CN103328635A

CN103328635A - 纤维选择性启动子

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Publication number: CN103328635A
Application number: CN2011800640873A
Authority: CN
Inventors: F·莫伊勒韦特; D·卢埃林
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Bayer CropScience NV
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Bayer CropScience NV
Priority date: 2011-01-04
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2031-12-21
Also published as: MX345212B; AU2011354240B2; MX2013007815A; ZA201304927B; WO2012093032A1; AU2011354240A1; EP2661498A1; EP2661498B1; US20130276170A1; US9243260B2; ES2613687T3; CN103328635B

Abstract

本发明涉及在棉花纤维中选择性地表达一种感兴趣的基因的材料和方法。具体地，本发明提供了一种用于在植物中调控纤维选择性表达的表达盒。

Description

纤维选择性启动子

发明领域

本发明涉及感兴趣的基因偏好性地或选择性地在植物（例如棉花植物）纤维中表达的材料和方法。具体地，本发明提供了用于在棉花植物中调控纤维偏好性或纤维选择性表达的表达盒。

本发明的介绍

棉花（棉花属物种）是世界上最重要的天然纺织纤维并且也是重要的油籽作物。棉花生产为大约1亿家庭提供收入，并且大约150个国家涉及棉花进口和出口。它的经济影响估计为全球每年大约$5000亿。世界棉花纤维的消耗每年大约1.15亿包或大约2700万公吨（国家棉花委员会（National CottonCouncil），超链接http://www.cotton.org/，2006）。棉花属是相对复杂的并且包括大约45个二倍体（2n=2x=26）物种和5个四倍体（2n=4x=52）物种，所有呈现二体遗传模式。二倍体物种（2n=26）分为8个基因组（A–G，和K）。非洲分化单位（包括A、B、E和F基因组）天然地发生在非洲和亚洲，同时D基因组分化单位是美国本土的。第三二倍体分化单位（包括C、G和K）在澳大利亚发现。所有52个染色体物种（包括陆地棉和海岛棉）都是经典的天然异源四倍体，它们从A基因组样祖先的非洲物种和D基因组样美洲物种之间的种间杂交在新世界（New World）中产生。与这些原始四倍体祖先最接近的现存的亲属是A基因组物种草棉（A1）和亚洲棉（A2）以及D基因组物种雷蒙德氏棉（D5）‘Ulbrich’。多倍体化被估计发生在100万至200万年前，产生了5个现存的异源四倍体物种。有趣地，这些A基因组物种生产纺锤状纤维并且以有限规模培养，但是D基因组物种不是。全球每年的棉花作物多于95%的是陆地棉、高原棉或美洲棉，并且加长棉或比马棉（海岛棉）占低于2%（国家棉花委员会，http://www.cotton.org，2006）。理解在异源四倍体中A和D亚基因组对基因表达的贡献可以有助于改进纤维性状，但是不幸的是棉花的大部分序列信息目前是缺乏的并且解码棉花基因组将是用于提高对棉花属中多倍体与基因组大小变化的功能重要性和农业重要性的理解的一个基础。

每一棉花纤维是胚珠的分化的单表皮细胞。每一棉铃生产大约50万纤维，一些形成绒毛一些形成棉绒。表皮细胞成为纤维的起始需要细胞命运的改变，该改变是一个涉及遗传、生理学和发育“转变“的生物学过程。遗传突变，多倍性，授粉/受精，以及激素调节可以影响发展成为纤维的细胞数量或改变纤维细胞特性（绒毛对棉绒）。然而，在纤维发育早期阶段这些因素如何控制基因表达变化（这些变化协调模式与速度）并不清楚。

相比之下，棉花纤维的形态学发育在本领域是得以良好记录的。棉纤维经历四个交搭的发育阶段：纤维起始、延长、次生胞壁生物合成、以及成熟。纤维起始是一种快速的过程。在开花期之后白色毛绒纤维立即开始发育并且持续至约开花后3天（DPA），此后纤维细胞延长（直到20DPA）。次生胞壁生物合成大约在15dpa起始并且持续至35DPA，随后是一个成熟过程直至45-60DPA。棉花纤维衍生自胚珠表皮细胞（成熟组织）。然而，仅～25%-30%的这些表皮细胞分化成为商业上重要的棉绒纤维。大多数细胞不分化成纤维或发育成短纤维或绒毛。对于进入纤维发育的细胞，在每一个胚珠上细胞起始和延长几乎同时发生，这表明基因表达方面的变化在纤维分化和发育中通过细胞间信号传导和/或时间机制被协调。

纤维生产和加工的遗传改进应该保证这种天然的可再生的产品变得与石油衍生合成纤维相竞争。

对组织选择性和发育调控性的基因进行鉴别的研究在理解蛋白质在纤维发育和细胞壁结构中的作用方面是重要的。此外，此些基因以及尤其它们的调控元件和启动子为通过基因工程的纤维修饰提供了重要工具。在很多情况下，希望的是转基因被发育地调控以在限定的发育阶段在纤维细胞中具有专一性或特异性表达。这种调控可以通过能够纤维特异性表达的启动子来最迅速完成。

有用的启动子驱动基因在纤维中偏好性地或选择性地和强烈地表达，即，强烈地和持续地表达，从纤维延长阶段通过次生壁沉积的起始到它的终止。次生壁沉积的起始被定义为当棉花纤维的干重/单位长度开始增加时或当任何细胞的干重/单位表面积通过包含多于40%（w/w）纤维素的新壁物质的合成而开始增加时的时间。就陆地棉棉花纤维来说，当棉花植物在温室或大田中在典型条件下（日间气温26°C-34°C，夜间气温20°C-26°C连同充足的光线、水和矿质营养）生长时，这被希望发生在14-17DPA之间。此外，有用的是该纤维选择性启动子驱动基因仅在纤维中表达同时排除或最小化在其它组织中的表达。本发明是针对满足这些需求。

附图说明

图1：在不同棉花组织中通过定量RT-PCR的FS18的相对表达，使用棉花RNA解旋酶作为参考。值是四个技术性重复的平均值。FS18在整个纤维发育中在延长和细胞壁增厚阶段表达。

图2：包含FS18启动子-GUS构建体的代表性转化体的GUS染色模式。观察到在10dpa和20dpa的纤维中的蓝色染色以及表皮腺中的少量染色跨幼叶叶柄的表面分布。在营养性毛状体中没有观察到染色。

图3：富含脯氨酸的细胞壁蛋白质（SCWPRP）在整个纤维发育中在延长和细胞壁增厚阶段表达并且在任何其它测试的组织中没有检测到。在不同组织中通过定量RT-PCR的SCW PRP的相对表达，使用棉花RNA解旋酶作为参考。值是四个技术性重复的平均值。

图4：包含SCWPRP启动子-GUS构建体的代表性转化体的GUS染色模式。观察到在10dpa的纤维中有较弱的染色以及在20dpa的纤维中有很强的染色。在叶表面、叶柄和茎的表面上的腺毛状体中也有强染色，但是在营养性毛状体中没有观察到染色。

图5：通过FS18启动子驱动的GUS转录本在不同棉花组织中的表达。给出了针对四个不同的独立株系中的每一个而言的两个不同T1植物的数据（图5A至图5D），其中表达是相对于30 dpa的纤维样品。图5E中给出了定量数据。在叶片中有两个异常值（突出显示），这两个异常值被怀疑是由于在样品收集前蓟马对叶片的损害。Nd：未确定。

图6：通过SCW-PRP启动子驱动的GUS转录本在不同棉花组织中的表达。给出了针对四个不同的独立株系中的每一个而言的两个不同T1植物的数据（图6A至图6D），其中表达是相对于30 dpa的纤维样品。图6E中给出了定量数据。Nd：未确定。

发明概述

本发明涉及从棉花分离的核酸分子，这些分子可以指导可操作地连接的DNA区域（比如对生物活性RNA进行编码的DNA区域）在包含或生产纤维的植物（比如棉花）的纤维中偏好性地或选择性地表达或转录。此外这些嵌合基因在延长和次生壁积累过程中在纤维中表达。

因此，本发明涉及嵌合DNA构建体，每一嵌合DNA构建体包括可操作地连接至一个第二DNA的5'端的DNA启动子一个，该第二DNA编码一种生物活性RNA，以及一个可操作地连接至该第二DNA的3'端调控区域。该DNA构建体可以被结合在一种表达系统中、载体、宿主细胞、植物或植物种子中。

本发明的另一个方面涉及适合用于诱导由一个第二DNA编码的蛋白质的表达的分离的DNA启动子，该第二DNA可操作地与该DNA启动子连接。这些DNA启动子分离自棉花并且在延长和次生壁积累的过程中在纤维中偏好性地或选择性地驱动表达。

本发明的另一个方面是针对在植物中在延长和次生壁积累的过程中在纤维中偏好性地或选择性地表达基因的方法，该方法包括用包含本发明的分离的DNA启动子的DNA构建体转化植物。

此外，在正常植物的延长和次生壁积累过程中在纤维中偏好性地或选择性地表达的基因的启动子对于纤维的基因工程化可以是有价值的以达到：（1）在正常和应激条件下改进的农业产量以及（2）改进的纤维特性，其依赖于次生壁积累过程中的修饰。本发明披露的启动子允许达到这些目标同时避免或最小化对植物生长和发育或纤维发育的其它阶段的多效性影响，该多效性影响会减小该目标性影响的益处。

在一个实施例中本发明提供了选自下组序列的纤维细胞偏好性的或选择性的启动子：i）包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核苷酸序列，ii）核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少90%，尤其至少95%序列一致性的核苷酸序列，iii）核苷酸序列，其包括在严格条件下与i）或ii）提到的核苷酸序列杂交的大约500bp至大约1375bp的DNA片段。

在另一个实施例中本发明提供了嵌合基因，该嵌合基因包括以下可操作地连接的DNA区域：i）根据以下各项的纤维细胞选择性或偏好性启动子：i）核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列或ii）核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少90%，尤其至少95%序列一致性的核苷酸序列或iii）核苷酸序列，其包括在严格条件下与i）或ii）提到的核苷酸序列杂交的大约500bp至大约1375bp的DNA片段，以及b）对编码感兴趣的生物活性RNA进行编码的异源DNA区域；以及c）可任选地转录终止和聚腺苷酸化信号。

在一个具体实施例中该嵌合基因包括生物活性RNA，其对感兴趣的蛋白质进行编码。

在另一个具体实施例中该生物活性RNA是抑制性RNA例如正义（共抑制）RNA、反义RNA、核糖核酸酶、微小RNA、双链发夹RNA。

在又另一个实施例中本发明提供了包括在此于前描述的嵌合基因的重组载体。

在另一个实施例中本发明提供了包括在此于前描述的嵌合基因的植物细胞。

在另一个实施例中本发明提供了在它的细胞中包括在此于前描述的嵌合基因的植物。该植物可以具有改变的纤维，其中所述的纤维在组分、长度或强度方面被改变。

在一个特殊的实施例中本发明的该植物在它的细胞中包括本发明的一种嵌合基因是一种棉花植物。

在另一个实施例中本发明提供了如在此于前描述的植物的种子。

在另一个实施例中本发明提供了从根据本发明的植物收获的改变的植物纤维。

在另一个实施例中本发明提供了用于在纤维生产植物（例如棉花植物）的纤维细胞中偏好性地或选择性地表达生物活性RNA的方法，，所述方法包括提供具有如在此于前所述的嵌合基因的所述植物的细胞并且培养所述植物。

