JP2013537515A - 抗ウイルス化合物のためのターゲットとしてのｐｌａ２ｇ１６ - Google Patents

抗ウイルス化合物のためのターゲットとしてのｐｌａ２ｇ１６ Download PDF

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Abstract

いくつかの側面において、本発明は、ウイルス感染を阻害するための組成物および方法を提供する。いくつかの側面において、本発明は、抗ウイルス化合物を同定するのに有用な組成物および方法を提供する。
【選択図】図１

Description

関連出願
[0001]本出願は、２０１０年６月１８日出願の米国出願第６１／３５６，４２６号に対する優先権および恩典を請求する。本出願の全内容は本明細書に援用される。
[0002]ウイルスは、世界中の疾患および死亡の主因である。ワクチンおよび公衆衛生手段によって、特定のウイルス感染の発生は非常に減少してきているが、こうしたアプローチは、医学的および／または獣医学的に非常に重要な多くのウイルスと取り組む際にはさほど成功してきていない。広く防御性のワクチンが存在するとしても、すべての個体のワクチン接種を達成するのは困難である。さらに、免疫老化および免疫抑制薬剤での治療などの要因のために、有効な免疫に対する障害が生じうる。いくつかのウイルスに対して、薬理学的療法が開発されてきており、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が有名な例である。しかし、有効な薬剤が利用可能であるのは、なお比較的わずかなウイルス疾患に過ぎない。
新規抗ウイルス化合物に関する、そしてこうした化合物を同定する新規アプローチに関する必要性がある。
発明の概要
[0003]本発明は、少なくとも部分的に、抗ウイルス薬剤発見のためのターゲットの同定に関する。１つの側面において、本発明は、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤と細胞を接触させる工程を含む、細胞のウイルス感染を阻害する方法を提供する。いくつかの態様において、ウイルスはピコルナウイルスである。いくつかの態様において、細胞は脊椎動物細胞である。いくつかの態様において、脊椎動物細胞は哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤はＰＬＡ２Ｇ１６の発現を阻害する。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤はＰＬＡ２Ｇ１６の酵素活性を阻害する。
[0004]別の側面において、本発明は、ウイルス感染の治療が必要な被験体にＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤を投与する工程を含む、被験体においてウイルス感染を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、ウイルス感染はピコルナウイルス感染である。いくつかの態様において、被験体は脊椎動物である。いくつかの態様において、被験体は哺乳動物、例えばヒトである。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤はＰＬＡ２Ｇ１６の発現を阻害する。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤はＰＬＡ２Ｇ１６の酵素活性を阻害する。
[0005]別の側面において、本発明は、候補抗ウイルス化合物を同定する、以下の工程を含む方法を提供する：（ａ）ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドおよび試験化合物を含む組成物を提供し；（ｂ）試験化合物がＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを阻害するかどうかを決定する工程、ここで、化合物がＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを阻害する場合、化合物が候補抗ウイルス化合物として同定される。いくつかの態様において、工程（ｂ）は、試験化合物がＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの発現を阻害するかどうかを決定する工程を含む。いくつかの態様において、工程（ｂ）は、試験化合物がＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの酵素活性を阻害するかどうかを決定する工程を含む。いくつかの態様において、酵素活性はホスホリパーゼＡ２活性である。いくつかの態様において、工程（ａ）の組成物は精製ＰＬＡ２Ｇ１６を含む細胞不含組成物であり；そして工程（ｂ）は、試験化合物がＰＬＡ２Ｇ１６の酵素活性を阻害するかどうかを決定する工程を含む。いくつかの態様において、工程（ａ）の組成物はＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを発現する細胞を含み、そして工程（ｂ）は、試験化合物がＰＬＡ２Ｇ１６の発現または酵素活性を阻害するかどうかを決定する工程を含む。いくつかの態様において、化合物がＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを阻害する場合、化合物はピコルナウイルスによるウイルス感染を阻害するのに有用な候補抗ウイルス化合物として同定される。いくつかの態様において、方法は、化合物が細胞または被験体のウイルス感染を阻害する能力を評価する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、細胞を化合物およびウイルスと接触させる工程をさらに含む、ここで細胞は化合物の非存在下でウイルスに感受性である。いくつかの態様において、方法は、被験体に化合物を投与する工程をさらに含む、ここで被験体は化合物の非存在下でウイルスによる感染に感受性である。いくつかの態様において、方法は、ウイルスに感染した細胞と化合物を接触させる工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、ウイルスに感染した被験体に化合物を投与する工程をさらに含む。
[0006]別の側面において、本発明は、以下の工程を含む、候補抗ウイルス化合物を検証する方法を提供する：（ａ）ＰＬＡ２ｇ１６を阻害する化合物を同定するかまたは選択することを含む方法にしたがって同定された候補抗ウイルス化合物を提供し；そして（ｂ）化合物がウイルスによる細胞または生物の感染を阻害するかどうかを決定する工程、ここで化合物がウイルスによる細胞または生物の感染を阻害する場合、化合物が抗ウイルス化合物として検証される。いくつかの態様において、ウイルスはピコルナウイルスである。
[0007]別の側面において、本発明は：（ａ）ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤；（ｂ）ウイルス；および（ｃ）細胞集団を含む、組成物を提供する。いくつかの態様において、ウイルスは少なくとも０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で存在する。いくつかの態様において、ウイルスはピコルナウイルスである。いくつかの態様において、細胞は培養されている。いくつかの態様において、細胞は脊椎動物細胞である。いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞集団は、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、またはそれより多い細胞を含む。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞の少なくともいくつかはウイルスに感染している。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤はＰＬＡ２Ｇ１６に結合する。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤はＰＬＡ２Ｇ１６の発現を阻害する。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤はＰＬＡ２Ｇ１６の酵素活性を阻害する。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は小分子である。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤はウイルスによる細胞の感染を検出可能に阻害するのに十分な量で存在する。
[0008]別の側面において、本発明は、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤を含む組成物であって、被験体におけるウイルス感染を治療するのに有用な、前記組成物を提供する。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤はＰＬＡ２Ｇ１６に結合する。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤はＰＬＡ２Ｇ１６の発現を阻害する。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤はＰＬＡ２Ｇ１６の酵素活性を阻害する。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は小分子である。いくつかの態様において、ウイルス感染はピコルナウイルス感染である。いくつかの態様において、被験体は脊椎動物である。いくつかの態様において、被験体は哺乳動物、例えばヒトである。
[0009]別の側面において、本発明は、ＰＬＡ２Ｇ１６をコードする遺伝子中に突然変異を有する哺乳動物細胞を提供する。いくつかの態様において、細胞は近半数体（ｎｅａｒ−ｈａｐｌｏｉｄ）細胞である。いくつかの態様において、細胞はＰＬＡ２Ｇ１６の突然変異体型を発現する。いくつかの態様において、細胞はＰＬＡ２Ｇ１６の突然変異体型を発現する、ここで突然変異体型は、非突然変異体型と比較した際、減少した触媒活性を有する。
[0010]別の側面において、本発明は、ウイルス感染に対して増加した耐性を有する非ヒト多細胞生物、例えば脊椎動物を同定する方法であって、機能ＰＬＡ２Ｇ１６が減少しているかまたは存在しない多細胞生物を同定する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、ウイルスによる感染に対して、増加した耐性を持つ非ヒト多細胞生物を同定する方法であって、生物が減少したＰＬＡ２Ｇ１６発現または活性を有するかどうか決定する工程を含む、ここで生物が減少したＰＬＡ２Ｇ１６発現または活性を有する場合、該生物がウイルスによる感染に対して、増加した耐性を有する、前記方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、ＰＬＡ２Ｇ１６が減少しているかまたは存在しない生物を、農業および／または畜産において提供するかまたは用いる工程をさらに含む。いくつかの態様において、ウイルス耐性動物は非家畜化種である。場合によって、種は危機に瀕している。いくつかの態様において、生物は商業的に重要な脊椎動物である。本発明のいくつかの態様において、生物は遺伝子改変（genetically modofied）されていない。
[0011]別の側面において、本発明は、機能ＰＬＡ２Ｇ１６が減少しているかまたは存在しない農場動物であって、ウイルスによる感染に対して増加した耐性を有する、前記動物を提供する。いくつかの態様において、動物は遺伝子改変されていない。他の態様において、動物は遺伝子改変されている。
[0012]本発明の任意の側面の特定の態様において、ピコルナウイルスはエンテロウイルス（エンテロウイルス属のメンバー）である。特定の態様において、エンテロウイルスは、ヒト・エンテロウイルス、例えばヒト・エンテロウイルスＡ、ヒト・エンテロウイルスＢ、ヒト・エンテロウイルスＣ、ヒト・エンテロウイルスＤ、ヒト・ライノウイルスＡ、ヒト・ライノウイルスＢ、またはヒト・ライノウイルスＣ種内に分類されるウイルスである。いくつかの態様において、ヒト・エンテロウイルスは、ポリオウイルス１、２、または３、あるいはヒト・エンテロウイルス６８〜１０７のいずれか、例えばＥＶ−７１である。本発明の任意の側面の特定の態様において、ピコルナウイルスはヘパトウイルス、例えばヒトＡ型肝炎ウイルスである。本発明の任意の側面の特定の態様において、ピコルナウイルスはコクサッキーウイルスである。特定の態様において、コクサッキーウイルスはヒト・コクサッキーウイルス、例えばコクサッキーウイルスＡ１〜Ａ２２、Ａ２４、またはＢ１〜Ｂ５のいずれかである。本発明の任意の側面の特定の態様において、ピコルナウイルスはライノウイルス（ヒト・ライノウイルスＡ、ヒト・ライノウイルスＢ、またはヒト・ライノウイルスＣ種のメンバー）、例えばヒト・ライノウイルス１〜１００のいずれかである。本発明の任意の側面の特定の態様において、ピコルナウイルスはエコーウイルスである。本発明の任意の多様な側面の特定の態様において、ウイルスは口蹄疫ウイルス、例えば７つの口蹄疫ウイルス血清型：Ｏ、Ａ、Ｃ、ＳＡＴ−１、ＳＡＴ−２、ＳＡＴ−３、およびアジア−１の１つである。
[0013]本発明の実施は、別に示さない限り、典型的には、当該技術分野の技術内の、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換え核酸（例えばＤＮＡ）技術、免疫学、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の慣用技術を使用するであろう。特定のこれらの技術の限定されない説明は、以下の刊行物中に見出される： Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．ら（監修）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、すべてＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、２００８年１２月版； Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｒｕｓｓｅｌｌ， およびＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第３版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， コールドスプリングハーバー， ２００１； Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．およびＬａｎｅ， Ｄ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ− Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， コールドスプリングハーバー， １９８８； Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．， “Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”， 第５版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニュージャージー州ホーボケン， ２００５。ウイルスに関する限定されない情報は、例えば、Ｋｎｉｐｅ， ＤＭおよびＨｏｗｌｅｙ， ＰＭ（監修） Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， 第Ｉ巻および第ＩＩ巻， 第５版． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２００７； Ｂｕｅｃｈｅｎ−Ｏｓｍｏｎｄ， Ｃ．（監修）， （２００６） Ｉｎｄｅｘ ｔｏ ＩＣＴＶｄＢ ｖｉｒｕｓ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ．： ＩＣＴＶｄＢ− Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｄａｔａｂａｓｅ， バージョン４中． ＩＣＴＶｄＢ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ， Ｍａｉｌｍａｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ， コロンビア大学， 米国ニューヨーク州ニューヨーク；ならびに“ＩＣＴＶｄＢ−Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｄａｔａｂａｓｅ”， バージョン４， ２００６年４月． ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｔｖｄｂ．ｏｒｇ／Ｉｃｔｖ／ＩＣＴＶｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ）およびＩＣＴＶｄｂ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｔｖｄｂ．ｏｒｇ／ＩＣＴＶｄＢ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ）に見出される。（オンラインデータベースは現在書き換え中であることに注意されたい。）国際微生物学連合の国際ウイルス分類学委員会（ＩＣＴＶ）の最新の報告： “Ｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ： ＶＩＩＩｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ”， ２００５， Ｃ．Ｍ． Ｆａｕｑｕｅｔ， Ｍ．Ａ． Ｍａｙｏ， Ｊ． Ｍａｎｉｌｏｆｆ， Ｕ． Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｇｅｒ，およびＬ．Ａ． Ｂａｌｌ（監修）， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓが、ウイルス分類学（分類および命名）の標準および定義参考文献と見なされ、これを、ＩＣＴＶによって続いて認可される分類学的提案が補足する。（ＩＣＴＶウェブサイト上、
ｈｔｔｐ：／／ｔａｌｋ．ｉｃｔｖｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｍｅｄｉａ／２２／ｄｅｆａｕｌｔ．ａｓｐｘ／．
ｈｔｔｐ：／／ｔａｌｋ．ｉｃｔｖｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｆｉｌｅｓ／ｉｃｔｖ＿ｏｆｆｉｃｉａｌ＿ｔａｘｏｎｏｍｙ＿ｕｐｄａｔｅｓ＿ｓｉｎｃｅ＿ｔｈｅ＿８ｔｈ＿ｒｅｐｏｒｔ／ｄｅｆａｕｌｔ．ａｓｐｘとして改訂として入手可能）（Ｃａｒｓｔｅｎｓ， ＥＢおよびＢａｌｌ， Ｌ． Ｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｖｏｔｅ ｏｎ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｐｒｏｐｏｓａｌｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ． Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， 第１５４巻， 第７号， ２００８、ならびにＣａｒｓｔｅｎｓ， Ｅ． Ｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｖｏｔｅ ｏｎ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｐｒｏｐｏｓａｌｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ（２００９） Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， 第１５５巻， 第１号， ２００９もまた参照されたい）。Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ： ２００９ リリースｖ４（２０１０年３月２０日）（ＩＣＴＶウェブサイト上、ｈｔｔｐ：／／ｉｃｔｖｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｖｉｒｕｓＴａｘｏｎｏｍｙ．ａｓｐで入手可能）が最新の分類学を示す。
[0014]療法剤およびヒト疾患に関する限定されない情報が、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， 第１１版， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， ２００５， Ｋａｔｚｕｎｇ， Ｂ．（監修） Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ／Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ； 第１０版（２００６）または第１１版（Ｊｕｌｙ ２００９)に見出される。本明細書に言及されるすべての特許、特許出願、および他の刊行物（例えば科学論文、書籍、ウェブサイト、およびデータベース）は、その全体が本明細書に援用される。明細書および援用される参考文献のいずれかの間に矛盾がある場合、本明細書（援用される参考文献に基づきうる、任意のその改正を含む）が統制するものとする。別に示さない限り、本明細書において、標準的に当該技術分野に認められる用語の意味を用いる。多様な用語の標準的な略語を用いる。
[0015]Ａ．内因性遺伝子におけるジーントラップベクター組込みの模式的概略。Ｂ．ポリオウイルス複製に必須の遺伝子に関する半数体遺伝子スクリーンの模式的概略。 [0016]半数体遺伝子スクリーンは、ＰＬＡ２Ｇ１６がポリオウイルス感染に必須であると同定する。突然変異誘発された半数体細胞をポリオウイルスと接触させ、そして耐性コロニーを増殖させた。逆ＰＣＲおよび大規模平行配列決定を用いて、ジーントラップ挿入部位を決定した。プロットは、個々のジーントラップ突然変異がマッピングされたヒト染色体上の位置をｘ軸上に、そして特定の突然変異からその隣接するものまでの距離をｙ軸上に示す。突然変異は、染色体１９中の既知のポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）において、そして染色体１１上の４２の独立のジーントラップ挿入を含有するホスホリパーゼＰＬＡ２Ｇ１６において、非常に濃縮されている。 [0017]野生型半数体細胞（ＷＴ；レーン１）、ＰＬＡ２Ｇ１６遺伝子中にジーントラップ挿入を含有する細胞（ＰＬＡ２Ｇ１６ＧＴ；レーン２）、ＰＬＡ２Ｇ１６中にジーントラップを含有し、そしてＦＬＡＧタグ化ＰＬＡ２Ｇ１６を発現する細胞（レーン３）；ＰＬＡ２Ｇ１６中にジーントラップを含有し、ＦＬＡＧタグ化突然変異体ＰＬＡ２Ｇ１６を発現する細胞（レーン４）；ＰＬＡ２Ｇ１６中にジーントラップを含有し、そして非タグ化ＰＬＡ２Ｇ１６を発現する細胞（レーン５）；ＰＬＡ２Ｇ１６中にジーントラップを含有し、そして非タグ化突然変異体ＰＬＡ２Ｇ１６を発現する細胞（レーン６）における、ＰＬＡ２Ｇ１６の発現に関するウェスタンブロット分析。 [0018]ＰＬＡ２Ｇ１６ジーントラップ挿入を含有する半数体細胞は、ポリオウイルス感染に耐性である。レトロウイルス過剰発現によってＰＬＡ２Ｇ１６を補完すると、ポリオウイルスに対するこれらの細胞の感受性が回復する。触媒部位突然変異体（Ｃ１１３Ａ）で補完しても感受性が回復しないため、これには、ＰＬＡ２Ｇ１６の触媒活性が必要である。 [0019]ＰＬＡ２Ｇ１６ジーントラップ挿入を含有する細胞は、コクサッキーウイルスＢ１に耐性である。細胞を２４ウェルのウェルにそして単層でプレーティングし、示すＭＯＩでウイルスを添加した。感染４日後、クリスタルバイオレットを用いて、生存している接着細胞を染色した。ＰＬＡ２Ｇ１６に関して突然変異体である細胞は、高濃度のコクサッキーウイルスＢ１によって影響を受けなかった。レトロウイルス過剰発現によってＰＬＡ２Ｇ１６を補完すると、コクサッキーウイルスＢ１に対するこれらの細胞の感受性が回復する。触媒部位突然変異体（Ｃ１１３Ａ）で補完しても感受性が回復しないため、これには、ＰＬＡ２Ｇ１６の触媒活性が必要である。 [0020]（Ａ）ポリオウイルスに対する野生型およびジーントラップ突然変異体細胞の感受性。（Ｂ）コクサッキーウイルスＢ１に対する野生型およびジーントラップ突然変異体細胞の感受性。示すＭＯＩ（ｘ軸）で細胞にポリオウイルスを添加し、そしてＭＴＴアッセイを用いて、３日後に生存度を測定した。ＨＡＰ１：野生型ＨＡＰ１細胞（ジーントラップなし）ＰＬＡ２Ｇ１６：ＰＬＡ２Ｇ１６遺伝子内にジーントラップ挿入を含有するＨＡＰ１細胞（ＰＬＡ２Ｇ１６ＧＴ）ＰＬＡ２Ｇ１６＋ＰＭ２Ｇ１６ＷＴ：野生型ＰＬＡ２Ｇ１６をコードするレトロウイルスに感染させたＨＡＰ１ ＰＬＡ２Ｇ１６ＧＴ細胞ＰＬＡ２Ｇ１６＋ＰＭ２Ｇ１６ＭＵＴ：触媒的に不活性である突然変異体ＰＬＡ２Ｇ１６（Ｃ１１３Ａ突然変異を含む）をコードするレトロウイルスに感染させたＨＡＰ１ ＰＬＡ２Ｇ１６ＧＴ細胞ＰＶＲ：ポリオウイルス受容体内にジーントラップ挿入を持つＨＡＰ１細胞。 [0021]Ｈｅｌａ細胞におけるＰＬＡ２Ｇ１６のノックダウンの結果、ヒト・ライノウイルスＨＲＶ−２およびＨＲＶ−１４に対する耐性が増加した。 [0022]例示的なＰＬＡ２Ｇ１６配列。ヒト配列において、予測される膜貫通ドメインを太字で示す。
[0023]Ｉ．定義
[0024]用語「抗体」は、免疫グロブリン、および抗原に結合可能な免疫グロブリンドメインを含有するその誘導体を含む。抗体は、哺乳動物または鳥類種、例えばヒト、げっ歯類（例えばマウス、ウサギ）、ヤギ、ニワトリ等から生じてもよいし、あるいはファージディスプレイなどの技術を用いて、ｅｘ ｖｉｖｏで生成されてもよい。抗体には、多様な免疫グロブリンクラスのメンバー、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはそのサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２等が含まれる。本発明の多様な態様において、「抗体」は、抗原結合部位を保持し、そして１またはそれより多い可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）を含む組換え分子を含む、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（一本鎖可変）などの抗体断片または分子を指す。抗体は、多様な態様において、一価、二価または多価であってもよい。抗体は、キメラまたは「ヒト化」抗体であってもよい。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい可能性もある。いくつかの側面において、抗体はイントラボディであり、これを細胞内で発現させてもよい。いくつかの態様において、化合物は、一本鎖抗体およびタンパク質形質導入ドメイン（例えば融合ポリペプチドとして）を含む。
[0025]化合物または他の剤（あるいはこうした化合物または剤を含有する組成物）の「有効量」または「有効用量」は、例えば、選択した投与型、経路、および／またはスケジュールにしたがって、細胞または生物に送達した際、望ましい生物学的および／または薬理学的効果を達成するのに十分な量を指す。一般の当業者には認識されるであろうように、有効である特定の化合物、剤、または組成物の絶対量は、所望の生物学的または薬理学的目的、送達しようとする剤、ターゲット組織等の要因に応じて多様でありうる。一般の当業者はさらに、「有効量」を、単一の用量で細胞と接触させるかまたは投与してもよいし、あるいは多数の用量を使用することによって、所望の効果を達成してもよいことを理解するであろう。抗ウイルス化合物の有効量は、以下の１またはそれより多くを達成するのに十分な量であってもよい：（ｉ）細胞培養において、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで、ウイルス複製を減少させる（例えば子孫ウイルスの産生を減少させる）；（ｉｉ）ウイルス感染の１またはそれより多い症状または徴候の重症度を減少させるか、またはこれらを防止する；（ｉｉｉ）ウイルス感染の再発リスクを有意に減少させる（例えば逆戻りするリスクを減少させる）；（ｉｖ）感染性病原体に曝露されている被験体において、臨床的に有意な感染のリスクを有意に減少させる。
[0026]「同一性」または「同一性パーセント」は、２またはそれより多い核酸またはポリペプチドの配列が同じである度合いの測定値である。配列を整列させて、同一性が最大になるようにギャップの導入を許容し、反対にある同一残基の残基（ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を決定し、ＴＧＡおよびＴＧＢ（ここで、ＴＧＡおよびＴＧＢは、整列中の配列ＡおよびＢにおける残基および内部ギャップ位の数の合計である）の最小値で割り、そして１００を乗じることによって、関心対象の配列Ａおよび第二の配列Ｂの間の同一性パーセントを計算してもよい。特定の同一性パーセントを達成するのに必要な同一残基の数を計算する際、小数を最も近い整数に四捨五入する。当該技術分野に知られる多様なコンピュータプログラムを使用して、配列を整列させてもよい。例えば、ＢＬＡＳＴ２、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ギャップ化ＢＬＡＳＴ等のコンピュータプログラムは整列を生成する。ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７， １９９３におけるように修飾された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２２６４−２２６８， １９９０）は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０， １９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれている。いくつかの態様において、比較目的のため、ギャップ化整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２， １９９７）に記載されるように、ギャップ化ＢＬＡＳＴを利用する。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する際、それぞれのプログラムのデフォルト・パラメータを使用してもよい。ＵＲＬ ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を有するウェブサイトを参照されたい。他の適切なプログラムには、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＤ， Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ， Ｇｉｂｓｏｎ ＴＪ， Ｎｕｃ Ａｃ Ｒｅｓ， ２２：４６７３−４６８０， １９９４）およびＧＡＰ（ＧＣＧバージョン９．１； ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの１９７０アルゴリズムを実行する（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＳＢ， Ｗｕｎｓｃｈ ＣＤ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ４８：４４３−４５３， １９７０．）が含まれる。
[0027]「感染」は、ウイルスなどの微生物による細胞（ときに「宿主細胞」または「宿主」と呼ばれる）または多細胞生物（ときに、「宿主」と呼ばれる）の（しばしば有害な）コロニー形成を指す。感染プロセスは、１またはそれより多い細胞内へのウイルスの進入（侵入）、および感染が進行した場合、ウイルス生活環の続く段階を含み、典型的にはウイルスの多重化を生じ、そしてしばしば医学的または獣医学的に重要なウイルスの場合、宿主に対してウイルスの有害な影響を生じる。ウイルス感染は、１またはそれより多いウイルス集団の存在が宿主細胞または生物に損傷を与えるいかなる状況であってもよい。用語「感染」は、脊椎動物、例えば哺乳動物、または他の生物の体内または体表に通常存在するウイルスの過剰な複製、あるいは脊椎動物、例えば哺乳動物、または他の生物の体内または体表に通常存在しないウイルスの存在および場合によって複製を含む。
[0028]「阻害する」は、文脈において適切であるように、「抑制する」、「減少させる」等の用語と交換可能に使用可能である。阻害の度合いは多様でありうることが理解されるであろう。例えば、阻害は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の減少を指してもよい。
[0029]「単離」は、通常、天然に見られる少なくともいくつかの他の物質から、通常は人の手を伴うプロセスによって分離されているか、あるいは人工的に産生されている、例えば化学的に合成されているか、または人工的環境中に存在している、物質を指す。
[0030]「核酸」は、「ポリヌクレオチド」と交換可能に用いられ、そしてヌクレオシドの天然存在ポリマー、例えば、通常ホスホジエステル結合によって連結されたＤＮＡおよびＲＮＡ、およびヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体の非天然存在ポリマーを含む。いくつかの態様において、核酸は、標準的ヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕと略される）を含む。他の態様において、核酸は１またはそれより多い非標準ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、１またはそれより多いヌクレオチドは、非天然存在ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である。核酸は、化学的または生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、修飾糖（２’−フルオロリボース、アラビノース、またはヘキソース）、修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートまたは５’−Ｎ−ホスホロアミダイト連結）、ロック化核酸、またはモルホリノを含んでもよい。いくつかの態様において、核酸は、ホスホジエステル結合によって連結されるヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、少なくともいくつかのヌクレオシドは、非ホスホジエステル結合によって連結される。核酸は、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖であってもよい。少なくとも部分的に二本鎖である核酸は、１またはそれより多いオーバーハング、例えば５’および／または３’オーバーハング（単数または複数）を有してもよい。研究または療法目的のためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アプタマー、またはアンチセンスに基づく分子の背景において有用であると当該技術分野で知られる、核酸修飾（例えばヌクレオシドおよび／または主鎖修飾）、非標準ヌクレオチド、送達ビヒクルおよびアプローチ等が、本発明の多様な態様で使用するために意図される。例えば、Ｃｒｏｏｋｅ， ＳＴ（監修） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ボカラトン： ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， ２００８； Ｋｕｒｒｅｃｋ， Ｊ．（監修） Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， ＲＳＣ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃｉｅｎｃｅｓ． ケンブリッジ： Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００８を参照されたい。核酸は、検出可能標識、例えば蛍光色素、放射性原子等を含んでもよい。「オリゴヌクレオチド」は、比較的短い核酸、例えば典型的には長さ約４〜約６０ヌクレオチドの間の核酸を指す。
