ES2613055T3

ES2613055T3 - Diagnóstico de interferón de tipo 1

Info

Publication number: ES2613055T3
Application number: ES10814513.7T
Authority: ES
Inventors: Brandon Higgs; Wei Zhu; Chris Morehouse; Barbara White; Bahija Jallal; Yihong Yao
Original assignee: MedImmune LLC
Current assignee: MedImmune LLC
Priority date: 2009-09-03
Filing date: 2010-09-02
Publication date: 2017-05-22
Anticipated expiration: 2030-09-02
Also published as: EP2473636B1; AU2010289383B2; WO2011028933A1; SMT201700063B; US20160024205A1; JP5727484B2; US20150191788A1; US20120251546A1; HUE032917T2; JP2015147788A; HRP20170091T1; EP2473636A4; AU2010289383A1; BR112012004781A2; DK2473636T3; PT2473636T; MX2012002640A; ME02599B; LT2473636T; PL2473636T3

Abstract

Un método para identificar un sujeto adecuado para el tratamiento de lupus con un anticuerpo anti-interferón alfa o un anticuerpo anti-receptor de interferón alfa que modula la actividad del interferón de tipo 1, que comprende detectar el ARNm aumentado de un grupo de genes que consisten en IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2 en una muestra del sujeto, en el que una media de cambio en veces en el ARNm del grupo de genes de al menos cuatro veces indica un sujeto adecuado para el tratamiento de lupus con el anticuerpo, en el que el aumento es relativo a a) el de una muestra de un tejido o persona que no tiene la enfermedad, o b) la expresión de uno o más genes de control.

Description

Diagnóstico de interferón de tipo 1

Listado de secuencias

La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que se ha presentado en formato ASCII a través de EFS-Web. La copia en ASCII, creada el 1 de septiembre de 2010, se denomina MED217T4.txt y tiene un tamaño de

28.665 bytes.

Campo de la divulgación

La presente divulgación se refiere a marcadores farmacodinámicos (PD) inducibles por interferones de tipo 1, tales como el interferón (IFN) alfa, a sondas y kits que detectan los marcadores PD, y a métodos que los emplean. La presente divulgación se refiere además a marcadores PD inducidos por enfermedades autoinmunitarias. La presente divulgación se refiere además a genes cuya expresión puede usarse como diagnóstico para pacientes que padecen enfermedades autoinmunitarias, tales como LES, DM, PM, SSc, AR, Sjogren y nefritis lúpica. La divulgación se refiere además a genes cuya expresión puede usarse para identificar a pacientes que padecen una enfermedad autoinmunitaria que responderán a un agente terapéutico que modula la actividad del interferón de tipo 1, tal como un anticuerpo anti-interferón alfa.

Antecedentes de la divulgación

La presente divulgación incluye marcadores PD que se inducen por IFNα. Los marcadores PD se pueden usarse en métodos para tratar a pacientes con un agente terapéutico que modula la actividad del interferón de tipo 1, tal como un agente que se une a y modula la actividad del IFNα, métodos que identifican a pacientes como candidatos para un agente terapéutico que modula la actividad del interferón de tipo 1, métodos de diagnóstico de un trastorno asociado con un aumento de los niveles de interferón de tipo 1 o IFNα en un paciente, métodos para supervisar la progresión de la enfermedad de un paciente que recibe tratamiento con un agente terapéutico que modula la actividad del interferón de tipo 1, tal como un agente terapéutico que se une a y modula la actividad del IFNα, y métodos para identificar un agente terapéutico candidato para tratar trastornos mediados por IFNα. La presente divulgación también incluye marcadores PD implicados de otra manera en enfermedades autoinmunitarias tales como LES, DM, PM, SSc, AR, Sjogren y nefritis lúpica.

El documento WO2008070137 desvela el uso de una combinación de 25 genes, que incluye IF127, IF144, IF144L y RSAD2, para identificar un sujeto adecuado para el tratamiento de lupus con un anticuerpo anti-interferón alfa o un anticuerpo anti-receptor del interferón alfa que modula la actividad del interferón de tipo 1.

Sumario de la divulgación

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Una realización de la divulgación incluye un método para identificar un paciente como un candidato para un agente terapéutico que modula la actividad del interferón de tipo 1, tal como un agente terapéutico que se une a y modula la actividad de IFNα y un agente que se une a un receptor de un interferón de tipo I o IFNα. La presencia o ausencia de un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα se detecta en una muestra del paciente. El perfil de expresión de marcadores PD comprende la regulación positiva de la expresión o actividad de un conjunto de genes. En una realización específica, el conjunto de genes puede ser: (a) IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (b) IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (c) IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (d) IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2; o (e) IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; o (f) IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Otra realización de la divulgación incluye un método para tratar a un paciente que tiene una enfermedad o trastorno mediado por IFN de tipo I o IFNα. Al paciente se le administra un agente que modula la actividad de IFN de tipo I o IFNα. En una realización, el agente se une a y neutraliza la actividad del IFN o IFNα. En otra realización, el agente se une a un receptor de un interferón de tipo 1 o IFNα. El agente neutraliza un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα del paciente. El perfil de expresión de marcadores PD comprende la regulación positiva de la expresión o actividad de un conjunto de genes. En una realización específica, el conjunto de genes puede ser: (a) IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (b) IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (c) IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (d) IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2; o (e) IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; o (f) IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Otra realización más de la divulgación incluye un método para tratar a un paciente con una enfermedad autoinmunitaria que comprende un perfil de marcadores PD de IFN de tipo I o IFNα moderado o fuerte. Al paciente se le administra un agente que modula la actividad de IFN de tipo I o IFNα. En una realización, el agente se une a y neutraliza la actividad de IFN o IFNα. En otra realización, el agente se une a un receptor de un interferón de tipo 1 o IFNα. El agente neutraliza un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα del paciente. El perfil de expresión de marcadores PD comprende la regulación positiva de la expresión o actividad de un conjunto de genes. En una realización específica, el conjunto de genes puede ser: (a) IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o

(b) IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (c) IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (d) IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2; o (e) IFI27, IFI44,

IFI44L y RSAD2; o (f) IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Una realización adicional de la divulgación incluye un método para neutralizar un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα en un paciente que lo necesita. Al paciente se le administra un agente que modula la actividad de IFN de tipo I o IFNα. En una realización, el agente se une a y neutraliza la actividad de IFN o IFNα. En otra realización, el agente se une a un receptor de un interferón de tipo 1 o IFNα. El agente neutraliza un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN o IFNα de tipo I del paciente. El perfil de expresión de marcadores PD comprende la regulación positiva de la expresión o actividad de un conjunto de genes. En una realización específica, el conjunto de genes puede ser: (a) IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (b) IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (c) IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (d) IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2; o (e) IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; o (f) IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Otra realización de la divulgación incluye un método para diagnosticar un trastorno asociado con niveles aumentados de IFNα en un paciente. En una muestra del paciente se detecta la presencia o ausencia de un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα. El perfil de expresión de marcadores PD comprende la regulación positiva de la expresión o actividad de un conjunto de genes. En una realización específica, el conjunto de genes puede ser: (a) IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (b) IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (c) IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (d) IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2; o (e) IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; o (f) IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Una realización adicional de la divulgación incluye un método para supervisar la progresión de la enfermedad de un paciente que recibe tratamiento con un agente terapéutico que se une a y modula la actividad del IFNα. En una primera muestra del paciente se obtiene un primer perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα. Al paciente se le administra un agente que modula la actividad de IFN de tipo I o IFNα. En una realización, el agente se une a y neutraliza la actividad de IFN o IFNα. En otra realización, el agente se une a un receptor de un interferón de tipo 1 o IFNα. A partir de una segunda muestra del paciente se obtiene un segundo perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα. El primer y el segundo perfiles de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα se comparan. El perfil de expresión de marcadores PD comprende la regulación positiva de la expresión o actividad de un conjunto de genes. En una realización específica, el conjunto de genes puede ser: (a) IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (b) IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (c) IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (d) IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2; o (e) IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; o (f) IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Otra realización de la divulgación incluye un método para identificar un agente terapéutico candidato para tratar trastornos mediados por IFNα. Se ponen en contacto células que comprenden un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα con un agente. Se detecta la presencia o ausencia de un cambio en el perfil de expresión de marcadores PD inducido por IFNα de las células. El perfil de expresión de marcadores PD comprende la regulación positiva de la expresión o actividad de un conjunto de genes. En una realización específica, el conjunto de genes puede ser: (a) IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (b) IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (c) IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (d) IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2; o (e) IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; o (f) IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Una realización adicional de la divulgación incluye un conjunto de oligonucleótidos. El conjunto de oligonucleótidos puede comprender oligonucleótidos que detectan específicamente la expresión de un conjunto de genes. En una realización específica, el conjunto de genes puede ser: (a) IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (b) IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (c) IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (d) IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2; o (e) IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; o (f) IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Otra realización adicional más de la divulgación incluye oligonucleótidos que detectan específicamente 18S, ACTB y GAPDH.

Otra realización de la divulgación es un kit que comprende oligonucleótidos para detectar específicamente al menos cuatro de IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2, y 18S, ACTB y GAPDH, así como reactivos adecuados para la detección.

Otra realización de la divulgación incluye un método para detectar la actividad de IFN en una muestra. Se incuban con una muestra células que comprenden una secuencia polinucleotídica que comprende un gen indicador bajo el control de un elemento de respuesta estimulado por IFN. Se detecta la expresión del gen indicador.

Otra una realización adicional de la divulgación incluye un método para supervisar la progresión o regresión de un trastorno autoinmunitario en un paciente. A partir de una primera muestra del paciente se obtiene un primer perfil de expresión de marcadores PD. A partir de una segunda muestra del paciente se obtiene un segundo perfil de expresión de marcadores PD. El primer y el segundo perfiles de expresión de marcadores PD se comparan. Una variación en el primer y el segundo perfiles de expresión de marcadores PD indica progresión o regresión de la enfermedad.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Curva característica operativa del receptor (ROC) para la firma de cuatro genes (IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2) usada para un diagnóstico. Este gráfico demuestra la relación entre sensibilidad (tasa de verdaderos positivos) y 1-especificidad (tasa de falsos positivos) para los pacientes con LES tratados usando el criterio de valoración clínico primario en los días 182 y 196.

Figuras 2A y B. Límite claro entre pacientes positivos y negativos en el ensayo de diagnóstico de LES usando el ensayo basado en la firma de cuatro genes (IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2). (A) Se muestra el promedio de log2 del cambio en veces -usando la plataforma de matriz de baja densidad TaqMan (TLDA) de qRT-PCR de Applied Biosystem para pacientes negativos para el ensayo y positivos para el ensayo. (B) Promedio de log2 del cambio en veces en el gráfico de densidad de los valores de firma de genes para pacientes con LES tratados con el fármaco.

Figuras 3A y B. Área bajo la curva ajustada con respecto al tiempo menos la puntuación de referencia SLEDAI en pacientes con LES positivos (A) o negativos (B) para la firma de cuatro genes (IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2) en cohortes tratadas con placebo o con 0,3/1/3/10 mg/kg de MEDI-545. Todos los datos proceden de un estudio de aumento de la dosis, controlado con placebo, doble ciego, aleatorizado, multicéntrico de fase 1b para evaluar múltiples dosis intravenosas de MEDI-545 en pacientes con LES de moderada a gravemente activo. Todos los sujetos con LES tienen una puntuación SLEDAI ≥ 6 antes de la selección.

Figuras 4A y B. Respuestas SELDAI, reducción (mejoría) ≥ 4 puntos. A. Positivo para el diagnóstico. B. Negativo para el diagnóstico. Todos los datos proceden de un estudio de aumento de la dosis, controlado con placebo, doble ciego, aleatorizado, multicéntrico, de fase 1b para evaluar múltiples dosis intravenosas de MEDI-545 en pacientes con LES de moderada a gravemente activo. Todos los sujetos con LES tienen una puntuación SLEDAI ≥ 6 antes de la selección.

Figuras 5A y B. Respuestas SLEDAI, reducción (mejoría) > 4 puntos, en sujetos Dx+ con una reducción > 50 % frente a una reducción <50 % en Dx después del punto de referencia. Todos los datos proceden de un estudio de aumento de la dosis, controlado con placebo, doble ciego, aleatorizado, multicéntrico, de fase 1b para evaluar múltiples dosis intravenosas de MEDI-545 en pacientes con LES de moderada a gravemente activo. Todos los sujetos con LES tienen una puntuación SLEDAI ≥ 6 antes de la selección.

Figuras 6A y B. Respuestas compuestas. A) Respuesta compuesta para pacientes positivos para la firma de cuatro genes. B) Respuesta compuesta para pacientes negativos para la firma de cuatro genes. Todos los datos proceden de un estudio de aumento de la dosis, controlado con placebo, doble ciego, aleatorizado, multicéntrico, de fase 1b para evaluar múltiples dosis intravenosas de MEDI-545 en pacientes con LES de moderada a gravemente activo. Todos los sujetos con LES tienen una puntuación SLEDAI ≥ 6 antes de la selección.

Figuras 7A y B. Área bajo la curva de SLEDAI menos el punto de referencia. A) sujetos positivos para la firma de cuatro genes. B) sujetos negativos para la firma de cuatro genes. Todos los datos proceden de un estudio de aumento de la dosis, controlado con placebo, doble ciego, aleatorizado, multicéntrico, de fase 1b para evaluar múltiples dosis intravenosas de MEDI-545 en pacientes con LES de moderada a gravemente activo. Todos los sujetos con LES tienen una puntuación SLEDAI ≥ 6 antes de la selección.

Figuras 8A y B. Cambio de SLEDAI desde el punto de referencia. A) sujetos positivos para la firma de cuatro genes. B) sujetos negativos para la firma de cuatro genes. Todos los datos proceden de un estudio de aumento de la dosis, controlado con placebo, doble ciego, aleatorizado, multicéntrico, de fase 1b para evaluar múltiples dosis intravenosas de MEDI-545 en pacientes con LES de moderada a gravemente activo. Todos los sujetos con LES tienen una puntuación SLEDAI ≥ 6 antes de la selección.

Figuras 9 A-C. Los sujetos con una inhibición > 50 % de firma de IFN de tipo I tienen mayores respuestas SLEDAI (reducción > 4 puntos). A) 1 mg/kg IV cada 2 semanas B) 3 mg/kg IV cada 2 semanas C) 10 mg/kg IV cada 2 semanas.

Figuras 10 A-C. Los sujetos con una inhibición <50 % de la firma de IFN de tipo I tienen menores respuestas SLEDAI (reducción > 4 puntos). A) 1 mg/kg IV cada 2 semanas B) 3 mg/kg IV cada 2 semanas C) 10 mg/kg IV cada 2 semanas.

Figuras 11A y B. Firma de cinco genes en diversas enfermedades. A) Firma de genes en sangre entera de pacientes normales, con LES, SM, PM, AR y SSc. B) Firma de genes en piel normal, piel con LES, piel con SSc, músculo normal, músculo con DM, músculo con PM y tejido sinovial normal.

Figuras 12A y B. Firma de cuatro genes en diversas enfermedades. A) Firma de genes en sangre entera de pacientes normales, LES, SM, PM, AR y SSc. B) Firma de genes en piel normal, piel con LES, piel con SSc, músculo normal, músculo con DM, músculo con PM y tejido sinovial normal.

Descripción detallada

La divulgación incluye métodos para identificar, diagnosticar, tratar y supervisar la progresión de enfermedades en pacientes. Los pacientes incluyen cualquier animal que tenga una enfermedad, trastorno o afección inducible por IFN de tipo I o IFNα. Los pacientes incluyen cualquier animal que tenga una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria. Las enfermedades/trastornos/afecciones autoinmunitarias incluyen lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes mellitus insulinodependiente, enfermedad inflamatoria del intestino (incluyendo enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y enfermedad celíaca), esclerosis múltiple, psoriasis, tiroiditis autoinmunitaria, esclerodermia, artritis reumatoide, glomerulonefritis, miositis inflamatoria idiopática, síndrome de Sjogren, vasculitis, miositis por cuerpos de inclusión (MCI), dermatomiositis (DM), polimiositis (PM), sarcoidosis, esclerodermia y nefritis lúpica. El paciente puede tener la enfermedad, trastorno o afección como resultado de una investigación experimental, por ejemplo, puede ser un modelo experimental desarrollado para la enfermedad, trastorno o afección. Como alternativa, el paciente puede tener la enfermedad, trastorno o afección en ausencia de manipulación experimental. Los pacientes incluyen seres humanos, ratones, ratas, caballos, cerdos, gatos, perros y cualquier animal usado para investigación.

El paciente puede comprender un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα. El perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα puede ser un perfil fuerte, un perfil moderado o un perfil débil. Puede decirse fácilmente que el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα es fuerte, moderado o débil determinando la desregulación en veces del perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα del paciente (por ejemplo, el aumento en veces en la expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα regulados positivamente en el paciente), con respecto a una o más muestras de control o uno o más pacientes de control y comparando la desregulación en veces del paciente con la de otros pacientes que tienen un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα. La desregulación en veces puede calcularse por métodos bien conocidos en la técnica de la misma manera que la comparación. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 8 de la Solicitud Internacional n.º PCT/US2007/024947. En una realización, la desregulación en veces se calcula como el cambio en veces en los niveles de expresión de ARNm. De forma similar, pueden generarse perfiles fuertes, moderados o débiles para genes que no son específicamente inducibles por IFN de tipo I o IFNα.

La regulación positiva o negativa de un grupo de genes comprendidos por un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα puede calcularse por métodos bien conocidos en la técnica. En una realización, la regulación positiva o negativa se calcula como el promedio de cambio en veces en los niveles de expresión de ARNm del grupo de al menos cuatro genes elegidos entre IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2. En otra realización, la regulación positiva o negativa se calcula como la diferencia entre el Ct (ciclo umbral) medio para al menos cuatro genes diana (IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2) y el Ct medio de tres genes de control.

I. Perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα

A. Genes de diagnóstico

El grupo de genes incluidos en el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα del paciente son (a) IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (b) IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (c) IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (d) IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2; o (e) IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; o (f) IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

En una realización específica, el grupo de genes incluidos en el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα del paciente comprende IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2. En otra realización específica, el grupo de genes incluidos en el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα del paciente consiste en IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2. En una realización específica adicional, el grupo de genes incluidos en el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα del paciente comprende IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2. En otra realización específica, el grupo de genes incluidos en el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα del paciente consiste en IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2.

Los marcadores PD inducibles por IFNα en un perfil de expresión pueden incluir (a) IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (b) IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (c) IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (d) IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2; o (e) IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; o (f) IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Los marcadores PD inducibles por IFNα en un perfil de expresión pueden consistir en (a) IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (b) IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (c) IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o (d) IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2; o (e) IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; o (f) IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

B. Proteínas séricas

Los marcadores PD inducibles por IFNα en un perfil de expresión pueden incluir alteraciones en uno cualquiera o más de los niveles de las proteínas séricas adiponectina, alfa-fetoproteína, apolipoproteína CIII, beta-2 microglobulina, antígeno 125 de cáncer, antígeno 19-9 de cáncer, eotaxina, FABP, factor VII, ferritina, IL-10, IL

12p70, IL-16, IL-18, IL-1ra, IL-3, MCP-1, MMP-3, mioglobina, SGOT, factor tisular, TIMP-1, TNF RII, TNF-alfa, VCAM-1, vWF, BDNK, complemento 3, ligando de CD40, EGF, ENA-78, EN-RAGE, IGF-1, MDC, mieloperoxidasa, RANTES o trombopoyetina.

Los marcadores PD inducibles por IFNα en un perfil de expresión pueden incluir alteraciones en uno cualquiera o más de los niveles de las proteínas séricas adiponectina, alfa-fetoproteína, apolipoproteína CIII, beta-2 microglobulina, antígeno 125 de cáncer, antígeno 19-9 de cáncer, eotaxina, FABP, factor VII, ferritina, IL-10, IL12p70, IL-16, IL-18, IL-1ra, IL-3, MCP-1, MMP-3, mioglobina, SGOT, factor tisular, TIMP-1, TNF RII, TNF-alfa, VCAM-1, orvWF.

Los marcadores PD inducibles por IFNα en un perfil de expresión pueden incluir alteraciones en uno cualquiera o más de los niveles de proteínas séricas BDNK, complemento 3, ligando de CD40, EGF, ENA-78, EN-RAGE, IGF-1, MDC, mieloperoxidasa, RANTES o trombopoyetina.

Los perfiles de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα pueden incluir una expresión o actividad regulada positivamente de genes en células expuestas a niveles elevados de IFNα con respecto al punto de referencia. La expresión o actividad regulada positivamente de genes incluye un aumento en la expresión de ARNm de un gen, un aumento en la expresión de una proteína codificada por un gen o un aumento en la actividad de una proteína codificada por un gen. La expresión o actividad de los genes puede regularse positivamente como una respuesta directa o indirecta a IFNα.

