JP2010110254A - 共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子ノックアウトブタ - Google Patents
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Abstract
【課題】抗体医薬もしくは再生医療を目的としたトランスレーショナル医療研究において、ヒト細胞移植のレシピエントとして有利に使用することができ、ヒトに解剖学的、サイズ的に類似しているヒト動物モデルとして有用なcommonγ遺伝子ノックアウトブタを提供すること。
【解決手段】commonγ遺伝子のノックアウトを目的としたターゲッティングベクターをブタ体細胞に導入し、マーカー遺伝子の発現を指標として相同組換えが生じていると判定される体細胞を選択して、この体細胞の細胞核をブタの除核された卵子に注入した核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植して妊娠ブタを作製し、妊娠ブタから採取した胎児の体細胞核のcommonγ遺伝子がノックアウトされている胎児の体細胞を用いて再核移植を行い、commonγ遺伝子のヘテロ接合体ノックアウト雌ブタを得る。
【選択図】なし
【解決手段】commonγ遺伝子のノックアウトを目的としたターゲッティングベクターをブタ体細胞に導入し、マーカー遺伝子の発現を指標として相同組換えが生じていると判定される体細胞を選択して、この体細胞の細胞核をブタの除核された卵子に注入した核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植して妊娠ブタを作製し、妊娠ブタから採取した胎児の体細胞核のcommonγ遺伝子がノックアウトされている胎児の体細胞を用いて再核移植を行い、commonγ遺伝子のヘテロ接合体ノックアウト雌ブタを得る。
【選択図】なし
Description
本発明は、ブタ共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子（commonγ遺伝子）ノックアウトブタやその作製方法に関する。
共通サイトカイン受容体ガンマ鎖（commonγ）は、当初、ＩＬ−２受容体の３番目の構成要素として特定され（例えば、非特許文献１参照）、その後、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１の受容体の共通する構成要素であることが明らかとなった（例えば、非特許文献２〜７参照）。そのため共通サイトカイン受容体ガンマ鎖（γｃ）と呼ばれている。ガンマ鎖は、リンパ球のおおよそすべての細胞系列で検出され（例えば、非特許文献８参照）、細胞質内領域でガンマ鎖と結合したJanus familyチロシンキナーゼ３（Ｊａｋ３）が活性化することによってリンパ細胞系列の発達において必須な役割を担うことが明らかとなっている（例えば、非特許文献９〜１１参照）。commonγ鎖遺伝子は調べられているすべての哺乳動物種においてＸ染色体に位置することが確認されている。ヒトでは、この遺伝子が変異した結果、Ｔ細胞及びＮＫ細胞は欠如もしくは、顕著な減少を示し、Ｂ細胞は正常もしくは増加するが、Ｔ細胞による誘導の欠如や不足と内因性のＢ細胞の欠陥（例えば、非特許文献１２〜１４参照）のために機能不全となるＸ連鎖重症複合免疫不全症（ＸＳＣＩＤ）が発症する。さらに、commonγ遺伝子発現欠損マウスは、作製されており、Ｂ細胞が大幅に減少することを除いて、ヒトにおけるＸ連鎖重症複合免疫不全症と同様の表現型を持つことが示されている（例えば、非特許文献１５、１６参照）。
ブタの様な大型動物でのＸＳＣＩＤモデルは、マウスに比べて寿命が長く、ヒトに解剖学的、サイズ的に類似しているため、ヒトＸＳＣＩＤモデルとしてより妥当かつ有用なものに成り得るため、作製されることが期待されている。ＳＣＩＤ動物の、より興味深い応用は、生体内におけるヒト細胞学の研究が可能となることが予想されるヒト細胞移植のレシピエントとして使用することが挙げられる。抗体医薬もしくは再生医療を目的としたトランスレーショナル医療研究では、ヒトの胚性幹細胞及び骨髄や臍帯から得られた造血幹細胞(Hematopoietic Stem cells：ＨＳＣｓ)を含む体性幹細胞を移植し、生体内での分化能や腫瘍原性を解析するモデル動物として免疫不全マウスが多く用いられている。
様々な免疫不全マウスの品種が開発されたが、commonγ遺伝子を欠損させたことは、ヒト細胞移植片の生着の障害となるＮＫ細胞活性の抑制に繋がり、大きな進展となった。実際に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γc-nullマウスの進展を利用して、ヒト免疫機能の再構築とヒト型抗体類の生産は、ヒトＨＳＣｓの移植片により実現している（例えば、非特許文献１７〜２１参照）。そのような免疫不全マウスの利用は、試験的な細胞移植のための有用モデルではあるが、再生医療の前臨床判定には、サイズ、寿命、及び解剖学な特徴を考慮した場合、大型動物モデルが、ヒトに対する幹細胞移植治療を目的とした場合、不可欠である。同様に、ＳＣＩＤ動物生体内で分化させたヒト型抗体もしくはヒト細胞の臨床応用にも必要不可欠である。
上記のように、大型動物モデルは、齧歯動物モデルから得られた実験データとヒトへの臨床応用の間の橋渡し役として非常に貴重であることが挙げられるが、ウマでＸＳＣＩＤについての報告（例えば、非特許文献２２参照）があるものの、取り扱いが簡便な大型動物での報告はない。マウスでは、胚性幹（ＥＳ）細胞の樹立により、遺伝子標的組換え（ジーンターゲッティング）が可能となっているが、ブタでは、マウスのようなＥＳ細胞が樹立されておらず、ジーンターゲッティングが困難となって来ていた。このように大型動物モデルの利用は遺伝子操作、特にジーンターゲッティングが困難なため制限されてきたが、この１０年間で体細胞核移植によるクローン動物作製により、ブタの様な大型動物でもジーンターゲッティングを含むより正確で複雑な遺伝子操作が可能になってきている（例えば、特許文献１参照）。実際、遺伝子ノックアウトされたブタのいくつかの系統が核移植により作出されている（例えば、特許文献２〜４参照）。したがってブタは解剖学的、生理学的にヒトに類似しているため、ヒトの医学研究のためのモデルとして使用されることが予想される（例えば、非特許文献２３，２４参照）。
その他、常染色体に位置し、免疫グロブリンとＴ細胞レセプターの遺伝子再構成にかかわるエンドヌクレアーゼ活性を持つＲＡＧ（Recombination Activating Gene）には、ＲＡＧ１とＲＡＧ２があり、どちらかが、変異した場合、リンパ幹細胞でのＴ、Ｂ細胞抗原受容体の共通するＶ（Ｄ）Ｊ組換え機構の異常が生じて、両細胞の分化が阻害され、Ｔ細胞、Ｂ細胞ともに著減あるいは欠損することが知られている（例えば、非特許文献２５参照）。
その他、常染色体に位置し、免疫グロブリンとＴ細胞レセプターの遺伝子再構成にかかわるエンドヌクレアーゼ活性を持つＲＡＧ（Recombination Activating Gene）には、ＲＡＧ１とＲＡＧ２があり、どちらかが、変異した場合、リンパ幹細胞でのＴ、Ｂ細胞抗原受容体の共通するＶ（Ｄ）Ｊ組換え機構の異常が生じて、両細胞の分化が阻害され、Ｔ細胞、Ｂ細胞ともに著減あるいは欠損することが知られている（例えば、非特許文献２５参照）。
本発明の課題は、抗体医薬もしくは再生医療を目的としたトランスレーショナル医療研究において、ヒト細胞移植のレシピエントとして有利に使用することができ、ヒトに解剖学的、サイズ的に類似しているヒト医用モデル動物として有用なcommonγ遺伝子ノックアウトブタを提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、まず、ブタ品種間におけるcommonγ遺伝子における一塩基多型解析を行い、ベクターに使用するゲノムの品種と同じ品種の体細胞を揃えることが組換え効率向上の点で好ましいことを見い出して、新たにターゲッティングベクターｐＣＴＶ０５−Ｉを構築し、線状化してエレクトロポレーションによりブタ胎児線維芽細胞に導入し、薬剤耐性マーカー遺伝子の発現を指標として５９７個のコロニーを選択した。かかる選択した相同組換えが生じていると判定される体細胞、例えば、標的フラグメントを保持していることがＰＣＲ解析で確認された３個のＰＣＲ陽性コロニーであっても、非相同組換え体細胞が様々な割合で含まれている可能性があり、ただでさえ確率が低く困難な体細胞核移植技術を用いたクローンブタの作出効率を考慮すると、効率的な相同組換え動物の作出の妨げとなる要因はあらかじめすべて排除するという必要性に迫られた。陽性コロニーをドナー細胞として核移植に供したところ、核移植後、１３６５個が生存し、２日間の体外培養後、７６１個（５５．８％）が分割した。その分割胚７６１個を３頭の仮腹へ分けて移植した結果、２頭が妊娠した。妊娠した仮腹２頭は、妊娠４０〜５０日目で、屠殺し胎児を９頭回収した。その９頭をＰＣＲ解析した結果、正常にターゲッティングされている６頭が確認された。この相同組み換え個体であることが確認された６頭の胎児から線維芽細胞を分離し、ドナー細胞として再核移植に供したところ、核移植後、５２５５個が生存し、２日間の体外培養後、２４８２個（４７．２％）が分割した。その分割胚２４８２個を１２頭の仮腹へ分けて移植した結果、６頭が妊娠した。妊娠した６頭から３１頭が分娩され、４頭のcommonγ遺伝子のヘテロ接合体ノックアウト雌ブタの生存を実際に確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、［１］以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を備えた共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子のヘテロ接合体ノックアウト雌ブタの作製方法に関する。
（ａ）ブタ共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子（commonγ遺伝子）上における少なくとも一部の配列をマーカー遺伝子と置換するcommonγ遺伝子のノックアウトを目的としたターゲッティングベクターを構築する工程；
（ｂ）工程（ａ）で構築されたターゲッティングベクターを、エレクトロポレーション等により雌ブタ体細胞（胎児線維芽細胞）に導入し、マーカー遺伝子の発現を指標として相同組換えが生じていると判定される体細胞を選択する工程；
（ｃ）採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、工程（ｂ）で選択された体細胞の細胞核を注入し、該細胞核が注入された核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植して妊娠ブタを作製する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた妊娠ブタから胎児を採取し、その胎児の体細胞核のcommonγ遺伝子がノックアウトされている胎児を選択する工程；
（ｅ）採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、工程（ｄ）で選択された胎児の体細胞の細胞核を注入し、該細胞核が注入された核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植して妊娠ブタを作製する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で得られた妊娠ブタの産仔を育成する工程；
（ａ）ブタ共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子（commonγ遺伝子）上における少なくとも一部の配列をマーカー遺伝子と置換するcommonγ遺伝子のノックアウトを目的としたターゲッティングベクターを構築する工程；
（ｂ）工程（ａ）で構築されたターゲッティングベクターを、エレクトロポレーション等により雌ブタ体細胞（胎児線維芽細胞）に導入し、マーカー遺伝子の発現を指標として相同組換えが生じていると判定される体細胞を選択する工程；
（ｃ）採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、工程（ｂ）で選択された体細胞の細胞核を注入し、該細胞核が注入された核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植して妊娠ブタを作製する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた妊娠ブタから胎児を採取し、その胎児の体細胞核のcommonγ遺伝子がノックアウトされている胎児を選択する工程；
（ｅ）採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、工程（ｄ）で選択された胎児の体細胞の細胞核を注入し、該細胞核が注入された核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植して妊娠ブタを作製する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で得られた妊娠ブタの産仔を育成する工程；
また本発明は、［２］以下の（ａ’）〜（ｆ’）の工程を備えたことを特徴とする共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子のノックアウト雄ブタの作製方法に関する。
（ａ’）ブタ共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子（commonγ遺伝子）上における少なくとも一部の配列をマーカー遺伝子と置換するcommonγ遺伝子のノックアウトを目的としたターゲッティングベクターを構築する工程；
（ｂ’）工程（ａ’）で構築されたターゲッティングベクターを、エレクトロポレーション等により雄ブタ体細胞（胎児線維芽細胞）に導入し、マーカー遺伝子の発現を指標として相同組換えが生じていると判定される体細胞を選択する工程；
（ｃ’）採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、工程（ｂ’）で選択された体細胞の細胞核を注入し、該細胞核が注入された核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植して妊娠ブタを作製する工程；
