ES2611150T3 - PLA2G16 como diana para compuestos antivirales - Google Patents

PLA2G16 como diana para compuestos antivirales Download PDF

Info

Publication number
ES2611150T3
ES2611150T3 ES11796527.7T ES11796527T ES2611150T3 ES 2611150 T3 ES2611150 T3 ES 2611150T3 ES 11796527 T ES11796527 T ES 11796527T ES 2611150 T3 ES2611150 T3 ES 2611150T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
pla2g16
polypeptide
compound
activity
substrate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11796527.7T
Other languages
English (en)
Inventor
Thijn R. Brummelkamp
Jan E. Carette
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Whitehead Institute for Biomedical Research
Original Assignee
Whitehead Institute for Biomedical Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Whitehead Institute for Biomedical Research filed Critical Whitehead Institute for Biomedical Research
Application granted granted Critical
Publication of ES2611150T3 publication Critical patent/ES2611150T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/0002—Remote monitoring of patients using telemetry, e.g. transmission of vital signals via a communication network
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/103—Detecting, measuring or recording devices for testing the shape, pattern, colour, size or movement of the body or parts thereof, for diagnostic purposes
    • A61B5/1036—Measuring load distribution, e.g. podologic studies
    • A61B5/1038—Measuring plantar pressure during gait
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/103—Detecting, measuring or recording devices for testing the shape, pattern, colour, size or movement of the body or parts thereof, for diagnostic purposes
    • A61B5/11—Measuring movement of the entire body or parts thereof, e.g. head or hand tremor, mobility of a limb
    • A61B5/112—Gait analysis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/68—Arrangements of detecting, measuring or recording means, e.g. sensors, in relation to patient
    • A61B5/6801—Arrangements of detecting, measuring or recording means, e.g. sensors, in relation to patient specially adapted to be attached to or worn on the body surface
    • A61B5/6802—Sensor mounted on worn items
    • A61B5/6804—Garments; Clothes
    • A61B5/6807—Footwear
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/72—Signal processing specially adapted for physiological signals or for diagnostic purposes
    • A61B5/7225—Details of analog processing, e.g. isolation amplifier, gain or sensitivity adjustment, filtering, baseline or drift compensation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/72—Signal processing specially adapted for physiological signals or for diagnostic purposes
    • A61B5/7271—Specific aspects of physiological measurement analysis
    • A61B5/7278—Artificial waveform generation or derivation, e.g. synthesising signals from measured signals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/72—Signal processing specially adapted for physiological signals or for diagnostic purposes
    • A61B5/7271—Specific aspects of physiological measurement analysis
    • A61B5/7285—Specific aspects of physiological measurement analysis for synchronising or triggering a physiological measurement or image acquisition with a physiological event or waveform, e.g. an ECG signal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G01N2333/918—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)

Abstract

Un método de identificación in vitro de un compuesto antiviral candidato que comprende etapas de: (a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido PLA2G16 y un compuesto de ensayo; (b) determinar si el compuesto de ensayo inhibe el polipéptido PLA2G16, en el que si el compuesto inhibe el polipéptido PLA2G16, el compuesto se identifica como un compuesto antiviral candidato útil para inhibir la infección viral por un Picornavirus.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
imagen7
imagen8
5
15
25
35
45
55
65
En algunas realizaciones, el virus puede infectar células de una o más especies de animales, por ejemplo, una o más especies de vertebrado, por ejemplo, especies de mamífero o de aves, en las que las células expresan PLA2G16. En diversas realizaciones, la invención puede aplicarse a cualquier virus cuya capacidad para infectar una célula, por ejemplo, una célula de animal, se reduzca si se inhibe PLA2G16. Aunque la invención se describe en el presente documento principalmente en referencia a ciertos virus de interés, las realizaciones de la invención pueden aplicarse a cualquier virus en el que la expresión de un polipéptido PLA2G16 en la célula promueva o desempeñe una función en una o más etapas del ciclo de vida viral. En algunas realizaciones, el virus es de importancia médica, por ejemplo, es reconocido en la técnica médica como un agente causante de una o más enfermedades que afectan a los seres humanos. En algunas realizaciones, el virus es de importancia veterinaria, por ejemplo, es reconocido en la técnica veterinaria como un agente causante de una o más enfermedades que afectan a animales no humanos. Véase, por ejemplo, Knipe & Howley, citado anteriormente; Büchen-Osmond, C. citado anteriormente, y Virus Descriptions en "ICTVdB -The Universal Virus Database", citado anteriormente, para discusión de diversas familias de virus, que incluyen virus de importancia médica y/o veterinaria.
El virus tiene un genoma de ARN monocatenario (ARNmc). El virus de genoma de ARNmc es de hebra positiva. El virus es un virus no envuelto y/o tiene una morfología de virión icosaédrico o de nucleocápside. El virus es un miembro de la superfamilia de tipo picornavirus (tales virus también se denominan "virus tipo picorna" en el presente documento). Los virus de la superfamilia tipo picornavirus son virus de ARNmc de sentido positivo que se caracterizan por un conjunto parcialmente conservado de genes que consiste en una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp), una proteasa tipo quimotripsina (3CPro), una helicasa de la superfamilia 3 (S3H) y una proteína unida a genoma (proteína viral, unida a genoma, VPg). La superfamilia tipo picornavirus engloba el orden propuesto Picornavirales (tratado más adelante), además de diversos géneros de virus y familias que se encuentran fuera del orden propuesto, que incluyen, por ejemplo, Caliciviridae y Astroviridae. Véase, por ejemplo, Koonin, EV, et al., Nature Reviews Microbiology, 6:925-939, 2008.
El virus es un miembro del orden propuesto Picornavirales. Este orden incluye virus que infectan eucariotas y que comparten las siguientes propiedades: (i) un genoma de ARN de sentido positivo, normalmente con una VPg unida a 5' y poliadenilada en 3', (ii) traducción de genoma en poliproteína(s) autoproteolíticamente procesada(s), (iii) proteínas de la cápside organizadas en un módulo que contiene tres dominios de rollo de gelatina relacionados que forman partículas no envueltas icosaédricas pequeñas con una simetría pseudo-T = 3, y (iv) un módulo de tridominio que contiene una helicasa de la superfamilia III, una (cisteína) proteinasa con un pliegue tipo quimotripsina y una ARN polimerasa dependiente de ARN. Según estos criterios, el orden Picornavirales incluye las familias Picornaviridae, Comoviridae, Dicistroviridae, Marnaviridae, Sequiviridae y los géneros Cheravirus, Iflavirus y Sadwavirus. Otros taxos de virus "tipo picorna", por ejemplo Potyviridae, Caliciviridae, Hipoviridae, no se adaptan a varios de los criterios anteriores y están más remotamente relacionados. La familia Caliciviridae está compuesta por pequeños (27-40 nm) virus icosaédricos no envueltos e incluyen los cuatro géneros Norovirus, Sapovirus, Vesivirus y Lagovirus. Los principales patógenos de importancia médica son los norovirus, que son una causa importante de gastroenteritis aguda. Patógenos veterinarios importantes incluyen vesivirus tales como calicivirus felino (FCV) y virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV). La familia Astroviridae incluye astrovirus humanos y animales que tienen morfología icosaédrica y una superficie de tipo estrella característica cuando se observan con microscopía electrónica. Son agentes importantes de la gastroenteritis y la diarrea en los seres humanos, además de en diversos animales, que incluyen mamíferos (por ejemplo, cerdos) y aves.
La invención se refiere a inhibir la infección por virus que son miembros de la familia Picornaviridae (también denominados "picornavirus" o "Picornavirus" en el presente documento). Los picornavirus (al igual que otros miembros de la superfamilia tipo picornavirus) son virus no envueltos con un genoma monocatenario de polaridad positiva. Comparten una organización genómica común con una región no traducida (UTR, untranslated region) 5' larga (por ejemplo, al menos aproximadamente 500 nucleótidos (nt) hasta aproximadamente 1200 nt de largo) que contiene un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES, internal ribosome entry site), un único marco de lectura abierto (ORF, open reading frame) que codifica una poliproteína que se procesa proteolíticamente, y una UTR 3’ corta, seguida de una cola de poliA (Knipe & Howley, citado anteriormente). Las principales características diferenciadoras entre los diferentes picornavirus incluyen, entre otras, la estructura secundaria de las UTR 5’ y el sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
La familia de los picornavirus incluye doce géneros: Aphthovirus, Avihepatovirus, Cardiovirus, Enterovirus, Erbovirus, Hepatovirus, Kobovirus, Parechovirus, Sapelovirus, Senecavirus, Teschovirus y Tremovirus (véase, "ICTVdB -The Universal Virus Database", Virus Taxonomy: 2009 Edición v4, citado anteriormente). Un virus que es un miembro de uno de estos géneros puede denominarse un aftovirus, avihepatovirus, cardiovirus, enterovirus, erbovirus, hepatovirus, kobovirus, parechovirus, rinovirus, sapelovirus, senecavirus, teschovirus o tremovirus, respectivamente. Estos géneros incluyen numerosos virus que infectan vertebrados, y varios de ellos contienen miembros que son causas importantes de enfermedad en seres humanos y/o en animales no humanos. Por ejemplo, los aftovirus incluyen virus de la glosopeda, que infectan a animales de pezuña hendida tales como ganado vacuno, cabras, cerdos y ovejas. Los cardiovirus incluyen dos agrupaciones distintas, incluyendo la primera el virus de la encefalomiocarditis e incluyendo el segundo el virus de la encefalomielitis murina de Theiler y virus relacionados, que incluyen algunos que infectan seres humanos.
10
imagen9
5
15
25
35
45
55
65
que incluyen aquellos de numerosos enterovirus humanos, por ejemplo, en la página web del Instituto Europeo de Bioinformática (http://www.ebi.ac.uk/), Centro Nacional para Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), y en la bibliografía científica.