C. Subtipos de interferón

El paciente que comprende el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα puede comprender además la regulación positiva de la expresión de cualquier número de subtipos de IFNα o IFN de tipo I. Los subtipos de IFNα o IFN de tipo I pueden incluir más de uno, más de dos, más de tres, más de cuatro, más de cinco, más de seis, más de siete, más de ocho, más de nueve o más de diez subtipos de IFNα o IFN de tipo I. Estos subtipos pueden incluir IFNα1, IFNα2, IFNα4, IFNα5, IFNα6, IFNα7, IFNα8, IFNα10, IFNα14, IFNα17, IFNα21, IFNβ

: o IFNω. El paciente puede comprender la regulación positiva de la expresión de los subtipos de IFN IFNα1, IFNα2, IFNα8 e IFNα14.

Como alternativa, un paciente tratado en los métodos incluidos por la divulgación simplemente puede ser uno identificado como uno que comprende un perfil de expresión génica con regulación positiva de la expresión de cualquier número de subtipos de IFNα o IFN de tipo I. Los subtipos de IFNα o IFN de tipo I pueden incluir más de uno, más de dos, más de tres, más de cuatro, más de cinco, más de seis, más de siete, más de ocho, más de nueve

: o más de diez subtipos de IFNα o IFN de tipo I. Estos subtipos pueden incluir IFNα1, IFNα2, IFNα4, IFNα5, IFNα6, IFNα7, IFNα8, IFNα10, IFNα14, IFNα17, IFNα21, IFNβ o IFNω. Estos subtipos pueden incluir IFNα1, IFNα2, IFNα8 e IFNα14.

D.: Receptores de IFNα

El paciente que comprende el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα puede comprender además la regulación positiva de la expresión de los receptores de IFNα, IFNΑR1 o IFNΑR2, o ambos, o TNFα, o IFNγ, o receptores de IFNγ (IFNGR1, IFNGR2 o tanto IFNGR1 como IFNGR2). El paciente puede identificarse simplemente como un paciente que comprende la regulación positiva de la expresión de los receptores de IFNα, IFNΑR1 o IFNΑR2, o ambos, o TNFα, o IFNγ o receptores de IFNγ (IFNGR1, IFNGR2 o tanto IFNGR1 como IFNGR2).

II. Regulación positiva

La regulación positiva o regulación negativa de los marcadores DP inducibles por IFN de tipo I o IFNα en el perfil de expresión del paciente puede tener cualquier grado con respecto al de una muestra de un control (que puede proceder de una muestra que no es un tejido enfermo del paciente (por ejemplo, piel no lesionada de un paciente con psoriasis) o de una persona sana no afectada por la enfermedad o trastorno) o puede ser relativo al de genes del paciente cuya expresión no ha cambiado por la enfermedad (denominados genes “constitutivos”).

El grado de regulación positiva o regulación negativa puede ser de al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 90 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 100 %, al menos un 125 % o al menos un 300 %, o al menos un 400 %, o al menos un 500 %

o más con respecto al control o muestra de control.

El perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα puede calcularse como el promedio del aumento en veces en la expresión o actividad del conjunto de genes comprendidos por el marcador PD. El perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα también puede calcularse como la diferencia entre el Ct (ciclo umbral) medio para los cuatro genes diana y el Ct medio de tres genes de control.

El promedio de aumento en veces en la expresión o actividad del conjunto de genes puede estar comprendido entre al menos aproximadamente 2 y al menos aproximadamente 15, entre al menos aproximadamente 2 y al menos aproximadamente 10, o entre al menos aproximadamente 2 y al menos aproximadamente 5. El promedio de aumento en veces en la expresión o actividad del conjunto de genes puede ser de al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 2,5, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 3,5, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 4,5, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 5,5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 6,5, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9 o al menos aproximadamente 10.

El grado de aumento de expresión permite la identificación de un límite de cambio en veces para identificar pacientes positivos para la firma y negativos para la firma que padecen enfermedades autoinmunitarias. En una realización, el límite es al menos aproximadamente 2. En otra realización, el límite es al menos aproximadamente 2,5. En otra realización, el límite es al menos aproximadamente 3. En otra realización, el límite es al menos aproximadamente 3,5. En otra realización, el límite es al menos aproximadamente 4. En otra realización, el límite es al menos aproximadamente 4,5. En otra realización, el límite se elige entre al menos 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4 y 4,5. En otra realización, el límite está comprendido entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8. En una realización, el límite es la media de los niveles de expresión aumentados de al menos cuatro de IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2. En otra realización, el límite es la media de los niveles de expresión aumentados de al menos cuatro de IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2.

El grado de aumento de expresión también permite la identificación de un límite de Ct delta para identificar pacientes positivos para la firma y negativos para la firma que padecen enfermedades autoinmunitarias. En una realización, el límite es al menos aproximadamente 7,6. En otra realización, el límite es 7,56. El límite de cambio en veces puede usarse para determinar un límite de Ct delta apropiado (por ejemplo, 1 < log2 del cambio en veces <3 corresponde a un intervalo de Ct delta de 8,65 a 6,56). De esta manera, en otra realización, el límite de Ct delta está comprendido entre aproximadamente 6,56 y aproximadamente 8,56.

Además, el paciente puede sobreexpresar o tener un tejido que sobreexpresa un subtipo de IFN de tipo I de al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 100 %, al menos un 125 %, al menos un 150 %, o al menos un 200 %, o al menos un 300 %, o al menos un 400 % o al menos un 500 % con respecto al del control. El subtipo de IFN de tipo I puede ser uno cualquiera de IFNα1, IFNα2, IFNα4, IFNα5, IFNα6, IFNα7, IFNα8, IFNα10, IFNα14, IFNα17, IFNα21, IFNβ o IFNω. Los subtipos de IFN de tipo I pueden incluir todos de IFNα1, IFNα2, IFNα8 e IFNα14.

La expresión o actividad regulada positivamente de cualquier gen detectado en una muestra, mediante sondas, o mediante sondas en kits en un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα puede ser al menos 1,2 veces, al menos 1,25 veces, al menos 1,3 veces, al menos 1,4 veces, al menos 1,5 veces, al menos 2,0 veces, al menos 2,25 veces, al menos 2,5 veces, al menos 2,75 veces, al menos 3,0 veces, al menos 3,5 veces, al menos 4,0 veces, al menos 4,5 veces, al menos 5,0 veces, al menos 6,0 veces, al menos 7,0 veces, al menos 8,0 veces, al menos 9,0 veces, al menos 10 veces, al menos 15,0 veces, al menos 20,0 veces, al menos 25,0 veces o al menos 50,0 veces mayor que los niveles del punto de referencia de las células de control, por ejemplo, células de voluntarios sanos o células de animales de control o células no expuestas a IFNα en cultivo. Todos los genes en el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα pueden tener una expresión o actividad regulada positivamente con el mismo aumento en veces. Como alternativa, los genes en el perfil de expresión de marcadores PD pueden tener niveles variables de expresión o actividad regulada positivamente.

A. Medición de la regulación positiva

La regulación positiva o negativa de la expresión o actividad génica de marcadores PD inducibles por IFNα puede determinarse por cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, la regulación positiva o negativa de la expresión génica puede detectarse determinando los niveles de ARNm. La expresión de ARNm puede determinarse por transferencia de Northern, transferencia por ranuras, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa tras transcripción inversa, o técnicas de hibridación de chips de genes. Véanse en las Patentes de Estados Unidos n.º

5.744.305 y 5.143.854 ejemplos de fabricación de obtención de matrices de ácidos nucleicos para técnicas de hibridación de chips de geses. Véanse en Establishing and functional characterization of an HEK-293 cell line expressing autofluorescently tagged (β-actin (pEYFP-ACTIN) and the neurokinin type 1 receptor (NK1-R) Hrovat, A; Zavec, AB; Pogacnik, A; Frangez, R; Vrecl, M 2010 Cellular & Molecular Biology Letters 1, 55-69, Expression profiles of proliferative and antiapoptotic genes in sporadic and colitis-related mouse colon cancer models, Svec, J; Ergang, P; Mandys, V; Kment, M; Pacha, J 2010 International Journal of Experimental Pathology 1, 44-53, and Protein kinase inhibitors emodin and dichloro-ribofuranosylbenzimidazole modulate the cellular accumulation and cytotoxicity of cisplatin in a schedule-dependent manner, Kurokawa, T; He, GA; Siddik, ZH 2010 Cancer Chemotherapy and Pharmacology 3, 427-436, ejemplos de cómo usar el método TAQMAN® para medir la expresión génica.

Pueden elegirse cebadores que se unan selectivamente a dianas en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) basándose en cebadores de determinación empírica que hibridan en una reacción PCR y producen suficiente señal

para detectar la diana entre el efecto de fondo, o pueden predecirse usando la temperatura de fusión del dúplex cebador:diana como se describe en Maniatis et al. Molecular Cloning, Segunda Edición, Sección 11.46. 1989. De forma similar, pueden elegirse empíricamente o predecirse sondas para detectar productos de PCR en un método TAQMAN® o relacionado. Dichos cebadores y sondas (colectivamente “oligonucleótidos”) pueden tener una longitud entre 10 y 30 nucleótidos o mayor.

La regulación positiva o negativa de la expresión o actividad génica de marcadores PD inducibles por IFNα puede determinarse detectando los niveles de proteína. Los métodos para detectar niveles de expresión de proteína incluyen ensayos basados en inmunología tales como ensayos de inmunoabsorbente ligado a enzimas, transferencia de Western, matrices de proteínas y tinción con plata.

Un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα puede comprender un perfil de actividad de proteína. La regulación positiva o negativa de la expresión o actividad de genes de marcadores PD inducibles por IFNα puede determinarse detectando la actividad de proteínas que incluyen, pero sin limitación, actividad de fosforilación detectable, actividad de desfosforilación o actividad de escisión. Además, la regulación positiva o negativa de la expresión o actividad de genes de marcadores PD inducibles por IFNα puede determinarse detectando cualquier combinación de estos niveles o actividades de expresión génica.

III. Enfermedades, trastornos o afecciones inducibles por IFN de tipo I o IFNα

Una enfermedad, trastorno o afección inducible por IFN de tipo I o IFNα es cualquiera que presente un perfil de expresión o firma génica de marcadores PD de IFN de tipo I o IFNα. Un perfil de expresión de marcadores PD y una firma génica se considerarán equivalentes. Estas enfermedades, trastornos o afecciones incluyen las que tienen un componente autoinmunitario tal como lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes mellitus insulinodependiente, enfermedad inflamatoria del intestino (incluyendo enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y enfermedad celíaca), esclerosis múltiple, psoriasis, tiroiditis autoinmunitaria, esclerodermia, artritis reumatoide, glomerulonefritis, miositis inflamatoria idiopática, síndrome de Sjogren, vasculitis, miositis con cuerpos de inclusión (MCI), dermatomiositis, polimiositis, nefritis lúpica y sarcoidosis. Otras enfermedades, trastornos o afecciones incluyen la enfermedad de injerto contra hospedador y rechazo de trasplantes.

A. Síntomas de los pacientes

Los pacientes también pueden presentar cualquiera de varios síntomas como se analiza, por ejemplo, en la Solicitud Internacional n.º PCT/US2007/024941 o pueden tener una puntuación clínica SLEDAI o una puntuación BILAG como se analiza en dicha solicitud. Estos síntomas pueden incluir fatiga, lesiones de órganos, erupción malar y alopecia. Al paciente se le puede asignar una puntuación usando un sistema de puntuación clínico conocido, por ejemplo, SLEDAI que es un índice de actividad de la enfermedad LES medido y evaluado en los últimos 10 días (Bombardier C, Gladman D, Urowitz M B, Caron D, Chang C H and the Committee on Prognosis Studies in SLE: Derivation of the SLEDAI for Lupus Patients. Arthritis Rheum 35: 630-640, 1992). La actividad de la enfermedad bajo el sistema de puntuación SLEDAI puede variar de 0 a 105. Se han definido las siguientes categorías de actividad SLEDAI: sin actividad (SLEDAI = 0); actividad leve (SLEDAI = 1-5); actividad moderada (SLEDAI = 6-10); actividad alta (SLEDAI = 11-19); actividad muy alta (SLEDAI = 20 o superior). (Griffiths, et al., Assessment of Patients with Systemic Lupus Erythematosus and the use of Lupus Disease Activity Indices). Otro índice de puntuación de enfermedad es el índice BILAG, que es un índice de actividad de LES que está basado en manifestaciones clínicas específicas en ocho sistemas de órganos: resultados generales, mucocutáneos, neurológicos, musculoesqueléticos, cardiovasculares, respiratorios, renales y hematológicos. La puntuación se basa en un sistema de letras, pero también pueden asignarse puntuaciones numéricas ponderadas a cada letra, haciendo que sea posible calcular una puntuación BILAG en el intervalo de 0-72. (Griffiths, et al., Assessment of Patients with Systemic Lupus Erythematosus and the use of Lupus Disease Activity Indices). Otros índices de puntuación incluyen la puntuación PGA, el índice compuesto de respondedores (CRI) y el ensayo ANAM4™. Los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, de tratamiento de un trastorno autoinmunitario, pueden usarse para cualquier sujeto identificado como un sujeto que tiene cualquier nivel de actividad de enfermedad medido por cualquier metodología de clasificación conocida en este campo, por ejemplo, leve, moderada, alta o muy alta. Los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, de tratamiento de un trastorno autoinmunitario, pueden dar como resultado una reducción en los síntomas del paciente o pueden dar como resultado una mejoría en una puntuación de la enfermedad para la enfermedad, trastorno o afección inducible por IFNα o IFN de tipo I del paciente.

IV. Agentes terapéuticos

Un agente terapéutico puede administrarse a un paciente o un paciente puede identificarse como un candidato para la administración de un agente o un agente terapéutico. Un agente terapéutico puede modular la actividad del interferón de tipo 1 o IFNα. Los agentes terapéuticos adecuados incluyen moléculas que se unen a y modulan la actividad de IFN de tipo I o IFNα. Los agentes terapéuticos adecuados incluyen moléculas que se unen a y modulan la actividad de receptores de interferones de tipo I o IFNα. El agente terapéutico puede ser una molécula pequeña o un agente biológico. Si el agente terapéutico es una molécula pequeña, puede sintetizarse o identificarse y aislarse a partir de una fuente natural.

Si el agente terapéutico es un agente biológico, puede ser un anticuerpo específico para cualquier subtipo de IFN de tipo I o IFNα. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser específico para uno cualquiera de IFNα1, IFNα2, IFNα4, IFNα5, IFNα6, IFNα7, IFNα8, IFNα10, IFNα14, IFNα17, IFNα21, IFNβ o IFNω. Como alternativa, el anticuerpo puede ser específico para dos cualesquiera, tres cualesquiera, cuatro cualesquiera, cinco cualesquiera, seis cualesquiera, siete cualesquiera, ocho cualesquiera, nueve cualesquiera, diez cualesquiera, once cualesquiera o doce cualesquiera de los subtipos de IFN de tipo I o IFNα. Si el anticuerpo es específico para más de un subtipo de IFN de tipo I, el anticuerpo puede ser específico para IFNα1, IFNα2, IFNα4, IFNα5, IFNα8, IFNα10 e IFNα21; o puede ser específico para IFNα1, IFNα2, IFNα4, IFNα5, IFNα8 e IFNα10; o puede ser específico para IFNα1, IFNα2, IFNα4, IFNα5, IFNα8 e IFNα21; o puede ser específico para IFNα1, IFNα2, IFNα4, IFNα5, IFNα10 e IFNα21. Los anticuerpos específicos para IFN de tipo I o IFNα incluyen MEDI-545, cualquier agente biológico o anticuerpo distinto de MEDI-545, anticuerpos descritos en las solicitudes de patente de Estados Unidos 11/009.410 presentada el 10 de diciembre de 2004 y 11/157.494 presentada el 20 de junio de 2005, 9F3 y otros anticuerpos descritos en la Patente de Estados Unidos n.º 7.087.726 (Ejemplo 1 y Ejemplo 2, los desvelados en la Tabla 3 y Tabla 4, y/o los desvelados en la tabla titulada “Depósito de Material” en las líneas 25-54, columna 56), NK-2 y YOK5/19 (documento WO 84/03105), LO-22 (Patente de Estados Unidos 4.902.618), 144 BS (Patente de Estados Unidos 4.885.166) y EBI-1, EBI-2 y EBI-3 (documento EP 119476). Un agente terapéutico que modula la actividad de IFNα puede neutralizar la actividad de IFNα. Un experto en la materia conocerá bien la preparación y formulación de dichos agentes biológicos y métodos para su administración.

MEDI-545 es un anticuerpo monoclonal (Mab) IgGlk de 147.000 Dalton completamente humano, que se une a la mayoría de subtipos de interferón alfa (IFNα). MEDI-545 está constituido en un 100% por secuencias proteicas humanas, lo cual hace que sea un anticuerpo monoclonal completamente humano. Los anticuerpos monoclonales completamente humanos pueden tener ventajas con respecto a otras formas de anticuerpos monoclonales, tales como anticuerpos quiméricos y humanizados, ya que pueden tener un perfil de seguridad más favorable y pueden eliminarse con menos rapidez del cuerpo humano, haciendo posible de esta manera la reducción de la frecuencia de dosificación. MEDI-545 se obtuvo a partir de un anticuerpo IgG4κ, 13H5, que se seleccionó basándose en ensayos funcionales ya que tenía las propiedades más deseables para ser un posible agente terapéutico. 13H5 posteriormente se convirtió en un isotipo de anticuerpo IgG1, producido en células CHO, y seleccionado para la caracterización adicional y desarrollo preclínico con un diseño inicial de MDX-1103, ahora denominado MEDI-545. Véase también la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos n.º 2007/0014724; Solicitud PCT PCT/US2008/058133 presentada el 25 de marzo de 2008 titulada “Anticuerpos con Perfiles de Desamidación Disminuidos”, y la Solicitud PCT PCT/US2008/058132 presentada el 25 de marzo de 2008.

El agente terapéutico puede ser un anticuerpo contra un receptor de interferón, incluyendo los desvelados en las Patentes de Estados Unidos n.º 7.619.070 y 7.662.381 y la Solicitud Internacional n.º PCT/US2009/033358.

A. Anticuerpos

El anticuerpo puede ser un anticuerpo sintético, un anticuerpo monoclonal, anticuerpos policlonales, un anticuerpo producido de forma recombinante, un intracuerpo, un anticuerpo multiespecífico (incluyendo anticuerpos biespecíficos), un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un Fv monocatenario (scFv) (incluyendo scFv biespecíficos), una molécula BiTE, un anticuerpo monocatenario, un fragmento Fab, un fragmento F(ab’), un Fv con enlaces disulfuro (sdFv), o un fragmento de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. El anticuerpo puede ser de una molécula de inmunoglobulina o una parte inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina. Además, el anticuerpo puede ser de cualquier isotipo. Por ejemplo, puede ser cualquiera de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud completa que comprende regiones variables y constantes, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como un anticuerpo monocatenario, o un fragmento Fab o Fab’2. El anticuerpo también puede conjugarse o unirse a un agente terapéutico, tal como una citotoxina o un isótopo radiactivo.

En los métodos de tratamiento, al paciente se le puede administrar un segundo agente distinto de un agente que se une a y modula la actividad de IFNα, o un agente que se une a y modula la actividad de un receptor de un interferón de tipo I o IFNα. Los segundos agentes incluyen, pero sin limitación, antiinflamatorios no esteroideos tales como ibuprofeno, naproxeno, sulindac, diclofenaco, piroxicam, ketoprofeno, diflunisal, nabumetona, etodolac y oxaprozina, indometacina; fármacos antimaláricos tales como hidroxicloroquina; hormonas corticosteroides tales como prednisona, hidrocortisona, metilprednisolona y dexametasona; metotrexato; agentes inmunosupresores tales como azatioprina y ciclofosfamida; y agentes biológicos que, por ejemplo, se dirigen a las células T tales como Alefacept y Efalizumab, o se dirigen a TNFα, tales como Enbrel, Remicade y Humira.

B. Identificación de agentes terapéuticos candidatos

Un agente terapéutico candidato para tratar trastornos mediados por IFNα puede identificarse por los métodos incluidos por la divulgación. Los agentes terapéuticos candidatos pueden ser cualquier tipo de molécula incluyendo una molécula pequeña o un agente biológico. Un agente terapéutico candidato identificado por los métodos incluidos por la divulgación puede identificarse inmediatamente como útil como agente terapéutico para una enfermedad, trastorno o afección. Como alternativa, un agente terapéutico candidato identificado por los métodos incluidos por la

divulgación puede necesitar ensayarse y/o modificarse adicionalmente antes de la selección para tratar a los pacientes. Como alternativa, un agente terapéutico candidato identificado por los métodos incluidos por la divulgación puede, después de ensayarse adicionalmente, desecharse como molécula para tratar a los pacientes.