（ｄ’）工程（ｃ’）で得られた妊娠ブタから胎児を採取し、その胎児の体細胞核のcommonγ遺伝子がノックアウトされている胎児を選択する工程；
（ｅ’）採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、工程（ｄ’）で選択された胎児の体細胞の細胞核を注入し、該細胞核が注入された核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植して妊娠ブタを作製する工程；
（ｆ’）工程（ｅ’）で得られた妊娠ブタの産仔を育成する工程；
（ａ’）ブタ共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子（commonγ遺伝子）上における少なくとも一部の配列をマーカー遺伝子と置換するcommonγ遺伝子のノックアウトを目的としたターゲッティングベクターを構築する工程；
（ｂ’）工程（ａ’）で構築されたターゲッティングベクターを、エレクトロポレーション等により雄ブタ体細胞（胎児線維芽細胞）に導入し、マーカー遺伝子の発現を指標として相同組換えが生じていると判定される体細胞を選択する工程；
（ｃ’）採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、工程（ｂ’）で選択された体細胞の細胞核を注入し、該細胞核が注入された核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植して妊娠ブタを作製する工程；
（ｄ’）工程（ｃ’）で得られた妊娠ブタから胎児を採取し、その胎児の体細胞核のcommonγ遺伝子がノックアウトされている胎児を選択する工程；
（ｅ’）採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、工程（ｄ’）で選択された胎児の体細胞の細胞核を注入し、該細胞核が注入された核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植して妊娠ブタを作製する工程；
（ｆ’）工程（ｅ’）で得られた妊娠ブタの産仔を育成する工程；
本発明はまた、［３］上記［１］記載の作製方法により得られた共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子（commonγ遺伝子）のヘテロ接合体ノックアウト雌ブタと、上記［２］記載の作製方法により得られたcommonγ遺伝子のノックアウト雄ブタとを掛け合わせて、その産仔からホモ接合体ノックアウト雌ブタを選択することを特徴とするcommonγ遺伝子のホモ接合体ノックアウト雌ブタの作製方法や、［４］ブタcommonγ遺伝子が、ブタランドレース種のＩＬ２ＲＧゲノム領域を含むＢＡＣライブラリーより分離したcommonγ遺伝子であることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載の作製方法や、［５］マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子であることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか記載の作製方法や、［６］ターゲッティングベクターが、ｐＣＴＶ０５−Ｉであるであることを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれか記載の作製方法に関する。
さらに本発明は、［７］共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子（commonγ遺伝子）の発現量が野生型に比べて消失もしくは低下していることを特徴とするブタや、［８］相同染色体上の少なくとも１つのcommonγ遺伝子座においてcommonγ遺伝子が破壊されている上記［７］記載のブタや、［９］commonγ遺伝子のヘテロ接合体ノックアウト雌ブタである上記［８］記載のブタや、［１０］commonγ遺伝子のノックアウト雄ブタである上記［８］記載のブタや、［１１］commonγ遺伝子のホモ接合体ノックアウト雌ブタである上記［８］記載のブタや、［１２］上記［７］〜［１１］のいずれか記載のブタの細胞や、［１３］上記［７］〜［１１］のいずれか記載のブタの組織・臓器や、［１４］上記［７］〜［１１］のいずれか記載のブタを幹細胞移植用のレシピエントとして使用する方法に関する。
本発明のcommonγ鎖遺伝子ノックアウトブタは、造血幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等のヒト幹細胞移植のためのレシピエントとして用いることができ、齧歯類モデルの限界を克服し、ヒト型抗体及び幹細胞移植の臨床応用に有益である。
本発明のcommonγ遺伝子のヘテロ接合体ノックアウト雌ブタの作製方法としては、上記の（ａ）〜（ｆ）の工程を備えた方法であれば特に制限されず、また、本発明のcommonγ遺伝子のノックアウト雄ブタの作製方法としては、上記の（ａ’）〜（ｆ’）の工程を備えた方法であれば特に制限されないが、commonγ遺伝子はＸ染色体に存在することから、性染色体がＸＹ型の雄ブタはＸ染色体を１本しか有さず、上記のcommonγ遺伝子のノックアウト雄ブタはホモ接合体と考えることができる。
上記工程（ａ）や（ａ’）は、ブタcommonγ遺伝子上における少なくとも一部の配列をマーカー遺伝子と置換するcommonγ遺伝子のノックアウトを目的としたターゲッティングベクターを構築する工程であり、ターゲッティングベクターの構築には、ブタのＩＬ−２受容体，ＩＬ−４受容体，ＩＬ−７受容体等のγ鎖のゲノム領域が用いられる。γ鎖のゲノム領域のＤＮＡフラグメントは、ブタゲノムライブラリーから、クローニング、さらに必要に応じてサブクローニングすることによって得られるが、γ鎖のコード領域を含むＢＡＣ（bacterial artificial chromosome）クローンを有利に用いることができる。例えば、ランドレース種由来ＢＡＣライブラリーから得られたコード領域を含むＤＮＡフラグメントの一部の配列をマーカー遺伝子と置換することで、commonγ遺伝子を不活性化するフラグメント（標的フラグメント）を得ることができ、この標的フラグメントを任意のベクターに導入するとターゲッティングベクターを得ることができる。ターゲッティングベクターとして、マーカー遺伝子としてＰＧＫ−ｎｅｏを有するｐＣＴＶ０５−Ｉを好適に例示することができる。
上記マーカー遺伝子としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、β−グルクロニダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素をコードするＤＮＡや、抗体のＦｃ領域をコードするＤＮＡや、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）等の蛍光発光タンパク質をコードするＤＮＡや、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ジフテリアトキシン耐性遺伝子、β−ｇａｌとｎｅｏRの融合遺伝子（β−ｇｅｏ）等の選択マーカー遺伝子などを具体的に挙げることができるが、これらの中でもＰＧＫ−ｎｅｏ：ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター／ネオマイシン抵抗遺伝子をコードするＤＮＡが好ましい。
上記工程（ｂ）や（ｂ’）は、工程（ａ）や（ａ’）で構築されたターゲッティングベクターを、ブタ胎児線維芽細胞等の体細胞に導入し、マーカー遺伝子の発現を指標として相同組換えが生じていると判定される体細胞を選択する工程であり、工程（ｂ）では雌ブタ体細胞が、工程（ｂ’）では雌ブタ体細胞が用いられる。ターゲッティングベクターは、導入前に線状化されることが好ましい。ターゲッティングベクターを体細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができるが、エレクトロポレーションやリポフェクションが好ましく、中でもエレクトロポレーションが好ましい。
ベクターを導入するブタ体細胞の種類は特に制限されないが、ベクターに使用するゲノムの品種と同じ品種の細胞を揃えることが組換え効率向上の点で好ましい。例えば、マーカー遺伝子としてＰＧＫ−ｎｅｏが用いられているときには、Ｇ４１８薬剤選択により相同組換えが生じていると判定されるＧ４１８耐性細胞コロニーを選択することができる。選択したＧ４１８耐性細胞コロニーが前記標的フラグメントを保持していることをＰＣＲ解析により確認しておくことが好ましい。また、体細胞として線維芽細胞を用いる場合、トリプシン処理で細胞を分散させたものが好ましく、また、培養細胞が線維芽細胞であることを、サイトケラチンとＳＳＥＡ−１との陰性反応、ビメンチンでの陽性反応、線維芽細胞の特異的プライマーによるＰＣＲ分析等により確認することが好ましい。
ベクターを導入するブタ体細胞の種類は特に制限されないが、ベクターに使用するゲノムの品種と同じ品種の細胞を揃えることが組換え効率向上の点で好ましい。例えば、マーカー遺伝子としてＰＧＫ−ｎｅｏが用いられているときには、Ｇ４１８薬剤選択により相同組換えが生じていると判定されるＧ４１８耐性細胞コロニーを選択することができる。選択したＧ４１８耐性細胞コロニーが前記標的フラグメントを保持していることをＰＣＲ解析により確認しておくことが好ましい。また、体細胞として線維芽細胞を用いる場合、トリプシン処理で細胞を分散させたものが好ましく、また、培養細胞が線維芽細胞であることを、サイトケラチンとＳＳＥＡ−１との陰性反応、ビメンチンでの陽性反応、線維芽細胞の特異的プライマーによるＰＣＲ分析等により確認することが好ましい。
上記工程（ｃ）や（ｃ’）は、採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子（レシピエント卵子）に、工程（ｂ）や（ｂ’）で選択された体細胞の細胞核（組換え体細胞核）を注入し、該細胞核が注入された核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植して妊娠ブタを作製する工程であり、上記レシピエント卵子としては、ブタの成熟卵子であれば特に制限されるものではなく、プロスタグランジンＦ２α、クロプロステノール、絨毛ゴナドトロピン等のホルモン投与による過排卵処理により得られる体内成熟卵子の他、屠場由来の卵巣から採取した卵子を体外成熟させたものも使用できるが、着床率の点からして体内成熟卵子、特に性成熟（６ヶ月齢以上）した雌ブタから採取した体内成熟卵子が好ましい。かかる体内成熟卵子は、過排卵処理により得られる雌ブタの子宮及び卵巣をＰＢＳ溶液等を用いて卵管灌流を行うことにより採取することができるが、卵丘細胞が付着している卵子はヒアルロニダーゼ処理を行って、卵丘細胞を除去することが好ましい。
上記ブタのレシピエント卵子からの除核は、細胞骨格形成阻害剤であるサイトカラシンＢ処理を施したブタの卵子から除核することが好ましく、より具体的にはサイトカラシンＢを含有するＮＣＳＵ２３等の培地で体外成熟卵子等のレシピエント卵子を処理した後、除核操作用シャーレのサイトカラシン入りドロップに移してホールディングピペットで保定し、透明帯を迅速・的確に貫通することができる除核用ピペット（外径１５〜３０μｍ）を用いて、Ｍ（metaphase）II期の染色体を含む第一極体の付近を極体ごと吸引することにより行われる。なお、吸引した極体を調べることにより除核できていることを確認することが好ましく、また除核卵子からはサイトカラシンＢを除去することが好ましい。
核移植に用いる工程（ｂ）や（ｂ’）で選択されたドナー細胞の細胞周期は特に制限されるものではないが、細胞周期Ｇ１／Ｇ０期に同調させた体細胞が好ましい。組換え体細胞核のレシピエント卵子への注入は直接注入（インジェクション）する体細胞核直接注入法を採用することが好ましい。上記体細胞核の除核されたレシピエント卵母細胞への直接導入は、体細胞核注入時に卵子の活性化を誘発せず、体細胞核が未受精卵子の細胞質内に存在する卵成熟促進因子（ＭＰＦ；Maturation Promoting Factor）の影響を受け、体細胞クローン作出に重要と報告される染色体凝縮（ＰＣＣ；Premature Chromosome Condensation）を起こすことになる。さらに、体細胞の細胞膜を崩壊させて実質的に体細胞核からなる画分を注入することがドナー細胞質の影響を排除して核移植胚の発生を良好にする点で好ましい。これに対して融合法による核の導入は、核の導入と同時に卵子に活性化を受け易く、ＰＣＣの過程を経ず胚発生が開始される恐れがあると同時に、体細胞の細胞質を伴って導入することになるので、細胞質による汚染に対して敏感であるブタのクローン作出においては好ましくない。また、体細胞核のインジェクションピペットとしては、透明帯の貫通が迅速・精確かつ簡単にでき、細胞質膜へのダメージを最小にすることができるものが好ましく、かかるインジェクションピペットとしてはピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック株式会社製）に取り付けた体細胞注入用ピペット（外径７〜２５μｍ）を具体的に例示することができる。
このようにして得られた体細胞核が注入された卵子には、活性化処理を施すことが好ましい。かかる活性化処理としては、従来公知の核移植胚の活性化処理方法であれば特に制限されるものではないが、クローンブタの作出においては電気パルス活性化処理を好適に例示することができる。電気パルス活性化処理としては、電荷の大きい１回の電気パルス、例えば１．５ｋＶ／ｃｍ、１００μｓｅｃ、１回を印加する方がそれより小さい電荷の電気パルスを２回印加するよりも胚活性の点で好ましく、また、電気パルス活性化処理後のサイトカラシンＢ処理における培地としてはＰＺＭ３（Biol. Reprod., 66, 112-119, 2002）を用いることが高い胚盤胞形成率の点で好ましい。また、電気パルスによる活性化処理の場合、体内成熟卵子の方が体外成熟卵子に比べて胚盤胞の発生能の点で好ましい。さらに、レシピエント細胞として体内成熟卵子を用いる場合には、過排卵処理のために使用した最初のｈＣＧ投与後、５０〜６０時間後、好ましくは５４〜５５時間後に活性化処理をすることが望ましい。体外成熟卵子を用いた場合は、成熟培養開始後４４〜６０時間後、好ましくは４８〜５４時間後に活性化処理することが望ましい。