Se ha estudiado ampliamente la estructura y ciclo de vida de los Picornavirus (véase, por ejemplo, Knipe & Howley, citado anteriormente). Brevemente, la cápside del picornavirus normalmente está compuesta por cuatro proteínas estructurales: VP1, VP2, VP3 y VP4 (los Parechovirus solo contienen VP1, VP2 y VP0, el precursor sin escindir de VP2+VP4). El elemento estructural básico de la cápside del picornavirus, denominado promotor, contiene una copia de VP1, VP2, VP3 y VP4. VP1, VP2 y VP3 forman una vaina con VP4 sobre su superficie interna. Diferencias en las secuencias de aminoácidos de ciertas porciones de VP1, VP2 y VP3 dan morfologías y antigenicidades distintas de diferentes picornavirus.
La replicación de picornavirus se produce en el citoplasma de la célula. Los picornavirus inician la infección uniéndose a un receptor sobre la membrana de la célula huésped, que va seguido de denudado y entrada del genoma viral en el citoplasma. El receptor del virus de la poliomielitis (PVR, CD155) y el rinovirus del grupo principal (ICAM-1) se identificaron en 1989, y desde entonces se han identificado receptores para varios otros picornavirus. Algunos picornavirus normalmente requieren co-receptores para la infección. Por ejemplo, muchos enterovirus se unen al factor acelerador del decaimiento (DAF; CD55), pero la infección normalmente requiere la presencia de una molécula adicional, por ejemplo, ICAM-1 o un miembro de la familia de las integrinas. El genoma de ARN se traduce tras la entrada en el citoplasma en una única poliproteína que se escinde durante la traducción por proteasas codificadas por virus (principalmente 2Apro y C3pro o 3CDpro) para producir todas las proteínas virales necesarias para la replicación viral. Algunos de los precursores sin escindir también tienen funciones durante la replicación viral. Entre las proteínas virales sintetizadas están la ARN polimerasa dependiente de ARN viral y proteínas accesorias requeridas para la replicación del genoma y síntesis de ARNm. La primera etapa de replicación del genoma es la copia del ARN de hebra positiva para generar un producto intermedio de hebra negativa, que se utiliza como molde para la síntesis de hebras positivas adicionales. La encapsidación empieza una vez se han acumulado suficientes proteínas de la cápside.
Muchos picornavirus producen cambios morfológicos característicos, denominados "efectos citopáticos", en células infectadas. Los efectos citopáticos pueden incluir la condensación de cromatina, la vesiculación nuclear, la proliferación de vesículas membranosas, la filtración de contenido intracelular y la deshidratación de toda la célula. En el caso de muchas especies de picornavirus, los viriones se liberan de células infectadas como consecuencia de la lisis celular. Otros picornavirus (por ejemplo, virus de la hepatitis A) se liberan de las células sin lisis celular. En algunas realizaciones de la invención, el (los) efecto(s) citopático(s) y/o la liberación de viriones se evalúa para determinar si una célula o un sujeto está infectado con un virus. En algunas realizaciones, el (los) efecto(s) citopático(s) y/o la liberación de viriones se evalúa para determinar si un compuesto inhibe una infección por virus.
IV. Polipéptidos PLA2G16
PLA2G16 es una proteína de ~18 kilodalton que se expresa a niveles muy altos en tejido adiposo de vertebrados (especialmente tejido adiposo blanco) y también se expresa a niveles más bajos en una amplia variedad de tejidos de vertebrado y líneas celulares cultivadas. PLA2G16 también se conoce como fosfolipasa A2 específica de tejido adiposo (AdPLA), supresor 3 tipo HRAS (HRASLA3), y por varios otros nombres. Un experto en la materia será fácilmente capaz de obtener secuencias de ARN genómico y de ARNm de PLA2G16 y la proteína PLA2G16 de bases de datos públicamente disponibles. El gen humano que codifica PLA2G16 ha sido asignado con GeneID: 11145 en la base de datos de genes del centro Nacional para Información Biotecnológica (NCBI; www.ncbi.nlm.nih.gov). Los genes que codifican PLA2G16 de ratón y rata han sido asignados con los siguientes Gene IDs: Gene ID: 225845 (Mus musculus); Gene ID: 24913 (Rattus norvegicus). Un experto en la materia será fácilmente capaz de obtener las secuencias de ARNm de PLA2G16 y proteína a partir de estas y otras especies. Por ejemplo, los números de acceso para las secuencias de referencia de ARN de PLA2G16 humano y de proteínas disponibles en el NCBI son las siguientes: NM_001128203 (variante 2 de transcrito) y NP_001121675 (proteína). NM_007069.3 (variante 1 de transcrito) y NP_009000.2 (proteína). La variante 1 de transcrito representa el transcrito más largo. Las variantes 1 y 2 codifican la misma isoforma, pero se diferencian en la región no traducida (UTR) 5’.
PLA2G16 tiene actividad de fosfolipasa y actividad de lisofosfolipasa significativamente más baja, pero detectable (Duncan, RE, et al., J Biol Chem., 283(37):25428-36, 2008). Las proteínas PLEA2 son enzimas que catalizan la hidrólisis del enlace sn-2 de fosfolípidos (Schaloske, RH y Dennis, EA, Biochim. Biophys. Acta 1761, 1246-1259, 2006). Se mostró que PLA2G16 generaba el ácido graso libre y lisofosfolípido a partir de fosfatidilcolina, con una preferencia para la hidrólisis en la posición sn-2, sugiriendo que la proteína es una PLA2 (Duncan, citado anteriormente). Se encontró PLA2G16 en asociación con membranas intracelulares y tiene un dominio que abarca la supuesta membrana del extremo C cuya deleción causó una pérdida de actividad. El análisis mutacional mostró que ciertos aminoácidos muy conservados, que incluyen His-23, Cys-113, Gln-129 y Asn-112, fueron esenciales para la catálisis, pero que la mutación de Asp-30 o His-80 a alanina no tuvo efecto. Así, parece que PLA2G16 contiene restos catalíticos activos de His y Cys en vez de una díada catalítica His/Asp o una tríada catalítica Ser/His/Asp como se encuentra en algunas otras PLA2s. Se encontró que el calcio activaba PLA2G16, pero no es esencial para la actividad. Como PLA2G16 no se ajusta claramente en ninguno de los 15 grupos principales previamente
12 5
15
25
35
45
55
65
identificados de PLA2, se propuso que era el primer miembro de un grupo distinto de fosfolipasa A2s dependiente de calcio (Grupo XVI) (Duncan, citado anteriormente).
PLA2G16 también se conoce en la técnica como la fosfolipasa de adipocito A2 (AdPLA) (Jaworski, K., et al. Nat Med., 15(2): 159-68, 2009). Es la principal PLA2 en tejido adiposo y desempeña una función importante en la regulación de la lipolisis de adipocitos. Los ratones nulos para PLA2G16 fueron viables y tuvieron peso normal en el destete, pero ganaron peso más lentamente que los compañeros de camada no mutantes, a pesar de tener consumos de alimento equivalentes (Jaworski, K., citado anteriormente). Por análisis de patologías estándar, los ratones nulos para PLA2G16 no mostraron evidencia de ninguna anomalía macroscópica, microscópica o funcional, aparte de adiposidad reducida. No cambiaron el perfil de células sanguíneas ni los parámetros inmunológicos en suero y tejido adiposo en estos ratones en comparación con los ratones no mutantes. Estos resultados sugieren que es probable que los métodos de la presente divulgación que comprenden inhibir PLA2G16 con el fin de inhibir la infección viral sean bien tolerados en células aisladas y en sujetos de interés, por ejemplo, seres humanos y otros vertebrados.
En algunas realizaciones, un "polipéptido PLA2G16" es un polipéptido cuya secuencia comprende o consiste en la secuencia de un polipéptido PLA2G16 de un organismo pluricelular (por ejemplo, un vertebrado, por ejemplo, un mamífero, tal como un ser humano, ratón, rata, bovino, etc.). Un polipéptido PLA2G16 que existe de forma natural o un polipéptido idéntico en secuencia a un polipéptido PLA2G16 que existe de forma natural se denomina un "polipéptido PLA2G16 nativo" o simplemente "PLA2G16" en el presente documento. Polipéptidos PLA2G16 nativos a modo de ejemplo se representan en la Figura 8 y con los números de acceso mencionados anteriormente. En algunas realizaciones, un polipéptido PLA2G16 es una variante de PLA2G16 ("variante de PLA2G16"). Las variantes de PLA2G16 incluyen polipéptidos que se diferencian en una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos con respecto a PLA2G16. Una adición puede ser una inserción dentro del polipéptido o una adición en el extremo N o C. En algunas realizaciones, el número de aminoácidos sustituido, delecionado o añadido puede ser, por ejemplo, aproximadamente 1 a 30, por ejemplo, aproximadamente 1 a 20, por ejemplo, aproximadamente 1 a 10, por ejemplo, aproximadamente 1 a 5, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5. En algunas realizaciones, una variante de PLA2G16 comprende un polipéptido cuya secuencia es homóloga a la secuencia de PLA2G16 durante al menos 50 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos, al menos 150 aminoácidos, o durante la longitud completa de PLA2G16 (pero no es idéntica en secuencia a PLA2G16 nativa). En algunas realizaciones, una variante de PLA2G16 comprende un polipéptido al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más idéntico a PLA2G16 (por ejemplo, de ser humano, ratón, rata, perro, vaca) durante al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de PLA2G16. En algunas realizaciones, una variante de PLA2G16 comprende un polipéptido al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntico a al menos los aminoácidos 23-113 de PLA2G16 humana o de ratón. En algunas realizaciones, un polipéptido PLA2G16 comprende un polipéptido al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntico a al menos los aminoácidos 23-129 de PLA2G16 humana o de ratón.
En algunas realizaciones, un polipéptido PLA2G16 comprende o consiste en un fragmento de PLA2G16. Un fragmento de PLA2G16 es un polipéptido que es más corto que PLA2G16 y es idéntico a PLA2G16 durante la longitud del polipéptido más corto. En algunas realizaciones, un fragmento de PLA2G16 es al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % tan largo como PLA2G16 nativa. En algunas realizaciones, un fragmento consiste en los aminoácidos 23-113 o 23-129 de PLA2G16 humana o de ratón. En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos en el extremo C están delecionados. Por ejemplo, en algunas realizaciones al menos el dominio que abarca la membrana en el extremo C está delecionado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, al menos los 30 aminoácidos del extremo C están delecionados. En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos en el extremo N están delecionados.