En métodos que identifican agentes terapéuticos candidatos, se ponen en contacto con un agente células que comprenden un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα. Las células pueden ser cualquier tipo de células, tales como líneas celulares inmortalizadas disponibles en el mercado que comprenden un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα, líneas celulares inmortalizadas disponibles en el mercado que se han tratado con IFNα para inducir un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα, células aisladas de un paciente que tiene un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα o células aisladas de un paciente sano y tratado con IFNα para inducir un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα.

La presencia o ausencia de un cambio en el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα de las células se detecta después de poner en contacto las células con el agente. La presencia de cambio puede ser cualquier cambio en el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα que incluye una reducción de al menos un 10 % en la expresión o actividad regulada positivamente de al menos 1 gen en el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα, al menos una reducción de un 20 % de dicho al menos 1 gen regulado positivamente, al menos una reducción del 30 % de dicho al menos 1 gen regulado positivamente, al menos una reducción del 40 % de dicho al menos 1 gen regulado positivamente, al menos una reducción del 50 % de dicho al menos 1 gen regulado positivamente, al menos una reducción del 60 % de dicho al menos 1 gen regulado positivamente, al menos una reducción del 70 % de dicho al menos 1 gen regulado positivamente, al menos una reducción del 75 % de dicho al menos 1 gen regulado positivamente, al menos una reducción del 80 % de dicho al menos 1 gen regulado positivamente, al menos una reducción del 85 % de dicho al menos 1 gen regulado positivamente, al menos una reducción del 90 % de dicho al menos 1 gen regulado positivamente, al menos una reducción del 95 % de dicho al menos 1 gen regulado positivamente, al menos una reducción del 96 % de dicho al menos 1 gen regulado positivamente, al menos una reducción del 97 % de dicho al menos 1 gen regulado positivamente, al menos una reducción del 98 % de dicho al menos 1 gen regulado positivamente, al menos una reducción del 99 % de dicho al menos 1 gen regulado positivamente o una reducción del 100 % de dicho al menos 1 gen regulado positivamente.

V. Neutralización del perfil inducible por IFN de tipo I o IFNα en pacientes

El tratamiento con el agente puede dar como resultado la neutralización del perfil inducible por IFN de tipo I o IFNα. El tratamiento con el agente puede dar como resultado una reducción en uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno mediado por IFN de tipo I o IFNα. El tratamiento con el agente puede dar como resultado menos brotes relacionados con la enfermedad o trastorno mediado por IFN de tipo I o IFNα. El tratamiento con el agente puede dar como resultado un mejor pronóstico para el paciente que tiene la enfermedad o trastorno mediado por IFN de tipo I o IFNα. El tratamiento con el agente puede dar como resultado una mayor calidad de vida para el paciente. El tratamiento con el agente puede aliviar la necesidad de coadministrar segundos agentes o puede reducir la dosificación de administración del segundo agente al paciente. El tratamiento con el agente puede reducir el número de hospitalizaciones del paciente que están relacionadas con el trastorno o enfermedad mediada por IFN de tipo I o IFNα.

El agente que se une a y modula la actividad de IFN de tipo I o IFNα puede neutralizar un perfil inducible por IFN de tipo I o IFNα. La neutralización del perfil inducible por IFN de tipo I o IFNα puede ser una reducción en al menos uno, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro genes. La neutralización del perfil inducible por IFN de tipo I o IFNα es una reducción de al menos un 2 %, al menos un 3 %, al menos un 4 %, al menos un 5 %, al menos un 7 %, al menos un 8 %, al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de cualquiera de dichos al menos uno, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro genes regulados positivamente en el perfil inducible por IFN de tipo I o IFNα. Como alternativa, la neutralización del perfil inducible por IFN de tipo I o IFNα se refiere a una reducción de la expresión de genes inducibles por IFN de tipo I o IFNα regulados positivamente que está dentro de, como máximo un 50 %, como máximo un 45 %, como máximo un 40 %, como máximo un 35 %, como máximo un 30 %, como máximo un 25 %, como máximo un 20 %, como máximo un 15 %, como máximo un 10 %, como máximo un 5 %, como máximo un 4 %, como máximo un 3 %, como máximo un 2 % o como máximo un 1 % de los niveles de expresión de esos genes inducibles por IFN de tipo I o IFNα en una muestra de control. Si el agente que se une a y modula la actividad del IFN de tipo I o IFNα es un agente biológico, tal como un anticuerpo, el agente puede neutralizar el perfil de IFN de tipo I o IFNα a dosis de 0,3 a 30 mg/kg, de 0,3 a 10 mg/kg, de 0,3 a 3 mg/kg, de 0,3 a 1 mg/kg, de 1 a 30 mg/kg, de 3 a 30mg/kg, de 5 a 30mg/kg, de 10 a 30mg/kg, de 1 a 10mg/kg, de 3 a 10mg/kg o de 1 a 5mg/kg.

El agente que se une a y modula la actividad de IFN de tipo I o IFNα puede neutralizar adicionalmente o como alternativa la expresión de uno o más subtipos de IFN de tipo I o IFNα. Los subtipos de IFN de tipo I o IFNα pueden incluir cualquiera de los siguientes: más de uno, más de dos, más de tres, más de cuatro, más de cinco, más de seis, más de siete, más de ocho, más de nueve o más de diez subtipos de IFN de tipo I o IFNα. Estos subtipos pueden incluir IFNα1, IFNα2, IFNα4, IFNα5, IFNα6, IFNα7, IFNα8, IFNα10, IFNα14, IFNα17, IFNα21, IFNβ o IFNω.

Estos subtipos pueden incluir todos de IFNα1, IFNα2, IFNα8 e IFNα14. Como alternativa, estos subtipos pueden incluir IFNα1, IFNα2, IFNα4, IFNα5, IFNα8, IFNα10, IFNα21. La neutralización de los subtipos de IFN de tipo I o IFNα puede ser una reducción de al menos un 2 %, al menos un 3 %, al menos un 4 %, al menos un 5 %, al menos un 7 %, al menos un 8 %, al menos un 10 % Al menos un 15 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de cualquiera de dichos al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cinco, al menos siete, al menos ocho o al menos diez de los subtipos. La neutralización de los subtipos de IFN de tipo I o IFNα puede ser una reducción en la expresión de genes de subtipo de IFN de tipo I o IFNα que está dentro de como máximo un 50 %, como máximo un 45 %, como máximo un 40 %, como máximo un 35 %, como máximo un 30 %, como máximo un 25 %, como máximo un 20 %, como máximo un 15 %, como máximo un 10 %, como máximo un 5 %, como máximo un 4 %, como máximo un 3 %, como máximo un 2 % o como máximo un 1 % de los niveles de expresión de esos subtipos de IFN de tipo I o IFNα en una muestra de control. Si el agente que se une a y modula la actividad de IFNα o la actividad de IFN de tipo I es un agente biológico, tal como un anticuerpo, el agente puede neutralizar los subtipos de IFNα o IFN de tipo I a dosis de 0,3 a 30 mg/kg, de 0,3 a 10 mg/kg, de 0,3 a 3 mg/kg, de 0,3 a 1 mg/kg, de 1 a 30 mg/kg, de 3 a 30 mg/kg, de 5 a 30 mg/kg, de 10 a 30 mg/kg, de 1 a 10 mg/kg, de 3 a 10mg/kg o de 1 a 5mg/kg.

El agente que se une a y modula la actividad de IFN de tipo I o IFNα puede, además o como alternativa, neutralizar la expresión de receptores de IFNα, IFNAR1 o IFNAR2 o ambos, o TNFα, o IFNy, o receptores de IFNy (IFNGR1, IFNGR2 o tanto IFNGR1 como IFNGR2). La neutralización de la expresión de receptores de IFNα, IFNAR1 o IFNAR2, o ambos, o TNFα, o IFNγ o receptores de IFNγ (IFNGR1, IFNGR2 o tanto IFNGR1 como IFNGR2) puede ser una reducción de al menos un 2 %, al menos un 3 %, al menos un 4 %, al menos un 5 %, al menos un 7 %, al menos un 8 %, al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40% , al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70 %, al menos un 75%, al menos un 80% o al menos un 90 % de cualquiera de dichos al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cinco o al menos seis de estos genes. La neutralización de la expresión de receptores de IFNα, IFNAR1 o IFNAR2, o TNFα, o IFNγ o receptores de IFNγ (IFNGR1, IFNGR2, o tanto IFNGR1 como IFNGR2) es una reducción de la expresión de como máximo un 50 %, como máximo un 45 %, como máximo un 40 %, como máximo un 35 %, como máximo un 30 %, como máximo un 25 %, como máximo un 20 %, como máximo un 15 %, como máximo un 10 %, como máximo un 5 %, como máximo un 4 %, como máximo un 3 %, como máximo un 2 % o como máximo un 1 % de los niveles de expresión de estos genes en una muestra de control. Si el agente que se une a y modula la actividad de IFN de tipo I

: o IFNα es un agente biológico, tal como un anticuerpo, el agente puede neutralizar la expresión de los receptores de IFNα IFNAR1 o IFNAR2, o TNFα o IFNγ, o receptores de IFNγ IFNGR1 o IFNGR2 a dosis de 0,3 a 30 mg/kg, de 0,3 a 10 mg/kg, de 0,3 a 3 mg/kg, de 0,3 a 1 mg/kg, de 1 a 30 mg/kg, de 3 a 30 mg/kg, de 5 a 30 mg/kg, de 10 a 30mg/kg, de 1 a 10mg/kg, de 3 a 10mg/kg, o de 1 a 5mg/kg.

C.: Muestras de pacientes

Las muestras también pueden obtenerse a partir de pacientes en los métodos de la divulgación. Las muestras incluyen cualquier fluido o tejido biológico, tal como sangre entera, saliva, orina, líquido sinovial, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, secreciones nasales, esputos, líquido amniótico, fluido de lavado broncoalveolar, células mononucleares de sangre periférica, glóbulos blancos totales, células de ganglio linfático, células de bazo, células de amígdala o piel. Las muestras pueden obtenerse por cualquier medio conocido en la técnica.

VI. Métodos de supervisión de la progresión de la enfermedad

En los métodos de supervisión de la progresión de la enfermedad de un paciente, pueden obtenerse muestras del paciente antes y después de la administración de un agente, por ejemplo, un agente que se une a y modula la actividad de IFN de tipo I o IFNα, o un agente que se une a y no modula la actividad de IFN de tipo I o IFNα, o una combinación de agentes que pueden o pueden no incluir un agente que se une a y modula la actividad de IFN de tipo I o IFNα. En las muestras se obtienen perfiles de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα (antes y después de la administración del agente). Los perfiles de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα en las muestras se comparan. La comparación puede ser del número de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα presentes en las muestras o puede ser de la cantidad de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα presentes en las muestras o cualquier combinación de éstas. Puede indicarse una variación que indique la eficacia del agente terapéutico si el número o nivel (o cualquier combinación de los mismos) de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα disminuye en la muestra obtenida después de la administración del agente terapéutico con respecto a la muestra obtenida antes de la administración del agente terapéutico. El número de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα regulados positivamente puede reducirse en al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 veces. El nivel de cualquier marcador PD inducible por IFN de tipo I o IFNα regulado positivamente dado puede reducirse al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 %. El número de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα regulados positivamente con niveles disminuidos puede ser al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4. Cualquier combinación de número disminuido y nivel disminuido de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα

regulados positivamente puede indicar eficacia. Puede indicarse variación que indique eficacia del agente terapéutico si el número o nivel (o cualquier combinación de los mismos) de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα regulados negativamente disminuye en la muestra obtenida después de la administración del agente terapéutico con respecto a la muestra obtenida antes de la administración del agente terapéutico.

La muestra obtenida a partir del paciente puede obtenerse antes de una primera administración del agente, es decir, al paciente no se le ha administrado previamente el agente. Como alternativa, la muestra obtenida a partir del paciente puede obtenerse después de la administración del agente en el transcurso del tratamiento. Por ejemplo, el agente puede haberse administrado antes del inicio del protocolo de supervisión. Después de la administración del agente, puede obtenerse una muestra adicional del paciente y se comparan los marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα en las muestras. Las muestras pueden ser del mismo tipo o de un tipo diferente, por ejemplo, cada muestra obtenida puede ser una muestra de sangre, o cada muestra obtenida puede ser una muestra de suero. Los marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα detectados en cada muestra pueden ser iguales, o pueden coincidir sustancialmente, o pueden ser similares.

Las muestras pueden obtenerse en cualquier momento antes y después de la administración del agente terapéutico. La muestra obtenida después de la administración del agente terapéutico puede obtenerse al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 12 o al menos 14 días después de la administración del agente terapéutico. La muestra obtenida después de la administración del agente terapéutico puede obtenerse al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 semanas después de la administración del agente terapéutico. La muestra obtenida después de la administración del agente terapéutico puede obtenerse al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 meses después de la administración del agente terapéutico.

Pueden obtenerse muestras adicionales del paciente después de la administración del agente terapéutico. Pueden obtenerse al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 muestras del paciente para supervisar la progresión o regresión de la enfermedad o trastorno a lo largo del tiempo. La progresión de la enfermedad puede supervisarse durante un período de tiempo de al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 5 semanas, al menos 6 semanas, al menos 7 semanas, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años, al menos 5 años, al menos 10 años, o durante la vida del paciente. Pueden obtenerse muestras adicionales del paciente a intervalos regulares tales como mensualmente, cada dos meses, una vez al trimestre, dos veces al año o a intervalos anuales. Las muestras pueden obtenerse del paciente después de la administración del agente a intervalos regulares. Por ejemplo, las muestras pueden obtenerse del paciente una semana después de cada administración del agente, o dos semanas después de cada administración del agente, o tres semanas después de cada administración del agente, o un mes después de cada administración del agente, o dos meses después de cada administración del agente. Como alternativa, pueden obtenerse múltiples muestras del paciente después de cada administración del agente.

De forma similar, puede supervisarse la progresión de la enfermedad en un paciente en ausencia de administración de un agente. Pueden obtenerse periódicamente muestras del paciente que tiene la enfermedad o trastorno. La progresión de la enfermedad puede identificarse si el número o tipo de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα aumenta en una muestra obtenida posteriormente con respecto a una muestra obtenida previamente. El número de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα puede aumentar en al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10. La progresión de la enfermedad puede identificarse si el nivel de cualquier marcador PD inducible por IFN de tipo I o IFNα regulado positivamente dado aumenta en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 %. La progresión de la enfermedad puede identificarse si el nivel de cualquier marcador PD inducible por IFN de tipo I o IFNα regulado negativamente dado disminuye en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 %. El número de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα regulados positivamente con niveles aumentados puede ser al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30 o al menos 35. El número de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα regulados negativamente con niveles disminuidos puede ser al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 20, al menos 25, al menos 30 o al menos 35. Cualquier combinación de un número aumentado y nivel aumentado de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα regulado positivamente puede indicar progresión de la enfermedad. Como alternativa, o en combinación, cualquier combinación de número disminuido y nivel disminuido de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα regulado negativamente puede indicar progresión de la enfermedad. La regresión de la enfermedad también puede identificarse en un paciente que tiene una enfermedad o trastorno, no tratado por un agente. En este caso, puede identificarse regresión si el número de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα disminuye en una muestra obtenida posteriormente con respecto a una muestra obtenida previamente. El número de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα puede

disminuir en al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10. La regresión de la enfermedad puede identificarse si el nivel de cualquier marcador PD inducible por IFN de tipo I o IFNα regulado positivamente dado disminuye en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 %. Puede identificarse regresión de la enfermedad si el nivel de cualquier marcador PD inducible por IFN de tipo I o IFNα regulado negativamente dado aumenta en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 %. El número de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα regulados positivamente con niveles disminuidos puede ser al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30 o al menos 35. El número de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα regulados negativamente con niveles aumentados puede ser al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 20, al menos 25, al menos 30 o al menos 35. La progresión de la enfermedad o la regresión de la enfermedad puede supervisarse mediante la obtención de muestras durante cualquier período de tiempo y a cualquier intervalo. La progresión de la enfermedad o la regresión de la enfermedad puede supervisarse mediante la obtención de muestras durante el transcurso de al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 5 semanas, al menos 6 semanas, al menos 7 semanas, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años, al menos 5 años, al menos 10 años o a lo largo de la vida del paciente. La progresión de la enfermedad o la regresión de la enfermedad puede supervisarse mediante la obtención de muestras al menos mensualmente, cada dos meses, una vez al trimestre, dos veces al año o anualmente. No es necesario obtener las muestras a intervalos estrictos.

VII. Kits y sondas

La divulgación también incluye kits y sondas. Las sondas pueden ser cualquier molécula que detecte cualquier expresión o actividad de cualquier gen que pueda incluirse en un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα.

VIII. Métodos de detección de la actividad de IFN

La divulgación también incluye métodos para detectar la actividad de IFN. Estos métodos pueden emplear células que comprenden una secuencia polinucleotídica que comprende un gen indicador bajo el control de un elemento de respuesta estimulado por interferón. Las células que comprenden la secuencia polinucleotídica pueden ser cualquier célula susceptible de transfección o transformación con una secuencia polinucleotídica y que puede mantenerse en cultivo. Estas células incluyen células animales, células bacterianas, células de levadura, células de insecto o células vegetales. Estas células pueden ser adherentes o pueden crecer en suspensión. Si las células son células animales, pueden proceder de una línea celular conocida tal como HeLa, COS, NIH3T3, AGS, 293, CHO, Huh-7, HUVEC, MCF-7, C6, BHK-21, BNL CL 2, C2C12, HepG2 y ATDC5. Se conocen innumerables líneas celulares y pueden obtenerse por los expertos en la materia. Las células, como alternativa, pueden ser células primarias que se han inmortalizado o no.

Las células pueden comprender una secuencia polinucleotídica que comprende un gen indicador bajo el control de un elemento de respuesta estimulado por interferón. La secuencia polinucleotídica puede estar integrada de forma estable en el ADN de la célula o puede ser un elemento extracromosómico que está de forma estable o transitoria en la célula. El polinucleótido puede haberse introducido en la célula como una molécula de polinucleótido desnuda, una molécula de polinucleótido complejada con lípidos u otras moléculas, o un polinucleótido en una partícula de virus.

Si el polinucleótido se introdujo como una molécula de polinucleótido desnuda, el polinucleótido puede haber sido una molécula lineal o circular. Los ejemplos no limitantes de moléculas de polinucleótido circulares incluyen plásmidos y cromosomas artificiales. Estos vectores pueden escindirse con enzimas, por ejemplo, para generar moléculas de polinucleótido lineales.

Además, si el polinucleótido se introdujo como un polinucleótido desnudo, puede haberse introducido en las células por cualquiera de muchas técnicas bien conocidas en este campo. Estas técnicas incluyen, pero sin limitación, electroporación, microinyección y liberación balística de partículas. Véase también, por ejemplo, Loeffler y Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217: 599-618; Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 618-644; Clin. Pharma. Ther. 29: 69-92 (1985), Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989 y Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., N. Y., N. Y. (1987-2001).

Si el polinucleótido se introdujo como un complejo con lípidos o liposomas, también puede haberse introducido por una de muchas técnicas conocidas por el experto en la materia. Los lípidos o liposomas comprenden una mezcla de partículas de grasa o lípidos que se unen al ADN o ARN para proporcionar un vehículo de liberación recubierto

hidrófobo. Los liposomas adecuados pueden comprender cualquiera de los materiales de liposomas fosfolípidos sintéticos o naturales convencionales, incluyendo fosfolípidos de fuentes naturales tales como huevo, fuentes vegetales o animales tales como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, esfingomielina, fosfatidilserina o fosfatidilinositol. También pueden usarse fosfolípidos sintéticos, por ejemplo, dimiristoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina y fosfatidiletanolaminas sintéticas correspondientes y fosfatidilgliceroles. También están disponibles para el experto en la materia lípidos o liposomas que pueden conjugarse con el vector. Los ejemplos de reactivos de transfección de lípidos o liposomas disponibles en el mercado conocidos por los expertos en la materia incluyen LIPOFECTAMINE™ (Invitrogen), GENEJUICE® (Novagen), GENEJAMMER® (Strata-gen), FUGENE®HD (Roche), MEGAFECTIN™ (Qbiogene), SUPERFECT® (Qiagen) y EFFECTENE® (Qiagen).

