ES2613687T3

ES2613687T3 - Promotores selectivos de fibras

Info

Publication number: ES2613687T3
Application number: ES11799713.0T
Authority: ES
Inventors: Frank Meulewaeter; Danny Llewellyn
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Bayer CropScience NV
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Bayer CropScience NV
Priority date: 2011-01-04
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2017-05-25
Anticipated expiration: 2031-12-21
Also published as: MX345212B; AU2011354240B2; MX2013007815A; ZA201304927B; WO2012093032A1; AU2011354240A1; EP2661498A1; CN103328635A; EP2661498B1; US20130276170A1; US9243260B2; CN103328635B

Abstract

Un método para expresar un ARN biológicamente activo preferentemente en una célula fibrosa de una planta productora de fibra a lo largo del desarrollo de las fibras y que es más activo durante las etapas tardías de la deposición de la pared celular secundaria, comprendiendo dicho método: a. proporcionar las células de dicha planta con un gen quimérico, comprendiendo dicho gen quimérico las siguientes regiones de ADN enlazadas operablemente: i. un promotor preferente de la célula fibrosa, seleccionado del siguiente grupo de secuencias nucleotídicas: 1. una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID No.: 1; y 2. una secuencia nucleotídica que comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID No.: 1; ii. una región de ADN heteróloga; y iii. opcionalmente una región de terminación de la transcripción y de poliadenilación; y b. hacer crecer dicha planta de manera que dicha planta produce fibras.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Transgénica y recombinante se refiere a un organismo hospedante, tal como una planta, en el que se ha introducido una molécula de ácido nucleico heteróloga (por ejemplo, el promotor, el gen quimérico o el vector como se describen aquí). El ácido nucleico se puede integrar de forma estable en el genoma de la planta.

Existe un número de métodos para introducir ADN en las células vegetales o en las plantas, mediante transformación. La transformación de algodón mediada por Agrobacterium se ha descrito, por ejemplo, en la patente US 5.004.863, en la patente US 6.483.013, y en el documento WO2000/71733.

Las plantas también se pueden transformar mediante bombardeo con partículas: partículas de oro o de volframio se revisten con ADN, y después se disparan en células vegetales jóvenes o embriones vegetales. Este método también permite la transformación de plastidios vegetales. La transformación del algodón mediante bombardeo con partículas se da a conocer, por ejemplo, en el documento WO 92/15675.

La transformación vírica (transducción) se puede usar para la expresión transitoria o estable de un gen, dependiendo de la naturaleza del genoma del virus. El material genético deseado se empaqueta en un virus vegetal adecuado, y se deja que el virus modificado infecte la planta. La progenie de las plantas infectadas está libre de virus, y también está libre del gen insertado. Los métodos adecuados para la transformación vírica se describen o se detallan adicionalmente en, por ejemplo, los documentos WO 90/12107, WO 03/052108 o WO 2005/098004.

En la patente US 7.172.881 se pueden encontrar también protocolos de transformación adicionales.

La célula vegetal puede derivar de cualquier planta productora de tricomas, tales como Gossypium (algodón), Nicotiana, Arabidopsis, así como las plantas productoras de fibra descritas anteriormente. En un ejemplo, la célula vegetal deriva de Gossypium.

“Algodón” o “planta de algodón”, como se usa aquí, puede ser cualquier variedad útil para hacer crecer algodón. Las variedades de algodón usadas más habitualmente son Gossypium barbadense, G. hirsutum, G. arboreum y G. herbaceum. Otras variedades incluyen G. africanum y G. raimondii. También se incluyen la progenie procedente de cruces de cualquiera de las especies anteriores con otras especies, o cruces entre tales especies.

Una célula vegetal de algodón puede ser cualquier célula que comprende esencialmente la información genética necesaria para definir una planta de algodón, que se puede suplementar, aparte del gen quimérico descrito aquí, con uno o más transgenes adicionales. Las células pueden derivar de los diversos órganos y/o tejidos que forman una planta de algodón, incluyendo, pero sin limitarse a, frutos, semillas, embriones, tejido reproductivo, regiones meristémicas, tejido de callo, hojas, raíces, brotes, flores, tejido vascular, gametocitos, esporocitos, polen, y microsporas. Aunque ciertas células vegetales pueden ser capaces de regenerarse en plantas completas, en algunos casos dichas células vegetales no se pueden desarrollar o regenerar adicionalmente en una planta completa.