[0031]「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸のポリマーを指す。タンパク質は１またはそれより多いポリペプチドを含む分子である。ペプチドは比較的短いポリペプチドであり、典型的には長さ約２〜６０アミノ酸の間である。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、交換可能に使用可能である。本明細書において、関心対象のポリペプチドは、しばしば、標準的アミノ酸（タンパク質において、天然に最も一般的に見られる２０のＬ−アミノ酸）を含有する。しかし、本発明の特定の態様において、当該技術分野に知られる他のアミノ酸および／またはアミノ酸類似体を用いてもよい。ポリペプチド中の１またはそれより多いアミノ酸（例えばＮ末端またはＣ末端で、あるいは側鎖中で）を、例えばアルキル基、炭水化物基、リン酸基、ハロゲン、コンジュゲート化のためのリンカーなどの部分の付加、例えば共有結合によって、修飾してもよい。本明細書に提示するポリペプチド配列は、別に示さない限り、Ｎ末端からＣ末端方向に提示される。「ポリペプチドドメイン」は、より長いポリペプチド内のアミノ酸のセグメントを指す。ポリペプチドドメインは、１またはそれより多い別個の結合または機能特性、例えば触媒活性を示してもよい。しばしば、ドメインは、多数の異なる種において見られるポリペプチド間の保存によって認識可能である。
[0032]本明細書において、用語「精製された」は、天然に関連した構成要素の大部分から分離されているか、または最初に生成された際の、剤または実体（例えば化合物）を指す。一般的に、こうした精製は、人の手の作用を伴う。精製された剤または実体は、部分的に精製されていても、実質的に精製されていても、または純粋であってもよい。こうした剤または実体は、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％より高く純粋であってもよい。いくつかの態様において、核酸またはポリペプチドは、それぞれ、調製物中に存在する総核酸またはポリペプチド材料の少なくとも７５％、８０％、８５５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多くを構成するように、精製されている。純度は、例えば乾燥重量、クロマトグラフィートレーシング上のピークサイズ、分子存在量、ゲル上のバンド強度、あるいは分子存在量と相関する任意のシグナルの強度、あるいは当該技術分野に認められた任意の定量法に基づくものであってもよい。いくつかの態様において、場合によって、水、緩衝剤、イオン、および／または小分子（例えばヌクレオチドまたはアミノ酸などの前駆体）が精製調製物中に存在してもよい。他の物質（例えば他の細胞成分）から分離することによって、または所望の度合いの純度を達成する方式で産生することによって、精製分子を調製することも可能である。いくつかの態様において、精製分子または組成物は、当該技術分野に認められた任意の精製法を用いて調製される分子または組成物を指す。いくつかの態様において、「部分的に精製された」は、細胞によって産生される分子がもはや細胞内に存在しない、例えば細胞が溶解されており、そして場合によって、細胞成分の少なくともいくつか（例えば細胞壁、細胞膜（単数または複数）、細胞内小器官（単数または複数））が除去されていることを意味する。
[0033]「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）は、配列特異的方式で、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られる内因性分子複合体が、遺伝子発現をサイレンシングするプロセスを含む。ＲＩＳＣは、相補性を有するｍＲＮＡの配列特異的分解または翻訳抑制を導くかまたは「ガイドする（ｇｕｉｄｅ）」短いＲＮＡ鎖を含有する。短いＲＮＡおよびｍＲＮＡの間の相補性は、完全（１００％）である必要はない。例えば、ｍＲＮＡおよび短いＲＮＡ鎖のハイブリダイゼーションによって形成される構造の相補性の度合いおよび／または特性は、鎖が（ｉ）ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）におけるｍＲＮＡの切断をガイドし、そして／または（ｉｉ）ＲＩＳＣによるｍＲＮＡの翻訳抑制を引き起こすことが可能であるようなものであってもよい。ガイド鎖およびターゲットｍＲＮＡの間の１またはそれより多いミスマッチは、特にガイド鎖のシード領域（２〜７位または２〜８位のヌクレオチド）の外では、許容されうることが認識されるであろう。サイレンシングをガイドする短いＲＮＡは、しばしば、最初に、短い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の一部としてＲＩＳＣ構成要素（複合体において、ときに、ＲＩＳＣ装填複合体と称される）と会合する。ＲＮＡｉは、しばしば、ターゲット遺伝子をノックダウンするのに用いられる。「ノックダウン」は、典型的には、例えば転写、ｍＲＮＡ安定性、翻訳、またはタンパク質安定性のレベルで起こりうる、発現の減少を指す。減少は、完全であっても（例えば遺伝子産物の量がバックグラウンドレベルまで減少する）、または完全未満であってもよい。例えば、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルは、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、またはそれより多く減少してもよい。
[0034]ＲＮＡｉは、真核細胞、例えば脊椎動物細胞において、当該技術分野に知られる多様な方式で、発現を阻害するために使用可能である。いくつかの態様において、短い二本鎖核酸を細胞内に導入する。いくつかの態様において、細胞内でプロセシングされて、短いｄｓＲＮＡを生じる核酸（例えば１またはそれより多いＲＮアーゼＩＩＩファミリー酵素、ダイサーによって）を、細胞内に導入するかまたは細胞内で発現させる。本明細書において、用語「ＲＮＡｉ剤」は、真核細胞において、ＲＮＡｉを達成するのに使用可能な核酸を含む。例示的なＲＮＡｉ剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。当該技術分野で知られるように、ｓｉＲＮＡは、典型的には、互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する２つの別個の核酸鎖を含む。これらは、例えば標準的核酸合成技術を用いて、あるいはより長いｄｓＲＮＡの切断によって、例えばダイサーなどのＲＮアーゼＩＩＩまたはＲＮアーゼＩＩＩ様酵素によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成可能である。特定の態様において、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、長さ約１５〜２９ヌクレオチド（ｎｔ）の間、例えば長さ１７〜２５ｎｔの間、例えば長さ１９〜２３ｎｔの間の二重鎖部分を含む、ここで、どちらかまたは両方の鎖は、場合によって、長さ１〜５ヌクレオチド（例えば２ヌクレオチド）の３’オーバーハングを有し、これはデオキシリボヌクレオチドで構成されてもよい。いくつかの態様において、鎖は、二重鎖部分内で、完全に相補的である一方、他の態様において、二重鎖部分は１またはそれより多いミスマッチ・ヌクレオチド対またはバルジを含有してもよい。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡの各鎖は、長さ１５〜２９ヌクレオチドの間、例えば長さ１９〜２５ｎｔの間、例えば長さ２１〜２３ｎｔの間である。ｓｈＲＮＡは、主に非自己相補性領域によって分離された２つの相補性部分を含有する単一核酸鎖を含む。相補性部分はハイブリダイズして、二重鎖構造を形成し、そして非自己相補性領域は、二重鎖の一方の鎖の３’端および他方の鎖の５’端を連結するループを形成する。ｓｈＲＮＡは細胞内プロセシングを経て、ｓｉＲＮＡを生成することも可能である。
[0035]ＲＮＡｉ剤にはまた、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびｍｉＲＮＡ前駆体も含まれる。用語「ｍｉＲＮＡ」および「ｍｉＲＮＡ前駆体」は、しばしば、内因性にコードされるＲＮＡを指すよう、当該技術分野に用いられる。本明細書において、「ｍｉＲＮＡ」および「ｍｉＲＮＡ前駆体」は、内因性ｍｉＲＮＡと類似の方式で機能する人工的に設計された核酸を含む。
[0036]特定の態様において、ＲＮＡｉ剤は、ｓｉＲＮＡ（例えば互いにハイブリダイズ可能な２つの別個の鎖として）、ｓｈＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ前駆体の転写のためのテンプレートを含むベクターである。こうしたベクターを用いて、テンプレートを脊椎動物細胞、例えば哺乳動物細胞内に導入して、そしてｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ前駆体の一過性または安定発現を生じてもよい。
[0037]本明細書において、「小分子」は、質量約２キロダルトン（ＫＤａ）未満の有機分子である。いくつかの態様において、小分子は、約１．５ＫＤａ未満、または約１ＫＤａ未満である。いくつかの態様において、小分子は、約８００ダルトン（Ｄａ）、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、または１００Ｄａ未満である。しばしば、小分子は少なくとも５０Ｄａの質量を有する。いくつかの態様において、小分子は非ポリマー性である。いくつかの態様において、小分子はアミノ酸ではない。いくつかの態様において、小分子はヌクレオチドではない。いくつかの態様において、小分子は糖ではない。いくつかの態様において、小分子は多数の炭素−炭素結合を含有し、そして１またはそれより多いヘテロ原子、および／またはタンパク質との構造的相互作用（例えば水素結合）に重要な１またはそれより多い官能基、例えばアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基、そしていくつかの態様において、少なくとも２つの官能基を含んでもよい。小分子は、しばしば、場合によって１またはそれより多い上記官能基で置換された、１またはそれより多い環状炭素または複素環構造、および／または芳香族または多環芳香族構造を含む。
[0038]「被験体」は、任意の多細胞生物、例えばウイルスによる感染に感受性であるか、あるいはウイルスに感染しているかまたは感染しうる、多細胞生物であってもよい。しばしば、被験体の細胞の少なくともいくつかは、ＰＬＡ２Ｇ１６の検出可能な量を発現する。いくつかの態様において、被験体は、動物、例えば脊椎動物、例えば哺乳動物または鳥類である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えばマウス、ラット、ウサギ）、有蹄動物（例えばヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ種）、イヌ、およびネコであってもよい。いくつかの態様において、動物は、経済的に重要な哺乳動物、例えばウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、またはヒツジなどである。しばしば、被験体は、例えば実験、診断、および／または療法目的のため、化合物を送達しようとする個体、あるいは試料を得るかまたは診断法を実行する個体である（例えば被験体がウイルス感染を有するかどうかまたはウイルス感染のリスクがあるかどうかを決定するために用いられるであろう試料または方法）。
[0039]「治療する」、「治療すること」および類似の用語は、被験体の内科的および／または外科的管理を提供することを指す。治療には、限定されるわけではないが、被験体に化合物または組成物（例えば薬学的組成物）を投与する工程が含まれてもよい。治療は、典型的には、疾患、障害、または望ましくない状態の経過を、被験体に有益な方式で改変するために行われる。治療の効果には、一般的に、疾患、障害、またはこうした用語が当てはまる状態、あるいはこうした疾患、障害または状態の１またはそれより多い症状または徴候を逆転させ、軽減し、その重症度を減少させ、その開始を遅延させ、これらを治癒させ、これらの進行を阻害し、そして／またはその発生または再発の可能性を減少させることが含まれうる。感染を発展させたか、または一般集団メンバーに比較して、感染を発展させるリスクが増加している被験体に、本発明の組成物を投与することも可能である。本発明の組成物を予防的に、すなわち状態のいかなる症状または徴候も発展する前に、投与してもよい。典型的には、この場合、被験体は状態を発展させるリスクがあるであろう。例えば、感染性病原体に被験体が曝露される前に、または発病事象発生前に、本発明の組成物を投与してもよい。「防止する」は、疾患または状態が起こる可能性を減少させるため、あるいは疾患または状態が起こるとすれば、その重症度を減少させるため、疾患または状態を発展させていない被験体に、化合物または組成物（例えば薬学的組成物）を投与することを指すことも可能である。被験体は、疾患または状態を発展させるリスクがあると同定可能である（例えば集団の大部分の他のメンバーに比較して増加したリスクにあるか、または疾患を発展させる可能性が増加するリスク要因を有するとして）。
[0040]ＩＩ．概観
[0041]本発明は、部分的に、抗ウイルス化合物の同定および／または性質決定に使用する、新規分子ターゲットとしてのホスホリパーゼＡ２、ＸＶＩ群（ＰＬＡ２Ｇ１６）の同定に関する。ＰＬＡ２Ｇ１６は、哺乳動物組織において、広くまたは遍在性に発現されるホスホリパーゼである。現在、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドが、脊椎動物細胞、例えば哺乳動物細胞の、ピコルナウイルス科のウイルスによる感染において、重要な役割を果たす宿主細胞因子であることが発見されてきている。本発明は、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害するとウイルス感染が阻害されるという認識を含む。実施例により詳細に記載するように、近半数体哺乳動物細胞株（ＨＡＰ１細胞株）において、ジーントラップ突然変異誘発戦略を用いて、ＰＬＡ２Ｇ１６遺伝子（ヒト細胞において染色体１１上に位置する）内への挿入によって、ポリオウイルスおよびコクサッキーウイルスＢ１による感染に細胞が耐性になることが示された。細胞において野生型ＰＬＡ２Ｇ１６を発現することによって、野生型ＰＬＡ２Ｇ１６機能を回復させると、感染に対する感受性が回復されたが、触媒的に不活性であるＰＬＡ２Ｇ１６の突然変異体型では回復されなかった。さらに、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いたライノウイルス感受性細胞株（ＨｅＬａ細胞）における内因性ＰＬＡ２Ｇ１６発現のノックダウンによって、これらの細胞はライノウイルス感染に耐性になる。本明細書に記載する発見によって、ＰＬＡ２Ｇ１６は、広範囲のウイルスによる脊椎動物細胞の感染に必要であることが示される。
[0042]本発明は、ウイルス感染を阻害するための組成物および方法を提供する。本発明はさらに、ウイルス感染を阻害するための候補化合物を同定するのに有用な組成物および方法を提供する。いくつかの側面において、組成物および方法は、抗ウイルス化合物（すなわちウイルス感染を阻害する化合物）の同定のためのターゲットとしてのＰＬＡ２Ｇ１６遺伝子および／またはＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの使用に関する。本発明の特定の方法は、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物を同定するかまたは提供する工程を含む。本発明の特定の態様にしたがって、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物は、候補抗ウイルス化合物である。本発明の特定の方法は、（ｉ）ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物を同定するかまたは提供し；そして（ｉｉ）該化合物が細胞または多細胞生物のウイルス感染を阻害するかどうか決定する工程を含む、ここで化合物が細胞または多細胞生物のウイルス感染を阻害する場合、該化合物は抗ウイルス化合物である。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物は、ＰＬＡ２Ｇ１６発現を阻害する。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物は、ＰＬＡ２Ｇ１６分子機能を阻害し、例えば、化合物はＰＬＡ２Ｇ１６触媒活性を阻害する。
[0043]ウイルス感染の阻害は、例えば、適切な参照レベル、例えば介入の非存在下で存在するであろうレベルに比較した際、細胞内へのウイルスの進入の減少、ウイルス遺伝子産物（単数または複数）（ウイルスＲＮＡおよび／またはタンパク質）産生の減少、子孫ウイルス産生の減少、子孫ウイルス放出の減少、および／または細胞集団内のウイルスの伝播の減少（例えば細胞培養において、または多細胞生物において）があるように、ウイルス生活環の１またはそれより多い段階を阻害する介入を含みうる。ウイルス感染の阻害は、多様な適切な指標のいずれかに基づいて評価可能である。いくつかの態様において、ウイルス感染の指標の阻害は、完全または実質的に完全であり、例えばウイルス遺伝子産物の産生、子孫ウイルスの産生、さらなる細胞の感染などのウイルス感染の指標が、バックグラウンドまたは検出不能レベル、例えばウイルスの非存在下で予期されるであろうようなレベルまで減少する。いくつかの態様において、阻害は完全ではない。いくつかの態様において、ウイルス感染の阻害は、ウイルス子孫またはウイルス遺伝子産物の産生において、およそ、少なくとも１０、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、またはそれより高い係数による減少を指す可能性もある。
[0044]いくつかの側面において、本発明は、細胞のウイルス感染を阻害する方法を提供する。いくつかの側面において、該方法は、細胞においてＰＬＡ２Ｇ１６を阻害し、それによって細胞のウイルス感染を阻害する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、細胞のウイルス感染が阻害されるように、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物と細胞を接触させる工程を含む。いくつかの態様において、細胞は動物細胞、例えば脊椎動物細胞である。いくつかの態様において、脊椎動物細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの側面において、本発明は、被験体のウイルス感染を阻害する方法を提供する。いくつかの態様において、被験体は脊椎動物である。いくつかの側面において、方法は、生物の少なくともいくつかの細胞において、例えばウイルスに感染しているかまたはウイルスによる感染に対して感受性である、少なくともいくつかの細胞において、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する工程を含む。いくつかの態様において、該方法は、被験体にＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物を投与する工程を含む。いくつかの態様において、被験体は動物、例えば脊椎動物である。いくつかの態様において、脊椎動物は哺乳動物である。
[0045]いくつかの側面において、本発明は、ウイルスに対する細胞または被験体の感受性を減少させる（または耐性を増加させる）方法であって、被験体の細胞において、または少なくともいくつかの細胞において、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する工程を含む、前記方法を提供する。したがって、本発明は、細胞または被験体が、ウイルスに感染し、そして／またはウイルスによる不都合な影響を経験する脆弱性または傾向を減少させる方法を提供する。ウイルスに対する「耐性」は、典型的には、感染に対して防御する能力を指す。説明の目的のため、本発明は、主に、ウイルス感染阻害に関して記載されるであろう。しかし、別に示さない限り、細胞または被験体のウイルス感染を阻害する本発明の方法は、ウイルス感染に対する細胞または被験体の感受性を阻害するか、あるいはウイルス感染に対する細胞または被験体の耐性を増加させるとして記載されうることが理解されるであろう。
[0046]いくつかの側面において、本発明は、被験体のための療法剤を選択する方法であって、（ａ）ＰＬＡ２Ｇ１６が宿主細胞因子であるウイルスによって、被験体が感染するかどうかを決定し；そして（ｂ）ＰＬＡ２Ｓ１６が宿主細胞因子であるウイルスによって被験体が感染する場合、被験体に対する療法剤として、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物を選択する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、方法はさらに、被験体にＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物を投与する工程を含む。
[0047]いくつかの側面において、本発明は、被験体がＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物での治療の候補であるかどうかを決定する方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、ＰＬＡ２Ｇ１６が宿主細胞因子であるウイルスに、被験体が感染しているか、または感染するリスクがあるかどうかを決定する工程を含む、ここで、ＰＬＡ２Ｇ１６が宿主細胞因子であるウイルスに、被験体が感染している場合、被験体はＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物での治療の候補である。いくつかの態様において、該方法は、ピコルナウイルスに、被験体が感染しているか、または感染するリスクがあるかどうかを決定する工程を含む、ここで、ピコルナウイルスに被験体が感染している場合、被験体はＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物での治療の候補である。いくつかの態様において、該方法は、被験体に、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物を投与する工程をさらに含む。
[0048]いくつかの側面において、本発明は、ウイルス感染の治療が必要な被験体を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、被験体のための療法剤として、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物を選択する工程を含む。いくつかの態様において、該方法は、被験体に、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物を投与する工程を含む。いくつかの態様において、治療法は、ウイルス感染のための治療が必要な被験体を提供する工程を含む。いくつかの態様において、治療法は、被験体がウイルスに感染していると診断する工程を含む。該被験体は、ウイルス感染の１またはそれより多い症状または徴候、例えばウイルス感染から生じる病的状態に関連する１またはそれより多い症状または徴候を有することも可能である。いくつかの態様において、該方法は、被験体に、化合物を含む薬学的組成物を投与する工程を含む。「投与」は、直接投与または間接的投与を含むことも可能である。「間接的」投与は、別の個体に提供し、処方し、投与するよう指示するか、あるいは、任意の方式で、被験体に化合物が利用可能であるようにするなどの活動を含む。
[0049]ＩＩＩ．ウイルスおよびウイルス性疾患
[0050]いくつかの側面において、本発明は、ウイルスによる細胞または被験体の感染を阻害することに関連し、ここでＰＬＡ２Ｇ１６は、ウイルスの生活環の１またはそれより多い段階において促進するかまたは役割を果たす。いくつかの態様において、ウイルスは、１またはそれより多い動物種、例えば１またはそれより多い脊椎動物種、例えば哺乳動物または鳥類種の、ＰＬＡ２Ｇ１６を発現する細胞に感染可能である。多様な態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６が阻害されると、細胞、例えば動物細胞を感染させる能力が減少する任意のウイルスに、本発明を適用することも可能である。本発明は、主に、関心対象の特定のウイルスに言及して記載されているが、細胞におけるＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの発現がウイルス生活環の１またはそれより多い段階において促進するかまたは役割を果たす任意のウイルスに、本発明の態様を適用してもよい。いくつかの態様において、ウイルスは医学的に重要であり、例えばヒトに影響を及ぼす１またはそれより多い疾患の原因病原体として、医学業において認識されている。いくつかの態様において、ウイルスは獣医学的に重要であり、例えば非ヒト動物に影響を及ぼす１またはそれより多い疾患の原因病原体として、獣医学業において認識されている。医学的および／または獣医学的に重要であるウイルスを含む、多様なウイルス科の考察に関しては、例えば、Ｋｎｉｐｅ ＆ Ｈｏｗｌｅｙ、上記； Ｂｕｅｃｈｅｎ−Ｏｓｍｏｎｄ， Ｃ．、上記、および“ＩＣＴＶｄＢ− Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｄａｔａｂａｓｅ”中のウイルス説明、上記を参照されたい。
[0051]いくつかの態様において、ウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ゲノムを有する。いくつかの態様において、ｓｓＲＮＡゲノムウイルスはプラス鎖である。いくつかの態様において、ウイルスは非エンベロープウイルスであり、そして／または正二十面体ビリオンまたはヌクレオカプシド形態を有する。いくつかの態様において、ウイルスは、ピコルナウイルス様スーパーファミリーのメンバーである（こうしたウイルスはまた、本明細書において、「ピコルナ様ウイルス」とも称される）。ピコルナウイルス様スーパーファミリーのウイルスは、プラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスであり、こうしたウイルスは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、キモトリプシン様プロテアーゼ（３ＣＰｒｏ）、スーパーファミリー３ヘリカーゼ（Ｓ３Ｈ）およびゲノム連結タンパク質（ウイルスタンパク質、ゲノム連結、ＶＰｇ）からなる部分的に保存された遺伝子セットによって特徴付けられる。ピコルナウイルス様スーパーファミリーは、提唱されるピコルナウイルス目（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒａｌｅｓ）（以下に論じる）、ならびに提唱される目に属さない多様なウイルス属および科、例えばカリシウイルス科およびアストロウイルス科を含むものを含む。例えば、Ｋｏｏｎｉｎ， ＥＶ，ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ６：９２５−９３９， ２００８を参照されたい。
[0052]いくつかの態様において、ウイルスは、提唱されるピコルナウイルス目のメンバーである。この目には、真核生物を感染させ、そして以下の特性を共有するウイルスが含まれる：（ｉ）通常、５’結合Ｖｐｇおよび３’ポリアデニル化を含む、プラス鎖ＲＮＡゲノム、（ｉｉ）自己タンパク質分解的にプロセシングされるポリタンパク質（単数または複数）へのゲノム翻訳、（ｉｉｉ）シュードＴ＝３シンメトリーの小さい正二十面体非エンベロープ粒子を形成する３つの関連するゼリーロールドメインを含有するモジュールで構成されたカプシドタンパク質、および（ｉｖ）スーパーファミリーＩＩＩヘリカーゼ、キモトリプシン様フォールドを持つ（システイン）プロテイナーゼおよびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含有する３ドメインモジュール。これらの基準にしたがって、ピコルナウイルス目には、ピコルナウイルス科、コモウイルス科、ジシストロウイルス科、マルナウイルス科（Ｍａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、セキウイルス科およびチェラウイルス属（Ｃｈｅｒａｖｉｒｕｓ）、イフラウイルス属（Ｉｆｌａｖｉｒｕｓ）およびサドワウイルス（Ｓａｄｗａｖｉｒｕｓ）が含まれる。「ピコルナ様」ウイルスの他の分類群、例えばポティウイルス科、カリシウイルス科、ヒポウイルス科（Ｈｙｐｏｖｉｒｉｄａｅ）は上記基準のいくつかに一致せず、そして関連がより遠い。カリシウイルス科は、小さい（２７〜４０ｎｍ）、非エンベロープ正二十面体ウイルスで構成され、そして４つの属、ノロウイルス属、サポウイルス属、ベシウイルス属、およびラゴウイルス属を含む。医学的に重要な主要病原体はノロウイルスであり、急性胃炎の主因である。重要な獣医学的病原体には、ネコ・カリシウイルス（ＦＣＶ）およびウサギ出血性疾患ウイルス（ＲＨＤＶ）などのベシリウイルス（ｖｅｓｉｒｉｖｕｒｓｅｓ）が含まれる。アストロウイルス科には、ヒトおよび動物アストロウイルスが含まれ、これらは正二十面体形態および電子顕微鏡によって見られる特徴的な星様表面構造を有する。これらは、ヒト、ならびに哺乳動物（例えばブタ）および鳥類を含む多様な動物における胃腸炎および下痢の重要な病原体である。
[0053]特定の関心対象のいくつかの態様において、本発明は、ピコルナウイルス科のメンバーであるウイルス（本明細書において、「ピコルナウイルス」とも称する）による感染を阻害することに関する。ピコルナウイルス（ピコルナウイルス様スーパーファミリーの他のメンバー同様）は、プラス極性の一本鎖ゲノムを持つ非エンベロープウイルスである。これらは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）（例えば少なくとも約５００ヌクレオチド（ｎｔ）から最長約１２００ｎｔ）、タンパク質分解的にプロセシングされるポリタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、およびポリＡテールが続く短い３’ＵＴＲ）を含む、共通のゲノム構成を共有する（ＫｎｉｐｅおよびＨｏｗｌｅｙ、上記）。異なるピコルナウイルスを区別する主要な特徴には、とりわけ、５’ＵＴＲおよびＩＲＥＳの二次構造が含まれる。
[0054]ピコルナウイルス科には、１２の属が含まれる：アフトウイルス属、アビヘパトウイルス属、カルジオウイルス属、エンテロウイルス属、エルボウイルス属、ヘパトウイルス属、コボウイルス属（Ｋｏｂｏｖｉｒｕｓ）、パレコウイルス属、サペロウイルス属（Ｓａｐｅｌｏｖｉｒｕｓ）、セネカウイルス属（Ｓｅｎｅｃａｖｉｒｕｓ）、テッショウウイルス属、およびトレモウイルス属（Ｔｒｅｍｏｖｉｒｕｓ）（“ＩＣＴＶｄＢ− Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｄａｔａｂａｓｅ”， Ｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ：２００９ リリースｖ４、上記を参照されたい）。これらの属の１つのメンバーであるウイルスは、アフトウイルス、アビヘパトウイルス、カルジオウイルス、エンテロウイルス、エルボウイルス、ヘパトウイルス、コボウイルス、パレコウイルス、ライノウイルス、サペロウイルス、セネカウイルス、テッショウウイルス、またはトレモウイルスと称されてもよい。これらの属には、脊椎動物を感染させる多数のウイルスが含まれ、そしてこれらの多くは、ヒトおよび／または非ヒト動物において、疾患の重要な原因であるメンバーを含有する。例えば、アフトウイルスには、口蹄疫ウイルスが含まれ、これは、割れた蹄を持つ動物、例えばウシ、ヤギ、ブタ、およびヒツジを感染させる。カルジオウイルスには、２つの別個のクラスターが含まれ、第一のものには脳心筋炎ウイルスが含まれ、そして第二のものには、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルスおよびいくつかはヒトを感染させる関連ウイルスが含まれる。
[0055]ヒト・エンテロウイルスは、とりわけ、穏やかな上気道症状およびインフルエンザ様疾病の一般的な原因である。より一般的でないが、これらは、より深刻な状態、例えばウイルス性髄膜炎、心筋炎、または脳炎などの中枢神経系状態を生じうる。エンテロウイルス属には、２００９年リリースのＩＣＴＶに示されるように、以下の１０種が含まれる（ｈｔｔｐ：／／ｉｃｔｖｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｖｉｒｕｓＴａｘｏｎｏｍｙ．ａｓｐ？ｖｅｒｓｉｏｎ＝２００９より入手可能）：ヒト・エンテロウイルスＡ、ヒト・エンテロウイルスＢ、ヒト・エンテロウイルスＣ、ヒト・エンテロウイルスＤ、サル・エンテロウイルスＡ、ウシ・エンテロウイルス、ブタ・エンテロウイルスＢ、ヒト・ライノウイルスＡ、ヒト・ライノウイルスＢおよびヒト・ライノウイルスＣ。これらの種の多くは多数の血清型を含み、血清型は次に多数の株を含みうる。ヒト・エンテロウイルス属種は、集合的に、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、およびヒトを感染させる多数の他のエンテロウイルスを含む。エンテロウイルス属はまた、多くの非ヒト腸内ウイルスも含む。ポリオウイルス血清型ポリオウイルス（ＰＶ）−１、ＰＶ−２、およびＰＶ−３がヒト・エンテロウイルスＣ種に含まれる。ポリオウイルスは、有効なワクチンが広く使用されたために、大部分根絶されているが、エンテロウイルス属内の他のウイルスは、しばしば、急性および慢性ヒト疾患の原因となっている。
[0056]コクサッキーウイルスは、マウスにおける病原性の初期の観察に基づいて、Ａ群およびＢ群ウイルスに分類される。コクサッキーウイルスは、ヒトにおいて、無菌性髄膜炎、手足口病、ヘルパンギナ、心筋炎（時に心筋症を導く）、および膵炎を含む、ある範囲の疾患と関連しており、そしてＩ型糖尿病の病原因子でありうる（例えば、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｖｏｌ． ３２３， ２００８の論文を参照されたい）。コクサッキーウイルスは、ヒト・エンテロウイルスＡ、ヒト・エンテロウイルスＢ、およびヒト・エンテロウイルスＣ種の中に分類される。例示的なコクサッキーウイルスには、血清型ＣＶ−Ａ２、ＣＶ−Ａ３、ＣＶ−Ａ４、ＣＶ−Ａ５、ＣＶ−Ａ６、ＣＶ−Ａ７、ＣＶ−Ａ８、ＣＶ−Ａ１０、ＣＶ−Ａ１２、ＣＶ−Ａ１４、ＣＶ−Ａ１６、ＣＶ−Ｂ１、ＣＶ−Ｂ２、ＣＶ−Ｂ３、ＣＶ−Ｂ４、ＣＶ−Ｂ５、ＣＶ−Ｂ６、ＣＶ−Ａ９、ＣＶ−Ａ１、ＣＶ−Ａ１１、ＣＶ−Ａ１３、ＣＶ−Ａ１７、ＣＶ−Ａ１９、ＣＶ−Ａ２０、ＣＶ−Ａ２１、ＣＶ−Ａ２２、ＣＶ−Ａ２４が含まれる。
[0057]ヒト・エンテロウイルスＡ、ヒト・エンテロウイルスＢ、ヒト・エンテロウイルスＣ、およびヒト・エンテロウイルスＤ種には、さらなるエンテロウイルス、例えば血清型ＥＶ−７１、ＥＶ−７６、ＥＶ−８９、ＥＶ−９０、ＥＶ−９１、ＥＶ−９２、ＥＶ−６９、ＥＶ−７３、ＥＶ−７４、ＥＶ−７５、ＥＶ−７７、ＥＶ−７８、ＥＶ−７９、ＥＶ−８０、ＥＶ−８１、ＥＶ−８２、ＥＶ−８３、ＥＶ−８４、ＥＶ−８５、ＥＶ−８６、ＥＶ−８７、ＥＶ−８８、ＥＶ−９３、ＥＶ−９７、ＥＶ−９８、ＥＶ−１００、ＥＶ−１０１、ＥＶ−１０６、ＥＶ−１０７、ＥＶ−９５、ＥＶ−９６、ＥＶ−９９、ＥＶ−１０２、ＥＶ−１０４、ＥＶ−１０５、ＥＶ−１０９、ＥＶ−６８、ＥＶ−７０、およびＥＶ−９４が含まれる。例えば、エンテロウイルス７１（ＥＶ−７１）は、世界の異なる部分で再発する大流行を引き起こす病原性エンテロウイルス血清型である。該ウイルスは、中枢神経系を感染させ、そしてヒト、特に幼児および低年齢の小児において、死および長期の神経学的続発症を引き起こしうる（Ｌｉｎ， Ｙ−Ｗ．，ら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ８３（１３）： ６４７７−６４８３， ２００９、および該論文中の参考文献）。ＥＶ−７１はまた、下痢、発疹、および手足口病も引き起こしうる。
[0058]ヒト・ライノウイルスＡおよびヒト・ライノウイルスＢ種のメンバー（「ライノウイルス」）は、上咽頭で、そしてときにより下の気道で複製する。これらのウイルス（１００を越える血清型が存在する）は、ヒトの風邪の重要な病原体であり、そしてまた、特に感受性である個体においては、より深刻な疾患を引き起こしうる。
[0059]テッショウウイルス属には、ブタにおいて灰白脳炎を引き起こすブタ・テッショウウイルスが含まれる。ヘパトウイルスには、急性肝臓感染である肝炎Ａを引き起こすヒトＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）が含まれる。
[0060]さらなるピコルナウイルスが引き続き発見されてきている。例えば、提唱されるコサウイルス（ｃｏｓａｖｉｒｕｓ）属のメンバーを記載する、Ｋａｐｏｏｒ， Ａ．，ら， Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｐｒｅｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ ｇｅｎｕｓ ｉｎ Ｓｏｕｔｈ Ａｓｉａｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １０５（５１）：２０４８２−７， ２００８を参照されたい。より最近、ハイスループット配列決定を用いて、クラッセウイルス（ｋｌａｓｓｅｖｉｒｕｓ）と称される新規ウイルスが発見された（例えば、Ｇｒｅｎｉｎｇｅｒ， ＡＬ，ら， Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｋｌａｓｓｅｖｉｒｕｓ− ａ ｎｏｖｅｌ ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｓｔｏｏｌ， Ｖｉｒｏｌ Ｊ．， ６：８２− ２００９を参照されたい）。
