KR20140004556A - 항바이러스 화합물에 대한 타켓인 pla2g16 - Google Patents

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Abstract

일 측면에서, 본 발명은 바이러스 감염을 억제하는 조성물 및 방법을 제공한다. 일 측면에서, 본 발명은 항바이러스 화합물 동정에 유용한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

항바이러스 화합물에 대한 타켓인 PLA2G16 {PLA2G16 AS A TARGET FOR ANTIVIRAL COMPOUNDS}
본 특허출원은 2010년 6월 18일에 출원된 미국출원 제61/356,426호에 대한 우선권을 주장하며 상기 출원의 내용은 본 발명의 내용에 전부 포함된다.
바이러스는 전세계에 걸쳐 퍼져나가는 질병 및 사망의 원인이다. 비록 백신과 공공의료정책을 통해 특정 바이러스 감염의 발병을 크게 줄였지만, 이러한 접근법은 의학적 및/또는 수의학적으로 중요한 많은 바이러스를 다루는 데 성공적이지 않다. 비록 보호 백신이 존재하지만 모든 개체의 백신화를 성취하는 것은 흥미를 끄는 일이다. 게다가 효과적인 면역화의 장애물은 면역노화 및 면역억제 약물 치료와 같은 인자에 의해 발생한다. 일부 바이러스에 대한 약제학적 치료법이 개발되었는데, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)가 주목할만한 예를 보여준다. 그러나 약물을 효과적으로 이용할 수 있는 바이러스 질환은 여전히 상대적으로 적다. 새로운 항바이러스 화합물 및 이러한 화합물들을 동정할 수 있는 새로운 접근법이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 일부 부분적으로 항바이러스 약물 개발용 타겟을 동정하기 위한 것이다. 일 측면에서, 본 발명은 세포를 PLA2G16와 접촉시키는 것을 포함하는 세포의 바이러스 감염을 억제하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 바이러스는 피코르나바이러스(Picornavirus )이다. 일 구체예에서, 상기 세포는 척추동물 세포이다. 일 구체예에서, 상기 척추동물 세포는 포유류 세포, 즉 인간 세포이다. 일 구체예에서, PLA2G16 억제제는 PLA2G16의 발현을 억제한다. 일 구체예에서, 상기 PLA2G16 억제제는 PLA2G16의 효소 활성을 억제한다.
다른 측면에서, 본 발명은 개체의 바이러스 질환을 치료하는 방법을 제공하고, PLA2G16 억제제를 바이러스 감염 치료를 필요로 하는 개체에 PLA2G16 억제제를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 바이러스 감염은 피코르나바이러스 감염이다. 일 구체예에서, 상기 개체는 척추동물이다. 일 구체예에서 상기 개체는 포유동물, 즉 인간이다. 일 구체예에서 상기 PLA2G16 억제제는 PLA2G16의 발현을 억제한다. 일 구체예에서, 상기 PLA2G16 억제제는 PLA2G16의 효소 활성을 억제한다.
다른 측면에서, 본 발명은 (a) PLA2G16 폴리펩타이드 및 테스트 화합물을 포함하는 조성물을 제공하고; (b) 상기 테스트 화합물이 PLA2G16 폴리펩타이드를 억제하면 상기 화합물을 항바이러스 화합물 후보로 동정하여, 상기 테스트 화합물이 PLA2G16 폴리펩타이드를 억제하는지 결정하는 단계;를 포함하는 항바이러스 화합물 후보 동정 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 (b) 단계는 상기 테스트 화합물이 상기 PLA2G16 폴리펩타이드의 발현을 억제하는지를 결정하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 (b) 단계는 상기 테스트 화합물이 상기 PLA2G16 폴리펩타이드의 효소 활성을 억제하는지를 결정하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 효소 활성은 포스포리파아제(phospholipase) A2 활성이다. 일 구체예에서, 상기 (a) 단계의 조성물은 정제 PLA2G16을 포함하는 셀-프리 조성물이고, 그리고 상기 (b) 단계는 상기 테스트 화합물이 PLA2G16의 효소 활성을 억제하는지 결정하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 만약 상기 화합물이 PLA2G16 폴리펩타이드를 억제한다면, 상기 화합물은 피코르나바이러스에 의한 바이러스 감염을 억제하는 데 유용한 항바이러스 화합물 후보로 동정된다. 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 화합물이 세포 또는 개체의 바이러스 감염을 억제하는 능력이 있는지 평가하는 것을 더 포함한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 세포를 상기 화합물 및 바이러스에 접촉시키는 단계를 더 포함하고, 상기 세포는 상기 화합물이 없을 때 상기 바이러스에 민감할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 방법은 개체에 상기 화합물 투여하는 단계를 더 포함하고, 상기 개체는 상기 화합물이 없을 때 상기 바이러스 감염에 민감할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 바이러스에 감염된 세포를 상기 화합물과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 화합물을 바이러스에 감염된 개체에 투여하는 단계를 더 포함한다.
다른 측면에서, (a) 본 발명은 PLA2Gl6을 억제하는 화합물을 동정하거나 선택하는 것을 포함하는 방법에 따라 동정된 항바이러스 화합물 후보를 제공하고; 그리고 (b) 상기 화합물이 바이러스에 의한 세포 또는 생물체의 감염을 억제하면 상기 화합물을 항바이러스 화합물로 평가하여, 상기 화합물이 바이러스에 의한 세포 또는 생물체의 감염을 억제하는지를 결정하는 단계;를 포함하는 항바이러스 화합물 후보 확인 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 바이러스는 피코프나바이러스이다.
다른 측면에서, 본 발명은 (a) PLA2G16 억제제; (b) 바이러스 및 (c) 세포 집단(population)을 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 바이러스는 적어도 0.01의 MOI(multiplicity of infection)를 가진다. 일 구체예에서, 상기 바이러스는 피코르나바이러스이다. 일 구체예에서, 상기 세포는 배양세포이다. 일 구체예에서 상기 세포는 척추동물 세포이다. 일 구체예에서 상기 세포는 포유동물 세포, 즉 인간 세포이다. 일 구체예에서, 상기 세포 집단은 적어도 102, 103, 104, 105, 106, 107, 또는 그 이상의 세포를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 일 구체예에서, 적어도 일부 세포는 바이러스에 감염되어 있다. 일 구체예에서, 상기 PLA2G16 억제제는 PLA2G16에 결합한다. 일 구체예에서, 상기 PLA2G16 억제제는 PLA2G16의 발현을 억제한다. 일 구체예에서, 상기 PLA2G16 억제제는 PLA2G16의 효소 활성을 억제한다. 일 구체예에서, 상기 PLA2G16 억제제는 소분자이다. 일 구체예에서, 상기 PLA2G16 억제제는 상기 바이러스에 의한 세포의 감염을 억제하는 것을 감지할 수 있을 만큼 충분한 양으로 존재한다.
일 측면에서, 본 발명은 PLA2G16 억제제를 포함하는, 개체의 바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 PLA2G16 억제제는 PLA2G16에 결합한다. 일 구체예에서, 상기 PLA2G16 억제제는 PLA2G16의 발현을 억제한다. 일 구체예에서, 상기 PLA2G16 억제제는 PLA2G16의 효소 활성을 억제한다. 일 구체예에서, 상기 PLA2G16 억제제는 소분자이다. 일 구체예에서, 상기 바이러스 감염은 피코르나바이러스 감염이다. 일 구체예에서, 상기 개체는 척추동물이다. 일 구체예에서, 상기 개체는 포유동물, 즉 인간이다.
다른 측면에서, 본 발명은 PLA2G16을 암호화하는 유전자에 돌연변이를 가지는 포유동물 세포를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 세포는 반수체에 근접한 포유동물(near-haploid mammalian) 세포이다. 일 구체예에서, 상기 세포는 PLA2G16의 돌연변이형을 발현하고, 상기 돌연변이형은 비돌연변이형과 비교하여 감소된 촉매 활성을 가진다.
다른 측면에서, 본 발명은 바이러스 감염 저항성이 증가된 비인간 다세포 생물체(non-human multicellular organism), 즉 척추동물을 동정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 기능성 PLA2G16이 없거나 감소된 다세포 생물체를 동정하느 방법을 포함한다. 다른 구체예에서 본 발명은 바이러스 감염 저항성이 증가된 비인간 다세포 생물체를 제공하고, 상기 방법은 상기 생물체가 감소된 PLA2G16 발현 또는 활성을 가진 다세포 생물체를 동정하는 방법을 제공하는데, 만약 상기 생물체가 PLA2G 16 발현 또는 활성이 감소되었다면 상기 생물체가 바이러스 감염 저항성이 증가된 것이다. 일 구체예에서, 상기 방법은 감소된 PLA2G16 또는 PLA2G16이 없는 동물을 제공하고 농업 및/또는 축산에 이용하는 것을 제공한다. 일 구체예에서, 바이러스 저항성 동물은 비축산종이다. 선택적으로 상기 종은 위험한 것이다. 일 구체예에서, 상기 생물체는 상업적으로 중요한 척추동물이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 생물체는 유전적으로 변형된 것이 아니다.
다른 측면에서, 본 발명은 감소된 PLA2G16 또는 PLA2G16이 없는 동물로, 상기 동물은 바이러스 감염에 대한 저항성이 증가한 농장 동물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 동물은 유전적으로 변형된 것이 아니다. 다른 구체예에서, 상기 동물은 유전적으로 변형된 것이다.
본 발명의 측면의 일부 구체예에서, 피코르나바이러스는 엔테로바이러스이다 (엔테로바이러스 속의 일원). 일부 구체예에서, 상기 엔테로바이러스는 인간 엔테로바이러스이다, 예를 들어, 인간 엔테로바이러스 A, 인간 엔테로바이러스 B, 인간 엔테로바이러스 D, 인간 리노바이러스 A, 인간 리노바이러스 B, 인간 리노바이러스 C 종으로 분류되는 바이러스이다. 몇몇 구체예에서, 상기 인간 엔테로바이러스는 폴리오바이러스 1, 2, 또는 3 또는 인간 엔테로바이러스 68-107 중의 어떤 바이러스이다, 예를 들어, EV-71. 본 발명의 측면의 일부 구체예에서, 상기 피코르나바이러스는 헤파토바이러스, 예를 들어, 인간 A형 간염(hepatitis A) 바이러스이다. 본 발명의 측면의 일부 구체예에서, 상기 피코르나바이러스는 콕사키바이러스이다. 일부 구체예에서, 상기 콕사키바이러스는 인간 콕사키바이러스, 예를 들어, 콕사키바이러스 A1 -A22, A24, 또는 B 1 -B5 중 어느 콕사키바이러스이다. 본 발명의 측면의 일부 구체예에서, 상기 피코르나바이러스는 리노바이러스 (인간 리노바이러스 A, 인간 리노바이러스 B, 또는 인간 리노바이러스 C 종의 일원), 예를 들어, 인간 리노바이러스 1-100 중 어느 리노바이러스이다. 본 발명의 측면의 일부 구체예에서, 상기 피코르나바이러스는 에코바이러스(echovirus)이다. 본 발명의 여러 측면 중 일부 구체예에서, 상기 바이러스는 구제역 바이러스, 예를 들어, 일곱 개의 구제역 바이러스 혈청형: 0, A, C, SAT- 1, SAT-2, SAT-3, 및 Asia-1 중 하나이다.
본 발명은 대개 따로 명시하지 않는 한, 당업계 내의 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 핵산 (예를 들어, DNA) 기술, 면역학, 및 RNA 간섭 (RNAi)의 종래의 기술들을 사용하여 실행될 것이다. 상기 기술들의 어떤 비-제한적인 설명이 하기 문헌들에서 발견된다: Ausubel , F., et al., ( eds .), Current Protocols in Molecular Biology , Current Protocols in Immunology, Current Protocols in Protein Science, 및 Current Protocols in Cell Biology, December 2008; Sambrook, Russell의 에디션인 모든 John Wiley ＆ Sons, N.Y., and Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001 ; Harlow, E. and Lane, D., Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988; Freshney, R.I., "Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique", 5th ed., John Wiley ＆ Sons, Hoboken, NJ, 2005. 바이러스들에 대한 비-제한적인 정보가, 예를 들어, Knipe, DM and Howley, PM (eds.) Fields Virology, Volumes I 및 II. 5th ed. Lippincott Williams and Wilkins, 2007; Buchen-Osmond, C. (Ed), (2006) Index to ICTVdB virus descriptions. In: ICTVdB - The Universal Virus Database, version 4. ICTVdB Management, Mailman School of Public Health, Columbia University, New York, NY, USA; 및 "ICTVdB - The Universal Virus Database", version 4, April 2006. http://www.ictvdb.org/Ictv/ICTVindex.htm) 및 ICTVdb Virus Descriptions (http://www.ictvdb.org/ICTVdB/index.htm) 에서 발견된다. (온라인 데이터베이스가 현재 개정되고 있음에 주의하고 있다.) 국제 미생물학회 연합(International Union of Microbiological Societies)의 국제 바이러스 분류위원회(International Committee on the Taxonomy of Viruses, ICTV)의 가장 최근의 보고: "Virus Taxonomy: VIHth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses", 2005, CM. Fauquet, M.A. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger, and L.A. Ball (Eds), Elsevier Academic Press가 바이러스 분류학 (분류 및 명명법)을 위한 표준 및 결정적인 참고 문헌으로 고려되며, 그 뒤에 ICTV (ICTV 웹사이트 http://talk.ictvonline.org/media 22/default.aspx/. http://talk.ictvonline.org/files/ictv_official_taxonomy_updates_since_the_8th_report/defau aspx에서 갱신함으로써 이용 가능하다)에 의해 공인되는 분류 제안에 의해 보충된다 (또한, Carstens, EB and Ball, L. Ratification vote on taxonomic proposals to the International Committee on Taxonomy of Viruses. Archives of Virology, Volume 154, Number 7, 2008, 및 Carstens, E. Ratification vote on taxonomic proposals to the International Committee on Taxonomy of Viruses (2009) Archives of Virology, Volume 155, Number 1 , 2009를 참고하라). 바이러스 분류학: 2009 Release v4 (March 20, 2010) (ICTV 웹사이트 에서 이용 가능하다)은 가장 최근의 분류학을 보여준다.
치료제 및 인간 질병에 대한 비-제한적인 정보는 Goodman and Oilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1 1th Ed., McGraw Hill, 2005, Katzung, B. (ed.) Basic and Clinical Pharmacology, McGraw-Hill/Appleton ＆ Lange; 10th ed. (2006) or 1 1th edition (July 2009)에서 발견된다. 본 발명에서 언급된 모든 특허들, 특허 출원들, 및 다른 간행물들 (예를 들어, 과학 기사들, 책들, 웹사이트들, 및 데이터베이스)은 그들 전체가 참조로서 포함된다. 명세서와 다른 포함된 참고문헌의 충돌시, 상기 명세서 (포함된 참고문헌에 기초할 것인 그의 구체예을 포함하는)가 조절할 것이다. 따로 명시되지 않는 한, 당업계-통상적인(Standard art-accepted) 용어의 의미가 본 발명에서 사용되었다. 다양한 용어에 대해 표준 약어가 본 발명에서 사용되었다.
도 1. A. 내생 유전자에서의 유전자-트랩 벡터 인테그레이션 도표. B. 폴리오바이러스 복제에 중요한 유전자에 대한 반수체 유전자 검색 도표.
도 2. 반수체 유전자 검색은 폴리오바이러스 감염에 중요한 것으로 PLA2G16를 동정한다. 돌연변이된 반수체 세포들은 폴리오바이러스와 접촉되었으며 저항성을 가지는 콜로니들이 생장되었다. 유전자 트랩 삽입 위치가 역 PCR 및 대량 병렬 시퀀싱을 이용하여 측정되었다. 상기 도는 각각의 유전자 트랩 돌연변이를 x-축에 및 특정 돌연변이와 그 이웃한 돌연변이와의 거리의 역수를 y-축에 맵핑하기 위해 인간 염색체 위에서 위치를 보여준다. 돌연변이는 폴리오바이러스 수용체(PVR)가 있는 것으로 잘 알려진 염색체 19 및 42 비의존적 유전자 트랩 삽입을 함유하는 포스포리파아제 PLA2G16가 있는 염색체 11에 매우 많다.
도 3. 야생형 반수체 세포 (WT; 레인 1), 유전자 트랩 삽입을 함유하는 세포, PLA2G16 유전자에 유전자 트랩 삽입을 함유하는 세포 (PLA2G16GT; 레인 2), PLA2G16에 유전자 트랩을 함유하고 FLAG-태깅된 PLA2G16를 발현하는 세포 (레인 3); PLA2G16에 유전자 트랩을 함유하고 FLAG-태깅된 돌연변이 PLA2G16를 발현하는 세포 (레인 4); PLA2G16에 유전자 트랩을 함유하고 태깅 안된 PLA2G16를 발현하는 세포 (레인 5); PLA2G16에 유전자 트랩을 함유하고 태깅 안된 돌연변이 PLA2G16를 발현하는 세포 (레인 6)에서의 PLA2G16의 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석.
도 4. PLA2G16 유전자 트랩 삽입을 함유하는 반수체 세포들은 폴리오바이러스 감염에 저항성을 가진다. 레트로바이러스 과발현에 의한 PLA2G16 보완은 상기 세포들의 폴리오바이러스에 대한 민감도를 회복시킨다. 촉매 위치 돌연변이 (C113A)에 의한 보완이 민감도를 회복시키기 않기 때문에 이 것은 PLA2G16의 촉매 활성을 요구한다.
도 5. PLA2G16 유전자 트랩 삽입을 함유하는 세포들은 콕사키바이러스 B1에 저항성을 가진다. 세포들은 24-웰의 웰에 플레이팅되고 나타낸 단층의 MOI에 바이러스가 첨가되었다. 감염 성공 사일 후, 부착된 세포들은 크리스탈 바이올렛으로 염색되었다. PLA2G16 돌연변이 세포들은 높은 농도의 콕사키바이러스 B1에 효과적이지 않았다. 레트로바이러스 과발현에 의한 PLA2G16의 보완은 상기 세포들의 콕사키바이러스 B1에 대한 민감도를 회복시켰다. 촉매 위치 돌연변이 (C113A)에 의한 보완이 민감도를 회복시키기 않기 때문에 이 것은 PLA2G16의 촉매 활성을 요구한다.
도 6. (A) 야생형 및 유전자 트랩 돌연변이 세포의 폴리오바이러스에 대한 민감도. (B) 야생형 유전자 트랩 돌연변이 세포의 콕사키바이러스 B1에 대한 민감도. 폴리오바이러스는 나타낸 세포의 MOI 에 첨가되었고 (X-축) MTT 분석을 이용하여 3일 후에 생존 능력이 측정되었다. HAP1 : 야생형 HAP1 세포 (유전자 트랩 없는) PLA2G16: PLA2G16 유전자에 유전자 트랩 삽입을 함유하는 (PLA2G16GT) HAP1 세포 PLA2G16+PM2G 16WT: 야생형 PLA2G16를 암호화하는 레트로바이러스로 감염된 HAP1 PLA2G16GT 세포 PLA2G16+PM2G 16MUT: 촉매 불활성 돌연변이 PLA2G16 (C113A 돌연변이와 함께)를 암호화하는 레트로바이러스로 감염된 HAP1 PLA2G16GT 세포 PVR: 폴리오바이러스 수용체로의 유전자 트랩 삽입이 있는 HAP1 세포.
도 7. Hela 세포에서의 PLA2G16의 낙다운은 인간 리노바이러스 HRV-2 및 HRV-14에 대하여 저항성을 증가시킨다.
도 8. PLA2G16 서열의 예. 예상되는 막관통 도메인이 인간 서열에서 볼드체로 나타내어진다.
I. 정의
용어 “항체(antibody)”는 면역글로불린들(immunoglobulins) 및 항원에 결합 가능한 면역글로불린 도메인을 함유하는 그의 파생물들(derivatives)을 포함한다. 항체는 포유동물, 예를 들어, 인간, 설치류(rodent) (예들 들어, 쥐, 토끼), 염소, 닭, 등 또는 조류(avian species)로부터 유래할 수 있으며, 또는 파지 디스플레이(phage display)와 같은 기술을 이용하여 생체외(ex vivo)에서 만들 수 있다.
항체들은 다양한 클래스의 면역글로불린 일원들을 포함한다, 예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, 또는 IgGl, IgG2와 같은 그의 서브클래스(subclasses), 등. 본 발명의 여러 구체예에서, “항체”는 항원 결합 자리를 보유하는 Fab', F(ab')2, scFv (단쇄 가변(single-chain variable))와 같은 항체 단편 또는 분자를 말하며 포함한다.
재조합 분자들은 하나 또는 그 이상의 다양한 도메인들 (VH or VL)을 포함한다. 항체는 여러 구체예에서 일가(monovalent), 이가(bivalent) 또는 다가(multivalent)일 수 있다. 항체는 키메릭(chimeric) 또는 “인간화 (humanized)된” 항체일 수 있다. 항체는 다중클론(polyclonal) 또는 단일클론(monoclonal)일 수 있으나, 단일클론 항체가 바람직할 것이다. 몇몇 측면에서, 항체는 체내(intrabody)에 존재하고, 세포 내에서(intracellularly) 발현될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 화합물은 단-쇄(single-chain) 항체 및 단백질 전달 도메인(protein transduction domain)를 포함한다 (예를 들어, 융합 폴리펩타이드로서).
화합물 또는 다른 약제 (또는 그런 화합물 또는 약제를 포함하는 조성물)의 “유효량(effective amount)” 또는 “유효용량(effective dose)”은 예를 들어, 선택된 투여 형태, 경로 및/또는 일정대로 세포 또는 기관에 전달되었을 때, 원하는 생물학적 및/또는 약학적인 효과를 얻기에 충분한 양을 말한다. 당업계에 종사하는 당업자들에 의해 평가되는 것과 같이, 특정 화합물, 약제, 또는 조성물의 유효한 절대량은 원하는 생물학적 또는 약학적 종점(endpoint), 전달될 약제, 표적 조직, 등과 같은 인자들에 따라 다를 것이다. 당업계의 당업자는 “유효량”이 세포와 접촉하거나 단일 용량으로 투여되거나, 또는 다중용량(multiple doses)의 이용에 의해 원하는 효과를 얻을 수 있는 것을 더 이해할 것이다. 항바이러스 화합물의 유효량은 하기 중에 하나 또는 그 이상을 얻기에 충분한 양일 것이다: (i) 세포 배양 및/또는 생체내에서 바이러스 복제 감소 (예를 들어, 자손 바이러스(progeny virus)의 생산 감소); (ii) 바이러스 감염의 강도 감소 또는 하나 또는 그 이상의 증상 또는 신호 예방; (iii) 유의미한 바이러스 감염의 재발(recurrence) 위험 감소 (예를 들어, 재발(relapse) 위험 감소); (iv) 감염원(infectious agent), 등에 노출된 개체에서의 임상적으로 유의미한 감염의 유의미한 위험 감소.
“동일성(Identity)” 또는 “동일성 비율(percent Identity)”은 둘 또는 그 이상의 핵산 서열 또는 폴리펩타이드의 같은 정도이다. 목적 서열 A 및 두 번째 서열 B사이의 동일성 비율은 서열을 정렬하고(aligning), 동일성을 최대화하기 위한 갭 도입을 허용하며, 동일한 잔기와 반대되는 잔기 (뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 측정하고, TGA 및 TGB(여기에서 TGA 및 TGB는 정렬에서 서열 A 및 B의 잔기 및 내부 갭 위치 수의 합이다)의 최소치로 나누어, 100을 곱하여 계산될 것이다. 특정 동일성 비율을 얻기 위해 필요한 동일한 잔기(identical residues)의 수를 계산할 때, 분수들(fractions)은 정수(whole number) 중에 가장 가까운 수로 반올림된다. 서열들은 당업계에 통상적인한 다양한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 정렬된다. 예를 들어, BLAST2, BLASTN, BLASTP, Gapped BLAST, 등과 같은 컴퓨터 프로그램으로 정렬한다. Karlin 및 Altschul, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:5873-5877,1993와 같이 변형된 Karlin 및 Altschul (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:22264-2268, 1990)의 알고리즘은 Altschul et al. (Altschul, et al., J, Mol. Biol. 215:403-410, 1990)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 포함된다. 몇몇 구체예에서, 비교 목적으로 갭이 있는 정렬(gapped alignments)을 얻기 위해, Gapped BLAST가 Altschul et al. (Altschul, et al. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997)에 기재된 바와 같이 이용되었다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램의 기본 변수들(default parameters)이 사용될 것이다. 웹사이트 URL www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조하라. 다른 적합한 프로그램은 CLUSTALW (Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ, Nuc Ac Res, 22:4673-4680, 1994) 및 GAP (GCG Version 9.1; Needleman ＆ Wunsch, 1970 algorithm을 시행 (Needleman SB, Wunsch CD, J Mol Biol, 48:443-453, 1970.))를 포함한다.