La presente enseñanza también describe una planta transgénica que consiste en la célula de la planta transgénica descrita aquí anteriormente, o que comprende el gen quimérico o el vector descrito aquí, integrado en el genoma de la planta. Esto se puede efectuar mediante protocolos de transformación descritos en cualquier otra parte en esta solicitud.

La presente enseñanza también describe una semilla generada a partir de una planta transgénica descrita aquí, en el que la semilla comprende el gen quimérico descrito aquí.

La semilla se forma mediante una planta embriónica encerrada junto con nutrientes almacenados mediante una cubierta de semilla. Es el producto del óvulo que ha madurado de plantas gimnospermas y angiospermas, plantas estas últimas a las que pertenece el algodón, que se produce tras la fertilización y hasta cierto grado el crecimiento dentro de la planta madre.

Se describen adicionalmente aquí fibras de algodón y aceite de semilla de algodón obtenibles u obtenidos a partir de las plantas descritas aquí. Las fibras de algodón descritas aquí se pueden distinguir de otras fibras aplicando el método de detección descrito en el documento WO2010/015423 y comprobando la presencia del promotor o gen quimérico descrito aquí en las fibras. En consecuencia, el promotor también se puede usar para hacer el seguimiento de las paredes celulares, en particular fibras de algodón.

También se describen aquí hilos y materiales textiles obtenidos de las fibras, así como material alimentario y pienso que comprende o está hecho del aceite de semilla de algodón descrito aquí. También se describe un método para obtener aceite de semilla de algodón, que comprende cosechar las semillas de algodón de la planta de algodón descrita aquí, y extraer dicho aceite de dichas semillas. Además, también se describe un método para producir fibras de algodón, que comprende hacer crecer la planta de algodón descrita aquí y cosechar algodón a partir de dichas plantas de algodón.

La presente enseñanza también describe un método para producir una célula vegetal o planta transformada, que comprende introducir el gen quimérico descrito en una célula vegetal progenitora para producir una célula vegetal transformada, y opcionalmente regenerar una planta a partir de dicha célula vegetal transformada.

imagen9

imagen10

imagen11

imagen12

5

10

15

20

25

30

35

40

están en negrita), que contienen los sitios de recombinación attB1 y attB2 para la recombinación in vitro usando el sistema de clonación Gateway (Invitrogen). La amplificación mediante PCR a partir de ADN de BAC, seguido de la limpieza mediante PEG según las instrucciones del fabricante, y la recombinación in vitro usando la reacción de BP con el vector intermedio pDONR201 (Invitrogen) y la transformación en células DH5 dieron como resultado la producción de pDONR/FS18pro(3P22). El vector intermedio se secuenció con los cebadores pDONR-F y pDONR-R (Invitrogen), y entonces se recombinó en un vector de destino del gen informador de GUS pSirogateIV-GUS usando la reacción de LR como se recomienda. El vector pSirogateIV-GUS contenía los bordes izquierdo y derecho del T-DNA, un gen GUS sin promotor en dirección 3’ desde el casete de recombinación de Gateway de attR, una secuencia terminadora de la transcripción/de poliadenilación procedente de una enzima málica de Flavaria bidentis, y un gen de resistencia a kanamicina expresable en planta con un promotor del ARN subgenómico del segmento 1 y un terminador del segmento 3 del virus del retraso del crecimiento del trébol, como se describe en Schunmann et al. (2003) Funct Plant Biol 30: 443-452.

El plásmido resultante pSirogateIV-FS18-GUS se secuenció con un cebador en el gen informador de GUS (GUSRev: 5’-tccagactgaatgcccacagg-3’, SEQ ID NO: 18) para confirmar la recombinación correcta del promotor, y entonces se transfirió a la cepa AGLI de Agrobacterium (Lazo et al (1991) Biotechnol. 9: 963-967) mediante electroporación.