在用于在纤维生产植物的纤维细胞中表达生物活性RNA的方法的具体实施例中，所述植物是棉花植物。

在另一个实施例中本发明提供了本发明的纤维偏好性或选择性启动子用于在纤维生产植物（例如棉花植物）的纤维细胞中偏好性或选择性表达生物活性RNA的用途。

发明详细说明

本发明提供了能够在纤维中转录异源核酸序列的启动子和表达盒，具体地是转录起始于纤维延长阶段贯穿纤维的次生壁阶段，更具体地是在棉花纤维中，以及在植物（具体地是棉花植物）中修饰、生产以及使用同样的启动子和表达盒的方法。本发明还提供了组合物、转化宿主细胞，例如植物，它们包含包括这些纤维选择性启动子的表达盒。在SEQ ID NO:1中描述的核苷酸序列代表陆地棉FS18基因的启动子的核苷酸序列，该陆地棉FS18基因涉及其它植物非特异性脂转移蛋白质。在SEQ ID NO:2中描述的核苷酸序列代表富含脯氨酸的蛋白质的基因（名义上指定为陆地棉该SCW-PRP基因）的启动子的核苷酸序列。

在一个实施例中本发明提供了纤维偏好性的或纤维选择性的启动子，该启动子具有SEQ ID NO:1从核苷酸位置1至核苷酸位置1375的的核苷酸序列用于在表达盒中使用。在具体实施例中所述纤维偏好性或纤维选择性启动子具有SEQ ID NO:1的从核苷酸位置500至核苷酸位置1375的核苷酸序列。在又另一个具体实施例中所述纤维偏好性或纤维选择性启动子具有SEQ ID NO:1的从核苷酸位置700至核苷酸位置1375的核苷酸序列。SEQ ID NO:1描述了在编码FS18蛋白质的第一个氨基酸的密码子的上游（即，定位于5’端上游）的区域。这种启动子区域可以是FS18基因的起始密码子上游至少大约300至大约400至大约500bp、至少大约1000bp、至少大约1100bp、至少大约1300bp。

在另一个实施例中本发明提供了纤维偏好性的或纤维选择性的启动子，该启动子具有SEQ ID NO:2的从核苷酸位置1至核苷酸位置1378的核苷酸序列用于在表达盒中使用。在一个具体实施例中所述纤维偏好性或纤维选择性启动子具有SEQ ID NO:2的从核苷酸位置500至核苷酸位置1378的核苷酸序列。在又另一个具体实施例中所述纤维偏好性或纤维选择性启动子具有SEQID NO:2的从核苷酸位置700至核苷酸位置1378的核苷酸序列。SEQ ID NO:2描述了在编码SCW-PRP蛋白质的第一个氨基酸的密码子的上游（即，定位于5’端上游）的区域。这种启动子区域可以是SCW-PRP基因的起始密码子上游至少大约300至大约400至大约500bp、至少大约600bp、至少大约700bp、至少大约800bp、至少大约900bp。

因此本发明提供了选自下组序列的纤维细胞偏好性的或选择性的启动子：i）核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列，ii）核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少90%，尤其至少95%序列一致性的核苷酸，iii）核苷酸序列，其包括在严格条件下与i）或ii）提到的核苷酸序列杂交的大约300bp至大约1300bp的DNA片段。

根据本发明的纤维偏好性的或纤维选择性的启动子也可以包括在更大的DNA分子中。

在具体的实施例中该纤维细胞选择性的或偏好性的启动子是在纤维延长阶段直到纤维的次生壁合成阶段结束期间活跃的启动子。

短语“DNA”、“DNA序列”、“核酸序列”和“核酸分子”是指包括有序排列的核苷酸的物理结构。该DNA序列或核苷酸序列可以被包含在更大的核苷酸分子、载体或类似物中。此外，在这些序列中的有序排列的核酸可以序列表、附图、表格、电子媒介或类似物的形式进行描述。术语“表达”是指基因的转录以产生相应的RNA。应理解的是所产生的RNA是生物活性RNA。在具体实施例中所述生物活性RNA是mRNA并且这个mRNA的翻译产生相应的基因产物（即，肽、多肽、或蛋白质）。在另一个具体实施例中该异源核酸（可操作地连接至本发明的启动子）也可以根据本领域熟知的规则对核糖核酸酶、反义RNA、正义RNA、双链RNA或合成或天然微小RNA分子进行编码以下调纤维中包括的其它基因的表达或下调甚至存在于以转基因植物的纤维为食的病原体或有害生物中的基因的表达。

如在此使用的可与术语“多肽”互换使用的术语“蛋白质”描述了一组由多于30个氨基酸组成的分子，而术语“肽”描述了由最多30个氨基酸组成的分子。蛋白质和肽可以进一步形成二聚体、三聚体和更高的寡聚物，即，由多于一个(多)肽分子组成。形成此类二聚体、三聚体等等的蛋白质或肽分子可以是相同的或不同的。结果是，相应的更高级结构称作同-或杂二聚体，同-或杂三聚体，等等。术语“蛋白质”和“肽”也指天然地修饰的蛋白质或肽，其中该修饰通过例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等来完成。这些修饰在本领域是熟知的。在另一个实施例中本发明提供了嵌合基因，该嵌合基因包括以下可操作地连接的DNA区域：a）纤维细胞偏好性的或纤维细胞选择性的启动子，选自i）核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列或ii）核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少90%，尤其至少95%序列一致性的核苷酸序列或iii）核苷酸序列，其包括在严格条件下与以上提到的i）或ii）核苷酸序列杂交的大约300bp至大约1300bp的DNA片段，以及b）对感兴趣的生物活性RNA进行编码的异源DNA区域以及可任选地c）在植物细胞中可操作的转录终止和聚腺苷酸化信号。术语“异源”是指衍生自不同来源的两种或更多种核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，就可操作地连接的DNA区域（例如编码序列）而言启动子是异源的，如果在自然界中一般找不到这种组合的话。此外，具体的序列就它插入到的细胞或生物体而言可以是“异源”的（即，在那个具体的细胞或生物体中不是自然发生的）。

术语“嵌合基因”是指包含以下各项的任何基因：a）DNA序列，包括在自然界中未发现的调控和编码序列，或b）编码非天然毗邻的蛋白的部分的序列，或c）非天然毗邻的启动子的部分。因此，一种嵌合基因可以包括调控序列和从不同来源得到的编码序列，或包括调控序列和从相同来源得到的编码序列，但是与在自然界中发现的排列方式不同。在本发明中，“同源”基因或多核苷酸或多肽是指一个与感兴趣的基因或多核苷酸或多肽共享序列相似性的一种基因或多核苷酸或多肽。

“纤维选择性”表达（或“转录”或纤维细胞选择性是等效的）在本发明的背景中是指一种核酸序列通过一个启动子（或一个转录调控元件）进行的转录，其方式是所述核酸序列在纤维中的转录促成了比所述核酸序列在大多数其他植物组织中的转录的多于10倍、20倍或甚至多于100倍。换言之，在纤维选择性表达中，可操作地连接至本发明的启动子上的核酸在纤维中的转录促成了以上描述的所述核酸序列的转录程度在大多数其他植物组织的任何单个组织之上。

“纤维偏好性”表达（或等效的“转录”）是指一个核酸序列通过一个转录调控元件进行的转录，其方式使得所述核酸序列在纤维中的转录促成了所述核酸序列在大多数其他植物组织中转录的2倍和10倍之间。术语“纤维增强”与术语“纤维偏好性”是等效的。换言之，在纤维偏好性表达中，在纤维中可操作地连接至本发明的启动子上的核酸的转录促成了以上描述的在大多数其他植物组织的任何单个组织中2倍和10倍之间的转录。

在此鉴别出的转录序列被发现在纤维中偏好性地或选择性地介导一个强的表达，更确切地说是在纤维的延长阶段和次生细胞壁阶段。一个表达盒包括SEQ ID NO:1和它的具有启动子功能的片段，该表达盒在纤维中在纤维延长和纤维的次生细胞壁形成阶段偏好性地或选择性地指导表达。一个表达盒包括SEQ ID NO:2和其片段，该表达盒在纤维中在纤维延长和纤维的次生细胞壁形成阶段偏好性地或选择性地指导表达。更确切地，一个表达盒包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2及其片段，该表达盒在纤维中在开花期后天数（dpa）10-35天之间偏好性地或选择性地指导表达。

短语“可操作地连接的”是指两个或更多的核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，一个启动子区域可以相对于一个核酸序列定位以使得一种核酸序列的转录通过该启动子区域被指导。因此，一个启动子区域被“可操作地连接”至该核酸区域。“功能性地连接”是一个等效的术语。

如在此使用的，“启动子”是指对于DNA的初始转录必不可少的一个DNA序列的区域，导致了一个与转录的DNA互补的RNA分子的产生；这一区域也可被称为“5’调控区域”。启动子通常被定位在有待转录的编码序列的上游并且具有作为RNA聚合酶II和其他蛋白质例如转录因子（调控转录的反式作用蛋白因子）的结合位点的区域以引发一个可操作地连接的基因的转录。启动子自身可以包括亚元件（例如启动子基序）例如调控可操作地连接的基因转录的顺式作用元件或增强子结构域。本发明的启动子可以被改变以包含“增强子DNA”来协助提高基因表达。如本领域所熟知的，某些DNA元件可以被用来增强DNA的转录。这些增强子经常在真核细胞中发挥功能的一个启动子中的转录起始的5’端被发现，但是经常可以在编码序列的上游（5’）或下游（3’）插入。在一些实例中，这些5’增强子DNA元件是内含子。在这些内含子中作为增强子DNA有用的是来自水稻肌动蛋白1基因的5’内含子（见US5641876）、水稻肌动蛋白2基因、玉米乙醇脱氢酶基因、玉米热激蛋白70基因（见US5593874）、玉米萎缩1基因、马铃薯光敏1基因、拟南芥组蛋白4内含子和矮牵牛热激蛋白70基因（见US5659122）。因此，如在此考虑的，一个启动子或启动子区域包括通过插入或缺失调控区域而得到的启动子变异，使得该启动子经受随机的或定向的诱变等。一个启动子的活性或强度可以通过以下方式进行测量：相对于一个之前测定过转录活性的启动子而言它所产生的RNA量，或在一个细胞或组织中蛋白质积累的量。