“감염(Infection)”은 세포 (때때로 “숙주 세포” 또는 “숙주(host)”라고 불리는) 또는 다세포 기관 (때때로 “숙주”라고 불리는)의 바이러스와 같은 미생물(microorganism)에 의한 (종종 해로운(detrimental)) 군체 형성(colonization)을 말한다. 감염의 과정은 바이러스가 하나 또는 그 이상의 세포(들)로 들어가는 것 (침입(invasion)) 및, 만일 감염이 진행되었다면, 바이러스 생활 주기, 특히, 바이러스의 증식 및 자주 바이러스의 경우에는 의학적 또는 수의학적 중요한 숙주에서의 바이러스의 해로운 효과를 야기하는 순차적인 단계를 포함한다. 바이러스 감염은 하나 또는 그 이상의 바이러스 군집(들)의 존재가 숙주 세포 또는 기관을 손상시키는 상황일 수 있다. 용어 “감염”은 평소에 척추동물, 예를 들어, 포유동물(mammal)의 신체 내 또는 위, 또는 다른 기관에 존재하는 바이러스의 지나친 복제를 포함하며, 또는 척추동물, 예를 들어, 포유동물의 신체 내 또는 위, 또는 다른 기관에 평소에 존재하는 바이러스의 존재 및 선택적으로, 복제를 포함한다.
“억제하다(Inhibit)”는 문맥적으로 “저해하다(suppress)” “감소시키다(decrease)”, 등등과 같은 용어와 혼용된다. 억제의 정도가 다양할 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 억제는 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 감소를 말할 수 있다.
“분리된(Isolated)”은 적어도 주로 인간에 의해 수반하는 과정에 의해 보통 자연에서 발견되는 다른 물질로부터 분리된(separated) 물질, 또는 인위적으로 생산된 물질, 예를 들어, 화학적으로 합성된, 또는 인공적인 환경에 존재하는 물질을 말한다.
“핵산(Nucleic acid)”은 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”와 혼용되며, DNA 및 RNA와 같은 뉴클레오시드들의 주로 포스포디에스터 결합에 의해 연결된 자연 발생적 폴리머들 및 뉴클레오시드들(nucleosides) 또는 뉴클레오시드 유사체(analogs)들의 비-자연 발생적 폴리머들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 핵산은 기 뉴클레오티드들 (약칭 A, G, C, T, U)을 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산은 하나 또는 그 이상의 비-표준 뉴클레오티드들 포함한다. 몇몇 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드들은 비-자연 발생적 뉴클레오티드들 또는 뉴클레오티드 유사체들이다. 핵산은 화학적 또는 생물학적으로 변형된 염기들 (예를 들어, 메틸화된 염기들), 변형된 당들(sugars) (2'-플루오로리보오스(fluororibose), 아라비노스(arabinose), 또는 헥소스(hexose)), 변형된 인산기(phosphate groups) (예를 들어, 포스포로티오에이트(phosphorothioates) 또는 5'-N-포스포라미디트(phosphoramidite) 결합), 잠금 핵산(locked nucleic acids), 또는 몰폴리노들(morpholinos)을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 포스포디에스터(phosphodiester) 결합에 의해 연결된 핵산은 뉴클레오시드들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 적어도 몇몇 뉴클레오시드들은 비-포스포디에스터 결합에 의해 연결되었다. 핵산은 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 부분적 이중-가닥일 수 있다. 적어도 부분적 이중-가닥 핵산은 하나 또는 그 이상의 돌출부(overhangs) 예를 들어, 5’ 및/또는 3’ 돌출부(들)를 가질 수 있다. 연구 또는 치료적 목적을 위한, RNA 간섭(interference) (RNAi) 관점에서 당업계에 유용한 것으로 알려진 핵산 변형 (예를 들어, 뉴클레오시드 및/또는 백본(backbone) 변형), 비-표준 뉴클레오티드들, 비히클 전달 및 접근 등, 앱타머(aptamer), 또는 안티센스-기반(antisense-based) 분자들이 본 발명의 다양한 구체예에서의 이용을 위해 고려된다. 예를 들어, Crooke, ST (ed.) Antisense drug technology: principles, strategies, and applications, Boca Raton: CRC Press, 2008; Kurrcek. J. (ed.) Therapeutic oligonucleotides, RSC biomolecular sciences Cambridge: Royal Society of Chemistry, 2008. 참조. 핵산은 검출 가능한 라벨, 예를 들어, 형광 염료, 방사선 원자, 등을 포함할 것이다. “올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide)”는 비교적 짧은 핵산, 예를 들어, 일반적으로 약 4 내지 약 60개의 뉴클레오티드 길이를 말한다.
“폴리펩타이드(polypeptide)”는 펩타이드 결합으로 연결된 아미노산 폴리머를 말한다. 단백질은 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 분자이다. 펩타이드는 비교적 짧은 폴리펩타이드, 일반적으로 약 2 내지 60개의 아미노산 길이를 말한다. 용어 “단백질(protein)”, “폴리펩타이드(polypeptide)”, 및 “펩타이드(peptide)”는 혼용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 표준 아민산들 (자연 단백질로 가장 일반적으로 발견되는 20 L-아미노산들)을 종종 함유한다. 그러나, 당업계에 통상적인 다른 아미노산들 및/또는 아미노산 유도체들이 본 발명의 일부 구체예에서 사용될 수 있다. 폴리펩타이드의 하나 또는 그 이상의 아미노산들 (예를 들어, N- 또는 C-말단의 또는 측쇄의)은 예를 들어, 알킬기(alkyl group), 카보하이드레이트기(carbohydrate group), 인산기(phosphate group), 할로겐(halogen), 접합(conjugation)을 위한 링커(linker), 등과 같은 모이어티(moiety)의 공유 결합(covalent linkage) 추가에 의해 변형될 수 있다. 본 발명에 나타낸 폴리펩타이드 서열은 별도의 표시가 없으면 N-말단에서 C-말단 방향으로 기재하였다. “폴리펩타이드 도메인”은 더 긴 폴리펩타이드 내의 아미노산 부분(segment)을 말한다. 폴리펩타이드 도메인은 하나 또는 그 이상의 개별(discrete) 결합 또는 기능적 성질, 예를 들어, 촉매 활성을 나타낼 것이다. 종종 도메인은 그것의 보존에 의해 여러 다른 종들에서 발견된 폴리펩타이드들 중에서 알 수 있다.
본 발명에 기재된 바와 같이, 용어 “정제된(purified)”은 사실상 그들이 관련된 또는 원래 만들어진 조성물의 대부분으로부터 분리된 약제 또는 실체(entities) (예를 들어, 화합물)를 말한다. 일반적으로, 그러한 정제는 인간에 의한 활동을 수반한다. 정제된 약제 또는 실체는 부분적으로 정제, 대체로 정제되거나, 또는 순수한 물질일 수 있다. 그런 약제 또는 실체는, 예를 들어, 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%o, 96%o, 97%o, 98%o, 99%, 또는 99% 이상 순수할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 핵산 또는 폴리펩타이드는 적어도 75%, 80%, 855%, 90%, 95%o, 96%, 97%, 98%o, 99%, 또는 그 이상의 총 핵산 또는 폴리펩타이드 재료를 구성하도록 정제된다. 각각, 제제에 나타내어진다. 순도(Purity)는 예를 들어, 건조 중량, 크로마토그래피 트레이싱(chromatography tracing) 피크의 크기, 분자 존재도(abundance), 젤에서의 밴드의 강도(intensity), 또는 분자 존재도와 관련된 어떤 신호의 세기, 또는 어떤 당업계에 받아들여지는 정량 방법에 기초할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 물, 완충액(buffers), 이온(ions), 및/또는 소분자들 (전구체, 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산)이 정제된 제제(preparation)에 선택적으로 존재할 수 있다. 정제된 분자는 다른 물질들 (예를 들어, 다른 세포 물질들)로부터의 분리, 또는 원하는 순도로 얻기 위해 이런 식으로 생산하여 제조될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 정제된 분자 또는 조성물은 당업계에 받아들여지는 정제 방법을 사용하여 제조된 분자 또는 조성물을 말한다. 몇몇 구체예에서, “부분적으로 정제된”은 세포에 의해 생산된 분자가 세포 내에 더 이상 존재하지 않는 것을 의미한다, 예를 들어, 세포가 파쇄되고, 선택적으로 적어도 세포 물질 (예를 들어, 세포벽, 세포막(들), 세포 기관(들))의 일부가 제거된.
"RNA 간섭” (RNAi)는 리보핵단백질복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)로 알려진 내생 분자(endogenous molecular) 복합체가 서열-특이적 상황에서 유전자 발현을 침묵시키는 과정을 포함한다. RISC는 상보적인 mRNA의 서열-특이적 분해(degradation) 또는 번역 억제(repression)를 안내 또는 “가이드(guides)”하는 짧은 RNA 가닥을 함유한다. 짧은 RNA 및 mRNA는 완벽히 (100%) 상보적 (complementarity) 일 필요 없다. 예를 들어, mRNA 및 짧은 RNA 가닥의 상보적인 정도 및/또는 혼성화에 의해 형성된 구조의 특성은 (i) 리보핵단백질복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)에서의 mRNA의 절단(cleavage) 가이드 및/또는 (ii) RISC에 의한 mRNA의 번역 억제를 야기할 수 있다. 가이드 가닥 및 표적 mRNA 사이의, 특히, 가이드 가닥의 시드 영역(seed region) (2-7 또는 2-8 위치의 뉴클레오티드)의 바깥쪽에 하나 또는 그 이상의 불일치(mismatch)가 용인될 수 있음을 확인할 수 있을 것이다. 침묵을 가이드하는 짧은 RNA는 종종 짧은 이중-가닥 RNA (dsRNA) 부분으로서 처음에 RISC 컴포넌트(components) (RISC 전달 복합체로도 가끔 불리우는 복합첼로)와 관련되게 된다. RNAi는 종종 표적 유전자를 낙다운(knockdown)하기 위해 사용된다.
“낙다운(knockdown)”은 일반적으로 발현에서의 감소를 말하며, 예를 들어, 전사, mRNA 안정성, 번역, 또는 단백질 안정성 수준에서 발생할 것이다. 감소는 완전하거나 (예를 들어, 유전자 산물의 양이 배경 값 정도로 감소되었다) 또는 보다 덜 완전할 수 있다. 예를 들어, mRNA 및/또는 단백질 수준은 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 그 이상으로 감소될 수 있다.
RNAi는 당업계에 통상적인 다양한 방법으로 진핵 세포에서, 예를 들어, 척추동물 세포의 발현을 억제하기 위해 이용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 짧은 이중-가닥 핵산은 세로 도입될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 짧은 dsRNA를 만들기 위해 세포 내에서 가공된(processed intracellularly) 핵산 (예를 들어, 하나 또는 그 이상의 RNase III 패밀리(family) 효소 다이서(Dicer)에 의해)은 세포로 도입되거나 발현된다. 본 발명에 기재된 바와 같이, “RNAi 약제” 용어는 진핵 세포에서 RNAi를 달성하기 위해 사용될 수 있는 핵산을 포함한다. RNAi 약제의 예는 짧은 간섭 RNA (short interfering RNA, siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA, shRNA)이다. 당업계에 통상적인 바와 같이, siRNA는 특히 이중(duplex)가닥을 형성하기 위해 서로 혼성화되는 두 분리된 핵산 가닥을 포함한다. 그들은 예를 들어, 표준 핵산 합성 기술을 사용하여 또는 더 긴 dsRNA, 예를 들어, Dicer와 같은 RNase III or RNase Ill 같은 효소에 의한 절단에 의해 생체 외(in vitro)에서 합성될 수 있다. 일부 구체예에서, siRNA 또는 shRNA는 약 15 내지 29 뉴클레오티드 (nt) 길이, 예를 들어, 17 내지 25 nt 길이, 예를 들어, 19 내지 23 nt 길이의 이중 부분을 포함하며, 데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기에서 가닥의 각각 또는 모두는 선택적으로 1 내지 5 뉴클레오티드 길이의 3’ 돌출부 (예를 들어, 2 뉴클레오티드)를 가진다. 몇몇 구체예에서, 가닥은, 다른 구체예에서 이중 부분이 하나 또는 그 이상의 미스매치 뉴클레오티드 쌍 또는 돌출부(bulges)를 함유할지라도, 이중 부분 내에서는 완전히 상동이다. 몇몇 구체예에서, 각각의 siRNA 가닥은 15 내지 29뉴클레오티드 길이이다, 예를 들어, 19 내지 25 nt 길이, 예를 들어, 21 내지 23 nt 길이이다. shRNA는 대부분 비-자기-상보적 부위(non-self-complementary region)로 분리된 두 상동 부분을 함유하는 단일 핵산 가닥을 포함한다. 상동 부분은 혼성화되어 이중 구조를 형성하며, 비-자기-상동 부위는 이중 가닥 중 한 가닥의3’ 말단 및 다른 가닥의 5’ 말단에 연결된 루프(loop)를 형성한다. shRNA들은 siRNA들을 만들기 위해 세포 내 가공을 겪을 수 있다.
또한, RNAi 약제는 마이크로RNA (microRNA, miRNA) 또는 miRNA 전구체를 포함한다. 용어 “miRNA” 및 “miRNA 전구체”는 종종 당업계에서 내생적으로 암호화된 RNA들을 나타내기 위해 사용된다. 본 발명에 기재된 바와 같이, “miRNA” 및 “miRNA 전구체”는 내생 miRNA들과 유사한 방식으로 기능하는 인공적으로 설계된 핵산을 포함한다.
일부 구체예에서, RNAi 약제는 siRNA (예를 들어, 서로에게 혼성화될 수 있는 두 분리된 가닥), shRNA, 또는 마이크로RNA 전구체의 전사를 위한 주형(template)을 포함하는 벡터이다. 그런 벡터들은 주형을 척추동물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포에 도입하기 위해 사용될 수 있으며, siRNA, shRNA, 또는 마이크로RNA 전구체의 일시적 또는 안정적인 발현을 초래한다.
본 발명에 기재된 “소분자(small molecule)”는 약 2 킬로달톤 (kilodaltons, KDa)보다 적은 질량의 유기 분자이다. 일부 구체예에서, 소분자는 약 1.5 KDa 보다, 또는 약 1 KDa 보다 적다. 몇몇 구체예에서, 소분자는 약 800 달톤 (Da), 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 또는 100 Da 보다 적다. 종종, 소분자는 적어도 50 Da의 질량을 가진다. 몇몇 구체예에서, 소분자는 비-중합체(non-polymeric)이다. 몇몇 구체예에서, 소분자는 아미노산이 아니다. 몇몇 구체예에서, 소분자는 뉴클레오티드가 아니다. 몇몇 구체예에서, 소분자는 당류(saccharide)가 아니다. 몇몇 구체예에서, 소분자는 다중 탄소-탄소 결합을 함유하며, 하나 또는 그 이상의 이원자(heteroatoms) 및/또는 다른 단백질과 구조적 상호작용 (예를 들어, 수소 결합)에 중요한 하나 또는 그 이상의 작용기(functional groups), 예를 들어, 아민, 카보닐, 하이드록실, 또는 카르복실기를 포함할 수 있고, 몇몇 구체예에서는 적어도 두 개의 작용기를 포함할 수 있다. 소분자는 종종 선택적으로 하나 또는 그 이상의 상기 작용기로 치환된, 하나 또는 그 이상의 사이클릭 탄소(cyclic carbon) 또는 헤테로사이클릭(heterocyclic) 구조 및/또는 방향족(aromatic) 또는 다중방향족(polyaromatic) 구조를 포함한다.
“개체(subject)”는 예를 들어, 바이러스 감염에 민감한 또는 바이러스에 감염되었을지도 모르는 다세포 생물(multicellular organism)일 수 있다. 종종 적어도 개체의 세포 중 일부가 검출 가능한 양의 PLA2G16을 발현한다. 몇몇 구체예에서, 개체는 동물이다, 예를 들어, 척추 동물, 예를 들어, 포유동물 또는 조류이다. 포유동물의 예는, 예를 들어, 인간, 비-인간 유인원, 설치류 (예를 들어, 쥐, 랫트, 토끼), 유제류(ungulates) (예를 들어, 양(ovine), 소(bovine), 말(equine), 염소(caprine) 종들), 개(canines), 및 고양이(felines)들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 동물은, 소, 말, 돼지, 염소, 또는 양과 같이 경제적으로 중요한 포유동물이다. 종종, 개체는 예를 들어, 실험, 진단, 및/또는 치료적 목적을 위해 화합물이 전달되는 개체 또는 개체로부터 얻어진 시료 또는 진단 방법이 수행된 개체이다 (예를 들어, 개체가 바이러스 감염이 있는지 또는 바이러스 감염의 위험이 있는지 검출하기 위해 이용되는 시료 또는 방법).
“치료하다(Treat)”, “치료(treating)” 및 유사한 용어는 개체의 의학 및/또는 외과적 관리를 제공하는 것을 말한다. 치료는 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 약학적 조성물)을 개체에 투여하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 치료는 특히 질병, 장애, 또는 원하지 않는 질환의 과정을 개체에 유익한 방식으로 변하게 해보려는 노력으로 받아들여진다. 치료의 효과는 일반적으로 반전(reversing), 완화(alleviating), 강도의 감소, 발병의 지연, 치유(curing), 진행의 억제, 및/또는 그런 용어가 적용되는 질병, 장애 또는 질환의 발생 또는 재발(reoccurence) 가능성의 감소, 또는 그런 질병, 장애 또는 질환의 하나 또는 그 이상의 증상들 또는 징후(manifestations)들을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 발달된 감염을 가지는 개체 또는 일반 대중의 일원과 관련된 감염 발달의 위험이 증가된 개체에 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 예방을 위해, 즉, 질환의 증상 또는 징후의 발달 전에 투여될 수 있다. 이런 경우에, 특히 개체는 질환 발달의 위험이 있을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물이 개체의 감염원(infectious agent) 노출 전에 또는 발병시키는 사건(pathogenic event) 발생 전에 투여될 수 있다. “예방(Preventing)”은 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 약학적 조성물)을 발달된 질병 또는 질환을 가지지 않은 개체에 질병 또는 질환이 발생할 가능성을 감소시키기 위해서 또는 질병 또는 질환이 발생할 강도를 감소시키기 위해서 투여하는 것을 말한다. 개체는 질병 또는 질환 발달 위험으로 식별될 것이다 (예를 들어, 대중의 대부분의 다른 많은 일원들과 관련된 증가된 위험에서 또는 질병의 발달 가능성을 증가시키는 위험 인자를 가지는).
II . 개요
본 발명은 부분적으로 항바이러스(antiviral) 화합물의 식별 및/또는 묘사하기 위한 용도의 새로운 표적 분자로서의 포스포리파아제(phospholipase) A2, 군 XVI (PLA2G16)을 확인(identification)하는 것에 관한 것이다. PLA2G16은 포유동물 조직에서 폭넓게 또는 보편적으로 발현되는 포스포리파아제이다. PLA2G16 폴리펩타이드가 척추동물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포의 피코르나바이러스 과(Picornavirus family) 바이러스에 의한 감염에서 중요한 역할을 하는 숙주 세포 인자인 것으로 발견되었다. 본 발명은 PLA2G16 억제가 바이러스 감염을 억제함을 포함한다. 근접-반수체(near-haploid) 포유동물 세포주 (HAP1 세포주)에 유전자 트랩 돌연변이 전략(gene trap mutagenesis strategy)을 이용한, 실시예에 더욱 구체적으로 기재된 바와 같이, PLA2G16 유전자 (인간 세포의 염색체 11에 위치한)로의 삽입은 감염에 폴리오바이러스(poliovirus) 및 콕사키 바이러스(Coxsackie virus) Bl에 대한 세포 저항성을 제공하는 것을 나타냈다. 촉매작용으로 돌연변이 PLA2G16 버전이 발현된 경우에는 아닌 반면, 세포에서의 야생형 PLA2G16 발현에 의한 야생형 PLA2G16 기능의 복원은 감염 민감도를 복원시켰다. 또한, 리노바이러스(rhinovirus)-민감도 세포주 (He La 세포들)에서의 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 이용한 내생 PLA2G16 발현의 낙다운은 상기 세포들을 리노바이러스 감염에 저항성을 갖게 하였다. 본 발명에 기재된 발견들은 넓은 범위의 바이러스들에 의한 척추동물 세포들의 감염에 PLA2G16가 필요함을 보여준다.
본 발명은 바이러스 감염을 억제하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 바이러스 감염을 억제하기 위한 후보 화합물을 식별하기에 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 몇몇 측면에서, 상기 화합물 및 방법은 항바이러스 화합물 (즉, 바이러스 감염을 억제하는 화합물)의 식별 표적으로서의 PLA2G16 유전자 및/또는 PLA2G16 폴리펩타이드 이용에 관한 것이다. 본 발명의 방법의 일부는 PLA2G16을 억제하는 화합물을 식별하는 것 또는 제공하는 것을 포함한다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, PLA2G16을 억제하는 화합물은 항바이러스 후보 화합물이다. 본 발명의 일부 방법은 (i) PLA2G16을 억제하는 화합물을 식별 또는 제공하는 단계; 및 (ii) 상기 화합물이 세포 또는 다세포 생물의 바이러스 감염을 억제하는지 측정하는 단계를 포함하며, 상기에서 화합물이 세포 또는 다세포 생물의 바이러스 감염을 억제하면, 상기 화합물은 항바이러스 화합물이다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16을 억제하는 화합물은 PLA2G16의 발현을 억제한다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16을 억제하는 화합물은 PLA2G16 분자 기능을 억제한다, 예를 들어, 상기 화합물은 PLA2G16 촉매 활성을 억제한다.
