CN104182655A

CN104182655A - 一种判断胎儿基因型的方法

Info

Publication number: CN104182655A
Application number: CN201410439489.2A
Authority: CN
Inventors: 陈昌岳; 王璇; 任一; 张祥林
Original assignee: SHANGHAI MAJORBIO PHARM TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI MAJORBIO PHARM TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-09-01
Filing date: 2014-09-01
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2034-09-01
Also published as: CN104182655B

Abstract

本发明涉及一种判断胎儿基因型的方法，包括以下具体步骤：A.提取孕妇外周血DNA样本，进行外显子测序，得到原始数据；B.对原始数据进行质控，与参考序列比对，检测SNP，注释并统计；C.基于孕妇和胎儿的基因型的四种组合方式，用最大期望值算法计算得到四种组合方式的SNP位点的最小等位基因频率的混合高斯模型；D．计算得到混合高斯模型的三个临界值；E．通过比较各SNP位点的最小等位基因频率与三个临界值之间的大小关系判断胎儿基因型。本发明的判断胎儿基因型的方法仅凭孕妇的外周血可推测胎儿基因突变位点，精确且安全，不需要来自父亲的DNA，测序深度更深，更节省成本，经济实用。

Description

一种判断胎儿基因型的方法

技术领域

本发明涉及一种基于特定的算法推断基因型的方法，属于生物技术领域。

背景技术

基因型又称遗传型，是某一生物个体全部基因组合的总称。它反映生物体的遗传构成，即从双亲获得的全部基因的总和。据估计，人类的结构基因约有5万对。因此，整个生物的基因型是无法表示的，遗传学中具体使用的基因型，往往是指某一性状的基因型。在人类染色体中，决定遗传性状的是来自父母的一对染色体上对应的基因，因为人体有各来自父母的俩套染色体，所以又称为二倍体。

基因型的判断结果可以作为中间结果，为学术研究、遗传性疾病的预防、个体化用药，遗传性疾病的诊断提供数据信息。目前，常见的基因型检测技术有荧光定量PCR技术、高通量测序技术、基因芯片技术等，这些技术各有优缺点，中国专利文献CN100482806C公开了一种基因型分型方法，改良的多重聚合酶链式反应包括一个同步聚合酶链式反应以及一个特异性聚合酶链式反应，而且这两个扩增步骤皆可以递减策略来进行，其中宽松的递减策略是以低于最佳退火温度的温度来使用，而严谨的递减策略是以高于最佳退火温度的温度来使用，这是典型的PCR技术。

通过上述技术检测基因型都需要先取得生物的DNA样本，然后进行检测。但是在判断胎儿基因型时就存在诸多的问题。检测胎儿的基因型时，如果通过侵入性实验（如羊水穿刺）来获得胎盘物质，从而进行基因分型，会增加孕妇的流产风险；如果对父母的基因型进行单倍体测序，实验繁琐，周期很长，花费很多。

发明内容

本发明的目的是提供一种仅凭孕妇的外周血，精确且安全的判断胎儿基因型的方法。

实现本发明目的的一个技术方案是一种判断胎儿基因型的方法，不用于疾病的诊断和治疗，包括以下具体步骤：

A. 提取孕妇外周血DNA样本，进行外显子测序，得到原始数据；

B. 对原始数据进行质控，与参考序列比对，检测SNP，注释并统计；

C. 基于孕妇和胎儿的基因型的四种组合方式，用最大期望值算法计算得到四种组合方式的SNP位点的最小等位基因频率的混合高斯模型；

所述四种组合方式分别是孕妇和胎儿都是纯合子时的第一组合方式，胎儿是杂合子且孕妇是纯合子的第二组合方式，胎儿是纯合子且孕妇是杂合子的第三组合方式和孕妇，以及胎儿都是杂合子的第四组合方式；

D．计算得到混合高斯模型的三个临界值；

所述三个临界值从小到大分别是第一临界值、第二临界值和第三临界值；所述第一临界值是所述第一组合方式的混合高斯模型与第二组合方式的混合高斯模型的交点，所述第二临界值是所述第二组合方式的混合高斯模型与第三组合方式的混合高斯模型的交点，所述第三临界值是所述第三组合方式的混合高斯模型与第四组合方式的混合高斯模型的交点；

E．通过比较各SNP位点的最小等位基因频率与三个临界值之间的大小关系判断胎儿基因型；

当SNP位点的最小等位基因频率小于或等于第一临界值时，孕妇和胎儿都是纯合子；当SNP位点的最小等位基因频率小于或等于第二临界值且大于第一临界值时，胎儿是杂合子且孕妇是纯合子；当SNP位点的最小等位基因频率小于或等于第三临界值且大于第二临界值时，胎儿是纯合子且孕妇是杂合子；当SNP位点的最小等位基因频率大于第三临界值时，孕妇和胎儿都是杂合子。