[0061]当業者は、ウイルス分類学および分類が発展し続けており、そしてウイルスは、例えばさらなるウイルスが発見されるかまたは研究されるにつれて、例えばウイルス遺伝子が配列決定されるにつれて、そして／またはウイルス間の関係が明らかになるにつれて、ウイルスが再分類されうることを認識するであろう。したがって、特定のウイルスは、本明細書に引用する特定の参考文献の刊行に続いて、ＩＣＴＶによって再分類されていることもありうるし、そして／または将来、再分類されることもありうる。さらに、当業者は、ウイルスに関する多くの刊行物および参考文献がＩＣＴＶによって確立される協定に忠実でなく、これらの協定の確立に先立つ可能性もあり、そして／または正式なおよび／または正式でない固有の命名を使用しうることを認識するであろう。ウイルス（ならびにその株および変異体）の特性の同定は、当該技術分野によく確立され、そして知られている。多くのウイルスの特徴的な参照試料が、多様な国際的に認識される生物学的供給源センターまたはカルチャーコレクション、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）、英国国立健康保護局カルチャーコレクションの国立病原性ウイルスコレクション（ＮＣＰＶ）（英国・ソールズベリー・ポートンダウン； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｐａｃｕｌｔｕｒｅｓ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｏｕｔｕｓ／ｎｃｐｖ．ｊｓｐ）および／または国際的に認識される特殊グループに寄託され、そして典型的にはこれらから入手可能であり、ウイルスを同定しそして／または性質決定するために使用する試薬も同様である。性質決定および／または分類は、核酸および／またはポリペプチド配列、免疫学的試薬（例えば抗血清）との反応性等の特性に基づきうる。多くのヒト・エンテロウイルスのものを含む、多くのエンテロウイルスのゲノム配列が、例えば欧州バイオインフォマティクス研究所のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／）、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、および科学的文献で公的に入手可能である。
[0062]ピコルナウイルス構造および生活環は徹底的に研究されてきている（例えば、Ｋｎｉｐｅ ＆ Ｈｏｗｌｅｙ、上記を参照されたい）。簡潔には、ピコルナウイルス・カプシドは、典型的には４つの構造タンパク質： ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４で構成される（パレコウイルスは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ２＋ＶＰ４非切断前駆体であるＶＰ０のみを含有する）。ピコルナウイルス・カプシドの基本的構築ブロックは、プロモーターと称され、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ４の１コピーを含有する。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、内表面上のＶＰ４とシェルを形成する。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の特定の部分のアミノ酸配列相違は、異なるピコルナウイルスに別個の形態および抗原性を与える。
[0063]ピコルナウイルスの複製は細胞質中で起こる。ピコルナウイルスは、宿主細胞膜上の受容体に付着することによって感染を開始し、その後、脱コートおよびウイルスゲノムの細胞質内への進入が続く。ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ、ＣＤ１５５）および主要群ライノウイルス（ＩＣＡＭ−１）は１９８９年に同定され、そして以来、多くの他のピコルナウイルスに対する受容体が同定されてきている。いくつかのピコルナウイルスは、典型的には感染のために共受容体を必要とする。例えば、多くのエンテロウイルスは、分解加速因子（ＤＡＦ；ＣＤ５５）に結合するが、感染は、典型的にはさらなる分子、例えばＩＣＡＭ−１またはインテグリンファミリーメンバーの存在を必要とする。ＲＮＡゲノムは、細胞質内に進入すると、単一のポリタンパク質に翻訳され、該タンパク質は翻訳中にウイルスがコードするプロテアーゼ（主に２ＡプロおよびＣ３プロまたは３ＣＤプロ）によって切断されて、ウイルス複製に必要なすべてのウイルスタンパク質を生じる。非切断前駆体のいくつかもまた、ウイルス複製中に機能を有する。合成されるウイルスタンパク質の中には、ゲノム複製およびｍＲＮＡ合成に必要なウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびアクセサリータンパク質がある。ゲノム複製の第一の段階は、プラス鎖ＲＮＡをコピーして、マイナス鎖中間体を生じることであり、このマイナス鎖は、さらなるプラス鎖を合成するためのテンプレートとして用いられる。十分なカプシドタンパク質が集積されたならばカプシド形成が始まる。
[0064]多くのピコルナウイルスが、感染細胞において「細胞変性効果」と呼ばれる特徴的な形態学的変化を産生する。細胞変性効果には、クロマチン凝縮、核ブレビング、膜小胞の増殖、細胞内内容物の漏出、および細胞全体の皺形成（ｓｈｒｉｖｅｌｉｎｇ）が含まれうる。多くのピコルナウイルス種の場合、細胞溶解の結果として、感染細胞からビリオンが放出される。他のピコルナウイルス（例えばＡ型肝炎ウイルス）は、細胞溶解なしに細胞から放出される。本発明のいくつかの態様において、細胞または被験体がウイルスに感染しているかどうかを決定するため、細胞変性効果（単数または複数）および／またはビリオン放出を評価する。いくつかの態様において、化合物がウイルス感染を阻害するかどうかを決定するため、細胞変性効果（単数または複数）および／またはビリオン放出を評価する。
[0065]ＩＶ． ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチド
[0066]ＰＬＡ２Ｇ１６は、脊椎動物脂肪組織（特に白色脂肪組織）において高発現されている〜１８キロダルトンタンパク質であり、そしてまた、非常に多様な脊椎動物組織および培養細胞株において、より低いレベルで発現されている。ＰＬＡ２Ｇ１６はまた、脂肪特異的ホスホリパーゼＡ２（ＡｄＰＬＡ）、ＨＲＡＳ様抑制因子３（ＨＲＡＳＬＡ３）として、そしていくつかの他の名前でも知られる。当業者は、公的に入手可能なデータベースから、ＰＬＡ２Ｇ１６ゲノムおよびｍＲＮＡ配列、ならびにＰＬＡ２Ｇ１６タンパク質を容易に得ることが可能であろう。ＰＬＡ２Ｇ１６をコードするヒト遺伝子には、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ； ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）の遺伝子データベースにおいて、ＧｅｎｅＩＤ：１１１４５が割り当てられてきている。マウスおよびラット由来のＰＬＡ２Ｇ１６をコードする遺伝子には、以下のＧｅｎｅＩＤが割り当てられてきている：Ｇｅｎｅ ＩＤ： ２２５８４５（マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））； Ｇｅｎｅ ＩＤ： ２４９１３（ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））。当業者は、これらのおよび他の種由来のＰＬＡ２Ｇ１６ ｍＲＮＡおよびタンパク質の配列を容易に得ることが可能であろう。例えば、ＮＣＢＩで入手可能なヒトＰＬＡ２Ｇ１６ ｍＲＮＡおよびタンパク質参照配列の寄託番号は、以下の通りである：ＮＭ＿００１１２８２０３（転写物変異体２）およびＮＰ＿００１１２１６７５（タンパク質）。ＮＭ＿００７０６９．３（転写物変異体１）およびＮＰ＿００９０００．２（タンパク質）。転写物変異体１は、より長い転写物に相当する。変異体１および２は、同じアイソフォームをコードするが、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）が異なる。
[0067]ＰＬＡ２Ｇ１６は、ホスホリパーゼ活性、および有意により低いが検出可能なリゾホスホリパーゼ活性を有する（Ｄｕｎｃａｎ， ＲＥ，ら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．， ２８３（３７）：２５４２８−３６， ２００８）。ＰＬＡ２タンパク質は、リン脂質のｓｎ−２結合の加水分解を触媒する酵素である（Ｓｃｈａｌｏｓｋｅ， ＲＨおよびＤｅｎｎｉｓ， ＥＡ， Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １７６１， １２４６−１２５９， ２００６）。ＰＬＡ２Ｇ１６は、ｓｎ−２位での加水分解に関する優先性を持つホスファチジルコリンから、遊離脂肪酸およびリゾリン脂質を生成することが示されており、タンパク質がＰＬＡ２であることが示唆される（Ｄｕｎｃａｎ、上記）。ＰＬＡ２Ｇ１６は細胞内膜と会合することが見出され、そしてＣ末端に推定される膜貫通ドメインを有し、その欠失は、活性喪失を引き起こした。突然変異分析によって、Ｈｉｓ−２３、Ｃｙｓ−１１３、Ｇｌｎ−１２９およびＡｓｎ−１１２を含む、特定の非常に保存されるアミノ酸が触媒に必須であることが示されたが、Ａｓｐ−３０またはＨｉｓ−８０のアラニンへの突然変異は影響しなかった。したがって、ＰＬＡ２Ｇ１６は、いくつかの他のＰＬＡ２において見られるように、Ｈｉｓ／Ａｓｐ触媒二アミノ酸またはＳｅｒ／Ｈｉｓ／Ａｓｐ触媒三アミノ酸よりも、ＨｉｓおよびＣｙｓ活性触媒残基を含有するようである。カルシウムは、ＰＬＡ２Ｇ１６を活性化することが見出されたが、活性には必須ではない。ＰＬＡ２Ｇ１６は先に同定される１５の主要なＰＬＡ２群のいずれにも明らかには適合しないようであるが、カルシウム依存性ホスホリパーゼＡ２の別個の群（ＸＶＩ群）の最初のメンバーであると提唱された（Ｄｕｎｃａｎ、上記）。
[0068]ＰＬＡ２Ｇ１６はまた、脂肪細胞ホスホリパーゼＡ２（ＡｄＰＬＡ）として当該技術分野に知られる（Ｊａｗｏｒｓｋｉ， Ｋ．，ら Ｎａｔ Ｍｅｄ．， １５（２）： １５９−６８， ２００９）。これは、脂肪組織において主要なＰＬＡ２であり、そして脂肪細胞脂肪分解を制御する際に重要な役割を果たす。ＰＬＡ２Ｇ１６ヌルマウスは生存可能であり、そして離乳時に正常な体重を有するが、同等の食物摂取を有するにもかかわらず、野生型同腹仔よりもより緩慢な体重増加を示す（Ｊａｗｏｒｓｋｉ， Ｋ．、上記）。標準的病理分析によって、ＰＬＡ２Ｇ１６ヌルマウスは、体脂肪蓄積の減少以外には、巨視的、微視的、または機能的異常のいかなる証拠も示さなかった。血球プロファイル、ならびに血清および脂肪組織における免疫学的パラメータは、野生型マウスに比較して、これらのマウスで変化していなかった。これらの結果から、ウイルス感染を阻害するためにＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する工程を含む、本発明の方法は、関心対象の単離細胞および被験体、例えばヒトおよび他の脊椎動物において、よく許容される可能性が高いと示唆される。
[0069]いくつかの態様において、「ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチド」は、その配列が多細胞生物（例えば脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、ウシ等）のＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの配列を含むかまたは該配列からなる、ポリペプチドである。天然存在ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドまたは天然存在ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドに配列が同一であるポリペプチドは、本明細書において、「天然ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチド」または単に「ＰＬＡ２Ｇ１６」と称される。例示的な天然ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドは、図８に、そして上述の寄託番号のもとに示される。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドは、ＰＬＡ２Ｇ１６の変異体（「ＰＬＡ２Ｇ１６変異体」）である。ＰＬＡ２Ｇ１６変異体には、ＰＬＡ２Ｇ１６に比較して、１またはそれより多いアミノ酸置換、付加、または欠失によって異なるポリペプチドが含まれる。付加は、ポリペプチド内への挿入、あるいはＮまたはＣ末端での付加であってもよい。いくつかの態様において、置換され、欠失され、または付加されるアミノ酸の数は、例えば、約１〜３０、例えば約１〜２０、例えば約１〜１０、例えば約１〜５、例えば１、２、３、４、または５であってもよい。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６変異体は、その配列が、ＰＬＡ２Ｇ１６の少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸に渡って、または全長に渡って、ＰＬＡ２Ｇ１６の配列に対して相同である（が、天然ＰＬＡ２Ｇ１６と配列が同一ではない）ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６変異体は、ＰＬＡ２Ｇ１６の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％に渡って、ＰＬＡ２Ｇ１６（例えばヒト、マウス、ラット、イヌ、ウシ由来）に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも同一であるポリペプチドを含む。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６変異体は、ヒトまたはマウスＰＬＡ２Ｇ１６の少なくともアミノ酸２３〜１１３に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも同一であるポリペプチドを含む。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドは、ヒトまたはマウスＰＬＡ２Ｇ１６の少なくともアミノ酸２３〜１２９に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも同一であるポリペプチドを含む。
[0070]いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドは、ＰＬＡ２Ｇ１６断片を含むかまたは該断片からなる。ＰＬＡ２Ｇ１６断片は、ＰＬＡ２Ｇ１６より短く、そしてより短いポリペプチドの全長に渡ってＰＬＡ２Ｇ１６と同一であるポリペプチドである。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６断片は、天然ＰＬＡ２Ｇ１６の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の長さである。いくつかの態様において、断片は、ヒトまたはマウスＰＬＡ２Ｇ１６のアミノ酸２３〜１１３または２３〜１２９からなる。いくつかの態様において、Ｃ末端の１またはそれより多いアミノ酸が欠失している。例えば、いくつかの態様において、Ｃ末端の少なくとも膜貫通ドメインが欠失している。例えば、いくつかの態様において、少なくともＣ末端の３０アミノ酸が欠失している。いくつかの態様において、Ｎ末端の１またはそれより多いアミノ酸が欠失している。
[0071]いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドは、異種ポリペプチド部分を含む。異種部分は、しばしば、天然ＰＬＡ２Ｇ１６中には存在しないかまたは天然ＰＬＡ２Ｇ１６に相同ではない配列を有する。異種部分は、例えば長さ５〜約５，０００アミノ酸の間、またはそれより長くてもよい。これは、しばしば、長さ５〜約１，０００アミノ酸の間である。いくつかの態様において、異種部分は、異なるポリペプチド中に見られる配列、例えば機能ドメインを含む。いくつかの態様において、異種部分は、ポリペプチドを精製し、発現させ、可溶化し、そして／または検出するのに有用な配列を含む。いくつかの態様において、異種部分は、ポリペプチド「タグ」、例えばアフィニティタグまたはエピトープタグを含む。例えば、タグは、アフィニティタグ（例えばＨＡ、ＴＡＰ、Ｍｙｃ、６ＸＨｉｓ、Ｆｌａｇ、ＧＳＴ）、蛍光または発光タンパク質（例えば、ＥＧＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ）、溶解度増進タグ（例えばＳＵＭＯタグ、ＮＵＳ Ａタグ、ＳＮＵＴタグ、またはバクテリオファージＴ７のＯｃｒタンパク質の単量体突然変異体）であってもよい。例えば、Ｅｓｐｏｓｉｔｏ ＤおよびＣｈａｔｔｅｒｊｅｅ ＤＫ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．； １７（４）：３５３−８（２００６）を参照されたい。いくつかの態様において、タグは、多数の機能を行ってもよい。タグはしばしば、比較的小さく、例えば長さ数アミノ酸から最大約１００アミノ酸の範囲内である。いくつかの態様において、タグは長さ１００アミノ酸を越え、例えば最大長さ約５００アミノ酸である。いくつかの態様において、タグは、例えばＮまたはＣ末端融合物として、ＮまたはＣ末端に位置する。ポリペプチドは、多数のタグを含んでもよい。いくつかの態様において、タグは切断可能であり、したがって、例えばプロテアーゼによって、ポリペプチドから除去可能である。いくつかの態様において、これは、ＰＬＡ２Ｇ１６に相同な部分をコードする配列およびタグの間にプロテアーゼ切断部位をコードする配列を含めることによって達成される。例示的なプロテアーゼには、例えば、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、因子Ｘａ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ等が含まれる。いくつかの態様において、「自己切断」タグを用いる。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ０５／０５７６３を参照されたい。タグをコードする配列は、ポリペプチドをコードする配列に関して５’または３’に（または両方に）位置してもよい。いくつかの態様において、タグまたは他の異種配列は、ポリペプチドリンカーによって、ポリペプチドの残りから分離される。例えば、リンカーは、短いポリペプチド（例えば１５〜２５アミノ酸）であってもよい。しばしば、リンカーは、セリン、グリシン、および／またはアラニンなどの小さいアミノ酸残基で構成される。異種ドメインは、膜貫通ドメイン、分泌シグナルドメイン等を含んでもよい。
[0072]いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６変異体は、機能変異体であり、すなわち変異体は、少なくとも部分的に、ＰＬＡ２Ｇ１６の少なくとも１つの生物学的活性を保持する。いくつかの態様において、機能変異体は、本発明のアッセイにおいて用いた際、非相同タンパク質または触媒的に不活性であるＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチド（例えば、Ｃ１１３Ａ置換を有するＰＬＡ２Ｇ１６）と区別可能な十分な活性を保持する。いくつかの態様において、活性は、例えばリン脂質のｓｎ−２結合の加水分解を触媒する能力によって測定されるような、ホスホリパーゼＡ２活性である。いくつかの態様において、活性はリゾホスホリパーゼ活性である。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６変異体は、天然ＰＬＡ２Ｇ１６がウイルスのための宿主因子として働く能力を保持する。例えば、ＰＬＡ２Ｇ１６変異体は、細胞のＰＬＡ２Ｇ１６遺伝子が不能になっている（例えばジーントラップ挿入により）ためにウイルス感染に耐性である脊椎動物細胞においてこれを発現すると、細胞はウイルス感染に感受性になるのに十分な活性を有する。いくつかの態様において、機能ＰＬＡ２Ｇ１６変異体は、ＰＬＡ２Ｇ１６の活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多くを保持し、例えばほぼ等しい活性を保持する。いくつかの態様において、機能変異体は、ＰＬＡ２Ｇ１６よりも高い活性を有してもよい。
[0073]当業者は、機能ＰＬＡ２Ｇ１６変異体または断片を容易に生成しうる。上に論じるように、活性に重要な多様な残基および活性を有意に減少させることなく改変可能である多様な残基の同定、ならびに他のＰＬＡ２ポリペプチドとの整列を含む、ＰＬＡ２Ｇ１６に関するかなりの情報が入手可能である（例えばＤｕｎｃａｎら、上記を参照されたい）。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６変異体は、ＰＬＡ２Ｇ１６に比較して、１またはそれより多い保存的アミノ酸置換を含む。保存的置換は、関与する残基の側鎖サイズ、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性性質の類似性に基づいて実行可能である。当該技術分野に知られるように、こうした置換は、一般的に、非保存的置換と比較した際、活性を保持する変異体を生じる可能性がより高い。１つの態様において、アミノ酸は、以下のように分類される：
特別： Ｃ
中性および小さい： Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ
極性および比較的小さい： Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ
極性および比較的大きい： Ｒ、Ｈ、Ｋ
非極性および比較的小さい： Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ
非極性および比較的大きい： Ｆ、Ｗ、Ｙ
特別： Ｃ
[0074]例えば、Ｚｈａｎｇ， Ｊ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ５０：５６−６８， ２０００）を参照されたい。いくつかの態様において、プロリン（Ｐ）は、それ自体のグループ中、二番目に特別なアミノ酸と見なされる。特定のグループにおいて、ある置換が特に関心対象である可能性もあり、例えばイソロイシンによるロイシン（またはその逆）、スレオニンによるセリン（またはその逆）、またはグリシンによるアラニン（またはその逆）の置換である。もちろん、非保存的置換は、しばしば、機能の保持と適合する。いくつかの態様において、置換または欠失は、活性に重要なアミノ酸、例えばアミノ酸Ｈｉｓ−２３、Ｃｙｓ−１１３、Ｇｌｎ−１２９またはＡｓｎ−１１２を改変せず、または欠失させない。いくつかの態様において、欠失は、Ｃ末端３６アミノ酸のすべてまたは実質的な部分を除去しない。例えば、いくつかの態様において、欠失は膜貫通ドメインを除去しない。いくつかの態様において、改変は、異なる種のＰＬＡ２Ｇ１６間で異なるアミノ酸で起こる。いくつかの態様において、置換は、アミノ酸を、異なる種において対応する位に存在するものに改変する。いくつかの態様において、機能ＰＬＡ２Ｇ１６変異体は、ＰＬＡ２Ｇ１６の全長の例えば少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％または１００％に渡って、ＰＬＡ２Ｇ１６に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチドを含む。いくつかの態様において、機能ＰＬＡ２Ｇ１６変異体は、ＰＬＡ２Ｇ１６の全長の例えば少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％または１００％に渡って、ＰＬＡ２Ｇ１６に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチドを含み、そしてＮおよび／またはＣ末端でタグを含む。ＰＬＡ２Ｇ１６変異体は、その活性を評価する、細胞不含アッセイおよび／または細胞に基づくアッセイで試験されてもよい。
[0075]いくつかの態様において、天然ＰＬＡ２Ｇ１６の活性と比較した際、実質的に減少した活性（例えば、天然ＰＬＡ２Ｇ１６の活性の１０％未満）を有するＰＬＡ２Ｇ１６の変異体または断片は、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤または抗ウイルス化合物として有用である。例えば、こうしたポリペプチドは、ウイルス感染において、例えば天然ＰＬＡ２Ｇ１６と競合することによって、天然ＰＬＡ２Ｇ１６の機能に干渉しうる。いくつかの態様において、天然ＰＬＡ２Ｇ１６の活性と比較した際、実質的に減少した活性を有するＰＬＡ２Ｇ１６の変異体または断片は、対照としてまたは免疫原として、あるいは結晶化または結合研究のために有用である。
[0076]標準的組換えＤＮＡ技術を用いて、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチド、例えば天然ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１６変異体を産生してもよい。例えばＰＬＡ２Ｇ１６を発現している細胞から（例えばＰＣＲまたは他の増幅法によって、あるいはクローニングによって）、あるいは既知のＰＬＡ２Ｇ１６ ｃＤＮＡまたはポリペプチド配列に基づく合成によって、ＰＬＡ２Ｇ１６をコードする核酸を容易に得ることも可能である。当業者は、遺伝暗号の縮重により、多くの異なる核酸配列が所望のポリペプチドをコードすることを知っている。場合によって、配列は、選択した宿主細胞において、発現のためにコドン最適化されている。例えば天然ＰＬＡ２Ｇ１６を、例えば部位特異的突然変異誘発を用いて改変することによって、または他の標準法によって、ＰＬＡ２Ｇ１６変異体をコードする核酸を容易に生成することも可能である。
[0077]通常、プラスミドまたはウイルス（例えばウイルスゲノムの一部として）などのベクター中で、適切な発現調節要素に機能可能であるように連結された、所望のポリペプチドをコードする核酸を、原核または真核細胞内に導入する。他の態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を用いて、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを産生する。例示的な細胞には、例えば、細菌細胞（例えば大腸菌）、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、真菌細胞（例えば酵母）が含まれる。当業者は、適切な発現調節要素（例えばプロモーター）に気付くであろう。プロモーターは、恒常性または制御可能、例えば誘導可能または抑制可能であってもよい。細菌細胞で使用するのに適した例示的なプロモーターには、例えば、Ｌａｃ、Ｔｒｐ、Ｔａｃ、ａｒａＢＡＤ（例えばｐＢＡＤベクター中）、ファージプロモーター、例えばＴ７またはＴ３が含まれる。哺乳動物細胞において発現を指示するのに有用な、例示的な発現調節配列には、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス極初期プロモーター、あるいはウイルスプロモーター／エンハンサー配列、レトロウイルスＬＴＲ、哺乳動物遺伝子、例えばアクチン、ＥＦ−１アルファ、メタロチオネイン等に由来するプロモーターまたはプロモーター／エンハンサーが含まれる。バキュロウイルス系のポリヘドリン・プロモーターは、昆虫細胞において、タンパク質を発現するのに利用される。当業者は、適切な発現調節要素（単数または複数）、選択可能マーカー、クローニング部位等を含有する多くの発現ベクターを知っており、そしてこれらを好適に用いて、関心対象のポリペプチドを発現させることも可能である。場合によって、こうしたベクターには、タグを含むポリペプチドの好適な産生を可能にする、タグをコードする配列が含まれる。ベクターを細菌、酵母、植物、または動物細胞内に導入し（例えば形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション等）、そして望ましい場合、ベクターを取り込んでいる細胞を選択し、そして安定な細胞株を得るのに適した方法。当該技術分野に知られる方法を用いて、ポリペプチドを発現するトランスジェニック動物または植物を産生してもよい。
[0078]ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを産生するため、適切な期間に渡って、培養中に細胞を維持してもよく、そしてポリペプチドを単離し、そして場合によってさらに精製する（もちろん、また、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを発現する生物から直接得た細胞または組織から、該ポリペプチドを単離してもよい）。標準的タンパク質単離／精製技術を用いてもよい。いくつかの態様において、アフィニティに基づく方法を用いる。例えば、ＰＬＡ２Ｇ１６に対する抗体を使用してもよい。タグ化ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの場合、用いる特定のタグに応じて、適切な単離法を選択してもよい。
[0079]Ｖ． ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害するための組成物および方法
[0080]用語「ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤」は、ＰＬＡ２Ｇ１６発現を阻害し、そして／またはＰＬＡ２Ｇ１６の１またはそれより多い活性を阻害する化合物を指す。例えば、化合物は、その非存在下に比較した際、化合物の存在下で１またはそれより多いＰＬＡ２Ｇ１６活性が減少し、そして／またはその非存在下に比較した際、化合物の存在下でＰＬＡ２Ｇ１６タンパク質または遺伝子産物のレベルまたは量が減少するならば、「ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤」である。特定の態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、これらがＰＬＡ２Ｇ１６と物理的に相互作用するという意味でＰＬＡ２Ｇ１６に直接作用する。他の態様において、阻害剤は、ＰＬＡ２Ｇ１６に間接的に作用する。ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、例えば、小分子、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、脂質、リン脂質等であってもよい。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、ＲＮＡｉ剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、または抗体である。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は小分子である。
[0081]本発明は、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する、いくつかの異なる方法を提供する。本明細書において、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する方法は、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの量の減少を生じる方法、およびＰＬＡ２Ｇ１６分子機能に干渉する方法を含む。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６は、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの量の減少が生じるように、ＰＬＡ２Ｇ１６発現を阻害するかまたはそれに干渉することによって阻害される。本明細書において、「発現」は、ポリペプチドを産生する際に関与する細胞プロセスを含み、そして転写、ｍＲＮＡプロセシングおよび輸送（真核細胞の場合）、ならびにｍＲＮＡ翻訳を生じることに関与する細胞プロセスを含む。発現を阻害するかまたはこれに干渉するのに有用な多様な方法が、本発明の態様において適用可能である。一般的に、こうした方法は、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの合成減少を生じ、そしてその結果として、存在するＰＬＡ２Ｇ１６分子機能活性総レベルの減少を生じる。
[0082]いくつかの態様において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて、ＰＬＡ２Ｇ１６発現を阻害する。ＰＬＡ２Ｇ１６発現を阻害するＲＮＡｉ剤（例えばｓｉＲＮＡ）の例示的な配列を実施例に提供する。当該技術分野に知られる多様なアプローチを用いて、さらなる配列を選択してもよい。望ましい場合、「オフターゲット」効果を最小限にするように、こうした配列を選択してもよい。いくつかの態様において、部位特異的化学修飾を用いて、潜在的なオフターゲット効果を減少させる。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６遺伝子をターゲットとする少なくとも２つの異なるｓｉＲＮＡを用いる（例えば組み合わせて）。ＲＮＡｉは、本明細書において、多様な目的のために用いられる。例えば、ＲＮＡｉ剤は、例えば療法または研究目的のため、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤として使用可能である。ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害するＲＮＡｉ剤は、第二の化合物、例えば小分子の効果が、ＰＬＡ２Ｇ１６（別のタンパク質ではなく）に対する効果のためであることを確認するために有用でありうる。例えば、ＰＬＡ２Ｇ１６の推定上の特異的阻害剤である小分子は、ＲＮＡｉによってＰＬＡ２Ｇ１６発現が阻害される細胞には影響を及ぼさないと予期されうる。他の側面において、ＲＮＡｉを用いて、細胞によって発現されうるＰＬＡ２Ｇ１６以外のＰＬＡ２の発現を阻害する。他のＰＬＡ２酵素を阻害して、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物の同定を容易にしてもよい。
[0083]本発明のいくつかの態様において、アンチセンスアプローチを用いて、ＰＬＡ２Ｇ１６発現を阻害し、ここで、ＰＬＡ２Ｇ１６をコードするｍＲＮＡに相補的な１またはそれより多いオリゴヌクレオチドが細胞に送達され、そしてこれがＰＬＡ２Ｇ１６ ｍＲＮＡにハイブリダイズして、ＲＮアーゼＨによるｍＲＮＡの分解または立体障害による翻訳の遮断を生じる。
[0084]本発明のいくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、ＰＬＡ２Ｇ１６の少なくとも１つの分子機能を阻害する。いくつかの態様において、分子機能は、触媒活性、例えばホスホリパーゼ活性および／またはリゾホスホリパーゼ活性である。例えば、活性は、ホスホリパーゼＡ２活性、すなわち、リン脂質のｓｎ−２結合の加水分解を触媒する能力であってもよい。いくつかの態様において、化合物は、ＰＬＡ２Ｇ１６の分子機能を直接阻害する。「直接阻害」は、ターゲットの分子機能を阻害する、ターゲットとの物理的相互作用（結合）を指す。例えば、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤のＰＬＡ２Ｇ１６への結合は、酵素が反応を触媒する能力に干渉し、そして／または基質が活性部位に進入するのを防止する。多様な化合物を用いて、ＰＬＡ２Ｇ１６分子機能を直接阻害することも可能である。ＰＬＡ２Ｇ１６を直接阻害する例示的な化合物は、例えば、小分子、抗体、またはアプタマーであることも可能である。いくつかの態様において、直接阻害剤は、基質類似体（例えばリン脂質類似体）または遷移状態類似体である。