En una primera etapa, la funcionalidad del promotor se evaluó en un ensayo de expresión transitoria mediante bombardeo con partículas de ADN de pSirogateIV-FS18(3P22)-GUS en óvulos de algodón cultivado, y tiñendo para la actividad de la enzima GUS según Jefferson et al (1987) EMBO J. 6: 3901-3907.

En este experimento, se usó como control un vector de expresión que comprende un casete de promotor 35S-GUS. La actividad del promotor se monitorizó contando el número de manchas de GUS/número de óvulos analizados (véase la Tabla 1).

Tabla 1: Número de manchas de GUS/número de óvulos analizados. El promotor FS18 fue capaz de conducir la expresión de GUS entre 16 dpa y 29 dpa

promotor: 7dpa 16 dpa 29 dpa

35S: 10/40 1/10 no ensayado

FS18: no ensayado 2/30 5/28

En la siguiente etapa, se llevó a cabo la transformación del algodón con la cepa de Agrobacterium que porta pSirogatelV-FS18-GUS, esencialmente como se describe en Murray et al. (1999) Mol. Breed. 5: 219-232 usando segmentos de cotiledones de plántulas de la variedad de cultivo Coker315-11 de algodón (una selección CSIRO procedente de la variedad de cultivo Coker 315 regenerable), y se llevó a cabo la selección para la resistencia a sulfato de kanamicina.

Se generó un total de 19 transformantes primarios, que representan 14 sucesos de transformación independientes. Las plantas se transfirieron a suelo y se dejaron florecer. Las flores se etiquetaron en la antesis y se recogieron capullos tanto a 10 como a 20 dpa, y las semillas que se desarrollan completamente con fibras se tiñeron para la enzima GUS usando tinciones histoquímicas de X-gluc como se describe por Jefferson et al. (1987) EMBO J. 6: 3901-3907.

Las hojas inmaduras, segmentos de pecíolos, raíces y secciones de tallos procedentes tanto de ramas jóvenes como más viejas también se tiñeron para GUS. Los patrones de tinción observados se resumen en la Tabla 2, y las imágenes representativas se muestran en la Figura 2.

Tabla 2: Tejidos en los que se detectó actividad de la enzima GUS en diferentes plantas de algodón transgénicas To transformadas con el constructo de SirogateIV-promotor FS18-GUS. +, expresión débil o localizada, ++ expresión media, +++ expresión muy fuerte, -sin tinción. 5

Línea transformante: Hoja Pecíolo Tallo Raíz Fibra a 10 dpa Fibra a 20 dpa

T420-48: - + Cierta tinción débil en unas pocas glándulas de la superficie, sin tinción en tricomas - - +++ +++

T420-2: - - - - +++ +++

T420-37: - + Cierta tinción débil en unas pocas glándulas de la + cierta tinción débil en unas pocas glándulas de la - +++ +++

10

15

20

25

30

35

40

45

imagen13

Se puede observar en la Figura 2 que el promotor FS18 es muy selectivo de la fibra, aunque hay una pequeña cantidad de expresión en un pequeño tricoma glandular en pecíolos y tallos.

3. Aislamiento del promotor de SCW-PRP (para referencia solamente)

Ji et al (2003), Nucleic Acids Res. 31: 2534-43, identificaron un clon de ADNc de 230 pb corto P2G01 (CB350474) mediante PCR sustractiva usando como conductor ADNc obtenido de fibras de 10 dpa y ADNc obtenido de un mutante sin fibras, seguido del cribado diferencial en una macromatriz de nailon frente a los ADNc de fibras de diferentes edades. El clon fue uno de alrededor de 30 genes de fibra expresados diferencialmente. Parece que la expresión del gen comenzó a alrededor de 5 días post-antesis (dpa), y continuó expresándose hasta la etapa de 20 dpa ensayada. La proteína codificada por P2G01 se designó en Ji et al (2003) como la subunidad catalítica de (H+)-ATPasa vacuolar, pero nuestro análisis sugirió que es más probable que sea una proteína rica en prolina. P2G01 (CB350474) no se expresó a 0 dpa, pero aumentó en expresión hasta niveles moderados en fibras a 5, 10 y 20 dpa. Se identificaron equivalencias con CB350474 a partir de una búsqueda Megablast de ESTs de fibras de algodón de