바이러스 감염 억제는 바이러스 생활 주기의 하나 또는 그 이상의 단계를 억제하여, 예를 들어, 개입 없이 존재하는 정도와 같은 적절한 참조 값과 비교해서, 예를 들어, 바이러스의 세포로의 진입을 감소시키고, 바이러스 유전자 산물(들)을 감소시키며 (바이러스 RNA들 및/또는 단백질들), 자손 바이러스의 생산을 감소시키고, 자손 바이러스의 방출을 감소시키며, 및/또는 바이러스의 세포 집단 내 (예를 들어, 세포 배양 또는 다세포 생물체)로 퍼짐을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 바이러스 감염의 억제는 다양한 적합한 지표들(indicators)에 기초해서 측정될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 바이러스 감염 지표의 억제는 완전하거나 주로 완전하다, 바이러스 감염 지표, 예를 들어, 바이러스 유전자 산물의 생산, 자손 바이러스 생산, 추가적인 세포들의 감염은 예를 들어, 바이러스가 없을 때 예상되는 정도와 같은 배경값 또는 측정 불가능한 정도이다. 몇몇 구체예에서, 억제는 완전하지 않다. 몇몇 구체예에서, 바이러스 감염의 억제는 예를 들어, 자손 바이러스 또는 바이러스 유전자 생산물의 생산에서, 적어도 약 10 분의 1, 적어도 102 분의 1, 적어도 103 분의 1, 적어도 104 분의 1, 또는 그 이상을 나타낼 수 있다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 세포의 바이러스 감염을 억제하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 세포에서 PLA2G16을 억제함으로써 세포의 바이러스 감염을 억제하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 세포를 PLA2G16을 억제하는 화합물과 접촉하여 세포의 바이러스 감염이 억제되는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 세포는 예를 들어, 척수동물 세포와 같은 동물 세포이다. 몇몇 구체예에서, 척추동물 세포는 포유동물 세포이다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 방법을 개체의 바이러스 감염을 억제하는 제공한다. 몇몇 구체예에서, 개체는 척추동물이다. 몇몇 측면에서, 방법은 생물체의 예를 들어, 바이러스 감염된 또는 바이러스에 의한 감염에 민감한 최소한 일부 세포에서 PLA2G16 억제를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 방법은 PLA2G16을 억제하는 화합물을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 개체는 동물, 예를 들어, 척추동물이다. 몇몇 구체예에서, 상기 척추동물은 포유동물이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 PLA2G16을 세포 또는 적어도 개체의 일부 세포에서 억제하는 것을 포함하는, 세포 또는 개체의 바이러스에 대한 민감도를 감소시키는 (또는 저항력을 증가시키는) 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 세포 또는 개체가 감염되는 취약성(vulnerability) 또는 성향(propensity) 및/또는 바이러스에 의한 악영향을 경험하는 것을 감소시키는 방법을 제공한다. 바이러스에 대한 “저항성(Resistance)”은 일반적으로 감염에 대해 방어할 수 있는 능력을 말한다. 상세한 설명의 목적을 위해, 본 발명은 주로 바이러스 감염 억제 용어에 대해 기재할 것이다. 그러나, 따로 명시하지 않는 한, 본 발명의 세포 또는 개체의 바이러스 감염 억제 방법이 세포 또는 개체의 바이러스 감염에 대한 민감도를 억제하거나 세포 또는 개체의 바이러스 감염에 대한 저항성이 증가하는 것으로서 기재될 수 있음이 이해되어야 할 것이다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 개체를 위해 (a) 개체가 PLA2G16가 숙주 세포 인자(host cell factor)인 바이러스에 감염되었는지 측정하고; 및 (b) 개체가 PLA2G16가 숙주 세포 인자인 바이러스에 감염되었다면, PLA2G16을 억제하는 화합물을 치료제로 선택하는 것을 포함하는, 치료제를 선택하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 추가로 PLA2G16을 억제하는 화합물을 개체에 투여하는 것을 포함한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 개체가 PLA2G16을 억제하는 화합물로 치료할 후보자인지 측정하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 개체가 PLA2G16가 숙주 세포 인자인 바이러스에 감염되었는지, 또는 감염 위험이 있는지 측정하는 것을 포함하며, 상기에서, 개체가 PLA2G16가 숙주 세포 인자인 바이러스에 감염되었다면, 상기 개체는 PLA2G16 억제 화합물로 치료될 후보자이다. 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 개체가 피코르나바이러스(picornavirus)에 감염되었는지, 또는 감염 위험이 있는지 측정하는 것을 포함하며, 상기에서, 개체가 피코르나바이러스에 감염되었다면, 상기 개체는 PLA2G16 억제 화합물로 치료될 후보자이다. 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 PLA2G16 억제 화합물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 바이러스 감염 치료가 필요한 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 PLA2G16을 억제하는 화합물을 개체를 치료하기 위한 치료제로서 선택하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 방법은 PLA2G16을 억제하는 화합물을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 치료 방법은 바이러스 감염 치료가 필요한 개체를 제공하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 치료 방법은 개체가 바이러스로 감염된 것으로 진단하는 것을 포함한다. 상기 개체는 예를 들어, 바이러스 감염으로 초래된 병리학적 상태(pathological state)와 관련된 하나 또는 그 이상의 바이러스 감염 증상 또는 신호를 가질 것이다. 몇몇 구체예에서, 방법은 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함한다. “투여(Administration)”는 직접적인 투여 또는 간접적인 투여를 포함할 수 있다. “간접(Indirect)” 투여는 투여하기 위한 제공, 처방(prescribing), 또 다른 개체에게 안내(directing), 또는 개체가 이용 가능한 화합물을 만드는 다른 방법과 같은 활동을 포함한다.
Ⅲ. 바이러스 및 바이러스 질병
몇몇 측면에서, 본 발명은 세포 또는 개체의 바이러스에 의한 감염을 억제하는 것에 관한 것이며, 상기에서 PLA2G16는 바이러스의 생활 주기의 하나 또는 그 이상의 단계에서 촉진 또는 역할을 한다. 몇몇 구체예에서, 상기 바이러스는 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 척추 동물 종들, 예를 들어, 포유동물 또는 조류들과 같은 동물 종들의 하나 또는 그 이상의 세포를 감염시킬 수 있으며, 상기에서 세포들은 PLA2G16을 발현한다. 여러 구체예에서, 본 발명은 세포, 예를 들어, 동물 세포를 감염시키는 능력이 PLA2G16가 억제되면 감소되는, 어떤 바이러스에도 적용될 수 있다. 본 발명에서 주로 어떤 목적 바이러스들에 관하여 주로 기재한 반면, 본 발명의 구체예들은 세포에서 PLA2G16 폴리펩타이드의 발현이 바이러스 생활 주기의 하나 또는 그 이상의 단계를 촉진 또는 역할을 하는 어떤 바이러스들에도 적용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 바이러스는 의학적으로 중요하다, 예를 들어, 의학계에서 인간에게 영향을 미치는 하나 또는 그 이상의 질병의 원인 인자(causative agent)로 인식된다. 몇몇 구체예에서, 바이러스는 수의학적으로 중요하다, 예를 들어, 수의학계에서 비-인간 동물에게 영향을 미치는 하나 또는 그 이상의 질병의 원인 인자(causative agent)로 인식된다. 의학적 및/또는 수의학적으로 중요한 바이러스들을 포함하는 다양한 바이러스 과(families)의 논의를 위해, 예를 들어, 상기 Knipe ＆ Howley; 상기 Biichen-Osmond, C., 및 상기 "ICTVdB - The Universal Virus Database"에 기재된 바이러스 설명을 참조하라.
몇몇 구체예에서, 바이러스는 단일-가닥 RNA (single-stranded RNA, ssRNA) 게놈을 가진다. 몇몇 구체예에서, 단일-가닥 RNA 게놈 바이러스는 양성 가닥(positive stranded)이다. 몇몇 구체예에서, 상기 바이러스는 비-외피 바이러스(non-enveloped virus)이며 및/또는 20면체(icosahedral) 비리온(virion) 또는 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 형태를 가진다. 몇몇 구체예에서, 상기 바이러스는 피코르나바이러스-유사 수퍼패밀리(superfamily)의 일원이다 (그런 바이러스들은 본 발명에서 “피코르나-유사 바이러스” 라고도 불린다.). 피코르나바이러스-유사 수퍼패밀리 바이러스들은 RNA 의존 RNA 중합효소 (RdRp), 키모트립신-유사 프로테아제(chymotrypsin-like protease, 3CPro), 수퍼패밀리 3 헬리케이즈(superfamily 3 helicase, S3H) 및 게놈-연결 단백질(genome-linked protein) (게놈 연결된 바이러스 단백질, VPg)로 이루어지는 부분적인 유전자 세트가 보존된 특성이 있는 양성-센스 ssRNA 바이러스이다. 피코르나바이러스-유사 수퍼패밀리는 피코르나바이러스 목 (하기에서 언급된)뿐만 아니라, 예를 들어, 칼리시비리대(Caliciviridae) 및 아스트로비리대(Astroviridae)를 포함하는 제안된 과의 범위 밖에 있는 여러 바이러스 속 및 과를 포함한다. 예를 들어, oonin, EV, et al., Nature Reviews Microbiology, 6:925-939, 2008를 참고하라.
몇몇 구체예에서, 바이러스는 제안된 피코르나바이러스 목의 일원이다. 상기 목(order)은 진핵생물을 감염시키고, 하기의 특성을 공유하는 바이러스들을 포함한다: (i) 대개 5’-과 결합하고 3’-폴리아데닐화된(polyadenylated) 양성-센스 RNA 게놈, (ii) 자가 단백질 가수 분해(autoproteolytically) 과정을 거친 다단백질(들)로의 게놈 번역, (iii) 세 개의 관련된 젤리-롤 도메인(jelly-roll domains)을 함유하는 분자로 조직되어 모조(pseudo)-T = 3 대칭(symmetry)과 함께 작은 20면체, 비-외피 입자들을 형성하는 캡시드(capsid) 단백질, 및 (iv) 수퍼패밀리 Ⅲ 헬리케이즈, 키모트립신-유사 접힘이 있는 (시스테인) 프로테이네이즈(proteinase) 및 RNA-의존 RNA 중합효소를 함유하는 세-도메인 모듈(three-domain module). 이러한 기준들에 따라, 피코르나바이러스 목은 과들을 피코르나비리대(Picornaviridae), 코모비리대(Comoviridae), 디시스트로비리대(Dicistroviridae), 마르나비리대(Marnaviridae), 시퀴비리대(Sequiviridae) 및 체라바이러스(Cheravirus), 이플라바이러스(Iflavirus) 및 새드와바이러스(Sadwavirus) 속(genera)을 포함한다. “피코르나-유사”의 다른 분류군(taxa) 바이러스들, 예를 들어, 포티비리대(Potyviridae), 칼리시비리대(Caliciviridae), 히포비리대(Hypoviridae)는 상기 몇 개의 기준들을 따르지 않으며, 더욱 덜 관련되었다. 칼리시비리대 과는 작은 (27-40 nm), 비외피, 20면체 바이러스들을 포함하며, 노로바이러스(Norovirus), 사포바이러스(Sapovirus), 베시바이러스(Vesivirus), 및 라고바이러스(Lagovirus)의 네 개의 속을 포함한다. 의학적으로 중요한 주요 병원체들은 급성 위장염(acute gastroenteritis)의 주 원인인 노로바이러스다. 수의학적으로 중요한 병원체들은 고양이 칼리시바이러스(feline calicivirus, FCV) 및 토끼 출혈성 질병 바이러스(rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)와 같은 베시바이러스들을 포함한다. 아스트로비리대 과는 20면체 형태 및 전자 현미경으로 봤을 때 별 같은 표면 구조의 특성을 가지는 인간 및 동물 아스트로바이러스들을 포함한다. 그들은 여러 동물들처럼 포유동물 (예를 들어, 돼지들) 및 조류를 포함하는 인간에서도 위장병 및 설사(diarrhea)에 중요한 약제이다.
특별히 흥미가 있는 몇몇 구체예에서, 본 발명은 피코르나비리대 과 (본 발명에서 “피코르나바이러스들(picornaviruses)” 또는 “피코르나바이러스들()”이라고도 불리는) 일원인 바이러스 일원에 의한 감염을 억제하는 것에 관한 것이다. 피코르나바이러스들 (피코르나바이러스-유사 수퍼패밀리의 다른 일원들과 같이)은 양극성(positive polarity)의 단일-가닥 게놈을 가진 외피없는 바이러스들이다. 그들은 긴 5’ 비번역 지역 (untranslated region, UTR) (예를 들어, 적어도 약 500 뉴클레오티드들 (nt)에서 약 1200 nt 길이)을 가진, 내부리보솜유입점(internal ribosome entry site, IRES), 단백질 가수분해 과정을 거친 다단백질을 암호화하는 단일 전사해독틀(open reading frame, ORF), 및 폴리 A 꼬리에 뒤따르는 짧은 3’ UTR을 함유하는 일반 게놈 구성을 공유한다 (상기 Knipe ＆ Howley). 다른 피코르나바이러스들, 다른 바이러스들 사이의 주 현저한 특색은 5’ UTR 및 IRES의 이차 구조를 포함한다.
피코르나바이러스 과는 12개의 속: 아프토바이러스(Aphthovirus), 아비헤파토바이러스(ㅊ), 카디오바이러스(Cardiovirus), 엔테로바이러스(Enterovirus), 어보비니스(Erbovinis), 헤파토바이러스(Hepatovirus), 코보바이러스(Kobovirus), 파레코바이러스(Parechovirus), 사펠로바이러스(Sapelovirus), 세네카바이러스(Senecavirus), 테스코바이러스(Teschovirus), 및 트레모바이러스(Tremovirus)를 포함한다 (상기 "ICTVdB - The Universal Virus Database", Virus Taxonomy: 2009 Release v4, 참조). 상기 속들 중 하나의 일원인 바이러스는 아프토바이러스(aphthovirus), 아비헤파토바이러스(avihepatovirus), 카디오바이러스(cardiovirus), 엔테로바이러스(enterovirus), 어보비니스(erbovinis), 헤파토바이러스(hepatovirus), 코보바이러스(kobovirus), 파레코바이러스(parechovirus), 사펠로바이러스(sapelovirus), 세네카바이러스(senecavirus), 테스코바이러스(teschovirus), 또는 트레모바이러스(tremovirus) 각각을 말하는 것이다. 상기 속들은 척추동물을 감염시키는 많은 바이러스들을 포함하며, 그들 중 많은 수는 인간 및/또는 비-인간 동물에서 질병의 중요한 원인이다. 예를 들어, 아프토바이러스들은 소, 염소, 돼지, 및 양과 같은 굽을 가진(cloven-footed) 동물들을 감염시키는 구제역 바이러스들(foot-and-mouth disease viruses)을 포함한다. 카디오바이러스들은 첫 번째는 뇌척수염바이러스(encephalomyocarditis virus)를 포함하고 두 번째는 쥐 뇌척수염 바이러스(Theiler's murine encephalomyelitis virus) 및 관련된 바이러스들을 포함하는, 인간을 감염시키는 일부 바이러스를 포함하는 두 개의 다른 클러스터들(clusters)을 포함한다.
인간 엔테로바이러스들은 흔한 그 중에서도 경미한 상기도염(upper respiratory) 증상 및 감기-유사 병(flu-like illnesses)의 원인이다. 이보다는 흔치 않지만, 그들은 바이러스성 수막염(viral meningitis), 심근염(myocarditis), 또는 뇌염(encephalitis)과 같은 중추신경계 질환(central nervous system conditions)와 같은 더욱 심각한 질환을 야기할 수 있다. 엔테로바이러스 속은 2009에 발표된 ICTV에 제시된 대로 (http://ictvonline.org/virusTaxonomy, asp?version=2009에서 이용 가능) 하기의 10 종들을 포함한다: 인간 엔테로바이러스(Human enterovirus) A, 인간 엔테로바이러스(Human enterovirus) B, 인간 엔테로바이러스(Human enterovirus) C, 인간 엔테로바이러스(Human enterovirus) D, 원숭이 엔테로바이러스(Simian enterovirus) A, 소 엔테로바이러스(Bovine enterovirus), 돼지 엔테로바이러스(Porcine enterovirus) B, 인간 리노바이러스(Human rhinovirus) A, 인간 리노바이러스(Human rhinovirus) B 및 인간 리노바이러스(Human rhinovirus) C. 상기 종들 중 많은 수는 다양한 혈청형(multiple serotypes)을 포함하므로, 결국 다양한 균주들을 포함할 수 있다. 인간 엔테로바이러스 종들은 종합적으로 폴리오바이러스(polioviruses), 콕사키바이러스(coxsackievirus), 에코바이러스(echoviruses), 및 인간을 감염시키는 많은 다른 엔테로바이러스들을 포함한다. 또한, 엔테로바이러스 속들은 많은 비인간 장관계 바이러스들(enteric viruses)을 포함한다. 상기 폴리오바이러스 혈청형 폴리오바이러스 (PV)-l, PV-2, 및 PV-3은 인간 엔테로바이러스 C 종에 포함된다. 폴리오바이러스가 효과적인 백신의 광범위한 사용으로 인해 대체로 퇴치되었을 지라도, 엔테로바이러스 속의 다른 바이러스들은 빈번하게 급성 및 만성 인간 질병을 야기한다.
콕사키바이러스(Coxsackieviruses)는 마우스에서의 그들의 병원성(pathogenicity)의 초기 관찰에 기초하여 A 군 및 B 군으로 나눠진다. 콕사키바이러스는 인간에서 무균성 수막염(aseptic meningitis), 구제역(hand-foot-mouth disease), 헤르판지나(herpangina), 심근염(myocarditis) (때때로 심근증(cardiomyopathy)을 유발하는), 및 췌장염(pancreatitis)을 포함하는 질병의 범위와 관련되며, 타입 I 당뇨병(diabetes)의 병인학적 인자일 것이다 (예를 들어, Curr Top Microbiol Immunol. Vol. 323, 2008 기사 참조). 콕사키바이러스들은 인간 엔테로바이러스 A, 인간 엔테로바이러스 B, 및 인간 엔테로바이러스 C로 분류된다. 콕사키바이러스의 예은 혈청형 CV-A2, CV-A3, CV-A4, CV-A5, CV-A6, CV-A7, CV-A8, CV-A10, CV-A12, CV-A14, CV-A16, CV-B1 , CV-B2, CV-B3, CV-B4, CV-B5, CV-B6, CV-A9, CV-A1 , CV-Al l , CV-A13, CV-A17, CV-A 19, CV-A20, CV-A21 , CV-A22, CV-A24를 포함한다.
인간 엔테로바이러스 A, 인간 엔테로바이러스 B, 인간 엔테로바이러스 C, 및 인간 엔테로바이러스 D 종들은 추가적으로 EV-71 , EV-76, EV-89, EV-90, EV-91 , EV-92, EV-69, EV-73, EV-74, EV-75, EV-77, EV-78, EV-79, EV-80, EV-81 , EV-82, EV-83, EV-84, EV-85, EV-86, EV-87, EV-88, EV-93, EV-97, EV-98, EV-100, EV- 101 , EV-106, EV-107, EV-95, EV-96, EV-99, EV- 102, EV- 104, EV- 105, EV-109, EV-68, EV-70, 및 EV-94와 같은 혈?형의 엔테로바이러스들을 포함한다. 예를 들어, 엔테로바이러스 71 (EV-71)는 세계의 다른 부분에서 재발 발생(recurrent outbreaks)을 야기하는 병원성의 혈?형 엔테로바이러스이다. 이 것은 중추신경계를 감염시킬 수 있으며 인간, 특히 영아 및 유아에서 죽음 및 장기 신경학적 후유증(long-term neurological sequelae)을 야기할 수 있다 (Lin, Y-W., et al., Journal of Virology, 83(13): 6477- 6483, 2009, 및 그 안의 참고문헌들). 또한, EV-71는 설사(diarrhea), 발진(rashes), 및 구제역을 야기할 수 있다.
인간 리노바이러스 A 및 인간 리노바이러스 B 종들 (“리노바이러스들”)의 일원은 인두(nasopharynx) 및 때때로 하기도관(lower respiratory tract)에서 복제한다. (100개 이상의 혈청형이 존재하는) 상기 바이러스들은 인간에서 일반적인 감기의 원인균(etiologic agents)으로써 중요하며, 특히, 개인의 민감도에 따라 더욱 심각한 질병도 야기할 수 있다.
테스코바이러스 속은 돼지에서 뇌회백질염(polioencephalitis)을 야기하는 돼지 테스코바이러스들 포함한다. 헤파토바이러스는 급성 간 염증을 유발하는, 인간 A형 간염(hepatitis A virus, HAV)을 포함한다.
추가적인 피코르나바이러스들이 계속 발견되고 있다. 예를 들어, 제안된 코사바이러스(cosavirus) 속들의 일원을 기재하고 있는, Kapoor, A., et al., A highly prevalent and genetically diversified Picornaviridae genus in South Asian children. Proc Natl Acad Sci U S A. 105(51):20482-7, 2008를 참조하라. 최근에, klassevirus로 명명된 가지는 신규한 바이러스가 고효율 서열분석(high throughput sequencing)을 이용하여 발견되었다 (예를 들어, Greninger, AL, et al., The complete genome of klassevirus - a novel picornavirus in pediatric stool, Virol J., 6:82- 2009 참조).
당업계의 당업자는 바이러스 분류학(taxonomy) 및 분류(classification)가 지속적으로 발달하고 있으며 바이러스들이 예를 들어, 추가적인 바이러스들이 발견 또는 연구되며, 예를 들어, 바이러스 유전자들이 서열분석되고, 및/또는 바이러스들 사이의 관계가 명백해짐으로서, 재분류될 수 있음을 알 것이다. 따라서, 이런 바이러스들은 본 발명에서 인용된 어떤 참고문헌의 발간 후에 ICTV에 의해 재분류되었을 것이며 및/또는 미래에 재분류될 것이다. 또한, 당업계의 당업자들은 바이러스에 관련된 발간 및 참고문헌이 그들의 규약 수립 및/또는 형식적인 및/또는 비형식적인 속칭 명명법 보다 앞섰을 ICTV에 의해 수립된 규약에 구애되지 않을 것이라는 것을 알 것이다. 바이러스들(및 균주 및 그의 변이체들)의 특성을 확인하는 것은 잘 수립되었으며 당업계에 통상적이다. 많은 바이러스들의 특징지어진 대조 샘플들은, 바이러스를 동정 및/또는 특성을 확인하기 위한 용도의 시약처럼, 일반적으로 국제적으로 알려진 여러 생물 자원 센터 또는 American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA; http://www.atcc.org/), 영국의 Health Protection Agency (Porton Downm Salisbury UK; )의 Health Protection Agency Culture Collections의 National Collection of Pathogenic Viruses (NCPV)와 같은 균주 수집 및/또는 국제적으로 알려진 전문 군들에 맡겨지고 그로부터 사용 가능하다. 특성화 및/또는 분류는 핵산 및/또는 폴리펩타이드 서열, 면역학적 시약에 대한 반응성 (예를 들어, 항혈청(antisera)), 등과 같은 성질에 기초한다. 많은 인간 엔테로바이러스를 포함하는 많은 엔테로바이러스들의 게놈 서열은 공개적으로 예를 들어, European Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk/), National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 웹사이트 및 과학문헌에서 이용 가능하다.
피코르나바이러스 구조 및 생활 주기는 광범위하게 연구되어왔다 (예를 들어, 상기 Knipe ＆ Howley 참조). 간단히, 피코르나바이러스 캡시드(capsid)는 일반적으로 네 구조적 단백질: VPl, VP2, VP3 및 VP4를 포함한다. (파레바이러스(Parechoviruses)는 오직 VPl, VP2, 및 VP2+VP4의 잘리지 않은 전구체인 VPO 만을 함유한다.). 프로모터(protomer)라고 불리는, 피코르나바이러스 캡시드의 기본적 요소(basic building block)는 오직 VPl, VP2, VP3, 및 VP4의 한 카피(copy)만을 함유한다. VPl, VP2, 및 VP3는 VP4와 함께 그의 안쪽 표면에 껍질(shell)을 형성한다. VPl, VP2, 및 VP3의 일부 부분의 아미노산 서열 차이가 피코르나바이러스의 뚜렷한 형태학적 및 항원결합성(antigenicities)의 차이를 제공한다.
피코르나바이러스의 복제는 세포질에서 발생한다.피코르나바이러스는 숙주 세포의 세포막 위 수용체에 부착하여 감염을 개시하고, 세포질로 바이러스 게놈의 탈외피(uncoating) 및 진입(entry)이 뒤따른다. 폴리오바이러스 수용체 (PVR, CD155) 및 주요 군 리노바이러스 (ICAM-1 )는 1989년에 동정되었으며, 그 때 이후로 많은 수의 피코르나바이러스 수용체들이 동정되어 왔다. 몇몇 피코르나바이러스들은 감염을 위해 일반적으로 공-수용체(co-receptors)를 필요로 한다. 예를 들어, 많은 엔테로바이러스들은 붕괴 촉진 인자 (decay-accelerating factor, DAF; CD55)에 결합하나, 감염은 일반적으로 추가적인 분자들, 예를 들어, ICAM-1 또는 인테그린 패밀리(integrin family member)의 존재를 필요로 한다. RNA 게놈은 세포질로 진입되어 단일 다단백질(polyprotein)로 번역되어 바이러스 복제에 필요한 모든 바이러스 단백질을 생산하기 위해 번역 동안 바이러스-암호화된 프로테아제 (주로 2Apro 및 C3pro 또는 3CDpro)에 의해 잘린다. 잘리지 않은 전구체의 일부 또한 바이러스 복제 동안 기능을 가진다. 바이러스 단백질들 중에 합성된 것은 게놈 복제 및 niRNA 합성에 필요한 바이러스 RNA-의존 RNA 중합효소 및 부속 단백질들이다. 게놈 복제의 첫 번째 단계는 추가적인 양성 가닥의 합성의 주형으로 사용되는 음성-가닥 중간체(intermediate)를 만들기 위해 양성-가닥 RNA를 카피하는 것이다. 즉시 충분한 캡시드 단백질들이 쌓이는 캡시드화(Encapsidation)가 시작된다.
많은 피코르나바이러스들은 감염된 세포에서 “세포 변성 작용(cytopathic effects)”이라고 불리는 형태학적 특성 변화를 낳는다. 세포 변성 작용은 염색질 응축(chromatin condensation), 핵 수포(nuclear blebbing), 막형성 소낭(membranous vesicles)의 증식, 세포내 구성요소의 누출, 및 전체 세포의 위축(shriveling)을 포함할 수 있다. 많은 피코르나바이러스 종의 경우에, 비리온들이 용균 작용에 의해 감염된 세포로부터 방출된다. 다른 피코르나바이러스들 (예를 들어, A형 간염 바이러스)은 용균 작용 없이 세포로부터 방출된다. 본 발명의 몇몇 구체예에서, 세포 변성 작용(들) 및/또는 비리온 방출은 세포 도는 개체가 바이러스에 감염되었는지 측정하기 위해 평가된다. 몇몇 구체예에서, 세포 변성 작용(들) 및/또는 비리온 방출은 화합물이 바이러스 감염을 억제하는지 측정하기 위해 평가된다.