在纤维中对功能性启动子片段的启动子活性的确认可以通过本领域普通技术人员来确定，例如使用一个启动子-报告子构建体，该构建体包括可操作地连接至一个在此进一步解释的β-葡萄糖苷酸酶（GUS）报告基因的基因组序列。本发明的启动子的已鉴别或已产生的片段的纤维偏好性或纤维选择性表达能力可以方便地通过将这种DNA分子可操作地连接至一种核苷酸序列而进行测定，该核苷酸序列编码一个容易计数的标记，例如一个β-葡萄糖苷酸酶基因，将这种嵌合基因引入一个植物并且，与该标记在该植物其他部分的表达谱相比，对在纤维中该标记的表达谱进行分析。标记（或报告基因）的其他候选物是氯霉素乙酰转移酶（CAT）和具有荧光特性的蛋白质，例如来自维多利亚多管发光水母的绿色荧光蛋白（GFP）。为定义一个最小的启动子区域，将代表该启动子区域的一个DNA区段从该感兴趣的基因的5’区域移除并且通过本领域普通技术人员熟知的重组DNA技术可操作地连接至一个标记基因（报告基因）的编码序列。该报告基因可操作地连接该启动子的下游，因此该启动子处引发的转录本进行通过该报告基因。报告基因总体上编码容易检测的蛋白质，包括但不限于氯霉素乙酰转移酶（CAT）、β-葡萄糖苷酸酶（GUS）、绿色荧光蛋白（GFP）、β-半乳糖苷酶（β-GAL）和荧光素酶。包含在该启动子的控制下的报告基因的表达盒可以通过本领域内熟知的转染技术引入一个合适的细胞类型中。为测定该报告蛋白，制备细胞裂解液并且对报告蛋白进行本领域熟知的合适的测定。例如，若CAT是所选择的报告基因，将在本研究中用包含在启动子控制下的CAT的构建体转染的细胞的裂解液与同位素标记的氯霉素和乙酰辅酶A（乙酰-CoA）进行混合。该CAT酶将来自乙酰-CoA的乙酰基转移至氯霉素的2-位或3-位上。该反应是通过薄层色谱法监测的，该薄层色谱法将乙酰化的氯霉素从未反应的材料中分离出来。这些反应产物此后通过放射自显影法被可视化。酶活性的水平对应于所产生的酶的量，这进而揭示了来自感兴趣的启动子或启动子片段的表达水平和纤维特异功能性。这个表达水平也可以被用来与其他启动子比较，以确定所研究的启动子的相对强度。一旦确认了活性和功能性，可以采用另外的突变和/或缺失分析来确定引发转录所需的最小区域和/或序列。因此，序列可以在该启动子区域的5’末端和/或该启动子区域的3’末端缺失，并且可以引入核苷酸取代。此后可以将这些构建体再次引入细胞并且确定它们的活性和/或功能性。

除了测量一种报告酶的活性外，该转录启动子的活性（和功能性）也可以通过测量所产生的RNA的水平来确定。该RNA例如mRNA的水平可以在一个单一时间点或在多重时间点进行测量，并且按照这样，成倍增加可以是平均成倍增加或由实验测量值得到的外推值。由于是对多个水平的一个比较，可以使用任何测量mRNA水平的方法。在一个优选的方面，进行比较的组织或器官是具有叶片或叶片组织的纤维或纤维组织。在另一个优选的方面，对多种组织或器官进行比较。一种优选的多重比较是一种纤维或纤维组织与2、3、4或更多种选自下组的组织或器官进行比较，该组由花组织、花原端、花粉、叶片、胚、芽、叶原基、芽原端、根、根尖、维管组织和子叶组成。如在此使用的，植物器官的实例是纤维、叶片、根等，并且组织的实例是叶原基、芽原端、维管组织等。一个启动子的活性或强度可以按相对于mRNA或蛋白质的总量它确切产生的mRNA或蛋白积累的量的方式进行测量。该启动子优选地以一个大约大于1%、大约2%的总mRNA水平、更优选地大于大约5%的总mRNA水平来表达一种可操作地连接的核酸序列。可替代地，一个启动子的活性或强度可以相对于一个被良好表征的启动子（之前已对其测定了转录活性）来表达。

在此将进一步清楚的是等效物FS18和SCW-PRP启动子可以被从其他植物（优选产生纤维的植物）分离。为此，可以将直系同源的启动子片段从其他植物中分离出，使用SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或一个具有至少其300个连续核苷酸的功能性片段作为一个探针并且从这些在在此描述的杂交条件下杂交的其他植物中鉴别核苷酸片段。通过举例，本发明的一个启动子可以被用来筛选一种感兴趣的作物或植物的基因组文库以根据本领域普通技术人员熟知的技术分离相应的启动子序列。因此，本发明的启动子序列可以在中等到高度严格的条件下用作一种探针，用于和一个基因组文库杂交。作为一个替代方案，等效物启动子可以使用FS18和/或SCW-PRP的编码序列分离以筛选一种感兴趣的作物的基因组文库（例如通过杂交或在计算机芯片上）。当在编码序列之间获得足够的一致性时（惯例是高于85%的一致性）然后可以将启动子区域从直系同源的FS18和/或直系同源的SCW-PRP基因上游分离出。

杂交发生在当这两个核酸分子在合适条件下彼此退火（anneal）时。核酸杂交是一项DNA操作领域普通技术人员熟知的技术。一对给定的核酸的杂交特性是它们的相似性或一致性的一种指示。两个核酸序列实质上相同的另一种指示是在严格条件下这两个分子彼此杂交。短语“特异性杂交”是指在严格条件下一个分子仅仅结合、双链化或杂交至一个特定的核苷酸序列，当这个序列存在于一个复杂混合物DNA或RNA中（例如全细胞的）时。“实质性地结合”是指在一个探针核酸与一个靶标核酸之间的互补性杂交并且包含较小量的错配，这种错配可以通过降低杂交介质的严格性来调整以达到所希望的靶标核酸序列的检测。“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”在核酸杂交实验例如南方和北方杂交法的背景下是序列依赖的，并且在不同环境参数下是不同的。高度严格的洗涤条件的一个实例是在72°C下用0.15MNaCl持续大约15分钟。严格的洗涤条件的实例是在65°C下大约15分钟的0.2X SSC洗涤。经常地，在高度严格的洗涤之前先进行低度严格的洗涤以除去背景探针信号。一个用于例如多于100个核苷酸的双链体的中度严格洗涤的实例是在45°C1X SSC持续大约15分钟。一个用于例如多于100个核苷酸的双链体的低度严格洗涤的实例是在40°C4-6X SSC持续大约15分钟。对于短的探针（例如，大约10-50个核苷酸），严格的条件典型地包括低于大约1.5M的盐浓度，更优选约0.01至0.1M，Na离子浓度（或其他盐）为pH7.0-8.3，并且对于长探针（例如>50个核苷酸）温度典型地在至少约30°C和至少约60°C。严格的条件还可以通过添加去稳定剂（例如甲酰胺）来实现。总体而言，在具体的杂交测定中，与观察到的一个不相关的探针相比，信噪比为2X（或更高）表明检测到了一个特定的杂交。在严格条件下不彼此杂交的核酸若它们编码的蛋白是实质上相同的，则它们仍然是实质上相同的。这发生在例如一个核酸的拷贝是使用基因编码所允许的最大密码子简并而产生时。非常严格的条件选择为对于一个具体探针等于T_m。一个用于互补核酸杂交的严格条件的一个实例是50%甲酰胺，这些互补核酸在一个Southern印迹法或Northern印迹法的滤膜上具有多于100个的互补残基，例如，在50%的甲酰胺、1M NaCl、1%SDS中在37°C杂交，并且在0.1x SSC中在60°C至65°C洗涤。低严格条件实例包括在30%-35%的甲酰胺缓冲液、1M NaCl、1%SDS（十二烷基磺酸钠）中在37°C杂交，并且在1X至2X SSC（20XSSC=3.0M NaCI/0.3M柠檬酸三钠）中在50°C-55°C洗涤。中等程度严格条件实例包括在40%至45%的甲酰胺，1.0M NaCI，1%SDS中在37°C杂交，并且在0.5X to1X SSC中在55°C至60°C洗涤。下面是杂交/洗涤条件的组的实例，它们可以被用于克隆与本发明的参考核苷酸序列实质性地相同的直系同源核苷酸序列：一种参考核苷酸序列优选地在7%的十二烷基磺酸钠（SDS）、0.5M NaPO₄，1mM EDTA中在50°C杂交至该参考核苷酸序列，在2X SSC、0.1%SDS中在50°C洗涤，更令人希望的是在7%的十二烷基磺酸钠（SDS）、0.5M NaPO₄，1mM EDTA中在50°C杂交，在1X SSC、0.1%SDS中在50°C洗涤，仍更令人希望的是在7%的十二烷基磺酸钠（SDS）、0.5M NaPO₄，1mM EDTA中在50°C杂交，在0.5X SSC、0.1%SDS中在50°C洗涤，甚至更令人希望的是在7%的十二烷基磺酸钠（SDS）、0.5M NaPO₄，1mM EDTA中在50°C杂交，在0.1X SSC、0.1%SDS中在50°C洗涤