G. hirsutum de Genbank, y se obtuvo una secuencia de transcrito de consenso de 659 pb (SEQ ID NO: 11) derivada de un número de ESTs que solapan.

imagen14

El transcrito de consenso codificó una pequeña proteína de 104 aminoácidos con un péptido señal predicho en el término NH2 (predicción usando SignalP, Emanuelsson et al., 2007 Nature Protocols 2, 953-971). La existencia del péptido señal predijo la secreción de la proteína madura fuera de la célula a la pared celular. No contenía dominios proteicos conservados en secuencia, pero la proteína madura predicha de 78 AA contenía 28,4% de prolina. Por lo tanto, la hemos denominado una proteína rica en prolina (PRP), aunque la búsqueda de secuencias proteicas usando BlastP, o de las secuencias nucleotídicas usando BLASTx, no reveló equivalencias convincentes con otras proteínas, excepto para una pequeña región en otra PRP de algodón putativa (ABM05951), PRP3.

La secuencia del transcrito de consenso se usó para buscar bibliotecas de EST de algodón usando MegaBlast. Se contaron los resultados con un valor de E de <-100, y entonces se agruparon según la fuente del tejido de la biblioteca de ADNc de la que derivaron. Los transcritos que se asemejan estrechamente a CB350474 fueron ligeramente menos abundantes que aquellos para FS18, pero solamente se encontraron en bibliotecas de ADNc de fibras, con alrededor de dos veces procedentes de fibras de la etapa de SCW temprana de 20-22 dpa que en fibras en elongación de 0-10 dpa. Por lo tanto, el gen se denominó una SCW PRP.

Se diseñaron para q-PCR cebadores que abarcan el extremo 3’ del transcrito de consenso, para medir el nivel de expresión del gen que corresponde al ADNc para SCW PRP. Estos fueron SCWPRP_F 5’-caggtacaccaatcgaggaa-3’ (SEQ ID NO: 12) y SCWPRP_R 5’-atggtgggattgttggtagc-3’ (SEQ ID NO: 13), que produjeron un producto de 110 pb en las amplificaciones. En cuanto a la medida de los niveles de expresión del gen FS18, se usó la ARN helicasa de algodón como gen de referencia en los ensayos de PCR cuantitativa, y se determinó el nivel de expresión en diferentes puntos de tiempo tras la antesis con respecto a 0 dpa. Se puede observar en la Figura 3 que la expresión del gen de SCWPRP fue selectivo de la fibra.

Un fragmento de 330 pb que abarca la región codificante del gen de SCW PRP se amplificó a partir de ADNc de fibra de algodón a 20 dpa, y se usó como sonda para cribar los filtros del inserto grande BAC de Acala Maxxa (Clemson Genomics Institute), como se describió anteriormente. Se aislaron 13 BACs diferentes, y se secuenciaron usando un cebador procedente de cerca del comienzo de la traducción (SCWPRP-hacia abajo: 5’gcaggttccaacgttttcat-3’ -(SEQ ID NO: 14). Esto identificó dos clases de genes que fueron muy similares y estaban representados por los clones de BAC BAC4A23 y BAC10G1. Los genes de SCW PRP en estos BACs se secuenciaron de forma más completa. Ninguno de los genes tuvo un intrón. El gen en BAC4A23 coincidió exactamente con la secuencia de ADNc de consenso, mientras que aquel en BAC10G1 tuvo tres diferencias de nucleótidos con respecto al transcrito de SCW PRP de consenso, de manera que representaron genes muy similares. La secuencia nucleotídica presente en BAC4A23 (SEQ ID NO: 15) se analizó con detalle.

imagen15

imagen16

En una primera etapa, la funcionalidad del promotor en el constructo se evaluó en un ensayo de expresión transitoria mediante bombardeo con partículas de ADN de pSirogateIV-Promotor 4A23-GUS en óvulos de algodón cultivados, y tiñendo en busca de la actividad de la enzima GUS según el método de Jefferson et al (1987) EMBO J. 6: 39013907.