IV . PLA2G 16 폴리펩타이드
PLA2G16는 척추 동물 지방 조직에 고도로 발현되고 또한 매우 폭넓은 척추 동물 조직 및 배양된 세포주에서 낮은 정도로 발현되는 ~18 킬로달톤(kilodalton)의 단백질이다. 또한, PLA2G16는 지방-특이적 포스포리파아제 A2 (phospholipase A2, AdPLA), HRAS-유사 억제제(HRAS-like suppressor 3, HRASLA3), 및 여러 다른 이름으로도 알려져 있다. 당업계의 당업자는 PLA2G16 게놈 서열 및 mRNA 서열 및 PLA2G16 단백질을 공개 활용 데이터베이스로부터 쉽게 얻을 수 있다. PLA2G16을 암호화하는 인간 유전자는 생물정보센터(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)의 유전자 데이터 베이스에서 유전자 lD: 11145를 부여 받았다. 마우스 및 랫트 유래 PLA2G16을 암호화하는 유전자는 유전자 IDs: 유전자 ID: 225845 (Mus musculus); 유전자 ID: 24913 (Rattus norvegicus)의 유전자 ID를 부여 받았다. 당업계의 당업자는 상기의 및 다른 종들의 PLA2G16 mRNA 및 단백질 서열을 쉽게 얻을 수 있다. 예를 들어, NCBI에서 이용 가능한 인간 PLA2G16 mRNA 및 단백질에 대한 대조 서열 수납번호(accession numbers)는: NM_001 128203 (전사 변이체 2) 및 NP 001 121675 (단백질), NM_007069.3 (전사 변이체 1) 및 NP_009000.2 (단백질)와 같다. 전사 변이체 1은 더 긴 전사체를 나타낸다. 변이체 1 및 2는 같은 아이소폼(isoform)을 암호화하나, 5’ 비번역 부위 (UTR)가 다르다.
PLA2G16는 포스포리파아제 활성 및 상당히 낮지만 검출 가능한 라이소포스포리파아아제 활성을 가진다 (Duncan, RE, et al., J Biol Chem., 283(37):25428-36, 2008). PLA2 단백질은 포스포리피드의 sn-2 결합의 가수분해를 촉매하는 효소이다 (Schaloske, RH and Dennis, EA, Biochim.Biophys. Acta 1761 , 1246-1259, 2006). PLA2G16은 단백질이 PLA2이 되도록 sn-2 위치에서 가수분해하여 포스파티딜콜린으로부터 유리지방산(free fatty acid) 및 라이소포스포리피드를 생성하는 것으로 보여졌다 (Duncan, 상기). PLA2G16는 세포내 막과 관련되어 발견되었으며 결손이 활성의 손실을 야기하는 막 스패닝 도메인(membrane spanning domain)으로 추정되는 C-말단을 가진다. 돌연변이 분석은 His-23, Cys-1 13, Gln-129 및 Asn-1 12를 포함하는 일부 고도로 보존된 아미노산이 촉매 작용에 필수적이나, Asp-30 또는 His-80의 알라닌으로의 돌연변이는 효과가 없음을 보여주었다. 따라서, PLA2G16는 몇몇 다른 PLA2들에서 발견된 His/Asp 촉매 이량(diad) 또는 Ser/His/Asp 촉매 삼량(triad) 보다는 His 및 Cys 촉매 활성 잔기를 함유하는 것으로 보인다. 칼슘은 PLA2G16을 활성화시키나, 활성에 필수적이지는 않은 것으로 발견되었다. PLA2G16가 이전에 동정된 PLA2의 15 주요 군과 명확하게 맞지 않기 때문에 칼슘-의존적 포스포리파아제 A2s (Group XVI)가 첫 별개의 군 일원으로 제안되었다(Duncan, supra).
또한, PLA2G16는 당업계에서 포스포리파아제 (AdPLA)로 알려져 있다 (Jaworski, K., et al. Nat Med., 15(2): 159-68, 2009). PLA2는 지방 조직에서 주요하고 지방세포(adipocyte) 지방분해 조절에서 중요한 역할을 한다. PLA2G16 무효 마우스(null mice)는 생존 가능하였으며, 이유기에 정상적인 체중을 가졌으나 동일한 음식 섭취에도 불구하고 한배의 다른 자손인 야생형에 비해 더 천천히 체중이 불었다 (Jaworski, K., supra). 표준 병리학 분석에서 PLA2G16 무효한 마우스는 감소된 비만증(adiposity) 이외에 어떤 살이찐(gross), 미시적, 또는 기능적 이상의 증거가 없었다. 상기 마우스들에서 혈청 및 지방 조직에서 혈액 세포 프로파일 및 면역학적 변수(parameters)는 야생형 마우스에 비해 변하지 않았다. 이런 결과는 바이러스 감염을 억제하기 위하여 PLA2G16을 억제하는 것을 포함하는 본 발명의 방법이 예를 들어, 인간 및 다른 척추동물들과 같은 관심의 분리된 세포 및 개체에서 잘 용인될 것 임을 제안한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명에서 “PLA2G16 폴리펩타이드”는 다세포 생물체 (예를 들어, 척추동물, 예를 들어, 인간, 마우스, 랫트, 소, 등과 같은 포유 동물)의 PLA2G16 폴리펩타이드의 서열로 구성 또는 이루어져 있는 서열의 폴리펩타이드이다. 자연발생 PLA2G16 폴리펩타이드 또는 자연발생 PLA2G16 폴리펩타이드와 동일한 서열의 폴리펩타이드는 “본연의(native) PLA2G16 폴리펩타이드” 또는 간단하게 “PLA2G16”를 말한다. 본연의 PLA2G16 폴리펩타이드의 예는 도 8 및 상기에서 언급한 수납 번호로 나타냈다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 폴리펩타이드는 PLA2G16의 변이체이다 (“PLA2G16 변이체”). PLA2G16 변이체들은 PLA2G16에 관하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 첨가, 또는 결손에 의해 다른 폴리펩타이드를 포함한다. 첨가(addition)는 폴리펩타이드 내의 삽입 또는 N- 또는 C-말단에 첨가된 것 일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 아미노산 치환, 결손, 또는 첨가된 수는 예를 들어, 약 1 내지 30, 예를 들어, 약 1 내지 20, 예를 들어, 약 1 내지 10, 예를 들어, 1 내지 5, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5일 수 있다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 변이체는 서열이 PLA2G16의 서열과 적어도 50 아미노산, 적어도 100 아미노산, 적어도 150 아미노산, 또는 PLA2G16의 전체 길이 이상으로 동일한 폴리펩타이드를 포함한다 (그러나 본연의 PLA2G16 서열과 똑같지 않다). 몇몇 구체예에서, PLA2G16 변이체는 적어도 PLA2G16의 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%o, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 PLA2G16와 더 동일한 폴리펩타이드 (예를 들어, 인간, 마우스, 랫트, 개, 소 유래)를 포함한다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 변이체는 인간 또는 마우스 PLA2G1의 23-113 아미노산과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 폴리펩타이드는 인간 또는 마우스 PLA2G1의 23-129 아미노산과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더욱 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
몇몇 구체예에서, PLA2G16 폴리펩타이드는 PLA2G16 단편으로 구성 또는 이루어진다. PLA2G16 단편은 PLA2G16보다 더 짧은 폴리펩타이드이며 폴리펩타이드의 길이 보다 더 짧은 PLA2G16과 동일하다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 단편은 적어도 본연의 PLA2G16 길이의 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 몇몇 구체예에서, 단편은 인간 또는 마우스 PLA2G16의 23-113 또는 23-129의 아미노산으를 포함한다. 몇몇 구체예에서, C-말단의 하나 또는 그 이상의 아미노산이 결손된다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서 C-말단의 적어도 멤브레인 스패닝 도메인이 결손된다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서, C-말단의 적어도 30 아미노산이 결손된다. 몇몇 구체예에서, N-말단의 하나 또는 그 이상의 아미노산이 결손된다.
몇몇 구체예에서, PLA2G16 폴리펩타이드는 이종(heterologous) 폴리펩타이드 부분으를 포함한다. 이종 폴리펩타이드 부분은 종종 본연의 PLA2G16에 존재하지 않거나 상동하지 않은 서열을 가진다. 이종 부분은 예를 들어, 약 5 내지 5,000개의 아미노산, 또는 더 길 것이다. 종종 그것은 약 5 내지 1,000 개의 아미노산이다. 몇몇 구체예에서, 이종 부분은 예를 들어, 기능적인 도메인(functional domain)과 같이 다른 폴리펩타이드에서 발견되는 서열를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 이종 부분은 폴리펩타이드를 정제, 발현, 가용화(solubilizing), 및/또는 검출하기 유용한 서열를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 이종 부분은 “태그(tag)” 폴리펩타이드를 포함한다, 예를 들어, 친화성 태그(affinity tag) 또는 태그 에피톱(epitope tag). 예를 들어, 태그는 친화성 태그 (예를 들어, HA, TAP, Myc, 6XHis, Flag, GST), 형광 또는 발광 단백질 (예를 들어, EGFP, ECFP, EYFP, Cerulean, DsRed, mCherry), 가용화-향상 태그 (예를 들어, SUMO 태그, NUS A 태그, SNUT 태그, 또는 박테리오파지 T7의 Ocr 단백질의 단일 돌연변이)일 수 있다. 예를 들어, Esposito D and Chatterjee DK. Curr Opin Biotechnol.; 17(4):353-8 (2006) 참조하라. 몇몇 구체예에서, 태그는 다양한 기능을 제공될 수 있다. 태그는 종종 비교적 작다, 예를 들어, 아미노산 몇 개 내지 약 100개의 아미노산 범위. 몇몇 구체예에서, 태그는 100개의 아미노산 보다 많다, 예를 들어, 약 500개의 아미노산, 또는 그 이상. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 폴리펩타이드는 예를 들어, N- 또는 C-말단에 융합되어, N- 또는 C-말단에 위치한 태그를 가진다. 폴리펩타이드는 다중 태그를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 6X His 태그 및 NUS 태그가 예를 들어, N-말단에 존재한다. 몇몇 구체예에서, 태그는, 예를 들어, 프로테아제에 의해 잘릴 수 있으므로, 폴리펩타이드로부터 제거될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 이것은 PLA2G16과 상동한 부분을 암호화하는 서열 및 태그 사이에 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 서열을 포함하여 얻어진다. 프로테아제의 예는 예를 들어, 트롬빈(thrombin), TEV 프로테아제, 인자 Xa (Factor Xa), PreScission 프로테아제, 등을 포함한다. 몇몇 구체예에서, “자가-절단(self-cleaving)” 태그가 사용된다. 예를 들어, PCT/US05/05763를 참조하라. 태그를 암호화하는 서열이 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대하여 5’ 또는 3’ (또는 둘 다)에 위치할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 태그 또는 다른 이종 서열이 폴리펩타이드 링커(linker)에 의해 나머지 폴리펩타이드로부터 분리된다. 예를 들어, 링커는 짧은 폴리펩타이드일 수 있다 (예를 들어, 15-25 아미노산). 종종 링커는 세린(serine), 글라이신(glycine), 및/또는 알라닌(alanine)과 같은 작은 아미노산 잔기를 포함한다. 이종 도메인은 막관통(transmembrane) 도메인, 분비 신호(secretion signal) 도메인, 등으를 포함할 수 있다.
몇몇 구체예에서, PLA2G16 변이체는 예를 들어, 적어도 부분적으로는 PLA2G16의 생물학적 활성을 보유하고 있는 변이체 기능적인 변이체이다. 몇몇 구체예에서, 기능적인 변이체는 본 발명의 분석에 사용했을 때 비-상동성 단백질 또는 촉매 불활성 PLA2G16 폴리펩타이드 (예를 들어, C113A 치환을 가지는 PLA2G16 폴리펩타이드)와 구별하기에 충분한 활성을 보유한다. 몇몇 구체예에서, 상기 활성은 예를 들어, 포스포리피드의 sn-2 결합 가수분해 촉매 능력으로서 측정된 포스포리파아제 A2의 활성이다. 몇몇 구체예에서, 상기 활성은 라이소포스포리파아제 활성이다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 변이체는 바이러스에 대한 숙주 세포 인자로서 제공되는 본연의 PLA2G16의 능력을 보유한다. 예를 들어, 상기 PLA2G16 변이체는 충분한 활성을 가지므로, 세포의 PLA2G16 유전자가 세포를 바이러스 감염에 민감하게 못 만들기 때문에 그것을 척추동물 세포에서 발현하는 것은 바이러스 감염에 저항성을 가진다. 몇몇 구체예에서, 기능적인 PLA2G16 변이체는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 PLA2G16 활성을 보유한다, 예를 들어, 거의 같은 활성. 몇몇 구체예에서, 기능적인 변이체는 PLA2G16보다 큰 활성을 가질 것이다.
당업계의 당업자는 기능적인 PLA2G16 변이체 또는 단편을 쉽게 만들 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, 다른 PLA2 폴리펩타이드와의 정렬처럼, 고려 가능한 정보는 활성에 중요한 다양한 잔기 및 활성의 유의미한 감소 없는 변화가 있을 수 있는 다양한 잔기 의 동정 및 을 포함하는 PLA2G16에 관하여 이용 가능하다 (예를 들어, 상기 Duncan, et al 참조). 몇몇 구체예에서, PLA2G16 변이체는 하나 또는 그 이상의 보존된 PLA2G16에 대한 아미노산 치환으를 포함한다. 보존적 치환은 연관된 잔기의 측쇄 크기 유사, 극성(polarity), 전하(charge), 가용성(solubility), 소수성(hydrophobicity), 친수성(hydrophilicity) 및/또는 양친매성(amphipathic) 성질에 근거한다. 당업계에 알려진 바와 같이, 그런 치환은, 일반적으로, 비-보존적 치환에 비해 더욱 활성을 보유하는 변이체를 초래할 가능성이 있다. 한 구체예에서, 아미노산은 하기와 같이 분류된다:
특별한(Special): C
중성 및 작은(Neutral and small): A, G, P, S, T
극성 및 비교적 작은(Polar and relatively small): N, D, Q, E
극성 및 비교적 큰(Polar and relatively large): R, H, K
비극성 및 비교적 작은(Nonpolar and relatively small): I, L, M, V
비극성 및 비교적 큰(Nonpolar and relatively large): F, W, Y
특별한(Special): C
예를 들어, Zhang, J. J. Mol. Evol. 50:56-68, 2000)를 참고하라. 몇몇 구체예에서, 프롤린(proline, P)은 두 번째 특별한 아미노산으로서 그 자신의 군으로 고려된다. 특별한 군 내에서, 특정 치환은 특별히 흥미로울 것이다, 예를 들어, 루신(leucine)의 이소루신(isoleucine) (또는 반대로), 세린(serine)을 트레오닌(threonine)으로 (또는 반대로)으로, 또는 알라닌(alanine)을 글라이신(glycine)으로 (또는 반대로)의 교체. 물론 비-보존적 치환도 종종 기능 보유와 양립한다. 몇몇 구체예에서, 치환 또는 결손은 활성에 중요한 아미노산을 바꾸거나 결실시키지 않는다, 예를 들어, His-23, Cys-113, Gin- 129 또는 Asn-112 아미노산. 몇몇 실싱태양에서, 결손은 36개의 아미노산 C-말단의 모두 또는 많은 부분을 제거하지 않는다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서, 결손은 막관통 도메인을 제거하지 않는다. 몇몇 구체예에서, 변화는 PLA2G16의 다른 종과 다른 아미노산에서 일어난다. 몇몇 구체예에서, 치환은 다른 종에서 상응하는 위치에 존재하는 아미노산을 바꾼다. 몇몇 구체예에서, 기능적인 PLA2G16 변이체는 PLA2G16와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다, 예를 들어, PLA2G16의 전장의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 100% 길이. 몇몇 구체예에서, 기능적인 PLA2G16 변이체는 예를 들어, 전장의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 100% 길이의 적어도 PLA2G16와 95%>, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함하며, N- 및/또는 C-말단에 태그를 포함한다. PLA2G16 변이체는 그들의 활성을 평가하기 위해 세포-없이 및/또는 세포-기반 분석으로 시험될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본연의 PLA2G16의 활성에 비해 상당히 감소된 활성을 가지는 PLA2G16의 변이체 또는 단편 (예를 들어, 본연의 PLA2G16의 활성의 10% 보다 적은)은 PLA2G16 억제제 또는 항바이러스 화합물로서 유용하다. 예를 들어, 그런 폴리펩타이드는 예를 들어, 본연의 PLA2G16과의 경쟁에 의해, 본연의 PLA2G16의 바이러스 감염에서의 기능에 간섭할 것이다. 몇몇 구체예에서, 본연의 PLA2G16의 활성에 비해 상당히 감소된 활성을 가지는 PLA2G16의 변이체 또는 단편은 대조군 또는 항원으로서, 또는 결정화(crystallization) 또는 결합 연구에 이용하기에 유용할 것이다.
PLA2G16 폴리펩타이드, 예를 들어, 본연의 PLA2G16 폴리펩타이드 또는 PLA2G16 변이체는 기준 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산될 수 있다. PLA2G16을 암호화하는 핵산은 예를 들어, PLA2G16을 발현하는 세포로부터 (예를 들어, PCR 또는 다른 증폭 방법 또는 클로닝에 의해) 또는 알려진 PLA2G16 cDNA 또는 폴리펩타이드 서열에 기초한 합성에 의해 쉽게 얻어질 수 있다. 당업계의 당업자는 유전 코드의 축퇴로 인한 많은 다른 핵산 서열이 원하는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 것을 알 것이다. 선택적으로, 서열은 선택된 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. PLA2G16 변이체를 암호화하는 핵산은 예를 들어, 부위 특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis)를 이용한 본연의 PLA2G16의 변형에 의해, 또는 다른 기준 방법에 의해 쉽게 제작될 수 있다.
자주 플라스미드 또는 바이러스 (예를 들어, 바이러스 게놈의 일부로서)와 같은 벡터에 있는 적절한 발현 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 원하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 원핵 또는 진핵 세포로 도입된다. 다른 구체예에서, PLA2G16 폴리펩타이드는 실험실내 번역을 이용하여 만들어진다. 예를 들어, 세포는 박테리아 세포 (예를 들어, E. coli), 곤충 세포, 포유동물 세포, 식물 세포, 진균 세포 (예를 들어, 효모)를 포함한다. 당업계의 당업자는 허용 가능한 발현 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)를 알 것이다. 프로모터는 예를 들어, 유도 또는 억제 가능하게, 구성 또는 조절 가능할 것이다. 박테리아 세포에서 이용하기에 허용 가능한 프로모터의 예는, 예를 들어, Lac, Trp, Tac, araBAD (예를 들어, pBAD 벡터 내의), T7 또는 T3와 같은 파지 프로모터를 포함한다. 포유동물 세포에서의 발현 지시를 위해 유용한 조절 서열 발현의 예는 예를 들어, SV40 전 및 후 프로모터(early and late promoters SV40), 즉각적인 전 프로모터인 아데노바이러스(adenovirus) 또는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 또는 바이러스 프로모터/인핸서 서열인 레트로바이러스(retroviral) LTRs 프로모터 또는 포유동물 유전자 유래 프로모터/인핸서들, 예를 들어, 액틴(actin), EF-1 알파, 메탈로티오네인(metallothionein), 등을 포함한다. 배큘로바이러스 시스템의 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터는 곤충 세포에서 단백질의 발현에 이용된다. 당업계의 당업자는 적합한 발현 조절 요소(들), 선별할 수 있는 마커들, 클로닝 위치들, 등을 포함하는 많은 발현 벡터를 알 것이며, 목적 폴리펩타이드의 발현을 위해 편리하게 이용될 수 있다. 선택적으로, 그런 벡터들은 태그를 암호화하는 서열을 포함하여, 태그를 포함하는 폴리펩타이드의 편리한 생산을 허용한다. 벡터를 박테리아, 효모, 식물, 또는 동물 세포 (예를 들어, 형질전환(transformation), 형질 도입(transfection), 감염(infection), 전기 천공법(electroporation), 등)로 도입하기 위해, 및 만일 원한다면, 벡터를 가진 세포 선별을 계속하여 고정된 세포주를 얻는 허용 가능한 방법. 폴리펩타이드를 발현하는 형질전환 동물들 또는 식물들이 당업계에 통상적인 방법으로 만들어질 수 있다.
PLA2G16 폴리펩타이드를 만들기 위해, 세포들은 적합한 기간 동안 계속 배양되며, 상기 폴리펩타이드는 분리되며, 선택적으로 추가 정제된다 (또한, 당연히 PLA2G16 폴리펩타이드는 그것을 발현하는 생물체로부터 직접적으로 얻어진 세포 또는 조직으로부터 분리될 수 있다). 표준 단백질 분리/정제 기술이 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 친화도-기반 방법이 이용된다. 예를 들어, PLA2G16 항체가 사용될 수 있다. 태깅된 PLA2G16 폴리펩타이드의 경우, 사용된 특정 태그에 따른 적합한 분리 방법이 선택될 수 있다.
V. PLA2G16 을 억제하기 위한 조성물 및 방법
용어 "PLA2G16 억제제(inhibitor)"는 PLA2G16 발현 및/또는 PLA2G16의 하나 또는 그 이상의 활성을 억제하는 화합물을 말한다. 예를 들어, 화합물은 화합물의 존재하에 만일 하나 또는 그 이상의 PLA2G16 활성이 화합물이 없는 것에 비해 감소되면 및/또는 PLA2G16 단백질 또는 유전자 산물의 정도 또는 양이 화합물의 존재하에 화합물이 없는 것에 비해 감소되면 “PLA2G16 억제제”이다. 일부 구체예에서, PLA2G16 억제제는 PLA2G16와 물리적인 상호작용하는 의미로PLA2G16에 직접적으로 작용한다. 다른 구체예에서, 억제제는 PLA2G16에 간접적으로 작용한다. PLA2G16 억제제는 예를 들어, 소분자(small molecule), 핵산, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), 폴리펩타이드, 펩타이드, 리피드(lipid), 포스포리피드, 등일 수 있다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 억제제는 RNAi 제제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 엡타머(aptamer), 또는 항체이다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 억제제는 소분자이다.
본 발명은 PLA2G16를 억제하는 많은 다른 방법을 제공한다. 본 발명에서 사용되는 PLA2G16를 억제하는 방법은 PLA2G16 폴리펩타이드의 양을 감소시키는 방법 및 PLA2G16 분자 기능과 간섭(interfere)하는 방법을 포함한다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16는 PLA2G16 발현의 억제 또는 간섭에 의해 억제되어, PLA2G16 폴리펩타이드의 양이 감소하게 된다. 본 발명에서 사용되는 “발현(expression)”은 폴리펩타이드 생산과 관련된 세포 공정 및 전사, mRNA 가공 및 운반 (진핵 세포의 경우에), 및 mRNA 번역을 포함한다. 발현을 억제 또는 간섭하기에 유용한 다양한 방법이 본 발명의 구체예에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 그런 방법은 PLA2G16 폴리펩타이드의 합성을 감소시키고, 결과적으로 존재하는 총 PLA2G16 분자의 기능활성 정도가 감소된다.
몇몇 구체예에서, PLA2G16 발현이 RNA 간섭(RNAi)를 이용하여 억제된다. PLA2G16 발현을 억제하는 RNAi 약제 (예를 들어, siRNAs) 서열의 예는 실시예에서 제공된다. 추가적인 서열이 당업계에 통상적으로 포함된 다양한 시도를 이용하여 선택될 수 있다. 원한다면, 그런 서열들은 “비특이적(off-target)” 효과를 최소화하기 위해 선택될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 위치-특이적 화학 변화가 비특이적 효과 가능성을 감소시키기 위해 사용된다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 유전자를 표적으로 하는 적어도 두 개의 다른 siRNA가 사용되었다 (예를 들어, 조합되어). RNAi는 본 발명에서 다양한 목적을 위해 사용된다. 예를 들어, RNAi 약제는 PLA2G16 억제제로서 사용될 수 있다, 예를 들어, 치료 또는 연구 목적을 위해. PLA2G16를 억제하는 RNAi 약제는 PLA2G16 (도 다른 단백질에 대한 것 보다)에 대한 효과 때문에 예를 들어, 소분자와 같은 이차 화합물의 효과를 확인하기에 유용할 수 있다. 예를 들어, PLA2G16의 특이적 억제제로 추정되는 소분자는 세포에서 PLA2G16 발현이 RNAi에 의해 억제되는 효과를 가지지 않을 것으로 기대될 것이다. 다른 측면에서, 세포에 의해 발현될 것인 RNAi는 PLA2G16 외에 PLA2를 억제하기 위해 사용된다. 다른 PLA2 효소 억제는 PLA2G16를 억제하는 화합물의 동정을 가능하게 할 것이다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, PLA2G16 발현은 하나 또는 그 이상의 PLA2G16를 암호화하는 mRNA에 상보적인 올리고뉴클레오타이드가 세포에 전달되어 PLA2G16 mRNA에 혼성화되어, 예를 들어, RNase H에 의한 mRNA의 분해 또는 입체 장애(steric hindrance)에 의한 번역의 봉쇄되는 결과를 초래하기에 적합한 안티센스를 이용하여 억제된다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, PLA2G16 억제제는 적어도 PLA2G16의 분자 기능을 억제한다. 몇몇 구체예에서, 상기 분자 기능은 촉매 활성이다, 예를 들어, 포스포리파아제 활성 및/또는 라이소포스포리파아제 활성. 예를 들어, 상기 활성은 포스포리파아제 A2 활성, 즉, 포스포리피드의 sn-2 결합의 가수분해를 촉매하는 능력이다. 몇몇 구체예에서, 화합물은 PLA2G16의 분자 기능을 직접적으로 억제한다. “직접 억제(Direct inhibition)”는 표적의 분자 기능을 억제하는 표적과의 물리적인 상호작용 (결합)을 말한다. 예를 들어, PLA2G16 억제제의 PLA2G16로의 결합은 효소의 반응 촉매 능력을 간섭할 수 있으며 및/또는 기질이 활성 자리(active site)로 들어가는 것을 예방할 수 있다. 다양한 화합물이 PLA2G16 분자 기능의 직접적인 억제에 사용될 수 있다. 직접적으로 PLA2G16를 억제하는 화합물의 예는 예를 들어, 소분자, 항체, 또는 엡타머 일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 직접적인 억제제는 기질 유사체(analog) (예를 들어, 포스포리피드 유사체) 또는 전이 상태(transition state) 유사체이다.