在本发明的另一个实施例中提供了纤维选择性启动子，其包括一种核苷酸序列，该核苷酸序列具有与在此描述的启动子和启动子区域至少40%、至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%的序列一致性并且也称为变体。术语“变体”就本发明的SEQ ID NO:1和2的转录调控核苷酸序列而言意在是指实质性相似的序列。像这些自然发生地等位基因变体，可以通过使用熟知的分子生物学技术鉴别，例如，通过在此之前概述的聚合酶链式反应（PCR）和杂交技术进行。变体核苷酸序列还包括合成地得到的核苷酸序列，例如那些通过使用SEQ ID NO:1或2的定向诱变产生的。总体上，本发明的核苷酸序列变体与天然（野生型或内源的）核苷酸序列将具有至少40%、50%、60%至70%，例如，优选地71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%至79%，总体上至少80%，例如，81%至84%、至少85%、例如，86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、至98%和99%的核苷酸序列一致性。在此披露的DNA分子的衍生物可以包括，但是不限于，序列缺失、单一或多位点突变、一个特定的限制酶切位点的改变、功能元件的添加、或可以增强或以其他方式改变启动子表达的其他方式的分子修饰。用于获得此些衍生物的技术在本领域是熟知的（J.F.Sambrook,D.W.Russell，N.Irwin的（2000），第3版，1、2、3卷，冷泉港实验室出版（参见，例如，J.F.Sambrook,D.W.Russell,和N.Irwin(2000)Molecular Cloning:A Laboratory Manual（《分子克隆：实验室手册》）,3^rd edition Volumes1,2,and3（第3版，卷1、2和3）.Cold Spring Harbor Laboratory Press（冷泉港实验室出版社））。例如，本领域的普通技术人员可以将该功能元件限定为在此披露的启动子的范围内并且删除任何非必需的元件。功能元件可以被修饰或组合以增加本发明的序列针对任何具体应用的实用性或表达。本领域普通技术人员对于描述用于构建、操作和分离高分子（例如DNA大分子、质粒等），连同重组生物体的产生以及DNA分子的筛选和分离的具体条件和程序的标准来源材料很熟悉。如在此使用的，术语“序列一致性百分比”是指经最优比对的DNA的窗口的两个区段之间的一致性核苷酸的百分比。用于比对一个对比窗口的最优序列比对是本领域普通技术人员熟知的并且可以通过例如以下工具来进行：Smith和Waterman的局部同源算法的工具来进行（Waterman,M.S.Introduction toComputational Biology:Maps,sequences and genomes（《计算生物学入门：图谱、序列和基因组》）.Chapman&Hall.；伦敦(1995)），Needleman和Wunsch的同源比对算法（J.MoI.Biol.（《分子生物学杂志》）,48:443-453(1970)），Pearson和Lipman相似性搜索方法（Proc.Natl.Acad.Sci.,（《美国科学院院刊》）85:2444（1988），并且优选地通过这些算法的计算机化实施，例如GAP、BESTFIT、FASTA和作为GCG（注册商标）的部分可得的TFASTA、威斯康星软件套装（注册商标来自Accelrys Inc.公司，San Diego（圣迭戈），Calif.）的部分。一个测试序列和一个参考序列的经比对的区段的“一致性分数”是这两个对齐的序列分享的相同组分的数目除以该参考序列区段中的总组分的数目，即，该整个参考序列或该参考序列的一个更小定义的部分。序列一致性百分比用一致性分数乘以100来表示。一种或多种DNA序列的比较可以是与一种全长DNA序列或其一部分进行比较，或与一个更长的DNA序列进行比较。

本发明的启动子可以被可操作地连接至一个相对于该启动子异源的核酸序列。该核酸序列通常可能是对其而言希望转录水平增加或水平改变（例如在一种不同的器官中）或水平减小的任何核酸序列。例如该核酸序列可以编码一个感兴趣的蛋白。感兴趣的示例性蛋白是例如可以在纤维中提供一种农业或工业上重要的特征的多肽。编码一种感兴趣的蛋白的合适的异源核酸序列包括，而不限于，那些编码几丁质合酶，结瘤蛋白C、蔗糖合酶、棒曲霉素、愈伤葡萄糖合酶、纤维细胞壁修饰蛋白和类似物。

在另一个实施例中本发明提供了一种载体，具体是包括本发明的表达盒的重组载体。“重组载体”是指例如质粒、黏粒、病毒、自主复制序列、噬菌体或线性单链、环状单链、线性双链或环状双链的DNA或RNA核苷酸序列。该重组载体可以衍生自任何来源并且能够进行基因组整合或自主复制。

因此，以上描述的任何启动子和异源核酸序列都可以在一个重组载体中被提供。一个重组载体典型地包括，在5’至3’取向上：一个指导核酸序列转录的启动子和一个核酸序列。该重组启动子可以进一步包括，如所希望的，一个3’转录终止子、一个3’多聚腺苷酸化信号、其他非翻译的核酸序列、转运和靶向核酸序列、可选择标记、增强子和操纵子。表述“5’UTR”是指DNA上游非翻译区域，或一个基因编码区域的5’并且“3’UTR”是指DNA下游非翻译区域，或一个基因编码区域的3’。制备重组载体的方法对于本领域普通技术人员是熟知的。用于制备特别适合于植物转化的重组载体的方法描述于US4971908、US4940835、US4769061和US4757011中。对于在高等植物中表达核酸有用的典型载体对于本领域普通技术人员是熟知的并且包括衍生自根瘤农杆菌的根瘤诱导质粒（Ti）的载体。也可以在该重组质粒中提供一种或多种另外的启动子。这些启动子可以被可操作地连接至，例如但不限于，以上描述的任何核苷酸序列。可替代地，这些启动子可以被可操作地连接至其他核酸序列，例如那些编码转运肽、可选择标记蛋白或反义序列的核酸序列。这些另外的启动子可以基于该载体将被插入其中的细胞类型进行选择。同样，在细菌、酵母和植物中发挥功能的启动子在本领域中也已被很好地传授。这些另外的启动子也可以基于它们的调控特征进行选择。此类特征的实例包括转录活性、可诱导性、组织特异性和发育阶段特异性的增强。

该重组载体还可以包含一种或多种另外的核酸序列。通常这些另外的核酸序列总体上可以是任何适合于在重组载体中使用的序列。这类核酸序列包括而不限于以上描述的任何核酸序列和其经修饰的形式。这些另外的结构性核酸序列还可以被可操作地连接至以上描述的任何启动子。该一个或多个结构性核酸序列可以各自被可操作地连接至分离的启动子。可替代地，这些结构性核酸序列可以被可操作地连接至一个单一启动子（即，单一操纵子）。

本发明还针对转基因植物和转化的宿主细胞，例如，如在此所描述的，包括一种可操作地连接至一个异源核酸序列的启动子的植物细胞。其他核酸序列也可以与该启动子和结构核酸序列一起被引入该植物或宿主细胞中，例如也与本发明的载体相联系。这些其他序列可以包括3’转录终止子、3’多聚腺苷酸化信号、其他非翻译核酸序列、转运或靶向序列、可选择标记、增强子和操纵子。以上描述了本发明优选的核酸序列，包括重组载体、结构性核酸序列、启动子和其他调控元件。

术语“转化”在此是指将核酸引入（或转移）至一个受体宿主例如一种植物或包括植物细胞、原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶片或幼苗、胚和花粉的任何植物部分或组织。包含该转化的核酸序列的植物被称为“转基因植物”。转化的、转基因的和重组体是指一种宿主生物体，例如已向其中引入异源核酸分子（例如一个表达盒或一个重组体载体）的一种植物。该核酸可以被稳定地整合到该植物的基因组中。

在此使用的，短语“转基因植物”是指一种植物，该植物具有向该植物的基因组（例如，核或质粒基因组）中稳定引入的一个引入的核酸。

在本发明的一些实施例中，将一种植物、细胞或生物体的一种或多种组分与具有“相似遗传背景”的一种植物、细胞或生物体进行了比较。在一个优选的方面，“相似遗传背景”是指以下背景，其中所进行比较的生物体共享它们核遗传物质的约50%或更高。在一个更优选的方面，相似遗传背景是指以下背景，其中所进行比较的生物体共享它们核遗传物质的约75%或更高，甚至更优选约90%。在另一个甚至更优选的方面，相似遗传背景是指以下背景，其中所进行比较的生物体是植物，并且这些植物除了使用植物转化技术最初引入的任何遗传物质之外是同基因的。转化的宿主细胞总体上可以是任何与本发明相容的细胞。转化的宿主植物或细胞可以是或衍生自一种单子叶植物或双子叶植物。

相应地，本发明是针对包括如以上描述的本发明的启动子或本发明的嵌合基因的转基因植物细胞和转基因植物，即，在此披露的启动子序列，可操作地连接至一个编码生物学活性RNA的异源核酸序列；或这些转基因植物细胞和转基因植物包括本发明的植物细胞。以上描述了优选的启动子序列和感兴趣的表达产物以及其他调控元件。

转基因植物可以通过将如以上所描述的这个或这些核酸序列引入植物或植物细胞中来产生。与本申请相关联的“引入”涉及在植物细胞或植物中通过人工手段放置遗传信息。这可以通过本领域已知的任何用于将RNA或DNA引入植物细胞、原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶片、幼苗、胚、花粉和小孢子、其他植物组织或整株植物的方法来实现。更具体地说，“引入”是指稳定地整合进该植物的基因组中。

包含转化的核酸序列的植物被称为“转基因植物”。转基因的和重组体是指一种宿主生物体，例如已向其中引入一种异源核酸分子（例如在此描述的启动子、嵌合基因或载体）的植物。该核酸可以被稳定地整合进该植物的基因组中。

有多种方法可供用于通过转化将DNA引入植物细胞或植物中。棉花的农杆菌介导的转化已描述于例如US专利5,004,863、US专利6,483,013和WO2000/71733中。

植物还可以通过粒子轰击来转化：用DNA涂覆金粒或钨粒的然后射入幼小植物的细胞或植物的胚中。这种方法也允许对植物原生质体进行转化。通过粒子轰击进行的棉花转化在例如WO92/15675中有报告。

取决于病毒基因组的性质，可以使用病毒转化（转导）进行基因的瞬间或稳定表达。所希望的遗传物质被包入一种合适的植物病毒中并且允许该经修饰的病毒感染该植物。该被感染的植物的后代是无病毒的并且也是无插入基因的。用于病毒转化的合适方法被描述或进一步详述于例如WO90/12107、WO03/052108或WO2005/098004中。

进一步的转化方案还可以在US专利7,172,881中找到。

该植物细胞可以衍生自任何产生毛状体的植物，例如棉花属（棉花）、烟草属、拟南芥属连同以上描述的产生纤维的植物。在一个实例中，该植物细胞衍生自棉花属。

如在此使用的“棉花”或“棉花植物”可以是任何有用于培养棉花的品种。最常用的棉花品种是海岛棉、陆地棉（G.hirsutum）、亚洲棉（G.arboreum）和草棉（G.herbaceum）。另一些品种包括阿非利加棉（G.africanum）和雷蒙德氏棉（G.raimondii）。还包括来自以上物种中任一种与其他物种杂交或以上物种之间的杂交的后代。

一种棉花植物细胞可以是任何实质上包括定义一种棉花植物所必需的遗传信息的任何细胞，该细胞可以除了在此披露的嵌合基因之外，通过一种或多种另外的转基因进行补充。细胞可以衍生自形成一种棉花植物的不同的器官和/或组织，包括但不限于果实、种子、胚、生殖组织、分生组织区域、愈伤组织、叶片、根、芽、花、维管组织、配子体、孢子体、花粉和小孢子。然而根据本发明的某些植物细胞可以能够再生成完整植物，在一些实施例中，所述细胞不能进一步发展或再生为一个完整植物。

本申请还披露了一种转基因植物，该转基因植物由以上描述的转基因植物细胞组成，或包括在此描述的嵌合基因或载体（稳定地整合到该植物基因组中）。这还可以通过在本申请中其他地方描述的转化方案实现。

在另一个实施例中，本发明涉及一种从在此描述的转基因植物产生的种子，其中所述的种子包括在此描述的嵌合基因。

种子由一个胚植物体形成，该胚植物体与贮藏的营养物质一起被种皮包围。它是裸子植物和被子植物的成熟胚珠的产物，棉花属于后者，这发生在受精后并且在某种程度上在母本植物中生长。