卵細胞からの除核時及び該除核細胞への組換え体細胞核の直接注入時の２回にわたって損傷を受けた核移植胚の胚盤胞への発生率を高め、クローンブタを効率よく作出するために、活性化処理後の核移植胚は、卵管又は子宮への移植前に、包埋剤により包埋処理を施こすことができる。かかる包埋剤による包埋処理は、複数回の包埋処理を行い、複数被膜で包埋した核移植胚とすることが好ましく、特に３重包埋処理を行い、３重被膜核移植胚とすることが好ましい。また、かかる複数回の包埋処理を行うに際しては、包埋剤の濃度を順次高めていく包埋処理、すなわち外層膜ほど高濃度の包埋剤を用いて包埋し、その物理的強度を内層から外層へと順次高めていくことが好ましい。このような包埋処理の詳細については前記特許文献３や４を参照することができる。
核移植胚、例えば活性化処理後に包埋剤による包埋処理をした核移植胚を卵管又は子宮に移植する雌ブタとしては特に制限されるものではないが、人工授精させた後の妊娠２１〜４０日目にプロスタグランジンＦ２α等を用いて人工流産させ、同期化を行った雌ブタを用いることが好ましい。また、核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植するに際し、複数個の受精卵もしくは単為発生胚を核移植胚に混合して雌ブタの卵管又は子宮に移植する追い移植法を用いることが好ましい。
上記工程（ｄ）や（ｄ’）は、工程（ｃ）や（ｃ’）で得られた妊娠ブタから胎児を採取し、その胎児の体細胞核のcommonγ遺伝子がノックアウトされている胎児を選択する工程であり、上記胎児に代えて産仔を用いることもできるが胎児の方が早期に得られることから産仔よりも好ましく、上記胎児には便宜上産仔も含まれる。上記工程（ｂ）や（ｂ’）において、マーカー遺伝子の発現を指標として選択した、相同組換えが生じていると判定される体細胞、例えば、標的フラグメントを保持していることがＰＣＲ解析で確認されたＰＣＲ陽性コロニーであっても、非相同組換え体細胞が様々な割合で含まれている可能性があり、ただでさえ確率が低く困難な体細胞核移植技術を用いたクローンブタの作出効率を考慮すると、効率的な相同組換え動物の作出の妨げとなる要因はあらかじめすべて排除しておくことが本発明の特徴の一つであり、そこで、単一な相同組換え細胞のみの集団を得るため、妊娠した雌ブタの胎児を採取し、採取した胎児から線維芽細胞等の体細胞を分離すると同時にゲノムＤＮＡを採取し、相同組み換え個体であり、前記標的フラグメントを保持していることをＰＣＲ解析により確認することにより、胎児の体細胞核のcommonγ遺伝子がノックアウトされている胎児を選択することができる。ＰＣＲ解析にて陽性であった胎児細胞を以下の工程（ｅ）や（ｅ’）に用いて再核移植を実施し、胚移植によりcommonγノックアウトクローン個体の作出に供することができる。
上記工程（ｅ）や（ｅ’）は、採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、工程（ｄ）や（ｄ’）で選択された胎児の体細胞の細胞核を注入し、該細胞核が注入された核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植して妊娠ブタを作製する工程であり、この工程（ｅ）や（ｅ’）は、相同組み換え個体と確認された体細胞核を用いることを除き、上記工程（ｃ）や（ｃ’）と同様に実施することができる。
上記工程（ｆ）や（ｆ’）は、工程（ｅ）や（ｅ’）で得られた妊娠ブタの産仔を育成する工程であり、工程（ｆ）によりcommonγ遺伝子のヘテロ接合体ノックアウト雌ブタが得られ、工程（ｆ’）によりcommonγ遺伝子のノックアウト雄ブタが得られる。得られた産仔がcommonγ遺伝子のヘテロ接合体ノックアウト雌ブタや、commonγ遺伝子のノックアウト雄ブタであることを確認することが好ましい。例えば、得られた産子より採取した細胞又は組織（耳）からゲノムＤＮＡを抽出し、標的フラグメントが含まれていることをサザンブロット解析により確認することが好ましい。また、得られた産子より採取した細胞又は組織（耳）から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲを行って、commonγのｍＲＮＡの発現量に基づいて確認することが好ましい。
次に本発明のcommonγ遺伝子のホモ接合体ノックアウト雌ブタの作製方法としては、上記の本発明のcommonγ遺伝子のヘテロ接合体ノックアウト雌ブタと、上記の本発明のcommonγ遺伝子のノックアウト雄ブタとを掛け合わせて、その産仔からホモ接合体ノックアウト雌ブタを選択する方法であれば特に制限されないが、かかるcommonγ遺伝子のホモ接合体ノックアウト雌ブタはメンデルの法則に従って生まれてくる産仔からゲノムＤＮＡを抽出し、標的フラグメントが含まれていることをサザンブロット解析により確認することにより、また、得られた産子より採取した細胞又は組織（耳）から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲを行って、commonγのｍＲＮＡが発現していないことを確認することにより選択することができる。
本発明のcommonγ遺伝子の発現量が野生型に比べて消失もしくは低下しているブタとしては、相同染色体上の少なくとも１つのcommonγ遺伝子座においてcommonγ遺伝子が破壊されているブタを挙げることができ、具体的には、commonγ遺伝子のヘテロ接合体ノックアウト雌ブタや、commonγ遺伝子のノックアウト雄ブタや、commonγ遺伝子のホモ接合体ノックアウト雌ブタを挙げることができ、これら本発明のcommonγ遺伝子ノックアウトブタと総称されるブタには、その後代（子孫）も含まれる。そして、本発明のcommonγ遺伝子ノックアウトブタは、さらなる改良ブタ、例えば、本発明のcommonγ遺伝子ノックアウトブタの体細胞核を相同組換えすることにより得られる他の免疫関連遺伝子（例えばＲＡＧ２遺伝子ノックアウト等）とのダブルノックアウト改変ブタの作製や、他の免疫関連遺伝子（例えばＲＡＧ２遺伝子ノックアウト等）改変ブタとの交配によるダブルノックアウト改変ブタの作製に用いることができる。
例えば、ブタＲＡＧ２遺伝子上における少なくとも一部の配列をマーカー遺伝子と置換するＲＡＧ２遺伝子のノックアウトを目的としたターゲッティングベクターの構築には、ブタのＲＡＧ２のゲノム領域が用いられる。ゲノム領域のＤＮＡフラグメントは、ブタゲノムライブラリーから、クローニング、さらに必要に応じてサブクローニングすることによって得られるが、ＲＡＧ２のコード領域を含むＢＡＣクローンを有利に用いることができる。例えば、ランドレース種由来ＢＡＣライブラリーから得られたコード領域を含むＤＮＡフラグメントの一部の配列をマーカー遺伝子と置換することで、ＲＡＧ２遺伝子を不活性化するフラグメント（標的フラグメント）を得ることができ、この標的フラグメントを任意のベクターに導入するとターゲッティングベクターを得ることができる。ターゲッティングベクターとして、マーカー遺伝子としてＰＧＫ−ｐｕｒｏｐＡを有するＲａｇ２ＴＶ０６−ＩＩを好適に例示することができる。このようなターゲッティングベクターを用いて、本発明のcommonγ遺伝子ノックアウトブタの作製方法に準じることにより、ＲＡＧ２遺伝子の発現量が野生型に比べて消失もしくは低下しているブタや、相同染色体上の少なくとも１つのＲＡＧ２遺伝子座においてＲＡＧ２遺伝子が破壊されているブタや、ＲＡＧ２遺伝子のヘテロ接合体ノックアウトブタや、ＲＡＧ２遺伝子のホモ接合体ノックアウトブタや、commonγ遺伝子・ＲＡＧ２遺伝子ダブルノックアウトブタや、それらノックアウトブタ由来の細胞や組織・臓器を得ることができる。
例えば、ブタＲＡＧ２遺伝子上における少なくとも一部の配列をマーカー遺伝子と置換するＲＡＧ２遺伝子のノックアウトを目的としたターゲッティングベクターの構築には、ブタのＲＡＧ２のゲノム領域が用いられる。ゲノム領域のＤＮＡフラグメントは、ブタゲノムライブラリーから、クローニング、さらに必要に応じてサブクローニングすることによって得られるが、ＲＡＧ２のコード領域を含むＢＡＣクローンを有利に用いることができる。例えば、ランドレース種由来ＢＡＣライブラリーから得られたコード領域を含むＤＮＡフラグメントの一部の配列をマーカー遺伝子と置換することで、ＲＡＧ２遺伝子を不活性化するフラグメント（標的フラグメント）を得ることができ、この標的フラグメントを任意のベクターに導入するとターゲッティングベクターを得ることができる。ターゲッティングベクターとして、マーカー遺伝子としてＰＧＫ−ｐｕｒｏｐＡを有するＲａｇ２ＴＶ０６−ＩＩを好適に例示することができる。このようなターゲッティングベクターを用いて、本発明のcommonγ遺伝子ノックアウトブタの作製方法に準じることにより、ＲＡＧ２遺伝子の発現量が野生型に比べて消失もしくは低下しているブタや、相同染色体上の少なくとも１つのＲＡＧ２遺伝子座においてＲＡＧ２遺伝子が破壊されているブタや、ＲＡＧ２遺伝子のヘテロ接合体ノックアウトブタや、ＲＡＧ２遺伝子のホモ接合体ノックアウトブタや、commonγ遺伝子・ＲＡＧ２遺伝子ダブルノックアウトブタや、それらノックアウトブタ由来の細胞や組織・臓器を得ることができる。
また、本発明のcommonγ遺伝子ノックアウトブタの細胞や組織・臓器も本発明の対象であり、かかる細胞や組織・臓器は上記のダブルノックアウト改変ブタの作製における供試体細胞源として有用であり、さらに、本発明のcommonγ遺伝子ノックアウトブタは、造血幹細胞，ＥＳ細胞，ｉＰＳ細胞等のヒトを含めた各種幹細胞の移植用のレシピエントとして使用することができ、再生医療等におけるトランスレーショナルリサーチ用のレシピエントとして利用すると、ヒト等の抗体や細胞、組織などを得ることができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［commonγＫＯクローンブタの作出］
１）旧ターゲッティングベクターの構造（ベクター名：pγcTVneo）
pγcTVneoベクターの作製のためのＩＬ２ＲＧ(ACCESSION No. AB092652)ゲノム領域（６６Ｃ３）を含むＢＡＣクローンは、ブタＬＷＤ(ランドレース×大ヨークシャー×デュロック)三元交雑種のＢＡＣライブラリーより分離した（Suzuki, K. et al. Construction and evaluation of a porcine bacterial artificial chromosome library. Animal genetics 31, 8-12 (2000)）。pγcTVneoベクターは、図１に示したように、５’側相同領域は、５’側エクソン１隣接領域７．９Ｋｂ、３’側相同領域はエクソン４及び５にかかる１．５ｋｂで作製した。
１）旧ターゲッティングベクターの構造（ベクター名：pγcTVneo）
pγcTVneoベクターの作製のためのＩＬ２ＲＧ(ACCESSION No. AB092652)ゲノム領域（６６Ｃ３）を含むＢＡＣクローンは、ブタＬＷＤ(ランドレース×大ヨークシャー×デュロック)三元交雑種のＢＡＣライブラリーより分離した（Suzuki, K. et al. Construction and evaluation of a porcine bacterial artificial chromosome library. Animal genetics 31, 8-12 (2000)）。pγcTVneoベクターは、図１に示したように、５’側相同領域は、５’側エクソン１隣接領域７．９Ｋｂ、３’側相同領域はエクソン４及び５にかかる１．５ｋｂで作製した。
２）新ターゲッティングベクターの構造(ベクター名：pCTV05-Ｉ)
ＩＬ２ＲＧ(ACCESSION No. AB092652)ゲノム領域（Ｌ２７４Ｇ２２）を含むＢＡＣクローンは、ブタランドレース種のＢＡＣライブラリーより分離した（Animal genetics 31, 8-12 (2000)）。pBluescriptIIのEcoRIサイトにＢＡＣクローンからＩＬ２ＲＧ遺伝子のエクソン７、イントロン７、エクソン８とその３’側隣接領域を含む１０ｋｂのEcoRI断片をサブクローニングした。この断片の３’側末端領域の約４００ｂｐの塩基配列を調べ、サザンブロット解析のための３’プローブを設計した。このサブクローンの３’側末端の１ｋｂを、AatII及びSalIによる切断の後に平滑末端化及びセルフライゲーションすることによって除去し、３’側相同領域となる９ｋｂが組み込まれたプラスミドを作製した。イントロン４、エクソン５及びイントロン５を含む５’側相同領域の約１ｋｂは、５’側にSalI もしくは XhoIサイトが含まれるプライマー(Gcint4F1XhoI : 5’- ACA TCT CGA GGA TTC CCA GCT CCT ATT CTC - 3’及びGcint5R1SalI : 5’- TAG AGT CGA CTG CCC TTA CTG TAT GCC AGC- 3 ’) ［配列番号１及び２］を用いてＢＡＣのＤＮＡからＰＣＲ増幅により作製した。SalIとXhoIにより増幅したＤＮＡ断片を消化し、ｐＫＪ２（Boer, P.H. et al. Polymorphisms in the coding and noncodingregions of murine Pgk-1 alleles. Biochemical genetics 28, 299-308 (1990)）から得られたPGK-neo-p(A)カセットを含むpBluescriptのXhoIサイトに挿入した。その後、HindIIIサイトをSalIサイトに転換したpMC1-Dtp-(A)（Taniguchi, M. et al. Disruption of semaphorinIII/D gene causes severe abnormality in peripheral nerve projection. Neuron 19, 519-530 (1997)）から切り出した MC1-DTA-p(A)カセットのXhoI/SalI断片を、５’側相同領域とPGK-neo-p(A)カセットを含むプラスミドのXhoIサイトに導入した。得られたプラスミドは、EcoRIとNotIにより３つの断片に消化し、pBluescriptを除く２つの断片を上で作製した３’相同領域と適切に順番に１つずつ連結し、その後、３’相同領域に５’末端に存在するEcoRIサイトを破壊した。最終的なターゲッティング構造は、PGK-neo-p(A)カセットの両側に位置するゲノムＩＬ２ＲＧ塩基配列の９Ｋｂ３’相同領域、１Ｋｂ５’相同領域及び図１に示したように５’相同領域の外側にある、MC1-DTA-p(A)カセットが含まれている。このターゲッティングベクター(ベクター名：pCTV05-I)はエレクトロポレーションによる遺伝子導入の前にNotI制限酵素消化で直線化した。