몇몇 구체예에서, 억제제는 비가역적(irreversible) 억제제이다. 대부분의 비가역적 효소 억제제들은 효소와 반응하고 효소 활성에 필요한 아미노산 잔기(들) 변형처럼 화학적으로 바꾼다. 예를 들어, 비가역적인 억제제는 하나 또는 그 이상의 알데하이드(aldehyde), 할로알케인(haloalkane), 알켄(alkene), 플루오로포스페이트(fluorophosphonate) (예를 들어, 알킬 플루오로포스페이트), 마이클 수용체(Michael acceptor), 페닐 설포네이트(phenyl sulfonate), 메틸케톤(methylketone), 예를 들어, 할로겐화된 메틸케톤 또는 디아조메틸케톤(diazomethylketone), 플루오로포스포네이트(fluorophosphonate), 바이닐 에스터(vinyl ester), 바이닐 설폰(vinyl sulfone), 또는 바이닐 설폰아마이드(vinyl sulfonamide)와 같은 반응 작용기(reactive functional group) 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 비가역적 PLA2G16 억제제는 PLA2G16의 아미노산 측쇄와 반응하는 친전자성 기(electrophilic group)를 포함한다. 예를 들어, 친전자성 기는 하이드록실(hydroxyl)기 또는 설피드릴(sulfhydryl)기와 같이 친핵체(nucleophile)를 함유하는 아미노산 측쇄와 반응할 것이다. 예를 들어, 상기 아미노산은 시스테인, 세린, 또는 트레오닌이다. 또 다른 구체예에서, 비가역적 억제제는 히스티딘(histidine)과 반응한다. 때때로 당업계에서 “시스테인 트랩(cysteine traps)”으로 불리는 모이어티들(Moieties)은 다양한 구체예에서 이용될 것이다. 몇몇 구체예에서, 시스테인-반응성 모이어티는 말레이미드(maleimide), 아이소티아졸리논(isothiazolinone), 테트라졸(tetrazole), 락탐(lactam), 또는 카바메이트(carbamate)이다. 반응성 기능기는 기질 유사체 또는 효소에, 예를 들어, 효소에 또는 활성 자리 가깝게, 결합하여 맞는 다른 분자로 통합될 수 있다.
다른 구체예에서, PLA2G16 억제제는 가역적인(Reversible) 억제제이다. 가역적인 억제제들은 비-공유결합하여, 효소, 효소-기질 복합체(enzyme-substrate complex), 또는 그 둘 다에 결합할 것이다. 가역적 억제제에 의한 억제는 경쟁적 억제, 비경쟁적 억제, 복합 억제, 비-경쟁적 억제로 분류될 것이다. 예를 들어, Berg J.M, et al., Biochemistry, 6th ed., W. H. Freeman and Company, 2007를 참조하라. 몇몇 구체예에서, 가역적인 억제제는 PLA2G16 활성 자리에 결합 및/또는 기질(들)과 PLA2G16 활성자리에 접근하기 위해 경쟁한다. 몇몇 구체예에서, 가역적 억제제는 비-가수분해성(non-hydrolyzable) 기질 유사체이다.
몇몇 구체예에서, PLA2G16 억제제는 지방산의 유사체이다, 상기에서 유사체는 4 내지 약 30 탄소 길이, 예를 들어, 12 내지 20 탄소 길이의 알킬 사슬을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 알킬기는 포화되었다. 몇몇 구체예에서, 상기 알킬기는 불포화되었다. 몇몇 구체예에서, 상기 알킬기는 비분지형이다(unbranched). 몇몇 구체예에서, 상기 알킬기는 포유동물 세포에 존재하는 지방산에서 발견되는 본연의 알킬기의 구조를 가진다. 지방산의 예는 예를 들어, 미리스톨레인산(myristoleic acid), 말미톨레인산(palmitoleic acid), 사피엔산(sapienic acid), 올레인산(oleic acid), 리놀레인산(linoleic acid), 리놀레닌산(linolenic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid), 에루스산(erucic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid), 라우르산(lauric acid), 미리스트산(myristic acid), 팔미트산(palmitic acid), 스테아린산(stearic acid), 및 에이코사노산(eicosanoic acid)을 포함한다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 억제제는 아라키돈산 도는 리놀렌산 유사체이다. 몇몇 구체예에서, 상기 유사체는 메틸화된 지방산이다. 몇몇 구체예에서, 상기 아라키돈산 유사체는 7,7-디메틸-5,8-에이코사디에노산과 같은 에이코사디에노산(eicosadienoic acid)이다.
몇몇 구체예에서, 상기 억제제는 지방산 유사체를 포함하며, 상기에서, 상기 유사체는 반응 작용기를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 지방산 유사체는 카르복실기(carboxyl group) 대신에 할로겐화된 메틸 케톤기를 포함한다. 예를 들어, 여러 구체예에서, 할로겐은 클로린(chlorine), 플루오린(fluorine), 브로민(bromine), 도는 아이오딘(iodine)이다. 몇몇 구체예에서, 할로겐화된 메틸 케톤기는 플루오로메틸케톤(fluoromethyl ketone), 트리 플루오로메틸케톤(trifluoromethyl ketone), 또는클로로메틸케톤(chloromethyl ketone)이다. 몇몇 구체예에서, 상기 지방산은 아라키돈산이다. 한 구체예에서, 상기 억제제는 COOH기가 COCF3로 교체된 아라키돈산의 트리플루오로메틸 케톤 유사체, 즉, 아라키도닐 트리플루오로메틸 케톤 (AACOCF3)이다. AACOCF3는 PLA2G16를 억제하고 또한 cPLA2 및 sPLA2를 억제한다 (상기 Duncan). AACOCF3가 cPLA2의 소수성 포켓에 결합하여AACOCF3의 카보닐기가 활성 자리의 세린 228과 공유 결합을 형성하는 것이 믿어진다 (Street et al., 1993; Trimble et al., 1993). 가설에 따름이 없이, AACOCF3는 PLA2G16의 활성 자리 세린과 반응할 것이다. 또 다른 구체예에서, PLA2G16 억제제는 메틸 아라키노닐 플루오로포스페이트(methyl arachidonyl fluorophosphates, MAFP) 또는 이의 유사체이다 (예를 들어, Martin, BR, et al., J. Pharm. Exp. Ther., 294 (3), 294: 1209-1218, 2000 참조). MAFP는 세린 및 시스테인 가수분해효소(hydrolases)를 효소에 공유 결합하여 억제하는 것으로 믿어진다. MAFP는 iPLA2 및 cPLA2만큼 PLA2G16을 억제하나, sPLA2은 억제하지 않는다. 가설에 따름이 없이, PLA2G16은 MAFP에 의해 불활성화되는 활성 시스테인 잔기를 필요로 할 것이다.
하나 또는 그 이상의 I-XV PLA2s 군을 억제하는 다양한 다른 화합물들이 동정되어왔다. 예를 들어, U.S. Pat. Pub. No. 20080319065은 2-하이드로카본 꼬리 및 네 개의 탄소 테더(carbon tether)를 가진 옥소아마이드(oxoamide)를 함유하고 PLA2 Group IVA c PLA2 및/또는 Group VIA iPLA2 및/또는 Group V sPLA2을 억제하는 것으로 보고된 화합물을 밝힌다. U.S. Pat. Pub. Nos. 20030144282 및 20100029645는 다양한 PLA2 효소 억제제들을 밝힌다 (예를 들어, WO2003048139 참조); 피리미돈(pyrimidone), 피리돈(pyridine), 피리디논(pyridinone), 및 피리미디논(pyrimidinone) 화합물 (예를 들어, WO2002030904 참조; WO 2001060805; WO 2000027824; WO 2003087088; WO 2003086400; WO 2003/042218; WO2003042206; WO200203091 1 ; WO2003041712), 피롤리딘(pyrrolidine) 파생물들 (예를 들어, WOl 998033797 참조). 가설에 따름이 없이, 하나 또는 그 이상의 Group l-XV PLA2 효소를 억제하는 화합물의 적어도 몇몇은 또한 PLA2G16을 억제할 것이다. 몇몇 구체예에서, 그런 다른 Group I- XV PLA2에 대한 주 작동 메커니즘은 그런 다른 PLA2에 존재하나 PLA2G16에는 존재하지 않는 서열 모티프에 특이적으로 결합하는 것과 관련되지 않는다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서 상기 화합물은 그것의 주 작동 메커니즘이 GXSXG 공통 모티프(consensus motif) 또는 CCXXHDXC 모티프에 결합하는 것을 수반하지 않는다.
몇몇 구체예에서, PLA2G16 억제제는 예를 들어, 파지 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이와 같은 표시 기술(display technique)을 이용하여 동정된 펩타이드를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 펩타이드는 하나 또는 그 이상의 비-표준 아미노산으를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 펩타이드는 고리형(cyclic)이다. 예를 들어, 상기 펩타이드는 이화화결합(disulfide bond) 또는 공유 결합을 통해 고리화될 수 있다, 예를 들어, N- 및 C- 말단 아미노산 사이, N- 또는 C- 말단 아미노산 및 내재 아미노산 사이, 또는 두 내재 아미노산 사이.
몇몇 구체예에서, PLA2G16 억제제는 엡타머를 포함한다. 일반적으로, 엡타머는 종종 특정 목적 분자에 결합하는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드이다 (예를 들어, DNA 또는 RNA, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 비-표준 뉴클레오티드 또는 2'-플루오로, 2'-아미노와 같은 변화, 및/또는 2'-메톡시 뉴클레오티드를 함유하는). 엡타머들은 대개 실험실 내 발생(evolution) 및 SELEX와 같은 선별 과정으로부터 유래된다. 목적 단백질에 대해 특이적인 엡타머를 얻기 위한 방법은 당업계에 자명하다. 예를 들어, Brody EN, Gold L. J Biotechnol. , 74( 1 ):5- 13, 2000를 참고하라.
몇몇 구체예에서, PLA2G16 억제제는 항체 또는 그의 일부를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 항체는 단일-사슬 항체, 이량체(diabody), 삼량체(triabody), 또는 미세소체(minibody)이다. 당업계의 항체 생산의 표준 방법이 항체, 예를 들어, PLA2G16에 결합하는 단일클론항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 동물, 예를 들어, 마우스 또는 토끼, 가 PLA2G16 또는 그의 일부로 면역화되고, 항체 생산 세포들이 분리되며, 단일클론 항체가 하이브리도마(hybridoma) 기술을 이용하여 동정된다. 몇몇 구체예에서, 상기 마우스는 적어도 몇몇 재배열되지 않은(unrearranged) 인간 면역글로불린 유전자 서열 및 바람직하게는 표적화된 쥐 과의 내생 중쇄 및 경쇄가 분해된 서열을 포함하는 형질전환 마우스이다. 몇몇 구체예에서, 항체는 재조합 핵산 기술 (예를 들어, 파지 또는 효모 디스플레이)을 이용하여 동정 또는 생산된다. 예를 들어, Lonberg N. Fully human antibodies from transgenic mouse and phage display platforms. Curr Opin Immunol. 20(4):450-9, 2008를 참조하라.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 화합물은 PLA2G16을 간접적으로 억제한다. “간접적 억제” 화합물 및 표적 사이에 물리적인 상호작용이 필요하지 않은 메커니즘에 의한 표적 (예를 들어, PLA2G16)의 억제를 말한다. 예를 들어, 상기 화합물은 PLA2G16의 위치(localization) 또는 번역-후 변형에 관련된 폴리펩타이드의 발현 또는 활성을 억제할 수 있다, 상기에서 위치 또는 번역-후 변형은 PLA2G1의 6분자 기능에 중요하다.
몇몇 구체예에서, PLA2G16 억제제는 당업계에서 항바이러스 활성 및/또는 바이러스 감염 치료가 필요한 개체의 치료에 유용하다고 알려진 또는 제안된 화합물이 아니다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 억제제는 당업계에서 항바이러스 활성 및/또는 바이러스 감염 치료가 필요한 개체의 치료에 유용하다고 알려진 또는 제안된 화합물이나, 선택적으로, 투여될 것이거나 또는 그 반대로 본 발명에서 (i) 다른 바이러스들, 예를 들어, 화합물이 항바이러스 활성을 가진 것으로 알려지거나 제안되지 않은, 바이러스에 의한 감염을 억제하기 위해; (ii) 다른 형태 (예를 들어, 더욱 고도로 정제된), 다른 양 또는 조성물, 또는 하나 또는 그 이상의 다른 기질들의 조합으로; (iii) 다른 경로 또는 다른 종의 개체으로; 및/또는 (iv) 하나 또는 그 이상의 본 발명의 조성물 및/또는 방법으로부터 명백히 제외하여 사용될 것이다.
VI . 조성물 및 화합물을 동정 및/또는 시험하기 위한 방법
본 발명은 바이러스 감염 억제에 유용한 화합물을 동정하는 방법 및 본 발명의 방법을 수행하기 위한 분석 시스템을 제공한다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 시험 화합물이 PLA2G16 폴리펩티드를 억제하는지를 측정하는 단계, 상기에서 만일 화합물이 PLA2G16을 억제하면, 상기 화합물은 항바이러스 화합물 후보자인 것을 포함하는, 시험 화합물이 항바이러스 화합물 후보자인지 측정하는 방법을 제공한다. 관련된 측면에서, 본 발명은, (a) 시험 화합물을 제공하는 단계; (b) 상기 시험 화합물이 PLA2G16을 억제하는지 측정하는 단계, 상기에서 화합물이 PLA2G16을 억제하면, 상기 화합물이 항바이러스 화합물 후보자인 것을 포함하는 항바이러스 화합물 후보자를 동정하는 방법을 제공한다.
몇몇 구체예에서, 상기 방법은 시험 화합물이 PLA2G16의 발현을 억제하는지 측정하고, 상기에서 화합물이 PLA2G16 발현을 억제하면, 상기 화합물이 항바이러스 화합물 후보자인 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 화합물이 PLA2G16의 분자 기능을 억제하는지 측정하고, 상기에서 화합물이 PLA2G16의 분자 기능을 억제하면 상기 화합물이 항바이러스 화합물의 후보자인 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 분자 기능은 효소 활성이다, 예를 들어, 포스포리파아제 A2 활성 또는 라이소포스포리파아제 활성.
몇몇 구체예에서, 방법이 다세포 생물체에 의해 자연적으로 발현된 PLA2G16, 즉 본연의 PLA2G16와 서열이 동일한 PLA2G16 폴리펩타이드를 이용하여 수행된다. 몇몇 구체예에서, 방법은 기능적 PLA2G16 변이체를 이용하여 수행된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 분석에서 사용된 상기 기능적 변이체는 PLA2G16의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%. 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 포스포리파아제 A2 활성을 보유한다. 몇몇 구체예에서, 상기 기능적 변이체는 적어도 50% 또는 적어도 75%를 보유하거나 본연의 PLA2G16와 같이 포스포리파아제 A2 활성 및/또는 라이소포스포리파아제 활성과 같다. PLA2G16 변이체는 단백질의 생산 또는 정제를 가능하게 하는 태그의 존재와 같은 본 발명의 스크리닝 방법에 이용을 간편하게 하는 특성을 가질 것이다. PLA2G16 변이체를 이용해서 억제제로 동정된 화합물은 본연의 폴리펩타이드를 억제하는 능력을 확인하기 위해 본연의 PLA2G16를 이용하여 추가로 시험될 수 있다.
넓은 범위의 시험 화합물들은 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 시험 화합물은 소분자, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 리피드, 카르보하이드레이트, 또는 하이브리드 분자일 수 있다. 화합물은 천연물(natural sources)로부터 또는 합성하여 얻어질 수 있다. 화합물들은 적어도 부분적으로 순수할 수 있거나 추출물로 또는 다른 형태의 혼합물로 존재할 것이다. 그의 추출물(Extracts) 또는 분획(fractions)이 예를 들어, 식물, 동물, 미생물, 해양생물(marine organisms), 발효액(fermentation broths) (예를 들어, 토양, 박테리아 또는 진균 배양액), 등으로부터 생산될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 화합물 수집물 (“라이브러리(library)”)이 시험되었다. 상기 라이브러리는 예를 들어, 100 내지 500,000의 화합물, 또는 그 이상의 화합물을 포함할 것이다. 화합물들은 종종 멀티웰 플레이트(multwell plates)에 배열된다(arrayed). 그들은 용매 (예를 들어, DMSO)에 용해 또는 건조 형태, 예를 들어, 가루 또는 고체로 제공될 수 있다. 합성 반-합성, 및/또는 자연 발생된 화합물의 수집물(Collections)이 시험되었다. 화합물 라이브러리는 구조적으로 관련된, 구조적으로 다양한, 또는 구조적으로 관련되지 않은 화합물을 포함할 수 있다. 화합물은 인공적(사람에 의해 발명되고 자연에서 발견되지 않는 구조를 가지는) 또는 자연발생적일 것이다. 몇몇 구체예에서, 라이브러리는 다른 약물 탐색 프로그램에서 “성공하는(hits)” 또는 “유도하는(leads)”것으로 동정된 적어도 몇몇 화합물 및/또는 그의 파생물을 포함한다. 화합물 라이브러리는 자연 산물 및/또는 합성 유기 화학으로 비-유도된 또는 유도되어 만들어진 화합물을 포함할 수 있다. 종종 화합물 라이브러리는 소분자 라이브러리다. 다른 목적 라이브러리들은 펩타이드 또는 펩토이드 라이브러리(peptoid libraries), cDNA 라이브러리, 및 올리고뉴클레오티드 라일브러리를 포함한다.
라이브러리는 모아질 수 있다 (예를 들어, 주로 같은 코어 구조를 가지고, 같은 전구체로부터 유래되며, 또는 공동으로 적어도 하나의 생화학 활성을 가지는 화합물로 구성되는). 몇몇 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 Group I-XV PLA2 효소의 억제제로서 동정된 화합물들이 시험된다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 억제제로 동정된 화합물의 PLA2G16에 대한 IC50는 하나 또는 그 이상의 다른 PLA2 효소 (예를 들어, 지금까지 알려진 인간에 존재하는 하나, 하나 이상, 또는 모든 다른 PLA2 효소)에 비해 약 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500, 또는 1000-배 낮을 것이다.
화합물 라이브러리는 Tocris Bioscience, Nanosyn, BioFocus와 같은 많은 상업적 판매원 및 정부 기관으로부터 이용 가능하다. 예를 들어, U.S. National Institutes of Health (NIH) Molecular Libraries Program의 기관인 Molecular Libraries Small Molecule Repository (MLSMR)은 물학적 활성이 알려진 및 알려지 않은 >300,000개의 화학적으로 다양한 화합물들의 수집물의 동정, 획득, 유지, 및 분배를 구상한다, 예를 들어, 고수율 스크리닝 분석 ( 참조). NIH Clinical Collection (NCC)는 인간 임상 실험에 이용된 기록이 있는 거의 450 개의 소분자 어레이를 플레이팅(plated array)한다. 상기 화합물들은 안전한 프로파일로 알려진 약물과 매우 유사(drug-like)하다. NCC 수집물은 96-웰 플레이트에 어레이되었다. 각각의 화합물 50 μl가 거의 10 mM의 100% DMSO 용액에 주어졌다. 몇몇 구체예에서, “승인된 인간 약물들”을 포함하는 화합물의 수집물이 시험된다. “승인된 인간 약물들”은 인간치료에 US 식약청(Food and Drug Administration), 유럽 의약품 평가청(European Medicines Evaluation Agency), 또는 그것이 시장에 나가기 전에 치료제의 안전성 평가를 맡고 있는 유사한 기관과 같은 정부 규제 기관(government regulatory agency)에 의해 사용이 승인된 화합물이다. 시험된 화합물은 예를 들어, 항종양(antineoplastic) 약물, 항생(antibacterial) 약물, 항바이러스(antiviral) 약물, 항진균(antifungal) 약물, 항원생동물(antiprotozoal) 약물, 항기생충(antiparasitic) 약물, 항우울(antidepressant) 약물, 항정신병(antipsychotic) 약물, 마취(anesthetic) 약물, 항협심증(antianginal) 약물, 항고혈압(antihypertensive) 약물, 항부정맥(antiarrhythmic) 약물, 항염증(anti-inflammatory) 약물, 진통(analgesic) 약물, 항혈전(antithrombotic) 약물, 구토방지(antiemetic) 약물, 면역조절(immunomodulator) 약물, 항당뇨병(antidiabetic) 약물, 지질- 또는 콜레스테롤 저하 약물 (예을 들어, 스타틴(statin)) , 항경련(anticonvulsant) 약물, 항응고(anticoagulant) 약물, 항불안(antianxiety) 약물, 수면(hypnotic) (수면-유도) 약물, 호르몬(hormonal) 약물, 또는 항-호르몬 약물, 등일 것이다. 몇몇 구체예에서, 화합물은 적어도 몇몇 전임상(preclinical) 또는 임상 개발을 겪거나, “약물-유사” 특성을 가지는지 측정 또는 예측된다. 예를 들어, 상기 시험된 화합물은 비-인간 동물에서 제 I 임상 단계(Phase I trial) 또는 적어도 전임상 연구를 끝내고 안전 및 내성 증거를 보인 것 일 것이다. 몇몇 구체예에서, 시험 화합물은, 사용될 농도에서, 몇몇 구체예에서는, 사용될 농도보다 10-배, 100-배, 또는 1,000-배 높은 농도에서, 투여될 생물체의 세포 또는 시험될 세포에 대체로 비-독성이다. 예를 들어, 다양한 구체예에서, 세포 생존 및/또는 증식에서 통계적으로 유효한 효과가 없거나, 또는 생존 또는 증식의 감소가 1%, 5%, 또는 10% 이상이 되지 않을 것이다. 세포독성 및/또는 세포 증식에서의 효과가 다양한 분석 (상기 언급된 분석들 중 일부)을 이용하여 평가될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 시험 화합물은 당업계에서 알려진 또는 사용되는 세포 배양 배지, 예를 들어, 척추동물, 예를 들어, 포유동물 세포를 배양하기에 허용 가능한 배양 배지, 에서 발견되는 화합물이 아니며, 또는 만일 시험 화합물이 당업계에 알려진 또는 사용되는 세포 배양 배지에서 발견된다면, 상기 시험 화합물이 다르게, 예를 들어, 본 발명의 발명에서 사용되었을 때보다 더 높은 농도로 사용된다.
몇몇 구체예에서, 시험 화합물은 당업계에서 하나 또는 그 이상의 바이러스에 항바이러스 활성을 가지는 것으로 인식되나, 표적 바이러스, 예를 들어, 피코르나바이러스의 감염을 억제하기에 유용하다고 알려지지 않은 화합물이다. 몇몇 구체예에서, 시험 화합물은 당업계에서 항바이러스 활성을 가진다고 인식된 화합물이 아니다.