En algunas realizaciones, un polipéptido PLA2G16 comprende una porción de polipéptido heterólogo. La porción heteróloga frecuentemente tiene una secuencia que no está presente en o es homóloga a PLA2G16 nativa. Una porción heteróloga puede tener, por ejemplo, entre 5 y aproximadamente 5.000 aminoácidos de longitud, o ser más larga. Frecuentemente tiene entre 5 y aproximadamente 1.000 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, una porción heteróloga comprende una secuencia que se encuentra en un polipéptido diferente, por ejemplo, un dominio funcional. En algunas realizaciones, una porción heteróloga comprende una secuencia útil para purificar, expresar, solubilizar y/o detectar el polipéptido. En algunas realizaciones, una porción heteróloga comprende una "marca" de polipéptido, por ejemplo, una marca de afinidad o marca de epítope. Por ejemplo, la marca puede ser una marca de afinidad (por ejemplo, HA, TAP, Myc, 6XHis, Flag, GST), proteína fluorescente o luminiscente (por ejemplo, EGFP, ECFP, EYFP, Cerulean, DsRed, mCherry), marca potenciadora de la solubilidad (por ejemplo, una marca SUMO, marca NUS A, marca SNUT, o un mutante monomérico de la proteína Ocr de bacteriófago T7). Véase, por ejemplo, Esposito D y Chatterjee DK. Curr Opin Biotechnol.; 17(4):353-8 (2006). En algunas realizaciones, una marca puede servir para múltiples funciones. Una marca es frecuentemente relativamente pequeña, por ejemplo, que oscila de algunos aminoácidos hasta aproximadamente 100 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, una marca tiene más de 100 aminoácidos de longitud, por ejemplo, hasta aproximadamente 500 aminoácidos de longitud, o más. En algunas realizaciones, un polipéptido PLA2G16 tiene una marca localizada en el extremo N o C, por ejemplo, como una fusión del extremo N o C. El polipéptido podría comprender múltiples marcas. En algunas realizaciones, están presentes una marca 6X His y una marca NUS, por ejemplo, en el extremo
13 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
N. En algunas realizaciones, una marca es escindible, de manera que puede eliminarse del polipéptido, por ejemplo, por una proteasa. En algunas realizaciones, esto se logra incluyendo una secuencia que codifica un sitio de escisión de proteasa entre la secuencia que codifica la porción homóloga a PLA2G16 y la marca. Proteasas a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, trombina, proteasa TEV, factor Xa, proteasa PreScission, etc. En algunas realizaciones, se utiliza una marca "auto-escindible". Véase, por ejemplo, el documento PCT/US05/05763. Las secuencias que codifican una marca pueden estar localizadas 5' o 3' con respecto a un polinucleótido que codifica el polipéptido (o ambos). En algunas realizaciones, una marca u otra secuencia heteróloga se separa del resto del polipéptido por un conector polipeptídico. Por ejemplo, un conector puede ser un polipéptido corto (por ejemplo, 1525 aminoácidos). Frecuentemente, un conector está compuesto por pequeños restos de aminoácidos tales como serina, glicina y/o alanina. Un dominio heterólogo comprendería un dominio transmembrana, un dominio de señal de secreción, etc.
En algunas realizaciones, una variante de PLA2G16 es una variante funcional, es decir, la variante conserva al menos en parte al menos una actividad biológica de PLA2G16. En algunas realizaciones, una variante funcional conserva actividad suficiente para ser distinguible de una proteína no homóloga o polipéptido PLA2G16 catalíticamente inactivo (por ejemplo, un polipéptido PLA2G16 que tiene una sustitución C113A) cuando se utiliza en un ensayo de la presente invención. En algunas realizaciones, la actividad es actividad de fosfolipasa A2, por ejemplo, como se mide por la capacidad para catalizar la hidrólisis del enlace sn-2 de fosfolípidos. En algunas realizaciones, la actividad es actividad de lisofosfolipasa. En algunas realizaciones, una variante de PLA2G16 conserva la capacidad de PLA2G16 nativa para servir de factor de célula huésped para un virus. Por ejemplo, la variante de PLA2G16 tiene actividad suficiente de manera que expresándola en una célula de vertebrado que es resistente a infección viral debido a que el gen PLA2G16 de la célula está inhabilitado (por ejemplo, por una inserción de trampa génica) convierte la célula en sensible a la infección viral. En algunas realizaciones, una variante de PLA2G16 funcional conserva al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de la actividad de PLA2G16, por ejemplo, actividad aproximadamente igual. En algunas realizaciones, una variante funcional puede tener mayor actividad que PLA2G16.
Un experto en la materia puede generar fácilmente variantes de PLA2G16 funcionales o fragmentos. Como se trata anteriormente, está disponible información considerable referente a PLA2G16, que incluye identificación de diversos restos importantes para la actividad y diversos restos que pueden alterarse sin disminuir significativamente la actividad, además de alineamientos con otros polipéptidos de PLA2 (véase, por ejemplo, Duncan, et al., citado anteriormente). En algunas realizaciones, una variante de PLA2G16 comprende una o más sustituciones de aminoácidos conservativas con respecto a PLA2G16. Pueden hacerse sustituciones conservativas basándose en la similitud en el tamaño de la cadena lateral, polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los restos implicados. Como se sabe en la técnica, es más probable que tales sustituciones, en general, produzcan una variante que conserve la actividad en comparación con sustituciones no conservativas. En una realización, los aminoácidos se clasifican del siguiente modo:
Especiales: C
Neutros y pequeños: A, G, P, S, T
Polares y relativamente pequeños: N, D, Q, E
Polares y relativamente grandes: R, H, K
No polares y relativamente pequeños: I, L, M, V
No polares y relativamente grandes: F, W, Y
Especiales: C
Véase, por ejemplo, Zhang, J. J. Mol. Evol. 50:56-68, 2000). En algunas realizaciones, se considera que la prolina
(P) está en su propio grupo como un segundo aminoácido especial. Dentro de un grupo particular, ciertas sustituciones pueden ser de interés particular, por ejemplo, sustituciones de leucina por isoleucina (o viceversa), serina por treonina (o viceversa), o alanina por glicina (o viceversa). Por supuesto, las sustituciones no conservativas también son frecuentemente compatibles con la retención de función. En algunas realizaciones, una sustitución o deleción no altera o deleciona un aminoácido importante para la actividad, por ejemplo, el aminoácido His-23, Cys113, Gln-129 o Asn-112. En algunas realizaciones, una deleción no elimina todo o una porción sustancial de los 36 aminoácidos del extremo C. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una deleción no elimina el dominio transmembrana. En algunas realizaciones, una alteración es en un aminoácido que se diferencia entre PLA2G16 de diferentes especies. En algunas realizaciones, una sustitución altera un aminoácido al presente en una posición correspondiente en una especie diferente. En algunas realizaciones, una variante de PLA2G16 funcional comprende un polipéptido al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % idéntico a PLA2G16, por ejemplo, sobre al menos el 70%,75%,80%, 85%,90%, 95%,96%, 97%,98%o el 99%o el 100%de la longitud completa de PLA2G16. En algunas realizaciones, una variante de PLA2G16 funcional comprende un polipéptido al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % idéntico a PLA2G16, por ejemplo, sobre al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % o el 100 % de la longitud completa de PLA2G16, y comprende una marca en el extremo N y/o extremo C. Para evaluar su actividad, podrían ensayarse variantes de PLA2G16 en ensayos acelulares y/o en ensayos basados en células.
14 5
15
25
35
45
55
65
En algunas realizaciones, una variante o fragmento de PLA2G16 que tiene actividad sustancialmente reducida en comparación con la actividad de PLA2G16 nativa (por ejemplo, menos del 10 % de la actividad de PLA2G16 nativa) es útil como inhibidor de PLA2G16 o compuesto antiviral. Por ejemplo, tal polipéptido podría interferir con la función de PLA2G16 nativa en la infección viral, por ejemplo, compitiendo con PLA2G16 nativa. En algunas realizaciones, una variante o fragmento de PLA2G16 que tiene actividad sustancialmente reducida en comparación con la actividad de PLA2G16 nativa es útil como control o como inmunógeno o para estudios de cristalización o de unión.
Un polipéptido PLA2G16, por ejemplo, un polipéptido PLA2G16 nativo o una variante de PLA2G16 puede producirse utilizando técnicas de ADN recombinante convencionales. Un ácido nucleico que codifica PLA2G16 puede obtenerse fácilmente, por ejemplo, a partir de células que expresan PLA2G16 (por ejemplo, por PCR u otros métodos de amplificación o clonando) o por síntesis basadas en una secuencia de ADNc o de polipéptidos PLA2G16. Un experto en la materia sabría que debido a la degeneración del código genético, numerosas secuencias de ácidos nucleicos diferentes codificarían el polipéptido deseado. Opcionalmente, una secuencia está optimizada en los codones para la expresión en una célula huésped de elección. Puede generarse fácilmente un nucleico que codifica una variante de PLA2G16, por ejemplo, modificando PLA2G16 nativa utilizando, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, o por otros métodos convencionales.