En este experimento, se usó como control un vector de expresión que comprende un casete de promotor 35S-GUS. La actividad del promotor se monitorizó contando el número de manchas de GUS/número de óvulos analizados (véase la Tabla 3).

Tabla 3: Número de manchas de GUS/número de óvulos analizados.

promotor: 7 dpa 16 dpa 29 dpa

35S: 10/40 1/10 no ensayado

SCWPRP: no ensayado 5/30 4/28

10

Se observó que el promotor SCWPRP conduce la expresión de GUS entre 16 dpa y 29 dpa.

En una etapa siguiente, se llevó a cabo la transformación del algodón con la cepa de Agrobacterium que porta pSirogateIV-promotor 4A23-GUS, esencialmente como se describe en Murray et al. (1999) Mol. Breed. 5: 219-232, usando los segmentos de cotiledones de plántulas de la variedad de cultivo de algodón Coker315-11 como fuente de

15 tejido de algodón en la transformación. Coker315-11 es una selección de CSIRO de la variedad de cultivo Coker 315 regenerable. En el experimento de transformación, la selección se llevó a cabo para la resistencia a sulfato de kanamicina.

Se generó un total de 17 transformantes primarios, que representan 12 sucesos de transformación independientes. Las plantas transformadas se transfirieron al suelo y se dejaron florecer. Las flores se etiquetaron en la antesis. Se

20 recogieron capullos tanto a 10 como a 20 dpa, y las semillas completas con fibras se tiñeron para la enzima GUS usando tinciones histoquímicas de X-gluc como se describe por Jefferson et al., 1987. Las hojas inmaduras, segmentos de pecíolos, raíces y secciones de tallos, procedentes tanto de ramas jóvenes como viejas, también se tiñeron para GUS. En la Tabla 4 se resumen los patrones de tinción, y en la Figura 4 se dan las imágenes representativas.

25 Tabla 4: Tejidos en los que se detectó actividad de la enzima GUS en diferentes plantas de algodón transgénicas T0 transformadas con el constructo de SirogateIV-promotor SCWPRP-GUS. +, expresión débil o localizada, ++

5

10

15

20

25

30

35

40

expresión media, +++ expresión muy fuerte, -sin tinción

Línea de transformante: Hoja Pecíolo Tallo Raíz Fibra de 10 dpa Fibra de 20 dpa

T427-26: + Solamente en pequeñas glándulas superficiales -no en tricomas + Solamente en pequeñas glándulas superficiales -no en tricomas; alguna tinción débil en el centro de pecíolos más viejos + Solamente en algunas glándulas superficiales -no en tricomas - ++ +++

T427-6-1: + Solamente en pequeñas glándulas superficiales -no en tricomas + Solamente en pequeñas glándulas superficiales -no en tricomas + Solamente en pequeñas glándulas superficiales -no en tricomas - ++ +++

Se observó que el promotor SCWPRP se expresa selectivamente en fibras, particularmente en etapas tardías, de acuerdo con los datos de Q-PCR. También se expresó en algún tipo de un tricoma glandular presente en la mayoría de las superficies epidérmicas verdes de tejidos molidos anteriores.

Materiales y métodos

1. Cultivo de óvulo de algodón y bombardeo con partículas

Se cosecharon capullos de algodón procedentes de cada etapa de iniciación de la fibra, se esterilizó la superficie en etanol al 95%, se sometieron a la llama de forma breve, y se disecaron en condiciones estériles. Los óvulos se transfirieron a un medio de cultivo líquido en presencia de ácido indol-3-acético 5 M y ácido giberélico 0,5 M. Los óvulos se colocaron en 2 papeles de filtro Whatmann prehumedecidos con Medio 100 (sal MS, vitaminas B5, MES