ＩＬ２ＲＧ(ACCESSION No. AB092652)ゲノム領域（Ｌ２７４Ｇ２２）を含むＢＡＣクローンは、ブタランドレース種のＢＡＣライブラリーより分離した（Animal genetics 31, 8-12 (2000)）。pBluescriptIIのEcoRIサイトにＢＡＣクローンからＩＬ２ＲＧ遺伝子のエクソン７、イントロン７、エクソン８とその３’側隣接領域を含む１０ｋｂのEcoRI断片をサブクローニングした。この断片の３’側末端領域の約４００ｂｐの塩基配列を調べ、サザンブロット解析のための３’プローブを設計した。このサブクローンの３’側末端の１ｋｂを、AatII及びSalIによる切断の後に平滑末端化及びセルフライゲーションすることによって除去し、３’側相同領域となる９ｋｂが組み込まれたプラスミドを作製した。イントロン４、エクソン５及びイントロン５を含む５’側相同領域の約１ｋｂは、５’側にSalI もしくは XhoIサイトが含まれるプライマー(Gcint4F1XhoI : 5’- ACA TCT CGA GGA TTC CCA GCT CCT ATT CTC - 3’及びGcint5R1SalI : 5’- TAG AGT CGA CTG CCC TTA CTG TAT GCC AGC- 3 ’) ［配列番号１及び２］を用いてＢＡＣのＤＮＡからＰＣＲ増幅により作製した。SalIとXhoIにより増幅したＤＮＡ断片を消化し、ｐＫＪ２（Boer, P.H. et al. Polymorphisms in the coding and noncodingregions of murine Pgk-1 alleles. Biochemical genetics 28, 299-308 (1990)）から得られたPGK-neo-p(A)カセットを含むpBluescriptのXhoIサイトに挿入した。その後、HindIIIサイトをSalIサイトに転換したpMC1-Dtp-(A)（Taniguchi, M. et al. Disruption of semaphorinIII/D gene causes severe abnormality in peripheral nerve projection. Neuron 19, 519-530 (1997)）から切り出した MC1-DTA-p(A)カセットのXhoI/SalI断片を、５’側相同領域とPGK-neo-p(A)カセットを含むプラスミドのXhoIサイトに導入した。得られたプラスミドは、EcoRIとNotIにより３つの断片に消化し、pBluescriptを除く２つの断片を上で作製した３’相同領域と適切に順番に１つずつ連結し、その後、３’相同領域に５’末端に存在するEcoRIサイトを破壊した。最終的なターゲッティング構造は、PGK-neo-p(A)カセットの両側に位置するゲノムＩＬ２ＲＧ塩基配列の９Ｋｂ３’相同領域、１Ｋｂ５’相同領域及び図１に示したように５’相同領域の外側にある、MC1-DTA-p(A)カセットが含まれている。このターゲッティングベクター(ベクター名：pCTV05-I)はエレクトロポレーションによる遺伝子導入の前にNotI制限酵素消化で直線化した。
３）胎児線維芽細胞の採取
ランドレース（雌）×大ヨークシャー（雄）で交配後、妊娠６２日目の胎児を採取した。採取した胎児は、ハサミで筋肉組織を採取し、細切した。細切した胎児組織１ｇ当たり１０ｍｌの０．２５％トリプシン−０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液に懸濁し、一晩冷蔵した（４℃）。遠心処理（１５００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）により上清を除去した後、３７℃に保温したウォーターバスにて２０〜３０分間処理した。保温処理後、胎児組織１ｇ当たり１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを加えてピペッティングし、セルストイレーナーにて濾過した。濾過液を遠心後、上清を除去し、沈殿物に１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを添加して再懸濁した。細胞数を計測し、適当量になるようＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにて調整した後、７５ｃｍ２細胞培養用フラスコに播いた。その播いた細胞は、３７℃で５％ＣＯ２でコンフルエントになるまで培養し、以下のエレクトロポレーションによる遺伝子導入に用いた。
ランドレース（雌）×大ヨークシャー（雄）で交配後、妊娠６２日目の胎児を採取した。採取した胎児は、ハサミで筋肉組織を採取し、細切した。細切した胎児組織１ｇ当たり１０ｍｌの０．２５％トリプシン−０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液に懸濁し、一晩冷蔵した（４℃）。遠心処理（１５００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）により上清を除去した後、３７℃に保温したウォーターバスにて２０〜３０分間処理した。保温処理後、胎児組織１ｇ当たり１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを加えてピペッティングし、セルストイレーナーにて濾過した。濾過液を遠心後、上清を除去し、沈殿物に１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを添加して再懸濁した。細胞数を計測し、適当量になるようＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにて調整した後、７５ｃｍ２細胞培養用フラスコに播いた。その播いた細胞は、３７℃で５％ＣＯ２でコンフルエントになるまで培養し、以下のエレクトロポレーションによる遺伝子導入に用いた。
４）遺伝子導入とＧ４１８薬剤選択（commonγＫＯ細胞の作出）
分離及び増殖した胎児線維芽細胞は、０．２５％トリプシン−０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液で剥離させ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにて懸濁した。細胞懸濁液を遠心処理（１５００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）した後、上清を除去し、冷ＨＢＳに再懸濁した。再懸濁液は、再度遠心処理を行って上清を除去した。細胞数が２．５×１０７cells／ｍｌになるようにＨＢＳにて調整した。キュベットに細胞溶液０．４ｍｌ（１．０×１０７cells／ｍｌ）と１００μｌの調整済みＤＮＡ液（５ｎＭの直線化したターゲッティングベクターを添加，図１）を加えた後、良く混和した。遺伝子導入には、電気穿孔法装置を３００Ｖ，９５０μＦ，抵抗∞の条件のパルスにて行った。パルス付加後、１０分間室温にて静置した。静置した細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに懸濁後、３枚の１０ｃｍシャーレに分けて培養した。パルス後４８時間目に８００μｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｇ４１８）を培養液に添加し、Ｇ４１８耐性細胞株を選別した。７〜１２日間薬剤選択後、Ｇ４１８耐性細胞コロニーを濾紙ディスクにより分離させ、２４穴細胞培養用ディッシュに移した。移した細胞がコンフルエントに達した後、トリプシン処理により剥離させた。剥離させた細胞の半分をＰＣＲ分析に用い、残りはそのまま残して培養した。
分離及び増殖した胎児線維芽細胞は、０．２５％トリプシン−０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液で剥離させ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにて懸濁した。細胞懸濁液を遠心処理（１５００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）した後、上清を除去し、冷ＨＢＳに再懸濁した。再懸濁液は、再度遠心処理を行って上清を除去した。細胞数が２．５×１０７cells／ｍｌになるようにＨＢＳにて調整した。キュベットに細胞溶液０．４ｍｌ（１．０×１０７cells／ｍｌ）と１００μｌの調整済みＤＮＡ液（５ｎＭの直線化したターゲッティングベクターを添加，図１）を加えた後、良く混和した。遺伝子導入には、電気穿孔法装置を３００Ｖ，９５０μＦ，抵抗∞の条件のパルスにて行った。パルス付加後、１０分間室温にて静置した。静置した細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに懸濁後、３枚の１０ｃｍシャーレに分けて培養した。パルス後４８時間目に８００μｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｇ４１８）を培養液に添加し、Ｇ４１８耐性細胞株を選別した。７〜１２日間薬剤選択後、Ｇ４１８耐性細胞コロニーを濾紙ディスクにより分離させ、２４穴細胞培養用ディッシュに移した。移した細胞がコンフルエントに達した後、トリプシン処理により剥離させた。剥離させた細胞の半分をＰＣＲ分析に用い、残りはそのまま残して培養した。
５）ＰＣＲ解析によるターゲッティングの検出
細胞は、２００ｇ／ｍｌのプロテナーゼＫが含む５０μｌの超純水に再懸濁し、５５℃で３時間保温した後、９５℃１０分間加熱してプロテナーゼを失活させた。ＰＣＲ分析は、２０μｌ量の反応液中に消化した５０μｌのサンプルから鋳型として１μｌを採取してAmpliTaqGoldを用いて実施した。ＰＣＲサイクルのパラメーターは、最初に９４℃を１０分間後、９４℃、３０秒、５８℃を２５秒、７２℃を１分１５秒の１サイクルを３５サイクルで行い、最後に７２℃、７分間処理した。プライマーはＦＰ１(5’- GCC TGC TCT TTA CTG AAG GC -3’) ［配列番号３］及びＧｃｉｎｔ４Ｆ(5’- CAA TCA GTC CAG TAG GAA GG -3’) ［配列番号４］を用いた。このプライマーは、１．１ｋｂの変異アレル特異的な産物を設定した。精製したＤＮＡに対するＰＣＲは、鋳型として１００ｎｇの精製ＤＮＡを使用した点を除いて同様に実施した。
細胞は、２００ｇ／ｍｌのプロテナーゼＫが含む５０μｌの超純水に再懸濁し、５５℃で３時間保温した後、９５℃１０分間加熱してプロテナーゼを失活させた。ＰＣＲ分析は、２０μｌ量の反応液中に消化した５０μｌのサンプルから鋳型として１μｌを採取してAmpliTaqGoldを用いて実施した。ＰＣＲサイクルのパラメーターは、最初に９４℃を１０分間後、９４℃、３０秒、５８℃を２５秒、７２℃を１分１５秒の１サイクルを３５サイクルで行い、最後に７２℃、７分間処理した。プライマーはＦＰ１(5’- GCC TGC TCT TTA CTG AAG GC -3’) ［配列番号３］及びＧｃｉｎｔ４Ｆ(5’- CAA TCA GTC CAG TAG GAA GG -3’) ［配列番号４］を用いた。このプライマーは、１．１ｋｂの変異アレル特異的な産物を設定した。精製したＤＮＡに対するＰＣＲは、鋳型として１００ｎｇの精製ＤＮＡを使用した点を除いて同様に実施した。
６）ホルモン処理による採卵方法
ランドレース（Ｌ）及びランドレース、大ヨークシャー（Ｗ）、デュロック（Ｄ）の三元交雑種（ＬＷＤ）の生後１６０〜１９４日齢の春機発動前の雌ブタを用いた。供試ブタにｅＣＧ(ピーメックス、三共)を１５００ＩＵ投与し、その７２時間後にｈＣＧ(プペローゲン、三共)を５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与４８時間後に屠殺し、卵巣、卵管、子宮の結合組織を摘出した。また、性成熟に達した雌ブタからの採卵は、予め発情時に雄希釈精液を用いて人工授精を行い、妊娠２１〜５０日後に流産処置し行った。核移植予定５日前にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロール約０．２ｍｇ（プラネート、武田：２ｍｌ量）を臀部筋肉内に投与した。その２４時間後に、同様にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にｅＣＧ（ピーメックス、三共）を臀部筋肉内に１５００ＩＵ投与した。ＰＧＦ２α＋ｅＣＧ投与７２時間後にｈＣＧ（プペローゲン、三共）を５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与４６時間後に屠殺し、卵巣、卵管、子宮の結合組織を摘出した。
ランドレース（Ｌ）及びランドレース、大ヨークシャー（Ｗ）、デュロック（Ｄ）の三元交雑種（ＬＷＤ）の生後１６０〜１９４日齢の春機発動前の雌ブタを用いた。供試ブタにｅＣＧ(ピーメックス、三共)を１５００ＩＵ投与し、その７２時間後にｈＣＧ(プペローゲン、三共)を５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与４８時間後に屠殺し、卵巣、卵管、子宮の結合組織を摘出した。また、性成熟に達した雌ブタからの採卵は、予め発情時に雄希釈精液を用いて人工授精を行い、妊娠２１〜５０日後に流産処置し行った。核移植予定５日前にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロール約０．２ｍｇ（プラネート、武田：２ｍｌ量）を臀部筋肉内に投与した。その２４時間後に、同様にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にｅＣＧ（ピーメックス、三共）を臀部筋肉内に１５００ＩＵ投与した。ＰＧＦ２α＋ｅＣＧ投与７２時間後にｈＣＧ（プペローゲン、三共）を５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与４６時間後に屠殺し、卵巣、卵管、子宮の結合組織を摘出した。
７）体内成熟卵子の準備