Un ácido nucleico que codifica el polipéptido deseado, operativamente unido a elementos de control de la expresión apropiados, normalmente en un vector tal como un plásmido o virus (por ejemplo, como parte del genoma viral), se introduce en células procariotas o eucariotas. En otras realizaciones, un polipéptido PLA2G16 se produce utilizando traducción in vitro. Células a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, células bacterianas (por ejemplo, E. coli), células de insecto, células de mamífero, células vegetales, células fúngicas (por ejemplo, levadura). Un experto en la materia conocerá elementos de control de la expresión adecuados (por ejemplo, promotores). Los promotores pueden ser constitutivos o regulables, por ejemplo, inducibles o represibles. Promotores adecuados a modo de ejemplo para su uso en células bacterianas incluyen, por ejemplo, Lac, Trp, Tac, araBAD (por ejemplo, en un vector pBAD), promotores de fago tales como T7 o T3. Secuencias de control de la expresión a modo de ejemplo útiles para dirigir la expresión en células de mamífero incluyen, por ejemplo, los promotores temprano y tardío del SV40, promotor temprano inmediato del adenovirus o del citomegalovirus, o secuencias de promotor / potenciador viral, LTRs retrovirales, promotores o promotor/potenciadores de genes de mamífero, por ejemplo, actina, EF-1 alfa, metalotioneína, etc. El promotor de la polihedrina del sistema de baculovirus es de uso para expresar proteínas en células de insecto. Un experto en la materia conocerá numerosos vectores de expresión que contienen elemento(s) de control de la expresión, marcadores de selección, sitios de clonación, apropiados etc., y pueden utilizarse convenientemente para expresar un polipéptido de interés. Opcionalmente, tales vectores incluyen secuencias que codifican una marca, para permitir la producción conveniente de un polipéptido que comprende una marca. Métodos adecuados para introducir vectores en células de bacteria, levadura, planta o de animal (por ejemplo, transformación, transfección, infección, electroporación, etc.), y, si se desea, seleccionar células que han captado el vector y que derivan de líneas celulares estables. Podrían producirse animales transgénicos o plantas que expresan el polipéptido utilizando métodos conocidos en la técnica.
Para producir un polipéptido PLA2G16, las células se mantienen en cultivo durante un periodo de tiempo adecuado, y el polipéptido se aísla y purifica opcionalmente adicionalmente (por supuesto, un polipéptido PLA2G16 también podría aislarse de células o tejidos obtenidos directamente de un organismo que lo expresa). Pueden usarse técnicas de aislamiento/purificación de proteínas estándar. En algunas realizaciones, se utilizan métodos basados en afinidad. Por ejemplo, puede emplearse un anticuerpo para PLA2G16. En el caso de polipéptidos PLA2G16 marcados, puede seleccionarse un método de aislamiento apropiado dependiendo de la marca particular usada.
V. Composiciones y métodos de inhibición de PLA2G16
El término "inhibidor de PLA2G16" se refiere a un compuesto que inhibe la expresión de PLA2G16 y/o inhibe una o más actividades de PLA2G16. Por ejemplo, un compuesto es "inhibidor de PLA2G16" si una o más actividades de PLA2G16 se reducen en presencia del compuesto en comparación con su ausencia y/o si el nivel o cantidad de proteína PLA2G16 o producto génico se reducen en presencia del compuesto en comparación con su ausencia. En ciertas realizaciones, los inhibidores de PLA2G16 actúan directamente sobre PLA2G16 en el sentido en que interaccionan físicamente con PLA2G16. En otras realizaciones, los inhibidores actúan indirectamente sobre PLA2G16. Un inhibidor de PLA2G16 puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña, ácido nucleico, oligonucleótido, polipéptido, péptido, lípido, fosfolípido, etc. En algunas realizaciones, un inhibidor de PLA2G16 es un agente de iARN, oligonucleótido antisentido, aptámero o anticuerpo. En algunas realizaciones, un inhibidor de PLA2G16 es una molécula pequeña.
La divulgación proporciona varios métodos diferentes de inhibición de PLA2G16. Como se usa en el presente documento, métodos de inhibición de PLA2G16 engloba métodos que producen una cantidad reducida de polipéptido PLA2G16 y métodos que interfieren con la función molecular de PLA2G16. En algunas realizaciones, PLA2G16 se inhibe inhibiendo o interfiriendo con la expresión de PLA2G16, de manera que se produzca una cantidad reducida de polipéptido PLA2G16. Como se usa en el presente documento, "expresión" engloba los procesos celulares implicados en la producción de un polipéptido e incluyen transcripción, procesamiento de ARNm y transporte (en el caso de células eucariotas), y traducción de ARNm. Pueden aplicarse una variedad de métodos
15
imagen10
imagen11
5
15
25
35
45
55
65
entre el compuesto y la diana. Por ejemplo, el compuesto podría inhibir la expresión o actividad de un polipéptido que participa en la localización o modificación postraduccional de PLA2G16, en el que tal localización o modificación postraduccional es importante para la función molecular de PLA2G16.
En algunas realizaciones, un inhibidor de PLA2G16 no es un compuesto que sea conocido o sugerido en la materia por tener actividad antiviral y/o por ser útil en el tratamiento de un sujeto en necesidad de tratamiento para una infección viral. En algunas realizaciones, un inhibidor de PLA2G16 es un compuesto que es conocido o sugerido en la materia por tener actividad antiviral y/o por ser útil en el tratamiento de un sujeto en necesidad de tratamiento para una infección viral pero, opcionalmente, puede administrarse o usarse de otro modo en la presente divulgación
(i) para inhibir la infección por un virus diferente, por ejemplo, un virus contra el que no se sabe o sugiere que el compuesto tenga actividad antiviral; (ii) en una forma diferente (por ejemplo, más altamente purificada), en una cantidad o composición diferente, o en combinación con una o más sustancias diferentes; (iii) por una vía diferente o a un sujeto de una especie diferente; y/o (iv) explícitamente excluida de una cualquiera o más de las composiciones y/o métodos desvelados.
VI. Composiciones y métodos de identificación y/o compuestos de ensayo
La invención como se define en las reivindicaciones proporciona métodos de identificación de compuestos útiles para inhibir la infección viral y ensayar sistemas para realizar los métodos inventivos. En algunos aspectos, la invención proporciona un método de determinación de si un compuesto de ensayo es un compuesto antiviral candidato, comprendiendo el método la etapa determinar si el compuesto de ensayo inhibe el polipéptido PLA2G16, en el que si el compuesto inhibe PLA2G16, el compuesto es un compuesto antiviral candidato. En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método de identificación de un compuesto antiviral candidato que comprende las etapas de: (a) proporcionar un compuesto de ensayo; (b) determinar si el compuesto de ensayo inhibe PLA2G16, en el que si el compuesto inhibe PLA2G16, el compuesto es un compuesto antiviral candidato.
En algunas realizaciones, el método comprende determinar si el compuesto de ensayo inhibe la expresión de PLA2G16, en el que si el compuesto inhibe la expresión de PLA2G16 el compuesto es un compuesto antiviral candidato. En algunas realizaciones, el método comprende determinar si el compuesto inhibe una función molecular de PLA2G16, en el que si el compuesto inhibe una función molecular de PLA2G16 el compuesto es un compuesto antiviral candidato. En algunas realizaciones, la función molecular es una actividad enzimática, por ejemplo, actividad de fosfolipasa A2 o actividad de lisofosfolipasa.
En algunas realizaciones, se realiza un método utilizando un polipéptido PLA2G16 idéntico en secuencia a PLA2G16 que se expresa naturalmente por un organismo pluricelular, es decir, una PLA2G16 nativa. En algunas realizaciones, se realiza un método utilizando una variante de PLA2G16 funcional. En algunas realizaciones, la variante funcional usada en un ensayo inventivo conserva al menos el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más de la actividad de fosfolipasa A2 de PLA2G16. En algunas realizaciones, una variante funcional conserva al menos el 20%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70%, 80 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más de la actividad de lisofosfolipasa de PLA2G16. En algunas realizaciones, la variante funcional conserva al menos el 50 % o al menos el 75 % o tiene aproximadamente la misma actividad de fosfolipasa A2 y/o actividad de lisofosfolipasa que PLA2G16 nativa. Una variante de PLA2G16 puede tener propiedades que la hacen conveniente para su uso en un método de cribado inventivo, tal como la presencia de una marca que facilita la producción o purificación de la proteína. Un compuesto identificado como un inhibidor utilizando una variante de PLA2G16 puede ensayarse adicionalmente utilizando PLA2G16 nativa para confirmar su capacidad para inhibir el polipéptido nativo.
En los métodos inventivos puede usarse una amplia variedad de compuestos de ensayo. Por ejemplo, un compuesto de ensayo puede ser una molécula pequeña, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, un oligonucleótido, un lípido, un hidrato de carbono o una molécula híbrida. Los compuestos pueden obtenerse de fuentes naturales o pueden producirse sintéticamente. Los compuestos pueden ser al menos parcialmente puros o pueden estar presentes en extractos u otros tipos de mezclas. Los extractos o fracciones de los mismos pueden producirse a partir de, por ejemplo, plantas, animales, microorganismos, organismos marinos, caldos de fermentación (por ejemplo, caldos de fermentación de tierra, bacterianos o fúngicos), etc. En algunas realizaciones, se ensaya una colección de compuestos ("biblioteca"). La biblioteca puede comprender, por ejemplo, entre 100 y 500.000 compuestos, o más. Los compuestos se presentan frecuentemente en placas multipocillo y pueden disolverse en un disolvente (por ejemplo, DMSO) o proporcionarse en forma deshidratada, por ejemplo, como un polvo o sólido. Pueden ensayarse colecciones de compuestos sintéticos, semi-sintéticos y/o que existen de forma natural. Las bibliotecas de compuestos pueden comprender compuestos estructuralmente relacionados, estructuralmente diversos, o estructuralmente no relacionados. Los compuestos pueden ser artificiales (que tienen una estructura inventada por el hombre y no encontrada en la naturaleza) o existir de forma natural. En algunas realizaciones, una biblioteca comprende al menos algunos compuestos que se han identificado como "aciertos" o "cabezas de serie" en otros programas de descubrimiento de fármacos y/o derivados de los mismos. Una biblioteca de compuestos puede comprender productos naturales y/o compuestos generados utilizando química orgánica sintética no dirigida o dirigida. Frecuentemente, una biblioteca de compuestos es una biblioteca de moléculas pequeñas. Otras bibliotecas de interés incluyen bibliotecas de péptidos (peptidotecas) o de peptoides, bibliotecas de ADNc y bibliotecas de oligonucleótidos.