此外，在此披露了从在此披露的植物可获得或获得的棉花纤维和棉花籽油。在此披露的棉花纤维可以通过采用在WO2010/015423中披露的检测方法，并且检查在纤维中存在本发明的该启动子或嵌合基因来与其他纤维区分。因此，该启动子还可以被用于跟踪细胞壁，具体地是根据本发明的棉花纤维。

在此还披露了由在此披露的纤维制成的纱线和织物连同包括在此披露的棉籽油或由在此披露的棉籽油制成的食品和饲料。还披露了一种用于获得棉籽油的方法，该方法包括从在此披露的棉花植物收获棉花籽并且从所述种子提取所述油。此外，还披露了一种用于生产棉花纤维的方法，该方法包括培养在此披露的棉花植物并且从所述棉花植物收获棉花。

在另一个实施例中，本发明披露了一种生产转化植物细胞或植物的方法，该方法包括将本发明的嵌合基因引入一个亲本植物细胞以产生一个转化植物细胞，并且可任选地从所述转化植物细胞再生一种植物。

此外本发明涉及本发明的一种嵌合基因在生产一种转化植物细胞中的用途。

一种生产改变的纤维的方法，该方法包括（i）培养本发明的植物，并且（ii）从该植物收获该纤维。

改变的纤维收获自本发明的一种植物或通过本发明的方法产生。

在另一个方面中，本申请披露了一种生产包括在此披露的嵌合基因的种子的方法，该方法包括（a）培养一种转基因植物，该转基因植物包括在此描述的嵌合基因或在此描述的载体，在此描述的一种转基因植物或通过在此描述的方法收获的一种转基因植物，其中所述转基因植物产生所述种子并且所述嵌合基因包括在所述种子中，并且（b）从所述转基因植物分离所述种子。

在生产转基因植物的方法或生产种子的方法的一个实例中，该植物是在本申请中的其他地方描述的棉花植物。

在另一个方面中，本申请披露了在棉花中产生纤维偏好性或纤维选择性表达的产物的方法，该方法包括将在此披露的嵌合基因或在此披露的载体引入一个棉花植物的基因组中；或提供在此披露的转基因植物。

在另一个方面中，本申请披露了一种改变棉花植物中的纤维特性的方法，该方法包括将在此披露的嵌合基因或在此披露的载体引入一个棉花植物的基因组中；或提供在此披露的转基因植物。

在一个实例中，该方法进一步包括培养所述植物直至种子产生。

在另一个基于以上另外步骤的实例中，该方法是用于增加来自棉花植物的棉花产量并且进一步包括收获由所述棉花植物生产的棉花。换句话说在此披露了一种用于增加来自棉花植物的棉花产量的方法，该方法包括将在此披露的嵌合基因或在此披露的载体引入一个棉花植物的基因组中；或提供在此披露的转基因植物；培养所述植物直至种子产生；并且收获由所述棉花植物生产的棉花。

与本申请相关联的术语“增加该产量”涉及棉花纤维产量方面的增加，该增加可以通过例如增加在棉花种子上产生的纤维数量，增加纤维的长度或增加纤维的强度来实现。基因和其表达产物涉及的赋予的这些特征已被以上描述。

在另一个方面中，本申请披露了在此披露的嵌合基因、在此披露的载体或在此披露的转基因植物或植物细胞用于一种产物在棉花中纤维偏好性或纤维选择性表达、用于改变棉花中的纤维特性或用于增加棉花产量的用途。以上所述的用于在此披露的其他方面的定义和另外的实例同样适用于本方面。

接下来的非限制性实例描述了用于分离该纤维选择性启动子的方法。除非在实例中另行说明，所有的重组DNA技术是根据如描述于Sambrook等人，（1989）分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版，纽约以及在Ausubel等人，（1994）最新分子生物学实验方法汇编，实验室指南（Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols），美国中的标准方案来进行的。对于植物分子工作的标准材料和方法描述在由BIOS科学出版物有限公司（英国）（BIOS Scientific Publications Ltd(UK)）和英国布莱克威尔的科学出版社（Blackwell Scientific Publications,UK）联合出版的由R.D.D.Croy编著的植物分子生物学Labfax（Plant Molecular Biology Labfax）(1993)中

贯穿本说明书和实例，提及了序列表中呈现的以下序列：

SEQ ID NO:1：衍生自棉花FS18基因的启动子序列

SEQ ID NO:2：衍生自棉花SCW-PRP基因的启动子序列

SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:18：人工序列和引物

SEQ ID NO:19：编码粗糙脉孢霉几丁质合酶2基因的核酸序列（Din和Yarden，1994）

SEQ ID NO:20：来自拟南芥的高尔基体靶向信号（Pagny等人，2003）

SEQ ID NO:21：编码玉米的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（epsps）基因的双重突变体的序列（Lebrun等人，1997）

SEQ ID NO:22：编码吸水链霉菌的bar基因（草铵膦乙酰转移酶基因）序列（Thompson et等人，1987）

SEQ ID NO:23：编码来自大肠杆菌的gfa基因（谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶）序列（Frohberg和Essigmann，2006）

实例

实例1

1.用于纤维选择性启动子鉴别的介绍和总策略

在我们的研究中我们的目的是针对其在纤维中驱动嵌合基因选择性表达的能力来分离特定棉花启动子，这些启动子具有的活性优选地从纤维延长阶段开始并持续直至次生胞壁合成。在我们实验的策略中我们使用基因组工具和候选的基因途径二者来分离并且测试多个棉花启动子。已公开的和现存的基因表达数据的生物信息学分析（EST采集、差异显示、微阵列分析和候选基因分析）被用于鉴别潜在的在棉花纤维中主要地或独占地表达的候选基因。在我们最初的分析中产生了第一清单，其中具有大约450个潜在纤维表达基因。通过检查与公共数据库中那些基因同源的EST的发生频率的方法来缩小这个清单（作为转录本丰度的替代品）。随后对一系列组织类型使用定量RT-PCR和/或Northern印迹法来验证演绎自文献或其它数据的表达谱，最初仅仅是使用可获得的RNAs或组织将在两个不同纤维阶段的表达水平与在相同植物的叶片、茎和根中的表达水平相对比。这个与在非纤维组织中表达水平的比较是用于确定启动子在纤维中是纤维选择性地或偏好性地表达。接下来，候选者的启动子区域或通过BAC库筛选（陆地棉栽培品种AcalaMaxxa的可以从克莱姆森基因组研究所（Clemson Genomics Institute）获得的BAC滤池）来进行分离，或如果全长cDNA或试验性共有cDNA序列可获得则通过反向PCR或基因组步行扩增试剂盒（Genome Walker Amplificationkits）来进行分离。得到的启动子序列被连接至报告基因（例如GUS）并且，在第一步骤中，通过棉花胚珠组织的离子轰击来进行评价以证实构建体是功能性的。在第二步骤中，转基因棉花植物通过农杆菌转化产生以将包括启动子-报告基因构建体的嵌合基因引入到棉花中。最后，转化植物中的表达图谱通过定量的和组织化学GUS染色进行分析以证实启动子的纤维特异性和表达。

2.FS18启动子的分离

FS18是纤维表达基因，最初由Orford和Timmis（1997）Theor ApplGenet（《遗传学理论与应用》）94:909-918通过来自陆地棉的纤维cDNA的差示筛选而得以鉴别。最初的cDNA克隆仅仅是长97bp并且形成了估算是大约长700个碱基的转录本的部分。然后这被用于在库筛选中的探针以获得两个更长的616bp和610bp的多聚腺苷酸化cDNA克隆，分别地被称为FS18和FS18A（Orford等，（1999）Theor Appl Genet（《遗传学理论与应用》）98:757-764.由FS18和FS18A相应的基因编码的蛋白质可能是非特异性脂转移蛋白质，其中许多在纤维中表达。

通过在具有默认参数以及最新基因银行棉花属EST数据库（GenbankGossypium species EST database）（Release No:177）（包括所有已知的二倍体和四倍体棉花属EST）的E-100的截止E值的Megablast搜索中使用FS18或FS18A核酸序列，明显的是这些FS18-样基因有可能是相对纤维特异性的并且在延长的和早期SCW增厚阶段的纤维中表达。然而，这个分析没有区分四倍体棉花中该两个假定的同源基因。使用更特异的方法通过仅仅对基因银行中以下这样的陆地棉EST进行搜索：该EST具有大约150bp的基因特异区域，该区域来自其中在这两个基因之间发生最大序列变化的中部cDNA（在这一区域有75%一致性），获得了这两个基因在总的组织水平方面的表达模式的更好的图片。Megablast仅检测到了与FS18A具有高相似性的10个ETS（E值低于E-50）同时它检测到了针对FS18的294个EST，因此后者基因明显是在棉花纤维中更高表达的基因并且是用于启动子分离更适合的靶标。两个基因似乎都是纤维选择性地并且在延长的纤维中（0-10dpa）以及大约20-22dpa的早期SCW阶段的纤维cDNA库中都是同等表现的。

用于基因特异性Megablast搜索的序列：

1)FS18

5’-

GATGGCTTAGTCGGCCTCCCACGCTGCCTTCCTTTTTTGTCAGGGAATGGTGATGGTGCTGATGCCACAGGTTGCTGTGCCATCGTCATGAATGCCTTGGGATCGCTCTGTGGTGATACATAGGAACCGATCTAGCT-3’（SEQ ID NO:3）

2)FS18A

5’-

GATGGCTTAGTCGGCCTCCCACGCTGCCTTCCTTTTTTGTCAGGGAATGGTGATGGTGCTGATGCCACAGGTTGCTGTGCCATCGTCATGAATGCCTTGGGATCGCTCTGTGGTGATACATAGGAACCGATCTAGCT-3’（SEQ ID NO:4）

引物被设计为用于Q-PCR的FS18的3’UTR并且用于扼要描述FS18和FS18A在陆地棉栽培品种Coker315不同植物组织中的相对表达，使用泛素基因作为一个针对表达水平的参考。根据Wan和Wilkins（1994）（AnalBiochem（《分析生物化学》）223:72-12）实施RNA制备，采用高达2g的地上纤维或其它组织。所有的RNA制品用DNA酶进行处理并且通过有机萃取进行纯化。在实时PCR实验中，根据制造商的推荐（Superscript II,BRLLife Technologies（BRL生命科技公司）,Gaithersburg（盖瑟斯堡）,MD,USA）我们使用5μg的总RNA用于产生cDNA，从oligo-dT引发cDNA（0.5μg的dT18）。所使用的这些引物是引物3（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）和FS18_F:5’-ctagcttgaaatcgggttcg-3’（SEQ IDNO:5）和FS18_R:5’-ttggatcccacccttaaaca-3’（SEQ ID NO:6）并且被设计以扩增一个89bp的产物。用于FS18的第二引物与FS18A具有一个单一的错配，但是该引物被认为有可能检测两种转录本。在PCR反应中用作参考的用于棉花RNA解旋酶基因的引物是RNAHel_F:5’-agcctgatcgatatgtggagggat-3’（SEQ ID NO:7）和RNAHel_R:5’-tcaggaaggtttggccatcttgga-3’（SEQ ID NO:8）；它们扩增一个180bp的产物（Hovav等，2007:Planta（《植物学》）227,319–329）。根据以下程序使用应用生物系统7900HT快速实时PCR系统（Applied Biosystems7900HT Fast Real-time PCR system）（CA USA）进行实时PCR实验。将15μL的预混液用移液管移至96孔板中，该预混液由10μl的2X SYBR Green JumpStart Taq Ready Mix（西格玛公司（Sigma）），0.5μL的与给定靶标基因相对应的每一20μM的正向和反向寡聚核苷酸以及4ul的PCR级别用水。这些模板（5μL的该cDNA反应的1/500稀释液）然后被添加至这些预混液中并且转移至热循环仪中。循环条件是95℃变性5分钟，接下来95℃变性15秒40个循环，60℃退火15秒并且72℃延伸20秒。扩增之后，进行一个解离阶段以检测任何复杂产物。使用RQmanager V1.2软件（应用生物系统公司（Applied Biosystems））进行数据分析并且使用ΔΔCt方法使用棉花解旋酶基因作为一个内部标准来确定与0dpa胚珠相比的相对转录本丰度。