Si el polinucleótido se introdujo como un complejo con otras moléculas, puede haberse compactado en una nanosfera. Se describen complejos de polinucleótidos compactados en las Patentes de Estados Unidos 5.972.901,

6.008.336 y 6.077.835. Se describen nanoesferas en las Patentes de Estados Unidos n.º 5.718.905 y 6.207.195. Estos complejos de polinucleótido compactados y nanoesferas que complejan ácidos nucleicos utilizan cationes poliméricos. Los cationes poliméricos típicos incluyen gelatina, poli-L-lisina y quitosano. Como alternativa, el polinucleótido puede haberse complejado con DEAE-dextrano, o transfectado usando técnicas tales como coprecipitación con fosfato cálcico o coprecipitación con cloruro cálcico.

Si el polinucleótido se introdujo asociado con un virus, el virus puede ser cualquier virus adecuado bien conocido para la liberación de polinucleótidos. Los ejemplos de virus que pueden usarse como vectores incluyen adenovirus, virus adenoasociado, lentivirus, retrovirus, herpes virus (por ejemplo, herpes virus simplex), vaccinia virus, papovirus, virus Sendai, virus SV40, virus sincitial respiratorio, etc.

La secuencia polinucleotídica puede incluir un gen indicador y un elemento de respuesta estimulado por interferón. El gen indicador puede ser uno cualquiera de luciferasa, cloranfenicol acetil transferasa, β-galactosidasa, proteína fluorescente verde, β-glucuronidasa o fosfatasa alcalina placentaria secretada. Se conocen variaciones de muchos de estos genes indicadores, por ejemplo, proteína fluorescente verde y luceriferasa, y pueden identificarse y/o producirse fácilmente por los expertos en la materia. Los expertos en la materia también conocerán otros genes indicadores además de los indicados y se pueden obtener fácilmente. Los expertos en la materia también conocen elementos de respuesta estimulados por interferón. Pueden obtenerse a partir de vendedores comerciales tales como Stratagene, Clonetech y Biomyx. También se han presentado, por ejemplo, en Alcantara et al. (Nuc. Acid Res. 30 (2002): 2068-2075 y Kirchhoff et al. (Oncogene 18 (1999): 3725-3736).

Las células empleadas en el ensayo pueden incubarse con una muestra. La muestra puede obtenerse a partir de un paciente o a partir de un vendedor con muestras de pacientes, o puede usarse una muestra de control para la calibración o como control. Si la muestra se obtiene a partir de un paciente, puede ser cualquier fluido o tejido biológico, tal como sangre entera, saliva, orina, líquido sinovial, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, secreciones nasales, esputos, líquido amniótico, fluido de lavado broncoalveolar, células mononucleares de sangre periférica, glóbulos blancos totales, células de ganglios linfáticos, células de bazo, células de amígdala o piel.

La expresión del gen indicador se detecta por cualquier medio bien conocido en la técnica. La expresión, incluso si es “0” indica actividad de IFN en la muestra. Un experto en la materia puede cuantificar adicionalmente cualquier nivel de expresión del gen indicador que después puede correlacionarse con el nivel de actividad de IFN en la muestra. Los solicitantes proporcionan un conjunto de realizaciones no limitantes para describir algunos de los aspectos de la divulgación.

Realizaciones

Realización 1. Un método para tratar a un paciente que tiene una enfermedad o trastorno mediado por IFN de tipo I o IFNα que comprende:

administrar un agente que se une a y modula la actividad de IFN de tipo I o IFNα;

en el que el paciente comprende un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα;

y en el que el agente neutraliza el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα del paciente.

Realización 2. Un método para tratar a un paciente con una enfermedad autoinmunitaria que comprende un perfil de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα moderado o fuerte, que comprende:

en el que el agente neutraliza el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα del paciente.

Realización 3. Un método para neutralizar un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα en un paciente que tiene una enfermedad o trastorno, que comprende:

administrar un agente que se une a y modula la actividad de IFN de tipo I o IFNα en el paciente;

Realización 4. El método de una cualquiera de las realizaciones 1 a 3, que comprende además detectar la neutralización del perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα del paciente.

Realización 5. El método de una cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en el que el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα comprende transcritos de genes de marcadores PD.

Realización 6. El método de una cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en el que el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα comprende polipéptidos expresados a partir de genes de marcadores PD.

Realización 7. El método de una cualquiera de las realizaciones 1 a 6, en el que el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα comprende la expresión o actividad regulada positivamente de un conjunto de genes elegidos entre:

(a): IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(b): IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(c): IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(d): IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2;

(e): IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; y

(f): IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Realización 8. El método de una cualquiera de las realizaciones 1 a 6, en el que el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα consiste en la expresión o actividad regulada positivamente de un conjunto de genes elegidos entre:

(a): IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(b): IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(c): IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(d): IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2;

(e): IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; y

(f): IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6

Realización 9. El método de la realización 7 u 8 en el que la expresión o actividad regulada positivamente de un conjunto de genes se calcula como un promedio de aumento en veces en la expresión o actividad del conjunto de genes.

Realización 10. El método de la realización 9 en el que el promedio de aumento en veces en la expresión o actividad del conjunto de genes está comprendido entre al menos aproximadamente 3 y al menos aproximadamente 15, entre al menos aproximadamente 3 y al menos aproximadamente 10 o entre al menos aproximadamente 3 y al menos aproximadamente 5.

Realización 11. El método de la realización 9, en el que el promedio de aumento en veces en la expresión o actividad del conjunto de genes es al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 2,5, al menos

aproximadamente 3, al menos aproximadamente 3,5, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 4,5, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 5,5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 6,5, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9 o al menos aproximadamente 10.

Realización 12. El método de una cualquiera de las realizaciones 1 a 11 en el que el agente es un agente biológico.

Realización 13. El método de la realización 12 en el que el agente es un anticuerpo.

Realización 14. El método de la realización 13, en el que el anticuerpo es MEDI-545.

Realización 15. El método de la realización 13, en el que el anticuerpo es específico para uno o más subtipos de IFN de tipo I o IFNα, pero no es MEDI-545.

Realización 16. El método de una cualquiera de las realizaciones 1 a 15, en el que la administración del agente alivia uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno.

Realización 17. El método de una cualquiera de las realizaciones 13 a 16, en el que el anticuerpo se administra a una dosis comprendida entre aproximadamente 0,03 y 30 mg/kg.

Realización 18. El método de la realización 17, en el que el anticuerpo se administra a una dosis comprendida entre 0,3 y 3 mg/kg o entre 0,03 y 1 mg/kg.

Realización 19. El método de una cualquiera de las realizaciones 1 a 18, en el que el agente neutraliza el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα del paciente en al menos un 10 %, en al menos un 20%, en al menos un 30%, en al menos un 40% o en al menos un 50%.

Realización 20. El método de una cualquiera de las realizaciones 1 a 19, en el que la enfermedad o trastorno es uno de lupus, nefritis lúpica, dermatomiositis, polimiositis, psoriasis, SSc, vasculitis, sarcoidosis, síndrome de Sjogren o miositis inflamatoria idiopática.

Realización 21. El método de la realización 20, en el que la enfermedad o trastorno es lupus.

Realización 22. El método de la realización 20, en el que la enfermedad o trastorno es psoriasis.

Realización 23. El método de una cualquiera de las realizaciones 1 a 22, en el que el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα comprende la expresión o actividad regulada positivamente de al menos los subtipos de IFNα 1, 2, 8 y 14.

Realización 24. Un método para supervisar o pronosticar la progresión de una enfermedad autoinmunitaria de un paciente que comprende:

obtener un primer perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα en una primera muestra de un paciente.

Realización 25. El método de la realización 24, en el que el primer perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα es un perfil fuerte y el pronóstico del paciente es progresión de la enfermedad.

Realización 26. El método de la realización 25, en el que la enfermedad autoinmunitaria es LES y la progresión es un brote de LES.

Realización 27. El método de la realización 26, en el que el primer perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα es un perfil débil y el pronóstico del paciente es regresión de la enfermedad.

Realización 28. El método de la realización 24, que además comprende:

obtener un segundo perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα en una segunda muestra de un paciente;

en el que un aumento en el número o nivel de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα en el segundo perfil de expresión con respecto al primero sirve de pronóstico para la progresión de la enfermedad; o

en el que una reducción en el número o nivel de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα en el segundo perfil de expresión con respecto al primero sirve de pronóstico de regresión de la enfermedad.

Realización 29. El método de una cualquiera de las realizaciones 26 a 28, en el que el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα comprende transcritos de genes de marcadores PD.

Realización 30. El método de una cualquiera de las realizaciones 24 a 28, en el que el tipo de perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα comprende polipéptidos expresados a partir de genes de marcadores PD.

Realización 31. El método de una cualquiera de las realizaciones 24 a 28, en el que el tipo de perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα comprende la expresión o actividad de un conjunto de genes elegidos entre:

(a): IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(b): IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(c): IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(d): IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2;

(e): IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; y

(f): IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Realización 32. El método de una cualquiera de las realizaciones 24 a 28, en el que el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα consiste en la expresión o actividad de un conjunto de genes elegidos entre:

(a): IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(b): IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(c): IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(d): IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2;

(e): IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; y

(f): IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Realización 33. Un método para supervisar la progresión de la enfermedad de un paciente que recibe tratamiento con un agente terapéutico que se une a y modula la actividad de IFNα, que comprende:

obtener un primer perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα en una primera muestra del paciente;

administrar un agente terapéutico que se une a y modula la actividad del IFNα;

obtener un segundo perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα en una segunda muestra del paciente; y

comparar el primer y el segundo perfiles de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα,

en el que una variación en el primer y el segundo perfiles de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα indica un nivel de eficacia del agente terapéutico que se une a y modula la actividad de IFNα.

Realización 34. El método de la realización 33, en el que el primer perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα comprende la expresión o actividad regulada positivamente de un conjunto de genes elegidos entre:

(a): IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(b): IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(c): IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(d): IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2;

(e): IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; y

(f): IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Realización 35. El método de la realización 33, en el que el primer perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFN de tipo I o IFNα consiste en la expresión o actividad regulada positivamente de un conjunto de genes elegidos entre:

(a): IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(b): IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(c): IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(d): IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2;

(e): IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; y

(f): IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Realización 36. El método de la realización 34 o 35, en el que la variación es una reducción en la expresión regulada positivamente de los niveles de actividad de los genes.

Realización 37. El método de una cualquiera de las realizaciones 33 a 35, en el que la enfermedad o trastorno es uno de lupus, nefritis lúpica, dermatomiositis, polimiositis, psoriasis, SSc, vasculitis, sarcoidosis, síndrome de Sjogren o miositis inflamatoria idiopática.

Realización 38. El método de la realización 37, en el que la enfermedad es lupus.

Realización 39. El método de una cualquiera de las realizaciones 33 a 38, en el que el agente terapéutico es una molécula pequeña o un agente biológico.

Realización 40. El método de la realización 39, en el que el agente biológico es un anticuerpo.

Realización 41. El método de la realización 40, en el que el anticuerpo es MEDI-545 y/o un anticuerpo específico para uno o más subtipos de IFN de tipo I o IFNα, pero no es MEDI-545.

Realización 42. El método de una cualquiera de las realizaciones 33 a 41, en el que el primer perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα se obtiene antes de la administración del agente terapéutico.

Realización 43. El método de una cualquiera de las realizaciones 33 a 41, en el que el primer perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα se obtiene en el momento de la administración del agente terapéutico.

Realización 44. El método de una cualquiera de las realizaciones 33 a 43, en el que la primera y la segunda muestra son sangre entera o suero.

Realización 45. El método de una cualquiera de las realizaciones 33 a 44, que comprende además obtener un tercer perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα en una tercera muestra del paciente.

Realización 46. El método de la realización 45, que comprende además obtener un cuarto perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα en una cuarta muestra del paciente.

Realización 47. El método de la realización 46, que comprende además obtener un quinto perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα en una quinta muestra del paciente.

Realización 48. El método de la realización 47, que comprende además obtener un sexto perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα en una sexta muestra del paciente.

Realización 49. El método de una cualquiera de las realizaciones 33 a 48, en el que la segunda muestra se obtiene al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas, al menos un mes o al menos dos meses después de la administración del agente terapéutico.

Realización 50. El método de la realización 45, en el que la tercera muestra se obtiene al menos 2 días, al menos 5 días, al menos una semana, al menos 2 semanas, al menos tres semanas, al menos un mes o al menos dos meses después de obtener la segunda muestra.

Realización 51. El método de la realización 46, en el que la cuarta muestra se obtiene al menos dos días, al menos cinco días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas, al menos un mes o al menos dos meses después de obtener la tercera muestra.

Realización 52. El método de la realización 47, en el que la quinta muestra se obtiene al menos dos días, al menos cinco días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas, al menos un mes o al menos dos meses después de obtener la cuarta muestra.

Realización 53. El método de una cualquiera de las realizaciones 33 a 52, en el que la variación es una reducción en la expresión o actividad regulada positivamente del gen.

Realización 54. El método de la realización 53, en el que la reducción es al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

Realización 55. Un método para identificar a un paciente como candidato de un agente terapéutico que se une a y modula la actividad de IFNα, que comprende:

detectar la presencia o ausencia de un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα en una muestra del paciente,

en el que la detección de la presencia del perfil de expresión de marcadores PD inducidos por IFNα identifica al paciente como un candidato para el agente terapéutico que se une a y modula la actividad de IFNα.

Realización 56. El método de la realización 55, en el que el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα comprende la expresión o actividad regulada positivamente de un conjunto de genes elegidos entre:

(a): IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(b): IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(c): IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(d): IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2;

(e): IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; y

(f): IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Realización 57. El método de la realización 55, en el que el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα consiste en la expresión o actividad regulada positivamente de un conjunto de genes elegidos entre:

(a): IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(b): IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(c): IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(d): IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2;

(e): IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; y

(f): IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Realización 58. El método de la realización 56 o 57, en el que la expresión o actividad regulada positivamente de un conjunto de genes se calcula como un promedio de aumento en veces en la expresión o actividad del conjunto de genes.

Realización 59. El método de la realización 58, en el que el promedio de aumento en veces en la expresión o actividad del conjunto de genes es al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3 y al menos aproximadamente 4.

Realización 60. El método de la realización 59, en el que el promedio de aumento en veces en la expresión o actividad del conjunto de genes es al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 2,5, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 3,5, al menos aproximadamente 4, al menos, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 5,5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 6,5, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 7,5, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10.

Realización 61. El método de una cualquiera de las realizaciones 55 a 60, en el que al paciente se le ha diagnosticado un trastorno elegido entre lupus, nefritis lúpica, dermatomiositis, polimiositis, psoriasis, SSc, vasculitis, sarcoidosis, síndrome de Sjogren o miositis inflamatoria idiopática.

Realización 62. El método de la realización 61, en el que el trastorno es lupus.

Realización 63. El método de una cualquiera de las realizaciones 55 a 62, en el que el agente terapéutico es una molécula pequeña o un agente biológico.

Realización 64. El método de la realización 63, en el que el agente biológico es un anticuerpo.

Realización 65. El método de la realización 64, en el que el anticuerpo es MEDI-545.

Realización 66. El método de la realización 64, en el que el anticuerpo es específico para uno o más subtipos de IFN de tipo I o IFNα, pero no es MEDI-545.

Realización 67. El método de una cualquiera de las realizaciones 55 a 66, en el la expresión o actividad regulada positivamente comprende un aumento en los niveles de ARNm de uno o más de los genes.

Realización 68. El método de una cualquiera de las realizaciones 55 a 66, en el que la expresión o actividad regulada positivamente comprende un aumento en los niveles de proteína de uno o más de los genes.

Realización 69. El método de una cualquiera de las realizaciones 55 a 66, en el que la expresión o actividad regulada positivamente comprende un aumento en la actividad enzimática de una proteína expresada a partir de uno o más de los genes.

Realización 70. El método de una cualquiera de las realizaciones 55 a 69, en el que la muestra es sangre entera.

Realización 71. Un método para diagnosticar un trastorno asociado con un aumento de los niveles de IFNα en un paciente, que comprende:

en el que la detección de la presencia del perfil de expresión de marcadores PD inducidos por IFNα identifica al paciente como un paciente que tiene un trastorno asociado con niveles aumentados de IFNα.

Realización 72. El método de la realización 71, en el que el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα comprende la expresión o actividad regulada positivamente de un conjunto de genes elegidos entre:

(a): IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(b): IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(c): IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(d): IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2;

(e): IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; y

(f): IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Realización 73. El método de la realización 71, en el que el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα consiste en la expresión o actividad regulada positivamente de un conjunto de genes elegidos entre:

(a): IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(b): IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(c): IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(d): IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2;

(e): IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; y

(f): IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Realización 74. El método de la realización 72 o 73, en el que la expresión o actividad regulada positivamente de un conjunto de genes se calcula como un promedio de aumento en veces en la expresión o actividad del conjunto de genes.

Realización 75. El método de la realización 74, en el que el promedio de aumento en veces en la expresión o actividad del conjunto de genes está comprendido entre al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3 y al menos aproximadamente 4.

Realización 76. El método de la realización 74, en el que el promedio de aumento en veces en la expresión o actividad del conjunto de genes es al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 2,5, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 3,5, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 4,5, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 5,5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 6,5, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9 o al menos aproximadamente 10.

Realización 77. El método de una cualquiera de las realizaciones 72 a 76, en el que la enfermedad o trastorno es uno de lupus, nefritis lúpica, dermatomiositis, polimiositis, psoriasis, SSc, vasculitis, sarcoidosis, síndrome de Sjogren o miositis inflamatoria idiopática.

Realización 78. El método de la realización 77, en el que el trastorno es lupus.

Realización 79. El método de una cualquiera de las realizaciones 72 a 78, en el que la expresión o actividad regulada positivamente comprende un aumento en los niveles de ARNm de uno o más de los genes.

Realización 80. El método de una cualquiera de las realizaciones 72 a 78, en el que la expresión o actividad regulada positivamente comprende un aumento en los niveles de proteína de uno o más de los genes.

Realización 81. El método de una cualquiera de las realizaciones 72 a 78, en el que la expresión o actividad regulada positivamente comprende un aumento en la actividad enzimática de una proteína expresada a partir de uno o más de los genes.

Realización 82. Un método para identificar un agente terapéutico candidato para tratar trastornos mediados por IFNα, que comprende:

poner en contacto células que comprenden un perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα con un agente; y

detectar la presencia o ausencia de un cambio en el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα de las células,

en el que la presencia de un cambio que comprende una reducción en la regulación positiva de los genes del perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα indica que el agente es un agente terapéutico candidato.

Realización 83. El método de la realización 82, en el que el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα comprende la expresión o actividad regulada positivamente de un conjunto de genes elegidos entre:

(a): IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(b): IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(c): IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(d): IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2;

(e): IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; y

(f) IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Realización 84. El método de la realización 82, en el que el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα consiste en la expresión o actividad regulada positivamente de un conjunto de genes elegidos entre:

(a): IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(b): IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(c): IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2;

(d): IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2;

(e): IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; y

(f): IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Realización 85. El método de la realización 83 u 84, en el que la expresión o actividad regulada positivamente de un conjunto de genes se calcula como un promedio de aumento en veces en la expresión o actividad del conjunto de genes.

Realización 86. El método de la realización 85, en el que el promedio de aumento en veces en la expresión o actividad del conjunto de genes está comprendido entre al menos aproximadamente 3 y al menos aproximadamente 15, entre al menos aproximadamente 3 y al menos aproximadamente 10 o entre al menos aproximadamente 3 y al menos aproximadamente 5.

Realización 87. El método de la realización 85, en el que el promedio de aumento en veces en la expresión o actividad del conjunto de genes es al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 2,5, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 3,5, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 4,5, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 5,5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 6,5, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9 o al menos aproximadamente 10.

Realización 88. El método de una cualquiera de las realizaciones 83 a 87, en el que las células se obtienen a partir de un paciente que comprende un trastorno asociado con niveles aumentados de IFNα.

Realización 89. El método de una cualquiera de las realizaciones 83 a 87, en el que las células son células tratadas con IFNα para inducir el perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα.

Realización 90. El método de una cualquiera de las realizaciones 83 a 89, en el que la regulación positiva de los genes del perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα comprende un aumento en los niveles de ARNm de uno o más de los genes.

Realización 91. El método de una cualquiera de las realizaciones 83 a 89, en el que la regulación positiva de los genes del perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα comprende un aumento en los niveles de proteína de uno o más de los genes.

Realización 92. El método de una cualquiera de las realizaciones 83 a 89, en el que la regulación positiva de los genes del perfil de expresión de marcadores PD inducibles por IFNα comprende un aumento en la actividad enzimática de una proteína expresada a partir de uno o más de los genes.