18 5
15
25
35
45
55
65
Una biblioteca puede estar enfocada (por ejemplo, puede estar compuesta principalmente de compuestos que tienen la misma estructura de núcleo, derivados del mismo precursor, o que tienen al menos una actividad bioquímica en común). En algunas realizaciones, se ensayan compuestos que se han identificado como inhibidores de una o más enzimas PLA2 del Grupo I-XV. En algunas realizaciones, la CI50 de un compuesto identificado como inhibidor de PLA2G16 puede ser aproximadamente 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500 o 1000 veces más baja para PLA2G16 frente a una o varias de otras enzimas PLA2 (por ejemplo, una, más de una, o todas las otras enzimas PLA2 presentes en seres humanos y conocidas hasta ahora).
Se dispone de bibliotecas de compuestos de diversos proveedores comerciales tales como Tocris BioScience, Nanosyn, BioFocus, y de entidades gubernamentales. Por ejemplo, el Molecular Libraries Small Molecule Repository (MLSMR), un componente del Programa de Bibliotecas Moleculares de los Institutos Nacionales Estadounidenses de Salud (NIH), está diseñado para identificar, adquirir, mantener y distribuir una colección de >300.000 compuestos químicamente diversos con actividades biológicas conocidas y desconocidas para su uso, por ejemplo, en ensayo de cribado de alto rendimiento (HTS) (véase https://mli.nih.gov/mli/). La Colección Clínica de NIH (NCC) es una matriz en placa de aproximadamente 450 moléculas pequeñas que tienen una historia de uso en ensayos clínicos humanos. Estos compuestos son muy similares a fármacos con perfiles de seguridad conocidos. La colección de NCC se presenta en seis placas de 96 pocillos. Se suministran 50 µl de cada compuesto, como una solución aproximadamente 10 mM en 100 % de DMSO. En algunas realizaciones, se prueba una colección de compuestos que comprende "fármacos humanos autorizados". Un "fármaco humano autorizado" es un compuesto que ha sido autorizado en el tratamiento de seres humanos por una agencia reguladora gubernamental tal como la Agencia estadounidense del Medicamento, Agencia europea de Evaluación de Medicamentos, o una agencia similar responsable de evaluar al menos la seguridad de agentes terapéuticos antes de permitir que sean comercializados. El compuesto de ensayo puede ser, por ejemplo, un fármaco antineoplásico, antibacteriano, antiviral, antifúngico, antiprotozoico, antiparasítico, antidepresivo, antipsicótico, anestésico, antianginoso, antihipertensor, antiarrítmico, antiinflamatorio, analgésico, antitrombótico, antiemético, inmunomodulador, antidiabético, hipolipemiante o hipocolesterolemiante (por ejemplo, estatina), anticonvulsivo, anticoagulante, ansiolítico, hipnótico (inductor del sueño), hormonal o antihormonal, etc. En algunas realizaciones, un compuesto es uno que ha experimentado al menos algún desarrollo preclínico o clínico o se ha determinado o predicho que tiene propiedades "similares a fármaco". Por ejemplo, el compuesto de ensayo puede haber completado un ensayo clínico de fase I o al menos un estudio preclínico en animales no humanos y haber mostrado pruebas de seguridad y tolerabilidad. En algunas realizaciones, un compuesto de ensayo es sustancialmente no tóxico para las células de un organismo a las que el compuesto puede administrarse o células en las que el compuesto puede ensayarse, a la concentración que va a usarse o, en algunas realizaciones, a concentraciones hasta 10 veces, 100 veces o 1.000 veces superiores a la concentración que va a usarse. Por ejemplo, puede no tener efecto estadísticamente significativo sobre la viabilidad y/o proliferación celular, o la reducción en la viabilidad o proliferación puede ser no superior al 1 %, 5 % o 10 % en diversas realizaciones. La citotoxicidad y/o el efecto sobre la proliferación celular pueden evaluarse utilizando cualquiera de una variedad de ensayos (algunos de los cuales se han mencionado anteriormente). En algunas realizaciones, un compuesto de ensayo no es un compuesto que se encuentre en un medio de cultivo celular conocido o usado en la materia, por ejemplo, medio de cultivo adecuado para cultivar células de vertebrado, por ejemplo, de mamífero o, si el compuesto de ensayo es un compuesto que se encuentra en un medio de cultivo celular conocido o usado en la materia, el compuesto de ensayo se utiliza a una concentración diferente, por ejemplo, más alta, cuando se utiliza en un método de la presente invención.
En algunas realizaciones, un compuesto de ensayo es un compuesto que es reconocido en la materia por tener actividad antiviral contra uno o más virus, pero que no se sabe que es útil para inhibir la infección por un virus de interés, por ejemplo, un picornavirus. En algunas realizaciones, un compuesto de ensayo no es un compuesto que sea reconocido en la materia por tener actividad antiviral.
En algunas realizaciones, se prueban uno o más compuestos o mezclas de los mismos que tienen actividad antiviral conocida, en las que la diana molecular del compuesto o mezcla y/o mecanismo de actividad antiviral es desconocida. La prueba de tales compuestos o mezclas según la presente invención para determinar si inhiben PLA2G16 puede conducir a descubrir que PLA2G16 es la diana molecular. Tal descubrimiento puede facilitar la purificación de un componente activo de una mezcla, desarrollo de derivados más altamente activos del compuesto, y/o permitir de otro modo el desarrollo adicional del compuesto o mezcla como agente terapéutico.
La etapa de determinar si un compuesto de ensayo inhibe la expresión de PLA2G16 puede llevarse a cabo de diversas maneras. Los compuestos que inhiben la expresión de PLA2G16 pueden identificarse poniendo en contacto células con un compuesto de ensayo, manteniendo las células en cultivo durante un periodo de tiempo adecuado (por ejemplo, un tiempo suficiente para permitir la degradación de ARNm de PLA2G16 y/o proteína existente), y después midiendo el nivel de ARNm de PLA2G16 o de proteína. Para medir ARNm o proteínas pueden usarse métodos conocidos en la técnica. Se dispone de diversos métodos diferentes basados en hibridación o basados en amplificación para medir ARN. Como ejemplos se incluyen, transferencias Northern, micromatriz (por ejemplo, micromatriz de oligonucleótidos o ADNc), (RT)-PCR con transcripción inversa (por ejemplo, RT-PCR cuantitativa), o transcripción inversa seguido de secuenciación. El ensayo TaqMan® y el ensayo de PCR SYBR® Green son técnicas de PCR en tiempo real comúnmente usadas. Otros ensayos incluyen RT-PCR™ normalizada (Sta) (Gene Express, Inc., Toledo, OH) y QuantiGene® (Panomics, Inc., Fremont, CA). En algunas realizaciones, se mide el nivel
19 5
15
25
35
45
55
65
de ARNm de PLA2G16. En otras realizaciones se utiliza un sistema basado en indicador. En algunas realizaciones, un sistema basado en indicador comprende un ácido nucleico en el que los elementos de control de la expresión del gen PLA2G16 están operativamente unidos a una secuencia que codifica una molécula indicadora ("indicador"). Los indicadores son frecuentemente proteínas, pero podrían ser ácidos nucleicos. Los indicadores son moléculas frecuentemente fácilmente detectables, tales como proteínas que producen una señal fluorescente, luminiscente o colorimétrica, o son capaces de absorber luz de una longitud de onda particular. En algunas realizaciones, una molécula indicadora comprende una enzima que actúa sobre un sustrato para producir una señal fluorescente, luminiscente o colorimétrica. Moléculas indicadoras a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, proteínas fluorescentes verde, azul, zafiro, amarilla, roja, naranja y cian, y derivados de las mismas; proteína fluorescente roja monomérica y derivados tales como aquellos conocidos como "mFruits", por ejemplo, mCherry, mStrawberry, mTomato; luciferasa; beta-galactosidasa; peroxidasa de rábano picante; fosfatasa alcalina; etc. En algunas realizaciones, un indicador es una proteína secretada. En algunas realizaciones, un indicador está codificado por una secuencia que está optimizada en los codones para la expresión en una célula de un organismo de interés. Métodos para la evaluación de la eficacia de un agente de iARN para silenciar la expresión de un gen diana pueden implicar el uso de una secuencia en la que el ARNm diana de un ARNhp o ARNip (o una porción de la diana) se clona en la dirección 3' de una secuencia que codifica un indicador, de manera que se produce un transcrito de ARNm bicistrónico que codifica tanto la secuencia diana como el indicador. La inactivación del gen diana produce la degradación (o inhibición traduccional) del transcrito de ARNm, que produce una disminución proporcional en la expresión de la proteína indicadora.
Los compuestos que inhiben la función molecular de PLAG16 pueden identificarse utilizando una variedad de diferentes ensayos acelulares o basados en células. Un ensayo acelular normalmente implica una molécula diana aislada. Por ejemplo, la molécula diana podría estar presente en un lisado de células o de tejido o fracción del mismo (por ejemplo, un lisado hecho de células que expresan la molécula diana) o podría ser una molécula diana al menos parcialmente purificada o sintetizada. Un lisado de tejido podría prepararse a partir de cualquier tejido que contuviera células que expresan PLA2G16. En algunas realizaciones, un lisado de tejido se obtiene a partir de tejido adiposo, por ejemplo, tejido adiposo blanco. Diversas células de las que un lisado celular podrían prepararse o a partir de las que podría purificarse un polipéptido PLA2G16 se mencionan más adelante en la discusión de ensayos basados en células. En algunas realizaciones, un polipéptido aislado es un polipéptido que ha sido sintetizado utilizando técnicas de ácido nucleico recombinantes o traducción in vitro. Con el fin de realizar el ensayo, un compuesto de ensayo se pone en contacto con la molécula diana, por ejemplo, preparando una composición que comprende el compuesto de ensayo y la molécula diana. Se miden uno o más parámetros, por ejemplo, unión, actividad enzimática, etc. La composición puede comprender otro(s) componente(s) necesario(s) o útil(es) para identificar un compuesto de interés. En algunas realizaciones, una composición para su uso en un ensayo de unión
o ensayo de actividad comprende membranas celulares o componentes de la membrana celular. Tales membranas
o componentes pueden existir de forma natural (por ejemplo, componentes presentes en la célula de membranas animales), artificial, o combinación de los mismos en diversas realizaciones. Por ejemplo, la composición puede contener una bicapa de membrana lipídica, vesículas de lípidos, etc. Opcionalmente, una bicapa lipídica se inmoviliza sobre una superficie. En algunas realizaciones, los lípidos comprenden fosfolípidos.