根据该q-PCR数据（见图1），FS18在纤维中高表达（从10dpa至35dpa），尽管最高值在大约20dpa的纤维中，其中在一些其它的花组织例如柱头中由少量表达。

在一个下一步骤中，我们分离了FS18启动子。另外根据供应商推荐的流程（http://www.genome.clemson.edu/resources/protocols）将该FS18c DNA的5'末端的一个片段用作探针来筛选一个来自陆地棉栽培品种Acala Maxxa（GH_MBb，克莱姆森基因组研究所）的大插入BAC库，并且选择三个最强杂交的BAC用于测序（BAC3P22、241H24以及213B4）。从FS18的3’UTR中的引物的上游贯穿（FS18Up:5’-tgtatcacacaattggatcccacc-3’）该编码区域进行的测序表明这三个BAC彼此非常相似并且与FS18非常相似。具体地，在该编码区域3P22与FS18是相同的并且241H24和213B4是彼此相同的但是相对于FS18有一个单一非保守碱基取代。

清楚的是所有这些BAC编码FS18基因而不是FS18A类型，因为它们缺乏在FS18A中可见的插入和碱基取代，并且可以推断的是它们可以代表两个非常近似相关的FS18基因家族成员。两个基因都不包含内含子。然后使用引物步行策略从BAC3P22和BAC241H24上的基因的编码区域的上游朝启动子进行测序。两个基因的启动子序列极端地相似（99%一致），因此有可能它们是一个祖先基因的相对近来的复制的结果。仅对由3P22编码的基因进行进一步研究。

1aatggatcgg gcctcgagta agaatttttt ggtccgagcc caacccagat

51ttacaaaaaa attgttgttg ttgtttttct actgttttat tgtcatttca

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901ctaaatcaga atcaggatta gaaacgacgc acacttctgt tgcccgattg

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1351gtttgttttt cttgtgatta atccat

SEQ ID NO:1

使用Gateway克隆系统（英杰公司（Invitrogen））使用gateway引物gwFS18Pro_F ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctaatggatcgggcctcgagta（SEQ ID NO:9）和gwFS18Pro_R ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatggattaatcacaagaaaaaca（SEQ ID NO:10）（基因特异性序列是粗体）从3P22的BAC DNA扩增ATG密码子上游的启动子（SEQ ID NO:1）的一个1376bp片段，这些gateway引物包含attB1和attB2重组位点用于体外重组。从BAC DNA的PCR扩增之后是根据制造商说明书的PEG清除以及使用BP反应利用中间载体pDONR201（英杰公司）的体外重组并且转化进入DH5α细胞，这导致了pDONR/FS18pro（3P22）的产生。使用pDONR-F引物和pDONR-R引物（英杰公司）对该中间载体进行测序并且然后使用推荐的LR反应将其重组进入一个GUS报告基因目的载体pSirogateIV-GUS。该pSirogateIV-GUS载体包含该T-DNA的左缘和右缘，一个在attR gateway重组盒的下游的无启动子GUS基因，一个来自Flavaria bidentis的苹果酸酶的转录终止子/多聚腺苷酸化序列以及一个植物可表达的卡那霉素抗性基因（其具有来自亚基因组RNA片段1的启动子和亚三叶草矮化病毒的片段3的终止子），如在Schunmann等（2003）Funct Plant Biol（《功能植物生物》）30:443-452中描述。

用GUS报告基因中的引物（GUSRev:5’-tccagactgaatgcccacagg-3’，SEQID NO:18）对所产生的质粒pSirogateIV-FS18-GUS进行测序以证实该启动子的正确重组并且然后通过电穿孔将其转移至农杆菌菌株AGLI（Lazo等人（1991）Biotechnol.（《生物技术》）9:963-967）。

在一个第一步骤中在瞬时表达测定中测试该启动子的功能性被，方法是将pSirogateIV-FS18（3P22）-GUS DNA粒子轰击进入培养的棉花胚珠并且根据Jefferson等人（1987）EMBO J.6:3901-3907针对GUS酶活性进行染色。

在这一实验中使用一个包括35S启动子-GUS盒的表达载体作为对照。通过对所分析的GUS斑点数目/胚珠数目进行计数来监测该启动子的活性（见表1）。

启动子	7dpa	16dpa	29dpa
				35S	10/40	1/10	未测试
FS18	未测试	2/30	5/28

表1：分析的GUS斑点数目/胚珠数目。FS18启动子能够在16dpa和29dpa之间驱动GUS的表达。

在下一步骤中，基本上如Murray等在Mol.Breed.（《分子育种》）5:219-232中描述地使用携带有pSirogateIV-FS18-GUS的农杆菌菌株、使用棉花栽培品种Coker315-11（一个从可再生的Coker315栽培品种的CSIRO选择）的幼苗子叶片段进行棉花转化并且针对卡那霉素硫酸盐抗性进行选择。

共产生了19个初代转化体，代表14个独立转化事件。将植物转移至土壤并且允许开花。在开花期时花被标记并且收集10dpa和20dpa的棉铃并且如通过Jefferson等人（1987）EMBO J.6:3901-3907描述的使用X-gluc组织化学染色针对GUS酶对具有纤维的整个发育中的种子进行染色。来自幼枝和较老枝的未成熟的叶片，叶柄片段，根以及茎部分也被用于GUS染色。观察到的染色模式总结在表2中并且代表性的图片显示在图2中。

表2：其中在用SirogateIV-FS18启动子-GUS构建体转化的不同T0转基因棉花植物中检测到GUS酶活性的组织。+，弱或局部表达，++中度表达，+++非常强表达，-没有染色。

在图2中可以看到的是FS18启动子是高度纤维选择性的，尽管在叶柄和茎上的小腺毛状体中有少量的表达。

3.SCW-PRP启动子的分离

Ji等人（2003）Nucleic Acids Res.（《核酸研究》）31:2534-43鉴别了一个短的230bp cDNA克隆P2G01（CB350474），方法是通过差式PCR法（使用获取自10dpa的纤维的cDNA以及使用来自一个无纤维突变体的cDNA作为驱动子），接下来是在一个尼龙膜阵列上针对不同年龄的纤维的cDNA的差示筛选。该克隆是大约30差异表达的纤维基因中的一个。该基因的表达似乎在大约开花期后5天（dpa）打开并且持续表达至测试时的20dpa阶段。由P2G01编码蛋白质在Ji等人（2003）中被指定为一个液泡（H+）-ATP酶催化亚基，但是我们的分析建议它更可能是一个富含脯氨酸的蛋白质。P2G01（CB350474）在0dpa时不表达但是在5dpa、10dpa和20dpa的纤维中的表达增加至中等水平。CB350474的匹配是鉴别自基因银行陆地棉棉花纤维EST的Megablast搜索并且获得了一个衍生自许多重叠EST的659bp共有转录本（SEQ ID NO:11）序列。

5’-

cgcggggaactcaaatcttcaatctttagatcatctctccaaaaaaatatggcaggttccaacgttttcattttaatagcttgcttcattttgttgggtttttcaagtatggaggttagcctagcaactcgaaatattcagcacgtgtcactaattgaagtgtcaccaataacattgtcgttattcccaccattgccaccaataagatctccgttcttgccaccaataccaccaataacattgtcaccaatgacattggcaccaataacattgacaccaacaggtacaccaatcgaggaaccaatagatccaccaaccgagaaaccaacagatccaccaactgaggtaccaacactgccttgaatcccaaagctaccaacaatcccaccatcttagcctaagcctatcactgttcttccacaagttcccagcaatagcttgccttccattcctttcatgtctccatctccacctccacctccacctccatccagctattgaagacaatttgattcctaattagtatcacatatattactgagaatgaactctgtcatcacattctctatgatgttatttcatgaaataagaatgtagtttctatttacattttacatatataataaagtgtggtgttttttttaaaaaaaaaaaaaaaa-3’（SEQ ID NO:11）

该共有转录本编码一个小的104个氨基酸的蛋白质，该蛋白质在NH₂末端具有一个预测的信号肽（使用SignalP预测，Emanuelsson等人，2007Nature Protocols（《自然实验方案》）2,953-917）。该信号肽的存在预测了该成熟蛋白质分泌出细胞进入细胞壁。它不包含在序列中保守的蛋白质结构域，但是该预测的78AA的成熟蛋白质包含28.4%的脯氨酸。因此我们称它为富含脯氨酸的蛋白质（PRP），尽管使用BlastP的蛋白质序列搜索或者使用BLASTx的核苷酸序列搜索并没有显示与其它蛋白质的可信匹配，除了在另一个假定的棉花PRP（ABM05951），PRP3中的一个小区域。

使用MegaBlast将该共有转录本序列用于查询棉花EST库。对E值<-100的命中进行计数并且然后根据它们衍生的cDNA库的组织来源进行分组。与CB350474紧密匹配的转录本与针对FS18的那些相比丰度稍低，但是它们仅仅在纤维cDNA库中被发现，在20-22dpa的早期SCW阶段的纤维中比在在0-10dpa的延长的纤维中多大约一倍。因此该基因被指定为SCW PRP。

跨该共有转录本的3’末端的引物被设计用于q-PCR以测量相对于SCWPRP的cDNA的基因的表达水平。它们是SCWPRP_F5’-caggtacaccaatcgaggaa-3’（SEQ ID NO:12）和SCWPRP_R5’-atggtgggattgttggtagc-3’（SEQ ID NO:13），在扩增中产生一个110bp的产物。至于FS18基因的表达水平的检测，在该定量PCR测定中将棉花RNA解旋酶用作一个参考基因并且确定相对于0dpa的开花期后的在不同时间点的表达水平。在图3中可以观察到该SCW PRP基因的表达是纤维选择性的。