Realización 93. Un conjunto de cebadores que comprende polinucleótidos que amplifican y detectan específicamente la expresión de uno cualquiera de los siguientes conjuntos de genes:

(a): IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o

(b): IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o

(c): IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o

(d): IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2; o

(e): IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; o

(f): IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Realización 94. El conjunto de cebadores de la realización 93 que comprende además cebadores para amplificar y detectar 18S, ACTB y GAPDH.

Realización 95. Un conjunto de cebadores que consiste en polinucleótidos que detectan específicamente la expresión de uno cualquiera de los conjuntos de genes:

(a): IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o

(b): IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o

(c): IFI27, IFI44L, IFI6 y RSAD2; o

(d): IFI27, IFI44, IFI6 y RSAD2; o

(e): IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2; o

(f): IFI27, IFI44, IFI44L e IFI6.

Realización 96. Las realizaciones 93 y 94, en las que el conjunto de cebadores tiene secuencias de SEQ ID NO 1-24. Realización 96. Cualquiera de las realizaciones 1-95, en las que IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2 tienen las

secuencias de SEQ ID NO: 25-32. Realización 97. Un kit que comprende los cebadores de las realizaciones 93-96. Realización 98. Cualquiera de las realizaciones 1-96, en las que la expresión aumentada es la media o mediana

de la expresión aumentada en los niveles de ARNm de IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2. Realización 99. Un método para identificar a un sujeto adecuado para el tratamiento con un agente terapéutico que modula la actividad del interferón de tipo 1, que comprende detectar niveles aumentados de ARNm de al

menos cuatro de IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2 en una muestra del sujeto, en el que un aumento en el ARNm de al menos aproximadamente cuatro veces indica un sujeto adecuado para el tratamiento con el agente. Realización 100. El método de la realización 99, en el que el ARNm está aumentado con respecto al ARNm de al

menos cuatro de IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2 en muestras reunidas procedentes de pacientes sanos.

Realización 101. El método de cualquiera de las realizaciones 99 o 100, en el que el nivel aumentado de ARNm está aumentado con respecto al ARNm de uno o más genes de control presentes en la muestra. Realización 102. El método de cualquiera de las realizaciones 99-101, en el que dichos uno o más genes de

control se eligen entre ACTB, GAPDH y ARNr 18S.

Realización 103. El método de cualquiera de las realizaciones 99-102, en el que se detecta un nivel aumentado de ARNm de IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2. Realización 104. El método de cualquiera de las realizaciones 99-103, en el que el agente se elige entre un

anticuerpo anti-interferón alfa y un anticuerpo anti-receptor de interferón alfa.

Realización 105. El método de la realización de cualquiera de 99 a 104, en el que el anticuerpo anti-interferón es sifalimumab. Realización 106. El método de la realización de cualquiera de 99-105, en el que el anticuerpo anti-interferón no

es sifalimumab. Realización 107. El método de la realización de cualquiera de 99-106, en el que la detección del ARNm de al

menos IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2 comprende 1) aislar ARN a partir de una muestra obtenida del sujeto; 2) sintetizar ADNc a partir del ARN; 3) hibridar el ADNc con oligonucleótidos que hibridan con secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NO:

25-32; y 4) amplificar el ADNc y detectar los productos amplificados.

Realización 108. El método de la realización de cualquiera de 99-107, en el que los oligonucleótidos se eligen entre oligonucleótidos que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 13-24.

Realización 109. Un método para identificar a un sujeto adecuado para el tratamiento con un agente terapéutico que modula la actividad del interferón de tipo 1, que comprende detectar un nivel aumentado de ARNm de al menos cuatro de IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2 en una muestra del sujeto, en el que el nivel aumentado de ARNm se calcula de acuerdo con el siguiente algoritmo:

en el que

15 y en el que un ΔCtIFN de aproximadamente 7,6 indica un sujeto adecuado para el tratamiento con el agente.

Realización 110. El método de la realización de cualquiera de 99-109, en el que el agente se elige entre un anticuerpo anti-interferón alfa y un anticuerpo anti-receptor de interferón alfa.

20 Realización 111. El método de la realización de cualquiera de 99-110, en el que el anticuerpo anti-interferón es sifalimumab.

Realización 112. El método de la realización de cualquiera de 99-111, en el que el anticuerpo anti-interferón no es sifalimumab.

25 Realización 113. El método de la realización de cualquiera de 99-112, en el que la detección del ARNm de al menos IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2 comprende:

1) aislar ARN a partir de una muestra obtenida del sujeto;

30 2) sintetizar ADNc a partir del ARN; 3) hibridar el ADNc con oligonucleótidos que hibridan con secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 25-35; y 4) amplificar el ADNc y detectar los productos amplificados.

35 Realización 114. El método de la realización de cualquiera de 99-113, en el que los oligonucleótidos se eligen entre oligonucleótidos que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 1-24.

Realización 115. Un método para tratar a un sujeto con un agente terapéutico que modula la actividad del interferón de tipo 1 que comprende:

40 a) identificar un sujeto adecuado para el tratamiento mediante la detección de niveles aumentados de ARNm de al menos cuatro de IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2 en una muestra del sujeto, en el que un aumento en el ARNm de al menos 4 veces indica un sujeto adecuado para el tratamiento; y b) administrar el agente terapéutico.

45 Realización 116. El método de la realización de cualquiera de 99-115, en el que el aumento de ARNm es con respecto al ARNm de al menos cuatro de IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2 en muestras reunidas procedentes de pacientes sanos.

50 Realización 117. El método de la realización de cualquiera de 99-116, en el que el aumento de ARNm es con respecto al ARNm de uno o más genes de control presentes en la muestra.

Realización 118. El método de la realización de cualquiera de 99-117, en el que dichos uno o más genes de control se eligen entre ACTB, GAPDH y ARNr 18S.

55 Realización 119. El método de la realización de cualquiera de 99-118, en el que se detecta un aumento de ARNm de IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2.

Realización 120. El método de la realización de cualquiera de 99-119, en el que el agente se elige entre un 60 anticuerpo anti-interferón alfa y un anticuerpo anti-receptor del interferón alfa.

Realización 121. El método de la realización de cualquiera de 99-120, en el que el anticuerpo anti-interferón es sifalimumab. Realización 122. El método de la realización de cualquiera de 99-121, en el que el anticuerpo anti interferón no

5 es sifalimumab. Realización 123. El método de la realización de cualquiera de 99-122, en el que la detección del ARNm de al menos IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2 comprende

10 1) aislar ARN a partir de una muestra obtenida del sujeto; 2) sintetizar ADNc a partir del ARN; 3) hibridar el ADNc con oligonucleótidos que hibridan con secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NO:

15 25-32; y 4) amplificar el ADNc y detectar los productos amplificados. Realización 124. El método de la realización de cualquiera de 99-123, en el que los oligonucleótidos se eligen 20 entre oligonucleótidos que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 13-24. Realización 125. Un método para identificar un sujeto adecuado para el tratamiento con un agente terapéutico que modula la actividad del interferón de tipo 1 que comprende 25 a) detectar un aumento de ARNm de al menos cuatro de IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2 en una muestra del sujeto, en el que el aumento del ARNm se calcula de acuerdo con el siguiente algoritmo

30 en el que

y en el que un ΔCtIFN de aproximadamente 7,6 indica un sujeto adecuado para el tratamiento con un agente 35 terapéutico que modula la actividad de IFNα; y b) administrar el agente terapéutico.

Realización 126. El método de la realización de cualquiera de 99-125, en el que el agente se elige entre un anticuerpo anti-interferón alfa y un anticuerpo anti-receptor del interferón alfa.

40 Realización 127. El método de la realización de cualquiera de 99-126, en el que el anticuerpo anti-interferón es sifalimumab.

Realización 128. El método de la realización de cualquiera de 99-127, en el que el anticuerpo anti-interferón no 45 es sifalimumab.

Realización 129. El método de la realización de cualquiera de 99-128, en el que la detección del ARNm de al menos IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2 comprende:

50 1) aislar ARN a partir de una muestra obtenida del sujeto; 2) sintetizar ADNc a partir del ARN; 3) hibridar el ADNc con oligonucleótidos que hibridan con secuencias de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2535; y 4) amplificar el ADNc y detectar los productos amplificados.

55 Realización 130. El método de la realización de cualquiera de 99-129, en el que los oligonucleótidos se eligen entre oligonucleótidos que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 1-24.

El conjunto de ejemplos que se presentan a continuación se proporcionan solo con fines ilustrativos y la divulgación 60 no debe considerarse limitada por estos ejemplos.

Ejemplos

IX.: Ejemplo 1: desarrollo de un ensayo de diagnóstico para agentes terapéuticos anti-IFN alfa

A.: Antecedentes

Se usó el perfilado de expresión génica para identificar genes farmacodinámicos (PD) cuyos transcritos satisfacen tres criterios de selección. Específicamente, son 1) inducibles por subtipos de IFN de tipo 1, 2) están reprimidos en el suero de pacientes con LES por MEDI-545 y 3) están sobreexpresados en pacientes con LES en comparación con donantes sanos normales. Dichos genes incluyen los presentados en la Solicitud Internacional n.º PCT/US2007/024947, presentada el 6 de diciembre de 2007, en la Solicitud Internacional n.º PCT/US2008/062646, presentada el 5 de mayo de 2008, en la Solicitud Internacional n.º PCT/US2009/033407, presentada el 6 de febrero de 2009 (que se refiere a perfiles de marcadores de miARN y perfiles de marcadores PD inducidos por IFN de tipo 1

o IFNα en enfermedades inflamatorias o autoinmunitarias) y en la Solicitud Internacional n.º PCT/US2009/048028, presentada el 19 de junio de 2009.

Los estudios previos permitieron la identificación de grupos de genes que pueden usarse como “firmas” de enfermedades, tales como LES. Por ejemplo, previamente se identificó una firma de 21 genes para LES y otras enfermedades autoinmunitarias. Véase la Solicitud Internacional n.º PCT/US2007/024947, presentada el 6 de diciembre de 2007. Se quiso determinar si podría usarse de manera fiable un subconjunto de los 21 genes para identificar pacientes que padezcan enfermedades autoinmunitarias, tales como LES. Además, se quiso determinar si podría usarse un subconjunto de los 21 genes como firma para determinar si un paciente respondería a un agente terapéutico que modula el interferón de tipo 1, tal como, por ejemplo, anticuerpos anti-interferón alfa o anticuerpos anti-receptor de interferón.

Para determinar si podría usarse un subconjunto de los 21 genes para identificar pacientes, se analizaron datos de expresión génica de pacientes implicados en ensayos clínicos en curso de MEDI-545. Se administró MEDI-545 a pacientes con LES siguiendo protocolos clínicos convencionales. El resultado clínico se evaluó usando métodos de evaluación de LES convencionales tales como los índices Safety of Estrogens in Lupus Erythematosus-Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SELENA-SLEDAI), the British Isles Lupus Activity Group y el Physician Global Assessment (MDGA). El perfilado de expresión génica de las muestras de los pacientes se realizó usando genoma humano de Affymetrix U133 más 2.0 GeneChips® para identificar genes candidatos.

Como se analiza más adelante, este análisis condujo a la identificación de un conjunto de genes de diagnóstico (por ejemplo, un ensayo basado en 4 o 5 genes) para la identificación de pacientes (por ejemplo, pacientes con LES o miositis) para su tratamiento con un agente terapéutico anti-IFN alfa o anti interferón de tipo I. Específicamente, se seleccionó el conjunto de genes de diagnóstico por su capacidad para predecir la respuesta a sifalimumab (MEDI545) en pacientes con LES. Como resultado, la medición de la expresión de estos cuatro genes puede usarse para predecir pacientes con LES que se beneficiarán o no del tratamiento con sifalimumab. Como se detalla más adelante, puede usarse la expresión de los cuatro genes en una diversidad de situaciones y para identificar pacientes adecuados para el tratamiento con terapias dirigidas contra esas enfermedades. Un grupo de cinco genes adecuados para el ensayo de diagnóstico consiste en IFI44, IFI44L, IFI27, RSAD2 e IFI6. Pueden ser adecuados 4 genes cualesquiera seleccionados de este grupo para un ensayo de diagnóstico. El grupo de genes para el que se proporcionan los datos analíticos en la Tabla 1 y en las Figuras 1 y 2 consisten en IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2.

B. Principio del Ensayo

El ensayo de diagnóstico se basa en la Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcripción Inversa Cuantitativa (qRT-PCR). Este ensayo amplifica y detecta transcritos que proceden de cuatro genes diana: IFI44, IFI44L, IFI27 y RSAD2. El ensayo de diagnóstico también amplifica y detecta un conjunto de moléculas de ARN endógenas como controles (“genes constitutivos”): ACTB, GAPDH y ARNr 18S. Los genes transcritos se amplifican a partir de muestras de ARN total obtenidas de muestras de sangre entera recogidas de pacientes usando el sistema de ARN en sangre PAXgene™ aclarado (Qiagen, n.º de Cat. del kit 762164; Becton Dickinson, tubos de recogida n.º de Cat. 762165; K042613). El ARN se aísla usando los procedimientos especificados en el kit de ARN en sangre PAXgene™. Los transcritos diana se amplifican usando dos cebadores directo e inverso específicos de la secuencia (no marcados). Cada diana amplificada se detecta usando una sonda específica de secuencia que se marca con un resto indicador fluorescente, FAM, y un resto de inactivador de la fluorescencia, BHQ1. Cada diana se amplifica y se detecta en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. Se realiza una determinación cuantitativa de la cantidad de cada transcrito en una muestra basándose en la detección de fluorescencia en el instrumento de PCR en Tiempo Real 7500 Fast Dx de Applied Biosystems, un sistema de ensayo clínico múltiplex (Applied Biosystems, Foster City, CA, n.º de Cat. 4406985; K082562) con la versión de software SDS 1.4.

La medición cuantitativa da como resultado la determinación de un valor de ciclo umbral (Ct) para cada diana que corresponde a la abundancia relativa del transcrito en la muestra de ARN. El Ct se determina midiendo el aumento geométrico en la señal de fluorescencia que resulta de la liberación de la proximidad del indicador-inactivador por la actividad exonucleasa 5’-3’ de la polimerasa durante la fase de elongación de cada ciclo de amplificación. Los

valores Ct cuantitativos para cada gen y control se usan para calcular el nivel de sobreexpresión de genes diana en sujetos que padecen enfermedades autoinmunitarias con respecto a sujetos sanos. El nivel de sobreexpresión puede expresarse como un cambio medio en veces en el nivel de ARNm de los genes diana en un sujeto que padece una enfermedad autoinmunitaria con respecto al nivel medio de los genes en un sujeto sano o puede expresarse como una puntuación de la sobreexpresión de los genes inducibles por Interferón de Tipo I.

Específicamente, la puntuación (ΔCtIFN) (“delta Ct”) se calcula como la diferencia entre el valor medio de Ct para los cuatro genes diana y el valor medio de Ct de los tres genes de control de acuerdo con el siguiente algoritmo.

15 Después se usa esta puntuación para determinar un resultado de ensayo cualitativo en el que una puntuación mayor

o igual a un límite es un resultado de ensayo positivo y una puntuación menor que un límite es un resultado de ensayo negativo. Un resultado negativo indica que no es probable que un paciente responda al tratamiento con sifalimumab (No Respondedor) y un resultado positivo indica que es probable que un paciente responda al

20 tratamiento con sifalimumab (Respondedor).

C. Etapas de ensayo

1. Preparación del ARN

25 Se prepara ARN total a partir de sangre entera, usando el Sistema de ARN en sangre PAXgene™ aclarado (Qiagen, n.º de Cat. del kit 762164, Becton Dickinson, tubos de recogida n.º de Cat. 762165; K042613) y proporciona el molde para la síntesis de ADNc. Se ensayan el rendimiento y la calidad del ARN por espectrofotometría midiendo la absorbancia a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm. El rendimiento de ARN se calcula usando la fórmula C

30 (mg/ml) = A280/0,025. Además, se evalúa la pureza del ARN usando la relación de la absorbancia a 260 nm y a 280 nm. El intervalo aceptable de la relación A260/A280 es ≥ 1,6.

2. Síntesis de ADNc y amplificación de la diana

35 Se sintetiza ADNc a partir de ARN total purificado usando la Mezcla de Enzima RT líquida y el Tampón RT que contiene los cebadores de RT y nucleótidos. La síntesis de ADNc usa una estrategia de cebado aleatorio usando cebadores de RT que son una mezcla de hexadecámeros aleatorios que hibridan con las moléculas de ARN y sirven como sustrato para las Enzimas RT. El ADNc resultante contiene una mezcla proporcional de ADN que representa las secuencias presentes en la muestra de ARN.

40 Los transcritos diana se amplifican y detectan simultáneamente usando el tampón de qPCR, el cebador y sondas de genes y polimerasa AmpliTaq Gold de calidad clínica. Durante cada ciclo de amplificación, dos cebadores directo e inverso específicos de secuencia (no marcados) hibridan con moldes de ADNc complementarios durante la fase de hibridación y sirven como sustrato para la polimerasa AmpliTaq Gold durante la fase de alargamiento, dando como

45 resultado la producción de una nueva cadena de ADN complementaria a la diana. Cada uno de los cebadores directo e inverso hibridan con una cadena con sentido o antisentido diferente. La detección de cada diana amplificada se realiza usando una sonda específica de secuencia que está marcada con un resto indicador fluorescente, FAM, y un resto inactivador de la fluorescencia, BHQ1, que hibrida con la secuencia diana complementaria durante la fase de hibridación. Cada diana se amplifica y detecta en pocillos individuales de una

50 placa de 96 pocillos.

Protocolo de ciclos Térmicos

37 ºC durante 15 min

95 ºC durante 10 min

95 ºC durante 15 s: 50 ciclos

60 ºC durante 1 min

Protocolo de ciclos Térmicos

modo de ensayo del aparato de ciclos térmicos 7500: estándar

3. Detección de la señal

Se realiza una determinación cuantitativa de la cantidad de cada transcrito en una muestra basándose en la

5 detección de fluorescencia en el instrumento de PCR de Tiempo Real 7500 Fast Dx de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA, n.º de Cat. 4406985; K082562) con la versión de software SDS 1.4, lo cual da como resultado la determinación de un valor de ciclo umbral (Ct) para cada diana que corresponde a la abundancia relativa del transcrito en la muestra de ARN. El instrumento determina el Ct midiendo el aumento geométrico en la señal de fluorescencia que resulta de la liberación de proximidad de indicador-inactivador por la actividad

10 exonucleasa 5’-3’ de la polimerasa durante la fase de alargamiento de cada ciclo de amplificación. Los valores Ct cuantitativos para cada gen y control se usan para calcular una puntuación de sobreexpresión de los genes inducibles por Interferón de Tipo I.

4. Controles de ensayo

15 Los controles de ARN de transcrito in vitro (IVT) (cada uno de los cuatro genes diana y los controles del gen constitutivos) opcionalmente incluidos con cada ensayo están diseñados para detectar posibles errores del usuario, contaminación, reacciones cruzadas y/o fallos del ensayo durante las etapas de transcripción inversa, síntesis de ADNc, PCR, hibridación y/o detección. Los resultados del control se usan como controles de validez para validar o

20 invalidar un ensayo dado. No se usan para validar el aislamiento de ARN, que se realiza con el Sistema de ARN de sangre PAXgene™ aclarado y se controlan mediante una comprobación de la calidad del ARN. Puede incluirse un control negativo y un control bajo positivo, próximo al límite.

5. Software

25 Se usa un software para calcular el delta Ct usando la ecuación descrita anteriormente. Después, se usa el delta Ct para determinar un resultado de ensayo cualitativo en el que una puntuación mayor o igual a un límite es un resultado de ensayo positivo y una puntuación menor que el límite es un resultado de ensayo negativo. Un resultado negativo indica que no es probable que un paciente responda al tratamiento con sifalimumab (No Respondedor) y un

30 resultado positivo indica que es probable que un paciente responda al tratamiento con sifalimumab (Respondedor).