0.5 g/l, MgCl2.6H2O 0,94 g/l, gelrita 2 g/l, glucosa 30 g/l, pH 5,8) suplementado con manitol 0,2 M, antes del bombardeo. Se hizo precipitar ADN sobre partículas de oro de 1 m mediante el método de cloruro de calcioespermidina descrito en el manual de instrucciones de BioRad (Richmond, CA) para el Biolistic Particle Delivery System (1000/he). Los óvulos cultivados se bombardearon con una distancia del objetivo de 6, 9 y 12 cm en vacío de Hg de 28 pulgadas (0,948 bares) según la recomendación del fabricante para tejidos vegetales y con diversas presiones de helio (900 y 1350 psi) (62,05 y 93,08 bares). Los óvulos bombardeados se transfirieron inmediatamente a un medio líquido reciente, o se incubaron en un medio sólido durante 2 días antes de transferirlos a un medio líquido. Para cerrar herméticamente cada cápsula, para prevenir que los tejidos se secasen, se usó una monocapa de cinta quirúrgica Micropore (3M Healthcare, St. Paul, MN). Los cultivos se incubaron a 32ºC en una atmósfera de 5% de CO2. Cada constructo se bombardeó en más de 120 óvulos por réplica, y los experimentos se repitieron al menos 6 veces.

2. Análisis de patrones de expresión de beta-glucuronidasa

La localización histoquímica de la actividad de la enzima GUS se llevó a cabo usando el sustrato 5-bromo-4-cloro-3indolil-beta-D-glucurónido (X-Gluc) como se describe por Jefferson RA et al (1987) EMBO J 6: 3901-3907. Para prevenir la difusión del producto de GUS durante la tinción, se añadieron 0,5 mM de ferri/ferrocianuro potásico al amortiguador de la tinción histoquímica. Se realizaron fotografías de los óvulos teñidos histoquímicamente asociados con las fibras con un estereomicroscopio Olympus SZX con una cámara digital Olympus DP11. Se construyeron composiciones de imágenes usando el software de Adobe Photoshop 5.5.

Ejemplo 2: Expresión del promotor FS18 en plantas de algodón

Los transformantes de algodón primarios se generaron como se describió en el ejemplo 1 con un constructo que comprende un gen quimérico para la expresión de GUS bajo el control del promotor FS18 (pSirogateIVFS18(3P22)GUS). Se recogieron semillas T1 procedentes de cuatro transformantes primarios independientes con expresión elevada en fibra de 10 o 20 dpa, y se plantaron en el invernadero. Estas líneas fueron T420-24, T420-31, T420-37 y T420-48. Secciones de cotiledones se tiñeron con X-Gluc, como se describió previamente. Se observó actividad de Gus en muchas de las plantas en tricomas glandulares pequeños distribuidos a lo largo del cotiledón y en áreas alrededor de bordes de corte que indican una respuesta a la herida. Cuando los cotiledones completos se tiñeron, la actividad de GUS se observó solamente en los tricomas glandulares y en algunas áreas dispersas cerca de los bordes, o internamente en el cotiledón, presumiblemente en áreas que han sido dañadas durante la manipulación antes de la tinción o cuando se regaron las plantas. No todos los cotiledones tuvieron esta tinción difusa en parches.

Dos plantas T1 procedentes de cada línea se hicieron crecer hasta madurez, y las flores se etiquetaron para recoger capullos de diferentes edades (0, 10, 20 y 30 dpa), y se cosecharon otros tejidos diversos, incluyendo hoja, pecíolo, tallo, raíz, cubierta del capullo (a 10 y 20 dpa), pequeño brote floral y diversas partes florales a 0 dpa (incluyendo bráctea, pétalo, estambres y estigma de las flores). Estos se tiñeron para la actividad de GUS, y material similar se

5 congeló para la extracción de ARN y RT-PCR cuantitativa para indagar en los niveles relativos de expresión en diferentes tejidos. La tinción de GUS fue en disolución de X-Gluc toda la noche a 37ºC como se describe en el ejemplo 1. Los tejidos se aclararon en una serie de etanol hasta que no se extrajo más clorofila, y se fotografiaron. Todas las líneas tuvieron patrones de tinción similares. Como ejemplo, en la Tabla 5, a continuación, se tabulan los resultados para la línea T420-24.