[0085]いくつかの態様において、阻害剤は不可逆的阻害剤である。大部分の不可逆的酵素阻害剤は、酵素と反応し、そして例えば酵素活性に必要なアミノ酸残基（単数または複数）を改変することによって、化学的に変化させる。例えば、不可逆的阻害剤は、１またはそれより多い反応性官能基、例えばアルデヒド、ハロアルカン、アルケン、フルオロホスホネート（例えばアルキルフルオロホスホネート）、マイケル・アクセプター、スルホン酸フェニル、メチルケトン、例えばハロゲン化メチルケトンまたはジアゾメチルケトン、フルオロホスホネート、ビニルエステル、ビニルスルホン、またはビニルスルホンアミドを含んでもよい。いくつかの態様において、不可逆的ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、ＰＬＡ２Ｇ１６のアミノ酸側鎖と反応する求電子基を含む。例えば、求電子基は、ヒドロキシルまたはスルフィドリル基などの求核基を含有するアミノ酸側鎖と反応することも可能である。例えば、アミノ酸は、システイン、セリン、またはスレオニンであってもよい。別の態様において、不可逆的阻害剤はヒスチジンと反応する。ときに、当該技術分野において「システイントラップ」と称される部分を、多様な態様において用いてもよい。いくつかの態様において、システイン反応性部分は、マレイミド、イソチアゾリノン、テトラゾール、ラクタム、またはカルバメートである。基質類似体、あるいは酵素結合に適合する他の分子に、例えば活性部位中または近傍において、反応性官能基を取り込んでもよい。
[0086]他の態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、可逆的阻害剤である。可逆的阻害剤は、非共有的に結合し、そして酵素、酵素−基質複合体、または両方に結合可能である。可逆的阻害剤による阻害は、競合的阻害、不競合的阻害、混合阻害、非競合的阻害として分類可能である。例えば、Ｂｅｒｇ Ｊ．Ｍ，ら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第６版， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， ２００７を参照されたい。いくつかの態様において、可逆的阻害剤は、ＰＬＡ２Ｇ１６活性部位に結合し、そして／またはＰＬＡ２Ｇ１６活性部位への基質（単数または複数）のアクセスに関して競合する。いくつかの態様において、可逆的阻害剤は加水分解不能基質類似体である。
[0087]いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、長さ４〜約３０炭素の間、例えば長さ１２〜２０炭素の間のアルキル鎖を含む、脂肪酸類似体である。いくつかの態様において、アルキル基は飽和している。いくつかの態様において、アルキル基は不飽和である。いくつかの態様において、アルキル基は分枝していない。いくつかの態様において、アルキル基は、脊椎動物細胞に存在する脂肪酸に天然に見られるアルキル基構造を有する。例示的な脂肪酸には、例えば、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、およびエイコサン酸が含まれる。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、アラキドン酸またはリノール酸の類似体である。いくつかの態様において、類似体はメチル化脂肪酸である。いくつかの態様において、アラキドン酸類似体はエイコサジエン酸、例えば７，７−ジメチル−５，８−エイコサジエン酸である。
[0088]いくつかの態様において、阻害剤は、反応性官能基を含む、脂肪酸類似体を含む。いくつかの態様において、脂肪酸類似体は、カルボキシル基の代わりに、ハロゲン化メチルケトン基を含む。例えば、多様な態様において、ハロゲンは、塩素、フッ素、臭素、またはヨウ素であってもよい。いくつかの態様において、ハロゲン化メチルケトン基は、フルオロメチルケトン、トリフルオロメチルケトン、またはクロロメチルケトンである。いくつかの態様において、脂肪酸はアラキドン酸である。１つの態様において、阻害剤は、ＣＯＯＨ基がＣＯＣＦ３で置換されているアラキドン酸のトリフルオロメチルケトン類似体、すなわち化合物アラキドニルトリフルオロメチルケトン（ＡＡＣＯＣＦ３）である。ＡＡＣＯＣＦ３はＰＬＡ２Ｇ１６を阻害し、そしてまたｃＰＬＡ２およびｓＰＬＡ２も阻害する（Ｄｕｎｃａｎ、上記）。ＡＡＣＯＣＦ３はｃＰＬＡ２の疎水性ポケット中で結合し、そしてＡＡＣＯＣＦ３のカルボニル基は、活性部位のセリン２２８と共有結合を形成すると考えられる（Ｓｔｒｅｅｔら、１９９３； Ｔｒｉｍｂｌｅら、１９９３）。理論に束縛されることは望ましくないが、ＡＡＣＯＣＦ３は、ＰＬＡ２Ｇ１６の活性部位セリンと反応しうる。別の態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、メチルアラキドニルフルオロホスフェート（ＭＡＦＰ）またはその類似体である（例えば、Ｍａｒｔｉｎ， ＢＲ，ら， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， ２９４（３）， ２９４： １２０９−１２１８， ２０００を参照されたい）。ＭＡＦＰは、酵素に共有結合することによって、セリンおよびシステイン加水分解酵素を阻害すると考えられる。ＭＡＦＰは、ＰＬＡ２Ｇ１６ならびにｉＰＬＡ２およびｃＰＬＡ２を阻害するが、ｓＰＬＡ２を阻害しない（Ｄｕｎｃａｎ、上記）。理論に束縛されることは望ましくないが、ＰＬＡ２Ｇ１６は、活性システイン残基（すなわちＣｙｓ−１１３）を必要とする可能性もあり、これはＭＡＦＰに不活性化される。
[0089]１またはそれより多いＩ〜ＸＶ群ＰＬＡ２を阻害する多様な他の化合物が同定されてきている。例えば、米国特許公報第２００８０３１９０６５号は、炭化水素テールおよび４炭素テザーを持つ２−オキソアミド（ｏｘｏａｍｉｄｅ）を含有し、そしてＰＬＡ２ ＩＶＡ群ｃＰＬＡ２および／またはＶＩＡ群ｉＰＬＡ２および／またはＶ群ｓＰＬＡ２を阻害すると報告される化合物を開示する。米国特許公報第２００３０１４４２８２号および第２０１０００２９６４５号は、多様なＰＬＡ２酵素の阻害剤を開示する。１またはそれより多いＰＬＡ２酵素を阻害する他の化合物には、ピペラジン（例えばＷＯ２００３０４８１３９を参照されたい）；ピリミドン、ピリドン、ピリジノン、およびピリミジノン化合物（例えばＷＯ２００２０３０９０４； ＷＯ ２００１０６０８０５； ＷＯ ２００００２７８２４； ＷＯ ２００３０８７０８８； ＷＯ ２００３０８６４００； ＷＯ ２００３／０４２２１８； ＷＯ２００３０４２２０６； ＷＯ２００２０３０９１１； ＷＯ２００３０４１７１２を参照されたい）、ピロリジン誘導体（例えばＷＯ １９９８０３３７９７を参照されたい）が含まれる。理論に束縛されることは望ましくないが、Ｉ〜ＸＶ群ＰＬＡ２酵素の１またはそれより多くを阻害する化合物の少なくともいくつかは、ＰＬＡ２Ｇ１６もまた阻害しうる。いくつかの態様において、こうした他のＩ〜ＸＶ群ＰＬＡ２に対する作用の主な機構は、こうした他のＰＬＡ２に存在するが、ＰＬＡ２Ｇ１６に存在しない配列モチーフへの特異的結合を伴わない。例えば、いくつかの態様において、化合物は、その主な作用機構が、ＧＸＳＸＧコンセンサスモチーフまたはＣＣＸＸＨＤＸＣモチーフへの結合を伴うものではない。
[0090]いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、ペプチド、例えばディスプレイ技術、例えばファージディスプレイまたはリボソームディスプレイを用いて同定されたペプチドを含む。いくつかの態様において、ペプチドは、１またはそれより多い非標準アミノ酸を含む。いくつかの態様において、ペプチドは環状である。例えば、ペプチドは、例えばＮおよびＣ末端アミノ酸間、ＮまたはＣ末端アミノ酸および内部アミノ酸間、あるいは２つの内部アミノ酸間で、ジスルフィド結合または共有結合を通じて環状化されることも可能である。
[0091]いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤はアプタマーを含む。一般的に、アプタマーは、関心対象の特定の分子に結合する、しばしば、一本鎖オリゴヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、場合によって１またはそれより多い非標準ヌクレオチドあるいは修飾、例えば２’−フルオロ、２’−アミノ、および／または２’−メトキシヌクレオチドを含有するもの）である。アプタマーは、典型的には、ＳＥＬＥＸのようなｉｎ ｖｉｔｒｏ進化および選択プロセスに由来する。関心対象のタンパク質に特異的なアプタマーを得るための方法は、当該技術分野に知られる。例えば、Ｂｒｏｄｙ ＥＮ， Ｇｏｌｄ Ｌ． Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ７４（１）：５−１３， ２０００を参照されたい。
[0092]いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、抗体またはその一部を含む。いくつかの態様において、抗体は、一本鎖抗体、ディアボディ、トリアボディ、またはミニボディである。当該技術分野に知られる抗体産生の標準法を用いて、ＰＬＡ２Ｇ１６に結合する抗体、例えばモノクローナル抗体を産生することも可能である。いくつかの態様において、動物、例えばマウスまたはウサギをＰＬＡ２Ｇ１６またはその一部で免疫し、抗体産生細胞を単離し、そしてハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を同定する。いくつかの態様において、マウスは、少なくともいくつかの未再編成ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を含み、そして好ましくは内因性重鎖および軽鎖ネズミ配列のターゲティング破壊を有するトランスジェニックマウスである。いくつかの態様において、組換え核酸技術（例えばファージまたは酵母ディスプレイ）を用いて、抗体を同定または産生する。例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ． Ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０（４）：４５０−９， ２００８を参照されたい。
[0093]本発明のいくつかの態様において、化合物は、ＰＬＡ２Ｇ１６を間接的に阻害する。「間接的阻害」は、化合物およびターゲットの間の物理的相互作用を必要としない機構によるターゲット（例えばＰＬＡ２Ｇ１６）の阻害を指す。例えば、化合物は、ＰＬＡ２Ｇ１６の局在または翻訳後修飾に関与するポリペプチドの発現または活性を阻害することも可能である、ここで、こうした局在または翻訳後修飾は、ＰＬＡ２Ｇ１６分子機構に重要である。
[0094]いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、抗ウイルス活性を有すること、ならびに／あるいはウイルス感染治療が必要な被験体を治療するのに有用であることが当該技術分野において知られるかまたは示唆される化合物ではない。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、抗ウイルス活性を有すること、ならびに／あるいはウイルス感染治療が必要な被験体を治療するのに有用であることが当該技術分野において知られるかまたは示唆される化合物であるが、場合によって、（ｉ）異なるウイルス、例えばその化合物が抗ウイルス活性を有することが知られず、また示唆されないウイルスによる感染を阻害し；（ｉｉ）異なる（例えばより精製された）型で、異なる量または組成中で、あるいは１またはそれより多い異なる物質と組み合わせて；（ｉｉｉ）異なる経路によって、または異なる種の被験体に；そして／または（ｉｖ）本発明の組成物および／または方法の１またはそれより多くのいずれからも明確に排除されるように、本発明において投与されるか、または別の方式で用いられる。
[0095]ＶＩ．化合物を同定しそして／または試験するための組成物および方法
[0096]本発明は、ウイルス感染を阻害するのに有用な化合物を同定する方法および本発明の方法を実行するためのアッセイ系を提供する。いくつかの側面において、本発明は、試験化合物が候補抗ウイルス化合物であるかどうかを決定する方法であって、試験化合物がＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを阻害するかどうかを決定する工程を含む、ここで化合物がＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する場合、化合物が候補抗ウイルス化合物である、前記方法を提供する。関連する側面において、本発明は：（ａ）試験化合物を提供し；（ｂ）試験化合物がＰＬＡ２Ｇ１６を阻害するかどうかを決定する工程を含む、ここで化合物がＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する場合、化合物が候補抗ウイルス化合物である、前記方法を含む。
[0097]いくつかの態様において、方法は、試験化合物がＰＬＡ２Ｇ１６の発現を阻害するかどうかを決定する工程を含む、ここで化合物がＰＬＡ２Ｇ１６発現を阻害する場合、化合物は候補抗ウイルス化合物である。いくつかの態様において、方法は、化合物がＰＬＡ２Ｇ１６の分子機能を阻害するかどうかを決定する工程を含み、化合物がＰＬＡ２Ｇ１６の分子機能を阻害する場合、化合物は候補抗ウイルス化合物である。いくつかの態様において、分子機能は酵素活性、例えばホスホリパーゼＡ２活性またはリゾホスホリパーゼ活性である。
[0098]いくつかの態様において、多細胞生物によって天然に発現されるＰＬＡ２Ｇ１６、すなわち天然ＰＬＡ２Ｇ１６に配列が同一であるＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを用いて、方法を実行する。いくつかの態様において、機能ＰＬＡ２Ｇ１６変異体を用いて、方法を実行する。いくつかの態様において、本発明のアッセイで用いる機能変異体は、ＰＬＡ２Ｇ１６のホスホリパーゼＡ２活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多くを保持する。いくつかの態様において、機能変異体は、ＰＬＡ２Ｇ１６のリゾホスホリパーゼ活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多くを保持する。いくつかの態様において、機能変異体は、少なくとも５０％または少なくとも７５％を保持するか、あるいは天然ＰＬＡ２Ｇ１６とほぼ同じホスホリパーゼＡ２活性および／またはリゾホスホリパーゼ活性を有する。ＰＬＡ２Ｇ１６変異体は、本発明のスクリーニング法で使用するのに好適である特性、例えばタンパク質の産生または精製を容易にするタグの存在を有しうる。天然ポリペプチドを阻害する能力を確認するため、天然ＰＬＡ２Ｇ１６を用いて、ＰＬＡ２Ｇ１６変異体を用いて阻害剤として同定された化合物をさらに試験してもよい。
[0099]本発明の方法において、非常に多様な試験化合物が使用可能である。例えば、試験化合物は、小分子、ポリペプチド、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、脂質、炭水化物、またはハイブリッド分子であってもよい。天然供給源から化合物を得てもよいし、または化合物を合成的に産生してもよい。化合物は、少なくとも部分的に純粋であってもよいし、あるいは、抽出物または他のタイプの混合物中に存在してもよい。抽出物またはその分画は、例えば、植物、動物、微生物、海洋生物、発酵ブロス（例えば土壌、細菌または真菌発酵ブロス）等から産生可能である。いくつかの態様において、化合物コレクション（「ライブラリー」）を試験する。ライブラリーは、例えば、１００〜５００，０００化合物の間、またはそれより多くを含んでもよい。化合物は、しばしば、マルチウェルプレート中にアレイ化される。これらを溶媒（例えばＤＭＳＯ）中に溶解してもよいし、あるいは乾燥型で、例えば粉末または固体として提供してもよい。合成、半合成、および／または天然存在化合物のコレクションを試験してもよい。化合物ライブラリーは、構造的に関連した、構造的に多様な、または構造的に関連しない化合物を含んでもよい。化合物は人工的（人によって発明された構造を有し、そして天然には見られない）であってもまたは天然に存在してもよい。いくつかの態様において、ライブラリーは、他の薬剤発見プログラムにおいて、「ヒット」または「リード」と同定されている、少なくともいくつかの化合物、および／またはその誘導体を含む。化合物ライブラリーは、天然産物、および／または非配向性または配向性合成有機化学を用いて生成された化合物を含んでもよい。しばしば、化合物ライブラリーは、小分子ライブラリーである。他の関心対象のライブラリーには、ペプチドまたはペプトイドライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、およびオリゴヌクレオチドライブラリーが含まれる。
[00100]ライブラリーは、フォーカシングされていてもよい（例えば、主に同じコア構造を有する化合物で構成されるか、同じ前駆体に由来するか、または少なくとも１つの生化学的活性を共通して有する）。いくつかの態様において、１またはそれより多いＩ〜ＸＶ群ＰＬＡ２酵素の阻害剤として同定されてきている化合物を試験する。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤として同定される化合物のＩＣ５０は、１またはそれより多い他のＰＬＡ２酵素（例えば、ヒトに存在するおよび現在までに知られる他のＰＬＡ２酵素の１つ、１より多く、またはすべて）に対して、ＰＬＡ２Ｇ１６に関して、約２、５、１０、２０、５０、１００，２５０、５００、または１０００倍低い可能性もある。
[00101]化合物ライブラリーは、Ｔｏｃｒｉｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｎａｎｏｓｙｎ、ＢｉｏＦｏｃｕｓなどの多くの商業的業者から、そして政府機関から、入手可能である。例えば、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）分子ライブラリープログラムの構成要素である分子ライブラリー小分子リポジトリー（ＭＬＳＭＲ）は、例えば、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイで用いるための既知のおよび未知の生物学的活性を持つ、＞３００，０００の化学的に多様な化合物のコレクションを同定し、獲得し、維持し、そして分配するように設計されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｌｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｌｉ／を参照されたい）。ＮＩＨ臨床コレクション（ＮＣＣ）は、ヒト臨床試験での使用歴を有する、およそ４５０の小分子のプレーティングされたアレイである。これらの化合物は安全性プロファイルが知られた非常に薬剤様のものである。ＮＣＣコレクションは、６枚の９６ウェルプレート中にアレイ化されている。１００％ＤＭＳＯ中、およそ１０ｍＭ溶液として、５０μｌの各化合物を供給する。いくつかの態様において、「認可されたヒト薬剤」を含む化合物のコレクションを試験する。「認可されたヒト薬剤」は、米国食品医薬品局、欧州医薬品審査庁、または療法剤の市販を許可する前に、少なくともその安全性を評価する責任がある、類似の政府機関などの政府監督機関によって、ヒトを治療する際に使用することが認可されている化合物である。試験化合物は、例えば抗新生物、抗細菌、抗ウイルス、抗真菌、抗原生動物、抗寄生虫、抑鬱、抗精神病、麻酔、抗狭心症、降圧、抗不整脈、抗炎症、鎮痛、抗血栓、制吐、免疫調節、抗糖尿病、脂質またはコレステロール低下（例えばスタチン）、抗痙攣、抗凝固、抗不安、催眠（睡眠誘導）、ホルモン、または抗ホルモン薬剤等であってもよい。いくつかの態様において、化合物は、少なくともいくつかの前臨床または臨床開発を経ているか、あるいは「薬剤様」特性を有すると決定されているかまたは予測されているものである。例えば、試験化合物は、第Ｉ相試験または少なくとも非ヒト動物での前臨床研究を完了しており、そして安全性および許容性の証拠が示されているものであってもよい。いくつかの態様において、試験化合物は、化合物を投与可能な生物の細胞、または化合物を試験可能な細胞に対して、使用しようとする濃度で、またはいくつかの態様において、使用しようとする濃度の最高１０倍、１００倍、または１，０００倍より高い濃度で、実質的に非毒性である。例えば、細胞生存度および／または増殖に対して統計的に有意な影響はない可能性もあるし、あるいは多様な態様において、生存または増殖における減少は、１％、５％、または１０％より高くない可能性もある。任意の多様なアッセイ（このうちいくつかを上に言及する）を用いて、細胞傷害性および／または細胞増殖に対する影響を評価してもよい。いくつかの態様において、試験化合物は、当該技術分野に知られるかまたは用いられる細胞培地、例えば脊椎動物、例えば哺乳動物細胞を培養するのに適した培地中に見られる化合物ではなく、あるいは試験化合物が、当該技術分野に知られるかまたは用いられる細胞培地中に見られる化合物である場合、該試験化合物は、本発明の方法で用いられる場合、異なる、例えばより高い濃度で用いられる。
[00102]いくつかの態様において、試験化合物は、１またはそれより多いウイルスに対して抗ウイルス活性を有すると当該技術分野に認識されるが、関心対象のウイルス、例えばピコルナウイルスによる感染を阻害するのに有用であるとは知られていない化合物である。いくつかの態様において、試験化合物は、当該技術分野において抗ウイルス活性を有すると認識される化合物ではない。
[00103]いくつかの態様において、既知の抗ウイルス活性を有する１またはそれより多い化合物またはその混合物を試験する、ここで、化合物または混合物の分子ターゲット、ならびに／あるいは抗ウイルス活性の機構は知られていない。本発明にしたがったこうした化合物または混合物がＰＬＡ２Ｇ１６を阻害するかどうかを決定する試験は、ＰＬＡ２Ｇ１６が分子ターゲットであるものを発見することにつながりうる。こうした発見は、混合物からの活性構成要素の精製、化合物のより活性が高い誘導体の発展を容易にし、そして／または療法剤としての化合物または混合物のさらなる開発を別の方式で可能にしうる。
[00104]試験化合物がＰＬＡ２Ｇ１６発現を阻害するかどうかを決定する工程は、多様な方式で実行可能である。細胞を試験化合物と接触させ、細胞を適切な期間（例えば存在するＰＬＡ２Ｇ１６ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の分解を可能にするのに十分な時間）、培養中に維持し、そして次いで、ＰＬＡ２Ｇ１６ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定することによって、ＰＬＡ２Ｇ１６発現を阻害する化合物を同定することも可能である。ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するために、当該技術分野に知られる方法を用いてもよい。ＲＮＡを測定するために、ハイブリダイゼーションに基づくまたは増幅に基づく多様な異なる方法が利用可能である。例には、ノーザンブロット、マイクロアレイ（例えばオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡマイクロアレイ）、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ（例えば定量的ＲＴ−ＰＣＲ）、または逆転写後配列決定が含まれる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイおよびＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＰＣＲアッセイは、一般的に用いられるリアルタイムＰＣＲ技術である。他のアッセイには、標準化（Ｓｔａ）ＲＴ−ＰＣＲＴＭ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、オハイオ州トレド）およびＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）（Ｐａｎｏｍｉｃｓ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フレモント）が含まれる。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６ ｍＲＮＡのレベルを測定する。他の態様において、レポーターに基づく系を用いる。いくつかの態様において、レポーターに基づく系は、ＰＬＡ２Ｇ１６遺伝子の発現調節要素が、レポーター分子（「レポーター」）をコードする配列に機能可能であるように連結されている核酸を指す。レポーターは、しばしば、タンパク質であるが、核酸であってもよい。レポーターは、しばしば、容易に検出可能な分子、例えば蛍光、発光、または比色シグナルを生じるか、あるいは特定の波長の光を吸収可能であるタンパク質である。いくつかの態様において、レポーター分子は、基質に作用して、蛍光、発光、または比色シグナルを生じる酵素を含む。例示的なレポーター分子には、例えば、緑色、青色、サファイア、黄色、赤色、オレンジ、およびシアン蛍光タンパク質およびその誘導体；「ｍフルーツ」として知られる単量体赤色蛍光タンパク質および誘導体、例えばｍチェリー、ｍストロベリー、ｍトマト；ルシフェラーゼ；ベータ−ガラクトシダーゼ；西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ；アルカリホスファターゼ等が含まれる。いくつかの態様において、レポーターは分泌されるタンパク質である。いくつかの態様において、レポーターは、関心対象の生物由来の細胞における発現のためにコドン最適化されている配列にコードされる。ＲＮＡｉ剤がターゲット遺伝子の発現をサイレンシングする効率を評価するための方法は、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのｍＲＮＡターゲット（またはターゲットの一部）がレポーターをコードする配列の下流にクローニングされている配列の使用を伴うことも可能であり、したがって、ターゲット配列およびレポーターの両方をコードする二シストロン性ｍＲＮＡ転写物が産生される。ターゲット遺伝子ノックダウンによって、ｍＲＮＡ転写物の分解（または翻訳阻害）が生じ、これがレポータータンパク質の発現の比例的減少を引き起こす。
[00105]多様な異なる細胞不含系または細胞に基づく系を用いて、ＰＬＡＧ１６分子機能を阻害する化合物を同定することも可能である。細胞不含アッセイは、典型的には単離されたターゲット分子を含む。例えば、ターゲット分子は、細胞または組織溶解物またはその分画（例えばターゲット分子を発現する細胞から作製された溶解物）中に存在してもよいし、あるいは少なくとも部分的に精製されたまたは合成されたターゲット分子であってもよい。組織溶解物は、ＰＬＡ２Ｇ１６を発現する細胞を含有する任意の組織から作製可能である。いくつかの態様において、組織溶解物は、脂肪組織、例えば白色脂肪組織から得られる。細胞溶解物を調製可能であるかまたはＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを精製可能である多様な細胞には、細胞に基づくアッセイの考察において、以下で言及する。いくつかの態様において、単離ポリペプチドは、組換え核酸技術またはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を用いて合成されているポリペプチドである。アッセイを実行するため、例えば試験化合物およびターゲット分子を含む組成物を調製することによって、試験化合物をターゲット分子と接触させる。１またはそれより多いパラメータ、例えば結合、酵素活性等を測定する。組成物は、関心対象の化合物を同定するのに必要であるかまたは有益である他の構成要素（単数または複数）を含むことも可能である。いくつかの態様において、結合アッセイまたは活性アッセイで使用するための組成物は、細胞膜または細胞膜構成要素を含む。こうした膜または構成要素は、多様な態様において、天然存在（例えば動物細胞膜に存在する構成要素）、人工的、またはその組み合わせであることも可能である。例えば、組成物は、脂質膜二重層、脂質小胞等を含有してもよい。場合によって、脂質二重層は、表面上に固定される。いくつかの態様において、脂質はリン脂質を含む。
[00106]多様な細胞不含アッセイを実行して、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを阻害する化合物を同定することも可能である。いくつかの態様において、アッセイは、試験化合物がＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドに結合するかどうかを検出し、そして／またはこうした結合の１またはそれより多い特性を定量化する。多くの結合アッセイ形式が当該技術分野で知られる。いくつかの態様において、標識不含アッセイを用い、一方、他の態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドまたは試験化合物のいずれかが検出可能に標識される。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチド、あるいはＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドに結合しそして／またはその活性を阻害する能力に関して試験しようとする化合物を固体支持体に付着させる。いくつかの態様において、固体支持体は、剛性または半剛性表面を有する物品である。いくつかの態様において、支持体の少なくとも１つの表面は、実質的に平面である。他の態様において、支持体は、ほぼ球形である。支持体は無機または有機材料あるいはその組み合わせで構成されてもよい。いくつかの態様において、支持体は、少なくとも部分的に、金属、セラミック、ガラス、プラスチック、ゲル、または他のマトリックスで構成される。こうした物品は、例えば、プレート（例えばマルチウェルプレート）、スライド、粒子（例えば「ビーズ」、例えば磁気ビーズ）、ペレット、バー、ロッド、ピン、ディスク、チップ、フィルターの型、または他の適切な型を取ってもよい。いくつかの態様において、支持体はセンサー、例えば結合における変化を検出可能なセンサーを含む。例えば、センサーは、重量または蛍光などのシグナルの変化を検出してもよい。いくつかの態様において、支持体は電極である。いくつかの態様において、化合物は、小分子マイクロアレイとして配置される。化合物は、表面上の多数の位置で、個々のウェルまたは容器中などに存在するであろう。例えば、Ｖｅｇａｓ ＡＪら， Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ． ３７（７）： １３８５−９４， ２００８を参照されたい。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドまたは化合物は、支持体に非共有的に付着するかまたは共有結合する。非共有付着は、アフィニティに基づく機構、または支持体に物理的に結合したままであるように、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドまたは試験化合物を固定する他の手段を通じた、例えば表面（こうした吸着を促進するための物質でコーティングされていてもよい）へのポリペプチドまたは化合物の吸着によってであってもよい。いくつかの態様において、抗体を用いて、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドまたは試験化合物を支持体に付着させる。いくつかの態様において、ビオチン−アビジン相互作用または他の強い結合相互作用を介して、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドまたは試験化合物を支持体に付着させる、ここで、２つの結合パートナーの一方が支持体に直接または間接的に付着し、そしてもう一方の結合パートナーが固定しようとする分子に付着する。
[00107]いくつかの態様において、試験化合物を多数の位置で（例えばアレイ形式で）固定する。ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを添加し、そして組成物を適切な期間維持して、結合が生じるのを可能にする。いくつかの態様において、未結合物質を洗浄によって除去し、そして抗体を用いて、またはポリペプチドが検出可能に標識されている場合、シグナルを検出することによって、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを検出する。他の態様において、洗浄工程は不要である。例えば、蛍光偏光、蛍光共鳴エネルギー移動、または電気化学発光の変化を測定することによって、結合を検出してもよい。他の態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを固定し、試験化合物を添加し、そして類似のアプローチを用いて結合を測定する。
[00108]いくつかの態様において、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、試験化合物およびＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチド間の動力学（結合および／または解離速度）および／または結合強度（アフィニティ）を測定する。例えば、ＳＰＲ技術（例えばＢｉａｃｏｒｅ， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅより入手可能なものなどの系）を用いて、チップ上に固定されたタンパク質への試験化合物の結合および解離を測定してもよく、そして測定された値を、試験化合物を含有しない溶液がチップ上に装填された際に得られたものと比較してもよい。結合および解離率および／または結合レベルに基づいて、タンパク質への結合が可能な試験化合物を選択してもよい。結合を検出し、そして／または定量化する他の有用な方法には、水晶振動子マイクロバランス、光学的カンチレバー、マイクロチャネル共鳴器、二偏波干渉計、結合導波路プラズモン共鳴、免疫沈降または他の抗体に基づく検出法、等温滴定および示差走査熱量測定、キャピラリー電気泳動、共鳴エネルギー移動、電気化学発光、および蛍光相関分析の使用が含まれる。
[00109]いくつかの態様において、アプタマー、ペプチド、加水分解不能基質類似体、またはＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドに結合することが知られる小分子を標識し、そしてポリペプチドに結合し、そして／またはその活性を阻害する能力に関して、試験化合物（例えば小分子）をスクリーニングするためのツールとして用いる。標識は、例えば放射性、蛍光、発光、または他の容易に検出可能な部分を含んでもよい。試験化合物が標識アプタマー、ペプチド、加水分解不能基質類似体、または小分子と競合する能力を検出してもよく、そしてこれを、試験化合物がＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドに結合する指標として利用する。例えば、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を用いてもよい。ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドに結合する化合物を同定するためのＳＰＡのいくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを、シンチラント物質を含有するビーズに付着させる。ビーズは、典型的には、ウェルまたは他の容器中に位置する。別の態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを、ウェルに直接包埋されたシンチラント物質に付着させる。ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドに結合可能な放射標識化合物および試験化合物をウェルに付加する。ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドに放射標識化合物が結合すると、シグナルが生じる。シグナルは、放射標識化合物と結合に関して競合する試験化合物の存在下で減少する。ＳＰＡの概説に関しては、例えば、Ｊ． Ｆｒａｓｅｒ Ｇｌｉｃｋｍａｎ，ら， Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓｓａｙｓ ｉｎ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ． ６（３）： ４３３−４５５， ２００８を参照されたい。フィルターを用いて、類似のアッセイを行ってもよい。
[00110]いくつかの態様において、およそ１ｍＭ、５００μΜ、１００μΜ、５０μΜ、１０μΜ、５μΜ、または１μΜと等しいかまたはそれ未満のＫｄでＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドに結合する化合物を選択する。いくつかの態様において、化合物は、およそ５００ｎΜ、１００ｎΜ、５０ｎΜ、または１０ｎΜと等しいかまたはそれ未満のＫｄでＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドに結合する。いくつかの態様において、化合物は、０．１〜１０ｎＭの間のＫｄでＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドに結合する。ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドに結合する化合物を、例えば細胞不含アッセイまたは細胞に基づくアッセイでさらに試験して、例えば以下に記載するように、これらがＰＬＡ２Ｇ１６活性（例えば触媒活性）を阻害する度合いを決定してもよい。