6. Componentes del kit de ensayo

Uso: Componentes

Tampón de RT

Reactivos de RT: Mezcla de enzima RT

Diluyente

Tampón de qPCR

Reactivos de Amplificación de ADN: Cebadores oligonucleotídicos y sondas para IFI44, IFI44L, IFI27 RSAD2 y cebadores oligonucleotídicos y sondas para Tres Genes de Control Genes (18S, ACTB y GAPDH)

Polimerasa AmpliTaq Gold

Control Positivo

Controles: Control Negativo

NTC

35 7. Oligonucleótidos para amplificar y detectar simultáneamente genes diana

Nombre del Oligo: Diana SEQ ID NO: Secuencia

MEDI_0001-F: 18S SEQ ID NO: 1 GCTACCACATCCAAGGAAGG

MEDI_0001-P: SEQ ID NO: 2 CGCAAATTACCCACTCCCGAC CC

MEDI_0001-R: SEQ ID NO: 3 GCCTCGAAAGAGTCCTGTATT

Nombre del Oligo: Diana SEQ ID NO: Secuencia

MEDI_0002-F: ACTB SEQ ID NO: 4 ACAGAGCCTCGCCTTTG

MEDI_0002-P: SEQ ID NO: 5 AGCTGGCGGCGGGTGTGG

MEDI_0002-R: SEQ ID NO: 6 CCTTGCACATGCCGGAG

MEDI_0003_A-F: GAPDH SEQ ID NO: 7 ACATCGCTCAGACACCATG

MEDI_0003_A-P: SEQ ID NO: 8 CCGTTGACTCCGACCTTCACC TT

MEDI_0003_A-R: SEQ ID NO: 9 ACCAGAGTTAAAAGCAGCCC

MEDI_0003_B-F: GAPDH SEQ ID NO: 10 TGGGTGTGAACCATGAGAAG TATG

MEDI 0003 B-P: SEQ ID NO: 11 CCTCAAGATCATCAGCAATGC CTCCTGCA

MEDI 0003 B-R: SEQ ID NO: 12 CAGGGGTGCTAAGCAGTTGG

MEDI_0004-F: IFI27 SEQ ID NO: 13 CTCTCACCTCATCAGCAGTG

MEDI_0004-P: SEQ ID NO: 14 CCAGAGGCCACCCTGACCAC

MEDI_0004-R: SEQ ID NO: 15 TCACAACTGTAGCAATCCTGG

MEDI_0005-F: IFI44 SEQ ID NO: 16 GATGCGAAGATTCACTGGATG

MEDI_0005-P: SEQ ID NO: 17 AGTTCTCAAGGCAGACAGTA AGCTCTTC

MEDI_0005-R: SEQ ID NO: 18 TGTTGAACCAGGGATCCATAT

MEDI_0006-F: IFI44L SEQ ID NO: 19 AAGCCGTAGTGGGGTCT

MEDI_0006-P: SEQ ID NO: 20 TATACCGCTCGGTTATGCTGG TG

MEDI-0006-R: SEQ ID NO: 21 AACATAAATGGCAGAGATTTT CCA

MEDI_0007-F: RSAD2 SEQ ID NO: 22 AAAGACTCCTACCTTATTCTG GATG

MEDI_0007-P: SEQ ID NO: 23 CTGAACTGTAGAAAGGGACG GAAGGAC

MEDI_0007-R: SEQ ID NO: 24 CTTCTACACCAACATCCAGGA

8. Secuencia de genes diana 15

Nombre de la Diana: SEQ ID NO

IFI27 variante 1: SEQ ID NO: 25

IFI27 variante 2: SEQ ID NO: 26

IFI44: SEQ ID NO: 27

IFI44L: SEQ ID NO: 28

IFI6 variante 1: SEQ ID NO: 29

IFI6 variante 2: SEQ ID NO: 30

IFI6 variante 3: SEQ ID NO: 31

RSAD2: SEQ ID NO: 32

18S: SEQ ID NO: 33

ACTB: SEQ ID NO: 34

GAPDH: SEQ ID NO: 35

X. Ejemplo 2: una diversidad de análisis demuestra que la respuesta a MEDI-545 se correlaciona con la firma de cuatro genes

El valor umbral usado para designar un sujeto de diagnóstico positivo frente a negativo se determinó usando dos métodos primarios. En primer lugar, se evaluó la distribución de la puntuación del cambio en veces de diagnóstico de cuatro genes de 202 sujetos con LES con respecto a la presencia de modas más allá de una sola moda. Dicha distribución multimoda implicaría la presencia de más de una población de puntuación. A partir de esta distribución, se identificaron dos modas distintas y el centroide de la región que discriminaba esas dos modas se encontró a un valor de aproximadamente 4. La distribución muestra que puede usarse un intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 para discriminar las dos modas y, por lo tanto, un límite de cambio en veces medio adecuado puede estar comprendido entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8.

En segundo lugar, se evaluó la distribución de puntuación de cambio en veces de diagnóstico de 24 genes de 24 donantes sanos normales con respecto a los límites superiores en comparación con la distribución de puntuación de LES. La puntuación de cambio en veces de diagnóstico promedio de los 24 donantes sanos es 1,34 con el límite superior (media +2*SD) de 2,91. Como el recuento de sujetos en la población de donantes sanos normales era mucho menor que el recuento de sujetos en nuestra población de enfermedad, se usó una estimación conservativa de la puntuación de diagnóstico de límite superior en los donantes sanos normales que coincidía con los resultados de la distribución de puntuación LES bimodal. De esta manera, se seleccionó un punto de corte de ≥ 4 para estratificar a los pacientes con LES en grupos positivos para el diagnóstico y negativos para el diagnóstico.

Para la población positiva para el diagnóstico, se estratificaron 147 sujetos con LES en este grupo y la media, mediana y desviación típica para las puntuaciones son 36,13, 63,76 y 2,71, respectivamente. Para la población negativa para el diagnóstico, se estratificaron 55 sujetos con LES en este grupo y la media, mediana y desviación típica para las puntuaciones son 0,95, 0,89 y 2,00, respectivamente. Un ensayo t modificado de Welch bilateral de dos muestras indica una diferencia significativa entre los dos grupos a un valor de p de 1,62 x 10-66 .

Se generaron curvas de características operativas del receptor (ROC) usando el criterio de valoración clínico SLEDAI usando la firma de cuatro genes (es decir, firma de IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2) obtenida a partir de los datos del ensayo clínico basado en el cálculo del cambio en veces. La curva se muestra en la Figura 1 usando una caída de SLEDAI de al menos 4 puntos desde el punto de referencia como criterio de valoración, evaluado en los días 182, 196 y 210 después del tratamiento. Basándose en la curva ROC, se seleccionó un punto límite de la media de cambio en veces de ≥ 4 en la expresión para IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2.

Con un punto límite de la medida de cambio en veces ≥ 4, la sensibilidad y especificidad del ensayo es del 87,0 % y del 32,9 %, respectivamente, basándose en los datos obtenidos a partir de muestras de sangre recogidas el día 182 después del tratamiento. El ABC para los datos del día 182 es de 0,59. Con un punto de corte de la medida de cambio en veces ≥ 4, la sensibilidad y especificidad del ensayo es del 85,7 % y 32,8 %, respectivamente, basándose en los datos obtenidos a partir de muestras de sangre recogidas el día 196 después del tratamiento. El ABC para los datos del día 196 es de 0,57. Finalmente, cuando se usa el mismo punto límite, la sensibilidad, especificidad y valores de ABC obtenidos al día 210 después del tratamiento son del 86,0 %, 33,8 % y 0,56, respectivamente.

Cuando se usa la media de sobreexpresión mostrada como cambio en veces para cada uno de los cuatro genes como clasificador para repartir los pacientes con LES en el estado Positivo al Diagnóstico (Respondedor) frente a Negativo al Diagnóstico (No Respondedor), existe una clara separación entre grupos. La distribución de las puntuaciones medias de los cuatro genes en una escala log2 presenta claramente dos modos aparentes, cayendo pocos valores entre ellos. Las Figuras 2A y B muestran la distribución de pacientes en grupos de ensayo positivos y negativos para el diagnóstico usando el diagnóstico de cuatro genes (IFI27, IFI44, IFI44, IFI44L y RSAD2) con un límite de la medida de cambio en veces ≥4.

A. SLENA-SLEDAI ≥ 4

Se reunieron todos los grupos de dosificación de sifalimumab a través de MI-CP 152 y usaron el criterio de valoración clínico de reducción en SELENA-SLEDAI ≥ 4 puntos respecto del punto de referencia (Respondedor SELENA-SLEDAI) para calcular en el día 182 un valor predictivo positivo del 46,6 % (PPV; porcentaje de sujetos que responden entre sujetos Positivos para el Diagnóstico [Dx+]). De forma similar, se calculó un valor predictivo negativo en el día 182 del 82,1 % (NPV, porcentaje de sujetos no respondedores entre sujetos Negativos para el Diagnóstico [Dx-]). Para este mismo criterio de valoración clínico, los valores de sensibilidad y especificidad fueron del 87,0 % y del 32,9 %.

Como se observó una tasa de respuesta al placebo de aproximadamente un 20 % a un 40 %, se consideró adecuado calcular el “delta PPV” y “delta NPV” para calcular un factor en el efecto del placebo sobre las tasas de precisión. El valor delta PPV es la diferencia entre el PPV para los sujetos tratados con sifalimumab (basándose principalmente en los datos de 0,3 y 1,0 mg/kg disponibles en el momento del análisis intermedio) y el PPV para los sujetos tratados con placebo. De forma similar, para el delta NPV, este cálculo consistía en la diferencia entre el NPV para los sujetos tratados con sifalimumab (de nuevo, principalmente los datos de los grupos de 0,3 y 1,0 mg/kg)

y el NPV para los sujetos tratados con placebo. Estos parámetros estadísticos delta PPV/NPV son estimaciones conservativas del PPV y NPV y demuestran el porcentaje de pacientes que responden habiendo recibido un fármaco, en el contexto de los pacientes que responden habiendo recibido placebo. De esta manera, estos parámetros estadísticos muestran el nivel de “interferencias” intrínseco en el estado respondedor. Sin embargo,

5 incluso con estos valores de PPV/NPV ajustados, aún se observa una fuerte tasa de respuesta para los pacientes positivos a Dx tratados con Sifalimumab en comparación a los pacientes negativos a Dx tratados con Sifalimumab.

En la Tabla 1 se muestra un resumen de los resultados

Las Figuras 3A y B muestran datos de un estudio de aumento de la dosis, controlado con placebo, con doble enmascaramiento, aleatorio, multicéntrico de fase 1b, para evaluar múltiples dosis intravenosas de MEDI-545 en pacientes con LES de moderado a gravemente activo. Todos los sujetos con LES tienen una puntuación SLEDAI ≥ 6 antes de la selección. Las Figuras 3A y B muestran el área bajo la curva con ajuste de tiempo menos la puntuación inicial SLEDAI en pacientes con LES positivos o negativos para la firma de cuatro genes (IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2) en cohortes de placebo o de 0,3/1/3/10 mg/kg de MEDI-545. Figura 3A positivo para la firma, Figura 3B negativo para la firma.

No hay patrones de correlación importantes entre el diagnóstico de cuatro genes (es decir la firma de IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2) y las variables demográficas/clínicas primarias de los sujetos en los ensayos clínicos. En la Tabla 2 se proporcionan coeficientes de correlación de Pearson para estas variables primarias.

Tabla 2. Coeficientes de correlación de Pearson para la firma de cuatro genes (es decir, la firma de IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2) y las variables demográficas/clínicas primarias. El día 182 y el día 196 representan patrones de expresión de genes obtenidos a partir de sangre recogida el día 182 y 196, respectivamente, después de la administración de MEDI545.

Variables Demográficas/Clínicas: Día 182 Día 196

Edad: -0,04 -0,04

Peso: 0,11 0,07

Sexo: 0,11 0,10

Raza: -0,09 -0,09

Etnia: -0,14 -0,14

País: -0,11 -0,11

Uso de esteroides inicial: 0,17 0,13

B. Correlación positiva en respuestas a SELDAI, reducción (mejoría) ≥ 4 puntos.

Los datos proceden del ensayo CP152. Se estratificaron sujetos con LES de moderada a gravemente activo mediante la selección de la firma de IFN de tipo I y después se expusieron a placebo o sifalimumab los días 0-182. Se muestra una respuesta SLEDAI, que es una reducción SLEDAI (mejoría en la actividad de la enfermedad) ≥ 4 puntos. Los cuadrados rellenos/líneas continuas representan sujetos expuestos a sifalimumab y los cuadrados blancos/líneas discontinuas representan pacientes con placebo. Las líneas cortas en los días 182-210 solo son valores medios para los días 182-210, la línea continua sin símbolos representa el valor medio para sujetos con sifalimumab y las líneas discontinuas sin símbolos representan valores medios para sujetos con placebo. Se incluyen sujetos que recibieron al menos una dosis de placebo o sifalimumab y que tuvieron una puntuación SLEDAI basal inicial ≥ 6, mostrándose los datos para los sujetos que recibieron 1, 3 o 10 mg/kg de sifalimumab o placebo. Los sujetos que requirieron corticosteroides de rescate a niveles mayores que los permitidos en el protocolo para un aumento en la actividad de la enfermedad en o antes del día 196, se consideran no respondedores en este análisis.

La Figura 4A incluye sujetos con un ensayo de diagnóstico positivo en la selección, con un promedio de respuesta SLEDAI (%) en los días 182-210 del 52,5 % para sujetos con sifalimumab (n = 88) y del 33,9 % para sujetos con placebo (n = 22). La Figura 4B incluye sujetos con un ensayo de diagnóstico negativo en la selección, con una respuesta compuesta promedio en los días 182-210 del 25,7 % para los sujetos con sifalimumab (n = 22) y del 22,2 % para los sujetos con placebo (n = 6).

C. Correlación positiva en la reducción de la respuesta a la firma y SLEDAI. Respuestas de SLEDAI, reducción (mejoría) ≥ 4 puntos, en sujetos Dx+ con ≥ 50 % reducción frente a <50 % reducción después del punto de referencia Dx.

Figuras 5A y B. Los datos proceden del ensayo CP152. Se estratificaron sujetos con LES de moderada a gravemente activa según la firma de IFN de tipo I en la selección y después se expusieron a placebo o sifalimumab en los días 0-182. Se muestra una respuesta SLEDAI, que es una reducción SLEDAI (mejoría en la actividad de la enfermedad) ≥ 4 puntos. Los cuadrados negros/línea continua representan sujetos expuestos a sifalimumab y los cuadrados blancos/líneas discontinuas representan pacientes con placebo. Las líneas cortas en los días 182-210 solo son valores promedio para los días 182-210, la línea continua sin símbolos representa el valor medio para los sujetos con sifalimumab y las líneas discontinuas sin símbolos representan los valores medios para los sujetos con placebo. Se incluyen sujetos que recibieron al menos una dosis de placebo o sifalimumab y una puntuación inicial SLEDAI > 6, mostrándose los datos para los sujetos que recibieron 1, 3 o 10 mg/kg de sifalimumab o placebo. Los sujetos que requirieron corticosteroides de rescate a niveles mayores que los permitidos en el protocolo para un aumento en la actividad de la enfermedad en o antes del día 196, se consideran no respondedores en este análisis.

La Figura 5A incluye sujetos con un ensayo de diagnóstico positivo en la selección y, si se tratan con sifalimumab, tenían una mediana de la reducción > 50 % en la puntuación de la firma de diagnóstico en el punto de referencia después de los días de dosificación 28-210, con una respuesta promedio SLEDAI (%) en los días 182-210 del 66,3 % para los sujetos con sifalimumab (n = 23) y del 33,9 % para los sujetos con placebo (n = 22). La Figura B incluye sujetos con un ensayo de diagnóstico positivo en la selección y, si se tratan con sifalimumab, tenían una mediana de la reducción < 50 % en la puntuación de la firma de diagnóstico en el punto de referencia después de los días de dosificación 28-210, con una respuesta SLEDAI promedio en los días 182-210 del 48,0 % para los sujetos con sifalimumab (n = 23) y del 33,9 % para los sujetos con placebo (n = 22).

D. Correlación positiva en respuesta compuesta y firma

Como se muestra en las Figuras 6A y B, la respuesta compuesta de los sujetos se correlaciona con una puntuación de firma de cuatro genes positiva. Los datos proceden del ensayo CP 152. Se estratificaron sujetos con LES de moderada a gravemente activo por la firma de IFN de tipo I en la selección y después se expusieron a placebo o sifalimumab a dosis de 0,3, 1, 3 o 10 mg/kg IV cada dos semanas, en los días 0-182. Se muestra una respuesta compuesta, que es una reducción SLEDAI (mejoría) ≥ 4 puntos + no más de 1 nueva puntuación BILAG B (una medida de un brote al menos moderado) + ausencia de empeoramiento en la evaluación física global > 0,76 centímetros (0,3 pulgadas) en una escala visual análoga de 7,62 centímetros (3 pulgadas). Los cuadrados negros/línea continua representan sujetos expuestos a sifalimumab y los cuadrados blancos/líneas discontinuas representan pacientes con placebo. Las líneas cortas en los días 182-210 solo son los valores promedio para los días 182-210, representando la línea continua sin símbolos el valor promedio para los sujetos con sifalimumab y representando las líneas discontinuas sin símbolos los valores medios para los sujetos con placebo. Se incluyen sujetos que recibieron al menos una dosis de placebo o sifalimumab y que tuvieron una puntuación SLEDAI en el punto de referencia ≥ 6. Los sujetos que requirieron corticosteroides de rescate a niveles mayores que los permitidos en el protocolo para un aumento en la actividad de la enfermedad en o antes del día 196 se consideran no respondedores en este análisis. La Figura 6A incluye sujetos con un ensayo de diagnóstico positivo en la selección, con respuesta compuesta promedio (%) en los días 182-210 del 46,4 % para los sujetos con sifalimumab (n = 88) y del 36,1 % para los sujetos con placebo (n = 29). La Figura 6B incluye sujetos con un ensayo de diagnóstico negativo en la selección, con una respuesta compuesta promedio los días 182-210 del 19,1 % para los sujetos con sifalimumab (n = 28) y del 14,8 % para los sujetos con placebo (n = 9).

E. Correlación positiva en área bajo la curva SLEDAI menos el punto de referencia

Como se muestra en las Figuras 7A y B, la reducción en el área bajo la curva SLEDAI menos el punto de referencia se correlaciona con una puntuación de firma de cuatro genes positiva. Los datos proceden del ensayo CP152. Se estratificaron sujetos con LES de moderada a gravemente activo por firma de IFN de tipo I basal y después se expusieron a placebo o sifalimumab a dosis de 0,3, 1, 3 o 10 mg/kg IV cada dos semanas, en los días 0-182. Se muestra el área bajo la curva menos el punto de referencia para la puntuación SLEDAI (una medida de la actividad de la enfermedad), indicando los valores negativos mayores una mayor reducción en la actividad de la enfermedad. Los cuadrados negros/línea continua representan sujetos expuestos a sifalimumab y los cuadrados blancos/líneas discontinuas representan pacientes tratados con placebo. Las líneas cortas en los días 182-210 solo son valores promedio para los días 182-210, representando la línea continua sin símbolos el valor promedio para los sujetos con sifalimumab y representando las líneas discontinuas sin símbolos valores medios para los sujetos tratados con placebo. Se incluyen sujetos que recibieron al menos una dosis de placebo o sifalimumab. La Figura 7A incluye sujetos con un ensayo de diagnóstico positivo en la selección, con un área bajo la curva SLEDAI promedio menos el punto de referencia en los días 182-210 de -2,34 para sujetos con sifalimumab (n = 92) y de -1,14 para sujetos con placebo (n = 30). La Figura 7B incluye sujetos con un ensayo de diagnóstico negativo en la selección, con un área bajo la curva SLEDAI promedio menos el punto de referencia en los días 182-210 de -0,46 para los sujetos con sifalimumab (n = 29) y de -0,88 para los sujetos con placebo (n = 10).

F. Correlación positiva en el cambio SLEDAI desde el punto de referencia y firma

Como se muestra en las Figuras 8A y B, la reducción en SLEDAI desde el punto de referencia se correlacionaba con una puntuación de firma de cuatro genes positiva. Los datos proceden del ensayo CP152. Se estratificaron sujetos con LES de moderada a gravemente activo por firma de IFN de tipo I en la selección y después se expusieron a placebo o sifalimumab a dosis de 0,3, 1, 3 o 10 mg/kg IV cada dos semanas, desde los días 0-182. Se muestra una respuesta SLEDAI, que es una reducción SLEDAI (mejoría en la actividad de la enfermedad) ≥ 4 puntos, en sujetos con SLEDAI ≥ 6 en el punto de referencia. Los cuadrados negros/línea continua representan sujetos expuestos a sifalimumab y los cuadrados blancos/líneas discontinuas representan pacientes con placebo. Las líneas cortas en los días 168-210 solo son valores promedio para los días 168-210, representando la línea continua sin símbolos el valor medio para sujetos con sifalimumab y representando las líneas discontinuas sin símbolos los valores promedio para los sujetos con placebo. Sujetos que recibieron al menos una dosis de placebo o sifalimumab. Los sujetos que requirieron corticosteroides de rescate a niveles mayores que los permitidos en el protocolo para un aumento en la actividad de la enfermedad en o antes del día 196 se consideran no respondedores en este análisis. Se muestran sujetos con un ensayo de diagnóstico positivo en el punto de referencia y con una reducción mediana en la firma de IFN de tipo I ≥ 50 % después de la dosificación de los días 28-210. La Figura 8A incluye sujetos que recibieron

sifalimumab a 1 mg/kg IV con una respuesta promedio SLEDAI en los días 168-210 del 53 % para los sujetos con sifalimumab (n = 10) y del 21 % para los sujetos con placebo de la misma cohorte (n = 7). La Figura 8B incluye sujetos que recibieron sifalimumab a 3 mg/kg IV con respuesta SLEDAI promedio los días 168-210 del 63 % para sujetos con sifalimumab (n = 6) y del 33 % para sujetos con placebo de la misma cohorte (n = 6).