Para identificar compuestos que inhiben un polipéptido PLA2G16 puede realizarse una variedad de ensayos acelulares. En algunas realizaciones, un ensayo detecta si un compuesto de ensayo se une a un polipéptido PLA2G16 y/o cuantifica una o más características de tal unión. Se conocen numerosos formatos de ensayos de unión en la técnica. En algunas realizaciones, se utiliza un ensayo sin marca, mientras que en otras realizaciones tanto el polipéptido PLA2G16 como el compuesto de ensayo marcados de manera detectable. En algunas realizaciones, un polipéptido PLA2G16 o un compuesto que va a ensayarse con respecto a la capacidad para unirse a y/o inhibir la actividad de un polipéptido PLA2G16 está unido a un soporte sólido. En algunas realizaciones, un soporte sólido es un artículo que tiene una superficie rígida o semi-rígida. En algunas realizaciones, al menos una superficie del soporte es sustancialmente plana. En otras realizaciones, un soporte es aproximadamente esférico. Un soporte puede estar compuesto de un material inorgánico u orgánico o combinación de los mismos. En algunas realizaciones, un soporte está compuesto al menos en parte de un metal, cerámica, vidrio, plástico, gel, u otra matriz. Tales artículos pueden, por ejemplo, tomar la forma de placas (por ejemplo, placas multipocillo), portaobjetos, partículas (por ejemplo, "perlas", por ejemplo, perlas magnéticas), pellas, barras, varillas, agujas, discos, chips, filtros, u otra forma adecuada. En algunas realizaciones, un soporte comprende un sensor, por ejemplo, un sensor capaz de detectar cambios en la unión. Por ejemplo, el sensor podría detectar un cambio en el peso o una señal tal como la fluorescencia. En algunas realizaciones, el soporte comprende un electrodo. En algunas realizaciones, los compuestos están dispuestos como una micromatriz de moléculas pequeñas. Los compuestos podrían estar presentes en múltiples localizaciones sobre una superficie, en pocillos individuales o recipientes, etc. Véase, por ejemplo, Vegas AJ, et al., Chem Soc Rev. 37(7): 1385-94, 2008. En algunas realizaciones, un polipéptido PLA2G16
o compuesto está no covalentemente unido o covalentemente unido al soporte. La unión no covalente podría ser, por ejemplo, por adsorción del polipéptido o compuesto a la superficie (que puede recubrirse con una sustancia para facilitar tal adsorción), mediante un mecanismo basado en afinidad, u otros medios de inmovilización del polipéptido PLA2G16 o compuesto de ensayo de manera que siga físicamente asociado al soporte. En algunas realizaciones, un anticuerpo se utiliza para unir un polipéptido PLA2G16 o compuesto de ensayo a un soporte. En algunas realizaciones, un polipéptido PLA2G16 o compuesto de ensayo se une a un soporte mediante una interacción biotina-avidina u otra interacción de unión fuerte, en las que uno de los dos componentes de la unión se une
20
imagen12
5
15
25
35
45
55
65
condiciones que de otro modo (es decir, en ausencia de un compuesto que es un posible inhibidor de PLA2G16) serían apropiadas para el polipéptido PLA2G16 para catalizar una reacción en la que el (los) sustrato(s) se convierte/n en uno o más producto(s). La reacción puede detenerse después de un periodo de tiempo deseado, por ejemplo, mediante adición de (2:1) metanol:cloroformo. Las condiciones y otro(s) componente(s) presente(s) en la composición pueden variar dependiendo, por ejemplo, del ensayo particular. Condiciones adecuadas para un polipéptido PLA2G16 para actuar sobre un sustrato pueden incluir, por ejemplo, un pH de entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 9,5, por ejemplo, entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 9,0, por ejemplo, entre aproximadamente 7,5 y aproximadamente 8,5, por ejemplo, aproximadamente 8,0. En algunas realizaciones, la temperatura es entre 10 ºC y 40 ºC, por ejemplo, entre 20 ºC y 30 ºC, por ejemplo, aproximadamente 25 ºC. Pueden estar presentes otros componentes en la composición. En algunas realizaciones, la composición comprende una sustancia tampón tal como Tris-HCl o borato de sodio, para ayudar a regular el pH. Otras sustancias tampón incluyen, por ejemplo, HEPES, MOPS, etc. En algunas realizaciones, la composición comprende un catión divalente, por ejemplo, calcio (Ca2+). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición comprende calcio hasta aproximadamente 5 mM, por ejemplo, entre calcio aproximadamente 0,5 mM y aproximadamente 2,5 mM. En realizaciones a modo de ejemplo, la composición comprende calcio aproximadamente 1 mM o calcio aproximadamente 2 mM. En algunas realizaciones, la composición no comprende un quelante de calcio tal como EDTA. En algunas realizaciones, la composición comprende un quelante de calcio en una cantidad que no reduce la concentración de calcio libre por debajo de aproximadamente 1,0 mM. En algunas realizaciones, la composición comprende un detergente, por ejemplo, desoxicolato, por ejemplo, a entre 1-5 mM, por ejemplo, aproximadamente 2 mM o aproximadamente 3 mM.
En algunas realizaciones, se determina la cantidad de producto producida y/o la tasa de formación de producto. Se evalúa el efecto del compuesto de ensayo sobre la cantidad de producto producida y/o la tasa a la que se produce el producto, por ejemplo, comparando con un valor de referencia adecuado. Si la cantidad de producto o tasa de producción de producto es reducida en presencia del compuesto de ensayo en comparación con un valor de referencia adecuado, el compuesto de ensayo inhibe la capacidad del polipéptido PLA2G16 para catalizar una reacción en la que el sustrato se convierte en uno o más producto(s), es decir, el compuesto de ensayo es un inhibidor del polipéptido PLA2G16. En algunas realizaciones, se determina la tasa de consumo de sustrato o la cantidad de sustrato consumida. Equivalentemente, puede determinarse la cantidad de sustrato que queda. Si la cantidad de sustrato consumida o la tasa de consumo de sustrato es reducida en presencia del compuesto de ensayo en comparación con un valor de referencia adecuado, el compuesto de ensayo inhibe la capacidad del polipéptido PLA2G16 para catalizar una reacción en la que el sustrato se convierte en uno o más producto(s), es decir, el compuesto de ensayo es un inhibidor del polipéptido PLA2G16. Un valor de referencia en cualquiera de estos ensayos puede ser un valor medido en condiciones similares o idénticas en ausencia del compuesto de ensayo.
En algunas realizaciones, un sustrato de PLA2G16 es útil para medir actividad de fosfolipasa, por ejemplo, actividad de fosfolipasa A2. Por ejemplo, un sustrato de PLA2G16 puede ser un fosfolípido que existe de forma natural o artificial. Como se conoce en la técnica, la mayoría de los fosfolípidos están compuestos de 1,2-diacilglicerol y un grupo fosfato, y una molécula orgánica (frecuentemente una base nitrogenada). Un puente fosfodiéster une el esqueleto de glicerol con la base, que algunas veces se denomina "grupo de cabeza". Como ejemplos de grupos de cabeza se incluyen la colina, la etanolamina, el inositol y la serina. Por ejemplo, un sustrato puede ser una fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina. Las cadenas de hidrocarburo de los grupos acilo de una molécula de fosfolípido son frecuentemente diferentes, por ejemplo, derivan de moléculas de ácido graso con diferentes cadenas de hidrocarburo. En algunas realizaciones, las cadenas de hidrocarburo tienen entre 12 y 30 carbonos en longitud. En algunas realizaciones, un sustrato de PLA2G16 tiene la estructura de un fosfolípido que existe de forma natural, por ejemplo, un fosfolípido encontrado en células de vertebrado, por ejemplo, células de mamífero. Sustratos de PLA2G16 a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, 1-palmitoil-2-linoleoil-PC, dilinoleoil-PC, 1-palmitoil-2-linoleoil-PS, 1-palmitoil-2-linoleoil-PE, fosfatidilinositol, 1-palmitoil-2-araquidonil-PC (abreviaturas: PC: fosfatidilcolina PE: fosfatidiletanolamina; PS: fosfatidilserina). En algunas realizaciones, el sustrato comprende colina como grupo de cabeza. En algunas realizaciones, se utiliza un análogo de fosfolípido que contiene un enlace tioéster en lugar del éster sn-2. En algunas realizaciones, un sustrato de PLA2G16 es útil para medir la actividad de lisofosfolipasa. Por ejemplo, el sustrato puede ser una lisofosfatidilcolina, por ejemplo, 1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicerol-3-fosfocolina.
En algunas realizaciones, un sustrato comprende un resto que facilita la detección de un producto de una reacción bioquímica catalizada por un polipéptido PLA2G16. Por ejemplo, el sustrato puede comprender uno o más átomos radiactivos, marcas fluorescentes y/o extintores de la fluorescencia. En algunas realizaciones, la marca comprende 14C, 3H o 32P. En algunas realizaciones, el sustrato comprende un resto que emite una señal tras la escisión del sustrato. En algunas realizaciones, el sustrato comprende un resto que puede ser fácilmente detectado tras liberarse del sustrato. Por ejemplo, el resto puede reaccionar con otro compuesto para producir una señal colorimétrica, fluorescente o luminiscente. Marcas incluyen, por ejemplo, materiales orgánicos (incluyendo fluoróforos colorante "tradicionales", extintores y polímeros); materiales inorgánicos tales como quelatos metálicos, nanocristales metálicos y semiconductores (por ejemplo, "puntos cuánticos", y fluoróforos de origen biológico tales como ciertos aminoácidos (por ejemplo, triptófano, tirosina); y compuestos que presentan luminiscencia tras la catálisis enzimática tales como luciferinas que existen de forma natural o sintéticas (por ejemplo, luciferina de luciérnaga o Renilla, coelenterazina). Colorantes fluorescentes incluyen, por ejemplo, colorantes de acridina; colorantes Alexa; BODIPY,
22 5
15
25
35
45
55
65
colorantes de cianina; colorantes de fluoresceína, colorantes de rodamina, y derivados de cualquiera de los anteriores. Véase, por ejemplo, The Handbook -A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10ª Edición (Invitrogen Corp.), que describe numerosas moléculas fluorescentes y de otro modo detectables y métodos de su uso y modificación. En otra realización, se utiliza un análogo de fosfolípido que contiene un enlace tioéster en lugar del éster sn-2 éster, y la hidrólisis del enlace tioéster en la posición sn-2 por PLA2 libera el tiol libre que puede detectarse por DTNB (ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico)).