摘出した卵巣、卵管、子宮の結合組織を直ちに実験室に持ち帰り、灌流液（ＰＢＳ：Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含、TAKARA ＋０．１％ウシ血清アルブミン：ＢＳＡ， Sigma, Cat. No. A-4503 ＋１００ｍｌ辺り１ｍｌ添加抗生物質: Antibiotic, ntimycotic, Sigma, A-7292）で卵管を灌流し、卵子を採取した。得られた卵子は０．１％ヒアルロニダーゼを含む、灌流液を用いて卵丘細胞を裸化し、卵細胞質の均一な卵子を選抜した後、ヒアルロニダーゼを含まない灌流液中で洗浄した。その後、ＰＺＭ−３液（Yoshioka, K., Suzuki, C., Tanaka, A., Anas, I.M. & Iwamura, S. Birth of piglets derived from porcine zygotes cultured in a chemically defined medium. Biology of reproduction 66, 112-119 (2002)）を用いてインキュベーター（３８．５℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２）内で供試するまで体外培養を行った。
摘出した卵巣、卵管、子宮の結合組織を直ちに実験室に持ち帰り、灌流液（ＰＢＳ：Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含、TAKARA ＋０．１％ウシ血清アルブミン：ＢＳＡ， Sigma, Cat. No. A-4503 ＋１００ｍｌ辺り１ｍｌ添加抗生物質: Antibiotic, ntimycotic, Sigma, A-7292）で卵管を灌流し、卵子を採取した。得られた卵子は０．１％ヒアルロニダーゼを含む、灌流液を用いて卵丘細胞を裸化し、卵細胞質の均一な卵子を選抜した後、ヒアルロニダーゼを含まない灌流液中で洗浄した。その後、ＰＺＭ−３液（Yoshioka, K., Suzuki, C., Tanaka, A., Anas, I.M. & Iwamura, S. Birth of piglets derived from porcine zygotes cultured in a chemically defined medium. Biology of reproduction 66, 112-119 (2002)）を用いてインキュベーター（３８．５℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２）内で供試するまで体外培養を行った。
８）屠場卵巣由来卵胞卵子の採卵方法
屠場にて食肉用として屠殺された春機発動前の未経産雌ブタより卵巣を採取し、ＰＢＳ（−）液にて３５℃保温下で研究室に持ち帰った。持ち帰った卵巣は直ちに、３７℃に保温したＰＢＳ（−）にて洗浄し、卵巣結合組織を除去した後、採卵作業を行った。直径３〜６ｍｍの卵胞を選び、１６Ｇ注射針付き１０ｍｌシリンジで吸引した。吸引した卵胞液は、５０ｍｌディスポチューブに回収し、５分以上室温放置後、上清を除去した。卵子が含まれる沈殿物に対し、ＴＡＬＰ−Ｈｅｐｅｓ液を加えて懸濁後、沈殿物がチューブの底に溜まったのを確認し、沈殿物を吸引しないよう、パスツールピペットにて上清を除去した。この洗浄操作を２〜３回繰り返した。卵丘細胞が３層以上密に付着した卵丘細胞卵子複合体（ＣＯＣ）とＣＯＣに壁側顆粒層細胞が付着した壁側顆粒層細胞−卵丘細胞卵子複合体（ＧＣＯＣ）を選別・採卵をした。
屠場にて食肉用として屠殺された春機発動前の未経産雌ブタより卵巣を採取し、ＰＢＳ（−）液にて３５℃保温下で研究室に持ち帰った。持ち帰った卵巣は直ちに、３７℃に保温したＰＢＳ（−）にて洗浄し、卵巣結合組織を除去した後、採卵作業を行った。直径３〜６ｍｍの卵胞を選び、１６Ｇ注射針付き１０ｍｌシリンジで吸引した。吸引した卵胞液は、５０ｍｌディスポチューブに回収し、５分以上室温放置後、上清を除去した。卵子が含まれる沈殿物に対し、ＴＡＬＰ−Ｈｅｐｅｓ液を加えて懸濁後、沈殿物がチューブの底に溜まったのを確認し、沈殿物を吸引しないよう、パスツールピペットにて上清を除去した。この洗浄操作を２〜３回繰り返した。卵丘細胞が３層以上密に付着した卵丘細胞卵子複合体（ＣＯＣ）とＣＯＣに壁側顆粒層細胞が付着した壁側顆粒層細胞−卵丘細胞卵子複合体（ＧＣＯＣ）を選別・採卵をした。
９）体外成熟培養
採取したＣＯＣ及びＧＣＯＣは、約１５〜２０個／穴で改変ＮＣＳＵ３７を１００μｌ分注し、１００μｌ流動パラフィンオイルカバーした６穴ディッシュを用いて成熟培養した。改変ＮＣＳＵ−３７は、１０％ブタ卵胞液、０．６ｍＭシステイン、５０μＭ βメルカプトエタノール、１ｍＭジブチリルｃＡＭＰ、１０ＩＵ／ｍｌ ＰＭＳＧ（ピーメックス；１０００ＩＵ三共製薬）、１０ＩＵ／ｍｌ ｈＣＧ（プペローゲン；１５００ＩＵ，三共製薬）を添加して作製した。２０〜２２時間まで培養後、ホルモン及びジブチリルｃＡＭＰ無添加改変ＮＣＳＵ３７に移して供試時まで培養した。成熟培養は３９℃、気相条件は、ＣＯ２５％，Ｏ２５％，Ｎ２９０％の条件で実施した。成熟培養時間は、４２〜４４時間で行い、成熟卵子（第一極体放出卵子）のみを試験に使用した。
採取したＣＯＣ及びＧＣＯＣは、約１５〜２０個／穴で改変ＮＣＳＵ３７を１００μｌ分注し、１００μｌ流動パラフィンオイルカバーした６穴ディッシュを用いて成熟培養した。改変ＮＣＳＵ−３７は、１０％ブタ卵胞液、０．６ｍＭシステイン、５０μＭ βメルカプトエタノール、１ｍＭジブチリルｃＡＭＰ、１０ＩＵ／ｍｌ ＰＭＳＧ（ピーメックス；１０００ＩＵ三共製薬）、１０ＩＵ／ｍｌ ｈＣＧ（プペローゲン；１５００ＩＵ，三共製薬）を添加して作製した。２０〜２２時間まで培養後、ホルモン及びジブチリルｃＡＭＰ無添加改変ＮＣＳＵ３７に移して供試時まで培養した。成熟培養は３９℃、気相条件は、ＣＯ２５％，Ｏ２５％，Ｎ２９０％の条件で実施した。成熟培養時間は、４２〜４４時間で行い、成熟卵子（第一極体放出卵子）のみを試験に使用した。
１０）卵子核の除去操作（除核操作）
除核操作前に、屠殺採卵した未受精卵子を、サイトカラシンＢ（Sigma: Cat. No. C-6762）が５μｇ／ｍｌ濃度含むＰＺＭ３液に移し、１５分間以上処理した。除核操作も同濃度のサイトカラシンＢが含まれるＰＺＭ３液で作製したドロップ内（１０ｃｍプラスチックシャーレの中心付近に５０μｌでドロップを作製し、ミネラルオイル２０ｍｌで被った）で行った。卵子は、第一極体が、１２時から３時方向の位置になるようにホールディングピペットで保定した。ピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック社製）に取り付けた除核用ピペット（外径２５〜３０μｍ、先端を３０〜４５度の角度で研磨）により、第一極体ごと細胞質を１／４〜１／３量程吸引した（Onishi, A. et al. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science (New York, N.Y 289, 1188-1190 (2000)）。除核用ピペットの操作性が悪くなった場合は、２０％ＰＶＰ液（Sigma: Cat. No. PVP-360）ドロップにて、吸引・排出を繰り返し、洗浄を行った。除核操作終了後、直ちにサイトカラシンＢが含まれないＰＺＭ３液に移し、洗浄を行う。洗浄には、ＰＺＭ３液が３ｍｌ入った３５ｍｍディッシュ(Falcon 1008)で２回以上、丁寧に洗浄し、サイトカラシンＢを除去した。その後、注入操作まで、ＰＺＭ３液ドロップ（３５ｍｍディッシュ：Falcon 3001 に１００μｌのドロップを作製し、４ｍｌミネラルオイルで被った）に移し、インキュベーター内で培養した。
除核操作前に、屠殺採卵した未受精卵子を、サイトカラシンＢ（Sigma: Cat. No. C-6762）が５μｇ／ｍｌ濃度含むＰＺＭ３液に移し、１５分間以上処理した。除核操作も同濃度のサイトカラシンＢが含まれるＰＺＭ３液で作製したドロップ内（１０ｃｍプラスチックシャーレの中心付近に５０μｌでドロップを作製し、ミネラルオイル２０ｍｌで被った）で行った。卵子は、第一極体が、１２時から３時方向の位置になるようにホールディングピペットで保定した。ピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック社製）に取り付けた除核用ピペット（外径２５〜３０μｍ、先端を３０〜４５度の角度で研磨）により、第一極体ごと細胞質を１／４〜１／３量程吸引した（Onishi, A. et al. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science (New York, N.Y 289, 1188-1190 (2000)）。除核用ピペットの操作性が悪くなった場合は、２０％ＰＶＰ液（Sigma: Cat. No. PVP-360）ドロップにて、吸引・排出を繰り返し、洗浄を行った。除核操作終了後、直ちにサイトカラシンＢが含まれないＰＺＭ３液に移し、洗浄を行う。洗浄には、ＰＺＭ３液が３ｍｌ入った３５ｍｍディッシュ(Falcon 1008)で２回以上、丁寧に洗浄し、サイトカラシンＢを除去した。その後、注入操作まで、ＰＺＭ３液ドロップ（３５ｍｍディッシュ：Falcon 3001 に１００μｌのドロップを作製し、４ｍｌミネラルオイルで被った）に移し、インキュベーター内で培養した。
１１）ドナー組換え体細胞の準備
ＰＣＲ解析によりcommonγ遺伝子がノックアウトされていると判定した雌胎児の線維芽細胞を核移植ドナー細胞として用いた。培養液にはＤＭＥＭ＋１０％ ＦＣＳを用い、植え継ぎ回数は０〜５回の細胞を用いた。核移植予定日に合わせて、植え継ぎを行った後、コンフルエント状態から培養液の交換を行わず、３〜１４日間放置し、細胞周期をＧ１／Ｇ０期に同調した。核移植に用いる約１時間前にドナー体細胞の準備を行った。細胞処理は、培養容器の培養液を除去した後に、ＰＢＳ（−）にて３回以上洗浄を行い、０．２５％トリプシン＋０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液にて細胞剥離処理を行った。剥離した細胞に１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭを加え、懸濁した後、遠心処理（１，５００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，室温）を行った。遠心処理後、上清を除去し、ＰＺＭ３液を適量加えて懸濁し、核移植に用いるまで室温で放置した。体細胞核注入操作時に、適当な細胞数を注入操作用チャンバーのドロップに添加して使用した。
ＰＣＲ解析によりcommonγ遺伝子がノックアウトされていると判定した雌胎児の線維芽細胞を核移植ドナー細胞として用いた。培養液にはＤＭＥＭ＋１０％ ＦＣＳを用い、植え継ぎ回数は０〜５回の細胞を用いた。核移植予定日に合わせて、植え継ぎを行った後、コンフルエント状態から培養液の交換を行わず、３〜１４日間放置し、細胞周期をＧ１／Ｇ０期に同調した。核移植に用いる約１時間前にドナー体細胞の準備を行った。細胞処理は、培養容器の培養液を除去した後に、ＰＢＳ（−）にて３回以上洗浄を行い、０．２５％トリプシン＋０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液にて細胞剥離処理を行った。剥離した細胞に１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭを加え、懸濁した後、遠心処理（１，５００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，室温）を行った。遠心処理後、上清を除去し、ＰＺＭ３液を適量加えて懸濁し、核移植に用いるまで室温で放置した。体細胞核注入操作時に、適当な細胞数を注入操作用チャンバーのドロップに添加して使用した。
１２）体細胞核の注入操作
注入用チャンバー（１０ｃｍシャーレにＰＺＭ３液５０μｌでドロップを作製し、ミネラルオイル２０ｍｌで被った）のドロップに適量のドナー細胞を添加し、除核済み卵子５０〜１００個を入れて操作した。注入操作には、ピエゾマイクロマニピュレーターに体細胞核注入用ピペット（外径７−１０μｍ，鈍端）を用いた。注入用ピペットをピエゾマイクロマニピュレーターに取り付ける前に、ピペット後端より５〜２０ｍｍの位置にフロリナートを３〜１０ｍｍ幅になるように、充填して使用した。そのピペットをピエゾに取り付けて使用する時は、先端より培養液、フロリナート、空気、ミネラルオイルの順で満たされている状態にして操作した。注入操作を行う前に、必ず２０％ＰＶＰ液ドロップ内で注入用ピペットを洗浄（ピペッティングやＰＶＰドロップへのピペット先端の出し入れ）した。浮遊している体細胞を吸引し、数回ピペッティングを行い、細胞膜を壊し、ホールディングピペットにて保定した除核済み卵子細胞質内へ注入した（Science (New York, N.Y 289, 1188-1190 (2000)、Wakayama, T., Perry, A.C., Zuccotti, M., Johnson, K.R. & Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 394, 369-374 (1998)）。体細胞核を注入した卵子は、活性化処理時間までインキュベーターで培養を行った（１〜３時間）。
注入用チャンバー（１０ｃｍシャーレにＰＺＭ３液５０μｌでドロップを作製し、ミネラルオイル２０ｍｌで被った）のドロップに適量のドナー細胞を添加し、除核済み卵子５０〜１００個を入れて操作した。注入操作には、ピエゾマイクロマニピュレーターに体細胞核注入用ピペット（外径７−１０μｍ，鈍端）を用いた。注入用ピペットをピエゾマイクロマニピュレーターに取り付ける前に、ピペット後端より５〜２０ｍｍの位置にフロリナートを３〜１０ｍｍ幅になるように、充填して使用した。そのピペットをピエゾに取り付けて使用する時は、先端より培養液、フロリナート、空気、ミネラルオイルの順で満たされている状態にして操作した。注入操作を行う前に、必ず２０％ＰＶＰ液ドロップ内で注入用ピペットを洗浄（ピペッティングやＰＶＰドロップへのピペット先端の出し入れ）した。浮遊している体細胞を吸引し、数回ピペッティングを行い、細胞膜を壊し、ホールディングピペットにて保定した除核済み卵子細胞質内へ注入した（Science (New York, N.Y 289, 1188-1190 (2000)、Wakayama, T., Perry, A.C., Zuccotti, M., Johnson, K.R. & Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 394, 369-374 (1998)）。体細胞核を注入した卵子は、活性化処理時間までインキュベーターで培養を行った（１〜３時間）。