몇몇 구체예에서, 항바이러스 활성을 가진다고 알려진 하나 또는 그 이상의 화합물 또는 그의 혼합물이 시험되었으며, 상기에서 상기 화합물 또는 혼합물의 표적 분자 및/또는 항바이러스 활성 메커니즘은 알려지지 않았다. 그런 화합물들 또는 혼합물들의 본 발명에 따른 그들이 PLA2G16를 억제하는지 측정하기 위한 시험이 PLA2G16이 표적 분자인 것을 발견하도록 유도할 것이다. 그런 발견은 혼합물로부터의 유효성분(active component) 정제, 화합물 또는 혼합물의 더욱 높은 활성 파생물들의 치료제로의 개발을 가능하게 할 것이다.
시험 화합물이 PLA2G16 발현을 억제하는지 측정하는 단계는 여러 방법으로 수행될 수 있다. PLA2G16 발현을 억제하는 화합물들은 세포와 시험 화합물의 접촉하고, 배양하는 세포를 적정 기간 (예를 들어, 존재하는 PLA2G16 mRNA 및/또는 단백질이 분해되기에 충분한 시간) 동안 유지하고, PLA2G16 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 것에 의해 동정될 수 있다. 당업계에 알려진 방법이 mRNA 또는 단백질을 측정하기 위해 이용될 수 있다. 다양한 다른 혼성화-기반 또는 증폭-기반 방법들이 RNA 측정을 위해 사용 가능하다. 예시는 노던 블롯(Northern blots), 마이크로어레이(microarray) (예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 또는 cDNA 마이크로어레이), 역전사(reverse transcription) (RT)-PCR (예를 들어, 정량적(quantitative) RT-PCR), 또는 역전사 뒤에 시퀀싱을 포함한다. TaqMan® 분석 및 SYBR® Green PGR 분석이 일반적으로 실-시간(real-time PCR) PCR 기술에 사용된다. 다른 분석은 Standardized (Sta) RT-PCR™ (Gene Express, Inc., Toledo, OH) 및 QuantiGene® (Panomics, Inc., Fremont, CA)를 포함한다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 mRNA의 수준이 측정된다. 다른 구체예에서, 리포터-기반 시스템(reporter-based system)이 사용된다. 몇몇 구체예에서, 리포터-기반 시스템은 PLA2G16 유전자와 발현 조절 요소가 리포터 분자 (“리포터”)를 암호화하는 서열에 조작 가능하게 연결된 핵산을 포함한다. 리포터는 종종 단백질이나 핵산일 수 있다. 리포터는 종종 쉽게 검출 가능한, 형광(fluorescent), 발광(luminescent), 또는 발색(colorimetric) 신호를 만드는 단백질 또는 특정 파장의 빛을 흡수 가능한 분자이다. 몇몇 구체예에서, 리포터 분자는 형광(fluorescent), 발광(luminescent), 또는 발색(colorimetric) 신호를 만들도록 기질에 작용하는 효소를 포함한다. 리포터 분자들의 예는 녹색, 파란색, 사파이어색, 노란색, 오렌지색, 및 시안색(cyan) 형광 단백질 및 그의 파생물을 포함한다; 빨간색 형광 단백질 단량체 및 “mFruits”로, 예를 들어, mCherry, mStrawberry, mTomato로 알려진 것과 같은 파생물; 루시퍼라아제(luciferase); 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase); 홀스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase); 알랄라인 포스파타아제(alkaline phosphatase); 등. 몇몇 구체예에서, 리포터들은 분비된 단백질이다. 몇몇 구체예에서, 리포터는 목적 생물체 유래 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 서열에 의해 암호화된다. RNAi 약제의 표적 유전자 발현 침묵(silence expression) 효과 평가를 위한 방법은 shRNA 또는 siRNA의 표적 mRNA (또는 표적의 부분)가 리포터를 암호화하는 서열의 하류에 클론된 서열의 이용과 관련될 수 있으므로, 표적 서열 및 리포터를 둘 다 암호화하는 바이시트로닉(bicistronic) mRNA 전사물이 만들어진다. 표적 유전자 낙다운은 mRNA 전사물의 분해를 초래하며, 이는 비례하는 리포터 단백질의 발현 감소를 야기한다.
PLAG16 분자 기능을 억제하는 화합물은 여러 다른 세포-없는(cell-free) 또는 세포-기반 분석을 이용하여 동정될 수 있다. 세포-없는 분석은 대개 분리된 표적 분자를 수반한다. 예를 들어, 표적 분자는 세포 또는 조직 파쇄물 또는 이의 분획에 (예를 들어, 표적 분자를 발현하는 세포로부터 만들어진 파쇄물) 존재할 수 있으며, 또는 적어도 부분적으로 정제 또는 합성된 표적 분자일 수 있다. 조직 분쇄물은 PLA2G16 발현하는 세포를 함유하는 조직으로부터 만들어질 수 있다. 몇몇 구체예에서, 조직 파쇄물은 지방 조직으로부터, 예를 들어, 백색 지방 조직(white adipose tissue)으로부터 얻어진다. 제조될 수 있는 세포 파쇄물 또는 PLA2G16 폴리펩타이드가 정제될 수 있는 다양한 세포들이 하기에 세포-기반 분석 논의에서 언급된다. 몇몇 구체예에서, 분리된 폴리펩타이드는 재조합 핵산 기술 또는 실험관내 번역을 이용해 합성된 폴리펩타이드이다. 분석을 수행하기 위해, 시험 화합물이 표적 분자와 접촉되었다, 예를 들어, 시험 화합물 및 표적 분자를 포함하는 조성물 제조에 의해. 하나 또는 그 이상의 지표, 예를 들어, 결합, 효소 활성, 등이 측정되었다. 상기 조성물은 목적 화합물 동정에 필요하거나 도움이 되는 요소(들)을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 결합 분석 또는 활성 분석에 이용하기 위한 조성물은 세포막 또는 세포막 구성요소를 포함한다. 그런 막 또는 구성요소는 여러 구체예에서, 자연발생적 (예를 들어, 동물세포 막에 존재하는 구성요소), 인공적, 또는 그의 조합일 것이다. 예를 들어, 상기 조성물은 이중층 지질막(lipid membrane bilayer), 지질 소낭(lipid vesicles), 등을 함유할 수 있다. 선택적으로, 지질 이중층은 표면에 고정화된다. 몇몇 구체예에서, 상기 지질(lipids)은 포스포리피드를 포함한다.
다양한 세포-없는 분석이 PLA2G16 폴리펩타이드를 억제하는 화합물을 동정하기 위해 수행될 것이다. 몇몇 구체예에서, 분석은 시험 화합물이 PLA2G16 폴리펩타이드에 결합하는지 검출 및/또는 그런 결합의 하나 또는 그 이상의 특성을 정량한다. 많은 결합 분석 방식들이 당업계에 알려져있다. 다른 구체예에서 PLA2G16 폴리펩타이드 또는 시험 화합물이 검출 가능하게 표지된 반면, 몇몇 구체예에서, 표지-없는(label-free) 분석이 이용된다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 폴리펩타이드의 결합 능력 및/또는 억제 활성이 시험될 PLA2G16 폴리펩타이드 또는 화합물이 고체 지지체에 부착되었다. 몇몇 구체예에서, 고체 지지체는 단단한 또는 반-단단한 표면을 가지는 제품이다. 몇몇 구체예에서, 지지체의 적어도 한 표면이 대체로 평평하다. 다른 구체예에서, 지지체는 거의 구형(spherical)이다. 지지체는 무기 또는 유기 재료 또는 그의 조합으로 구성될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 지지체는 적어도 금속, 세라믹, 유리, 플라스틱, 젤, 또는 다른 기질 부분을 포함한다. 이러한 제품은 예를 들어, 플레이트 (예를 들어, 멀티 웰 플레이트), 슬라이드, 입자 (예를 들어, “비드(beads)”, 예를 들어, 자석 비드), 펠릿, 바, 간상체(rods), 핀, 디스크, 칩, 필터, 또는 다른 적합한 형태의 모습을 취할 것이다. 몇몇 구체예에서, 지지체는 센서, 예를 들어, 결합에서의 변화를 검출 가능한 센서(sensor)를 포함한다. 예를 들어, 상기 센서는 질량 또는 형광과 같은 신호 변화를 검출할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 지지체는 전극(electrode)을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 화합물은 소분자 마이크로어레이로 정렬된다. 화합물들은 표면, 개개의 웰 또는 관(vessels), 등에서 여러 위치에 존재할 수 있다. 예를 들어, Vegas AJ, et al., Chem Soc Rev. 37(7): 1385-94, 2008를 참고하라. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 폴리펩타이드 또는 화합물은 지지체에 비공유 결합적으로 부착되거나 공유 결합되어있다. 비공유 결합적 부착은 친화도-기반 메커니즘을 통한, 예를 들어, 폴리펩타이드 또는 화합물의 표면으로의 흡착 (그런 흡착을 가능하게 하기 위한 물질로 코팅될 수 있는), 또는 PLA2G16 폴리펩타이드 또는 시험 화합물을 고정하여 물리적으로 지지체와 연결어 유지될 수 있는 다른 방법들 일 수 있다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 폴리펩타이드 또는 시험 화합물을 지지체에 부착하기 위해 항체가 이용된다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 폴리펩타이드 또는 시험 화합물이 비오틴-아비딘(biotin-avidin) 상호작용 또는 다른 강한 상호작용 결합에 의해 지지체에 부착된다, 상기에서 두 결합 파트너들 중 하나가 직접적 또는 간접적으로 지지체에 부착되고 다른 결합 파트너가 고정된 분자에 부착된다.
몇몇 구체예에서, 실험 화합물들이 여러 위치에 (예를 들어, 어레이 형태에서) 고정화된다. PLA2G16 폴리펩타이드가 추가되고 조성물이 결합이 일어나도록 적당한 기간 동안 유지된다. 몇몇 구체예에서, 결합안된 물질이 세척에 의해 제거되고, 만일 폴리펩타이드가 검출 가능하게 표지되면, 신호 감지에 의해 PLA2G16 폴리펩타이드가 항체를 이용하여 검출된다. 다른 구체예에서, 세척 단계는 불필요하다. 예를 들어, 결합은 형광 편광(fluorescence polarization), 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer), 또는 전기화학발광(electrochemiluminescence) 변화 측정에 의해 검출될 것이다. 다른 구체예에서, PLA2G16 폴리펩타이드가 고정되고, 시험 화합물들이 추가되며, 결합이 유사한 방법을 이용하여 측정된다.
몇몇 구체예에서, 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance, SPR)이 시험 화합물 및 PLA2G16 폴리펩타이드 사이의 운동(kinetics) (및/또는 속도(off rates)) 및/또는 결합 세기 (친화도(affinity))를 측정하기 위해 이용된다. 예를 들어, SPR 기술을 이용하여 (예를 들어, Biacore, Life Sciences, GE Healthcare로부터 이용 가능한 시스템들) 시험 화합물과 칩에 고정된 단백질 사이의 결합 및 해리(dissociation)가 측정될 수 있고, 시험 화합물을 함유하지 않은 용액이 칩에 로딩되었을 때 얻어진 값은 상기 측정된 값과 비교된다. 단백질에 결합 가능한 시험 화합물이 결합도 및 해리도(binding and dissociation rate) 및/또는 결합 정도에 기초하여 선별될 수 있다. 결합 검출 및/또는 정량을 위해 다른 유용한 방법은 석영 결정 미량 저울(quartz crystal microbalance), 광 캔티레버(optical cantilever), 마이크로채널공명기(microchannel resonator), 이중 편광빛가르개(dual polarisation interferometer), 플라즈몬-도파로 공명(coupled waveguide plasmon resonance), 면역침강(immunoprecipitation) 또는 다른 항체-기반 검출 방법들, 등온 적정(isothermal titration) 및 시차 주사 열량 측정법(differential scanning calorimetry), 모세관 전기이동(capillary electrophoresis), 공명 에너지 이동(resonance energy transfer), 전기화학발광(electrochemiluninesce), 및 형광 관련 분석의 용도를 포함한다.
몇몇 구체예에서, PLA2G16 폴리펩타이드와 결합하는 것으로 알려진 엡타머, 펩타이드, 비-가수분해성 기질 유사체, 또는 소분자가 표지되고, 결합 및/또는 폴리펩타이드의 활성을 억제 가능한 시험 화합물 (예를 들어, 소분자)을 스크리닝하기 위한 도구로서 사용된다. 상기 표지는 예를 들어, 방사선, 형광, 발광, 또는 다른 손쉬운 검출 가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 표지된 엡타머, 펩타이드, 비-가수분해성 기질 유사체, 또는 소분자와 경쟁하기 위한 시험 화합물의 능력이 검출될 수 있으며, 시험 화합물의 PLA2G16 폴리펩타이드와의 결합 지표(indicator)로서 제공된다. 예를 들어, 섬광 근접 측정법 (scintillation proximity assay, SPA)이 사용될 수 있다. PLA2G16 폴리펩타이드와 결합하는 화합물을 동정하기 위한 SPA의 몇몇 구체예에서, PLA2G16 폴리펩타이드가 섬광 물질을 함유하는 비드에 부착된다. 상기 비드는 대개 웰(well) 또는 관에 위치한다. 다른 구체예에서, PLA2G16 폴리펩타이드는 웰에 직접적으로 박힌 섬광 물질에 부착된다. PLA2G16 폴리펩타이드 및 시험 화합물에 결합 가능한 방사선 표지된 화합물이 웰에 첨가된다. 방사선표지된 화합물의 PLA2G16 폴리펩타이드와의 결합은 신호를 야기한다. 상기 신호는 방사선 표지된 화합물과 결합 경쟁하는 시험 화합물의 존재하에 감소하였다. 예를 들어, SPA를 리뷰한 J. Fraser Glickman, et al., Scintillation Proximity Assays in High-Throughput Screening. Assay and Drug Development Technologies. 6(3): 433-455, 2008 참조하라. 유사한 분석이 필터를 이용하여 수행될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 1 mM, 500 μΜ, 100 μΜ, 50 μΜ, 10 μ.Μ, 5 μΜ, 또는 1 μΜ와 같거나 그 이하의 Kd로 PLA2G16 폴리펩타이드에 결합하는 화합물이 선택된다. 몇몇 구체예에서, 화합물은 500 nM, 100 nM, 50 nM, 또는 10 nM와 같거나 그 이하의 Kd로 PLA2G16 폴리펩타이드에 결합한다. 몇몇 구체예에서, 화합물은 0.1 내지 10 nM Kd로 PLA2G16 폴리펩타이드에 결합한다. PLA2G16 폴리펩타이드에 결합하는 화합물은 그들이 PLA2G16 활성 (예를 들어, 촉매 활성)을 억제하는 정도를, 예를 들어, 하기에 기재된 바와 같이, 측정하기 위하여 추가로, 예를 들어, 세포-없이 또는 세포-기반 분석으로, 시험될 수 있다.
여러 다른 분석들이 PLA2G16 활성을 억제하는 화합물을 동정 및/또는 특징짓기 위해 이용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 화합물의 PLA2G16 폴리펩타이드의 화학 반응의 촉매 작용을 억제하는 활성이 평가된다. 몇몇 구체예에서, 상기 화학 반응은 포스포리피드의 sn-2 결합의 가수분해이다. PLA2G16 폴리펩타이드, 하나 또는 그 이상의 PLA2G16 기질(들)을 포함하는 화합물, 및 시험 화합물이 제공된다. 상기 PLA2G16 폴리펩타이드, 하나 또는 그 이상의 PLA2G16 기질(들), 및 시험 화합물은 주로 액체 배지에 허용 가능하다. 몇몇 구체예에서, 상기 액체 배지는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%), 97%>, 98%, 99% 또는 그 이상의 물 (v/v)를 포함하는 수용성 배지이다. 몇몇 구체예에서, 상기 액체 배지는 DMSO와 같은 유기 용매를, 예를 들어, PLA2G16 폴리펩타이드의 활성에 유기 용매가 없을 때의 활성에 비해 유의미하게 효과를 미치지 않는 양으로 포함한다. 본 발명의 문맥상 “기질(substrate)”은 PLA2G16 이 작용하는 분자, 즉, PLA2G16에 의한 촉매 작용 화학 반응을 겪는 분자이다. 기질의 예는 하기에서 논의된다. 기질 및 PLA2G16 폴리펩타이드의 농도는 다양할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 기질은 약 1 μΜ 내지 500 μΜ, 예를 들어, 약 10 μΜ 내지 50 μΜ, 100 μΜ 또는 200 μΜ 존재한다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 폴리펩타이드는 약 1 μg/ml 내지 100 1 μg/ml 존재한다. 농도 및 양의 선택이 적어도 특정 분석의 부분에 따를 것 이며 그것은 당업계 내임이 이해될 것이다. 조성물은 적합한 시간 동안 그렇지 않으면 PLA2G16 폴리펩타이드가 기질(들)과 기질들이 하나 또는 그 이상의 산물(들)로 전환되는 촉매 반응하기에 적합한 조건하에 (즉, 강력한 PLA2G16 억제제인 화합물 없이) 유지된다. 상기 반응은 원하는 시간 후에, 즉, (2 : 1) 메탄올:클로로폼의 첨가에 의해 정지될 것이다. 상기 조건 및 조성물에 존재하는 다른 성분(들)은 예를 들어, 특정 분석에 따라 다를 수 있다. PLA2G16 폴리펩타이드가 기질에 작용하기 위한 적합한 조건은 예를 들어, 약 6.5 내지 9.5, 예를 들어, 약 7.0 내지 9.0, 예를 들어, 약 7.5 내지 8/5, 예를 들어, 약 8.0의 pH를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 온도는 10 ℃ 내지 40 ℃, 예를 들어, 20 ℃ 내지 30 ℃, 예를 들어, 약 25 ℃이다. 다른 성분들은 조성물 내에 존재할 것이다. 몇몇 구체예에서, 상기 조성물은 pH를 조절하기 위해 Tris-HCl 또는 소튬보레이트(sodium borate)와 같은 완충액 물질(buffer substance)을 포함한다. 다른 완충 물질은 예를 들어, HEPES, MOPS, 등을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 조성물은 이가 양이온(divalent cation), 예를 들어, 칼슘 (Ca2 +)을 포함한다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서, 상기 조성물은 약 5 mM의 칼슘을, 예를 들어, 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM 칼슘을 포함한다. 구체예의 예시에서, 상기 조성물은 약 1 mM 칼슘 또는 약 2 mM의 칼슘을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 조성물은 EDTA와 같은 칼슘 킬레이터(calcium chelator)를 포함하지 않는다. 몇몇 구체예에서, 상기 조성물은 유리 칼슘 농도를 약 1.0 mM 이하로 감소시키지 않을 양의 칼슘 킬레이터를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 조성물은 계면활성제(detergent), 예를 들어, 약 1 내지 5 mM, 예를 들어, 약2 mM 또는 약 3 mM의 데옥시콜레이트(deoxycholate)를 포함한다.
몇몇 구체예에서, 상기 생산된 생산량(amount of product) 및/또는 생산률(rate of product) 형성이 측정된다. 상기 시험 화합물의 생산된 생산량 및/또는 생산률에 대한 효과가, 예를 들어, 적합한 참고값(reference value)과의 비교에 의해 평가되었다. 산물의 생산량 또는 생산률이 시험 화합물의 존재하에 적합한 참조값에 비해 감소하면, 상기 시험 화합물은 PLA2G16 폴리펩타이드의 기질을 하나 또는 그 이상의 산물(들)로 바꾸는 촉매 작용 능력을 억제한다, 즉, 상기 시험 화합물이 PLA2G16 폴리펩타이드의 억제제이다. 몇몇 구체예에서, 상기 기질 소비율 또는 기질 소비량이 측정되었다. 동등하게, 상기 남은 기질의 양이 측정되었다. 기질 소비량 또는 기질 소비율이 시험 화합물의 존재하에 적합한 참조값에 비해 감소하면, 상기 시험 화합물은 PLA2G16 폴리펩타이드의 기질을 하나 또는 그 이상의 산물(들)로 바꾸는 촉매 작용 능력을 능력을 억제한다, 즉, 상기 시험 화합물이 PLA2G16 폴리펩타이드의 억제제이다. 상기 분석에서의 참조값은 시험 화합물이 없는 유사한 또는 동일한 조건하에 측정될 수 있다.
몇몇 구체예에서, PLA2G16 기질이 포스포리파아제, 예를 들어, 포스포리파아제 A2 활성을 측정하기에 유용하다. 예를 들어, PLA2G16 기질은 자연발생 또는 인공 포스포리피드일 수 있다. 당업계에 통상적으로, 거의 모든 포스포리피드는 1 , 2-디아실글리세롤(diacylglycerol) 및 포스페이트(phosphate)기, 및 유기분자 (종종 질소 염기)로 구성된다. 포스포디에스터 가교(bridge)는 글리세롤 백본을 때로 “헤드기(head group)”로 불리는 염기와 연결한다. 헤드기의 예는 클로린, 에탄올아민(ethanolamine), 이노시톨(inositol), 및 세린이다. 예를 들어, 기질은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 또는 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine) 일 수 있다. 포스포리피드 분자의 아실기의 탄화수소 사슬(hydrocarbon chains)은 종종 다르다, 예를 들어, 그들은 다른 탄화수소 사슬을 가진 지방산 분자로부터 유래한다. 몇몇 구체예에서, 탄화수소 사슬은 12 내지 30개의 탄소이다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 기질은 자연 발생적 포스포리피드, 즉, 척추동물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포에서 발견되는 포스포리피드의 구조를 가진다. PLA2G16 기질의 예는 예를 들어, l ?팔미토일(palmitoyl)-2-리놀레오일(linoleoyl)-PC, 디리놀레오일(dilinoleoyl)-PC, 1 -팔미토일-2-리놀레오일-PS, 1 -팔미토일-2-리놀레오일-PE, 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 1 - 팔미토일 -2-아라키돈일(arachidonyl)-PC (약어: PC: 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine); PE: 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine); PS: 포스파티딜세린(phosphatidylserine))를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 기질은 콜린을 헤드기로서 포함한다. 몇몇 구체예에서, sn-2 에스터 대신에 티오 에스터 결합을 함유하는 포스포리피드 유사체가 사용되었다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 기질은 라이소포스포리파아제 활성 측정을 위해 유용하다. 예를 들어, 상기 기질은 라이소포스파티딜콜린, 예를 들어, l -팔미토일-2-하이드록시(hydroxyl)-sn-글리세롤-3-포스포콜린(phosphocholine) 일 수 있다.
몇몇 구체예에서, 기질은 PLA2G16 폴리펩타이드에 의한 생물학적 촉매 반응 산물의 검출을 가능하게 하는 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 상기 기질은 하나 또는 그 이상의 방사선 원자(radioactive atoms), 형광 표지, 및/또는 형광 퀀처(quenchers)를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 표지는 14C, 3H, 또는 32P 를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 기질은 기질 절단시 신호를 배출하는 모이어티를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 기질은 기질로부터 방출되어 쉽게 검출될 수 있는 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 상기 모이어티는 발색(colorimetric), 형광, 또는 배출 신호를 만들기 위해 또 다른 화합물과 반응할 수 있다. 표지(Labels)는 예를 들어, 유기물질 (“종래의(traditional)” 염료, 퀀처, 및 중합체들을 포함하는); 금속 킬레이트, 금속 및 반도체 나노결정(semiconductor nanocrystals) (예를 들어, “퀀텀 닷(quantum dots)”), 및 일부 아미노산 (예를 들어, 트립토판, 티로신)과 같은 생물학적 유래 발색단(fluorophores)과 같은 무기물질; 및 촉매 효소 작용하에 발광(luminescensce)을 나타내는 자연발생 또는 합성된 루시페린(luciferin)과 같은 화합물 (예를 들어, 반딧불이(firefly) 또는 레닐라(Renilla) 루시페린, 코엘렌테라진(coelenterazine))을 포함한다. 형광 염료는, 예를 들어, 아크리딘 염료(acridine dyes); 알렉사 염료(Alexa dyes); BODIPY, 시아닌 염료(cyanine dyes); 형광 염료(fluorescein dyes), 로다민 염료(rhodamine dyes), 및 앞서 말한 것의 파생물을 포함한다. 예를 들어, 많은 형광 및 그 밖의 검출 가능한 분자들 및 그의 이용 방법 및 변형을 기재한 Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies 1Oth edition (Invitrogen Corp.) 핸드북을 참고하라. 또 다른 구체예에서, sn-2 에스터 대신 티오 에스터 결합을 함유하는 포스포리피드 유사체가 사용되며, sn-2 위치에서의 PLA2 유리 티올기 방출에 의한 티오에스터 결합의 가수분해가 DTNB (5,5'-디티오비스(dithiobis)(2-니트로벤조산(nitrobenzoic acid)))에 의해 검출 가능하다.