[00111]多様な異なるアッセイを使用して、ＰＬＡ２Ｇ１６活性を阻害する化合物を同定し、そして／または性質決定してもよい。いくつかの態様において、化合物が、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドによる化学反応の触媒を阻害する能力を評価する。いくつかの態様において、化学反応は、リン脂質のｓｎ−２結合の加水分解である。ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチド、１またはそれより多いＰＬＡ２Ｇ１６基質、および試験化合物を含む組成物を提供する。ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチド、１またはそれより多いＰＬＡ２Ｇ１６基質、および試験化合物は、通常、適切な液体媒体中にある。いくつかの態様において、液体媒体は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより多い水（ｖ／ｖ）を含む水性媒体である。いくつかの態様において、液体媒体は、例えば、有機溶媒の非存在下での活性と比較した際、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの活性に有意に影響を及ぼさない量で、ＤＭＳＯなどの有機溶媒を含んでもよい。この文脈において、「基質」は、ＰＬＡ２Ｇ１６が作用する分子、すなわち、ＰＬＡ２Ｇ１６によって触媒される化学反応を経る分子である。例示的な基質を以下に論じる。基質およびＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの濃度は多様でありうる。いくつかの態様において、基質は、約１μＭ〜５００μＭの間、例えば約１０μＭ〜約５０μＭ、１００μＭ、または２００μＭの間で存在する。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドは、１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの間で存在する。濃度および量の選択は、少なくとも部分的に特定のアッセイに応じ、そして当該技術分野の範囲内であることが理解されるであろう。組成物を、そうでなければ（すなわち潜在的なＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤である化合物の非存在下で）基質（単数または複数）が１またはそれより多い産物に変換される反応をＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドが触媒するのに適した条件下で、適切な期間、維持する。望ましい期間の後、例えば（２：１）メタノール：クロロホルムの添加によって、反応を停止してもよい。条件および組成物中に存在する他の構成要素（単数または複数）は、特定のアッセイに応じて多様でありうる。ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドが基質に対して作用するのに適した条件には、例えば約６．５〜約９．５の間、例えば約７．０〜約９．０の間、例えば約７．５〜約８．５の間、例えば約８．０のｐＨが含まれる。いくつかの態様において、温度は、１０℃〜４０℃の間、例えば２０℃から３０℃の間、例えば約２５℃である。他の構成要素が組成物中に存在してもよい。いくつかの態様において、組成物は、ｐＨを制御するのを補助するために、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌまたはホウ酸ナトリウムなどの緩衝物質を含む。他の緩衝物質には、例えばＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ等が含まれる。いくつかの態様において、組成物は、二価陽イオン、例えばカルシウム（Ｃａ２＋）を含む。例えば、いくつかの態様において、組成物は、最大約５ｍＭカルシウム、例えば約０．５ｍＭ〜約２．５ｍＭカルシウムの間を含む。例示的な態様において、組成物は約１ｍＭカルシウムまたは約２ｍＭカルシウムを含む。いくつかの態様において、組成物は、ＥＤＴＡのようなカルシウム・キレート剤は含まない。いくつかの態様において、組成物は、遊離カルシウム濃度を約１．０ｍＭ未満に減少させない量で、カルシウム・キレート剤を含む。いくつかの態様において、組成物は、例えば１〜５ｍＭの間、例えば約２ｍＭまたは約３ｍＭで、界面活性剤、例えばデオキシコール酸を含む。
[00112]いくつかの態様において、産生された産物の量および／または産物形成速度を決定する。産生される産物の量および／または産物が産生される速度に対する試験化合物の影響を、例えば適切な参照値と比較することによって評価する。産物の量または産物産生速度が、適切な参照値と比較した際、試験化合物の存在下で減少している場合、試験化合物は、基質が１またはそれより多い産物に変換される反応をＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドが触媒する能力を阻害する、すなわち試験化合物は、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの阻害剤である。いくつかの態様において、基質消費速度または基質消費量を決定する。同等に、残る基質の量を決定してもよい。消費される基質の量または基質消費速度が、適切な参照値と比較した際、試験化合物の存在下で減少する場合、試験化合物は、基質が１またはそれより多い産物に変換される反応をＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドが触媒する能力を阻害する、すなわち試験化合物は、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの阻害剤である。任意のこれらのアッセイの参照値は、試験化合物の非存在下、類似のまたは同一の条件下で測定された値であってもよい。
[00113]いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６基質は、ホスホリパーゼ活性、例えばホスホリパーゼＡ２活性を測定するのに有用である。例えば、ＰＬＡ２Ｇ１６基質は、天然存在または人工的リン脂質であってもよい。当該技術分野に知られるように、大部分のリン脂質は、１，２−ジアシルグリセロールおよびリン酸基、ならびに有機分子（しばしば窒素塩基）で構成される。ホスホジエステル架橋は、グリセロール主鎖を塩基に連結し、これはしばしば「頭部基」と称される。例示的な頭部基は、コリン、エタノールアミン、イノシトール、およびセリンである。例えば、基質は、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンであってもよい。リン脂質分子のアシル基の炭化水素鎖は、しばしば異なり、例えば、これらは異なる炭化水素鎖を持つ脂肪酸分子に由来する。いくつかの態様において、炭化水素鎖は、長さ１２〜３０炭素の間である。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６基質は、天然存在リン脂質、例えば脊椎動物細胞、例えば哺乳動物細胞において見られるリン脂質の構造を有する。例示的なＰＬＡ２Ｇ１６基質には、例えば、１−パルミトイル−２−リノレオイル−ＰＣ、ジリオレノイル−ＰＣ、１−パルミトイル−２−リノレオイル−ＰＳ、１−パルミトイル−２−リノレオイル−ＰＥ、ホスファチジルイノシトール、１−パルミトイル−２−アラキドニル−ＰＣ（略語：ＰＣ：ホスファチジルコリン ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン；ＰＳ：ホスファチジルセリン）。いくつかの態様において、基質は、頭部基としてコリンを含む。いくつかの態様において、ｓｎ−２エステルの代わりに、チオエステル結合を含有するリン脂質類似体を用いる。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６基質は、リゾホスホリパーゼ活性を測定するのに有用である。例えば、基質は、リゾホスファチジルコリン、例えば１−パルミトイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリンであってもよい。
[00114]いくつかの態様において、基質は、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドによって触媒される生化学反応の産物の検出を容易にする部分を含む。例えば、基質は、１またはそれより多い放射性原子、蛍光標識、および／または蛍光消光剤を含んでもよい。いくつかの態様において、標識は、１４Ｃ、３Ｈ、または３２Ｐを含む。いくつかの態様において、基質は、基質から切断されるとシグナルを放出する部分を含む。いくつかの態様において、基質は、基質から放出されると容易に検出可能である部分を含む。例えば、部分は別の化合物と反応して、比色、蛍光、または発光シグナルを産生してもよい。標識には、例えば、有機物質（「伝統的」色素フルオロフォア、消光剤、およびポリマーを含む）；無機物質、例えば金属キレート剤、金属および半導体ナノ結晶（例えば「量子ドット」、および特定のアミノ酸（例えばトリプトファン、チロシン）などの生物学的起源のフルオロフォア）；ならびに天然存在または合成ルシフェリン（例えばホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）またはレニラ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェリン、セレンテラジン）など、酵素触媒に際して発光を示す化合物が含まれる。蛍光色素には、例えばアクリジン色素；Ａｌｅｘａ色素；ＢＯＤＩＰＹ、シアニン色素；フルオレセイン色素、ローダミン色素、および前述のいずれかの誘導体が含まれる。例えば、多くの蛍光および他の検出可能分子、ならびにその使用法および修飾法を記載する、例えば、Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ-Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， 第１０版（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を参照されたい。別の態様において、ｓｎ−２エステルの代わりにチオエステル結合を含有するリン脂質類似体を用い、そしてＰＬＡ２によるｓｎ−２位でのチオエステル結合の加水分解が、遊離チオールを放出し、これがＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））によって検出されてもよい。
[00115]いくつかの態様において、基質は小胞またはミセル中に存在する。例えば、脂質−界面活性剤ミセルが使用可能である。いくつかの態様において、イオン性界面活性剤、例えばデオキシコール酸を用いる。他の界面活性剤には、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００が含まれる。いくつかの態様において、約１００μＭ １−パルミトイル−２−リノレオイル−ＰＣと２ｍＭデオキシコール酸および２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する組成物を用いる。試験化合物を小胞またはミセル中に取り込んでもよい。
[00116]多様なアッセイを用いて、ＰＬＡ２触媒活性を測定してもよい。いくつかの態様において、Ｉ〜ＸＶ群ＰＬＡ２（例えば細胞質ゾルまたは分泌ＰＬＡ２）の活性を測定するために当該技術分野で用いられているアッセイを用いるかまたは用いるために修飾して、ＰＬＡ２Ｇ１６の触媒活性を測定する。いくつかの態様において、ｓｎ−２位に１４Ｃまたは３Ｈ標識脂肪酸を含有するリン脂質（例えばホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミン）の基質とともに、放射測定アッセイを用いる。放出された脂肪酸を未反応基質から分離し、そして液体シンチレーション計測によって定量化する。他の態様において、蛍光置換アッセイを用いる。例えば分光光度計を用いて蛍光分子を検出することも可能である。例示的なアッセイは、ジデカノイル−ホスファチジルコリンのホスホリパーゼＡ２触媒加水分解の結果として放出されるデカン酸による、アルブミンまたはラット肝臓脂肪酸結合タンパク質からの蛍光脂肪酸プローブの置換を伴う。Ａ．Ｒ． Ｋｉｎｋａｉｄ ＆ Ｄ．Ｃ． Ｗｉｌｔｏｎ， Ａ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ ａ２ ｕｓｉｎｇ ａｌｂｕｍｉｎ ａｎｄ ｍｅｄｉｕｍ ｃｈａｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１２： ６５−７０， １９９３； Ｄ．Ｃ． Ｗｉｌｔｏｎ， Ａ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｌｉｐａｓｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｌｅａｓｅ ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２６６： ４３５−４３９， １９９０）。また、遊離脂肪酸および高い蛍光の７−ヒドロキシクマリンを産生する、ｃＰＬＡ２による７−ヒドロキシクマリンの脂肪酸エステルの加水分解に基づくｃＰＬＡ２活性に関するアッセイを記載する、Ｈｕａｎｇ， Ｚ．，ら， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２２： １１０−１１５， １９９４もまた参照されたい。別のアッセイは、重合リポソーム基質に基づく蛍光定量ホスホリパーゼアッセイである（Ｃｈｕ， Ｗ．，ら， Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ ａｓｓａｙｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｓｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １０９： ７−１７， １９９９）。別の態様において、ｓｎ−２エステルの代わりにチオエステル結合を含有するリン脂質類似体を基質として用いて、ホスホリパーゼ活性を測定する（Ｙｕ， Ｌ，ら Ｃａｒｂｏｎｏｔｈｉｏａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ ａ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６５： ３５−４１， １９９８）。
[00117]別の態様において、ＰＬＡ２基質としてジリノレオイルホスファチジルコリン（ＤＬ−ＰＣ）およびカップリング酵素としてリポキシゲナーゼを用いたカップリング分光測定アッセイを用いる。例えば、Ｊｉｍｅｎｅｚ， Ｍ．，ら Ａ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ（２） ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３１９（１）： １３１−７， ２００３、および該文献中の参考文献、ならびにＤｕｎｃａｎ、上記を参照されたい。このアッセイにおいて、リポキシゲナーゼ（リノール酸エステル：酸素酸化還元酵素、ＥＣ １．１３．１１．１２）は、少なくとも１つの（Ｚ，Ｚ）−ペンタジエン系を含有する脂肪酸への、分子酸素の付加を触媒して、対応するヒドロペルオキシドを生じる。リポキシゲナーゼは、ホスリパーゼの作用によって放出されたリノール酸を酸化し、次いで、リポキシゲナーゼの作用による、リノール酸からの対応するヒドロペルオキシドの形成から生じる、２３４ｎｍの吸光度の増加を記録することによって、該ホスホリパーゼの活性を分光光度的に追跡することも可能である。この方法は、リン脂質加水分解の連続記録を提供する。
[00118]いくつかの態様において、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を用いる。例えば、放射標識ＰＬＡ２Ｇ１６基質を、シンチラント物質を含有するビーズに付着させてもよい。ビーズは、典型的には、ウェルまたは他の容器中に位置する。別の態様において、シンチラント物質は、ウェル内に直接包埋される。ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを適切な組成（場合によってカルシウムおよび／または緩衝剤を含有する）中でウェルに添加する。基質の加水分解が放射性部分を放出し、シグナル減少が生じる。ＳＰＡの考察に関しては、例えば、Ｊ． Ｆｒａｓｅｒ Ｇｌｉｃｋｍａｎ、上記を参照されたい。
[00119]いくつかの態様において、アッセイ読み取り値は、共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）、例えば蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、発光共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）、または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）に基づく。非常に多様なＲＥＴに基づくアッセイが実行可能である。一般的に、こうしたアッセイは、２つの部分（ときにドナーおよびアクセプターと称される）間のエネルギー移動を伴う距離依存性相互作用を利用する。両方の部分がＰＬＡ２Ｇ１６基質の一部として存在し、そして基質の切断が部分の一方を放出するように配置されるならば、シグナル（例えばシグナルの増加または減少）が検出可能である。ＦＲＥＴは、２つの部分の電子励起状態間の距離依存性相互作用であり、ここで、励起は、光子の放出を伴わずに、ドナー部分からアクセプター部分に移動し、ＦＲＥＴアクセプターからの放出を生じる。ＬＲＥＴは、ＦＲＥＴに類似であるが、エネルギー移動ドナーとして発光部分、例えばランタニドを用いる。ＢＲＥＴはＦＲＥＴに類似であるが、エネルギードナーとして発光または発光生成生体分子、例えばルシフェラーゼ、エクオリン、またはその誘導体を、そしてアクセプターとして蛍光部分、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの生体分子を使用し、こうして励起光源の必要性を排除する（Ｐｔｌｅｇｅｒ， Ｋ．およびＥｉｄｎｅ， Ｋ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ３（３）， １６５−１７４， ２００６に概説される）。
[00120]本発明のアッセイは、アクセプター放出、ドナー消光（ＲＥＴドナーからの放出減少）、および／またはドナーの蛍光寿命の改変を検出可能である。本発明のアッセイは、アクセプター放出の増加、アクセプター放出の減少、ドナー消光、ドナー消光の減少、ならびに／あるいはドナーの蛍光寿命の増加または減少を利用して、ＰＬＡ２Ｇ１６基質の切断を検出することも可能である。消光剤ともまた称される非蛍光アクセプターを使用し、そしてこれらには、ダブシルおよびＱＳＹ色素が含まれる。こうした分子は、ごく近接して位置する場合、励起蛍光標識のエネルギーを吸収し、そして可視光の放出を伴わずにそのエネルギーを消散させることも可能である。多くの適切なドナー／アクセプター対が、当該技術分野に知られる。例えば、Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ- Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， 第１０版（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を参照されたい。
[00121]ＦＲＥＴに基づくアッセイのいくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６基質の第一のアシル鎖は、付着した蛍光消光剤を有し、そして第二のアシル鎖は、付着したフルオロフォアを有する。フルオロフォアから消光剤への分子内ＦＲＥＴは、ＰＬＡ２が基質切断を仲介して、その際、少なくとも１つの脂肪酸部分が分子の残りから分離され、そして分子間距離が有効なエネルギー移動に必要な距離を超えるまで、蛍光を消光する。蛍光シグナルの増加は基質切断を示す。阻害剤の存在は、阻害剤の非存在下で観察されるであろうものに比較して、蛍光シグナルの減少を引き起こすであろう。いくつかの態様において、リン脂質ｓｎ−１−アシル鎖は、付着した蛍光消光剤（例えばダブシル、ｐ−メチルレッドとしても知られる）を含有し、そしてｓｎ−２アシル鎖は、付随するＢＯＤＩＰＹフルオロフォアを含有する。ダブシル基への分子内ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）は、ＰＬＡが仲介する基質切断が起こるまで、ＢＯＤＩＰＹ蛍光を消光する。例えば、ダブシルおよびＢＯＤＩＰＹ含有リン脂質ＤＢＰＡ、ＤＢＰＣ、ＤＢＰＥ、およびＤＢＰＧ（略語： ＤＢ：ダブシル−ＢＯＤＩＰＹ； ＰＧ：ホスファチジルグリセロール）の説明に関しては、Ｒｏｓｅ， ＴＭ ＆ Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ， ＧＤ， ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １（２）： ８３−８９， ２００６を参照されたい。
[00122]ＰＬＡ２活性を測定するために使用可能な別のアッセイ形式は、陽イオン性コンジュゲート化多価電解質をシリカ微小球体上に担持する、蛍光に基づくアッセイである（例えば、ヒト血清由来ＰＬＡ２に関するこうしたアッセイを記載する、Ｃｈｅｍｂｕｒｕ Ｓ，ら Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｅａｄ ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ａｃｔｉｖｉｔｙ， Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｂ．， １１２（４６）： １４４９２−９， ２００８を参照されたい。このアッセイを、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの活性を阻害する化合物を検出するために使用するよう修飾してもよい）。ポリマーでコーティングしたビーズを、陰イオン性リン脂質でさらにコーティング（ｏｖｅｒｃｏａｔ）して、ＰＬＡ２に関するセンサーとして働く「リポビーズ」を提供する。脂質は、ＰＬＡ２の基質、および外部電子移動消光剤、９，１０−アントラキノン−２，６−ジスルホン酸（ＡＱＳ）によるポリマー蛍光の消光を減弱させる剤としての二重の役割を果たす。ＡＱＳによるポリマー蛍光の消光は、ＰＬＡ２が脂質を消化するにつれて増加する。ビーズをコーティングする陰イオン性リン脂質中で少量のエネルギー移動消光剤置換基質を使用することによって、脂質はまた、それ自体、消光剤および基質として用いられることも可能である。この場合、ポリマーの蛍光は、脂質層が損なわれていないときには消光され；酵素が脂質を消化するにつれて、ポリマーの蛍光が回復する。マルチウェルプレート読み取り装置中で蛍光変化を監視することによって、および／またはフローサイトメトリーによって、ＰＬＡ２活性のセンシングを実行してもよい。
[00123]「細胞に基づくアッセイ」は、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを発現するかまたは含有する生存細胞を、試験化合物と接触させ、そしてＰＬＡ２Ｇ１６活性などの関心対象のパラメータを評価するアッセイである。典型的には、細胞を細胞培養中に維持し、そして試験化合物を培地に添加する。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドがＰＬＡ２Ｇ１６基質に対して作用する能力に対する、試験化合物の効果を、評価する。例えば、ＰＬＡ２Ｇ１６基質、例えば検出可能に標識された基質が培地に添加されるか、または標識前駆体から細胞によって合成されてもよい。遊離脂肪酸を検出することによって、または遊離脂肪酸から産生された下流産物を検出することによって、基質の切断を検出してもよい。例えば、シクロオキシゲナーゼによってアラキドン酸を修飾して、エイコサノイド（例えばプロスタグランジン、ロイコトリエン）を形成する。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６基質に作用しうる他のＰＬＡ２酵素を実質的に欠く細胞を使用してもよい。いくつかの態様において、既知のＰＬＡ２酵素の発現に関して、多様な細胞株をスクリーニングすることによって、こうした細胞を同定する。他の態様において、１またはそれより多いＰＬＡ２酵素をコードする遺伝子のターゲット化欠失またはこうした遺伝子内への挿入によって、あるいは細胞にこうした他のＰＬＡ２酵素（単数または複数）の発現を阻害するｓｈＲＮＡを発現させることによって、細胞株を生成する。他の態様において、こうした他のＰＬＡ２酵素（単数または複数）に特異的なｓｉＲＮＡと接触しており、該酵素の発現がノックアウトされている細胞において、アッセイを実行する。
[00124]ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの阻害剤として同定されている化合物を、細胞培養中または動物モデル中（「ｉｎ ｖｉｖｏ」）で試験して、ウイルス感染を阻害する能力を決定してもよい。いくつかの態様において、宿主細胞を、細胞の感染に適した条件下で、ウイルスおよびＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤と接触させる。試験化合物がウイルス感染を阻害する能力を評価する。化合物がウイルス感染を検出可能に減少させる場合、化合物は、抗ウイルス化合物と同定される。ウイルスは、例えば、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチド、またはＰＬＡ２Ｇ１６様ポリペプチドを生活環の中で利用する任意のウイルスであってもよい。
[00125]本発明の方法の態様において、非常に多様な細胞タイプが使用可能である。典型的には、細胞は、天然にまたは人の手による改変の結果として、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを発現しまたは含有するが、ＰＬＡ２Ｇ１６を発現しない細胞は、例えば対照目的のために有用でありうる。細胞は、関心対象のいかなる生物、例えば脊椎動物、例えば哺乳動物から生じてもよい。いくつかの態様において、細胞は霊長類細胞、例えばサル細胞またはヒト細胞である。細胞は、初代細胞、不死化細胞、癌細胞等であってもよい。しばしば、細胞は、実質的に遺伝的に同一である細胞で構成される細胞集団のメンバー、例えば細胞株である。細胞株は、単一の細胞に、または単一の個体から単離された多数の細胞に由来する可能性もある。細胞は、関心対象の組織または臓器から生じてもよいし、あるいは関心対象の特性を有してもよい。いくつかの態様において、細胞は上皮細胞、線維芽細胞、腎臓細胞、横紋肉腫または横紋筋肉腫、肺、または気管支細胞、前脂肪細胞、または脂肪細胞である。いくつかの態様において、細胞は、乳房、膀胱、骨、脳、気管支、子宮頸、結腸、子宮内膜、食道、喉頭、肝臓、肺、神経、筋肉、卵巣、膵臓、前立腺、胃、腎臓、皮膚、精巣、または甲状腺から生じる。多くの細胞株が当該技術分野に知られ、そのうちの多くがアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Ｃｏｒｉｅｌｌ細胞リポジトリー、欧州細胞培養コレクション、日本研究生物資源コレクションなどのリポジトリーから、または多様な商業的供給業者から得られうる。いくつかの態様において、前脂肪細胞は３Ｔ３−Ｌ１細胞である。いくつかの態様において、細胞はＣＯＳ細胞、例えばＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７細胞である。いくつかの態様において、細胞はＨｅＬａ細胞である。いくつかの態様において、細胞はＶｅｒｏ、ＲＤ、ＣＨＯ、ＨＥＫ−２９３、ＨＭＥＣ、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＨＥｐ−２、Ａ５４９、またはＢＥＡＳ−２Ｂ細胞である。いくつかの態様において、細胞は腫瘍細胞である。いくつかの態様において、腫瘍細胞は癌腫から生じる。いくつかの態様において、腫瘍細胞は肉腫から生じる。いくつかの態様において、腫瘍細胞は血液学的悪性疾患、例えばリンパ腫または白血病または骨髄腫から生じる。いくつかの態様において、腫瘍細胞は、乳房、膀胱、骨、脳、子宮頸、結腸、子宮内膜、食道、頭頸部、喉頭部、肝臓、肺（小細胞または非小細胞）、卵巣、膵臓、前立腺、胃、腎臓、皮膚（例えば基底細胞、黒色腫、扁平細胞）、精巣、または甲状腺癌から生じる。腫瘍細胞は、確立された腫瘍細胞株（例えばＮＣＩ−６０腫瘍細胞株の１つ）あるいは当該技術分野に知られるかまたは新規に樹立された別の腫瘍細胞株の細胞であってもよい。
[00126]いくつかの態様において、細胞は造血細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ＫＢＭ−７細胞またはその誘導体、例えばＨＡＰ１細胞である。いくつかの態様において、細胞は、該細胞において少なくとも１つの「再プログラミング因子」を発現させるか、あるいは少なくとも１つの「再プログラミング剤」（例えば内因性再プログラミング因子の発現を誘導するか、または再プログラミング因子の代わりになる剤）に該細胞を曝露することによって、部分的に再プログラミングされている、ＫＢＭ−７細胞または他の細胞である。再プログラミング細胞、例えば近半数体哺乳動物細胞は、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤および／または抗ウイルス化合物を同定する際の使用を容易にしうる。こうした再プログラミングは、ＫＢＭ−７細胞（通常は懸濁中で増殖する）を接着細胞、例えばＨＡＰ１細胞に変換することも可能である。当該技術分野に知られるように、転写因子、例えば４つの転写因子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ（ｃ−Ｍｙｃはなくてもよいが、ｃ−Ｍｙｃを省くと再プログラミング効率が減少する）、または４つの転写因子、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、およびＬｉｎ２８の組み合わせのレトロウイルス仲介性導入を通じて、マウスおよびヒト線維芽細胞ならびに多様な他の正常体細胞タイプをｉｎ ｖｉｔｒｏで再プログラミングして、多能性状態にすることが可能である（例えば、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ， Ａ．ら， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２５（１０）：１１７７−８１（２００７）； Ｙｕ， Ｊ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３１８（５８５８）：１９１７−２０（２００７）；およびＮａｋａｇａｗａ， Ｍ．ら， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２６（１）：１０１−６（２００８）を参照されたい。こうした転写因子はしばしば、「再プログラミング因子」と呼ばれる）。
[00127]いくつかの態様において、細胞は天然にＰＬＡ２Ｇ１６を発現する。いくつかの態様において、細胞は、改変の非存在下で発現される場合よりもより高いレベルでＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを発現するように改変されている。いくつかの態様において、細胞は、ＨＡＰ１細胞、ＨｅＬａ細胞、または関心対象のウイルスの宿主細胞として働くことが可能な他の細胞に存在する発現レベルの少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、またはおよそ１００％のレベルでＰＬＡ２Ｇ１６を発現する。発現レベルを、例えば「ハウスキーピング」遺伝子の発現に基づいて規準化してもよい。一般的に用いられるハウスキーピング遺伝子には、例えばベータ−アクチン、ＧＡＰＤＨ、ホスホグリセリン酸キナーゼ等が含まれる。細胞において、一過性にまたは安定にポリペプチドを発現する標準法が使用可能である。
[00128]いくつかの態様において、細胞は、ウイルス、例えばピコルナウイルスによる感染に天然に感受性であることが当該技術分野に知られるタイプのものである。例えば、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで、通常、ウイルスのターゲット細胞であるタイプ、または培養中にウイルスの宿主として当該技術分野に使用されてきている細胞株であってもよい。多様な異なるタイプの細胞において、化合物を試験してもよい。例えば、化合物は、最初にウイルス阻害に関する試験をスクリーニングするかまたは実行するために好適な特性を有する細胞において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤または抗ウイルス化合物として同定され、そして次いで、関心対象のウイルスの天然ターゲットである１またはそれより多い細胞において続いて試験されてもよい。
[00129]いくつかの態様において、本明細書記載の方法で用いる細胞は、試験化合物に対するその使用を促進する特性を有するように、遺伝子改変されているかまたは選択されている。例えば、細胞は、そうでなければ試験化合物を細胞外に輸送しうる１またはそれより多くの分子ポンプの発現が減少しているかまたは存在しないように、遺伝子改変されているかまたは選択されている。いくつかの態様において、細胞は、ウイルス感染の検出を促進するように改変されている。例えば、細胞は、ウイルスタンパク質（単数または複数）の存在下でのみ活性であるプロモーターまたは他の発現調節要素（単数または複数）が、蛍光タンパク質または酵素などの容易に検出可能なポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに機能可能であるように連結されている、レポーター遺伝子を含んでもよい。別の態様において、細胞は、ウイルスプロテアーゼの切断部位を含み、該タンパク質の切断が検出可能である、タンパク質を発現する。例えば、タンパク質は、プロテアーゼ切断部位を含有するドメインによって分離されるＦＲＥＴ対（例えばＦＲＥＴドナーおよびアクセプター対であるポリペプチド）を含有してもよい。プロテアーゼによる切断は、ＦＲＥＴ対メンバーの分離を生じ、ＦＲＥＴ破壊を生じ、これを検出し、そしてウイルス感染の指標として利用してもよい。別の態様において、ウイルスプロテアーゼの細胞浸透性基質を細胞内に導入する。候補抗ウイルス化合物、例えばＰＬＡ２Ｇ１６活性を阻害する化合物をこうした細胞において試験して、該化合物がウイルス感染を阻害することを確認してもよい。