１３）卵子の活性化処理
体細胞核を注入した卵子の活性化処理は直流パルス刺激(SSH-2, 島津製作所)を、１．５ｋＶ／ｃｍ １００μsec. ×１回の条件にて行った。チャンバーには２ｍｍ幅のステンレスワイヤー電極を用い、電気刺激用の電解質溶液には０．０５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｇＳＯ４ならびに０．０１％ＢＳＡを含む０．２８Ｍマンニトール溶液を用いた。
体細胞核を注入した卵子の活性化処理は直流パルス刺激(SSH-2, 島津製作所)を、１．５ｋＶ／ｃｍ １００μsec. ×１回の条件にて行った。チャンバーには２ｍｍ幅のステンレスワイヤー電極を用い、電気刺激用の電解質溶液には０．０５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｇＳＯ４ならびに０．０１％ＢＳＡを含む０．２８Ｍマンニトール溶液を用いた。
１４）活性化卵子の第２極体放出抑制処理
活性化処理卵子は５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ (Sigma: Cat. No. C-6762)を含むＰＺＭ３液で２時間培養し、第２極体の放出を抑制させる処理を行った。
活性化処理卵子は５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ (Sigma: Cat. No. C-6762)を含むＰＺＭ３液で２時間培養し、第２極体の放出を抑制させる処理を行った。
１５）活性化卵子の体外培養
活性化後２倍体処理をした卵子は、ＰＺＭ３液にて体外培養を行い、活性化処理後２日目に分割胚のみ胚移植に用いた。
活性化後２倍体処理をした卵子は、ＰＺＭ３液にて体外培養を行い、活性化処理後２日目に分割胚のみ胚移植に用いた。
１６）ホルモン処理による仮腹の同期化と胚移植方法
仮腹の同期化は妊娠ブタを人工流産処置することで行った。また、仮腹の発情は、採卵ブタのものより、１日遅れるように発情同期化処置を行った。供試予定の雌ブタは、発情時に、雄ブタ希釈精液を用いて人工授精を行い妊娠させた。妊娠後２１〜５０日目の妊娠ブタを用いた。核移植予定６日前にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロール約０．２ｍｇ（プラネート、武田：２ｍｌ量）を臀部に注射した。その２４時間後に、同様にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にｅＣＧ（ピーメックス、三共）を１０００ＩＵ投与した。ＰＧＦ２α＋ｅＣＧ投与７２時間後にｈＣＧ（プペローゲン、三共）を５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与、約６８時間目に仮腹へケタラール投与後、ハロセン麻酔下で外科的に胚移植手術を行った。胚移植はＰＰカテーテル（フジヒラ）を卵管へ挿入して行った。
仮腹の同期化は妊娠ブタを人工流産処置することで行った。また、仮腹の発情は、採卵ブタのものより、１日遅れるように発情同期化処置を行った。供試予定の雌ブタは、発情時に、雄ブタ希釈精液を用いて人工授精を行い妊娠させた。妊娠後２１〜５０日目の妊娠ブタを用いた。核移植予定６日前にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロール約０．２ｍｇ（プラネート、武田：２ｍｌ量）を臀部に注射した。その２４時間後に、同様にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にｅＣＧ（ピーメックス、三共）を１０００ＩＵ投与した。ＰＧＦ２α＋ｅＣＧ投与７２時間後にｈＣＧ（プペローゲン、三共）を５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与、約６８時間目に仮腹へケタラール投与後、ハロセン麻酔下で外科的に胚移植手術を行った。胚移植はＰＰカテーテル（フジヒラ）を卵管へ挿入して行った。
１７）組み換えクローン胎児の採取及び細胞分離作業
同定したＰＣＲ陽性コロニーは、非相同組換え細胞が、様々な割合で含まれている可能性があり、体細胞核移植技術を用いた効率的な相同組換え動物の作出の妨げとなりうることが予想された。そこで、単一な相同組換え細胞のみの集団を得るため、妊娠した雌ブタの３２日目もしくは３９日目に胎児を採取した。採取した胎児は、３）と同様に細胞を分離すると同時にゲノムＤＮＡを採取し、相同組み換え個体であるか５）と同様の条件でＰＣＲ解析した。ＰＣＲ解析にて陽性であった胎児細胞を用いて再核移植を実施し、胚移植によりcommonγノックアウトクローン個体の作出に供した。
同定したＰＣＲ陽性コロニーは、非相同組換え細胞が、様々な割合で含まれている可能性があり、体細胞核移植技術を用いた効率的な相同組換え動物の作出の妨げとなりうることが予想された。そこで、単一な相同組換え細胞のみの集団を得るため、妊娠した雌ブタの３２日目もしくは３９日目に胎児を採取した。採取した胎児は、３）と同様に細胞を分離すると同時にゲノムＤＮＡを採取し、相同組み換え個体であるか５）と同様の条件でＰＣＲ解析した。ＰＣＲ解析にて陽性であった胎児細胞を用いて再核移植を実施し、胚移植によりcommonγノックアウトクローン個体の作出に供した。
１８）サザンブロット解析
ゲノムＤＮＡは、クローン胎児もしくはクローン産子より採取した細胞または組織（耳）から抽出した。その細胞及び細切した組織断片は、lysis buffer (５０ｍＭ Tris，ｐＨ８．０，１００ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１％ＳＤＳ，０．５ｍｇ／ｍｌ proteinase Ｋ)で５５℃にて一晩処理し、溶解した。ＤＮＡは、フェノールとフェノール／クロロホルムにより処理した後、エタノール沈殿により抽出した。サザンブロッティング用に、子ブタ及び胎児細胞より抽出したゲノムＤＮＡ１０ｕｇを、EcoRIにて切断した後、０．８％アガロースゲルにて電気泳動後、Hybond N+メンブレンにブロッティングした。３’相同領域の外側にある３’隣接領域に相当する３’プローブとエクソン２の一部、イントロン２、エクソン３、イントロン３及びエクソン４の一部にわたる５’プローブは、ＰＣＲプライマー(3’プローブ：5’- TCA ACA CTC CCA GCA CTT TG -3’及び 5’- TCT TAG TGC GAA AGA TCC GC-3’［配列番号５及び６］、5’プローブ： 5’-CTG AGC TCC AGC CTA CCA ACC TAA C - 3’及び5’-AGT CCA GCT GCG GTC CCG GTC ACT C -3’［配列番号７及び８］)によって作成した。プローブは、HighPrime (Roche)を用いたランダムプライミング法により、[α32-P]dCTPを用いて標識した。そのメンブレンは、３２Ｐ標識したプローブを用いてハイブリダイズし、Imaging Plate (富士フィルム, 東京, 日本)上で一晩感光させ、FLA-3000G image analyzer (富士フィルム)を用いて解析した。
ゲノムＤＮＡは、クローン胎児もしくはクローン産子より採取した細胞または組織（耳）から抽出した。その細胞及び細切した組織断片は、lysis buffer (５０ｍＭ Tris，ｐＨ８．０，１００ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１％ＳＤＳ，０．５ｍｇ／ｍｌ proteinase Ｋ)で５５℃にて一晩処理し、溶解した。ＤＮＡは、フェノールとフェノール／クロロホルムにより処理した後、エタノール沈殿により抽出した。サザンブロッティング用に、子ブタ及び胎児細胞より抽出したゲノムＤＮＡ１０ｕｇを、EcoRIにて切断した後、０．８％アガロースゲルにて電気泳動後、Hybond N+メンブレンにブロッティングした。３’相同領域の外側にある３’隣接領域に相当する３’プローブとエクソン２の一部、イントロン２、エクソン３、イントロン３及びエクソン４の一部にわたる５’プローブは、ＰＣＲプライマー(3’プローブ：5’- TCA ACA CTC CCA GCA CTT TG -3’及び 5’- TCT TAG TGC GAA AGA TCC GC-3’［配列番号５及び６］、5’プローブ： 5’-CTG AGC TCC AGC CTA CCA ACC TAA C - 3’及び5’-AGT CCA GCT GCG GTC CCG GTC ACT C -3’［配列番号７及び８］)によって作成した。プローブは、HighPrime (Roche)を用いたランダムプライミング法により、[α32-P]dCTPを用いて標識した。そのメンブレンは、３２Ｐ標識したプローブを用いてハイブリダイズし、Imaging Plate (富士フィルム, 東京, 日本)上で一晩感光させ、FLA-3000G image analyzer (富士フィルム)を用いて解析した。
１９）ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡは、分離したＰＢＭＣよりSepazol (東洋紡, 大阪, 日本)を用いて抽出した。１ｕｇの全ＲＮＡをランダムヘキサマープライマーを用いてRevertraAce (東洋紡)によりｃＤＮＡに逆転写した。次のＰＣＲ増幅は、KOD plus ver.2 (東洋紡)を用いて、最初の変性が９４℃、２分間、各サイクルが９８℃、１０秒間、アニーリング／増幅が６８℃、４５秒間で実施した。２組のプライマーセットをコモンガンマ遺伝子の増幅に用いた。最初のセットは、Gcex2F (5’-ATTGCACTTGGAACAGCAGC-3’)［配列番号９］とGcex4R (5’- CTCCAGTTGAGTTCTAGCTG-3’) ［配列番号１０］、二つ目のセットはGcex4F (5’-CAGCTA GAACTCAACTGGAG-3’) ［配列番号１１］ と Gcex6R (5’-CGACAATCAGTCCCATGGAG -3’) ［配列番号１２］である。最適なサイクル数は、線型増幅領域内で決定した。ＧＡＰＤＨを内在コントロールとして供した。そのＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲル上で分離させ、エチディウムブロマイドを用いて可視化した。
全ＲＮＡは、分離したＰＢＭＣよりSepazol (東洋紡, 大阪, 日本)を用いて抽出した。１ｕｇの全ＲＮＡをランダムヘキサマープライマーを用いてRevertraAce (東洋紡)によりｃＤＮＡに逆転写した。次のＰＣＲ増幅は、KOD plus ver.2 (東洋紡)を用いて、最初の変性が９４℃、２分間、各サイクルが９８℃、１０秒間、アニーリング／増幅が６８℃、４５秒間で実施した。２組のプライマーセットをコモンガンマ遺伝子の増幅に用いた。最初のセットは、Gcex2F (5’-ATTGCACTTGGAACAGCAGC-3’)［配列番号９］とGcex4R (5’- CTCCAGTTGAGTTCTAGCTG-3’) ［配列番号１０］、二つ目のセットはGcex4F (5’-CAGCTA GAACTCAACTGGAG-3’) ［配列番号１１］ と Gcex6R (5’-CGACAATCAGTCCCATGGAG -3’) ［配列番号１２］である。最適なサイクル数は、線型増幅領域内で決定した。ＧＡＰＤＨを内在コントロールとして供した。そのＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲル上で分離させ、エチディウムブロマイドを用いて可視化した。
２０）リアルタイムＰＣＲ
１μｇの全ＲＮＡの一定量を用いてランダムヘキサマープライマーによるRevertraAce (東洋紡)によりｃＤＮＡに逆転写した。ｍＲＮＡの定量は、既報に準じて行った（Shoji, S. et al. EMBO J. 25, 834(2006)，Amanai, M. et al. Biol. Reprod. 75, 891(2006)）。
１μｇの全ＲＮＡの一定量を用いてランダムヘキサマープライマーによるRevertraAce (東洋紡)によりｃＤＮＡに逆転写した。ｍＲＮＡの定量は、既報に準じて行った（Shoji, S. et al. EMBO J. 25, 834(2006)，Amanai, M. et al. Biol. Reprod. 75, 891(2006)）。
２１）誕生したクローンブタのＰＣＲ判定
誕生したクローンブタから採取可能な組織（耳、臍帯組織）や血液等からＤＮＡを抽出し、５）に準じてＰＣＲ解析を行った。
誕生したクローンブタから採取可能な組織（耳、臍帯組織）や血液等からＤＮＡを抽出し、５）に準じてＰＣＲ解析を行った。
２２）誕生したクローンブタのＦＡＣＳ解析
誕生したクローンブタから末梢血単核細胞もしくは脾臓単核細胞を分離し、抗ブタＣＤ４抗体及び抗ブタＣＤ８抗体（BD Bioscience Pharmingen、サンディエゴ、カナダ）を用いて、４℃、３０分間反応させた。抗体反応後、細胞は０．５％ＦＣＳが含まれるＰＢＳ（−）液に懸濁し、ＦＡＣＳ（ベクトンディッキンソン）による抗原発現を定量解析した。
誕生したクローンブタから末梢血単核細胞もしくは脾臓単核細胞を分離し、抗ブタＣＤ４抗体及び抗ブタＣＤ８抗体（BD Bioscience Pharmingen、サンディエゴ、カナダ）を用いて、４℃、３０分間反応させた。抗体反応後、細胞は０．５％ＦＣＳが含まれるＰＢＳ（−）液に懸濁し、ＦＡＣＳ（ベクトンディッキンソン）による抗原発現を定量解析した。
［ブタにおけるcommonγ鎖遺伝子の一塩基多型解析］
１）材料及び計画
家畜において,
commonγ鎖遺伝子の多型が免疫特性や抗病性等に及ぼす影響について報告が少ない。ブタにおけるcommonγ鎖遺伝子の多型を調べるため、報告されている塩基配列(ACCESSION No. AB092652)からイントロン２、エクソン３及びイントロン３にかかる断片を増幅させるための、ＰＣＲプライマーを設計し、６品種のブタのＰＣＲ−ＲＦＬＰ及び塩基配列解析を実施した。