上述混合高斯模型的定义为

，

其中，K是高斯分布模型的个数，K=4，π_k是第k个高斯分布的概率密度函数，μ_k是第k个高斯分布的均值，δ_k是第k个高斯分布的方差。

上述述最大期望值算法计算得到混合高斯模型的具体步骤是：

步骤一，假设π_k、μ_k和δ_k的初始值已知，估计每个高斯模型的权重γ(i,k)，计算公式为

，

其中，i是所有最小等位基因频率数据的数位；j是高斯分布模型的数位；

步骤二，基于估计的每个高斯模型的权重，确定π_k、μ_k和δ_k，计算公式为

，

其中，n是所有最小等位基因频率数据的个数；

步骤三，将第二步确定的π_k、μ_k和δ_k代入目标函数

中；

步骤四，重复步骤二和步骤三直至目标函数收敛，计算结束。

上述外显子测序是利用外显子捕获扩增，然后采用现有的二代基因测序技术，对该样品建库后上机测序。

本发明具有积极的效果：

（1）本发明的判断胎儿基因型的方法，利用外显子捕获技术、二代测序技术，再结合切实有效地算法，仅凭孕妇的外周血精确地推测胎儿基因突变位点，为腹中胎儿的基因缺陷评估提供了数据支撑，该技术相比目前全基因组水平的检测更节省成本，测序深度更深，经济实用并且能达到同等效果。

（2）本发明的判断胎儿基因型的方法仅凭孕妇的外周血就可以精确推测胎儿是否携带缺陷基因，无需对进行羊水穿刺，对胎儿没有任何伤害。

（3）本发明的判断胎儿基因型的方法仅凭孕妇的外周血就可以精确推测胎儿是否携带缺陷基因，不需要来自父亲的DNA，对于那些不知道孩子的父亲是谁或父亲不愿意证明或承认的人群，该技术也可以进行检测。

附图说明

图1是实施例1的基因型分布概率图；

图2是实施例1的基因型分布概率曲线图；

图3是实施例2的基因型分布概率图；

图4是实施例3的基因型分布概率图；

图5是实施例4的基因型分布概率图；

图6是实施例5的基因型分布概率图；

图7是实施例6的基因型分布概率图；

图8是实施例7的基因型分布概率图；

图9是实施例8的基因型分布概率图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是下述实施例中，若非特意表明，文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照仪器制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同，可参见维基百科有关DNA测序理论的相关内容以及其引用的相关文献（网址：http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_ sequencing_theory），也可参见外文书籍Waterman, Michael S. (1995).Introduction to Computational Biology（ISBN 0-412-99391-0）。

实施例1

本实施例的判断胎儿基因型的方法，包括以下具体步骤：

A. 提取孕妇外周血DNA样本，利用外显子捕获扩增，然后采用现有的二代基因测序技术，对该样品建库后上机测序，得到原始数据。

B. 对原始数据进行质控，与参考序列比对，检测SNP，注释并统计。

C. 基于孕妇和胎儿的基因型的四种组合方式，用最大期望值算法计算得到四种组合方式的SNP位点的最小等位基因频率的混合高斯模型。

所述四种组合方式分别是第一组合方式、第二组合方式、第三组合方式和第四组合方式。当孕妇和胎儿都是纯合子时为第一组合方式，最小等位基因频率接近于0。当胎儿是杂合子且孕妇是纯合子时为第二组合方式，最小等位基因频率接近于ω/2。当胎儿是纯合子且孕妇是杂合子时为第三组合方式，最小等位基因频率接近于(1-ω)/2。当孕妇和胎儿都是杂合子为第四组合方式，最小等位基因频率接近于1/2。其中，ω是胎儿基因组在孕妇外周血中的浓度。

最小等位基因频率（MAF，Minor allele fraction）通常是指在给定人群中的不常见的等位基因发生频率。每个等位基因的最小等位基因频率被计算认为是第二大核酸百分比含量。

混合高斯模型的定义为

，

混合高斯模型数据集的最大目标函数为

，

其中，i是所有最小等位基因频率数据的数位。

最大期望值算法计算得到混合高斯模型的具体步骤是：

步骤一，假设π_k、μ_k和δ_k的初始值已知，估计每个高斯模型的权重γ(i，k)，计算公式为

，

其中，j是高斯分布模型的数位。

，

其中，n是所有最小等位基因频率数据的个数。

步骤三，将第二步确定的π_k、μ_k和δ_k代入目标函数

中。

最大期望算法（Expectation-maximization algorithm）可参见外文书籍Information Theory, Inference, and Learning Algorithms，by David J.C. MacKay；Pattern Recognition and Machine Learning，by Christopher M.B；The Expectation Maximization Algorithm,by Frank Dellaert。

