara.
5
Como huevos fertilizados humanos, se usaron huevos fertilizados tras congelacion y descongelacion, los cuales no estaban destinados a ser usados para tratamiento despues de ello y se acordo que tuvieran un uso en investigacion. Se transfirio cada uno de los huevos fertilizados humanos tras congelacion-descongelacion a cada medio tras la equilibracion. Despues de ello, se lavo el huevo fertilizado humano moviendo hasta obtener varias gotas. Se 10 transfirio el huevo fertilizado lavado a una gota fresca de cada medio y se cultivo en condiciones de 37°C, 4% de O2 y 6% de CO2 durante 5 a 6 dfas. Se observo el embrion con un microscopio cada dfa a partir del segundo dfa despues del inicio del cultivo y se observo el estadio de desarrollo del embrion. En la Tabla 11 se muestran los resultados tfpicos obtenidos.
15 [Tabla 11]
Medio del embrion
N° Estadio de desarrollo
Dfa 2 Dfa 3 Dfa 4 Dfas 5-6
1 estadio de 4 celulas estadio de 8 celulas estadio de morula estadio de blastocisto
Ejemplo 5
2 estadio de 4 celulas estadio de 6 celulas estadio de 8 celulas estadio de morula
3
estadio de 2 estadio de 6 estadio de 9 estadio de
celulas celulas celulas blastocisto
4
estadio de 2 celulas estadio de 4 celulas estadio de 5 celulas estadio de morula
Como se muestra en la Tabla 11, esta claro que el medio del Ejemplo 5 es un excelente medio de cultivo para embriones humanos.
20

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composicion para el cultivo de embriones, que tiene la constitucion mostrada en la siguiente Tabla A. 5 Tabla A
    Componente
    mM
    L-Alanina
    0,297 + 0,089
    L-Asparraguina
    0,015 + 0,005
    Acido L-aspartico
    0,120 + 0,036
    Acido L-glutamico
    0,550 + 0,165
    Glicina
    0,979 + 0,294
    L(-)-Prolina
    0,105 + 0,032
    L-Serina
    0,176 + 0,053
    L(+)-Arginina
    0,108 + 0,032
    L(-)-Cistina
    0,048 + 0,014
    L-Histidina
    0,053 + 0,016
    L(+)-Isoleucina
    0,036 + 0,011
    L-leucina
    0,081 + 0,024
    L(+)-Lisina
    0,176 + 0,053
    L-Metionina
    0,022 + 0,007
    L(-)-Fenilalanina
    0,045 + 0,013
    L(-)-Treonina
    0,109 + 0,033
    L-Triptofano
    0,018 + 0,005
    L-Tirosina
    0,048 + 0,014
    L-Valina
    0,108 + 0,032
    L-Glutamina o derivado de glutamina
    0,398 + 0,119
    Taurina
    1,412 + 0,424
    donde el derivado de la glutamina es glicil-L-glutamina, L-alanil-L-glutamina, L-leucil-L-glutamina, L-valil-L-glutamina o L-isoleucil-L-glutamina.
    10
  2. 2. La composicion para el cultivo de embriones segun la reivindicacion 1, que ademas contiene electrolitos.
  3. 3. La composicion para el cultivo de embriones segun la reivindicacion 2, que contiene acidos organicos y/o carbohidratos.
    15
  4. 4. La composicion para el cultivo de embriones segun la reivindicacion 3, que ademas contiene al menos un componente seleccionado entre el grupo consistente en indicadores de pH, ajustadores de pH, tampones de pH, antibioticos, vitaminas, elementos metalicos traza, quelantes, hormonas, factores de crecimiento, lfpidos o sus constituyentes, protemas de soporte, componentes de la matriz extracelular, substancias reductoras y polfmeros.
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