１）材料及び計画
家畜において,
commonγ鎖遺伝子の多型が免疫特性や抗病性等に及ぼす影響について報告が少ない。ブタにおけるcommonγ鎖遺伝子の多型を調べるため、報告されている塩基配列(ACCESSION No. AB092652)からイントロン２、エクソン３及びイントロン３にかかる断片を増幅させるための、ＰＣＲプライマーを設計し、６品種のブタのＰＣＲ−ＲＦＬＰ及び塩基配列解析を実施した。
２）ＰＣＲプライマー
Forward: 5’-CTGAGCTCCAGCCTACCAACCTAAC-3’(exon2) ［配列番号１３］
Reverse: 5’-AGTCCAGCTGCGGTCCCGGTCACTC-3’(exon4) ［配列番号１４］
Forward: 5’-CTGAGCTCCAGCCTACCAACCTAAC-3’(exon2) ［配列番号１３］
Reverse: 5’-AGTCCAGCTGCGGTCCCGGTCACTC-3’(exon4) ［配列番号１４］
３）ＰＣＲ／ＲＦＬＰの条件
ＰＣＲ反応は、PCR Gold Buffer (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)に、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ，２０ｐｍｏｌずつのプライマー，２００μＭのｄＮＴＰ，２．５ＵのAmpliTaq Gold DNA ポリメラーゼを添加し総液量２０μｌで作製した。ＰＣＲ反応は、最初の熱変性９５℃、９分間後、各サイクル９５℃、３０秒，５８℃、３０秒，７２℃、３０秒を３５サイクル反応させた後、７２℃、１０分間で実施した。増幅させたＰＣＲ産物は、制限酵素EcoRVで消化し、２％アガロースゲルにて電気泳動した。その消化した断片は、７９５ｂｐもしくは５３１と２６４ｂｐで検出した。
ＰＣＲ反応は、PCR Gold Buffer (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)に、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ，２０ｐｍｏｌずつのプライマー，２００μＭのｄＮＴＰ，２．５ＵのAmpliTaq Gold DNA ポリメラーゼを添加し総液量２０μｌで作製した。ＰＣＲ反応は、最初の熱変性９５℃、９分間後、各サイクル９５℃、３０秒，５８℃、３０秒，７２℃、３０秒を３５サイクル反応させた後、７２℃、１０分間で実施した。増幅させたＰＣＲ産物は、制限酵素EcoRVで消化し、２％アガロースゲルにて電気泳動した。その消化した断片は、７９５ｂｐもしくは５３１と２６４ｂｐで検出した。
４）塩基配列
予測された多型サイトの塩基配列は、直接ＰＣＲ産物を用いてBigDyeターミネーター(Applied Biosystems, Foster, CA, USA)で解析した。
予測された多型サイトの塩基配列は、直接ＰＣＲ産物を用いてBigDyeターミネーター(Applied Biosystems, Foster, CA, USA)で解析した。
［pγcTVneoターゲッティングベクター由来クローンブタの作出試験結果］
１）三元交雑種由来ＢＡＣライブラリーより作製したpγcTVneoターゲッティングベクターを用いてエレクトロポレーションによる遺伝子導入を１６回行い、Ｇ４１８により選択した結果、１５４３個のＧ４１８耐性コロニーをピックアップした。１５４３個のコロニーをＰＣＲ解析した結果、３個（０．１９％）の陽性コロニーが得られた（表１）。
１）三元交雑種由来ＢＡＣライブラリーより作製したpγcTVneoターゲッティングベクターを用いてエレクトロポレーションによる遺伝子導入を１６回行い、Ｇ４１８により選択した結果、１５４３個のＧ４１８耐性コロニーをピックアップした。１５４３個のコロニーをＰＣＲ解析した結果、３個（０．１９％）の陽性コロニーが得られた（表１）。
２）上記１）で得られた陽性コロニーをドナー細胞として核移植に供した。核移植後、２０２３個が生存し、２日間の体外培養後、９７１個（４７．９％）が分割した（表２）。その分割胚９７１個を６頭の仮腹へ分けて移植した結果、２頭が妊娠した。妊娠した仮腹２頭は、妊娠４０〜５０日目で、屠殺し胎児を３頭回収した（表２）。その３頭をＰＣＲ解析した結果、正常にターゲッティングされていないことが確認された。
［ブタにおけるcommonγ鎖遺伝子の一塩基多型解析結果］
１）ブタcommonγ鎖遺伝子の多型について報告が少ないため、commonγ鎖遺伝子の多型を調査するため報告されている情報(ACCESSION No. AB092652)からイントロン２、エクソン３及びイントロン３にかかる断片を増幅させるためのＰＣＲプライマーを設計し、６品種のブタのＰＣＲ−ＲＦＬＰ及び塩基配列解析を実施した。その結果、制限酵素EcoRV消化により検出されたイントロン２に存在するGAATTC配列にＡとＴが置換されていた。
１）ブタcommonγ鎖遺伝子の多型について報告が少ないため、commonγ鎖遺伝子の多型を調査するため報告されている情報(ACCESSION No. AB092652)からイントロン２、エクソン３及びイントロン３にかかる断片を増幅させるためのＰＣＲプライマーを設計し、６品種のブタのＰＣＲ−ＲＦＬＰ及び塩基配列解析を実施した。その結果、制限酵素EcoRV消化により検出されたイントロン２に存在するGAATTC配列にＡとＴが置換されていた。
２）対立遺伝子頻度は、西洋種４種（ランドレース、バークシャー、大ヨークシャー、デュロック）と中国種２種（梅山ブタ、金華ブタ）の７４頭のブタ（５０頭雌、２４頭雄）を用いて判別した。ブタcommonγ鎖遺伝子は、Ｘ染色体に位置するため、総数１２４本（雄２４本、雌５０×２本＝１００本）のＸ染色体のＳＮＰ型を調べた結果、西洋種はＡ塩基だけを検出し、中国種はＴ塩基のみを検出した。品種内に関しては多型は検出されなかった（表３）。
３）梅山ブタとランドレース種間の交雑試験では、メンデルの法則に従った共優性及びＸ染色体連鎖型であることが確認された（図３）。
［pCTV05-Ｉターゲッティングベクター由来クローンブタ作出試験結果］
１）実施例３及び４の結果から、commonγ鎖遺伝子には中国種と西洋種間で多型が確認されたため、西洋種間では多型が確認されなかったが、ベクターに使用するゲノムの品種と遺伝子導入に使用する細胞の品種を揃えることが、組換え効率に影響するものと推察された。そこで、新たなベクターの構築を目指した。ランドレース種由来ＢＡＣライブラリーから作製したpCTV05-Ｉターゲッティングベクターは、エクソン４の一部からイントロン５の一部に相当する１ｋｂの５’相同領域とエクソン７の一部から３’隣接領域に相当する３’相同領域を含む通常のポジティブ・ネガティブセレクションが可能なものを設計した（図２）。ターゲッティングが成功した場合、ＰＧＫ−ｎｅｏ発現カセットによってイントロン５の一部，エクソン６，イントロン６及びエクソン７の一部が置換されることが想定され、レセプター機能に必須な膜貫通ドメインをコードする遺伝子配列がエクソン６に位置するため、結果的に遺伝子機能の不活化が起こる。メス胎児から得られた線維芽細胞に対し、直線状にしたベクターを遺伝子導入し、Ｇ４１８により選択した。Ｇ４１８耐性コロニーをピックアップし、プライマーＦＰ１（PGK-neo発現カセットの３’末端からの遺伝子配列）とGcint4F4（５’側短腕のすぐ外側のイントロン４に位置する配列）を用いたＰＣＲ分析によるスクリーニングを行った。２回の遺伝子導入操作からＧ４１８耐性コロニーを５９７個ピックアップし、３個（０．５１％）のコロニーが正常にターゲッティングされた特異的なＰＣＲ産物１．１ｋｂｐを産生した（表１）。
１）実施例３及び４の結果から、commonγ鎖遺伝子には中国種と西洋種間で多型が確認されたため、西洋種間では多型が確認されなかったが、ベクターに使用するゲノムの品種と遺伝子導入に使用する細胞の品種を揃えることが、組換え効率に影響するものと推察された。そこで、新たなベクターの構築を目指した。ランドレース種由来ＢＡＣライブラリーから作製したpCTV05-Ｉターゲッティングベクターは、エクソン４の一部からイントロン５の一部に相当する１ｋｂの５’相同領域とエクソン７の一部から３’隣接領域に相当する３’相同領域を含む通常のポジティブ・ネガティブセレクションが可能なものを設計した（図２）。ターゲッティングが成功した場合、ＰＧＫ−ｎｅｏ発現カセットによってイントロン５の一部，エクソン６，イントロン６及びエクソン７の一部が置換されることが想定され、レセプター機能に必須な膜貫通ドメインをコードする遺伝子配列がエクソン６に位置するため、結果的に遺伝子機能の不活化が起こる。メス胎児から得られた線維芽細胞に対し、直線状にしたベクターを遺伝子導入し、Ｇ４１８により選択した。Ｇ４１８耐性コロニーをピックアップし、プライマーＦＰ１（PGK-neo発現カセットの３’末端からの遺伝子配列）とGcint4F4（５’側短腕のすぐ外側のイントロン４に位置する配列）を用いたＰＣＲ分析によるスクリーニングを行った。２回の遺伝子導入操作からＧ４１８耐性コロニーを５９７個ピックアップし、３個（０．５１％）のコロニーが正常にターゲッティングされた特異的なＰＣＲ産物１．１ｋｂｐを産生した（表１）。
２）ＰＣＲ陽性コロニーは、核移植に使用するために増殖させた。５個のＰＣＲ陽性コロニーのうち１個を核移植に使用した。総数２３２５個の核移植胚のうち１７０３個が生存し、その内、６４．３％（１０４６個）が正常な２−８細胞期胚まで体外で発生した。総数１０４６個の分割胚を、４頭の雌ブタの卵管へ移植した（表２）。
３）同定したＰＣＲ陽性コロニーは、非相同組換え細胞が、様々な割合で含まれている可能性があり、体細胞核移植技術を用いた効率的な相同組換え動物の作出の妨げとなりうることが予想された。従って、単一な相同組換え細胞のみの集団を得るため、妊娠した雌ブタの３２日目もしくは３９日目に胎児を採取し、ＰＣＲ及びサザンブロット解析によりそれぞれの胎児から分離した体細胞を選別した。妊娠した３頭の雌ブタの内、２頭から総数９頭の胎児が採取でき（表２）、そのうち６頭がＰＣＲ陽性だった（データは示していない）。
４）さらなる確認のために、６頭の胎児から胎児体細胞を分離し、サザンブロット解析用の充分なゲノムＤＮＡを得るために増殖させた。EcoRIを用いて消化したゲノミックＤＮＡは、３’相同領域の外側の３’隣接領域に相当する３’プローブとエクソン２の一部、イントロン２、エクソン３、イントロン３及びエクソン４の一部にまたがる５’プローブによりハイブリダイズさせた。ヘテロ接合性の相同組換え雌細胞のため、それぞれのプローブが変異アレルと野生型アレルに相同する２つのバンドでハイブリダイズする：３’プローブは、変異型アレルの１２．５−ｋｂのバンドと野生型アレルの１０−ｋｂのバンド、５’プローブは、変異型アレルの１２．５−ｋｂのバンドと野生型アレルの２．５−ｋｂのバンドが検出され、一方無処置の細胞は野生型アレルの１つのバンドのみがハイブリダイズされる（図１に図表）。６つ細胞群すべてのハイブリダイゼーションにおいて予想された２つのバンドが検出され、調べた６頭の胎児がすべてへテロ接合型ノックアウトであることが確認できた（図４）。我々は正確に相同組換えが起こっていることが確認されたそれら６つの細胞群の１つを用いてその後の核移植に用いた。
５）総数６１０２個の核移植胚にうち４９８４個が生存し、その内、４９．８％（２４８２個）が正常な２〜８細胞期胚まで体外で発生した。２４８２個の分割胚を１１頭の仮腹である雌ブタの卵管へ移植し、６頭が妊娠し分娩まで至り、死産１４頭を含む３１頭の子ブタが誕生した（表３、図５）。１７頭の生存産子の内３頭が、原因不明の生後間もなく死亡した。しかしながら、これらの短命だった子ブタの生時体重（０．６±０．２ｋｇ）は、残った１４頭（１．０±０．３ｋｇ）よりも有意に小さかった。さらに、他の１０頭は、肺炎や重度の関節炎により衰弱し、生後６〜７０日の間に死亡した（５頭の安楽死も含む）。最終的に、見かけ上は健康である４頭が、現在まで生存している（表２）。
６）ＰＣＲ解析により、誕生した３１頭の子ブタすべてが、ヘテロ接合体のcommonγ鎖遺伝子のノックアウトであることを確認され（図６Ａ）、生存している４頭が、サザンブロット解析により相同組換えが生じていることが確認された（図６Ｂ）。commonγ鎖遺伝子のヘテロ接合体ノックアウト雌ブタは、マウスとヒトの場合（非特許文献１５，２３参照）のように正常なブタから識別不可能であることが予想された。しかしながら、下痢症、肺炎、重度の関節炎の頻発から、感染症に対する感受性が高くなっていることが示唆された。これらの現象の根底にある理由を調査するため、死産や生後死のブタの脾臓及び胸腺のような免疫系組織を調べた。死産及び生後直死産子の脾臓は正常もしくは若干小さい程度であったが、リンパ系の凝集（白脾髄）の低形成が度々観察された（図８）。死産１４頭のうち１２頭、生後死１３頭のうち１２頭では、胸腺の欠損か著しい低形成が認められた（表４、図７Ａ）。この特徴はマウス及びヒトとは異なるものであった。
７）次に、７週時点で生存していた７頭のヘテロ接合体ノックアウトブタ（３頭はすでに衰弱し、その後に安楽死させ、残り４頭は見かけ上は健康で生存している）から末梢血を採取し、フローサイトメトリー解析によりリンパ系の集団（ＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性のＴ細胞）の構成を調査した。４頭の現在も生存する子ブタは、ＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性のＴ細胞が正常ブタと同等レベルであったが、衰弱した３頭は、循環血液中もしくは脾臓内に存在するＴ細胞が少なかった（図９Ａ，Ｂ）。