G. Inhibición de la firma, respuesta SLEDAI y dosis

Figuras 9 A-C. Los datos proceden del ensayo CP152. Se estratificaron sujetos con LES de moderada a gravemente activo por firma de IFN de tipo I en la selección y después se expusieron a placebo o sifalimumab a dosis de 0,3, 1, 3 o 10 mg/kg IV cada dos semanas, en los días 0-182. Se muestra una respuesta SLEDAI, que es una reducción SLEDAI (mejoría en la actividad de la enfermedad) ≥ 4 puntos, en sujetos con SLEDAI ≥ 6 en el punto de referencia. Los cuadrados negros/línea continua representan sujetos expuestos a sifalimumab y los cuadrados blancos/líneas discontinuas representan pacientes con placebo. Las líneas cortas en los días 168-210 solo son valores promedio para los días 168-210, representando la línea continua sin símbolos el valor medio para los sujetos con sifalimumab y representando las líneas discontinuas sin símbolos los valores promedio para los sujetos con placebo. Sujetos que recibieron al menos una dosis de placebo o sifalimumab. Los sujetos que requirieron corticosteroides de rescate a niveles mayores que los permitidos en el protocolo para un aumento en la actividad de la enfermedad en o antes del día 196 se consideran no respondedores en este análisis. Se muestran los sujetos con un ensayo de diagnóstico positivo en el punto de referencia y con una reducción mediana en la firma de IFN de tipo I ≥ 50 % después de la dosificación de los días 28-210. La Figura 9A incluye sujetos que recibieron sifalimumab a 1 mg/kg IV con una respuesta SLEDAI promedio en los días 168-210 del 53 % para los sujetos con sifalimumab (n = 10) y del 21 % para los sujetos con placebo de la misma cohorte (n = 7). La Figura 9B incluye sujetos que recibieron sifalimumab a 3 mg/kg IV con respuesta SLEDAI promedio en los días 168-210 del 63 % para sujetos con sifalimumab (n = 6) y del 33 % para sujetos con placebo de la misma cohorte (n = 6). La Figura 9C incluye sujetos que recibieron sifalimumab a 10 mg/kg IV con una respuesta SLEDAI promedio en los días 168-210 del 75 % para sujetos con sifalimumab (n = 9) y del 45 % para sujetos con placebo de la misma cohorte (n = 9).

Los datos proceden del ensayo CP152. Se estratificaron sujetos con LES de moderada a gravemente activo por firma de IFN de tipo I en la selección y después se expusieron a placebo o sifalimumab a dosis de 0,3, 1, 3 o 10 mg/kg IV cada dos semanas, en los días 0-182. Se muestra una respuesta SLEDAI, que es una reducción SLEDAI (mejoría en la actividad de la enfermedad) ≥ 4 puntos, en sujetos con SLEDAI basal ≥ 6. Los cuadrados negros/línea continua representan sujetos expuestos a sifalimumab y los cuadrados blancos/líneas discontinuas representan pacientes con placebo. Las líneas cortas en los días 168-210 solo son valores promedio para los días 168-210, representando la línea continua sin símbolos el valor medio para sujetos con sifalimumab y representando las líneas discontinuas sin símbolos valores promedio para sujetos con placebo. Sujetos que recibieron al menos una dosis de placebo o sifalimumab. Los sujetos que requirieron corticosteroides de rescate a niveles mayores que los permitidos en el protocolo para un aumento en la actividad de la enfermedad en o antes del día 196 se consideran no respondedores en este análisis. Se muestran los sujetos con un ensayo de diagnóstico positivo en el punto de referencia y con una reducción mediana en la firma de IFN de tipo I < 50 % después de la dosificación de los días 28-210. La Figura 10A incluye sujetos que recibieron sifalimumab a 1 mg/kg IV con una respuesta SLEDAI promedio en los días 168-210 del 37 % para sujetos con sifalimumab (n = 10) y del 21 % para sujetos con placebo de la misma cohorte (n = 7). La Figura 10B incluye sujetos que recibieron sifalimumab a 3 mg/kg IV con una respuesta SLEDAI promedio en los días 168-210 del 42 % para sujetos con sifalimumab (n = 12) y del 33 % para sujetos con placebo de la misma cohorte (n = 6). La Figura 10C incluye sujetos que recibieron sifalimumab a 10 mg/kg IV con una respuesta SLEDAI promedio en los días 168-210 del 45 % para sujetos con sifalimumab (n = 15) y del 45 % para sujetos con placebo de la misma cohorte (n = 9).

H. Delta Ct con respecto al cambio en veces con respecto a donantes sanos

En los estudios iniciales, se calcularon los cambios en veces usando un grupo de 24 donantes sanos normales como referencia para cada paciente con LES. Sin embargo, se ha descubierto que esta referencia puede tener algunos problemas de confusión, específicamente: 1) podría introducir variación en el ensayo y 2) la fabricación de una referencia artificial con el mismo intervalo dinámico de forma consistente es problemática.

Se realizaron análisis para evaluar la necesidad de esta referencia normal y se descubrió que cuando se comparaban valores de delta Ct con valores de cambio en veces, existe una correlación mayor del 99 % entre los dos (ambos transformados en log2). Por lo tanto, es posible usar el valor delta Ct con los genes constitutivos de las muestras de los pacientes con LES como referencia, y no existe la necesidad de medir o comparar con donantes sanos. Este enfoque puede mejorarse cuando el resultado primario del ensayo de diagnóstico es un resultado cualitativo de positivo o negativo, a diferencia de una puntuación cuantitativa. Nuestros resultados muestran que un límite ≥ 4 en la escala de cambio en veces se traduce en un límite ≥7,6 en la escala de delta Ct.

XI.: Ejemplo 3. Relación entre actividad de la enfermedad y expresión de genes inducibles por interferón de tipo 1 y por otras citocinas en sangre en dermatomiositis y polimiositis

A.: Antecedentes

Se sometió sangre periférica de 42 pacientes con DM o PM a perfilado de expresión génica usando el genoma humano de Affymetrix U133 más 2.0 GeneChips® en un estudio inicial para identificar la prevalencia de pacientes que presentaban sobreexpresión periférica de genes inducibles por IFN de tipo 1. Para obtener una perspectiva científica adicional sobre el IFN de tipo 1 como diana terapéutica potencial para DM y PM, después se incluyeron prospectivamente 24 pacientes con DM o PM y se sometieron a seguimiento durante hasta 6 años (media de 1,9 años) mientras recibían un cuidado clínico convencional.

B. Metodología

Se evaluaron cursos clínicos que incluían la puntuación MITAX (índice de actividad de Intención de Tratamiento de Miositis) de la actividad de la enfermedad a lo largo de 150 visitas de pacientes. Este índice se basa en 6 sistemas u órganos que usa el médico, para cada órgano o sistema, que trataría con altas dosis de esteroides y/o fármacos inmunosupresores. Se usaron muestras de sangre periférica recogidas en 80 visitas de pacientes para el análisis de micromatriz de la expresión de genes inducidos por citocinas para las rutas de señalización de IFN de tipo 1, TNF-α, IL-1β, GM-CSF, IL-10 e IL-13.

C. Resultados

35 de los 42 (87 %) pacientes de DM y PM tuvieron una sobreexpresión moderada/fuerte de genes inducibles por IFN de tipo 1 en sangre periférica. En el estudio longitudinal durante el transcurso de tratamiento, 21 de los 24 pacientes mostraron sobreexpresión de una firma de genes inducibles por IFN de tipo 1 en sangre periférica. Específicamente, la sobreexpresión de IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2 y de una firma compuesta de 13 genes inducibles por IFN de tipo 1 (IFI27, RSAD2, IFI44L, ISG15, OAS3, HERC5, MX1, ESPTI1, IFIT3, IFI44, OAS1, IFIT1 e IFI6) se correlacionaron en gran medida con la actividad de la enfermedad durante el tratamiento. En el caso de 3 pacientes, la sobreexpresión de genes inducibles por IFN de tipo 1 durante el tratamiento precedía a una recaída de la enfermedad en aproximadamente 1 mes. Las firmas de genes inducibles de TNF-α, IL-1β, GM-CSF, IL-10 e IL-13 también se sobreexpresaban en pacientes DM y PM, pero no se correlacionaron con la actividad de la enfermedad.

La determinación como diana del IFN de tipo 1 puede proporcionar efectos clínicos beneficiosos en las poblaciones de pacientes de DM y PM con sobreexpresión de genes inducibles por IFN de tipo 1 en la periferia. La sobreexpresión de genes inducibles por IFN de tipo 1 en sangre periférica merece un estudio adicional para su uso como biomarcador farmacodinámico y predictivo para el desarrollo de una terapia anti-IFN de tipo 1 para estos pacientes. Específicamente, los resultados descritos anteriormente con LES indican que el diagnóstico con cuatro genes permitiría la identificación de pacientes de DM y PM que responderán a la terapia anti-interferón alfa.

XII.: Ejemplo 4: uso de una firma de cuatro o cinco genes para evaluar la presencia y magnitud de la sobreexpresión de genes inducibles por IFN de tipo 1 en sangre entera de pacientes que padecen LES, DM, PM, SSc y AR

A.: Antecedentes

Se emprendieron estudios para determinar si hay un efecto común de activación de la ruta de interferón de tipo I (IFN) en sujetos con lupus eritematoso sistémico (LES), dermatomiositis (DM), polimiositis (PM), artritis reumatoide (AR) y esclerodermia sistémica (SSc).

Se identificaron transcritos sobreexpresados en sangre entera (SE) de 262 sujetos con LES, 44 con DM, 33 con PM, 38 con SSc y 89 con AR y se comparó la expresión con 24 sujetos sanos usando Affymetrix U133 Plus 2.0 Genechip®. La activación de la ruta de IFN de tipo I en SE se evaluó individualmente para cada sujeto usando la firma de cinco genes de IFN de tipo I (IFI27, IFI44, IFI44L, IFI6 y RSAD2), así como en piel lesionada de 16 sujetos con LES y 22 con SSc, biopsias de músculo de 37 sujetos con DM y 36 con PM, y tejido sinovial de 20 sujetos con AR. También se evaluaron otras firmas de genes de citocinas tales como TNF-α, IL1β, IL-10, IL-13, IL-17 y GM-CSF para la activación de rutas en la SE de estos sujetos. Además, se realizó una clasificación molecular de sujetos enfermos y sanos con un método de agrupamiento usando perfiles de expresión de transcritos tanto inducibles por IFN de tipo I como no inducibles por IFN de tipo I.

Este panel de 5 genes usado para evaluar la activación de la ruta de IFN de tipo I en sujetos se identificó a partir del conjunto de 21 genes inducibles por IFN de tipo I usados para medir la farmacodinámica de un mAb anti-IFN-α en sujetos con DM, PM y LES, como se describe en Yao et al., 2009. Se descubrió que los 5 genes eran los que más se sobreexpresaban entre estos 21 genes en sujetos con LES, DM, PM, SSc, AR y enfermedad de Sjogren en comparación con donantes sanos normales (Tabla 3). Los genes de la Tabla 3 se clasifican en orden descendente para cada bloque de 21 genes (dentro de cada enfermedad individual), para ilustrar la clasificación de los 5 genes entre los 21 genes.

Tabla 3 Expresión de genes en LES, DM, PM, SSc, AR

Sonda: Gen Símbolo Valor p cambio en veces prevalencia enfermedad

202411_at: proteína 27 inducible por interferón alfa IFI27 0 30,065 0,767 LES

204415_at: proteína 6 inducible por interferón alfa IFI6 0 16,465 0,882 LES

214059_at: Proteína 44 inducida por interferón IFI44 0 13,855 0,779 LES

213797_at: dominio que contiene radical de S-adenosil metionina 2 RSAD2 0 13,232 0,763 LES

204439_at: similar a proteína 44 inducida por interferón IFI44L 0 10,532 0,748 LES

219211_at: peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina 18 USP18 0 7,271 0,679 LES

44673_at: lectina 1 de tipo Ig que se une a ácido siálico, sialoadhesina SIGLEC1 0 6,348 0,656 LES

202145_at: complejo 6 de antígeno de linfocitos, locus E LY6E 0 6,186 0,683 LES

202869_at: 2’,5’-oligoadenilato sintetasa 1, 40/46 kDa OAS1 0 6,181 0,729 LES

205569_at: proteína 3 asociada a lisosomas LAMP3 0 5,189 0,725 LES

218400_at: 3’-5’-oligoadenilato sintetasa 3, 100 kDa OAS3 0 5,053 0,706 LES

219863_at: dominio hect y RLD 5 HERC5 0 4,841 0,729 LES

203153_at: proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 1 /// proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 1 IFIT1 0 4,840 0,729 LES

205483_s_at: modificador de tipo ubiquitina ISG15 ISG15 0 4,633 0,702 LES

227609_at: interacción con estroma epitelial 1 (mama) EPSTI1 0 4,519 0,706 LES

202086_at: resistencia a mixovirus (virus de la gripe) 1, proteína p78 inducible por interferón (ratón) /// resistencia a mixovirus (virus de la gripe) 1, proteína p78 inducible por interferón (ratón) MX1 0 4,142 0,725 LES

204972_at: 2’-5’-oligoadenilato sintetasa 2,69/71 kDa OAS2 0 4,094 0,683 LES

Sonda: Gen Símbolo Valor p cambio en veces prevalencia enfermedad

204747_at: proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 3 IFIT3 0 3,992 0,702 LES

219684_at: proteína transportadora de receptor (quimiosensorial) 4 RTP4 0 3,928 0,649 LES

241916_at: Fosfolípido escramblasa 1 PLSCR1 0 3,297 0,687 LES

241812_at: Proteína 6 transactivada por ADN polimerasa DNAPTP6 0 3,217 0,561 LES

204415_at1: proteína 6 inducible por interferón alfa IFI6 0 12,253 0,932 DM

214059_at1: Proteína 44 inducida por interferón IFI44 2,21E-11 9,736 0,750 DM

213797_at1: dominio que contiene radical de S-adenosil metionina 2 RSAD2 5,63E-10 9,423 0,750 DM

202411_at1: proteína 27 inducible por interferón alfa IFI27 6,86E-06 8,796 0,682 DM

204439_at1: similar a proteína 44 inducida por interferón IFI44L 3,13E-08 5,800 0,659 DM

202869_at1: 2’,5’-oligoadenilato sintetasa 1, 40/46 kDa OAS1 2,91E-08 4,149 0,727 DM

203153_at1: proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 1 /// proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 1 IFIT1 3,68E-06 3,883 0,682 DM

219863_at1: dominio hect y RLD5 HERC5 3,03E-08 3,753 0,614 DM

205569_at1: proteína 3 de membrana asociada con lisosomas LAMP3 2,11E-06 3,366 0,591 DM

204747_at1: proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 3 IFIT3 3,66E-09 3,263 0,682 DM

218400_at1: 2’-5’-oligoadenilato sintetasa 3, 100 kDa OAS3 4,34E-06 3,191 0,591 DM

227609_at1: interacción con el estroma epitelial 1 (mama) EPSTI1 1,86E-06 3,096 0,568 DM

202086_at1: resistencia a mixovirus (virus de la gripe) 1, proteína p78 inducible por interferón (ratón) /// resistencia a mixovirus (virus de la gripe) 1, proteína p78 inducible por interferón (ratón) MX1 1,60E-06 3,058 0,636 DM

Sonda: Gen Símbolo Valor p cambio en veces prevalencia enfermedad

219211_at1: peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina USP18 5,25E-05 3,044 0,568 DM

241916_at1: Fosfolípido escramblasa 1 PLSCR1 3,81E-08 2,939 0,705 DM

44673_at1: lectina 1 de tipo Ig que se une al ácido siálico, sialoadhesina SIGLEC1 2,87E-07 2,841 0,432 DM

205483_s_at 1: modificador de tipo ubiquitina ISG15 ISG15 6,13E-06 2,722 0,568 DM

202145_at1: Complejo de antígeno 6 de linfocitos, locus E LY6E 3,07E-05 2,685 0,500 DM

204972-at1: 2’-5’-oligoadenilato sintetasa 2, 69/71 kDa OAS2 1,59E-06 2,545 0,500 DM

219684_at1: proteína 4 del transportador del receptor (quimiosensorial) RTP4 3,84E-05 2,528 0,568 DM

241812_at1: Proteína 6 transactivada por ADN polimerasa DNAPTP6 0,001397 833 1,624 0,318 DM

204415_at2: proteína 6 inducible por interferón alfa IFI6 0 11,500 1,000 PM

213797_at2: dominio que contiene radical de S-adenosil metionina 2 RSAD2 8,53E-08 6,775 0,727 PM

214059_at2: Proteína 44 inducida por interferón IFI44 4,66E-07 6,283 0,727 PM

202411_at2: proteína 27 inducible por interferón alfa IFI27 0,000334 1 5,652 0,667 PM

204439_at2: Similar a proteína 44 inducida por interferón IFI44L 2,87E-06 4,470 0,667 PM

202869_at2: 2’,5’-oligoadenilato sintetasa 1, 40/46 kDa OAS1 3,08E-08 4,431 0,697 PM

219863_at2: dominio hect y RLD5 HERC5 1,65E-06 3,102 0,576 PM

203153_at2: proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 1 /// proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 1 IFIT 1 0,000223 959 2,922 0,576 PM

227609_at2: interacción con estroma epitelial 1 (mama) EPSTI1 2,60E-06 2,846 0,606 PM

205569_at2: proteína de membrana 3 asociada con lisosomas LAMP3 6,22E-05 2,831 0,576 PM

241916_at2: Fosfolípido escramblasa 1 PLSCR1 3,24E-07 2,753 0,697 PM

Sonda: Gen Símbolo Valor p cambio en veces prevalencia enfermedad

204747_at2: proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 3 IFIT3 2,25E-06 2,684 0,606 PM

218400_at2: 2’-5’-oligoadenilato sintetasa 3, 100 kDa OAS3 0,000152 771 2,644 0,424 PM

44673_at2: lectina 1 de tipo Ig que se une a ácido siálico, sialoadhesina SIGLEC1 5,34E-05 2,620 0,424 PM

202145_at2: complejo 6 de antígeno de linfocitos, locus E LY6E 0,000183 714 2,406 0,394 PM

205483_s_at 2: modificador de tipo ubiquitina ISG15 ISG15 9,97E-05 2,369 0,485 PM

202086_at2: resistencia a mixovirus (virus de la gripe) 1, proteína p78 inducible por interferón (ratón) /// resistencia a mixovirus (influenza virus) 1, proteína p78 inducible por interferón (ratón) MX1 0,000540 479 2,342 0,515 PM

219684_at2: proteína 4 transportadora de receptor (quimiosensorial) RTP4 8,87E-05 2,218 0,455 PM

219211_at2: peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina USP18 0,003664 023 2,195 0,364 PM

204972_at2: 2’-5’-oligoadenilato sintetasa 2. 69/71 kDa OAS2 0,000106 864 2,082 0,364 PM

241812_at2: Proteína 6 transactivada por ADN polimerasa DNAPTP6 0,016913 8 1,533 0,242 PM

204415_at3: proteína 6 inducible por interferón alfa IFI6 0 6,235 0,865 Artritis Reumatoide

214059_at3: Proteína 44 inducida por interferón IFI44 1,60E-07 3,393 0,596 Artritis Reumatoide

202411_at3: proteína 27 inducible por interferón alfa IFI27 0,000442781 2,866 0,539 Artritis Reumatoide

213797_at3: dominio que contiene radical de S-adenosil metionina 2 RSAD2 9,28E-06 2,783 0,494 Artritis Reumatoide

202869_at3: 2’,5’-oligoadenilato sintetasa 1, 40/46 kDa OAS1 9,98E-08 2,391 0,528 Artritis Reumatoide

204439_at3: similar a proteína 44 inducida por interferón IFI44L 5,15E-05 2,235 0,461 Artritis Reumatoide

202145_at3: complejo 6 de antígeno de linfocitos, locus E LY6E 5,88E-12 2,139 0,438 Artritis Reumatoide