从20dpa的棉花纤维的cDNA中扩增一个跨该SCW PRP基因的编码区域的330bp片段并且将其用作探针来如以上描述地筛选Acala Maxxa大插入BAC滤池（克莱姆森基因组研究所）。13个不同的BAC被分离并且使用一个来自翻译起始附近的引物（SCWPRP-下：5’-gcaggttccaacgttttcat-3’-（SEQID NO:14）进行测序。这两类鉴别的基因非常相似并且用BAC克隆BAC4A23和BAC10G1来表示。在这些BAC上的SCW PRP基因被更加完全地测序。基因都不包含内含子。在BAC4A23中的基因与该共有cDNA序列精确匹配同时在BAC10G1中的基因与该共有SCW PRP转录本相比具有三个核苷酸差异，因此它们代表非常相似的基因。存在于BAC4A23中的核苷酸序列（SEQ ID NO:15）被详细分析。

aactagtgaaacagatacaaacttgtgttagattctacagaagtaaaaataaattatttggggtgttacattgttaatattttaaacataatcataagtttaaggacctatctaaaattagaccaataaaatttaaaatataaatatgatattgtttcttggatttatagaataatggattgttatatacatagtatgagatgatctattgattctatattcttaccgttgaatttatgaattttttttcttatttcttttgagtttgattaatgatgtactgtatttatatgtttatcgaagaatattttatatttaaaatttatttaatctcattagttgatacttgtcttttttgttcttcacggaaagttgttatatataagttcagtaaataataatgaaatataaattttaattatatctagtactcaataagaagatggagaaagttatgttaattatagttataaattatttataaatttaatatatatatataaagaaaatagttgtataactaataattatttttacaatactttatatagttatatttaaaaaaattttaaaattaaaatactattattttgttcaatatattaatatttatattatttaatttattattgaatatgaataaattttttttgaaaattatatttttaatttttagaaattttatataactttccatatatatatttctgatttgtcaatttcttttgagatttatctaaattgatttgaattttttttatttttaaaaaataaaataattttaaaatttcttggaattttatataaatttttggatttttcaaaaaaaattgagatttttttcttttttttcgattttttaaatttatttcaggaaaatataaactaacttttctttgctttgggtataattaatattagataacccacaaattagatcaataggagcttcatgtcctaatcccatttaattacttttgttgtatcattaatttagtcgaccttacatagtagctctatggggcaaatagttataaatgttaaattagtatttaaatcttgaagtttttaatttaaagttcagactattagtattatatcaaatatttaagggtaaatatatattctaatatctaagcttgggtcaaggtttaaattaagtacttaaacttggttttatagttcaaattgatttaaataactaagtattaatttgaattaagaagcaaagttcaagtacctaattagactataaaaaaaacttttgctagtaaattgaaccttaaagtcgagtttagttatctaattggacaaaaaaatcttaaataccaatttaaaccctaaagtcaagtttaggtaccaaagtgtatatttatctaatatttaaatttgatccacctaatttaaatttttttggtccaatgcaataagagaattaattaatacttacacacatgatagagatatacccacaacagatacacactacaaaaaacattaaaaaatagaaagatatatttcctacaaaatttaaaagcatttaattttttaactaacattagacaaatggaaatggaaagacttatttttaagtttatggatgaatctaatttatctaaacattgggttttttttttttgtgacgaaatatgggtgagagaaggtagtaagctaagtaggggagtaatatctcaaacaaataattaaaaaactcctttaaatgtggctataaatacctgaaaccaatccttctttcctcaactcaaatcttcaatctttagatcatctctccaaaaaaatatggcaggttccaacgttttcattttaatagcttgcttcattttgttgggtttttcaagtatggaggttagcctagcaactcgaaatattcagcacgtgtcactaattgaagtgtcaccaataacattgtcgttattcccaccattgccaccaataagatctccgttcttgccaccaataccaccaataacattgtcaccaatgacattggcaccaataacattgacaccaacaggtacaccaatcgaggaaccaatagatccaccaaccgagaaaccaacagatccaccaactgaggtaccaacactgccttgaatcccaaagctaccaacaatcccaccatcttagcctaagcctatcactgttcttccacaagttcccagcaatagcttgccttccattcctttcatgtctccatctccacctccacctccacctccatccagctattgaagacaatttgattcctaattagtatcacatatattactgagaatgaactctgtcatcacattctctatgatgttatttcatgaaataagaatgtagtttctatttacattttacatatataataaagtgtggtgttttttttaagttattaaattattaaaattatatatccaaaaatataaacatgattaaatgttatacaatcatttataaaggtattataattgatgctatcaactccaacatagttatacttcaggaaaaaaaaacataacataatcacttgccaatgaatgatgtgattattttaggtataattgcaaaaaaatcctcaacgtttggggacttttggttttgtgcctttgaccttttttttattgacaccctcaacattataattttttttcagaaattagcctaattttaacaataaatgtgagttaaccgttaatcaagcgccgatcaacgaaataagtctatgtggcataccacataagcacgatgacatcatctaaaaaattgtttaacaatttttttttttcattttgtttccttctttcttcttctctctttctctcttcctgctattacag

SEQ ID NO:15

使用引物gwSCWPRP_F5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatagtatgagatgatctattgattctatattctta-3’（SEQ IDNO:16）和gwSCWPRP_R5’-gggaccactttgtacaagaaagctgggtatttttttggagagatgatctaaagattgaagatt-3’（SEQ IDNO:17）从BAC4A23扩增一个1378bp的启动子片段（SEQ ID NO:2）。该扩增产物通过BP体外重组反应（英杰公司）被克隆进入pDONR201并且通过测序被证实。这通过LR反应（英杰公司）被重组进入SirogateIV-GUS表达载体中，通过测序进行证实并且引入根瘤农杆菌的AGL1菌株中以通过土壤农杆菌介导的转化引入棉花细胞。

atagtatgagatgatctattgattctatattcttaccgttgaatttatgaattttttttcttatttcttttgagtttgattaatgatgtactgtatttatatgtttatcgaagaatattttatatttaaaatttatttaatctcattagttgatacttgtcttttttgttcttcacggaaagttgttatatataagttcagtaaataataatgaaatataaattttaattatatctagtactcaataagaagatggagaaagttatgttaattatagttataaattatttataaatttaatatatatatataaagaaaatagttgtataactaataattatttttacaatactttatatagttatatttaaaaaaattttaaaattaaaatactattattttgttcaatatattaatatttatattatttaatttattattgaatatgaataaattttttttgaaaattatatttttaatttttagaaattttatataactttccatatatatatttctgatttgtcaatttcttttgagatttatctaaattgatttgaattttttttatttttaaaaaataaaataattttaaaatttcttggaattttatataaatttttggatttttcaaaaaaaattgagatttttttcttttttttcgattttttaaatttatttcaggaaaatataaactaacttttctttgctttgggtataattaatattagataacccacaaattagatcaataggagcttcatgtcctaatcccatttaattacttttgttgtatcattaatttagtcgaccttacatagtagctctatggggcaaatagttataaatgttaaattagtatttaaatcttgaagtttttaatttaaagttcagactattagtattatatcaaatatttaagggtaaatatatattctaatatctaagcttgggtcaaggtttaaattaagtacttaaacttggttttatagttcaaattgatttaaataactaagtattaatttgaattaagaagcaaagttcaagtacctaattagactataaaaaaaacttttgctagtaaattgaaccttaaagtcgagtttagttatctaattggacaaaaaaatcttaaataccaatttaaaccctaaagtcaagtttaggtaccaaagtgtatatttatctaatatttaaatttgatccacctaatttaaatttttttggtccaatgcaataagagaattaattaatacttacacacatgatagagatatacccacaacagatacacactacaaaaaacattaaaaaatagaaagatatatttcctacaaaatttaaaagcatttaattttttaactaacattagacaaatggaaatggaaagacttatttttaagtttatggatgaatctaatttatctaaacattgggttttttttttttgtgacgaaatatgggtgagagaaggtagtaagctaagtaggggagtaatatctcaaacaaataattaaaaaactcctttaaatgtggctataaatacctgaaaccaatccttctttcctcaactcaaatcttcaatctttagatcatctctccaaaaaaat

SEQ ID NO:2

在一个第一步骤中，该构建体中的启动子的功能性在一个瞬时表达测定中进行测试，方法是将pSirogateIV-4A23启动子-GUS DNA粒子轰击进入培养的棉花胚珠并且根据Jefferson等人（1987）EMBO J.6:3901-3907针对GUS酶活性进行染色

在这一实验中使用一个包括35S启动子-GUS盒的表达载体作为对照。通过对所分析的GUS斑点数目/胚珠数目进行计数来监测该启动子的活性（见表3）。

启动子	7dpa	16dpa	29dpa
				35S	10/40	1/10	未测试
SCWPRP	未测试	5/30	4/28

表3：分析的GUS斑点数目/胚珠数目。

观察到该SCWPRP启动子在16dpa和29dpa之间驱动GUS的表达。

在下一个步骤中基本上如Murray等人（1999）Mol.Breed（《分子育种》）.5:219-232中所描述地使用携带pSirogateIV-4A23启动子-GUS的农杆菌菌株进行棉花转化，在转化中使用棉花栽培品种Coker315-11的幼苗子叶片段作为一棉花组织来源Coker315-11是一个来自可再生的Coker315栽培品种的CSIRO选择。在该转化实验中，针对卡那霉素硫酸盐抗性进行选择。

产生了17个初代转化体，代表12个独立转化事件。这些转化植物被转移至土壤并且允许开花。在开花期花被标记。收集10dpa和20dpa的棉铃并且如通过Jefferson等人，1987描述的使用X-gluc组织化学染色针对GUS酶对具有纤维的整个种子进行染色。来自幼枝和较老枝的未成熟的叶片，叶柄片段，根以及茎部分也被用于GUS染色。染色模式总结在表4中并且代表性的图片显示在图4中。

表4：其中在用SirogateIV-SCWPRP启动子-GUS构建体转化的不同T₀转基因棉花植物中检测到GUS酶活性的组织。+，弱或局部表达，++中度表达，+++非常强表达，-没有染色。

与Q-PCR数据一致，观察到该SCWPRP启动子在纤维中选择性地表达，特别是在较晚的阶段。在地上组织的大部分绿色表皮表面上存在的一些种类的腺毛状体中它也可以表达。