８）さらにＰＢＭＣから全ＲＮＡを抽出し、commonγ遺伝子に対する２セットのプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。最初のセットは、エクソン２から４にかかる断片を増幅させるために設計し、もう一方のセットはエクソン４から６までを増幅させるために設計した。ターゲッティングされたアレルでは、エクソン６は、欠失されるため、後者のセットに対する断片は野生型アレルからのみ増幅される。野生型のコントロールであるブタと生存しているブタ４頭は、両方のプライマーセットで強い増幅が検出された（図７Ｂ）。一方、衰弱したブタ３頭の内、２頭は、前半のプライマーセットだけ弱い増幅を示し、残りの１頭は、両方のプライマーセットで弱い増幅が検出された（図７Ｂ）。また、リアルタイムＰＣＲ解析の結果、野生型のコントロールに比べて胸腺欠損ヘテロ接合体ノックアウトブタが、Ｉｌ２ｒｇ、ＣＤ４及びＣＤ８の転写レベルが大きく枯渇していることが確認された（図９Ｃ）。これらの結果から、衰弱したブタ及び死亡した子ブタの大部分は、野生型アレルからのcommonγ遺伝子の転写が減少もしくは消滅したことによりＳＣＩＤ様の表現形を示したのではないかということを示唆した。この異常発現は、細胞培養を含む体細胞クローニングの工程の間に生じた何らかのエピジェネティックもしくはジェネティックな欠陥に起因するであろう。特に最初のプライマーセットだけ増幅が増加した２頭の衰弱したブタにおいては、commonγ遺伝子の転写がターゲットアレルからのみ検出されていることから、選択的なＸ染色体の不活化が関与していることを仮説として考えることができる（M. F. Lyon, Nature 190, 372 (1961)）。実際に、Ｘ染色体の不活化の状態が、体細胞クローニングの過程及び核移植に使用する体細胞の維持による正確に初期化されていないことが報告されている（L. Jiang et al., Mol. Reprod. Dev. 75, 265 (2008)、L. D. Nolen et al., Dev. Biol. 279, 525 (2005)、S. Senda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 321, 38 (2004)、F. Xueet al., Nat. Genet. 31, 216 (2002)）。Ｆ１及びＦ２産子の詳細な解析が、これらの現象の根底にある正確な機構の評価に求められる。
［ＲＡＧ２ＫＯクローンブタの作出］
１）ターゲッティングベクターの構造(ベクター名：rag2TV06-I)
ＲＡＧ２(ACCESSION No. AB091391)ゲノム領域(L376O22)を含むＢＡＣクローンは、ブタランドレース種のＢＡＣライブラリーより分離した（Suzuki, K. et al. Construction and evaluation of a porcine bacterial artificial chromosome library. Animal genetics 31, 8-12 (2000)）。rag2TV06- Iベクターは、図１０に示したように、５’側相同領域は、５’側エクソン１Ａ隣接領域約８Ｋｂ、３’側相同領域はエクソン２を含む約１ｋｂで作製した。
１）ターゲッティングベクターの構造(ベクター名：rag2TV06-I)
ＲＡＧ２(ACCESSION No. AB091391)ゲノム領域(L376O22)を含むＢＡＣクローンは、ブタランドレース種のＢＡＣライブラリーより分離した（Suzuki, K. et al. Construction and evaluation of a porcine bacterial artificial chromosome library. Animal genetics 31, 8-12 (2000)）。rag2TV06- Iベクターは、図１０に示したように、５’側相同領域は、５’側エクソン１Ａ隣接領域約８Ｋｂ、３’側相同領域はエクソン２を含む約１ｋｂで作製した。
２）ターゲッティングベクターの構造(ベクター名：rag2TV06-II)
ＲＡＧ２(ACCESSION No. AB091391)ゲノム領域(L376O22)を含むＢＡＣクローンは、ブタランドレース種のＢＡＣライブラリーより分離した（Suzuki, K. et al. Construction and evaluation of a porcine bacterial artificial chromosome library. Animal genetics31, 8-12 (2000)）。rag2TV06-IIベクターは、図１０に示したように、５’側相同領域は、５’側エクソン２の一部からイントロン１にかかる領域約１Ｋｂ、３’側相同領域はエクソン２を含む３’側エクソン２隣接領域約８．５Ｋｂで作製した。
ＲＡＧ２(ACCESSION No. AB091391)ゲノム領域(L376O22)を含むＢＡＣクローンは、ブタランドレース種のＢＡＣライブラリーより分離した（Suzuki, K. et al. Construction and evaluation of a porcine bacterial artificial chromosome library. Animal genetics31, 8-12 (2000)）。rag2TV06-IIベクターは、図１０に示したように、５’側相同領域は、５’側エクソン２の一部からイントロン１にかかる領域約１Ｋｂ、３’側相同領域はエクソン２を含む３’側エクソン２隣接領域約８．５Ｋｂで作製した。
３）ＰＣＲ解析によるターゲッティングの検出
遺伝子導入および薬剤選択（ピューロマイシン）後、増殖した細胞は、２００ｇ／ｍｌのプロテナーゼＫが含む５０μｌの超純水に再懸濁し、５５℃で３時間保温した後、９５℃１０分間加熱してプロテナーゼを失活させた。ＰＣＲ分析は、２０μｌ量の反応液（表５）中に消化した５０μｌのサンプルから鋳型として１μｌを採取してＬＡｔａｑＨＳを用いて実施した。ＰＣＲサイクルのパラメーターは、最初に９４℃を５分間後、９４℃、３０秒、６８℃を１分３０秒、の１サイクルを３５サイクルで行い、最後に７２℃、７分間処理した。プライマーはrag2TV06-Ｉを解析する場合、FP1(5’- GCC TGC TCT TTA CTG AAG GC -3’)[配列番号１５]および rag2TV Icont4(5’-CTT GCT ATC TCC ACA TGC TC -3’) [配列番号１６]を用い、rag2TV06-IIを解析する場合、rag2TV5‘UTRF4(5’- GGG CAG GAA AGA GAG ATC TG -3’) [配列番号１７]および FP1(5’- GCC TGC TCT TTA CTG AAG GC -3’) [配列番号１８]を用いた。また、サザンブロッティングの結果を図１１及び１２に示す。
遺伝子導入および薬剤選択（ピューロマイシン）後、増殖した細胞は、２００ｇ／ｍｌのプロテナーゼＫが含む５０μｌの超純水に再懸濁し、５５℃で３時間保温した後、９５℃１０分間加熱してプロテナーゼを失活させた。ＰＣＲ分析は、２０μｌ量の反応液（表５）中に消化した５０μｌのサンプルから鋳型として１μｌを採取してＬＡｔａｑＨＳを用いて実施した。ＰＣＲサイクルのパラメーターは、最初に９４℃を５分間後、９４℃、３０秒、６８℃を１分３０秒、の１サイクルを３５サイクルで行い、最後に７２℃、７分間処理した。プライマーはrag2TV06-Ｉを解析する場合、FP1(5’- GCC TGC TCT TTA CTG AAG GC -3’)[配列番号１５]および rag2TV Icont4(5’-CTT GCT ATC TCC ACA TGC TC -3’) [配列番号１６]を用い、rag2TV06-IIを解析する場合、rag2TV5‘UTRF4(5’- GGG CAG GAA AGA GAG ATC TG -3’) [配列番号１７]および FP1(5’- GCC TGC TCT TTA CTG AAG GC -3’) [配列番号１８]を用いた。また、サザンブロッティングの結果を図１１及び１２に示す。
本研究は、独立行政法人農業生物資源研究所、独立行政法人理化学研究所、プライムテック株式会社、３者間の共同研究契約（平成２０年１０月１日締結「免疫欠損ブタを用いたヒト化ブタの開発」に関する研究）に基づいて実施されたもので、免疫欠損ブタの生産のため、雌ヘテロ接合体であるcommonγ遺伝子ノックアウトブタを作製した。これらの免疫欠損ブタは、造血幹細胞、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞（K. Takahashi et al., Cell 131, 861 (2007)）のようなヒト幹細胞移植のためのレシピエントとして貴重である。Ｘ染色体に相同組み換えを実施した雌産子を用いて、ここで作製したノックアウトブタが実用化使用に有効であることを判定するためには、ヒト幹細胞の生着率を調べることができる。さらに、免疫に必要とされる重要な役割を担うＲＡＧ２遺伝子の破損のような追加の遺伝子操作が（Shinkai, Y. et al. RAG-2-deficient mice lack mature lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J rearrangement. Cell 68, 855-867 (1992)）、ヒト幹細胞生着率の改善に効果的である可能性がある。
Claims (14)
- 以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を備えたことを特徴とする共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子のヘテロ接合体ノックアウト雌ブタの作製方法。
（ａ）ブタ共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子（commonγ遺伝子）上における少なくとも一部の配列をマーカー遺伝子と置換するcommonγ遺伝子のノックアウトを目的としたターゲッティングベクターを構築する工程；
（ｂ）工程（ａ）で構築されたターゲッティングベクターを、雌ブタ体細胞に導入し、マーカー遺伝子の発現を指標として相同組換えが生じていると判定される体細胞を選択する工程；
（ｃ）採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、工程（ｂ）で選択された体細胞の細胞核を注入し、該細胞核が注入された核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植して妊娠ブタを作製する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた妊娠ブタから胎児を採取し、その胎児の体細胞核のcommonγ遺伝子がノックアウトされている胎児を選択する工程；
（ｅ）採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、工程（ｄ）で選択された胎児の体細胞の細胞核を注入し、該細胞核が注入された核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植して妊娠ブタを作製する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で得られた妊娠ブタの産仔を育成する工程； - 以下の（ａ’）〜（ｆ’）の工程を備えたことを特徴とする共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子のノックアウト雄ブタの作製方法。
（ａ’）ブタ共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子（commonγ遺伝子）上における少なくとも一部の配列をマーカー遺伝子と置換するcommonγ遺伝子のノックアウトを目的としたターゲッティングベクターを構築する工程；
（ｂ’）工程（ａ’）で構築されたターゲッティングベクターを、雄ブタ体細胞に導入し、マーカー遺伝子の発現を指標として相同組換えが生じていると判定される体細胞を選択する工程；
（ｃ’）採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、工程（ｂ’）で選択された体細胞の細胞核を注入し、該細胞核が注入された核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植して妊娠ブタを作製する工程；
（ｄ’）工程（ｃ’）で得られた妊娠ブタから胎児を採取し、その胎児の体細胞核のcommonγ遺伝子がノックアウトされている胎児を選択する工程；
（ｅ’）採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、工程（ｄ’）で選択された胎児の体細胞の細胞核を注入し、該細胞核が注入された核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植して妊娠ブタを作製する工程；
（ｆ’）工程（ｅ’）で得られた妊娠ブタの産仔を育成する工程； - 請求項１記載の作製方法により得られた共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子（commonγ遺伝子）のヘテロ接合体ノックアウト雌ブタと、請求項２記載の作製方法により得られたcommonγ遺伝子のノックアウト雄ブタとを掛け合わせて、その産仔からホモ接合体ノックアウト雌ブタを選択することを特徴とするcommonγ遺伝子のホモ接合体ノックアウト雌ブタの作製方法。
- ブタcommonγ遺伝子が、ブタランドレース種のＩＬ２ＲＧゲノム領域を含むＢＡＣライブラリーより分離したcommonγ遺伝子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の作製方法。
- マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の作製方法。
- ターゲッティングベクターが、ｐＣＴＶ０５−Ｉであるであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の作製方法。
- 共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子（commonγ遺伝子）の発現量が野生型に比べて消失もしくは低下していることを特徴とするブタ。
- 相同染色体上の少なくとも１つのcommonγ遺伝子座においてcommonγ遺伝子が破壊されている請求項７記載のブタ。
- commonγ遺伝子のヘテロ接合体ノックアウト雌ブタである請求項８記載のブタ。
- commonγ遺伝子のノックアウト雄ブタである請求項８記載のブタ。
- commonγ遺伝子のホモ接合体ノックアウト雌ブタである請求項８記載のブタ。
- 請求項７〜１１のいずれか記載のブタの細胞。
- 請求項７〜１１のいずれか記載のブタの組織・臓器。
- 請求項７〜１１のいずれか記載のブタを幹細胞移植用のレシピエントとして使用する方法。
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