[00130]細胞を、多様な期間、試験化合物（単数または複数）および／またはウイルスと接触させてもよい。特定の態様において、１時間〜２０日間の間、例えば１２〜４８時間の間、４８時間〜５日間の間、例えば約３日間、５日〜１０日間の間、あるいは任意の間の範囲または特定の値で、細胞を、試験化合物（単数または複数）および／またはウイルスと接触させる。いくつかの態様において、ウイルス複製および子孫ウイルス産生の１またはそれより多い周期が完了するのに十分な期間、細胞をウイルスと接触させる。いくつかの態様において、細胞を、少なくとも、光学顕微鏡下で検出可能なプラークが産生されるのに十分な期間、ウイルスと接触させる。培養期間のすべてまたは一部の間に、細胞を試験化合物と接触させてもよい。望ましい場合、ＰＬＡ２Ｇ１６活性またはウイルス感染を評価する前に、試験化合物を取り除いてもよい。いくつかの態様において、細胞を、試験化合物と接触させる前に、ウイルスと接触させる。他の態様において、細胞を、ウイルスと接触させる前に試験化合物と接触させる。ウイルスの絶対数、および感染多重度（ＭＯＩ）は多様でありうる。「感染多重度」は、感染ターゲット（例えば細胞）に対する感染性病原体（例えばウイルス）の比を指す。いくつかの態様において、１０−４〜１０２の間のＭＯＩを用いる。例えば、０．００１〜１０の間のＭＯＩ、例えば０．０１〜１の間のＭＯＩを用いてもよい。いくつかの態様において、１０％〜１００％の間の細胞において、病的変化を生じるのに適したウイルスの量を用いる。当業者は、ウイルス感染に対する影響を検出可能であるように、使用する適切な量のウイルスを決定することが可能であろう。ウイルスストックのある範囲の希釈を試験して、適切な量を同定してもよい。細胞をウイルスと接触させた後、適切な期間、細胞を培養中に維持する。典型的には、期間は、ウイルスが細胞に進入し、そしてウイルス感染の指標となる少なくとも１つの事象が起こるのに十分な期間であろう。こうした事象は、細胞、ならびに／あるいは少なくとも１つのウイルス遺伝子産物の合成または部分的合成に対するウイルス遺伝子産物（単数または複数）の検出可能な効果であってもよい。一般的に、期間は、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤の存在下に対して、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤の非存在下における、細胞に対するウイルスの効果の間の相違を検出するのに十分であろう。細胞に対するウイルスの検出可能な効果は、いくつかのまたは大部分の細胞ＲＮＡ（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）の合成の改変（例えば減少）、抗ウイルス反応の誘導（例えば２’５’−オリゴアデニル酸シンテターゼをコードする遺伝子などのインターフェロン・ターゲット遺伝子（単数または複数）の誘導）、クロマチン凝集、核ブレビング、膜小胞の増殖などの形態学的効果；細胞内内容物の漏出；細胞傷害性；ウイルス特異的酵素（例えばプロテアーゼ）による基質の切断等であってもよい。細胞傷害性は、例えば細胞溶解（細胞単層における透明な領域または「プラーク」として明らかでありうる）を検出することによって、あるいは細胞生存度および／または増殖に関する任意の多様なアッセイ、例えば細胞膜完全性アッセイ、細胞ＡＴＰに基づく生存度アッセイ、ミトコンドリア還元酵素活性アッセイ、ＢｒｄＵ、ＥｄＵ、またはＨ３−チミジン取り込みアッセイ、核酸色素、例えばＨｏｅｃｈｓｔ色素、ＤＡＰＩ、アクチノマイシンＤ、７−アミノアクチノマイシンＤもしくはヨウ化プロピジウムを用いたＤＮＡ内容物アッセイ、細胞代謝アッセイ、例えばＡｌａｍａｒＢｌｕｅ、ＭＴＴ、ＸＴＴ、およびＣｅｌｌＴｉｔｒｅ Ｇｌｏ等を用いることによって、評価可能である。プラークアッセイは、ウイルス力価を評価し、そしてウイルス感染性に対する化合物の効果を検出する、よく確立された手段である。いくつかの態様において、プラークアッセイは、標準ウイルスストックを多数の同一細胞培養、例えばマルチウェルプレートのウェル中で増殖させたものに接種する工程を含む。凝固剤、例えばアガロースを添加して、培地を通じたウイルスの拡散を最小限にしてもよい。ストックのウイルス力価は、通常、あらかじめ決定されており、そして各ウェルにおいて、計数可能な数のプラークを生じるように選択されている。異なる濃度の試験化合物を一連のウェル内に導入する。化合物を含有しない対照ウェルと比較して、ウイルスプラークの数の５０％の減少を生じる化合物の最低濃度として定義される、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）として、化合物の効果を表すことも可能である。望ましい場合、ＩＣ９０を類似の方式で評価してもよい。ウイルスの効果を有意に減少させる化合物は、ウイルスによる感染の阻害剤である。例えば、所定の量のウイルスによって生じるウイルスプラークの数および／またはサイズを有意に減少させる化合物は、ウイルス感染の阻害剤である。場合によって、ＩＣ５０またはＩＣ９０を決定する。いくつかの態様において、望ましいＩＣ５０またはＩＣ９０を持つ、１またはそれより多い化合物を選択する。いくつかの態様において、ＩＣ５０および／またはＩＣ９０は、１００ｍｇ／ｍｌより大きくなく、例えば１０ｍｇ／ｍｌより大きくなく、例えば１．０ｍｇ／ｍｌより大きくなく、例えば１００μｇ／ｍｌより大きくなく、例えば１０μｇ／ｍｌより大きくなく、例えば５μｇ／ｍｌより大きくなく、または１μｇ／ｍｌより大きくない。いくつかの態様において、ＩＣ５０および／またはＩＣ９０は、５００μＭ未満であるかまたはそれに等しい。いくつかの態様において、ＩＣ５０および／またはＩＣ９０は、１００μＭ未満であるかまたはそれに等しい。いくつかの態様において、ＩＣ５０および／またはＩＣ９０は、１０μＭ未満であるかまたはそれに等しい。いくつかの態様において、ＩＣ５０および／またはＩＣ９０は、ナノモル範囲、すなわち１μＭ未満であるかまたはそれに等しい。
[00131]いくつかの態様において、ハイスループットスクリーン（ＨＴＳ）を実行する。ハイスループットスクリーンは、細胞不含アッセイまたは細胞に基づくアッセイを利用してもよい。ハイスループットスクリーンは、しばしば、高い効率で、例えば平行して、多数の化合物を試験することを伴う。例えば、短時間に、例えば数時間から数日間で、何万または何十万の化合物をルーチンにスクリーニングすることも可能である。しばしば、こうしたスクリーニングは、例えば９６、３８４、１５３６、３４５６、またはそれより多いウェル（ときに、マイクロウェルまたはマイクロタイタープレートまたはディッシュと称される）を含有するマルチウェルプレート、あるいは支持体中に多数の物理的に分離された腔が存在する他の容器中で行われる。ハイスループットスクリーンは、例えば液体取り扱い、画像化、データ獲得およびプロセシング等のため、自動化の使用を伴ってもよい。本発明をいかなる点でも限定することなく、本発明のＨＴＳの態様において適用可能な特定の一般的な原理および技術が、Ｍａｃａｒｒｏｎ Ｒ ＆ Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ ＲＰ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｓｓａｙｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， ５６５：１−３２， ２００９および／またはＡｎ ＷＦ ＆ Ｔｏｌｌｉｄａｙ ＮＪ．， Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ： ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８６：１−１２， ２００９、および／またはこれらのいずれかにおける参考文献に記載される。例示的な方法はまた、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｐ． ＪａｎｚｅｎによるＨｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（２００２）およびＪｏｒｇ ＨｕｅｓｅｒによるＨｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（２００６）にも開示される。
[00132]いくつかの態様において、最初のスクリーンを実行して、ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドに結合し、そして／またはこれを阻害する化合物を同定し、そして次いで、こうした化合物がウイルス感染を阻害する能力を評価する。いくつかの態様において、試験化合物を細胞に基づくアッセイにおいてまず試験して、ウイルス感染を阻害する化合物（単数または複数）を同定し、そして次いで、これらがＰＬＡ２Ｇ１６を阻害するかどうか決定するために試験する。
[00133]本発明は、本発明の方法いずれか、例えば候補抗ウイルス化合物を同定する方法いずれかを実行するのに適した構成要素を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、アッセイ系は、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤を同定するのに適した構成要素を含む。いくつかの態様において、アッセイ系は、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤を同定するのに適した構成要素を含む。いくつかの態様において、組成物は、候補抗ウイルス化合物を検証する本発明の方法いずれかを実行するのに適した構成要素を含む。いくつかの態様において、組成物は、候補抗ウイルス化合物が、培養細胞においてまたはｉｎ ｖｉｖｏで、ウイルス感染を阻害することを確認するのに適した構成要素を含む。１つの側面において、本発明の組成物は、（ｉ）ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを発現する単離細胞；（ｉｉ）細胞を感染させることが可能なウイルス；および（ｉｉｉ）試験化合物を含む。いくつかの態様において、ウイルスはピコルナウイルス、例えば病原性ピコルナウイルスである。ウイルスは、典型的には、細胞によるウイルス感染を検出するのに適した量で組成物中に存在する。こうした量は、典型的には、ウイルスに感染した個体がいる環境に培養細胞がたまたま曝露された際に、偶然に起こりうるよりも多い。いくつかの態様において、細胞に対するウイルス粒子（例えば感染性ウイルス粒子）の比は、少なくとも１：１０６、少なくとも１：１０５、例えば少なくとも１：１０４、少なくとも１：１０３、少なくとも１：１０２、少なくとも１：１０、または少なくとも１：１である。いくつかの態様において、細胞よりも多くのウイルス粒子がある（例えば感染性ウイルス粒子）。試験化合物は、例えば、上に論じる化合物のいずれであることも可能である。いくつかの態様において、試験化合物は、ホスホリパーゼＡ２阻害剤、例えばＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤である。いくつかの態様において、試験化合物は小分子である。いくつかの態様において、試験化合物は、少なくとも１つの細胞不含アッセイまたは細胞に基づくアッセイにおいて、ＰＬＡ２Ｇ１６に結合し、そして／またはこれを阻害することが決定されてきている。
[00134]細胞不含アッセイおよび／または細胞に基づくアッセイにおいて同定された化合物を被験体（例えば非ヒト脊椎動物）において試験して、ｉｎ ｖｉｖｏでのウイルス感染を阻害する能力を評価してもよい。ウイルス感染のための動物モデルが当該技術分野に知られる。動物は、例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ等であってもよい。１つの態様において、動物モデルは、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）誘導性心筋症のネズミモデルである。例えば、Ｓｚａｌａｙ Ｇ， Ｏｎｇｏｉｎｇ ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓ， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ， １６８（５）： １５４２−５２， ２００６、および該文献中の参考文献を参照されたい。１つの態様において、動物モデルは、ＥＶ７１感染のためのマウスモデルである。例えば、マウスにＥＶ７１を経口接種する動物モデルを記載する、Ｗａｎｇ， Ｙ． Ｆ．，ら， Ａ ｍｏｕｓｅ−ａｄａｐｔｅｄ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１ ｓｔｒａｉｎ ｃａｕｓｅｓ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｏｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７８：７９１６−７９２４， ２００４を参照されたい。疾患の徴候および生存に関して、マウスを毎日監視してもよい。別の態様において、弱毒化メンゴウイルスを、ライノウイルス感染のためのげっ歯類モデルにおいて用いる。例えば、Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ＬＡ， Ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｉｒｗａｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ． Ｖｉｒｏｌ Ｊ．， ６： １２２， ２００９を参照されたい。感染後に組織または体液を収集して、ウイルス力価を決定し、そして／またはウイルス感染の他の徴候を評価してもよい。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＮＡに関して）またはタンパク質に関する免疫学的方法などの標準法を用いて、ウイルスＲＮＡまたはタンパク質を検出してもよい。例えば、Ｌｉ， Ｚ． Ｈ．，ら， Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍｉｃｅ ｂｙ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９７：８５４−８５７， ２００８を参照されたい。
[00135]本発明はさらに、通常は感受性であるウイルスを接種されているかまたはこうしたウイルスに曝露されているか、あるいはウイルス感染に罹患しており、そしてＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤が投与されている、非ヒト被験体、例えば脊椎動物を提供する。ウイルスの「接種」は、ウイルスが被験体の体内に導入されていることを意味する。曝露は、被験体に接種するか、または被験体がウイルスに出会う可能性が増加するように、ウイルスおよび被験体をある程度近接させておくことを伴ってもよい。接種はいかなる適切な経路によってもよい。接種または曝露は、典型的には、抗ウイルス化合物の非存在下で、その種の集団の少なくとも２５％で、明らかな疾患を生じるのに十分な量のウイルスを伴うであろう。ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、例えば、上に論じられるかまたは本発明にしたがって同定される化合物のいずれであってもよい。いくつかの態様において、試験化合物は小分子である。いくつかの態様において、試験化合物は、少なくとも１つの細胞不含アッセイまたは細胞に基づくアッセイにおいて、ＰＬＡ２Ｇ１６に結合し、そして／またはこれを阻害することが決定されてきている。非ヒト被験体を監視して、例えば抗ウイルス剤としての化合物の安全性、許容性、および／または有効性を評価してもよい。ウイルスに感染した被験体におけるＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤の効果を評価することは、本発明の側面である。
[00136]いくつかの態様において、本発明は、ＰＬＡ２Ｇ１６遺伝子座内に挿入を有するか、または別の方式でＰＬＡ２Ｇ１６発現を欠く、近半数体細胞を提供する。近半数体細胞は、体細胞が通常、二倍体である種、例えば哺乳動物のものである。いくつかの態様において、本発明は、触媒的に不活性である突然変異体ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを発現する近半数体細胞を提供する、ここで、該近半数体突然変異細胞株は、場合によって内因性ＰＬＡ２Ｇ１６遺伝子中に挿入を有する。いくつかの態様において、本発明は、タグ化機能ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを発現する近半数体細胞を提供する、ここで、該近半数体突然変異細胞株は、場合によって内因性ＰＬＡ２Ｇ１６遺伝子中に挿入を有する。近半数体哺乳動物細胞は、本明細書において、５より多い染色体が２またはそれより多いコピー数で存在しない哺乳動物細胞を指す。いくつかの態様において、近半数体哺乳動物細胞は、２またはそれより多いコピー数で存在する１、２、３、または４より多い染色体を持たない。「近半数体」細胞は、半数体細胞を含むと理解されなければならない。機能ＰＬＡ２Ｇ１６の発現を欠く細胞由来の細胞株、例えばＰＬＡ２Ｇ１６遺伝子内に挿入を有する細胞で構成される細胞株をさらに提供する。いくつかの態様において、細胞株は、触媒的に不活性である突然変異体ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを発現し、該ポリペプチドはいくつかの態様においてタグ化されている。いくつかの態様において、近半数体細胞株は、最終的に、培養中に染色体を獲得し、したがって、もはや近半数体でなくなる。いくつかの態様において、細胞株は近二倍体または二倍体になりうる。
[00137]本発明はさらに、本発明の組成物のいずれかの１またはそれより多い構成要素および／または本発明の方法のいずれかを実行するのに適した構成要素を含む、キットを提供する。構成要素は、例えば個々の容器中に、個々にパッケージングされてもよく、容器がさらに大きな容器内で提供されてもよい。キットは、例えば抗ウイルス化合物を同定するかまたは性質決定するために、方法いずれかを実行するため、内容物を使用するための使用説明書を含有してもよい。
[00138]いくつかの態様において、計算的アプローチを使用して、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物を同定し、そして／または性質決定する。例えば、核磁気共鳴、相同性モデリング、および／またはＸ線結晶学を用いて、例えばＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの三次元構造を決定するかまたは近似の構造を生成することも可能である。場合によって、リガンド（例えば阻害剤）が結合したポリペプチドの構造を決定する。いくつかの態様において、候補ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤の最初の同定において、計算的アプローチを用いる（時に「バーチャルスクリーニング」と称される）。ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの、例えば化合物にアクセス可能な領域（例えば「ポケット」）に結合する能力に関して、候補化合物の構造をスクリーニングしてもよい。領域は、既知のまたは潜在的な活性部位、あるいは化合物にアクセス可能な任意の領域、例えば表面上の凹面領域または間隙であってもよい。多様なドッキングおよびファルマコフォアに基づくアルゴリズムが開発されてきており、そしてこうしたアルゴリズムを実装するコンピュータプログラムが利用可能である。一般的に用いられるプログラムには、Ｇｏｌｄ、Ｄｏｃｋ、Ｇｌｉｄｅ、ＦｌｅｘＸ、Ｆｒｅｄ、およびＬｉｇａｎｄＦｉｔ（最新のリリースを含む）が含まれる。例えば、本明細書に援用される、Ｇｈｏｓｈ， Ｓ．，ら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １０（３）： １９４−２−２， ２００６； Ｍｃｌｎｎｅｓ Ｃ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ； １１（５）： ４９４−５０２， ２００７、ならびに前述の論文のいずれかの中の参考文献を参照されたい。いくつかの態様において、バーチャルスクリーニングアルゴリズムは、２つの主な段階：検索する（「ドッキングする」とも呼ばれる）およびスコア化する段階を含む。最初の段階では、プログラムは、自動的に２つの分子（試験化合物およびターゲット分子）の候補複合体のセットを生成し、そして候補複合体の相互作用のエネルギーを決定する。スコア化する段階は、候補複合体にスコアを割り当て、そして少なくとも部分的にエネルギーに基づいて、好ましい相互作用を示す構造を選択する。バーチャルスクリーニングを実行するため、このプロセスを、多数の試験化合物で反復して、ターゲットと最も好ましい相互作用を示すものを同定する。いくつかの態様において、活性部位またはありうる活性部位内の小分子の低エネルギー結合モードを同定する。変動には、剛性または柔軟性ドッキングアルゴリズムの使用、および／または潜在的な水分子の結合の包含が含まれてもよい。
[00139]多くの小分子構造が入手可能であり、そしてバーチャルスクリーニングに使用可能である。例えば、ＺＩＮＣは、バーチャルスクリーニングに使用可能な、商業的に入手可能な化合物の何百万もの構造を含有する、公的に利用可能なデータベースである（ｈｔｔｐ：／／ｚｉｎｃ．ｄｏｃｋｉｎｇ．ｏｒｇ／； Ｓｈｏｉｃｈｅｔ， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｆ． Ｍｏｄｅｌ， ４５（１）： １７７−８２， ２００５）。約２５０，０００の小分子構造を含有するデータベースが、米国癌研究所ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／１２９．４３．２７．１４０／ｎｃｉｄｂ２／）上で入手可能である。いくつかの態様において、多数の小分子、例えば５０，０００；１００，０００；２５０，０００；５００，０００または１００万、２００万、５００万、１０００万、またはそれより多くをスクリーニングする。化合物をスコア化し、そして場合によって、ターゲットに結合する潜在能力によってランク付けしてもよい。バーチャルスクリーンで同定された化合物を、細胞不含アッセイまたは細胞に基づくアッセイまたは動物モデルにおいて試験して、ＰＬＡ２Ｇ１６活性および／またはウイルス感染を阻害する能力を確認する。
[00140]計算的アプローチを用いて、実際のまたはバーチャルスクリーンにおいて同定された化合物の、１またはそれより多い物理化学的、薬物動態学的および／または薬力学的特性を予測してもよい。例えば、吸収、分布、代謝、および排出（ＡＤＭＥ）パラメータを予測してもよい。こうした情報を用いて、例えばさらなる試験または修飾のため、ヒットを選択してもよい。例えば、「薬剤様」分子に典型的な特性を有する小分子を選択し、そして／または１またはそれより多い望ましくない特性を有する小分子を回避してもよい。１つの態様において、リピンスキーの「ルールオブファイブ」基準の少なくともいくつかを満たす化合物を選択する。
[00141]１つの側面において、本発明は、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害する化合物を同定するスクリーンの結果が保存されているコンピュータ読み取り可能媒体を提供する。結果は、データベース中に保存され、そしてこれには、スクリーニングプロトコル、スクリーンからまたはさらなるスクリーンから得た結果、ならびに／あるいはスクリーン中で同定した化合物に対して実行した試験（例えばウイルス感染の動物モデルにおける試験）のプロトコルまたはそこから得た結果が含まれてもよい。
[00142]上述のものなどの実際のまたはバーチャルスクリーンにおいて同定された最初の化合物（「ヒット」）に基づいて、ＰＬＡ２Ｇ１６を阻害するさらなる化合物を同定するかまたは設計してもよい。こうしたさらなる化合物およびこれらを設計するかまたは合成する方法は、本発明の側面である。いくつかの態様において、ヒット化合物の構造を調べてファルマコフォアを同定し、これを用いてさらなる化合物（「誘導体」）を設計することも可能である。
[00143]さらなる化合物は、例えば、最初のヒットと比較した際、１またはそれより多い改善された（すなわちより望ましい）薬物動態学的および／または薬力学的特性を有することも可能であるし、あるいは単に異なる構造を有することも可能である。例えば、化合物は、関心対象の分子ターゲット（例えばＰＬＡ２Ｇ１６）に対するより高いアフィニティ、非ターゲット分子に対するより低いアフィニティ、より高い溶解度（例えば増加した水溶性）、増加した安定性、増加した生物学的利用能、および／または減少した副作用（単数または複数）等を有してもよい。ヒット構造の経験的な修飾（例えば関連した構造を持つ化合物の合成、および細胞不含アッセイまたは細胞に基づくアッセイ、あるいは非ヒト動物におけるそれらの試験）を通じて、最適化を達成してもよい。こうした修飾は、医薬品化学の確立された原理を利用して、１またはそれより多い特性を予測可能に改変することも可能である。
[00144]いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤を修飾するか、あるいは細胞取り込み、安定性（例えば血清中の）を増進させ、半減期を増加させ、毒性もしくは免疫原性を減少させ、または別の方式で化合物に所望の特性を与える部分を取り込ませる。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含む。ＰＴＤまたは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、すべてではないとしても多くの哺乳動物細胞の血漿膜を横断可能なペプチドまたはペプトイドである。ＰＴＤは、該分子が付着しているかまたは存在している部分の取り込みを増進可能である。しばしば、こうしたペプチドにはアルギニンが豊富である。例えば、１型および２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）のＴａｔタンパク質のＰＴＤは、広く研究されてきており、そして哺乳動物細胞内にカーゴを輸送するのに用いられている。例えば、本明細書に援用される、Ｆｏｎｓｅｃａ ＳＢ，ら， Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．， ６１（１１）：９５３−６４， ２００９； Ｈｅｉｔｚ Ｆ，ら， Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １５７（２）： １９５−２０６， ２００９、および前述のいずれかにおける参考文献を参照されたい。いくつかの態様において、ＰＴＤは、小細胞、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、またはＰＬＡ２Ｇ１６を阻害するポリペプチドの細胞取り込みを増進するために用いられる。
[00145]いくつかの態様において、化合物は、およそ１ｍＭ、５００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、１０μＭ、５μＭ、または１μＭに等しいかまたはそれ未満の濃度で、細胞不含アッセイまたは細胞に基づくアッセイで用いた際、少なくとも５０％のＰＬＡ２Ｇ１６レベルまたは触媒活性の減少を引き起こす。いくつかの態様において、化合物は、より低い濃度、例えばおよそ５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、または１０ｎＭに等しいかまたはそれ未満の濃度で、細胞不含アッセイまたは細胞に基づくアッセイで用いた際、少なくとも５０％のＰＬＡ２Ｇ１６活性の減少（すなわち化合物の非存在下で期待されるであろう活性の５０％またはそれ未満への減少）を引き起こす。いくつかの態様において、化合物は、０．１〜１０ｎＭの間の濃度で用いた際、少なくとも５０％のＰＬＡ２Ｇ１６活性の減少を引き起こす。ＰＬＡ２Ｇ１６レベルまたは活性を評価するのに適した多様な方法が上述される。いくつかの態様において、化合物は、およそ１ｍＭ、５００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、１０μＭ、５μＭ、または１μＭに等しいかまたはそれ未満の濃度で、適切な細胞培養系で用いた際、少なくとも５０％の産生または子孫ウイルスの減少（すなわち化合物の非存在下で期待されるであろう子孫ウイルスの数の５０％またはそれ未満への減少）あるいは少なくとも５０％の細胞変性効果の減少を引き起こす。いくつかの態様において、化合物は、より低い濃度、例えばおよそ５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、または１０ｎＭに等しいかまたはそれ未満の濃度で、適切な細胞培養系で用いた際、少なくとも５０％の産生または子孫ウイルスまたは細胞変性効果の減少を引き起こす。いくつかの態様において、化合物は、０．１〜１０ｎＭの間の濃度で用いた際、適切な細胞培養系で用いた際に、少なくとも５０％の産生または子孫ウイルスの減少を引き起こす。ウイルス産生または細胞変性効果を評価するのに適した多様な方法が上述される。他の側面において、化合物は、ＰＬＡ２Ｇ１６レベル、触媒活性、ならびに／あるいは子孫ウイルス産生または細胞変性効果の少なくとも２５％、または少なくとも７５％、または少なくとも９０％の減少を引き起こす。
[00146]一般的に、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤およびそれを用いる方法は、阻害剤を同定するかまたは生成する方法、あるいはＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤を同定するかまたは生成するために用いられた構成要素に依存せず、そして限定されないことが注目される。例えば、本発明の特定の態様において、ヒトＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを用い、そして／またはヒト細胞を用いて同定されたＰＬＡ２１６阻害剤を用いて、ヒトを治療する。本発明の特定の態様において、ヒトＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを用い、そして／またはヒト細胞を用いて同定されたＰＬＡ２１６阻害剤を用いて、非ヒト動物、例えば非ヒト脊椎動物を治療する。いくつかの態様において、非ヒト動物のＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを用い、そして／または非ヒト動物由来の細胞を用いて同定されたＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤を用いて、その種の非ヒト動物、異なる非ヒト動物種、および／またはヒトを治療する。本発明の多様な態様において、ヒト細胞を感染させるウイルスによる感染を阻害するＰＬＡ２１６阻害剤を用いて、ヒト、非ヒト動物、または両方を治療することも可能である。例えば、特定の態様において、ヒト細胞を感染させるウイルスによる感染を阻害するＰＬＡ２１６阻害剤を用いて、主にまたは唯一、非ヒト動物の細胞しか感染させないウイルスによる感染を阻害する。
[00147]ＶＩＩ． 薬学的組成物、治療法、および他の適用
[00148]本明細書記載の方法にしたがって同定され、選択され、または設計された化合物は、多様な使用を有しうる。いくつかの態様において、化合物は、療法目的のため、例えばウイルス感染の治療が必要な被験体のための療法剤として、有用である。いくつかの態様において、被験体は、該生物の体内にまたは体の上に、過剰な数のウイルス集団が存在する際、ならびに／あるいはウイルス集団（単数または複数）の存在の影響が生物の細胞または他の組織に損傷を与えている際、ウイルス感染に「罹患している」。被験体は、例えばウイルス感染に罹患しているか、あるいは（ｉ）一般集団の大部分のメンバー；および／または（ｉｉ）その被験体が典型的に経験するリスクレベルと比較した際に、ウイルス感染を発展させるリスクが増加している場合、ウイルス感染の「治療の必要がある」可能性もある。
[00149]本発明は、ヒトおよび／または動物被験体における非常に多様なウイルス感染、例えば本明細書に論じるウイルスいずれかによる感染の治療を意図する。いくつかの態様において、ウイルスは、ピコルナウイルス、例えばカルジオウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス（例えばコクサッキーウイルス、ライノウイルス、またはエコーウイルス）、またはヘパトウイルス、またはライノウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスは、エンテロウイルス属内で、系統発生的にクラスターを形成する。いくつかの態様において、ピコルナウイルスは：ヒト・エンテロウイルスＡ、ヒト・エンテロウイルスＢ、ヒト・エンテロウイルスＣ、ヒト・エンテロウイルスＤ、サル・エンテロウイルスＡ、ウシ・エンテロウイルス、ブタ・エンテロウイルスＢ、ヒト・ライノウイルスＡ、ヒト・ライノウイルスＢおよびヒト・ライノウイルスＣからなる群より選択される種を伴って分類される。いくつかの態様において、ピコルナウイルスは：ヒト・エンテロウイルスＡ、ヒト・エンテロウイルスＢ、ヒト・エンテロウイルスＣ、ヒト・エンテロウイルスＤ、ヒト・ライノウイルスＡ、ヒト・ライノウイルスＢおよびヒト・ライノウイルスＣからなる群より選択される種を伴って分類される。いくつかの態様において、ウイルスは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）または英国国立健康保護局カルチャーコレクションの国立病原性ウイルスコレクション（ＮＣＰＶ）に寄託されており、そして場合によって配布が利用可能である血清型である。
[00150]本発明は、例えばピコルナウイルスによる、ウイルス感染から生じる疾患および医学的状態を治療する方法を提供する。例示的な疾患および状態には、例えば喘息悪化、細気管支炎、大腸炎、風邪、ＣＯＰＤ悪化、脳炎、脳脊髄炎、腸炎、口蹄疫、手足口病、胃腸炎、ヘルパンギナ、肝炎、髄膜炎、髄膜脳炎、心筋炎、膵炎、ポリオ、および肺炎が含まれる。いくつかの側面において、本発明は、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤のｅｘ ｖｉｖｏ使用を意図する。例えば、移植（例えば異種移植または同じ種の個体内への移植）で使用することが意図される臓器、組織、または細胞をｅｘ ｖｉｖｏでＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤と接触させて、例えばレシピエントへのウイルス感染伝染の可能性を減少させることも可能である。別の態様において、臓器、組織、または細胞移植片のレシピエントをＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤で治療して、例えば移植された細胞、組織、または臓器（単数または複数）からのウイルス感染の罹患可能性を減少させることも可能である。こうした治療を、移植処置の前、処置中、または処置後に開始してもよい。
[00151]いくつかの態様において、ウイルスは、有効なワクチンが存在しないか、商業的に使用されていないか、または広く使用されていないものである。例えば、コクサッキーウイルスＢ３は、ヒト集団に広く蔓延し、そして心筋炎または膵炎などの深刻な疾患を引き起こす。コクサッキーウイルスＢ４は、無菌性髄膜炎、髄膜脳炎、心筋炎、肝炎、膵炎、胃腸炎、壊死性腸炎、および肺炎などの広い範囲の疾患を引き起こしうる。しかし、これらのウイルスの臨床的重要性にもかかわらず、商業的に利用可能な、そして臨床的に適用可能な予防ワクチンは存在しない。エンテロウイルス７１は、ワクチンが利用可能でない、非常に重大な医学的重要性を持つ別のウイルスである。
[00152]いくつかの態様において、ウイルスは、有効なワクチンが商業的に使用され、そして／または利用可能であるものである。限定なしに、本発明の方法は、ワクチン接種されていないか、またはそうでなければ免疫でない被験体を治療し、ワクチンが十分な免疫を提供可能でないウイルス株に感染した被験体等を治療することに利用法を見出しうる。いくつかの態様において、個体は、ワクチン株、例えば弱毒化株に感染する。いくつかの態様において、本発明は、ポリオ大流行の環境において、ポリオウイルスに曝露されたかまたは感染した可能性もあるヒト被験体、例えばワクチン接種されていないまたはそうでなければ免疫でない個体（例えば免疫無防備状態の個体）、ポリオが根絶されていない地域に、またはそうした地域から旅行する個体等を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、例えば口蹄疫大流行の環境において、口蹄疫ウイルスに関する治療が必要な家畜を治療することを意図する。
[00153]いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤、例えば本発明にしたがって同定されたＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、ウイルス感染の治療に加えて、またはその代わりに、１またはそれより多い療法的使用を有しうる。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤は、過剰な体脂肪、過剰な体脂肪に関連する疾患、または代謝障害のための治療が必要な被験体のための療法剤として有用である。過剰な体脂肪は、被験体にとって望ましい量より多い体脂肪を有する状態、あるいは健全な医学的判断内で、疾患に寄与するか、または疾患リスク増加を生じると見なされる体脂肪の量を有する状態であることも可能である。いくつかの態様において、化合物は、アテローム性動脈硬化症または血管疾患（例えば心臓血管または脳血管疾患）を治療するのに有用である。いくつかの態様において、化合物は、例えば３０より大きいかまたは３０に等しい肥満度指数（ＢＭＩ）を有する被験体において、肥満を治療するのに有用である。いくつかの態様において、化合物は、代謝障害、例えば糖尿病（例えば真性糖尿病とも呼ばれるＩＩ型糖尿病）、耐糖能障害、インスリン耐性、代謝症候群、レプチン不全、または高トリグリセリド血症を治療するのに有用である。