241916_at3: Fosfolípido escramblasa 1 PLSCR1 1,66E-06 2,041 0,438 Artritis Reumatoide

Sonda: Gen Símbolo Valor p cambio en veces prevalencia enfermedad

44673_at3: lectina 1 de tipo Ig que se une a ácido siálico, sialoadhesina SIGLEC1 6,83E-08 1,908 0,326 Artritis Reumatoide

227609_at3: interacción con estroma epitelial 1 (mama) EPSTI1 6,66E-06 1,825 0,360 Artritis Reumatoide

204972_at3: 2’-5’-oligoadenilato sintetasa 2. 69/71 kDa OAS2 1,23E-09 1,761 0,315 Artritis Reumatoide

202086_at3: resistencia a mixovirus (virus de la gripe) 1, proteína p78 inducible por interferón (ratón) /// resistencia a mixovirus (virus de la gripe) 1, proteína p78 inducible por interferón (ratón) MX1 0,000342238 1,739 0,371 Artritis Reumatoide

218400_at3: 2’-5’-oligoadenilato sintetasa 3, 100 kDa OAS3 0,000277383 1,739 0,371 Artritis Reumatoide

219863_at3: dominio hect y RLD5 HERC5 0,000175256 1,692 0,303 Artritis Reumatoide

205569_at3: proteína de membrana 3 asociada con lisosomas LAMP3 0,0029278 1,630 0,303 Artritis Reumatoide

219684_at3: proteína 4 transportadora de receptor (quimiosensorial) RTP4 0,00252807 1,544 0,281 Artritis Reumatoide

204747_at3: proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 3 IFIT3 0,005459384 1,445 0,348 Artritis Reumatoide

205483_s_at 3: modificador de tipo ubiquitina ISG15 ISG15 0,009827494 1,393 0,292 Artritis Reumatoide

219211_at3: peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina USP18 0,079726231 1,274 0,236 Artritis Reumatoide

241812_at3: Proteína 6 transactivada por ADN polimerasa DNAPTP6 0,121840941 1,137 0,124 Artritis Reumatoide

203153_at3: proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 1 /// proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 1 IFIT1 0,654268059 1,093 0,270 Artritis Reumatoide

204415_at4: proteína 6 inducible por interferón alfa IFI6 0 15,488 1,000 Escleroderma

213797_at4: dominio que contiene radical de S-adenosil metionina 2 RSAD2 1,92E-08 5,758 0,711 Escleroderma

Sonda: Gen Símbolo Valor p cambio en veces prevalencia enfermedad

214059_at4: Proteína 44 inducida por interferón IFI44 2,52E-07 4,494 0,658 Escleroderma

202411_at4: proteína 27 inducible por interferón alfa IFI27 0,001868066 4,096 0,579 Escleroderma

202869_at4: 2’,5’-oligoadenilato sintetasa 1, 40/46 kDa OAS1 1,43E-08 3,581 0,711 Escleroderma

204439_at4: similar a proteína 44 inducida por interferón IFI44L 1,98E-05 3,105 0,553 Escleroderma

203153_at4: proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 1 /// proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 1 IFIT1 2,36E-05 2,919 0,632 Escleroderma

219863_at4: dominio hect y RLD5 HERC5 2,37E-08 2,860 0,632 Escleroderma

202086_at4: resistencia a mixovirus (virus de la gripe) 1, proteína p78 inducible por interferón (ratón) /// resistencia a mixovirus (virus de la gripe) 1, proteína p78 inducible por interferón (ratón) MX1 9,86E-06 2,308 0,474 Escleroderma

218400_at4: 2’-5’-oligoadenilato sintetasa 3, 100 kDa OAS3 3,26E-05 2,300 0,474 Escleroderma

204747_at4: proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 3 IFIT3 8,63E-07 2,280 0,526 Escleroderma

202145_at4: complejo 6 de antígeno de linfocitos, locus E LY6E 2,38E-05 2,229 0,421 Escleroderma

205569_at4: proteína de membrana 3 asociada con lisosomas LAMP3 0,0001192 2,206 0,500 Escleroderma

205483_s_at4: modificador de tipo ubiquitina ISG15 ISG15 1,45E-05 2,177 0,447 Escleroderma

227609_at4: interacción con estroma epitelial 1 (mama) EPSTI1 2,54E-05 2,177 0,553 Escleroderma

219684_at4: proteína 4 transportadora de receptor (quimiosensorial) RTP4 0,000226923 1,943 0,395 Escleroderma

204972_at4: 2’-5’-oligoadenilato sintetasa 2, 69/71 kDa OAS2 3,34E-06 1,909 0,368 Escleroderma

44673_at4: lectina 1 de tipo Ig que se une a ácido siálico, sialoadhesina SIGLEC1 0,000242727 1,831 0,342 Escleroderma

Sonda: Gen Símbolo Valor p cambio en veces prevalencia enfermedad

219211_at4: peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina USP18 0,002152959 1,815 0,316 Escleroderma

241916_at4: Fosfolípido escramblasa 1 PLSCR1 0,000483597 1,793 0,395 Escleroderma

241812_at4: Proteína 6 transactivada por ADN polimerasa DNAPTP6 0,303084481 0,913 0,079 Escleroderma

202411_at: Proteína 27 inducible por interferón alfa IFI27 0,00094654 25,635 1,000 Síndrome de Sjogren

204439_at: tipo de proteína 44 inducida por interferón IFI44L 0,008982765 5,742 1,000 Síndrome de Sjogren

219211_at: peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina /// similar a peptidasa 18 específica de ubiquitina USP18 0,002566614 5,079 1,000 Síndrome de Sjogren

213797_at: dominio que contiene radical de S-adenosil metionina 2 RSAD2 0,003104168 4,705 1,000 Síndrome de Sjogren

203153_at: proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 1 /// proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 1 IFIT1 0,0104006 4,142 1,000 Síndrome de Sjogren

204747_at: proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 3 IFIT3 0,003638823 3,857 1,000 Síndrome de Sjogren

44673_at: lectina 1 de tipo Ig que se une a ácido siálico, sialoadhesina SIGLEC1 0,007125541 3,755 1,000 Síndrome de Sjogren

205483_s_at: modificador de tipo ubiquitina ISG15 ISG15 0,000690576 3,557 1,000 Síndrome de Sjogren

219863_at: dominio hect y RLD5 HERC5 0,007639108 3,499 1,000 Síndrome de Sjogren

227609_at: interacción con estroma epitelial 1 (mama) EPSTI1 0,001244694 3,060 1,000 Síndrome de Sjogren

204415_at: proteína 6 inducible por interferón alfa IFI6 0,000905658 2,912 1,000 Síndrome de Sjogren

Sonda: Gen Símbolo Valor p cambio en veces prevalencia enfermedad

218400_at: 2’-5’-oligoadenilato sintetasa 3, 100 kDa OAS3 0,009517756 2,764 1,000 Síndrome de Sjogren

202086_at: resistencia a mixovirus (virus de la gripe) 1, proteína p78 inducible por interferón (ratón) /// resistencia a mixovirus (virus de la gripe) 1, proteína p78 inducible por interferón (ratón) MX1 0,003908144 2,722 1,000 Síndrome de Sjogren

204972_at: 2’-5’-oligoadenilato sintetasa 2, 69/71 kDa OAS2 0,00753208 2,590 1,000 Síndrome de Sjogren

214059_at: Proteína inducida por interferón 44 IFI44 0,039282229 2,477 0,750 Síndrome de Sjogren

202145_at: complejo 6 de antígeno de linfocitos, locus E LY6E 0,01319652 2,418 0,750 Síndrome de Sjogren

202869_at: 2’,5’-oligoadenilato sintetasa 1, 40/46 kDa OAS1 0,022562072 1,796 0,250 Síndrome de Sjogren

219684_at: proteína 4 transportadora de receptor (quimiosensorial) RTP4 0,231709806 1,749 0,250 Síndrome de Sjogren

241916_at: Fosfolípido escramblasa 1 PLSCR1 0,472321498 1,284 0,000 Síndrome de Sjogren

241812_at: Proteína 6 transactivada por ADN polimerasa DNAPTP6 0,529363363 0,917 0,000 Síndrome de Sjogren

205569_at: proteína de membrana 3 asociada con lisosomas LAMP3 0,318182147 0,905 0,000 Síndrome de Sjogren

Se descubrió que la proporción de sujetos con LES, DM, PM, SSc y AR que eran positivos para la activación de la ruta de IFN de tipo I en SE era del 72 % para LES, del 66 % para DM, del 61 % para PM, del 50 % para SSc y del 33 % para AR. Se observó la sobreexpresión concordante de transcritos inducibles con IFN de tipo I tanto en el

5 tejido implicado como en SE.

A partir de estos estudios, se observó de forma consistente la activación de la ruta del IFN de tipo I en una población de sujetos con LES, DM, PM, SSc y AR. Los subgrupos de sujetos con PM y AR también mostraron activación de la ruta de TNF-α y un subgrupo de sujetos con SSc mostró una fuerte activación de la ruta de IL-17. Un conjunto

10 común de 36 transcritos inducibles por IFN de tipo I se encontraba entre los transcritos más sobreexpresados en la SE de los sujetos. De esta manera, estos estudios muestran que es posible clasificar a todos los sujetos con diferentes manifestaciones de enfermedad por características moleculares, en lugar de que se presente la nomenclatura clásica LES, DM, PM, SSc y AR.

15 B. Resultados

En la Figura 11A se muestran las puntuaciones para las firmas de genes inducibles por IFN de tipo I calculadas usando los cinco genes inducibles por IFN de tipo I en la SE de sujetos individuales con LES, DM, PM, SSc y AR y sujetos sanos. Las puntuaciones compuestas de la expresión relativa de múltiples genes pueden proporcionar una 20 medición fiable de la actividad de la ruta. Los pacientes con las puntuaciones compuestas de más de 4 se consideraron positivos para la firma de genes inducibles por IFN de tipo I. El umbral para el estado positivo/negativo para la firma de genes de IFN de tipo I usando el panel de 5 genes se determinó usando la distribución de valores de firma de los donantes sanos normales. Como el tamaño de muestra para estos 24 donantes sanos normales es modesto, se construyó una estimación conservativa para un umbral de estado de firma. El máximo de los valores de 25 firma de genes de IFN de tipo I en los donantes sanos normales es 3. Un límite de 4 permite una variación adicional que probablemente esté más alineada con la población general. Las puntuaciones para la sobreexpresión de firmas de genes inducibles por IFN de tipo I en la SE de estos sujetos fueron significativas cuando se compararon con las de los sujetos sanos (las medianas de las puntuaciones para sujetos normales sanos, con LES, DM, PM, AR y SSc son 1,1, 34,5, 12,4, 5,3, 2,3 y 4,3, respectivamente; los valores de p son 7,8310-47, 7,5310-7, 6,6310-4, 4,7310-5 y

30 5,2310-4, para sujetos con LES, DM, PM, AR y SSc, respectivamente).

Para cada enfermedad autoinmunitaria, el porcentaje de sujetos que recibieron una puntuación que hizo que se clasificaran como “positivos para la firma” para la activación de las rutas de IFN de tipo I se obtuvo usando la puntuación de firma de IFN de tipo I de 5 genes (Tabla 4). Los pacientes que son positivos para la firma para la activación de la ruta de IFN de tipo 1 dentro de cada enfermedad autoinmunitaria son: 73 % LES, 66 % DM, 61 % PM y 50 % SSc, 33 % AR. Este método para identificar sujetos similares con una firma positiva (o firma negativa) sugiere una sólida presencia de sobreexpresión de genes de IFN de tipo I en un subgrupo específico de estas enfermedades autoinmunitarias.

Tabla 4. Porcentajes de sujetos con una firma positiva de genes inducibles por IFN de tipo I en controles sanos normales y en las enfermedades LES, DM, PM, AR y SSc en la SE

Firma: Donantes normales LES DM PM AR SSc

Firma de IFN de tipo I: 0,0 % 72,5 % 65,9 % 60,6 % 32,6 % 50,0 %

Tamaño de muestra: 24 262 44 33 89 38

También se evaluó la sobreexpresión de genes inducibles por IFN de tipo I en tejidos de sujetos con enfermedad (piel lesionada de sujetos con LES y SSc, muestras de músculo de sujetos con DM y PM, y tejido sinovial de sujetos con AR). Se usó la estimulación in vitro de un modelo humano primario de queratinocitos/fibroblastos y la línea celular muscular de mioblastos (SkMC) con IFN-α o IFN-β para identificar los posibles transcritos inducibles por IFN de tipo I en células características de la piel y músculo. La mayoría de los transcritos inducidos por IFN de tipo I en las células de piel o líneas de células musculares residentes también fueron inducibles en la SE (los datos de piel se describieron en Yao Y, Jallal J, et al. Type I IFN as a potential therapeutic target for psoriasis. PLoS ONE 2008; 3(7): e2737. doi:10.1371/journal.pone.0002737). En los siguientes tamaños de muestras, 16 LES, 37 DM, 36 PM, 22 SSc y 20 AR, se observó una alta sobreexpresión de genes inducibles por IFN de tipo I en los sitios de enfermedad en un gran subgrupo de sujetos con LES, SSc, DM, PM y AR que se evaluaron (valores de p <0,01 para sujetos con LES, SSc, DM y PM, respectivamente; las medianas de las puntuaciones de firma de IFN de tipo I de 5 genes son 0,8, 13,6, 4,5 en piel de donantes sanos normales, sujetos con LES y SSc; 0,9, 15,3 y 5 en muestras de músculo de donantes sanos normales, sujetos con DM y PM; 1,0 y 7,1 en tejidos sinoviales y donantes sanos normales y sujetos con AR (la comparación de AR tuvo un tamaño de muestra del control normal demasiado pequeño como para evaluarse); Figura 11 B).

En un análisis entre los pacientes que tienen firmas de genes inducibles por IFN de tipo I positivas (usando la firma de 5 genes) en SE correspondiente y muestras de tejidos enfermos, 13 de 16 sujetos con LES mostraron puntuaciones de firma de genes inducibles por IFN de tipo I comparables en SE y piel lesionada (P <0,05 usando el ensayo exacto de Fisher). Para los 10 sujetos con DM y 9 sujetos con PM con muestras de SE y músculo emparejadas, 2 muestras de músculo con DM, 1 músculo con PM y 1 muestra de SE de PM (del mismo paciente) fueron negativas para una firma de genes inducibles por IFN de tipo I. Para los 10 sujetos con SSc con muestras emparejadas de SE y piel, 7 sujetos demostraron puntuaciones de firma de genes inducibles por IFN de tipo I comparables. Estas observaciones muestran una fuerte tendencia de expresión concordante de genes inducibles por IFN de tipo I en SE y tejidos enfermos de sujetos con LES, DM, PM y SSc.

En un análisis adicional, se estudió la firma de cuatro genes (IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2) y se determinó si también muestra una fuerte tendencia de expresión concordante de los cuatro genes inducibles por IFN de tipo I en SE y tejidos enfermos de sujetos con LES, DM, PM y SSc. Véanse las Figuras 12A y B.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> MEDIMMUNE, LLC

<120> DIAGNÓSTICO DE INTERFERÓN

<130> MED0217.PCT4

<140>

<141>

<150> 61/239.630

<151>

<160> 35

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 20 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400> 1 gctaccacat ccaaggaagg 20

<210> 2 15 <211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 2 cgcaaattac ccactcccga ccc 23

25 <210> 3

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400> 3

gcctcgaaag agtcctgtat tg 22 35

<210> 4

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400>: 4 45 acagagcctc gcctttg 17

<210> 5

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400>: 5 55 agctggcggc gggtgtgg 18

<210> 6

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador sintético

65 <400> 6 ccttgcacat gccggag 17

<210> 7

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400> 7 acatcgctca gacaccatg 19

<210> 8

<211> 23

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 8 ccgttgactc cgaccttcac ctt 23

<210> 9

<211> 20 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400> 9 accagagtta aaagcagccc 20

<210> 10 35 <211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400> 10 tgggtgtgaa ccatgagaag tatg 24

45 <210> 11

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 11

cctcaagatc atcagcaatg cctcctgca 29 55

<210> 12

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400> 12 65 caggggtgct aagcagttgg 20

<210> 13

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400> 13 ctctcacctc atcagcagtg 20

<210> 14

<211> 20

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 14 ccagaggcca ccctgaccac 20

<210> 15

<211> 21 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400> 15 tcacaactgt agcaatcctg g 21

<210> 16 35 <211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400> 16 gatgcgaaga ttcactggat g 21

45 <210> 17

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 17

agttctcaag gcagacagta agctcttc 28 55

<210> 18

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400> 18 65 tgttgaacca gggatccata tg 22

<210> 19

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400> 19 aagccgtagt ggggtct 17

<210> 20

<211> 23

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 20 tataccgctc ggttatgctg gtg 23

<210> 21

<211> 24 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400> 21 aacataaatg gcagagattt tcca 24

<210> 22 35 <211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400> 22 aaagactcct accttattct ggatg 25

45 <210> 23

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 23 ctgaactgta gaaagggacg gaaggac 27 55

<210> 24

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400> 24 65 cttctacacc aacatccagg a 21

<210> 25

<211> 665

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 656

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15

<400> 26

<210> 27

<211> 1742

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 5889

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 836

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 848

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 860

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 3512

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 526

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 33

5 <210> 34

<211> 551

<212> ADN

<213> Homo sapiens

10 <400> 34

<210> 35

<211> 684

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 35

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un método para identificar un sujeto adecuado para el tratamiento de lupus con un anticuerpo anti-interferón alfa o un anticuerpo anti-receptor de interferón alfa que modula la actividad del interferón de tipo 1, que comprende detectar el ARNm aumentado de un grupo de genes que consisten en IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2 en una muestra del sujeto, en el que una media de cambio en veces en el ARNm del grupo de genes de al menos cuatro veces indica un sujeto adecuado para el tratamiento de lupus con el anticuerpo, en el que el aumento es relativo a

a) el de una muestra de un tejido o persona que no tiene la enfermedad, o b) la expresión de uno o más genes de control.
2.

El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-interferón es sifalimumab.
3.

El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-interferón no es sifalimumab.
4.

El método de la reivindicación 1, en el que la detección de ARNm de IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2 comprende

a) aislar ARN de una muestra obtenida del sujeto; b) sintetizar ADNc a partir del ARN; c) hibridar el ADNc con oligonucleótidos que hibridan con secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 25 a 28 y 32; y d) amplificar el ADNc y detectar los productos amplificados.
5.

El método de la reivindicación 4, en el que los oligonucleótidos se eligen entre oligonucleótidos que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 13 a 24.
6.

Un anticuerpo anti-interferón alfa o un anticuerpo anti-receptor de interferón alfa que modula la actividad del interferón de tipo 1 para uso en el tratamiento de lupus en un sujeto adecuado, en el que el sujeto adecuado para el tratamiento se identifica detectando un nivel aumentado de ARNm de un grupo de genes que consiste en IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2 en una muestra del sujeto, en el que una media del cambio en veces en el ARNm del grupo de genes de al menos 4 veces indica un sujeto adecuado para el tratamiento de lupus, en el que el aumento es relativo a

a) el de una muestra de un tejido o persona que no tiene la enfermedad, o b) la expresión de uno o más genes de control.
7.

El anticuerpo para uso de la reivindicación 6, en el que el anticuerpo anti-interferón es sifalimumab.
8.

El anticuerpo para uso de la reivindicación 6, en el que el anticuerpo anti-interferón no es sifalimumab.
9.

El anticuerpo para uso de la reivindicación 6, en el que la detección del ARNm de IFI27, IFI44, IFI44L y RSAD2 comprende

a) aislar ARN de una muestra obtenida del sujeto; b) sintetizar ADNc a partir del ARN; c) hibridar el ADNc con oligonucleótidos que hibridan con secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 25 a 28 y 32; y d) amplificar el ADNc y detectar los productos amplificados.
10.

El anticuerpo para uso de la reivindicación 9, en el que los oligonucleótidos se eligen entre oligonucleótidos que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 13 a 24.
11.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el anticuerpo para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que el aumento de ARNm es relativo a muestras reunidas de pacientes sanos.
12.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 b) o 2 a 5 u 11, en la medida en que las reivindicaciones 2 a 5 y 11 remiten a la reivindicación 1 b), o el anticuerpo para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 6b) o 7 a 11, en la medida en que las reivindicaciones 7 y 11 remiten a la reivindicación 6b), en el que los genes de control se seleccionan entre ACTB, GAPDH y ARNr 18S.
13.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 11 o 12, o el anticuerpo para uso en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en el que la muestra es sangre entera o suero.
14.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 u 11 a 13, o el anticuerpo para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, en el que el sujeto necesita tratamiento de lupus eritematoso sistémico.