En algunas realizaciones, un sustrato está presente en una vesícula o micela. Por ejemplo, pueden usarse micelas de lípido-detergente. En algunas realizaciones, se utiliza un detergente iónico tal como desoxicolato. Otros detergentes incluyen, por ejemplo, Triton X-100. En algunas realizaciones, se utiliza una composición que contiene 1-palmitoil-2-linoleoil-PC aproximadamente 100 µM con desoxicolato 2 mM y CaCl22 mM. Puede incorporarse un compuesto de ensayo en la vesícula o micela.
Puede usarse una variedad de ensayos para medir la actividad catalítica de PLA2. En algunas realizaciones, se utiliza un ensayo que se ha usado en la materia para medir la actividad de una PLA2 del Grupo I-XV (por ejemplo, una PLA2 citosólica o secretada) o se modifica para su uso para medir la actividad catalítica de PLA2G16. En algunas realizaciones, se utiliza un ensayo radiométrico, con un sustrato de fosfolípido (por ejemplo, fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina) que contiene un ácido graso marcado con 14C o 3H en la posición sn-2. Los ácidos grasos liberados se separan del sustrato sin reaccionar y se cuantifican por recuento de centelleo líquido. En otras realizaciones, se utiliza un ensayo de desplazamiento de la fluorescencia. Puede detectarse una molécula fluorescente utilizando, por ejemplo, un espectrofotómetro. Un ensayo a modo de ejemplo implica el desplazamiento de una sonda de ácido graso fluorescente de albúmina o proteína de unión de ácido graso de hígado de rata por el ácido decanoico liberado como resultado de la hidrólisis catalizada por fosfolipasa A2 de didecanoil-fosfatidilcolina
A.R. Kinkaid & D.C. Wilton, A continuous fluorescence displacement assay for phospholipase a2 using albumin and medium chain phospholipid substrates. Anal. Biochem. 212: 65-70, 1993; D.C. Wilton, A continuous fluorescence displacement assay for the measurement of phospholipase A2 and other lipases that release long-chain fatty acids. Biochem. J. 266: 435-439, 1990). Véase, por tanto, Huang, Z., et al., Anal. Biochem. 222: 110-115, 1994, que describe un ensayo para la actividad de cPLA2 basado en la hidrólisis de ésteres de ácidos grasos de 7hidroxicumarina por cPLA2, que produce el ácido graso libre y la 7-hidroxicumarina muy fluorescente. Otro ensayo es un ensayo fluorimétrico de fosfolipasa, que se basa en sustratos de liposomas polimerizados (Chu, W., et al., Fluorometric phospholipase assays based on polymerised liposome substrates. Methods Mol. Biol. 109: 7-17, 1999). En otra realización, como sustrato, se utiliza un análogo de fosfolípido que contiene un enlace tioéter en lugar del éster sn-2, para medir la actividad de fosfolipasa (Yu, L, et al. Carbonothioate phospholipids as substrate for a spectrophotometric assay of phospholipase A2. Anal. Biochem. 265: 35-41, 1998).
En otra realización, como sustrato de PLA2, se utiliza un ensayo espectrofotométrico acoplado utilizando dilinoleoilfosfatidilcolina (DL-PC) y como enzima de acoplamiento se utiliza lipoxigenasa. Véase, por ejemplo, Jiménez, M., et al. A continuous spectrophotometric assay for phospholipase A(2) activity Anal Biochem., 319(1):131-7, 2003, y referencias en su interior, y Duncan, citado anteriormente. En este ensayo, la lipoxigenasa (linoleato:oxígeno oxidorreductasa, EC 1.13.11.12) cataliza la adición de oxígeno molecular a ácidos grasos que contienen al menos un sistema de (Z,Z)-pentadieno para dar los hidroperóxidos correspondientes. La lipoxigenasa oxida el ácido linoleico liberado por la acción de fosfolipasa, cuya actividad puede después seguirse espectrofotométricamente registrando el aumento en la absorbancia a 234 nm debido a la formación del hidroperóxido correspondiente a partir del ácido linoleico por la acción de lipoxigenasa. Este método proporciona un registro continuo de la hidrólisis de fosfolípidos.
En algunas realizaciones, se utiliza un ensayo de proximidad de centelleo (SPA, scintillation proximity assay). Por ejemplo, un sustrato de PLA2G16 radiomarcado puede unirse a perlas que contienen un material centelleante. Las perlas normalmente se localizan en pocillos u otros recipientes. En otra realización, el material centelleante se incorpora directamente en los pocillos. Un polipéptido PLA2G16 se añade al pocillo en una composición adecuada (que opcionalmente contiene calcio y/o un tampón). La hidrólisis del sustrato libera el resto radiactivo, produciendo una señal reducida. Véase, por ejemplo, J. Fraser Glickman, citado anteriormente, para la discusión de SPA.
En algunas realizaciones, una lectura de ensayo se basa en transferencia de energía por resonancia (RET), por ejemplo, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), transferencia de energía por resonancia de luminiscencia (LRET) o transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET). Puede implementarse una amplia variedad de ensayos basados en RET. En general, tales ensayos hacen uso de una interacción dependiente de la distancia que implica la transferencia de energía entre dos restos (algunas veces denominados donante y aceptor). Si ambos restos están presentes como parte de un sustrato de PLA2G16 y posicionados de manera que la escisión del sustrato libere uno de los restos, puede detectarse una señal (por ejemplo, un aumento o disminución en una señal). FRET es una interacción dependiente de la distancia entre los estados excitados electrónicos de dos restos en los que la excitación se transfiere de un resto de donante a un resto de aceptor sin emisión de un fotón, produciendo la emisión del aceptor de FRET. LRET tiene similitudes con FRET, pero usa un resto luminiscente, por ejemplo, un lantánido como donante de transferencia de energía. BRET es análogo a FRET, pero usa una biomolécula luminiscente o que genera luminiscencia tal como luciferasa, aecuorina,
o un derivado de las mismas como donante de energía y un resto fluorescente, por ejemplo, una biomolécula tal
23 5
15
25
35
45
55
65
como proteína verde fluorescente (GFP) como aceptor, eliminando así la necesidad de una fuente de luz de excitación (revisado en Pfleger, K. an Eidne, K., Nature Methods, 3(3), 165-174, 2006).
Los ensayos de la invención pueden detectar emisión de aceptor, extinción del donante (emisión reducida del donante de RET), y/o una alteración en la vida de la fluorescencia del donante. Los ensayos de la invención pueden hacer uso de aumentos en la emisión del aceptor, disminución en la emisión del aceptor, extinción del donante, reducción en la extinción del donante y/o aumento o disminución en la vida de la fluorescencia del donante para detectar la escisión de un sustrato de PLA2G16. Son de uso aceptores no fluorescentes, también denominados extintores, e incluyen los colorantes Dabcyl y QSY. Tales moléculas son capaces de absorber la energía de una marca fluorescente excitada cuando está localizada en estrecha proximidad y de disipar esa energía sin la emisión de luz visible. Se conocen en la técnica numerosos pares de donante/aceptor adecuados. Véase, por ejemplo, The Handbook -A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10ª Edición (Invitrogen Corp.).
En algunas realizaciones de un ensayo basado en FRET, una primera cadena de acilo del sustrato de PLA2G16 tiene un extintor de fluorescencia unido y la segunda cadena de acilo tiene un fluoróforo unido. La FRET intramolecular del fluoróforo al extintor extingue la fluorescencia hasta la escisión del sustrato mediada por PLA2, cuando al menos un resto de ácido graso se separa del resto de la molécula, y la distancia intermolecular supera la requerida para la eficiente transferencia de energía. Un aumento en la señal de fluorescencia indica la escisión del sustrato. La presencia de un inhibidor producirá una reducción en la señal de fluorescencia con respecto a la que se observaría en ausencia del inhibidor. En algunas realizaciones, la cadena de acilo sn-1 de los fosfolípidos contiene un extintor de la fluorescencia unido (por ejemplo, Dabcyl, también conocido como rojo de p-metilo), y la cadena de acilo sn-2 contiene un fluoróforo BODIPY añadido. La FRET intramolecular (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) al grupo Dabcyl extingue la fluorescencia de BODIPY hasta la escisión del sustrato mediada por PLA. Véase, por ejemplo, Rose, TM & Prestwich, GD, ACS Chemical Biology, 1(2): 83-89, 2006, para una descripción de fosfolípidos que contienen Dabcyl y BODIPY DBPA, DBPC, DBPE y DBPG (abreviaturas: DB: Dabcyl-BODIPY; PG: fosfatidilglicerol).
Otro formato de ensayo que puede usarse para medir la actividad de PLA2 es un ensayo basado en fluorescencia en el que polielectrolitos conjugados catiónicos están soportados sobre microesferas de sílice (véase, por ejemplo, Chemburu S, et al. Conjugated polyelectrolyte supported bead based assays for phospholipase A2 activity, Phys Chem B., 112(46):14492-9, 2008, que describe un ensayo tal para PLA2 derivada de suero humano. Este ensayo puede modificarse para su uso para detectar compuestos que inhiben la actividad de un polipéptido PLA2G16). Las perlas recubiertas de polímero se recubren en exceso con un fosfolípido aniónico para proporcionar "lipoperlas" que sirven de sensor para PLA2. El lípido sirve a una función doble como sustrato para PLA2 y un agente para atenuar la extinción de la fluorescencia del polímero por el extintor de transferencia de electrones externo ácido 9,10antraquinona-2,6-disulfónico (AQS). La extinción de la fluorescencia del polímero por AQS aumenta a medida que PLA2 digiere el lípido. El lípido también puede usarse él mismo como extintor y sustrato empleando una pequeña cantidad de lípido sustituido con extintor de transferencia de energía en el fosfolípido aniónico que recubre las perlas. En este caso, la fluorescencia del polímero se inactiva cuando la capa de lípido está intacta; a medida que la enzima digiere el lípido, se restaura la fluorescencia del polímero. La detección de la actividad de PLA2 puede realizarse monitorizando los cambios de fluorescencia en un lector de placa multipocillo y/o por citometría de flujo.