[00154]本発明の治療法には、ウイルス感染に罹患したかまたはそのリスクがある被験体を同定する工程、感染を引き起こすと推測されるウイルスを同定する工程、少なくとも部分的に、ウイルスの同一性または推測される同一性、および／または感染の位置または性質に基づいて、療法剤または剤の組み合わせを選択する工程、ならびに／あるいは選択した剤を被験体に処方するか、提供するか、または投与する工程が含まれることも可能である。本発明の特定の態様において、該方法には、被験体が、ウイルス、例えばピコルナウイルスによる感染に罹患しているかまたはそのリスクがある有意な可能性（例えば少なくとも５％）を有することを決定する工程が含まれる。被験体は、多様な状況のいずれにおいて「感染のリスクがある」可能性もある。「リスクがある」は、その被験体の１またはそれより多い状況、状態、または特質の非存在下で、こうした被験体が有するであろうリスクに比較して、ならびに／あるいは平均的な健康な集団メンバーが有するであろうリスクに比較して、ならびに／あるいは被験体が以前有したリスクに比較して、増加したリスクがあることを意味する。集団は、典型的には、同じ種の被験体群である。被験体を「リスクに」さらす状態の例には、限定されるわけではないが、免疫不全（例えば遺伝的免疫不全）；正常な微生物フロラを減少させるかまたは排除する可能性もある抗生物質剤（単数または複数）での以前の治療；免疫系を抑制する剤（例えば癌化学療法、免疫抑制剤）（単数または複数）での治療；免疫系を損傷する剤への曝露；慢性疾患、例えば糖尿病、ＣＯＰＤ、または嚢胞性線維症；同時に存在するまたは先行する細菌または真菌感染；手術または他の外傷；乳児期または高齢；病原性ウイルス等への曝露を伴う職業、事象、または生活状態、あるいは被験体のヘルスケア提供者の判断および技術内で、被験体が増加したリスクであるとする、任意の他の状態が含まれる。いくつかの態様において、被験体は、病原性ウイルスに最近曝露されている、例えば被験体がウイルス感染に罹患したことが知られているかまたは罹患したと考えられる個体と接触しているならば、ウイルス感染を発展させるリスクが増加している可能性もある（例えば先行する１、２、３、または４週間以内、あるいはウイルスの「インキュベーション期間」内の曝露）。１つの態様において、インキュベーション期間は、症候性感染症を発展させる個体の１０％〜９０％が発展させるであろう、ウイルスへの曝露後の期間を指す。
[00155]任意の多様な方法を使用して、本発明にしたがった治療が必要な被験体（例えばウイルス感染のリスクがあるかまたはウイルス感染に罹患している被験体）を同定することも可能である。例えば、こうした方法には、少なくとも部分的に、症状、病歴（入手可能な場合）、身体検査、臨床検査、画像化研究、免疫診断アッセイ、核酸に基づく診断、ならびに／あるいは試料、例えば血液、尿、痰、唾液、鼻汁、便、滑液、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、膿汁、あるいは体液、細胞、または組織の任意の試料からの潜在的に原因性であるウイルスの単離および培養に基づく臨床診断が含まれる。いくつかの態様において、診断は、少なくとも部分的に血清学（例えばウイルスと特異的に反応する抗体の検出）に基づくことも可能である。いくつかの態様において、診断は、少なくとも部分的に、被験体からのウイルスおよび／またはウイルスゲノムまたは遺伝子産物の単離に基づくことも可能である。いくつかの態様において、試料をウイルスゲノムまたは遺伝子産物に関して試験する。例えば、ＰＣＲまたは他の核酸増幅法を用いてウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを増幅することも可能であり、こうしたＤＮＡまたはＲＮＡを、ハイブリダイゼーションに基づく方法などの多様な方法で検出することも可能である。多重化ＰＣＲまたは他の増幅法が有用である。シグナル増幅アッセイには、分枝鎖ＤＮＡアッセイおよびハイブリッド捕捉アッセイが含まれる。転写に基づく増幅および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）を使用してもよい。マイクロアレイ、例えばオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いてもよい。マイクロアレイは固相または懸濁アレイ（例えばＬｕｍｉｎｅｘプラットホームのように微小球体に基づくアプローチ）であってもよい。免疫学的方法（例えばＥＬＩＳＡまたは粒子凝集）を用いて、ウイルス抗原、例えばポリペプチドを検出してもよい。ウイルス構成要素に特異的に結合する標識化合物を使用してもよい。いくつかの態様において、ウイルスを細胞培養中で増殖させ、そして同定する。同定は、形態、培養細胞に対する影響、ならびに／あるいはウイルス特異的核酸および／またはポリペプチドの検出に基づいてもよい。いくつかの態様において、特定のウイルスは同定されず、一方、他の態様において、特定のウイルスが同定される。
[00156]本明細書に開示され、そして本明細書記載の方法を用いて同定され、または検証された化合物および組成物を、経口、鼻内、皮下、筋内、静脈内、動脈内、非経口、腹腔内、クモ膜下腔内、気道内、眼、舌下、膣、直腸、皮膚、または例えばエアロゾルとして、吸入によるなどの任意の適切な手段によって、投与してしてもよい。治療しようとする状態のタイプ（例えばウイルス感染）に応じて、本発明の化合物を、例えば吸入させるか、摂取させるか、または全身経路によって投与することも可能である。したがって、多様な投与様式または経路が利用可能である。選択する特定の様式は、もちろん、選択する特定の化合物、治療される特定の状態、および療法効果のために必要な投薬量に応じるであろう。本発明の方法は、一般的に言って、医学的にまたは獣医学的に許容されうる任意の投与様式、すなわち臨床的に許容されえない（例えば医学的または獣医学的に許容されえない）副作用を引き起こすことなく、有効性の許容されうるレベルを生じる任意の様式を用いて実施可能である。用語「非経口」には、静脈内、筋内、腹腔内、皮下、骨内、および胸骨内注射、または注入技術が含まれる。いくつかの態様において、投与経路は非経口または経口である。場合によって、投与の経路または位置は、少なくとも部分的に、特定のウイルス感染および／または感染組織の位置に基づいて選択される。例えば、化合物を感染組織に、またはその近傍に送達してもよい。いくつかの態様において、吸入医薬品を用いる。こうした投与は、例えば呼吸器感染の被験体において、肺への直接送達を可能にするが、これは全身送達を達成するためにも使用可能である。吸入による投与のため、いくつかのタイプの計測用量吸入装置が定期的に用いられる。これらのタイプのデバイスには、計測用量吸入装置（ＭＤＩ）、呼吸動作ＭＤＩ、乾燥粉末吸入装置（ＤＰＩ）、ＭＤＩと組み合わせたスペーサー／保持チャンバー、およびネブライザーが含まれる。他の態様において、例えば中枢神経系のウイルス感染を持つ被験体において、クモ膜下腔内投与を用いてもよい。療法剤を投与するための他の適切な経路およびデバイスは、一般の当業者にあきらかであろう。
[00157]ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤の適切な調製物、例えば実質的に純粋な調製物を、１またはそれより多い薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤等と組み合わせて、適切な薬学的組成物を産生してもよい。本発明は、被験体への投与のため、（ｉ）ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤；および（ｉｉ）薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤を含む、多様な薬学的に許容されうる組成物を提供する。用語「薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤」は、組成物の活性成分（単数または複数）の生物学的活性または有効性に有意に干渉せず、そして用いられるかまたは投与される濃度で、宿主に対して過剰に毒性でない、キャリアー（この用語は、キャリアー、媒体、希釈剤、溶媒、ビヒクル等を含む）または賦形剤を指す。他の薬学的に許容されうる成分もまた、組成物中に存在しうる。薬学的活性化合物の配合に適した物質およびその使用が当該技術分野に周知である（例えば、薬学的に許容されうる物質および多様なタイプの薬学的組成物を調製する方法のさらなる考察に関しては、本明細書にその全体が援用される、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”， Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ， 第１９版， １９９５， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．： ペンシルバニア州イーストン、およびその最新版またはバージョン、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ． 第２１版 ペンシルバニア州フィラデルフィア Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２００５を参照されたい）。
[00158]薬学的組成物は、典型的には、意図される投与経路と適合するように配合される。例えば、非経口投与のための調製には、無菌水溶液または非水性溶液、懸濁物、およびエマルジョンが含まれる。水性キャリアーには、水、アルコール性溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁物が含まれ、生理食塩水および緩衝媒体、例えば塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能有機エステル、例えばオレイン酸エチル、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；保存剤、例えば抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性調整のための剤である。酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムでｐＨを調整してもよい。こうした非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量バイアルに封入されていてもよい。監督機関によって規定される標準または規準を満たす条件下で、こうした組成物中で使用するための薬学的組成物および化合物を製造してもよい。例えば、製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）にしたがってこうした組成物および化合物を製造してもよいし、そして／またはこうした組成物および化合物を、ヒトに投与しようとする薬学的剤に適切な品質管理法に供してもよい。
[00159]経口投与のため、当該技術分野に周知の薬学的に許容されうるキャリアーと、活性化合物を組み合わせることによって、化合物を容易に配合することも可能である。こうしたキャリアーは、本発明の化合物が、治療しようとする被験体による経口摂取のため、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ジェル、シロップ、スラリー、懸濁物等として配合されることを可能にする。経口投薬型に適した賦形剤は、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤；例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物である。望ましい場合、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、アガー、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどを添加してもよい。場合によって、また経口配合物を生理食塩水または内部酸性状態を中和するための緩衝剤中に配合してもよいし、あるいはいかなるキャリアーも含まずに投与してもよい。適切なコーティングを伴う糖衣錠コアを提供する。この目的のため、濃縮糖溶液を用いてもよく、該溶液は、場合によってアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。同定するため、または活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるため、染色剤または色素を錠剤または糖衣錠コーティングに添加してもよい。
[00160]経口で使用可能な薬学的調製物には、ゼラチン製の押し込み型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセロールまたはソルビトールで作製された柔らかい密封カプセルが含まれる。押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、ならびに場合によって安定化剤と混合された、活性成分を含有してもよい。軟カプセル中、活性化合物は、適切な液体、例えば脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁されてもよい。さらに、安定化剤を添加してもよい。経口投与用に配合された微小球体もまた使用可能である。こうした微小球体は、当該技術分野においてよく定義されてきている。
[00161]経口送達用の配合物は、胃腸管における安定性を改善し、そして／または吸収を増進する剤を取り込んでもよい。
[00162]吸入による投与のため、適切な噴霧剤、例えば二酸化炭素、フルオロカーボンなどのガスを含有する加圧容器またはディスペンサー、あるいはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形で、本発明の組成物を送達してもよい。液体または乾燥エアロゾル（例えば乾燥粉末、巨大孔粒子等）を用いてもよい。本発明はまた、鼻スプレーまたは鼻投与の他の形を用いた組成物の送達も意図する。
[00163]局所適用のため、こうした組成物中で使用するのに適した１またはそれより多い薬学的に許容されうるキャリアー中に懸濁または溶解された活性構成要素を含有する、適切な軟膏、ローション、ジェル、またはクリーム中に薬学的組成物を配合してもよい。
[00164]目への局所送達のため、例えば点眼剤において、または軟膏において使用するため、等張、ｐＨ調整無菌生理食塩水中の溶液または微粒子化懸濁物として、薬学的に許容されうる組成物を配合してもよい。
[00165]経粘膜または経皮送達のため、薬学的組成物を配合してもよい。経粘膜または経皮投与のため、配合物中で、障壁に浸透するのに適した浸透剤を用いてもよい。こうした浸透剤は、当該技術分野に一般的に知られる。本発明の薬学的組成物を、座薬として（例えばココアバターおよび他のグリセリドなどの慣用的な座薬基剤とともに）または直腸送達のための停留浣腸として、配合してもよい。
[00166]いくつかの態様において、薬学的組成物には、体からの迅速な排除に対して活性剤（単数または複数）を保護することを意図する１またはそれより多い剤が含まれ、例えば徐放配合物、移植物、微小被包送達系などがある。化合物を粒子、例えばマイクロ粒子またはナノ粒子内に被包するかまたは取り込んでもよい。生体分解性生体適合性ポリマー、例えば酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡ、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリエーテル、およびポリ乳酸を用いてもよい。こうした配合物の調製法は、当業者には明らかであろう。例えば、そして限定なしに、ｓｉＲＮＡの送達のため、粒子に基づく多くの送達系が当該技術分野に知られる。本発明はこうした組成物の使用を意図する。リポソームまたは他の脂質に基づく粒子もまた、薬学的に許容されうるキャリアーとして用いられうる。
[00167]いくつかの態様において、本発明は、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤、例えば本発明の方法にしたがって同定されるかまたは検証される本明細書記載のＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤の薬学的に許容されうる誘導体を提供する。本発明にしたがって、特定の化合物の薬学的に許容されうる誘導体には、限定されるわけではないが、必要とする被験体に投与した際、直接または間接的に、化合物を提供することが可能な、薬学的に許容されうる塩、エステル、こうしたエステルの塩、あるいは任意の他の付加体または誘導体が含まれる。したがって、薬学的に許容されうる誘導体には、塩、プロドラッグ、および／または活性代謝物が含まれうる。用語「薬学的に許容されうる塩」は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー性反応等を伴わずに、ヒトおよび／またはより低次の動物の組織と接触させて使用するのに適しており、そして合理的な利益／リスク比と釣り合っている、塩を指す。非常に多様な適切に薬学的に許容されうる塩が、当該技術分野に周知である。薬学的に許容されうる塩には、限定されるわけではないが、適切な無機および有機酸および塩基に由来するものが含まれる。ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤の薬学的に許容されうる誘導体を配合し、そして一般的に同じ目的（単数または複数）のために用いる。
[00168]本発明の薬学的組成物は、被験体に投与される際、そのために投与される疾患または状態、例えばウイルス感染を治療するのに十分な時間、および十分な量で投与される。細胞培養または実験動物において、標準的薬学的方法によって、活性剤の療法効率および毒性を評価してもよい。ヒトまたは他の被験体で使用するのに適した投薬量範囲で配合する際に、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを用いてもよい。当該技術分野に知られるように、ヒトにおける臨床試験において、ヒト投与のため、異なる用量をさらに試験してもよい。用いる用量は許容される最大用量またはより低い用量であってもよい。薬学的組成物における活性剤の療法的に有効な用量は、約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であってもよい。他の例示的な用量には、例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ体重が含まれる。いくつかの態様において、単一用量を投与する一方、他の態様において、多用量を投与する。一般の当業者は、特定の任意の状況において適切な用量が、利用する剤（単数または複数）の強度に応じ、そして場合によって特定のレシピエントに対して合わせる（ｔａｉｌｏｒ）ことも可能であることを認識するであろう。被験体のための特定の用量レベルは、使用する特定の剤（単数または複数）の活性、疾患または障害の重症度、被験体の年齢、体重、全身健康状態を含む多様な要因に応じる可能性もある。
[00169]薬学的組成物、特に経口または非経口組成物を、投与を容易にし、そして投薬量を均一にするために、単位投薬型で配合することが望ましい可能性もある。単位投薬型は、本明細書においてこの用語を用いる際、治療しようとする被験体のための単位投薬型として適した、物理的に別個の単位を指し；各単位は、適切な薬学的に許容されうるキャリアーと関連して、望ましい療法効果を生じるように計算された、あらかじめ決定された量の活性剤（単数または複数）を含有する。本発明は、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤のあらかじめ決定された量を含有する薬学的に許容されうる単位投薬型を提供し、こうした量はウイルス感染の治療が必要な被験体を治療するのに適している。
[00170]療法措置には、長期に渡る、多数の単位投薬型の投与が含まれてもよいことが理解されるであろう。いくつかの態様において、被験体を１〜７日間の間、治療する。いくつかの態様において、被験体を７〜１４日間の間、治療する。いくつかの態様において、被験体を１４〜２８日間の間、治療する。他の態様において、より長い療法期間、例えば約４〜約１０週間の間に渡って投与する。いくつかの態様において、ウイルス感染の少なくとも１つの症状または徴候の重症度が減少し始めるか、あるいは重症度が有意に減少するか、あるいは被験体がもはやウイルス感染を発展させるリスクがなくなるまで、被験体を治療する。いくつかの態様において、治療を無期限に、例えば予防を達成するために続けてもよい。例えば、再発ウイルス感染のリスクがあるか、またはウイルス感染を回避することを望む被験体を、こうしたリスクが存在するか、または被験体がウイルス感染を回避することを望む間、任意の期間、治療することも可能である。被験体は、１日に１またはそれより多い用量を投与されてもよいし、あるいは治療期間内で、１日おきにまたはより頻繁でなく用量を投与されてもよい。
[00171]いくつかの態様において、２またはそれより多いＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤を投与する。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤と、ウイルス感染を治療するのに有用な第二の化合物を組み合わせて投与する。併用治療に関する句「組み合わせて」は、本明細書において、第一および第二の化合物の投与に関して、（ｉ）ごく最近投与された第一の剤の用量の９０％より多くが不活性型に代謝されるかまたは体から排出される前に、第二の化合物の用量が投与されるか；あるいは（ｉｉ）第一および第二の化合物の用量が互いに４８時間以内に投与されるか；あるいは（ｉｉｉ）重複する期間の間に（例えば連続するかまたは断続的な注入によって）、剤が投与されるか；あるいは（ｉｖ）前述の任意の組み合わせのように行われる投与を意味する。化合物は、単一の組成物の構成要素としてともに投与されてもよいが、そうである必要はない。いくつかの態様において、これらは、実質的に同時に（これによって、互いに１０分以内であることを意味する）個々に投与されてもよい。いくつかの態様において、これらは、互いに短時間の間に（これによって、３時間未満、ときに１時間未満離れていることを意味する）個々に投与されてもよい。化合物は、同じ投与経路によって投与されてもよいが、そうである必要はない。第二の化合物と組み合わせて投与される場合、特定の生物学的反応を誘発するのに必要な第一の化合物の有効量は、第二の化合物の非存在下で投与される際の第一の化合物の有効量より少なくてもまたは多くてもよく（またはその逆も可能である）、それによって、一方の化合物が他方の化合物の非存在下で投与される際に必要であろう量と比較して、どちらかまたは両方の剤の用量の調整が可能になる。例えば、本発明の化合物を組み合わせて投与する場合（例えばＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤および第二の抗ウイルス化合物）、どちらかの化合物の療法投薬量未満、または両方の療法投薬量未満を、ウイルス感染の治療が必要な被験体の治療において使用してもよい。いくつかの態様において、２つの化合物を組み合わせて用い、いくつかの態様において、第二の抗ウイルス化合物を療法量未満で投与して、望ましい療法的結果を生じる。「療法量未満」は、本明細書において、他方の化合物の非存在下で投与された際、被験体において療法的結果を生じると予期される量よりも少ない、例えば推奨される量よりも少ない量を指す。多数の化合物の効果は、付加的または相乗的であってもよいが、そうである必要はない。１またはそれより多い化合物を多数回投与してもよい。
[00172]いくつかの態様において、特定のウイルス、例えばピコルナウイルスに感染した被験体を治療するのに有用であると当該技術分野に知られる抗ウイルス剤を、第二の化合物として、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤と組み合わせて用いる。いくつかの態様において、ウイルスを中和するかまたは阻害する抗体を用いる。いくつかの態様において、ウイルス融合を阻害する化合物を用いる。いくつかの態様において、プロテアーゼ阻害剤またはキナーゼ阻害剤を用いる。いくつかの態様において、例えばウイルス遺伝子をターゲティングするＲＮＡｉ剤、例えばｓｉＲＮＡを用いる。いくつかの態様において、カプシド結合剤を用いる。いくつかの態様において、第二の化合物は、例えばルプリントリビル（ｒｕｐｒｉｎｔｒｉｖｉｒ）、プレコナリル、ピリダジニルオキシムエーテル、またはアルビドールである。例えば、Ｂａｒｎａｒｄ ＤＬ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ａｎｔｉ−ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ． １２（１１）： １３７９−９０， ２００６； ＤｅＰａｌｍａ， ＡＭ，ら， Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ２８（６）：８２３−８８４， ２００８を参照されたい。
[00173]いくつかの態様において、療法的に有用であるには十分に活性でない化合物は、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤と組み合わせて投与された際、療法的に有用となる。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤と組み合わせて投与した際、こうした化合物をより低い用量で用いることも可能である。
[00174]いくつかの態様において、本発明は、ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤、およびウイルス感染、例えばピコルナウイルスによる感染を阻害するのに有用な第二の化合物を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、２つ（またはそれより多く）の剤を含む単位投薬型を提供する。
[00175]本発明はまた、薬学的に許容されうるＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤、および場合によって１またはそれより多い他の薬学的に許容されうる成分を含有する、１またはそれより多い容器（例えばバイアル、アンプル、瓶）を含む、薬学的パックまたはキットも提供する。こうした容器（単数または複数）と場合によって関連するのは、薬学的製品の製造、使用または販売を監督する政府機関によって規定された形の公示であってもよく、こうした公示は、ヒト投与のための製造、使用または販売の該機関による認可を反映する。公示は、例えば投与用量、経路、および／または方法、認可される適応症（例えば、薬学的組成物が治療における使用に関して認可されているウイルス感染）、作用機構、あるいは開業医および／または患者に対する使用情報を記載してもよい。異なる成分が、固体（例えば凍結乾燥）または液体型で供給されてもよい。各成分は、一般的に、それぞれの容器中でアリコットされるか、または濃縮型で提供されるのに適しているであろう。キットにはまた、凍結乾燥成分の再構成用の媒体も含まれてもよい。キットの個々の容器は、好ましくは、商業的販売のため、厳重な閉鎖（ｃｌｏｓｅ ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）下で維持される。
[00176]本発明にしたがって阻害されるべきウイルスは、関心対象の細胞タイプ、臓器または臓器系に感染可能である。例えば、いくつかの態様において、ウイルスは、胃腸管の細胞を感染させる。いくつかの態様において、ウイルスは、肝臓、例えば肝細胞を感染させる。いくつかの態様において、ウイルスは呼吸系、例えば上気道および／または下気道を感染させる。いくつかの態様において、ウイルスは筋細胞、例えば心筋細胞を感染させる。いくつかの態様において、ウイルスは神経系（例えばニューロン）を感染させる。いくつかの態様において、ウイルスは中枢神経系を感染させる。いくつかの態様において、ウイルスは皮膚細胞（例えばケラチノサイト）を感染させる。いくつかの態様において、ウイルスは粘膜細胞を感染させる。いくつかの態様において、ウイルスは免疫系細胞、例えばリンパ球またはマクロファージを感染させる。いくつかの態様において、ウイルス感染は、関心対象の細胞タイプ、臓器、または臓器系に対する損傷と関連する。こうした損傷は、ウイルスによる細胞の感染によって、および／または免疫仲介機構によって生じうる。
[00177]いくつかの態様において、化合物は、例えば正常な生理学的プロセスまたは病的プロセスにおけるＰＬＡ２Ｇ１６の役割をさらに研究するための研究目的のために有用である。例えば、化合物を用いて、代謝におけるおよび／またはウイルス感染におけるＰＬＡ２Ｇ１６の役割をさらに研究してもよい。
[00178]別の側面において、本発明は、例えばピコルナウイルスによるウイルス感染に増加した耐性を有する、非ヒト多細胞生物、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト脊椎動物を生成する方法を提供する。１つの側面において、非ヒト多細胞生物は、同じ種の正常な非トランスジェニック生物と比較した際、内因性ＰＬＡ２Ｇ１６活性が減少している。いくつかの態様において、生物は、該動物が機能ＰＬＡ２Ｇ１６の減少した発現を有するように、ＰＬＡ２Ｇ１６遺伝子内へのターゲティングされた挿入または該遺伝子の少なくとも一部の欠失を有する、トランスジェニック非ヒト脊椎動物である。他の態様において、トランスジェニック非ヒト動物は、ＰＬＡ２Ｇ１６発現を減少させるＲＮＡｉ剤、例えばｓｈＲＮＡを発現する。いくつかの態様において、生物はげっ歯類である。いくつかの態様において、生物はマウスではない。いくつかの態様において、脊椎動物は、商業的に重要な動物である。例えば、生物は、少なくとも１つの国の国民総生産に少なくとも＄１０，０００寄与することも可能であり、そして／または州間または国家間の交易の対象であってもよい。商業的に重要な例示的な動物は、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、七面鳥、魚である。いくつかの態様において、動物は家畜化された動物、例えば農場動物、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、またはウマなどの家畜である。いくつかの態様において、ウイルス耐性動物は、非家畜化種である。場合によって、種は危機に瀕している。該方法を用いて、ウイルス感染に耐性であり、そして野生においてまたは飼育下で、生き延びる可能性が改善されている個体を同定してもよい。ウイルス感染に耐性である動物は、動物およびヒト宿主の両方が感染しうるウイルスの蔓延を減少させうる。例えば、相同組換え、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ仲介組換え、オリゴヌクレオチド仲介遺伝子改変等を用いて、突然変異または欠失を操作してもよい。トランスジェニック生物を生成するために、当該技術分野で知られる標準法を用いて、こうした生物を生成してもよい。例えば、体細胞核トランスファー（ＳＣＮＴ）を用いてもよい。
[00179]別の側面において、本発明は、機能ＰＬＡ２Ｇ１６が減少しているかまたは存在しない、非ヒト多細胞生物、例えば非ヒト脊椎動物、例えば非ヒト動物を同定する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、生物は、減少したＰＬＡ２Ｇ１６の発現を有する。いくつかの態様において、生物は、ＰＬＡ２Ｇ１６の機能的に不活性な変異体または断片を発現する。例えば、生物は、フレームシフト突然変異、あるいは活性に必要な少なくともいくつかの残基の欠失または改変を有してもよい。例えば遺伝子型を決定し（例えば減少したまたは改変されたＰＬＡ２Ｇ１６を生じる突然変異または多型を有する動物を同定するため）、そして／または組織における発現レベルを調べ、そしてＰＬＡ２Ｇ１６発現または活性が低いかまたは存在しない動物を同定して、生物を同定してもよい。いくつかの態様において、当該技術分野に知られる多型、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）を調べる。例えば、ゲノムプロジェクトおよび他の配列決定努力によって、動物ゲノム中の多くのＳＮＰが同定されてきている。ＳＮＰ、例えばＰＬＡ２Ｇ１６遺伝子中またはその近傍に位置するＳＮＰを評価して、改変された、例えば機能ＰＬＡ２Ｇ１６の減少または非存在と関連するものと同定してもよい。こうしたＳＮＰを所持する動物を同定してもよい。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６の減少または非存在は、ウイルスによる感染のためのターゲットである、少なくともいくつかの組織および／または細胞で起こる。いくつかの態様において、ＰＬＡ２Ｇ１６の減少または非存在は、大部分のまたはすべての組織で起こる。望ましい特質（例えばＰＬＡ２Ｇ１６の減少または非存在）を持つ生物を選択してもよい。標準的交雑技術を適用して、ＰＬＡ２Ｇ１６発現および／または活性が特に低い動物を産生してもよい。例えば、家畜交雑の標準法を用いてもよい。伝統的な交雑スキームおよび／またはマーカー補助選択を使用してもよい。いくつかの態様において、突然変異または多型は自発的に生じる突然変異であり、すなわち人によって生成されない。いくつかの態様において、突然変異は人によって、例えば放射線または化学的突然変異誘発を用いて、生成される。したがって、本発明は、機能ＰＬＡ２Ｇ１６が減少したかまたは存在しない、遺伝子改変されていない非ヒト生物、例えば非ヒト動物を産生する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、機能ＰＬＡ２Ｇ１６が減少したかまたは存在しない生物を同定するかまたは選択する工程を含む。いくつかの態様において、非ヒト生物は、選択的交雑技術を用いて産生される。本発明は、こうした生物およびその使用法をさらに提供する。
[00180]いくつかの態様において、方法は、農業および／または畜産において、機能ＰＬＡ２Ｇ１６が減少しているかまたは存在しない生物を提供するかまたは用いる工程を含む。生物は、遺伝子改変された生物または遺伝子改変されていない生物であってもよい。生物は、ウイルスに感染する可能性が減少していてもよいし、そして／または感染重症度が減少していてもよい。例えば、いくつかの態様において、動物は口蹄疫ウイルスによる感染の可能性が減少し、そして／または感染の重症度が減少している。いくつかの態様において、動物はウシまたはブタ・エンテロウイルスによる感染の可能性が減少し、そして／または感染の重症度が減少している。いくつかの態様において、本発明は、（ａ）機能ＰＬＡ２Ｇ１６が減少しているかまたは存在しない動物を提供し；そして（ｂ）該動物を用いて畜産に従事する工程を含む方法を提供する。畜産は、食肉用、または動物製品（例えばミルク、卵、またはウール）を採取するための動物の交雑および飼育、ならびに作業および／または交友のための種の育種および世話を含む。農業は、農業経営を通じた、食品および／または製品の産生を指す。
[00181]当業者は、目的を実行し、そして言及する結果および利点、ならびにそれに固有のものを得るために、本発明がよく適応することを容易に認識する。本明細書の説明および実施例の詳細は、特定の態様の代表であり、例示的であり、そして本発明の範囲に対する限定とは意図されない。これらの修飾および他の使用が、当業者には明らかであろう。これらの修飾が、本発明の精神内に含まれる。当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示する本発明に対して、多様な置換および修飾・改変を行いうることが容易に明らかであろう。
[00182]冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、明細書および請求項中、明確に逆に示さない限り、複数の指示対象を含むと理解されなければならない。群の１またはそれより多いメンバー間に「または」を含む請求項または説明は、群メンバーの１、１より多く、またはすべてが、所定の産物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別の方式で関連する場合、逆に示さない限りまたは文脈から別に明らかでない限り、満たされると見なされる。本発明には、群の正確に１つのメンバーが所定の産物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別の方式で関連する態様が含まれる。本発明にはまた、群メンバーの１より多く、またはすべてが、所定の産物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別の方式で関連する態様も含まれる。さらに、別に示さない限り、あるいは矛盾または不一致が生じることが一般の当業者に明らかでない限り、１またはそれより多い制限、要素、条項、記述用語等が、列挙する請求項の１またはそれより多くから、同じ基本請求項に依存する別の請求項（または適切であるように、任意の他の請求項）に導入されている、すべての変動、組み合わせ、および順列を、本発明が提供することが理解されるものとする。適切な場合、本明細書に記載するすべての態様が、本発明のすべての異なる側面に適用可能であることが意図される。適切な場合、態様または側面のいずれも、１またはそれより多い他のこうした態様または側面と自由に組み合わせ可能であることもまた意図される。要素が、例えばマーカッシュ群または類似の形式で、リストとして提示される場合、要素の各下位群もまた開示され、そして任意の要素（単数または複数）が群から除去されうることが理解されるものとする。一般的に、本発明、または本発明の側面が、特定の要素、特徴等を含むと称される場合、本発明の特定の態様または本発明の側面は、こうした要素、特徴等からなるかまたは本質的にこれらからなると理解しなければならない。単純化するために、これらの態様は、すべての場合で、本明細書の非常に多くの用語で特に記述されているわけではない。特定の排除が明細書中に列挙されるかどうかにかかわらず、本発明の任意の態様または側面が、請求項から明確に排除されうることもまた理解しなければならない。例えば、任意の１またはそれより多いウイルス属、ウイルス種、ウイルス、アッセイ、化合物、疾患、被験体、またはその組み合わせが排除されうる。