10 Tabla 5: Patrones de tinción de GUS para la línea T420-24.

Tejido: Comentario

Óvulo de 0 dpa: Óvulo teñido en la superficie

Fibra y óvulo de 10 dpa: Fibras fuertemente teñidas

Fibra de 20 dpa: Fibras fuertemente teñidas

Fibra de 30 dpa: Fibras fuertemente teñidas

Cotiledón: Tricomas glandulares pequeños teñidos, cierta tinción irregular de mesófilo y epidermis alrededor de las heridas. Unas pocas glándulas alrededor del néctar se tiñeron fuertemente, pero la mayoría de las glándulas en el néctar no se tiñeron

Hoja: Tricomas glandulares pequeños teñidos, cierta tinción en los bordes del corte o alrededor del daño, ciertos tricomas pilosos teñidos, pero solamente en áreas próximas en las que hay una respuesta a la herida.

Pecíolo de la hoja: Tricomas glandulares pequeños teñidos, tricomas pilosos no teñidos

Tallo: Cierta tinción irregular débil en vasculatura, pero probablemente una respuesta a herida en secciones de corte

Raíz: Sin tinción

Cubierta del capullo (0, 10 y 20 dpa): Tinción de la pared de la cubierta del capullo y del tabique que separa los lóculos, en todas las etapas

Capullo floral: Unos pocos tricomas glandulares pequeños teñidos pero sin tricomas pilosos, tinción ocasional de áreas dañadas.

Bráctea floral: Unos pocos tricomas glandulares pequeños teñidos, pero sin tricomas pilosos.

Pétalo: Tinción de tricomas glandulares pequeños en la base del pétalo, y solamente a lo largo de un borde en el que se solapan los pétalos. Cierta tinción irregular de áreas dañadas del pétalo, particularmente más distante hacia la base del pétalo, donde la tinción podría ser bastante fuerte.

Estambre/antera/polen: Tinción muy fuerte en polen, tinción más débil de la pared de la antera y algunas veces del filamento

Estigma/estilo: Tinción débil de la superficie del estigma y de las papilas estigmáticas

Expresión cuantitativa de GUS en diferentes tejidos

Se recogieron muestras, y el ARN se preparó como se describe en Wan y Wilkins (1994) (Anal Biochem 223: 72-12) y se trató con ADNasa. El ARN total se convirtió en ADNc usando transcriptasa inversa Superscript II y cebadores 15 aleatorios, y se llevó a cabo la RT-PCR cuantitativa como se describió previamente. Los cebadores usados fueron Q-GUS (CAGGGAGGCAAACAATGAATCAACAACTCTC) y Q-ME (TGCAAACAGCAACAGATCAACTGTCCTTTTTCC), específicos para el transgén de GUS introducido, y el gen de ubiquitina de algodón endógeno se usó para la normalización, como se describe previamente. Todas las muestras se ajustaron con respecto a la expresión de GUS en cada planta de fibras de 30 dpa ajustadas como 1,0, y entonces

20 se promediaron a lo largo de dos plantas diferentes en cada una de cuatro líneas independientes diferentes.

Q-PCR indica que el promotor FS18 es activo a lo largo del desarrollo de la fibra, pero es expresado más

5

10

15

20

25

30

35

fuertemente más tarde en el desarrollo. Consistente con los datos de tinción de GUS, el promotor parece ser activo en la cubierta del capullo y en la hoja (probablemente en respuesta al daño por insectos, ya que fue bastante variable con la mayoría de las muestras que tienen poca o ninguna expresión de GUS en las hojas). La expresión en otros tejidos fue baja, ya que los tricomas glandulares pequeños en los que GUS se detectó mediante tinción representan una proporción muy pequeña de las células totales extraídas. No se detectaron niveles elevados de transcritos de GUS en los estambres. En la Figura 5 se da un resumen de la expresión en diferentes tejidos, y los datos cuantitativos en este experimento se pueden tomar de la Figura 5E.