D．计算得到混合高斯模型的三个临界值；

为了更加方便地确认本发明算法的准确度，本实施例采用从网上下载已经通过深度测序得到的某个家庭中的母亲和女儿的原始数据，按比例混合，人工模拟出孕妇胎儿外周血。

先从1000 Genomes Project网站上下载某个家庭中母亲（NA19238）和女儿（NA19240）的原始数据。

NA19238（母亲）的外显子数据，paired reads长度100bp，个数213657130。NA19240（女儿）的外显子数据，paired reads长度100bp，个数65285053。

对于NA19238（母亲）生成的外显子数据，运用GATK软件生成SNP文件，该SNP文件作为NA19238（母亲）外显子区域的reference基因型。

对于NA19240（女儿）的外显子数据，运用GATK软件生成SNP文件，该SNP文件作为NA19240（女儿）的外显子区域的可靠的reference基因型。

对于NA19238(母亲)和NA19240（女儿）SNP文件，理论上根据个体分型的判断原理（MAF=0:homogeneous（纯合），MAF>0:heterogeneous（杂合）），可推断出这两个个体SNP位点的基因型，实际是直接由SNP文件的GT参数决定每个位点的genotype：0/0表示该位点为纯合的，和ref一致；0/1表示该位点为杂合的，有ref和variant两个基因型；1/1表示sample中该位点为纯合的，和variant一致。

母亲和女儿的原始数据的混合比例计算公式为：

ω=(M×a)/(M×a+D×b)。

其中，D是女儿的DNA的外显子数据个数，a是女儿的DNA的外显子数据paired reads的长度M是母亲的DNA的外显子数据个数，b是母亲的DNA的外显子数据paired reads的长度。

本实施例中母亲和女儿的原始数据的混合比例是：

ω=(65285053×100)/(65285053×100+213657130×100)=23.4%。

如图1所示，根据混合的数据，计算出混合后的SNP的MAF值，根据孕妇和胎儿的基因型的四种组合方式，用最大期望值算法计算得到四种组合方式的SNP位点的最小等位基因频率的混合高斯模型。

如图2所示，运用混合高斯模型，判断出四种组合方式的MAF值的数据服从的概率分布，绘制出每个SNP位点的MAF值所属各分布的概率曲线，共四条。计算得到四条概率曲线的三个交点，即三个临界值。通过比较各SNP位点的最小等位基因频率与三个临界值之间的大小关系，即选取最大的概率对应的分布，从而判断位点的基因型。

实施例2至实施例8

实施例2至实施例8的其余部分与实施例1相同，不同之处在于：采用的从网上下载的某个家庭中的母亲和女儿的原始数据不同。

先从1000 Genomes Project网站上下载某个家庭中母亲（NA12892）和女儿（NA12878）的原始数据。

NA12892（母亲）的外显子数据，paired reads长度250bp，个数30395088。NA12878（女儿）的外显子数据，paired reads长度76bp，个数74057330。

由于NA12892（母亲）的外显子数据小于NA12878（女儿）的外显子数据，所以按照不同比率随机选取NA12878（女儿）的外显子数据的reads形成六个新数据，再运用GATK软件生成相应的SNP文件。原始数据和新数据都进行混合，混合比例如表1所示。

表1 实施例2至7数据混合情况表

如图3至图9所示，根据混合的数据，计算出混合后的SNP的MAF值，根据孕妇和胎儿的基因型的四种组合方式，用最大期望值算法计算得到四种组合方式的SNP位点的最小等位基因频率的混合高斯模型。计算得到混合高斯模型的三个临界值。通过比较各SNP位点的最小等位基因频率与三个临界值之间的大小关系判断胎儿基因型。

数据的验证

本发明通过计算女儿的原始数据与混合数据计算所得的数据进行比较，评估预测的精确度，具体步骤是：

第一步，胎儿样品测序数据（女儿）经过一系列的处理步骤最终检测得到胎儿单体所有SNP信息，一个SNP信息包括SNP位置（如第6条染色体的第49870碱基位点）及SNP基因型（如杂合突变基因型GT，或是纯和突变基因型TT，表示该位点由G突变为T）。

一个SNP位点对应一个基因型，那么胎儿所有的SNP信息即一对一映射的数据集合，我们用集合的形式表示为(A->A’)；同理，母亲样品测序数据经过一系列的处理步骤最终检测得到的母亲单体所有SNP位点及位点基因型，用集合的形式表示为(B->B’)。