材料和方法

1.棉花胚珠培养和粒子轰击

收获来自每一个纤维起始阶段的棉铃，以95%的乙醇进行表面消毒，简短过火焰，在无菌条件下被解剖。将胚珠在5μM吲哚-3-乙酸和0.5μM的赤霉素存在下转移至液体培养基。在粒子轰击之前，这些胚珠被放置在提前用培养基100（MS盐、B5维生素、MES0.5g/L、MgCl₂.6H₂00.94g/L、脱乙酰吉兰糖胶2g/L、葡萄糖30g/L、pH5.8）浸湿的2张Whatmann滤纸上，该培养基补充有0.2M的甘露醇。如在Biorad公司（Richmond（里士满），CA）的用于生物射弹粒子运输系统（1000/he）的说明书手册中描述，通过氯化钙亚精胺法将DNA沉淀在1um金粒上。在根据制造商推荐的用于植物组织的28英寸汞真空中并且利用不同的氦压力（900psi与1350psi），以6cm、9cm和12cm的靶标距离轰击培养的胚珠。将经轰击的胚珠立即转移至新鲜的液体培养基或在转移至液体培养基之前在固体培养基上培育两天。将一个单层的微孔外科胶带（3M医疗保健公司（3M Healthcare），St.Paul（圣保罗）,MN）用以密封每一培养皿以防止这些组织脱水。培养物在32°C在5%的CO₂气氛中进行培育。在每一重复每一个构建体被轰击进入多于120个胚珠中并且这些实验至少重复6次。

2.β-葡萄糖苷酸酶表达模式的分析。

使用底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷（X-Gluc）进行GUS酶活性的组织化学定位，如Jefferson RA等人（1987）EMBO J6:3901-3907所述。在染色中为防止GUS产物扩散，将0.5mM的铁氰化钾/亚铁氰化钾添加至组织化学染色缓冲液。使用具有奥林巴斯DP11数码相机的奥林巴斯SZX立体显微镜对与纤维关联的经组织化学染色的胚珠进行照相。使用Adobe Photoshop5.5软件构建图像组合物。

实例2：FS18启动子在棉花植物中的表达

如在实例1中描述产生初代棉花转化体，这些转化体具有一种构建体，该构建体包括一种用于在FS18启动子控制下表达GUS的嵌合基因（pSirogateIV-FS18(3P22)GUS）来自四个独立的初代转化体（它们在10dpa或20dpa的纤维中具有高表达）的T1种子被收集并且种植在温室中。这些株系是T420-24、T420-31、T420-37和T420-48。子叶的部分如先前所述地用X-Gluc染色。在许多这些植物中的跨子叶分布的小腺毛状体中以及显示了创伤反应的围绕切割边缘的区域中观察到了GUS活性。当整个子叶被染色时GUS活性仅在以下区域被观察到：腺毛状体中，边缘附近的一些片状区域中，或内部地在以下这样的子叶上：它们推测地处于在染色之前的处理过程中或当对植物浇水时已经被损害的区域中。并不是所有子叶都具有这种片状扩散染色。

将来自每一株系的两个T1植物培养至成熟并且花被标记以收集不同年龄（0dpa、10dpa、20dpa和30dpa）的棉铃并且收获不同的其它组织，这些组织包括叶片、叶柄、茎、根、棉铃壳（在10dpa和20dpa）、小花蕾以及在0dpa的不同的花部分（包括花苞叶、花瓣、雄蕊和柱头）。将这些用于GUS活性染色并且将相似材料冷冻用于RNA提取和定量RT-PCR以在不同组织中观察相对表达水平。GUS染色是在X-Gluc溶液中在37℃过夜，如在实例1中所述。组织在一系列乙醇中被清洗直到没有更多叶绿素被提取并且进行拍照。所有的株系具有相似的染色模式。举例说明，品系T420-24的结果在下表5中列出。

表5：T420-24的GUS-染色模式。

在不同组织中的定量GUS表达

收集样品并且如在Wan和Wilkins（1994）（Anal Biochem（《分析生物化学》）223:72-12）中所述制备RNA并且用DNA酶处理。使用SuperscriptII反转录酶和随机引物将总RNA转换为cDNA并且如先前所述进行定量RT-PCR。使用的引物是对引入的GUS转基因具有特异性的Q-GUS（CAGGGAGGCAAACAATGAATCAACAACTCTC）和Q-ME（TGCAAACAGCAACAGATCAACTGTCCTTTTTCC）并且如先前所述将内源性棉花泛素基因用于归一化。相对于设置为1.0的具有30dpa的纤维的每一植物中的GUS的表达对所有样品进行调整并且然后在四个不同独立株系中的每一个中的两个不同植物之间取平均值。

Q-PCR表明FS18启动子在整个纤维发育中是活跃的，但是在发育后期是更强烈表达。与该GUS染色数据一致，该启动子似乎在该棉铃壳和叶片中是活跃的（可能是对昆虫损害的响应，因为它变化很大，其中大多数样品在叶片中有很少或没有GUS表达）。在其它组织中的表达是低的，因为通过染色检测到GUS的小腺毛状体代表了提取的总细胞的很小比例。在雄蕊中没有检测到高GUS转录本。不同组织中的表达的综述在图5中给出，这一实验的定量数量数据可以取自图5E。

结论

总的来说，这些数据支持以下结论：FS18启动子是纤维偏好性的并且在整个纤维发育中表达，但是在次生细胞壁积累的较晚阶段更活跃。它在该植物的别处表达，但是经常地在相对专门的细胞或组织中表达，这些组织包括在茎、叶片、苞片、叶柄和花瓣上遍及植物表皮分布的小腺毛状体。在母系棉铃壳中有一些表达。该启动子也具有一些创伤反应性，但是这似乎是一个较小的活性。

实例3：SCW-PRP启动子在棉花中的表达

根据实例1的方法产生四个独立的初代转化体的T1种子，这些种子具有一种构建体，该构建体包括一种用于在SCW_PRP启动子的控制下表达GUS的嵌合基因（SirogateIV-SCWPRP启动子-GUS构建体）并且从根据实例1中所述的方法产生并且包括一种用于在SCW_PRP启动子的控制下表达GUS的嵌合基因的初代转化体收集在10dpa或20dpa的纤维中具有高表达的转化体并且在温室中种植。这些株系是T427-5、T427-6、T427-26-1（在实例1中介绍）和T427-31。子叶的部分如先前所述地用X-Gluc染色。在许多这些植物中的跨子叶分布的小腺毛状体中以及显示了创伤反应的围绕切割边缘的区域中观察到了GUS活性。当整个子叶被染色时GUS活性仅在以下区域被观察到：跨子叶及其叶柄的众多腺毛状体中，边缘附近的一些片状区域中，或内部地在以下这样的子叶上：它们推测地处于在染色之前的处理过程中或当对植物浇水时已经被损害的区域中。并不是所有子叶都具有这种片状扩散染色。

将来自每一株系的两个植物培养至成熟并且花被标记以收集不同年龄（0dpa、10dpa、20dpa和30dpa）的棉铃并且收获不同的其它组织，这些组织包括叶片、叶柄、茎、根、棉铃壳（在10dpa和20dpa）、小花蕾以及在0dpa的不同的花部分（包括花苞叶、花瓣、雄蕊和柱头）。将这些用于GUS活性染色并且将相似材料冷冻用于RNA提取和定量RT-PCR以在不同组织中观察相对表达水平。GUS染色是在X-Gluc溶液中在37℃过夜，如前面所述。组织在一系列乙醇中被清洗直到没有更多叶绿素被提取并且进行拍照。所有的株系具有相似的染色模式。T427-5的结果在下表6中描述。

表6：品系T427-5的GUS-染色模式

Q-PCR表明该SCW-PRP启动子在整个纤维发育中是活跃的，但是在发育后期是更强烈表达。在其它组织中的表达是低的，因为通过染色检测到GUS的小腺毛状体代表了提取的总细胞的很小比例。与FS18启动子相比SCW-PRP启动子似乎活跃于更多的腺毛状体中，在雄蕊中没有检测到高水平的GUS转录本。不同组织中的表达的综述在图6中给出，这一实验的定量数据可以取自图6E。

结论

总的来说，这些数据支持从较早研究中得出的以下结论：SCW-PRP启动子是纤维偏好性的并且在整个纤维发育中表达，但是在次生细胞壁积累的较晚阶段更活跃。它有时在该植物的别处表达，但是经常地在相对专门的细胞或组织中表达，这些组织包括在子叶、茎、叶片、苞片、叶柄和花瓣上遍及植物表皮分布的小腺毛状体。在母系棉铃壳的内壁中有一些表达。该启动子也具有一些创伤反应性，但是这似乎是一个较小的活性。

实例4：在FS18和SCW-PRP启动子控制下的几丁质合酶在棉花中的表达

可以在棉花植物中表达几丁质合酶以通过将几丁质聚合物引入纤维细胞壁来增加棉花纤维中的正电荷。对于此，纤维偏好性的或纤维特异性的表达是重要的，因为如果控制一个几丁质合酶基因表达的启动子在除纤维细胞之外的许多其他组织或细胞类型中驱动表达，那么用该几丁质合酶基因转化的植物大部分并不显示一个可感知的表型。

产生了根据本发明的包括嵌合基因的四个载体：

pTIB344：包括一个编码粗糙脉孢霉几丁质合酶2基因的核酸序列（Din和Yarden,1994,SEQ ID NO:19），该核酸序列包括一个在FS18启动子控制下的来自拟南芥的高尔基体靶向信号（Pagny等人，2003,SEQ ID NO:20）和作为可选择标记基因的epsps基因（玉米的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因的双突变体，Lebrun等人，1997;SEQ ID NO:21）。

pTIB345：包括一个编码粗糙脉孢霉几丁质合酶2基因的核酸序列，该核酸序列包括一个在SCW-PRP启动子控制下的高尔基体靶向信号和作为可选择标记基因的epsps。

这些载体被用于使用一个本领域熟知的下胚轴转化法来转化棉花变种Coker312-17。对于pTIB34417而言61个植物中有17个并且对于pTIB34516而言67个植物中由16个显示出良好的植物发育。

6个（pTIB344）和1个（pTIB345）植物到目前为止已经结棉铃表明在棉铃壳中几丁质合酶的潜在表达没有阻止这些植物结棉铃。

pTIB328：包括一个编码粗糙脉孢霉几丁质合酶的核酸序列，该核酸序列包括一个在FS18启动子控制下的高尔基体靶向信号和作为可选择标记基因的bar基因（吸水链霉菌的草铵膦乙酰转移酶基因（Thompson等人，1987;SEQ ID NO:22）。

pTIB329：包括一个编码粗糙脉孢霉几丁质合酶的核酸序列，该核酸序列包括一个在该SCW-PRP启动子控制下的高尔基体靶向信号和作为可选择标记基因的bar。

这些载体被用于在本领域熟知的愈伤组织转化方法中转化棉花变种Coker312-17。对于pTIB328而言1个和对于pTIB329而言5个T0植物目前为止产生了种子，表明在棉铃壳中几丁质合酶的潜在表达没有阻止这些植物结棉铃以及产生种子。

所有的这些载体（除了以上列举的）在相同启动子控制下表达来自大肠杆菌的gfa（谷氨酰胺：果糖-6-磷酸氨基转移酶）（Frohberg和Essigmann,2006；SEQ ID NO:23）比该几丁质合酶基因更进一步增加对细胞的几丁质供应。