Conclusión

En conjunto, estos datos apoyan la conclusión de que el promotor FS18 es preferente de la fibra y se expresa a lo largo del desarrollo de la fibra, pero es más activo durante las etapas tardías de la deposición de la pared celular secundaria. Se expresa en otro lugar en la planta, pero habitualmente en células o tejidos relativamente especializados, incluyendo tricomas glandulares pequeños distribuidos a lo largo de la epidermis vegetal en tallos, hojas, brácteas, pecíolos y pétalos. Hay algo de expresión en la cubierta del capullo materna. El promotor también tiene cierta sensibilidad a heridas, pero parece que esto es una actividad menor.

Ejemplo 3: Expresión del promotor SCW-PRP en algodón (para referencia solamente)

Se generaron semillas T1 de cuatro transformantes primarios independientes según el método del ejemplo 1 con un constructo que comprende un gen quimérico para la expresión de GUS bajo el control del promotor SCW_PRP (constructo de SirogateIV-promotor SCWPRP-GUS), y los transformantes con expresión elevada en fibra de 10 o 20 dpa se recogieron de los transformantes primarios generados según el método descrito en el ejemplo 1 y que comprenden un gen quimérico para la expresión de GUS bajo el control del promotor SCW-PRP, y se plantaron en el invernadero. Estas líneas fueron T427-5, T427-6, T427-26-1 (introducida en el ejemplo 1) y T427-31. Secciones de cotiledones se tiñeron con X-Gluc, como se describió previamente. Se observó actividad de Gus en muchas de las plantas en tricomas glandulares pequeños distribuidos a lo largo del cotiledón, y en áreas alrededor de los bordes de corte, indicando una respuesta a heridas. Cuando se tiñeron cotiledones completos, la actividad de GUS solo se observó en los numerosos tricomas glandulares a lo largo del cotiledón y su pecíolo y en algunas áreas irregulares cerca de los bordes o internamente en el cotiledón, presumiblemente en áreas que habían sido dañadas durante la manipulación antes de la tinción o cuando las plantas se regaron. No todos los cotiledones tuvieron esta tinción difusa en parches.

Dos plantas de cada línea se hicieron crecer hasta madurez, y las plantas se etiquetaron para recoger capullos de diferentes edades (0, 10, 20 y 30 dpa), y se recolectaron otros tejidos diversos, incluyendo hoja, pecíolo, tallo, raíz, cubierta del capullo (a 10 y 20 dpa), capullo floral pequeño y diversas partes florales a 0 dpa (incluyendo bráctea floral, pétalo, estambres y estigmas). Éstos se tiñeron para la actividad de GUS, y material similar se congeló para la extracción de ARN y la RT-PCR cuantitativa para observar los niveles relativos de la expresión en diferentes tejidos. La tinción de GUS fue en disolución de X-Gluc toda la noche a 37ºC, como se describe previamente. Los tejidos se aclararon en una serie de etanol hasta que no se extrajo más clorofila, y se fotografiaron. Todas las líneas tuvieron patrones de tinción similares. Los resultados para la línea T427-5 se representan en la tabla 6, a continuación.

Tabla 6: Patrones de tinción de GUS para la línea T427-5

Tejido: Comentario

Óvulo de 0 dpa: Superficie del óvulo teñida

Fibra y óvulo de 10 dpa: Fibras fuertemente teñidas

Fibra de 20 dpa: Fibras fuertemente teñidas

Fibra de 30 dpa: Fibras fuertemente teñidas

Cotiledón: Numerosos tricomas glandulares pequeños a lo largo de venas pequeñas y grandes y en y alrededor del néctar se tiñeron (más que con FS18GUS), cierta tinción irregular de mesófilo y epidermis alrededor de las heridas (más fuerte que FS18GUS)

Hoja: Numerosos tricomas glandulares pequeños teñidos, cierta tinción en los bordes de corte o alrededor del daño, ciertos tricomas pilosos teñidos pero solamente en áreas cercanas en las que hay una respuesta a la herida

Raíz: Sin tinción

imagen17

Claims

imagen1