Un "ensayo basado en células" es un ensayo en el que células viables que expresan o contienen un polipéptido PLA2G16 se ponen en contacto con un compuesto de ensayo y se evalúa un parámetro de interés tal como la actividad de PLA2G16. Normalmente, las células se mantienen en cultivo celular y el compuesto de ensayo se añade al medio de cultivo. En algunas realizaciones, se evalúa el efecto del compuesto de ensayo sobre la capacidad del polipéptido PLA2G16 para actuar sobre un sustrato de PLA2G16. Por ejemplo, un sustrato de PLA2G16, por ejemplo, un sustrato detectablemente marcado, puede añadirse al medio de cultivo o ser sintetizado por la célula a partir de precursor marcado. La escisión del sustrato puede detectarse detectando un ácido graso libre o detectando un producto aguas abajo producido a partir de un ácido graso libre. Por ejemplo, el ácido araquidónico se modifica por ciclooxigenasas para formar eicosanoides (por ejemplo, prostaglandinas, leucotrienos). En algunas realizaciones, puede usarse una célula que carece sustancialmente de otras enzimas PLA2 que podrían actuar sobre el sustrato de PLA2G16. En algunas realizaciones, tales células se identifican por cribado de una variedad de líneas celulares para la expresión de enzimas PLA2 conocidas. En otras realizaciones, se genera una línea celular por deleción o inserción diana en los genes que codifican una o más enzima(s) PLA2 o haciendo que la célula exprese ARNhp que inhibe la expresión de tal(es) otra(s) enzima(s) PLA2. En otras realizaciones, el ensayo se realiza en células que han sido puestas en contacto con ARNip específico para tal(es) otra(s) enzima(s) PLA2 para inactivar su expresión.
Un compuesto identificado como un inhibidor de un polipéptido PLA2G16 puede ensayarse en cultivo celular o en modelos animales ("in vivo") para determinar su capacidad para inhibir la infección viral. En algunas realizaciones, células huésped se ponen en contacto con un virus y un inhibidor de PLA2G16 en condiciones adecuadas para la infección de las células. Se evalúa la capacidad del compuesto de ensayo para inhibir la infección viral. Si el compuesto reduce detectablemente la infección viral, el compuesto se identifica como un compuesto antiviral. El virus puede ser, por ejemplo, cualquier virus que utilice el polipéptido PLA2G16, o un polipéptido tipo PLA2G16, en su ciclo de vida.
24
imagen13
imagen14
imagen15
imagen16
imagen17
imagen18
imagen19
imagen20
imagen21
imagen22
imagen23
imagen24
imagen25
imagen26
imagen27
imagen28
imagen29

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
ES11796527.7T 2010-06-18 2011-06-17 PLA2G16 como diana para compuestos antivirales Active ES2611150T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35642610P 2010-06-18 2010-06-18
US356426P 2010-06-18
PCT/US2011/040920 WO2011160043A2 (en) 2010-06-18 2011-06-17 Pla2g16 as a target for antiviral compounds

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2611150T3 true ES2611150T3 (es) 2017-05-05

Family

ID=45348904

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11796527.7T Active ES2611150T3 (es) 2010-06-18 2011-06-17 PLA2G16 como diana para compuestos antivirales

Country Status (8)

Country Link
US (2) US20130211209A1 (es)
EP (1) EP2583099B1 (es)
JP (2) JP6053675B2 (es)
KR (1) KR101931628B1 (es)
AU (1) AU2011268127B2 (es)
CA (1) CA2805409A1 (es)
ES (1) ES2611150T3 (es)
WO (1) WO2011160043A2 (es)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015018797A2 (en) * 2013-08-05 2015-02-12 Haplogen Gmbh Antiviral compounds
GB2527364A (en) * 2014-06-20 2015-12-23 Imp Innovations Ltd Treatment
CA3036428A1 (en) 2016-09-13 2018-03-22 Haplogen Gmbh Antiviral compounds
WO2019068841A1 (en) 2017-10-05 2019-04-11 Haplogen Gmbh ANTIVIRAL COMPOUNDS
EP3989971A4 (en) * 2019-06-28 2023-08-09 Niklovir AB NEW ANTIVIRAL THERAPIES

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5523389A (en) * 1992-09-29 1996-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of human immunodeficiency virus
TW577875B (en) 1997-01-31 2004-03-01 Shionogi & Co Pyrrolidine derivatives with inhibitory activity for phospholipase A2
WO2000027824A1 (en) 1998-11-12 2000-05-18 Elan Pharmaceuticals Substituted pyrimidine compositions and methods of use
NZ520752A (en) 2000-02-16 2004-03-26 Smithkline Beecham P Pyrimidine-4-one derivatives as LDL-PLA2 inhibitors
GB0024808D0 (en) 2000-10-10 2000-11-22 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
GB0024807D0 (en) 2000-10-10 2000-11-22 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
GB0127143D0 (en) 2001-11-10 2002-01-02 Smithkline Beecham Novel compounds
GB0127139D0 (en) 2001-11-10 2002-01-02 Smithkline Beecham Novel compounds
GB0127140D0 (en) 2001-11-10 2002-01-02 Smithkline Beecham Novel compounds
US6797708B2 (en) 2001-12-03 2004-09-28 Wyeth Inhibitors of cytosolic phospholipase A2
FR2833261B1 (fr) 2001-12-06 2004-07-02 Yang Ji Chemical Company Ltd Nouveaux composes inhibiteurs specifiques de la phospholipase a2 secretee non pancreatique humaine du groupe ii
GB0208280D0 (en) 2002-04-10 2002-05-22 Glaxo Group Ltd Novel compounds
GB0208279D0 (en) 2002-04-10 2002-05-22 Glaxo Group Ltd Novel compounds
GT200600228A (es) * 2005-05-27 2006-12-26 Inhibidores de la fosfolipasa a2 citosolica
CA2619641A1 (en) 2005-08-17 2007-02-22 The Regents Of The University Of California Systemic and intrathecal effects of a novel series of phospholipase a2 inhibitors on hyperalgesia and spinal pge2 release
WO2009100035A2 (en) * 2008-02-01 2009-08-13 Wyeth Interleukin-21 (il-21) and il-21 receptor (il-21r) modulation of regulatory t cells and forkhead box p3 (foxp3)
JP5366074B2 (ja) * 2008-11-05 2013-12-11 プライムテック株式会社 共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子ノックアウトブタ
CA2767623C (en) 2009-07-09 2018-11-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for mammalian genetics and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20130219533A1 (en) 2013-08-22
JP2013537515A (ja) 2013-10-03
WO2011160043A2 (en) 2011-12-22
AU2011268127B2 (en) 2016-01-14
US9011821B2 (en) 2015-04-21
AU2011268127A1 (en) 2013-01-10
JP6053675B2 (ja) 2016-12-27
JP6285993B2 (ja) 2018-02-28
KR20140004556A (ko) 2014-01-13
EP2583099A2 (en) 2013-04-24
CA2805409A1 (en) 2011-12-22
KR101931628B1 (ko) 2019-03-13
US20130211209A1 (en) 2013-08-15
WO2011160043A3 (en) 2012-05-31
EP2583099B1 (en) 2016-11-02
JP2017018113A (ja) 2017-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2611150T3 (es) PLA2G16 como diana para compuestos antivirales
Blanchetot et al. Regulation of receptor protein‐tyrosine phosphatase α by oxidative stress
US8394602B2 (en) Luminescent method for measuring endotoxin
JP4668418B2 (ja) 多種酵素アッセイ
Hou et al. A ratiometric fluorescent probe for in vivo tracking of alkaline phosphatase level variation resulting from drug-induced organ damage
US20160223529A1 (en) Bimolecular protease-based biosensor
CN113564149B (zh) 一种三联体融合蛋白及其在病毒自剪切蛋白酶抑制剂活性评估和筛选时的应用
Hermann et al. C. elegans BLOC-1 functions in trafficking to lysosome-related gut granules
Li et al. Measurement of the activity of the Atg4 cysteine proteases
Hwang et al. Use of fluorescence resonance energy transfer for rapid detection of enteroviral infection in vivo
CA2768042C (en) Bret-based biosensors and methods for monitoring raf dimerization
US20230341397A1 (en) Protease biosensors and methods of virus detection
Gong et al. β-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG
Aryan et al. Nucleolus activity-dependent recruitment and biomolecular condensation by pH sensing
Huang et al. Z-REX: shepherding reactive electrophiles to specific proteins expressed tissue specifically or ubiquitously, and recording the resultant functional electrophile-induced redox responses in larval fish
JP2020521118A (ja) 遺伝学的にコードされたカリウムイオン指標
GB2349217A (en) Screening methods for compounds affecting SERCA activity
Monillas et al. Oligomeric state regulated trafficking of human platelet-activating factor acetylhydrolase type-II
TWI457565B (zh) 用於鑑別出改變ＮＡＰＥ－ＰＬＤ或Ａｂｈ４之作用劑的分析方法
KR20200145063A (ko) 구제역 바이러스 진단을 위한 리보조절인자 및 이의 용도
WO2005114188A2 (en) Cul4 e3 ligase mediators as regulators of p53
JP2010213658A (ja) 細胞内プロテアーゼ活性の解析方法及びキメラタンパク質
Hermann et al. C. elegans
Belting et al. ErbB4 tyrosine kinase inhibition impairs neuromuscular development in zebrafish embryos