몇몇 구체예에서, 기질은 소낭(vesicle) 또는 마이셀(micelle)에 존재한다. 예를 들어, 리피드-계면활성제 마이셀(lipid-detergent micelles)이 이용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 데옥시콜레이트와 같은 이온성 계면활성제가 사용된다. 다른 계면활성제는 예를 들어, Triton X-100을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 약 100 μΜ의 l -팔미토일-2-리놀레오일-PC와 2 mM 데옥시콜레이트를 포함하는 조성물 및 2 mM CaCl2가 사용되었다. 시험 화합물은 소낭 또는 마이셀로 편입될 수 있다.
다양한 분석이 PLA2 촉매 활성을 측정하기 위해 이용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 당업계에서 Group I-XV PLA2 (예를 들어, 세포질 또는 분비된PLA2)를 측정하기 위해 이용된 분석이 이용되거나 PLA2G16의 촉매 활성을 측정하기 위해 변형되었다. 몇몇 구체예에서, 14C- 또는 3H-표지된 지방산을 sn-2 위치에 함유하는 포스포리피드의 기질 (예를 들어, 포스파티딜콜린 또는 포스파티딜에탄올아민)과 함께 방사선 연대(radiometric) 분석이 사용되었다. 방출된 상기 지방산이 반응 안된 기질로부터 분리되고 액체 섬광 계수(liquid scintillation counting)에 의해 정량된다. 다른 구체예에서, 형광 이동(fluorescence displacement) 분석이 이용된다. 형광 분자는 예를 들어, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 검출될 수 있다. 분석의 예는 포스포리파아제 A2-촉매된 디데카노일(didecanoyl)-포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 가수분해 결과로서 방출된 데칸산(decanoic acid)에 의한 알부민 또는 랫트 간 지방산-결합 단백질로부터의 지방산 프로브 형광 이동을 수반한다, A.R. Kinkaid ＆ D.C. Wilton, A continuous fluorescence displacement assay for phospholipase a2 using albumin and medium chain phospholipid substrates. Anal. Biochem. 212: 65-70, 1993; D.C. Wilton, A continuous fluorescence displacement assay for the measurement of phospholipase A2 and other lipases that release long-chain fatty acids. Biochem. J. 266: 435-439, 1990). 또한, 7-하이드록시쿠마린(hydroxycoumarin)의 cPLA에 의한 지방산 에스테르 가수분해에 기초한 cPLA2 활성에 대한 분석이 기재된 유리 지방산 및 높은 형광 7-하이드록시쿠마린을 생산하는 Huang, Z., et al., Anal. Biochem. 222: 1 10-1 15, 1994를 참고하라. 또 다른 분석은 중합된 리포좀 기질(polymerized liposome substrates)에 기초한 형광 포스포리파아제 분석이다 (Chu, W., et al., Fluorometric phospholipase assays based on polymerised liposome substrates. Methods Mol. Biol. 109: 7-17, 1999. 또 다른 구체예에서, 포스포리파아제 활성을 측정하기 위해sn-2 에스터 대신에 티오 에스터 결합을 함유하는 포스포리피드 유사체가 기질로서 사용된다 (Yu, L, et al. Carbonothioate phospholipids as substrate for a spectrophotometric assay of phospholipase A2. Anal. Biochem. 265: 35-41 , 1998).
또 다른 구체예에서, 디리놀레오일 포스파티딜콜린(dilinoleoyl phosphatidylcholine, DL-PC)을 PLA2 기질로 및 리폭시게나아제(lipoxygenase)를 연결된 효소로 이용한 연결된 분광광도계 분석이 이용된다. 예를 들어, Jimenez, M., et al. A continuous spectrophotometric assay for phospholipase A(2) activity Anal Biochem., 31 (1): 131 -7, 2003, 및 그의 참고 문헌, 및 상기 Duncan를 참고하라. 본 연구에서, 리폭시게나아제 (리놀레이트:산소 산화환원효소(oxygen oxidoreductase), EC 1.13.1 1.12)는 (Z,Z)-펜타디엔(pentadiene) 계를 적어도 하나 포함한 지방산으로의 산소 분자의 첨가를 촉매하여 상응하는 하이드로퍼옥사이드(hydroperoxides)가 된다. 리폭시게나아제는 포스포리파아제의 작용에 의해 방출된 리놀레산을 산화시키며, 뒤이어 분광측정법(spectrophotometrically)으로 기록될 수 있는 상기 포스포리파아제의 활성이 리폭시게나아제의 작용에 의한 리놀레산 유래 하이드로퍼옥사이드의 형성 때문에 234 nm에서 흡수 증가한다. 상기 방법은 지속적인 포스포리피드 가수분해 기록을 제공한다.
몇몇 구체예에서, 섬광 근접 측정법 (SPA)가 이용된다. 예를 들어, 방사선 표지된 PLA2G16 기질이 섬광 물질을 함유하는 비드에 부착될 수 있다. 상기 비드는 대개 웰 또는 다른 관(vessels)에 위치한다. 또 다른 구체예에서, 섬광 물질은 웰에 직접적으로 박힌다. PLA2G16 폴리펩타이드가 허용 가능한 조성물 (선택적으로 칼슘 및/또는 완충액을 함유하는)로 웰에 추가된다. 기질의 가수분해는 방사선 모이어티를 방출하여, 감소된 신호를 초래한다. SPA의 논의를 위해 상기 J. Fraser Glickman를 참고하라.
몇몇 구체예에서, 분석 판독(readout)은 공명 에너지 전이(resonance energy transfer, RET), 예를 들어, 형광 공명 에너지 전이 (FRET), 발광 공명 에너지 전이 (LRET), 또는 생체발광 공명 에너지 전이 (bioluminescence resonance energy transfer, BRET)에 기초한다. 광범위한 RET-기반 분석이 시행될 수 있다. 일반적으로, 그런 분석은 두 모이어티 (때로 공여자 및 수여자로 불리는) 사이에 에너지 전이가 수반되는 거리-의존적 상호작용을 활용한다. 두 모이어티가 PLA2G16 기질의 일부로서 존재하고 위치하여 기질의 절단이 한 모이어티를 방출하게 하면, 신호 (예를 들어, 신호의 증가 또는 감소)가 검출될 수 있다. FRET은 두 전기적으로 들뜬 상태(excited states)의 모이어티 사이의 광자(photon)의 배출(emission)없는 들뜸이 공여자 모이어티로부터 수여자 모이어티로 전이된 FRET 수여자로부터의 배출을 야기하는 거리-의존적 상호작용이다. LRET은 FRET과 유사하나 발광 모이어티(luminescent moiety), 예를 들어, 란탄족(lanthanide)을 에너지-전이 공여자로서 사용한다. BRET은 FRET과 비슷하나 발광성의 또는 발광- 발생하는 루시퍼라아제(luciferase), 에쿼린(aequorin), 또는 그의 파생물과 같은 생체분자(biomolecule)를 에너지 공여자로서 및 형광 모이어티, 예를 들어, 와 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP)과 같은 생체분자를 수여자로서 사용함으로써 들뜸 빛 출처의 필요성을 선별한다 (reviewed in Ptleger, K. an Eidne, K., Nature Methods, 3(3), 165-174, 2006).
본 발명의 분석은 수여자(acceptor) 배출(emission), 공여자(donor) 퀀칭(quenching) (RET 공여자로부터의 감소된 배출), 및/또는 공여자의 형광 수명(fluorescence lifetime) 변화를 검출할 것이다. 본 발명의 분석은 PLA2G16 기질 절단 검출을 위해 수여자 배출 증가, 수여자 배출 감소, 공여자 퀀칭, 공여자 퀀칭 감소, 및/또는 공여자의 형광 수명의 증가 또는 감소를 활용할 수 있다. 또한 퀀처로도 불리는비형광 수여자는 유용하고 댑실(dabcyl) 및 QSY 염료를 포함한다. 그런 분자들은 아주 가까이 위치할 때 들뜬 형광 표지 에너지 및 보이는 빛의 방출 없이 소멸 에너지를 흡수 가능하다. 많은 허용 가능한 공여자/수여자 쌍들이 당업계에 자명하다. 예를 들어, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10th edition (Invitrogen Corp.) 핸드북을 참고하라.
FRET-기반 분석의 몇몇 구체예에서, PLA2G16 기질의 첫 번째 아실 사슬이 형광 퀀처에 부착되었고 두 번째 아실 사슬이 형광표지(flurophore)에 부착되었다. 형광표지 내지 퀀처 분자내(Intramolecular) FRET은 적어도 하나의 지방산 모이어티가 나머지 분자로부터 분리될 때, PLA2-매개 기질이 절단까지 형광을 퀀칭하고, 분자내 거리는 유효 에너지 전이를 위해 요구되는 거리를 초과한다. 형광 신호 증가는 기질 절단을 나타낸다. 억제제의 존재는 억제제가 없을 때 관찰된 신호에 비례하여 형광 신호 감소를 야기할 것이다. 몇몇 구체예에서, 상기 포스포리피드 sn-1 ?아실 사슬은 부착된 형광 퀀처 (예를 들어, p-메틸 레드로도 알려진 댑실)를 함유하며, sn-2 아실 사슬은 첨부된 BODIPY 형광 표지를 함유한다. 댑실기에 대한 분자내 FRET (fluorescence resonance energy transfer)은 PLA-매개 기질 절단까지 BODIPY 형광을 퀀칭한다(quenches). 예를 들어, Dabcyl- 및 BODIPY-함유하는 포스포리피드 DBPA, DBPC, DBPE, 및 DBPG (축약형: DB: Dabcyl-BODIPY; PG: phosphatidylglycerol)의 기재에 대한 Rose, TM ＆ Prestwich, GD, ACS Chemical Biology, 1 (2): 83-89, 2006를 참고하라.
PLA2 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 분석 포맷은 형광 기반 분석으로 양이온 결합된 고분자전해질(polyelectrolytes)이 실리카 미세구들에서 지지되는 것이다(Chemburu S, 결합된 고분자전해질이 포스포리파아제(phospholipase) A2 활성을 위한 구슬기반의 분석으로 지지된다. Phys Chem B., 1 12(46): 14492-9, 2008을 참고, 이것은 인간 혈청에서 얻어진 PLA2분석 같은 것을 말한다. 이 분석은 PLA2G16 폴리펩타이드의 활동을 억제하는 화합물 탐지에 사용하기 위해 변형될 수 있다.). 중합체로 코팅된 구슬들은 PLA2를 위한 센서 역할을 하는 ‘지질구슬(lipobeasd)’을 제공하기 위해 음이온 인지질로 코팅될 수 있다. 지질은 PLA2를 위한 기질의 역할과 외부 전자 전이 소광제 AQS (9,10-anthraquinone-2,6-disulfonic acid)에 의해 중합체 형광의 소광을 약화시키기 위한 중개자의 역할, 두 가지 역할을 한다. AQS에 의한 중합체 형광의 소광은 PLA2가 지질을 소화함에 따라 증가한다. 지질은 또한 구슬에 코팅한 음이온 인지질에서 지질로 대체되는 적은 양의 에너지 전이 소광제를 쓰는 것에 의해 기질과 소광제 그 자체로 사용된다. 이러한 사례에서 중합체의 형광은 지질층이 온전하게 존재할 때 소광되며, 효소가 지질을 소화시킴에 따라 중합체의 형광이 회복된다. PLA2 활동의 검출은 다중홈판리더(multiwell plate reader) 또는 유세포 분석기에 의해 형광 변화를 관찰함으로써 수행될 수 있다.
“세포 기반 분석”은 PLA2G16 폴리펩타이드를 표현 또는 포함하는 살아있는 세포가 테스트 화합물과 접촉되는 분석이며, PLA2G16 활동과 같은 흥미로운 파라미터가 추정되는 것이다. 전형적으로, 세포는 세포배지에서 유지되며 테스트 화합물은 배양기에 첨가된다. 몇몇 구체예에서는, PLA2G16 기질에서 행동하는 PLA2G16 폴리펩타이드의 능력에 대한 테스트 화합물의 효과가 평가된다. 예를 들어, PLA2G16 기질은(예, 탐지할 수 있도록 표지된 기질) 배지에 첨가될 수 있거나 표지된 전구체로부터 세포에 의해 합성될 수 있다. 기질 조각은 유리지방산(free fatty acid)으로부터 생산되는 후속 산물을 발견하는 것이나, 유리 지방산을 발견하는 방법으로 탐지될 수 있다. 예를 들어, 아라키돈산(arachidonic acid)은 사이클로옥시게네이즈(cyclooxygenases)에 의해 아이코사노이드(예를 들어 프로스타글란딘(prostaglandins), 류코트리엔(leukotrienes)) 형태로 변형된다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 기질에서 행동할 수 있는 다른 PLA2효소가 상당히 부족한 세포가 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 그러한 세포는 알려진 PLA2 효소의 발현을 위한 다양한 세포주 검사에 의해 발견된다. 다른 구체예에서, 세포주는 하나 이상의 PLA2 효소를 인코딩하는 유전자로 삽입되거나 결실되는 것에 의해 생성되거나, 그러한 다른 PLA2 효소의 발현을 억제하는 shRNA를 발현시키기 위한 세포유발에 의해 생성된다. 다른 구체예에서, 그들의 발현을 억제하기 위한 다른 PLA2 효소에 특이적인 siRNA와 접촉된 세포에서 분석이 수행된다.
PLA2G16 폴리펩타이드의 억제제로 규명된 화합물은 세포배양으로 검사될 수 있거나 바이러스 감염을 억제하기 위한 능력을 확인하기 위해 동물 모델로(“생체 내”) 검사될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 숙주세포들은 세포 감염에 적합한 상태에 놓인 바이러스, PLA2G16 억제제와 접촉된다. 바이러스 감염을 억제하기 위한 테스트 화합물의 능력이 평가된다. 만약 화합물에서 바이러스 감염이 감지할 수 있을 정도로 감소한다면, 화합물은 항바이러스 화합물로 규정된다. 바이러스는 예를 들어, 그 생활주기에서 PLA2G16 폴리펩타이드나 PLA2G16-유사 폴리펩타이드를 활용할 수 있는 어느 바이러스라도 가능하다.
폭넓고 다양한 세포형(cell types)이 본 발명에 따른 방법의 구체예에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 세포는 자연스럽게 혹은 인간의 손을 거쳐, 변형의 결과로 PLA2G16 폴리펩타이드를 포함하거나 발현시킨다. 비록 세포가 PLA2G16을 발현하지 않더라도 유용할 수 있다 세포는 어느 흥미로운 유기체로부터도 기원할 수 있다. 예, 척추동물, 포유동물. 몇몇 구체예에서 세포는 원숭이나 인간 세포와 같은 영장류 세포이다. 세포는 영장류 세포, 불멸의 세포, 암세포 등일 수 있다. 종종 세포는 유전적으로 상당히 동일한 세포로 구성된 세포 개체군의 개체일 수 있다. 세포주는 단세포나 단세포로부터 분리된 다세포로부터 유래한 것일 수 있다. 세포는 조직으로부터 혹은 흥미로운 기관에서 유래했을 수 있고 흥미로운 자산을 가질 수 있다. 몇몇 구체예에서 세포는 상피세포, 섬유아세포, 간세포, 레브도살코마(rhabdosarcoma), 레브도미오살코마(rhabdomyosarcoma), 폐, 기관지 세포, 전지방세포나 지방세포이다. 몇몇 구체예에서 세포는 가슴, 방광, 뼈, 뇌, 기관지, 자궁경관, 결장, 자궁내막, 식도, 후두, 간, 폐, 신경, 근육, 난소, 췌장, 전립선, 위, 신장, 피부, 고환이나 갑상선에서 기원한다. 세포주는 당업계에 다양하게 알려져 있으며, American Type Culture Collection, Coriell 세포 반응(Coriell Cell Repositories), 유럽 세포배양집, 일본 생물자원 리서치 컬렉션 또는 다양한 상업지와 같은 지식의 보고에서 알 수 있다. 몇몇 구체예에서, 전지방세포는 3T3-L1세포이다. 몇몇 구체예에서 세포는 COS-1이나 COS-7과 같은 COS 세포이다. 몇몇 구체예에서 세포는 HeLa세포이다. 몇몇 구체예에서 세포는 Vero, RD, CHO, HEK-293, HMEC, MDCK, NIH-3T3, HEp-2, A549, or BEAS-2B세포이다. 몇몇 구체예에서 세포는 종양세포이다. 몇몇 구체예에서 종양세포는 상피성 암(carcinoma)으로부터 유래했다. 몇몇 구체예에서 종양세포는 육종에서 유래했다. 몇몇 구체예에서 종양세포는 림프종, 백혈병, 골수종과 같은 악성종양에서 유래했다. 몇몇 구체예에서 종양세포는 가슴, 방광, 뼈, 뇌, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 머리와 목, 후두강, 간, 폐(소세포폐암이나 비소세포성 폐암), 난소, 췌장, 전립선, 위, 신장, 피부(기저세포, 흑색종, 편평상피세포) 고환, 갑상선암에서 유래했다. 종양세포는 NCI-60 종양세포계와 같은 주화 종양세포계의 세포일 수 있고 당업계에서 알려진 또 다른 종양 세포계 혹은 새로이 계통이 확립된 세포일 수 있다.
몇몇 구체예에서 세포는 조혈세포이다. 몇몇 구체예에서 세포는 KBM-7 세포이거나 HAP1 세포와 같이 그것의 파생세포일 수 있다. 몇몇 구체예에서 세포는 KBM-7세포이거나 최소한 하나의 “재프로그로래밍된 인자”를 발현하는 것에 의해 부분적으로 재프로그래밍되거나 최소한 하나의 “재프로그래밍 중개”세포에 노출된 것일 수 있다. 반수체에 근접한 포유동물 세포와 같은 재프로그래밍 세포는 PLA2G16 억제제나 항바이러스 항체를 구별하는데 그 능력을 활용할 수 있다. 그러한 재프로그래밍은 KBM-7 세포를 HAP1 세포와 같은 접착세포로 전환시킬 수 있다. 당업계에 알려졌듯이 쥐와 인간 섬유아세포와 여러 다른 보통의 체성 세포타입은 생체외에서 레트로바이러스 중개의 전사인사 결합의 도입을 통해 분화다능상태로 재프로그래밍될 수 있다. 예로서 4개의 전사인자 Oct4, Sox2, Klf'4, and c-Myc(비록 누락된 c-Myc이 재프로그래밍 효율을 감소시키더라도, 불필요해진 c-Myc을 말함), 또는 네 개의 전사인자 Oct4, Nanog, Sox2, and Lin28가 있다. (참조, Meissner, A., et al., Nat Biotechnol., 25(10): 1 177- 81 (2007); Yu, J., et al, Science, 318(5858): 1917-20 (2007); and Nakagawa, M., et al., Nat Biotechnol., 26(1 ): 101 -6 (2008)그러한 전사인자들은 종종 “재프로그래밍 인자”라고 불려진다.
몇몇 구체예에서 세포는 자연스럽게 PLA2G16을 발현시킨다. 몇몇 구체예에서 세포는 변형이 없는 경우가 되는 것보다 높은 수준에서 PLA2G16 폴리펩타이드를 발현시키도록 변형된다. 몇몇 구체예에서 세포는 PLA2G16을 최소 25%, 50%, 75%, 90%, 95% 또는 HAP1세포에서 존재하는 발현단계만큼 높은 약 100%에서 발현시킨다. 발현수준은, 예, “하우스키핑” 유전자의 발현에 기초하는 경우 정상화될 수 있다. 공통적으로 하우스키핑 유전자는 베타-액틴, GAPDH, 포스포글리세르 키나아제 등을 포함한다. 세포에서 일시적이거나 안정적으로 폴리펩타이드를 발현하는 표준 방법이 사용될 수 있다.
몇몇 구체예에서 당업계에서 알려진 세포는 피코르나바이러스(picornavirus)와 같은 바이러스에 의해 저절로 감염에 걸리기 쉬운 구체예다. 예를 들어, 세포는 보통 생체 내에서 바이러스의 타겟이 되는 구체예일 수 있거나 배지에서 바이러스를 위한 숙주로서 당업계에서 사용되고 있는 세포주일 수 있다. 화합물은 다른 많은 구체예의 세포에서 테스트될 수 있다. 예를 들어 화합물은 초기에 PLA2G16 억제제로 규명될 수 있고, 세포에서 바이러스 억제를 위한 테스트를 수행하거나 검사를 위한 편리한 자원을 가진 세포의 항바이러스 화합물일 수 있다. 그리고 그 이후, 흥미로운 바이러스의 자연적 타켓인 하나 이상의 세포에서 검사된다.
몇몇 구체예에서, 이 명세서에서 언급된 방법에 사용되는 세포는 유전적으로 변형되거나, 테스트 화합물에 그 사용을 가능하게 하는 자산을 갖기 위해 선택된다. 예를 들어, 세포 밖으로 테스트 화합물을 이동시킬 수 있는 하나 이상의 분자 펌프의 발현을 감소시키거나 없애기 위해 유전적으로 변형되거나 선택된다. 몇몇 구체예에서 세포는 바이러스 감염을 탐지하기 위해 변형된다. 예를 들어, 세포는 바이러스 단백질 존재 하에 활성화 되는 프로모터나 다른 세포 발현 억제인자인 리포터 유전자로 구성될 수 있다. 이들은 바이러스 단백질의 존재 하에서 발현되며 형광 단백질이나 효소와 같이 즉시 발견할 수 있는 폴리펩타이드를 인코딩하는 오픈리딩프레임(open reading frame)에 사용할 수 있게 연결된다. 또 다른 구체예에서, 세포는 바이러스 프로테아제를 위한 제한효소를 구성하는 단백질을 발현한다. 그 점에서 단백질의 분열은 탐지할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 프로테아제 제한효소를 포함하는 도메인에 의해 나눠진 FRET 한 쌍(예: FRET donor와 acceptor쌍을 가진 폴리펩타이드)을 포함 할 수 있다. 프로테아제에 의한 분해는 FRET의 붕괴 결과를 가져오도록 FRET쌍을 분리하는 결과를 가져온다. 이는 바이러스 감염 지표로서 작용하고 감지될 수 있다. 또 다른 구체예에서 바이러스 프로테아제를 위한 세포투과성 기질이 세포로 도입된다. 항바이러스 화합물의 후보자(예로 PLA2G16활성을 억제하는 화합물)가 바이러스 감염을 억제하는지 확인하기 위해서 검사될 수 있다
세포들은 테스트 화합물 및/또는 다양한 세포주기 동안의 바이러스와 접촉될 수 있다. 몇몇 구체예에서 세포들은 테스트 화합물 및/또는 1시간에서 20일 사이의 바이러스 접촉된다(예, 12시간과 48시간 사이, 48시간에서 5일 사이, 약 3일, 5일에서 19일 사이, 또는 어떤 특정 기간 등). 몇몇 구체예에서, 세포들은 최소 하나 이상의 바이러스 복제 주기 완성과 후대 바이러스의 생산을 위한 충분한 시간 동안 바이러스와 접촉한다. 몇몇 구체예에서 세포들은 광학현미경으로 탐지할 수 있는 플라크의 생산에 충분한 최소의 시간 동안 바이러스와 접촉한다. 세포들은 배양기간 일부나 전 시간 동안 테스트 화합물과 접촉될 수 있다. 몇몇 구체예에서 세포들은 테스트 화합물과 세포가 접촉하기 전에 바이러스와 접촉된다. 세포들은 바이러스와 세포가 접촉하기 전에 테스트 화합물과 접촉된다. 바이러스의 절대수 감염다중도(MOI)는 달라질 수 있다. “감염다중도”는 세포와 같은 감염 개체 대 바이러스와 같은 감염 중개자의 비율을 말한다. 몇몇 구체예에서 104와 102 사이의 MOI가 사용된다. 예를 들어0.001과 10사이의 MOI (다른 예로 0.01과 1 사이)가 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서 세포의 10%와 100%사이에서 병리학적 변화를 낳는데 적합한 바이러스의 양이 사용된다. 당업계의 기술 중 하나는 바이러스 감염의 영향을 감지할 수 있게 하기 위한 적절한 바이러스의 양을 결정할 수 있다. 바이러스의 희석화 범위는 적절한 양을 확인하기 위해 검사될 수 있다. 세포는 바이러스와 세포의 접촉 후 적절한 시간 동안 배지에서 유지된다. 전형적으로 시간주기는 바이러스가 세포로 들어가기 충분하며 바이러스 감염이 일어났음을 가리키는 최소 하나의 사건을 위해 충분할 것이다. 그러한 사건은 세포 및 또는 최소 하나의 바이러스 유전자 산물의 합성이나 부분합성에서 바이러스 유전자 산물의 확인 가능한 효과 일 수 있다. 일반적으로 시간주기는 PLA2G16 억제제의 존재 대비 PLA2G16억제제의 부재 시 세포에서의 바이러스 효과 사이의 차이를 발견하기 충분할 것이다. 세포에서 바이러스의 탐지할 수 있는 효과는 세포 RNA나 단백질의 일부나 대부분의 합성과정에서의 변형(예, 감소)을 들 수 있다. 항바이러스 반응의 귀결(예, 유전자 인코딩 2'5'-oligoadenylate synthetase 와 같은 인터페론 타겟 유전자의 귀결), 크로마틴 응축과 같은 형태학적 효과, 핵의 블레빙(blebbing), membranous vesicles의 증식; 새포 내 내용물의 누출; 세포독성; 바이러스 특이적 효소에 의한 기질의 쪼개짐(예, 프로테아제) 등이 있다. 세포독성은 예를 들어 세포 용해(이것은 소거 영역이나 세포 단분자막에서 “플라크"로 증거가 될 수 있다.) 의 검사에 의해 평가될 수 있다. 혹은 세포막 보전 분석, 세포 ATP-기초한 생존능력 검사, 미토콘드리아 환원효소 활성 분석, BrdU, EdU, or H3 -Thymidine 혼합 분석, 핵산 염료를 사용한 DNA 내용 분석, AlamarBlue, MTT, XTT, 및 CellTitre Glo와 같은 세포 대사 분석, Hoechst Dye, DAPI, Actinomycin D, 7-aminoactinomycin D 또는 propidium iodide와 같은 분석 등, 증식이나 세포 생존능력을 위한 다양한 분석을 사용하기도 한다. 플라크 분석은 바이러스 적정농도와 바이러스 감염에서 화합물의 효과를 탐지하기 위해 인정받는 수단이다. 몇몇 구체예에서 플라크 분석은 홈판의 홈에서 자라는 다수의 동일 세포배양에서 표준 바이러스 수를 주입하는 것을 수반한다. 아가로오스와 같은 고화제는 배지를 통해 바이러스에 최소 양으로 첨가될 수 있다. 바이러스 적정농도는 보통 미리 결정되고 플라크 각각의 셀 수 있는 숫자를 산출하기 위해 선택된다. 서로 다른 농도의 테스트 화합물이 일련의 웰들에 도입된다. 농도가 다른 테스트 화합물가 일련의 홈에 도입된다. 복합체의 효과는 50%의 저지농도로 표현될 수 있다(IC50), 가장 낮은 농도의 화합물은 화합물이 포함되지 않은 대조군 홈에 비하여 바이러스 플라크의 수가 50% 감소하는 결과를 가져온다. 원한다면, 비슷한 방법의 IC90이 가능하다. 바이러스의 효과가 현저히 감소된 화합물은 바이러스에 의한 감염의 억제제이다. 예를 들어, 주어진 양의 바이러스에 의해 발생한 바이러스 플라크의 사이즈 및/또는 숫자가 현저히 감소된 화합물은 바이러스 감염의 억제제다. 선택적으로 IC50나 IC90이 결정된다. 몇몇 구체예에서, 원하는 IC50나 IC90과 하나 이상의 화합물이 선택된다. 몇몇 구체예에서 IC50및/또는 IC90이 100 mg/ml(예, 10 mg/ml, 1.0 mg/ml, 100 μg/ml, 10 μg/ml, 5 μg/ml)보다 많아선 안 된다. 몇몇 구체예에서, 100 μΜ와 동등하거나 보다 적은 IC50 및/또는 IC90, 10 μΜ와 동등하거나 보다 적은 IC50 및/또는 IC90의 양을 정한다. 몇몇 구체예에서 IC50 및/또는 IC90은 나노 분자의 영역에서 1 μΜ이거나 1 μΜ보다 적게 넣는다.