(A->A’)与(B->B’)作为已知可靠的胎儿与母亲的SNP信息。

第二步，外周血混合胎儿与母亲的测序数据经过一系列处理步骤及方法的应用分别推断出胎儿与母亲的各SNP位点及相应的基因型，同样用集合的形式表示，推断胎儿的SNP位点及相应基因型是(a->a’)与母亲的SNP位点及相应的基因型(b->b’)。

(a->a’)与(b->b’)作为预测的胎儿与母亲的SNP信息。

第三步，对预测结果准确性的判断，即判断所有预测出的胎儿及母亲的SNP信息与已知可靠的胎儿与母亲的SNP信息进行比较。判断的两个指标分别是Recall（召回率）与Precision（精确度）。

Recall的计算：预测出的胎儿（或母亲）所有SNP位置信息与已知可靠的胎儿（或母亲）所有SNP位置信息的交集，这个交集与已知可靠的胎儿（或母亲）的所有SNP位置信息的比例。

Precision的计算：预测出的胎儿（或母亲）所有SNP基因型信息与已知可靠的胎儿（或母亲）所有SNP基因型信息的交集，这个交集与已知可靠的胎儿（或母亲）的所有SNP位置信息的比例。

Recall代表的是预测出准确的SNP位置信息的比例，Precision代表的这些预测出的准确的SNP位置信息且基因型信息也是准确的比例。

胎儿Recall的计算公式为：(A⋂a)/A。

胎儿Precision的计算公式为：(A’⋂a’)/(A’)。

母亲Recall的计算公式为：(B⋂b)/B。

母亲Precision的计算公式为：(B’⋂b’)/(B’)。

Recall和Precision值越高可信度越高。

上文中取交集符号不完全等同于数学意义上的交集。SNP位置->SNP基因型一对一数据集表示为（如A->A’），A⋂a表示的是相同的SNP位置信息集合，A’⋂a’表示的是对应相同的SNP位置且基因型也相同的集合。

实施例1至实施例7的的混合数据的计算结果和精确度评估结果，如表2所示。

表2混合数据计算结果和精确度评估结果表

表2中的Recall是胎儿的召回率，表2中的Precision是胎儿的精确度。从表2中可知，实施例2至实施例8的测序平均深度为30倍以上，实施例1的测序平均深度为175倍。精确度的评估结果显示，实施例1的召回率大于93%，精确度大于84%，精确度很高。实施例2至实施例8的数据来自于同一母女，召回率均大于82%，精确度均大于84%。

实施例2至实施例8的召回率比实施例1低，其原因是原始数据的量不够，且在混合时只取了胎儿原始数据的部分混合到母亲的数据里。由此可知，混合数据的量直接影响判断基因型的准确性，，当数据的量较少时，判断的结果与原始胎儿数据的基因型有所差别，但是准确率仍比较高，在可以接受的范围内。本发明的判断胎儿基因型的方法在实际使用时需要提高测序的深度和覆盖度。

另外，如表2所示，实施例2至实施例8的数据来自于同一母女，所以三个临界值（Cutoff值）差不多。当胎儿基因组在孕妇外周血中的浓度（ω）比较低（实施例2和3）的情况下，Cutoff3为0.42，而和当胎儿基因组在孕妇外周血中的浓度（ω）比较高（实施例4至8）的情况下，Cutoff3为0.41。这是由于胎儿基因组在孕妇外周血中的浓度低的情况下，胎儿的数据量较少，预测准确度较低。实施例2至实施例8的三个临界值与实施例1的三个临界值存在差异，这是由于不同人的SNP情况也不一样，但这个差距不会很显著。所以，临界值存在个体差异，不同的孕妇外周血DNA样本必须重新用最大期望值算法计算得到四种组合方式的SNP位点的最小等位基因频率的混合高斯模型，从而计算出专属的临界值，再通过比较各SNP位点的最小等位基因频率与三个临界值之间的大小关系判断胎儿基因型。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims

1.一种判断胎儿基因型的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

D．计算得到混合高斯模型的三个临界值；

2.根据权利要求1所述的判断胎儿基因型的方法，其特征在于：所述混合高斯模型的定义为

，

3.根据权利要求2所述的判断胎儿基因型的方法，其特征在于，所述最大期望值算法计算得到混合高斯模型的具体步骤是：

，

其中，n是所有最小等位基因频率数据的个数；

步骤三，将第二步确定的π_k、μ_k和δ_k代入目标函数

中；

4.根据权利要求3所述的判断胎儿基因型的方法，其特征在于：所述外显子测序是利用外显子捕获扩增，然后采用现有的二代基因测序技术，对该样品建库后上机测序。