[00183]請求項または説明が、問題の組成物、例えば化合物に関する場合、別に示さない限り、あるいは矛盾または不一致が生じることが一般の当業者に明らかでない限り、本明細書に開示する任意の方法にしたがって、問題の組成物を作製するかまたは用いる方法、ならびに本明細書に開示する任意の目的のため、問題の組成物を用いる方法が、本発明の側面であることが理解されるものとする。請求項または説明が、方法、例えば化合物を同定する方法に関する場合、別に示さない限り、あるいは矛盾または不一致が生じることが一般の当業者に明らかでない限り、本明細書に記載するように、化合物を用いるか、または組成物を配合する方法が、本発明の側面であることが理解されるものとする。
[00184]本明細書に範囲が与えられる場合、本発明には、終点が含まれる態様、両方の終点が排除される態様、および一方の終点が含まれ、そしてもう一方が排除される態様が含まれる。別に示さない限り、両方の終点が含まれると仮定されるべきである。さらに、別に示さない限り、または文脈および一般の当業者の理解から明らかでない限り、範囲として示される値は、文脈が明らかに別に示さない限り、本発明の異なる態様において、言及される範囲内の任意の特定の値または下位範囲を、範囲の下限の単位の１０分の１までと仮定しうることが理解されるものとする。また、本明細書において、一連の数値に言及する場合、本発明には、同様に、任意の介在する値または一連の任意の２つの値によって定義される範囲に関連する態様、ならびに最低の値を最小限としてもよく、そして最高の値を最大限としてもよい態様も含まれることが理解される。本明細書に用いる数値には、割合として表される値が含まれる。数値の前に、「約」または「およそ」が置かれる、本発明の任意の態様に関して、本発明には、正確な値が列挙される態様が含まれる。数値の前に「約」または「およそ」が置かれない本発明の任意の態様に関して、本発明には、数値の前に「約」または「およそ」が置かれる態様が含まれる。「およそ」または「約」には、別に示さない限り、または文脈から明らかでない限り、一般的に、いずれかの方向に（数値より大きいかまたは小さい）数値の１％の範囲内に属する、またはいくつかの態様において、数値の５％の範囲内に属する、またはいくつかの態様において、数値の１０％の範囲内に属する数値が含まれる（こうした数値が、ありうる数値の１００％を許容されないほど越える場合を除く）。１より多い行為が含まれる、本明細書に請求する任意の方法において、明確に逆に示されない限り、方法の行為の順序は、方法の行為を列挙する順序に必ずしも限定されないが、本発明には、順序がこのように限定される態様が含まれることを理解すべきである。別に示されない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書記載の任意の産物または組成物は「単離された」と見なされうることもまた、理解すべきである。
実施例１：ＫＢＭ７サブクローンの性質決定およびレトロウイルス感染
[00185]本発明者らは、効率的な順方向遺伝的アプローチを可能にすると考えられる、ヒト細胞における半数体ゲノム設定をまず性質決定した。ＣＭＬ細胞株ＫＢＭ７のサブクローンは、近半数体染色体セットを所持すると記載されている（Ｋｏｔｅｃｋｉ， Ｍ．， Ｒｅｄｄｙ， Ｐ．Ｓ．，およびＣｏｃｈｒａｎ， Ｂ．Ｈ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅａｒ−ｈａｐｌｏｉｄ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２５２， ２７３−２８０， １９９９）。本発明者らはまず、この細胞株（Ｂ．Ｈ． Ｃｏｃｈｒａｎ博士、タフツ大学医学部、マサチューセッツ州ボストンの寛大な提供による）が容易に増殖し、ウイルス感染に耐容性であり、そして効率的にサブクローン可能であるかどうかを調べた。用語「ＫＢＭ７細胞株」は、本明細書において、この近半数体細胞株またはそのサブクローンを指すよう用いられる。ＫＢＭ７細胞株またはそのサブクローンの細胞を「ＫＢＭ７細胞」と称してもよい。ＫＢＭ７細胞は、高いサブクローニング効率（ほぼ〜８０％）を有し、そしていくつかのサブクローンをさらに調べた。ＫＢＭ７サブクローンは、およそ２４時間の世代時間で容易に増殖し、そしてまばらなおよび非常に高い細胞密度（例えば〜１ｘ１０７細胞／ｍｌ）で維持可能であった。重要なことに、フローサイトメトリー分析によって、ＫＢＭ７サブクローンが、二倍体ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞に比較した際、低二倍体核型を有することが示された。１つのサブクローンを、２４色ＦＩＳＨスペクトル核型決定によって、さらに調べ、そしてこのサブクローンは、染色体８以外のすべての染色体に関して半数体であり、そしてＢＣＲ−ＡＢＬ形質転換慢性骨髄性白血病細胞に特徴的なフィラデルフィア染色体（ｔ（９；２２））を含有することが示された。ＰＣＴ公報第ＷＯ ２０１１／００６１４５号、およびＣａｒｅｔｔｅ ＪＥ，ら， Ｈａｐｌｏｉｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒｓ ｕｓｅｄ ｂｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００９ Ｎｏｖ ２７；３２６（５９５７）： １２３１−５もまた参照されたい。
実施例２：ＫＢＭ７細胞のレトロウイルス感染
[00186]本発明者らは、次に、ＫＢＭ−７細胞をレトロウイルスに感染させることが可能であるかどうかを決定した。２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣから得た）において、パッケージングベクターを伴うＧＦＰ発現レトロウイルスベクターのトランスフェクションによって、ウイルスを産生した。レトロウイルスベクターは、ｐＬＩＢ−ＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であったが、多くの異なるレトロウイルスベクターが使用可能であることが理解されるであろう。ウイルスを含有する上清を用いて、ＫＢＭ７細胞を感染させた。レトロウイルスによるＫＢＭ７細胞の感染効率を改善するため、異なる条件を試験した。２４ウェル組織培養ディッシュ中、２，０００ｒｐｍで、室温で４５分間、細胞を遠心分離すると、遠心分離なしの場合に比較して、感染効率の２倍の増加が生じた。次に、レトロネクチン、ポリブレンおよび硫酸プロタミン添加の効果を試験して、それぞれ、２５％、３３％および４４％の効率を生じた。１ミリリットルの培地あたり、８マイクログラムの硫酸プロタミンが好ましい添加である。Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ローター中、２５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１．５時間、超遠心することによって、ウイルスを濃縮すると、未希釈ウイルスに比較して、感染率が劇的に改善され、そしてＡｍｉｃｏｎフィルターによる濃縮よりも好ましかった。結論として、硫酸プロタミンの存在下で、スピン感染のために濃縮ウイルスを用いた場合、ＫＢＭ−７細胞は最適に感染した。これらのサブクローンは、ＶＳＶ−Ｇ偽型であるＧＦＰ発現レトロウイルスまたはレンチウイルスに効率的に（〜７０−９０％）感染可能であり、そして高レベルのＧＦＰ発現を数ヶ月維持した。
実施例３：ピューロマイシンおよびＧＦＰ選択可能マーカーを含有するベクターを含有するジーントラップベクターの構築
[00187]不活性化ＬＴＲ、アデノウイルス血清型４０の長い線維遺伝子由来の強いスプライス−アクセプター部位（Ｃａｒｅｔｔｅら ２００５ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（８）１０５３−１０６２）、およびＧＦＰまたはピューロマイシン耐性遺伝子（ＰＵＲＯ）のいずれかの後に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有するレトロウイルス・ジーントラップベクターを以下のように構築した。オーバーハングＣｌａＩおよびＮｈｅＩ制限部位ならびに部分的スプライス・アクセプター部位を含有するプライマー：（ＧＦＰ： ５’−ＧＡＴＣＧＣＴＡＧＣＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧ−３’および５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ−３’ ＰＵＲＯ： ５’−ＧＡＴＣＧＣＴＡＧＣＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣ−３’および５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＣＡＣＣＧＧＧＣＴＴＧＣＧＧＧＴＣ−３’）を用いたＰＣＲ増幅によって、ＰＵＲＯまたはＧＦＰのコード配列を得た。これらのＰＣＲ産物をｐＥＧＦＰＣ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中に挿入してＥＧＦＰを置換した。続いて、オーバーハングＣｌａＩおよびＢａｍＨＩ部位ならびにスプライス・アクセプターシグナルの５’端を含有するプライマー（ＧＦＰ： ５’−ＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＴＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＧ−３’および５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ−３’ ＰＵＲＯ： ５’−ＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＴＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣ−３’および５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ−３’）を用いたＰＣＲを行って、完全スプライス・アクセプター部位を導入し、そしてポリアデニル化シグナルが続くＧＦＰまたはＰＵＲＯいずれかを得た。これらのＰＣＲ産物をｐＲＥＴＲＯ−ＳＵＰＥＲ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら ２００２ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ． ２（３）：２４３−７）中に挿入してｐｏｌＩＩＩプロモーターを置換した。生じたプラスミドをｐＧＴ−ＧＦＰおよびｐＧＴ−ＰＵＲＯと名付けた。３つのリーディングフレームすべてにＧＦＰまたはピューロマイシン・レポーター遺伝子を含有するジーントラップ構築物を生成した。
[00188]ウイルスベクターは、プロモーター不含レポーターおよびポリアデニル化シグナルのすぐ上流にアデノウイルス・スプライス・アクセプター部位を含有し、したがって、活性遺伝子のイントロン内へのベクター挿入は、天然遺伝子座を不活性化し、そして遺伝子のプロモーターによって駆動される転写は、上流エクソン（単数または複数）がＧＦＰまたはＰＵＲＯ遺伝子にスプライシングされた、融合転写物を生じる。転写は、挿入されたポリＡ部位で終結するため、ＧＦＰ遺伝子をコードする遺伝子がレポーター遺伝子として働くジーントラップベクターに関して図１Ｂに模式的に示すように、生じる融合転写物は、一部切除され、そして機能しないバージョンの細胞性タンパク質およびＧＦＰまたはＰＵＲＯのいずれかをコードする。
実施例４：突然変異体細胞ライブラリーの生成
[00189]ほぼすべての遺伝子においてノックアウト・アレルを持つ細胞ライブラリーを生成するため、近半数体ＫＢＭ７細胞を、実施例３に記載するように生成されたジーントラップに感染させた。レトロウイルス・パッケージング・プラスミドと組み合わせて、ｐＧＴ−ＧＦＰまたはｐＧＴ−ＰＵＲＯのいずれかで、Ｔ１７５ディッシュ中の２９３Ｔ細胞をトランスフェクションすることによって、ジーントラップウイルスを作製した。Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ローター中、２５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１．５時間の超遠心を用いて、ウイルス含有上清を濃縮した。突然変異体ＫＢＭ７細胞のバッチは、典型的には、実施例２に記載する方法を用いて、ウェルあたり１５０万細胞を含有する１枚の２４ウェル組織培養ディッシュの感染によって作製される。１ミリリットルあたり５００ｎｇのピューロマイシンを用いて、感染２日後に、ピューロマイシン耐性遺伝子を含有するジーントラップに感染した細胞を選択した。限界希釈によって選択した後、細胞を拡大し、そしてさらなるスクリーンのために凍結した。活発に発現される遺伝子に関してジーントラップが導入されるバイアスを無効にするために、ＧＦＰジーントラップ感染細胞を、選択せずにスクリーンに用いるか、またはＧＦＰ発現細胞に関するＦＡＣＳ分取を用いて選択するか、いずれかとした。いくつかの場合、ＧＦＰ発現に基づくさらなる層別化を行って、異なるレベルのＧＦＰを含む細胞のバッチを得た。比較的より長い半減期の遺伝子産物をコードする遺伝子を同定する可能性を増加させるため、ジーントラップ感染６日後またはそれより後に、スクリーンを実行して、それによって遺伝子産物が細胞増殖中に希釈されるのを可能にした。
実施例５：半数体遺伝学に有用な新規細胞タイプの生成
[00190]本発明者らは、例えば、多能性誘導性転写因子、例えばＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ−Ｍｙｃの導入によって、分化した細胞状態の再プログラミングを可能にする、近年記載されている方法、体細胞再プログラミングを用いて、半数体遺伝学に適したさらなる細胞タイプを生成した（Ｚａｅｈｒｅｓ， Ｈ．，およびＳｃｈｏｌｅｒ， Ｈ．Ｒ．（２００７）． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ： ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ． Ｃｅｌｌ １３１， ８３４−８３５）。レトロウイルス感染によってＫＢＭ−７細胞内にこれらの４つの転写因子を導入すると（Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｋ．，ら， Ｃｅｌｌ， １３１（５）：８６１−７２， ２００７に記載される通り）、付着細胞クローンの形成が生じた。これらのクローンのいくつかまたは大部分は、造血系細胞表面マーカーＣＤ４３およびＣＤ４５を失った。これらの細胞の大部分は、多能性ではなかった。サブクローンを単離し、そして「ＨＡＰ１」と名付けた。ＨＡＰ１細胞は、１０％ＦＣＳを含有する培地中で培養可能であり、そしてトリプシンを用いて拡大可能であった。これらの細胞は、造血性ではなく、そしてこれらの細胞の大部分は、染色体８を含む各染色体を単一コピーで有した。
[00191]インフルエンザウイルスとは対照的に、ＫＢＭ７細胞は、ポリオウイルスには生産的に感染不能である（図１Ｂ、左パネル）。しかし、ＨＡＰ１細胞は、ポリオウイルス感染に非常に感受性であり、そして数日以内に、大規模な細胞死を経る（図１Ｂ、上部右および下部右パネルを比較されたい）。続いて、新鮮なＨＡＰ１細胞を本発明者らのジーントラップ・レトロウイルス構築物に感染させ、そしてポリオウイルスに曝露した。２つの耐性コロニーを拡大し、そして組込みをマッピングした。どちらの突然変異体も、既知のポリオウイルス進入受容体ＰＶＲに独立の組込みを含有し、したがってその耐性が説明された。これらの結果は、ＫＢＭ７細胞由来の再プログラミングされた非造血系細胞株、例えばＨＡＰ１細胞における半数体遺伝子スクリーンを通じて、ポリオウイルス感染に必須の因子が発見可能であることを示す。
実施例６：ポリオウイルスのための宿主因子としてのＰＬＡ２Ｇ１６の同定
[00192]ポリオウイルスのための新規宿主因子を同定するため、ＨＡＰ１細胞を用いて、より大規模なスクリーンを行った（図１Ｃ）。実施例４に記載するように、レトロウイルスを調製し、そして突然変異体ＨＡＰ１細胞ライブラリーを生成した。１億の突然変異誘発した半数体ＨＡＰ１細胞をポリオウイルスと接触させ、そして耐性コロニーが増殖するのを可能にした。ジーントラップ挿入部位を同定するため、大規模平行配列決定技術で使用するため、逆ＰＣＲプロトコルを適応させた。これを行うため、ジーントラップベクターに感染させた３０００万の細胞からゲノムＤＮＡを単離した。２つはＮｌａＩＩＩそして２つはＭｓｅＩを用いて、試料あたり４つの消化反応を行った。続いて、消化したＤＮＡをカラム精製し（Ｑｉａｇｅｎ）、そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、３００マイクロリットルの体積中、１マイクログラムのＤＮＡを室温で一晩連結した。別の周期のカラム精製後、外側に向かうプライマーを用いた逆ＰＣＲのテンプレートとしてＤＮＡを用いた。大規模平行配列決定プラットホームである「Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノム分析装置」で使用するのに必要なアダプター配列を含有するように、オリゴヌクレオチドを設計した。ＮｌａＩＩＩで消化したテンプレートに関して、用いたオリゴヌクレオチドは： ５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧＴＴＣＴＣＴＡＧＣＴＴＧＣＣ−３’ ５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＣＣＣＡＧＧＴＴＡＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＣ−３’であった。ＭｓｅＩで消化したテンプレートに関して、用いたオリゴヌクレオチドは： ５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧＴＴＣＴＣＴＡＧＣＴＴＧＣＣ−３’ ５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣＴＧＴＧＴＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＧ−３’であった。４つのＰＣＲ反応をプールし、そして製造者のプロトコルにしたがって、Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノム分析装置上での分析に用い、そしてヒトゲノムに対してマッピングした。典型的には、この分析から、ヒトゲノム上の異なる位置にマッピングされる〜２０，０００の挿入部位が得られる。ジーントラップ挿入が濃縮されているゲノム遺伝子座の同定を容易にするため、グラフ中に「挿入密度」をプロットしてもよい。１／（３つの続く挿入部位までの平均距離）を計算することによって、すべての挿入に関して、挿入密度を決定する。
[00193]図２におけるプロットは、個々のジーントラップ突然変異がマッピングされたヒト染色体上の位置をｘ軸上に示し、そして特定の突然変異からその隣接するものまでの逆数をｙ軸上に示す。突然変異は、染色体１９中の既知のポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）において、そして染色体１１上のホスホリパーゼＰＬＡ２Ｇ１６をコードする遺伝子と本発明者らが同定した領域において、非常に濃縮されていることが見出された。この遺伝子は、４２の独立のジーントラップ挿入を含有した。
実施例７：ジーントラップ挿入がＰＬＡ２Ｇ１６発現を除去することの確認
[00194]アミノ酸１１３のＣからＡへの変化（Ｃ１１３Ａ突然変異）によって、ＰＬＡ２Ｇ１６が触媒的に不活性になる（Ｄｕｎｃａｎ、上記）。ＦＬＡＧタグを含みまたは含まずに、ＨＡＰ１細胞において、野生型または突然変異体ヒトＰＬＡ２Ｇ１６を発現するのに適したレトロウイルス構築物を、標準法を用いて生成し、そしてＰＬＡ２Ｇ１６遺伝子座においてジーントラップ挿入を含有する（ＰＬＡ２Ｇ１６ＧＴ）ＨＡＰ１細胞内に導入した。Ｆｌａｇタグ化ヒトＰＬＡ２Ｇ１６およびＩＲＥＳ−ブラストサイジン選択可能マーカー遺伝子を発現するｐＭＸレトロウイルスベクターを用いた。ＰＬＡ２Ｇ１６の非タグ化型のため、ヒトＰＬＡ２Ｇ１６ ｃＤＮＡをｐＢＡＢＥｐｕｒｏレトロウイルスベクター内にクローニングした。ＰＬＡ２Ｇ１６に対するポリクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロットを行って、ＰＬＡ２Ｇ１６発現を調べた（図３）。ＰＬＡ２Ｇ１６は、野生型（ＷＴ）ＨＡＰ１細胞（すなわち、ジーントラップベクターに曝露されていないＨＡＰ１細胞）において検出された（レーン１）。予期されるように、ＰＬＡ２Ｇ１６ＧＴ細胞は、検出可能なＰＬＡ２Ｇ１６を欠いた（レーン２）。レーン３〜６に見られるように、ＰＬＡ２Ｇ１６は、ＰＬＡ２Ｇ１６（野生型またはＣ１１３Ａ突然変異体）をコードする構築物を受け取ったＰＬＡ２Ｇ１６ＧＴ細胞において容易に検出された。予期されるように、ＦＬＡＧタグ化ＰＬＡ２Ｇ１６のサイズは、非タグ化ＰＬＡ２Ｇ１６よりもわずかに大きかった（レーン３および４対５および６を比較されたい）。この実験は、ジーントラップが、実際に、ＰＬＡ２Ｇ１６発現を有効に抑止し、そしてＨＡＰ１ ＰＬＡ２Ｇ１６ＧＴ細胞内に導入されると、構築物がＰＬＡ２Ｇ１６発現を回復することを立証した。
実施例８：ＰＬＡ２Ｇ１６の欠如によって細胞がポリオウイルスに耐性になることの確認
[00195]ＰＬＡ２Ｇ１６発現を排除すると、ポリオウイルスによる感染が阻害されることを確認するため、半数体ＰＬＡ２Ｇ１６ＧＴ細胞を、ＰＬＡ２Ｇ１６または触媒的に不活性である突然変異体（Ｃ１１３Ａ改変を含有する）をコードするレトロウイルスに感染させた。ＰＬＡ２Ｇ１６ＧＴは、ポリオウイルスの非存在下で頑強に増殖する（図４、左パネル）。図４（左から２番目のパネル）に示すように、ＰＬＡ２Ｇ１６ＧＴ細胞（ＰＬＡ２Ｇ１６ジーントラップ挿入を含有する）はまた、ポリオウイルスの存在下でも増殖する。ＰＬＡ２Ｇ１６ＧＴ細胞において、野生型ＰＬＡ２Ｇ１６のレトロウイルス過剰発現によってＰＬＡ２Ｇ１６を補完すると、これらの細胞のポリオウイルスに対する感受性が回復する（右から二番目のパネル）。触媒部位突然変異体（Ｃ１１３Ａ）で補完しても、感受性は回復されない（右パネル）ため、これには、ＰＬＡ２Ｇ１６の触媒活性が必要である。
[00196]図６Ａは、グラフ形式で、ポリオウイルスに対するジーントラップ突然変異体細胞の感受性を示す。示すＭＯＩで細胞を感染させ、そして感染３日後、ＭＴＴアッセイを用いて、生存度を測定した。ＰＬＡ２Ｇ１６内へのジーントラップ挿入は、ポリオウイルスによる感染に対して細胞を感受性にし、そして細胞において野生型を発現することによって感受性は回復可能であったが、触媒的に不活性である突然変異体ＰＬＡ２Ｇ１６では回復不能であった。予期されるように、ポリオウイルス受容体内へのジーントラップ挿入によって、半数体細胞はポリオウイルス感染に耐性になる。ＰＬＡ２Ｇ１６内へのジーントラップ挿入は、ポリオウイルス受容体内へのジーントラップ挿入と本質的に同等の効果を有する。
実施例９：ＰＬＡ２Ｇ１６挿入によって、半数体細胞はコクサッキーウイルスに耐性になる
[00197]図５は、野生型半数体細胞および機能ＰＬＡ２Ｇ１６を欠く細胞に対するコクサッキーウイルスＢ１の影響を示す。細胞を２４ウェルのウェルにプレーティングし、そして示すＭＯＩのコクサッキーウイルスＢ１で単層を処理した。感染４日後、クリスタルバイオレットを用いて、生存している接着細胞を染色した。野生型細胞は試験したすべてのＭＯＩでウイルスに非常に感受性であった（最上列）。ジーントラップ挿入のため、ＰＬＡ２Ｇ１６に関して突然変異体である細胞は、高濃度のウイルスであっても、コクサッキーウイルスＢ１によって本質的に影響を受けなかった（上から２列目）。レトロウイルス過剰発現によってＰＬＡ２Ｇ１６を補完すると、コクサッキーウイルスＢ１に対するこれらの細胞の感受性が回復する（上から３列目）。触媒部位突然変異体（Ｃ１１３Ａ）で補完しても、感受性は回復されない（最下列）ため、これには、ＰＬＡ２Ｇ１６の触媒活性が必要である。したがって、ＰＬＡ２Ｇ１６ジーントラップ挿入を含有する細胞はコクサッキーウイルスＢ１に耐性であり、そして野生型を発現することによって感受性は回復可能であったが、触媒的に不活性である突然変異体ＰＬＡ２Ｇ１６では回復不能であった。
[00198]図６Ｂは、グラフ形式で、コクサッキーウイルスＢ１に対するジーントラップ突然変異体細胞の感受性を示す。示すＭＯＩで細胞をウイルスと接触させ、そして３日後、ＭＴＴアッセイを用いて、生存度を測定した。ＰＬＡ２Ｇ１６内へのジーントラップ挿入は、コクサッキーウイルスＢ１による感染に対して細胞を感受性にし、そして細胞において野生型を発現することによって感受性は回復可能であったが、触媒的に不活性である突然変異体ＰＬＡ２Ｇ１６では回復不能であった。予期されるように、ポリオウイルス受容体内へのジーントラップ挿入は、コクサッキーウイルスＢ１に対する感受性に有意な影響は及ぼさない。
実施例１０：ＰＬＡ２Ｇ１６ノックダウンはライノウイルスに対する耐性を増加させる
[00199]ＰＬＡ２Ｇ１６のＲＮＡｉ仲介ノックダウンがライノウイルス感染を阻害する能力を、ＨｅＬａ細胞において研究した。ＰＬＡ２Ｇ１６をターゲットとする２つの異なるｓｉＲＮＡを用いて、ＰＬＡ２Ｇ１６発現をＨｅＬａ細胞において阻害し、そしてヒト・ライノウイルスＨＲＶ−２およびＨＲＶ−１４への曝露後、細胞が生存し、そして増殖する能力を調べた。ｓｉＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ ｓｉＲＮＡ ２２３２００、配列５’−ＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＧＡＣＡＡＡｔｔ−３’およびｓｉＲＮＡ ２１９７７、配列５’−ＧＵＡＣＣＡＧＧＵＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡｔｔ−３’であった。ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされていないかまたは対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞は、ヒト・ライノウイルスＨＲＶ−２およびＨＲＶ−１４による感染に非常に感受性であった（図７、左の２つのカラム）。ＨｅＬａ細胞においてＰＬＡ２Ｇ１６をノックダウンすると、ＨＲＶ−２およびＨＲＶ−１４の両方に対する耐性が有意に増加した（図７、右の２つのカラム）。ＰＬＡ２Ｇ１６をターゲティングするｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞は、ＨＲＶ−２およびＨＲＶ−１４への曝露後、生存し、そしてよく増殖することが可能であった。

Claims (71)

  1. ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤と細胞を接触させることを含む、細胞のウイルス感染を阻害する方法。
  2. ウイルスがピコルナウイルスである、請求項１の方法。
  3. ピコルナウイルスがエンテロウイルスである、請求項２の方法。
  4. ピコルナウイルスがコクサッキーウイルスである、請求項２の方法。
  5. ピコルナウイルスがヘパトウイルスである、請求項２の方法。
  6. ピコルナウイルスがライノウイルスである、請求項２の方法。
  7. 細胞が脊椎動物細胞である、請求項１の方法。
  8. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項１の方法。
  9. 細胞がヒト細胞である、請求項１の方法。
  10. 阻害剤がＰＬＡ２Ｇ１６の発現を阻害する、請求項１の方法。
  11. 阻害剤がＰＬＡ２Ｇ１６の酵素活性を阻害する、請求項１の方法。
  12. ウイルス感染の治療が必要な被験体にＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤を投与することを含む、被験体においてウイルス感染を治療する方法。
  13. ウイルス感染がピコルナウイルス感染である、請求項１２の方法。
  14. ピコルナウイルスがエンテロウイルスである、請求項１３の方法。
  15. ピコルナウイルスがコクサッキーウイルスである、請求項１３の方法。
  16. ピコルナウイルスがヘパトウイルスである、請求項１３の方法。
  17. ピコルナウイルスがライノウイルスである、請求項１３の方法。
  18. 被験体が脊椎動物である、請求項１２の方法。
  19. 被験体が哺乳動物である、請求項１２の方法。
  20. 被験体がヒトである、請求項１２の方法。
  21. 阻害剤がＰＬＡ２Ｇ１６の発現を阻害する、請求項１２の方法。
  22. 阻害剤がＰＬＡ２Ｇ１６の酵素活性を阻害する、請求項１２の方法。
  23. 候補抗ウイルス化合物を同定する方法であって：（ａ）ＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドおよび試験化合物を含む組成物を提供し；（ｂ）試験化合物がＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを阻害するかどうかを決定する工程を含み、ここで、化合物がＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを阻害する場合、化合物が候補抗ウイルス化合物として同定される、前記方法。
  24. 工程（ｂ）が、試験化合物がＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの発現を阻害するかどうかを決定することを含む、請求項２３の方法。
  25. 工程（ｂ）が、試験化合物がＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドの酵素活性を阻害するかどうかを決定することを含む、請求項２３の方法。
  26. 酵素活性がホスホリパーゼＡ２活性である、請求項２５の方法。
  27. 工程（ａ）の組成物が精製ＰＬＡ２Ｇ１６を含む細胞不含組成物であり；そして工程（ｂ）が、試験化合物がＰＬＡ２Ｇ１６の酵素活性を阻害するかどうかを決定する工程を含む、請求項２３の方法。
  28. 工程（ａ）の組成物がＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを発現する細胞を含み、そして工程（ｂ）が、試験化合物がＰＬＡ２Ｇ１６の発現または酵素活性を阻害するかどうかを決定することを含む、請求項２３の方法。
  29. 化合物がＰＬＡ２Ｇ１６ポリペプチドを阻害する場合、化合物がピコルナウイルスによるウイルス感染を阻害するのに有用な候補抗ウイルス化合物として同定される、請求項２３の方法。
  30. 化合物が細胞または被験体のウイルス感染を阻害する能力を評価することをさらに含む、請求項２３の方法。
  31. 細胞を化合物およびウイルスと接触させる工程をさらに含み、ここで細胞は化合物の非存在下でウイルスに感受性である、請求項２３の方法。
  32. 被験体に化合物を投与する工程をさらに含み、ここで被験体は化合物の非存在下でウイルスによる感染に感受性である、請求項２３の方法。
  33. ウイルスに感染した細胞と化合物を接触させる工程をさらに含む、請求項２３の方法。
  34. ウイルスに感染した被験体に化合物を投与する工程をさらに含む、請求項２３の方法。
  35. 候補抗ウイルス化合物を検証する方法であって：（ａ）請求項２３の方法にしたがって同定された候補抗ウイルス化合物を提供し；そして（ｂ）化合物がウイルスによる細胞または生物の感染を阻害するかどうかを決定する工程を含み、ここで化合物がウイルスによる細胞または生物の感染を阻害する場合、化合物が抗ウイルス化合物として検証される、前記方法。
  36. ウイルスがピコルナウイルスである、請求項３５の方法。
  37. （ａ）ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤；（ｂ）ウイルス；および（ｃ）細胞集団を含む、組成物。
  38. ウイルスが少なくとも０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で存在する、請求項３７の組成物。
  39. ウイルスがピコルナウイルスである、請求項３７の組成物。
  40. 細胞が培養されている、請求項３７の組成物。
  41. 細胞が脊椎動物細胞である、請求項３７の組成物。
  42. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項３７の組成物。
  43. 細胞がヒト細胞である、請求項３７の組成物。
  44. 細胞の少なくともいくつかがウイルスに感染している、請求項３７の組成物。
  45. ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤がＰＬＡ２Ｇ１６に結合する、請求項３７の組成物。
  46. ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤がＰＬＡ２Ｇ１６の発現を阻害する、請求項３７の組成物。
  47. ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤がＰＬＡ２Ｇ１６の酵素活性を阻害する、請求項３７の組成物。
  48. ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤が小分子である、請求項３７の組成物。
  49. ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤がウイルスによる細胞の感染を検出可能に阻害するのに十分な量で存在する、請求項３７の組成物。
  50. ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤を含む組成物であって、被験体におけるウイルス感染を治療するのに有用な、前記組成物。
  51. ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤がＰＬＡ２Ｇ１６に結合する、請求項５０の組成物。
  52. ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤がＰＬＡ２Ｇ１６の発現を阻害する、請求項５０の組成物。
  53. ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤がＰＬＡ２Ｇ１６の酵素活性を阻害する、請求項５０の組成物。
  54. ＰＬＡ２Ｇ１６阻害剤が小分子である、請求項５０の組成物。
  55. ウイルス感染がピコルナウイルス感染である、請求項５０の組成物。
  56. 被験体が脊椎動物である、請求項５０の組成物。
  57. 被験体が哺乳動物である、請求項５０の組成物。
  58. 被験体がヒトである、請求項５０の組成物。
  59. ＰＬＡ２Ｇ１６をコードする遺伝子中に突然変異を有する、近半数体（ｎｅａｒ−ｈａｐｌｏｉｄ）哺乳動物細胞。
  60. 細胞がＰＬＡ２Ｇ１６の突然変異体型を発現する、請求項５９の近半数体哺乳動物細胞。
  61. 細胞がＰＬＡ２Ｇ１６の突然変異体型を発現し、ここで突然変異体型が、非突然変異体型と比較した際、減少した触媒活性を有する、請求項６０の近半数体哺乳動物細胞。
  62. ウイルスによる感染に対して、増加した耐性を持つ非ヒト多細胞生物を同定する方法であって、生物が減少したＰＬＡ２Ｇ１６発現または活性を有するかどうか決定する工程を含み、ここで生物が減少したＰＬＡ２Ｇ１６発現または活性を有する場合、該生物がウイルスによる感染に対して、増加した耐性を有する、前記方法。
  63. ウイルスがピコルナウイルスである、請求項６２の方法。
  64. 生物が商業的に重要な脊椎動物である、請求項６２の方法。
  65. （ａ）機能ＰＬＡ２Ｇ１６が減少しているかまたは存在しない多細胞生物を提供し；そして（ｂ）該生物を農業および／または畜産において用いる工程を含む、方法。
  66. 生物が商業的に重要な脊椎動物である、請求項６５の方法。
  67. 生物が遺伝子改変されていない、請求項６５の方法。
  68. 生物が、機能ＰＬＡ２Ｇ１６が減少していないかまたは非存在でない生物に比較して、ピコルナウイルスによる感染に対して増加した耐性を有する、請求項６５の方法。
  69. 機能ＰＬＡ２Ｇ１６が減少しているかまたは存在しない農場動物であって、ウイルスによる感染に対して増加した耐性を有する、前記動物。
  70. ウイルスがピコルナウイルスである、請求項６９の農場動物。
  71. ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、またはシチメンチョウである、請求項６９の農場動物。
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