몇몇 구체예에서, 고속 대량 스크리닝(HTS)이 수행된다. HTS는 무세포나 세포기반 분석에 활용할 수 있다. HTS는 종종 고효율로(예, 동시에) 많은 양의 화합물을 검사하는 것과 관련된다. 예를 들어, 수십, 수백, 수천의 화합물은 일반적으로 짧은 시간 동안 검사된다.(몇 시간에서 몇 일). 종종 그러한 검사는 복합 홈판에서 수행된다(96, 384, 1536, 3456개 이상의 홈, 때로 마이크로 웰 또는 마이크로티터 판, 또는 접시라 한다.) 또는 다른 물리적으로 분리된 다수의 홈이 있는 관에서 수행된다. 그러한 관은 기질에 존재한다. 고속 대량 스크리닝은 자동화에 사용될 수 있다. 이 밖에 시료 주입, 이미지화, 데이터 습득과 처리가 있다. 현재의 발명의 HTS의 구체예에서 적용될 수 있는 특정한 일반 원리와 기술이 어떤 방법으로든 제한 없이 Macarron R ＆ Hertzberg RP에 제시되어 있다. 고속 대량 스크리닝 분석의 디자인과 구현. Methods Mol Biol, 565: 1 -32, 2009 and/or An WF ＆ Tolliday NJ., 도입: 고속 대량 스크리닝의 세포기반 분석. Methods Mol Biol. 486: 1-12, 2009, 본보기적인 방법이 Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), William P. Janzen (2002)에 제시되고 High-Throughput Screening in Drug Discovery (Methods and Principles in Medicinal Chemistry) (2006), Jorg Hoser에 제시되어 있다. .
몇몇 구체예에서, 첫 번째 검사는 PLA2G16 폴리펩타이드를 억제하고/또는 묶어 놓는 화합물을 규명하기 위해 수행된다. 또한 바이러스 감염을 억제하는 화합물의 능력이 평가된다. 몇몇 구체예에서, 테스트 화합물은 바이러스 감염을 억제하는 화합물의 확인을 위해 세포 기반 분석에서 첫째로 테스트되며, 그들이 PLA2G16을 억제하는지 여부를 결정하기 위해 검사된다. .
발명은 독창적인 방법 중 어떤 것이든지 수행하기에 적절한 요소를 구성하는 구성요소를 제공한다. 예, 후보 항바이러스 화합물을 확인하는 어떤 방법이든지. 몇몇 구체예에서, 검사 시스템은 PLA2G16 억제제를 확인하기 위해 적절한 요소를 구성한다. 몇몇 구체예에서 구성요소들은 후보 항바이러스 화합물을 입증하는 어떤 방법이든지 수행하기 위해 적절한 요소를 이루는 구성요소이다. 몇몇 구체예에서, 구성요소들은 배양세포나 생체 내에서 바이러스 감염을 억제하는 항바이러스 화합물의 후보를 확인하기에 적절한 요소를 구성한다. 한 측면에서, 독창적인 구성요소는 (i) PLA2G16 폴리펩타이드를 발현하는 분리된 세포 (ii) 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 (iii) 테스트 화합물이다. 몇몇 구체예에서 바이러스는 병원성의 피코르나바이러스이다. 바이러스는 전형적으로 세포에 의해서 바이러스 감염을 탐지하는데 적절한 양의 구성으로 존재한다. 그러한 양은 배양된 세포가 우연히 바이러스에 의해 개별적으로 감염된 환경에 노출될 수 있는 기회보다 많이 일어날 수 있다. 몇몇 구체예에서, 세포에서 바이러스 입자(전염성의 바이러스 입자)의 비율은 최소 1 : 106, 1 : 105, 1 : 104, 1 : 103 , 1 : 102, 1 : 10, 1 : 1 이다. 몇몇 구체예에서는 세포보다 더 많은 바이러스 입자가 있다. 테스트 화합물은 앞서 논의한 어떤 화합물이라도 가능하다. 몇몇 구체예에서 테스트 화합물은 포스포리파아제A2 억제제이다(예, PLA2G16 억제제). 몇몇 구체예에서 테스트 화합물은 작은 분자이다. 몇몇 구체예에서 테스트 화합물은 최소 하나의 무세포 또는 세포기반분석에서 PLA2G16을 억제 및/또는 묶기 위해 결정되었다.
셀프리 및/또는 세포기반 분석에서 확인된 화합물은 생체 내 바이러스 감염 억제 능력을 검사하기 위해 개체(예, 인간이 아닌 척추동물)에서 검사될 수 있다. 바이러스 감염을 위한 동물모델은 당업계에 알려져 있다. 동물은 예를 들어 설치류, 비인간 영장류, 개, 고양이 등이 있다. 한 측면에서, 동물 모델은 콕사키바이러스 B3(CVB3)-유도 심근염 쥐에 의한 모델이다. 참고, Szalay G, Ongoing. 예, Szalay G, 콕사키바이러스 심근염은 심근의 이뮤노프로테오좀(immunoproteasomes)의 활성과 증가된 형성과 관련되어 있다. Am J Pathol, 168(5): 1542-52, 2006을 참고하라. 한 측면에서, 동물 모델은 EV71 감염을 위한 쥐 모델이다. Wang, Y. F., 쥐-특이적 엔테로바이러스71 변형은 이를 구강주입한 쥐에게 신경학적 질병을 유발한다. J. Virol. 78:7916-7924, 2004을 참고하라;이는 EV71이 구강으로 주입된 쥐의 동물 모델을 나타낸다. 쥐는 질병과 생존의 징후를 위해 매일 관찰될 것이다. 또 다른 구체예에서, 희석된 맹고바이러스(mengovirus )가 리노바이러스 감염을 위해 쥐 모델에 사용된다. 예, Rosenthal LA, 피코르나바이러스-유도된 기도 감염과 면역의 쥐 모델. Virol J., 6: 122, 2009을 참고하라. 조직과 체액은 바이러스 역가를 결정하기 위해 및/또한 바이러스 감염의 다른 신호를 산정하기 위해 감염 후에 수집될 수 있다. 예를 들어 바이러스 RNA나 단백질은 RT-PCR과 같은 표준 방법을 사용해 탐지될 수 있다(예, Li, Z. H., et al., Ribavirin reduces mortality in enterovirus 71-infected mice by decreasing viral replication. J. Infect. Dis. 197:854-857, 2008을 참고하라).
발명은 비인간 개체(예, 척추동물)을 더 제공한다. 어떤 점에서 비인간 개체는 바이러스를 직접 주입하거나, 정상적인 방법으로 민감하게 노출되거나, 바이러스 감염을 겪거나, PLA2G16억제제가 개체에게 주입된다. 바이러스의 “주입(inoculation)”은 바이러스가 개체의 몸에 도입되는 것을 의미한다. 노출은 개체에 주입하거나, 개체가 바이러스와 직면할 가능성을 증가시키기 위해서 상당히 가까이에서 바이러스와 개체를 놓는 것과 관련할 수 있다. 주입은 어떠한 적절한 방법으로든 가능하다. 주입이나 노출은 항바이러스 화합물의 부재상태에서 분명한 질병을 그 종의 개체군에서 최소 25%로 만들기 위해 만들기 위해 보통 충분한 바이러스 양과 관계 있을 것이다. PLA2G16 억제제는 예를 들어 독창적인 방법으로 확인된 것이나 앞서 논의한 어떤 화합물이든지 가능하다. 몇몇 구체예에서, 테스트 화합물은 작은 분자이다. 몇몇 구체예에서 테스트 화합물은 최소 하나의 무세포나 세포기반 분석에서 PLA2G16을 억제 및/또는 묶기 위해 결정되어왔다. 비인간 개체는 예를 들어, 안전, 내구성 및/또는 항바이러스 중개자로 화합물의 효능을 평가하기 위해 관찰될 수 있다. 바이러스로 감염된 개체에서 PLA2G16 억제제의 효과를 평가하는 것은 발명의 한 측면이다.
몇몇 구체예에서, 발명은 세포는 PLA2G16으로 삽입되거나 PLA2G16의 발현이 이 결핍된 반수체에 근접한 세포(near-haploid cell)를 제공한다. 예를 들면 포유동물과 같은 종의 반수체에 근접한 세포는 체세포가 보통 이배체이다. 몇몇 구체예에서, 발명은 촉매반응으로 돌연변이 PLA2G16 폴리펩타이드를 불활성화시키는 반수체에 근접한 세포를 제공한다. 반수체에 근접한 돌연변이 세포주는 거기에 내생의 PLA2G16 유전자가 삽입되어 있다. 몇몇 구체예에서 발명은 표지된 기능적 PLA2G16 폴리펩타이드를 발현하는 반수체 세포를 제공하고, 거기에 선택적으로 반수체에 근접한 돌연변이 세포는 내생의 PLA2G16 유전자가 삽입되어 있다. 본 명세서에서 사용된 반수체에 근접한 포유동물 세포란 두 개 이상의 카피에서 5개 이하의 염색체가 존재한다. 몇몇 구체예에서 반수체에 근접한 포유동물 세포는 두 개 또는 그 이상의 카피로 1, 2, 3, 4개 이하의 크로모좀을 가진다. “반수체에 근접한” 세포는 반수체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본 발명은 기능적 PLA2G16의 발현이 부족한 세포로부터 유도된 세포주, 예를 들면 PLA2G16 유전자에 삽입물이 포함된 세포주로 구성된다. 몇몇 구체예에서 세포주는 촉매반응으로 불활성화된 돌연변이 PLA2G16 폴리펩타이드를 발현한다. 이는 몇몇 구체예에서 표지된 것이다. 몇몇 구체예에서 반수체에 근접한 세포주는 결국 배양기간 동안 크로모좀을 얻는다. 따라서 더 이상 반수체에 근접한 것이 아니다. 몇몇 구체예에서 세포주는 이배체에 가깝거나 이배체가 될 수도 있다.
또한 본 발명은 발명의 구성요소를 갖는 하나 이상의 구성물 및/또는 발명의 방법을 수행하기에 적합한 구성으로 된 키트를 제공한다. 구성물은 각각 포장될 수 있다. 예를 들면, 큰 컨테이너 내에서 제공될 수 있는 개별 컨테이너가 있다. 키트는 어떠한 방법을 실행하기 위해 컨텐츠를 사용하기 위한 지시사항을 포함할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 계산적 접근법이 PLA2G16을 억제하는 화합물을 특정 및/또는 발견하기 위해 동원된다. 예를 들어 PLA2G16 폴리펩타이드의 3차원 구조가 결정될 수 있거나, 대략적인 구조는 핵자기공명, 상동 모델링(homology modeling), X-ray 결정학을 이용해 밝혀진다. 선택적으로 거기에 묶인 리간드(예, 억제제)와 폴리펩타이드의 구조가 결정된다. 몇몇 구체예에서, 계산적 접근은 후보 PLA2G16 억제제의 초기 식별에 사용된다(때때로 “가상 스크리닝”으로 쓰인다). 후보 화합물의 구조는 PLA2G16 폴리펩타이드에 결합하기 위한 능력이 있는지 검사된다. 예, 화합물에 접근할 수 있는 위치(예, "pocket")에 결합하는지. 위치는 알려진 곳이거나 잠재적 활성영역이거나 화합물에 접근할 수 있는 어떤 위치일 수 있다. 여러 가지 도킹과 약물분자구조에 기반한 알고리즘이 발달되어 왔고, 그러한 알고리즘을 이행하는 컴퓨터 프로그램을 활용 가능하다. 통상적으로 Gold, Dock, Glide, FlexX, Fred, 그리고 LigandFit(가장 최근에 개발된 것을 포함. 참고, Ghosh, S., et al., Current Opinion in Chemical Biology, 10(3): 194-2-2, 2006; Mclnnes C, Current Opinion in Chemical Biology; 1 1(5): 494-502, 2007, 이는 참고문헌으로 본 명세서에 포함된 앞서 언급한 두 가지 문헌이다. 몇몇 구체예에서 가상 스크리닝 알고리즘은 두 가지 중대한 단계를 포함한다: 찾기(도킹으로 불리기도 한다.)와 스코어링(scoring)이다. 첫 번째 단계에서 프로그램은 자동적으로 두 분자의 후보 복합체들(테스트 화합물과 목표개체 분자)을 생성하고, 후보 복합체들의 에너지 상호작용을 결정한다. 스코어링 단계는 후보 복합체에 스코어를 정하고 에너지의 최소 일부분에 기초한 좋은 상호작용을 보여주는 구조를 선택한다. 가상분석을 수행하기 위해서 이러한 과정은 여러 번 반복되는데 목표개체과 가장 좋은 상호작용을 보이는 테스트 화합물을 밝히기 위해서다. 몇몇 구체예에서, 활성영역 또는 가능한 활성영역 내에서 작은 분자의 저에너지 결합방식이 확인된다. 변화는 엄격하거나 유연한 도킹 알고리즘의 사용 및/또한 물 분자의 잠재적인 결합을 포함할 수 있다.
매우 많은 작은 분자구조가 가상분석을 위해 이용가능하며 사용될 수 있다. 예를 들어, 가상분석에 사용될 수 있는 아연은 상업적으로 무수히 이용 가능한 화합물의 구조를 포함하는 공공연한 데이터베이스이다(http://zinc.docking.org/; Shoichet, J. Chem. Inf. Model, 45(1): 177-82, 2005). 데이터베이스는 국립 암 연구소(미국) 웹사이트 ()에서 이용 가능한 약 250,000의 작은 분자구조를 포함한다. 몇몇 구체예에서 다수의 작은 분자들이 검사된다. 예를 들어, 50,000; 100,000; 250,000; 500,000 또는 100만, 200만, 500만, 1000만 이상의 분자다. 화합물은 선택적으로 스코어링될 수 있고, 목표개체에 결합하려는 그들의 가능성이 점수 매겨진다. 가상 스크리닝에서 확인된 화합물은 바이러스 감염 및/또는 PLA2G16 활성을 억제하기 위한 그들의 능력을 확인하기 위해 세포 프리나 세포기반 분석, 또는 동물 모델로 검사할 수 있다.
계산적 접근은 실제 또는 가상분석에서 규명되는 화합물에서 하나 이상의 물리화학, 약물동력학, 약물역학적 특징을 예측하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 흡수, 분배, 대사, 분비(ADME) 파라미터가 예측될 수 있다. 그러한 정보는 예를 들어, 더 많은 추가적 검사 또는 변경을 위해 선택적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, “약품-유사” 형질 전형을 갖는 작은 분자가 선택될 수 있고 및/또한 하나 이상의 의도하지 않은 형질을 갖는 작은 분자가 회피될 수 있다. 한 구체예에서, 적어도 리핀스키의 “5의 규칙(rule of five)”을 만족하는 화합물이 선택된다.
한 구체예에서, 본 발명은 PLA2G16을 억제하는 화합물을 확인하기 위해 검사 결과를 저장하는 컴퓨터 기록매체를 제공한다. 결과는 데이터베이스에 저장되고 검사 프로토콜, 검사로부터 얻어진 결과, 추가 검사로부터 얻어진 결과, 및/또는 검사를 통해 확인된 화합물에서 행한 검사로 얻은 결과를 포함할 수 있다.(예, 바이러스 감염의 동물모델 검사)
PLA2G16을 억제하는 추가적 화합물이 상기 언급한 것과 같은 실제나 가상 분석에서 확인된 초기 화합물("hits")에 기초하여 확인되거나 디자인될 수 있다. 그러한 추가적 화합물과 디자이닝 방법은 또는 그들의 합성은 발명의 한 양상이다. 몇몇 구체예에서 hit 화합물의 구조는 추가적 화합물(“파생물”)을 디자인하는데 사용될 수 있는 약물 분자 구조를 확인하기 위해 조사된다.
예를 들어 추가적 화합물은 초기 hit나 단순히 다른 구조를 가진 것과 비교해 하나 이상의 향상된 약물동력학 및/또는 약물역학 특징을 갖는다. 예를 들어 화합물은 흥미로운 분자 개체에 대한 높은 친화력을 가질 수도 있다.(예 PLA2G16), 비-목표개체 분자를 위한 낮은 친화력, 엄청난 용해도(예, 수용성 증가), 안정도 증가, 생물학적 이용도 증가, 부작용 감소 등도 있다. 최적화는 hit 구조의 실증적인 변형을 통한 달성(예, 관련된 구조로 화합물을 합성하는 것과 무세포 또는 세포기반 분석을 통한 검사, 또는 비인간 동물에서의 검사) 및/또는 계산적 접근을 사용해 달성된다. 그러한 변형은 하나 이상의 성질을 예측 가능하도록 변형하기 위한 의약화학의 확립된 원리로 사용할 수 있다.
몇몇 구체예에서, PLA2G16 억제제는 변형되거나 세포흡수, 안정성 강화(혈청에서), 반감기 증가, 독성감소, 면역원성, 그렇지 않으면 화합물에 바람직한 성질을 부여하는 일부분을 포함한다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 억제제는 단백질 형질도입 도메인(PTD)을 구성한다. PTD나 세포 투과 단백질(CPP)은 펩타이드나 펩토이드로, 비록 전부는 아닐지라도 많은 포유동물 세포의 플라즈마 멤브레인을 가로지를 수 있다. PTD는 부착 또는 존재하는 부분 일부의 흡수를 강화할 수 있다. 그러한 펩타이드는 종종 아르기닌이 풍부하다. 예를 들어, 인간면역결핍바이러스 구체예 1과2(HIV-1 and HIV-2)의 Tat 단백질의 PTD는 폭넓게 연구되고 있으며 포유동물 세포로 운반물을 운송하는데 사용된다. 참고, Fonseca SB, et al., Adv Drug Deliv Rev., 61 (1 1):953-64, 2009; Heitz F, et al., Br J Pharmacol., 157(2): 195-206, 2009을 참고하라. 몇몇 구체예에서 PTD는 작은 분자, siRNA, 앱타머, PLA2G116을 억제하는 폴리펩타이드의 세포 흡수를 강화하는데 사용된다.
몇몇 구체예에서, 화합물은 무세포나 세포기반 분석에서 농도 약 1 mM, 500 μΜ, 100 μΜ, 50 μΜ, 10 μΜ. 5 μΜ, 또는 1 μΜ 또는 보다 적은 농도로 사용됐을 때, PLA2G16 양의 감소를 일으키고, 촉매활성을 최소 50%까지 감소시킨다. 몇몇 구체예에서 화합물은 낮은 농도(예를 들어, 약 500 nM, 100 nM, 50 nM, or 10 nM 또는 보다 적은 농도)의 무세포나 세포기반 분석에서 사용되었을 때, PLA2G16 활성을 약 50%로 감소시킨다.(즉, 50% 혹은 그보다 적은 활성 감소는 화합물의 부재에서 예상될 수 있다). 몇몇 구체예에서, 화합물은 농도 0.1 ~ 10 nM 사이에서 사용될 때, 최소 50%까지 PLA2G16 활성 감소를 일으킨다. PLA2G16양이나 활성을 평가하는 다양한 방법이 위에 언급되었다. 몇몇 구체예에서 화합물은 생산감소를 일으키거나 자손바이러스의 수를 최소 50%까지 감소시키거나(즉, 화합물이 부재할 때 예상되는 자손바이러스의 수를 50%까지 감소시킨다), 약 1 mM, 500 μΜ, 100 μΜ, 50 μΜ, 10 μΜ, 5 μΜ, 또는 1 μΜ 또는 보다 적은 농도로 적합한 세포배양 시스템에서 놓여졌을 때, 세포변성효과를 적어도 50%까지 감소시킨다. 몇몇 구체예에서, 화합물은 적합한 세포 배양 시스템에 놓여졌을 때, 세포변성효과나 자손바이러스의 생산을 최소 50%까지 감소시킨다. 예로 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM 또는 보다 적은 농도에 있을 때이다. 몇몇 구체예에서, 화합물은 0.1~10 nM 농도의 적합한 세포배양시스템에 놓였을 때, 자손바이러스의 생산을 50%까지 감소시킨다. 바이러스 생산 평가나 세포변성효과 평가에 적합한 여러 방법이 위에서 언급되었다. 다른 구체예에서, 화합물은 PLA2G16 수준, 촉매 활성 및/또는 자손 바이러스의 생산 또는 세포 변성 효과를 최소 25%, 75%, 90%까지 감소시킨다.
일반적으로 PLA2G16 억제제와 이것의 사용방법은 억제제가 확인, 생산, 확인에 필요한 요소, 혹은 PLA2G16 억제제를 생성하는 것에 의해 제한되거나 그에 의존하지 않는다. 예를 들어 PLA2G16 억제제 발명의 몇몇 구체예에서 확인된 인간 PLA2G16 폴리펩타이드의 사용 및/또는 인간 세포의 사용은 인간의 치료를 위해 사용된다 몇몇 구체예에서 PLA2G16 억제제 발명은 확인된 인간 PLA2G16의 사용 및/또는 인간세포의 사용은 비인간 척추동물 같은 비인간 동물의 치료에 사용된다. 몇몇 구체예에서, 비인간 동물의 PLA2G16 및/또는 비인간 동물로부터 파생된 세포를 사용하는 PLA216 억제제는 비인간 동물 종, 및/또는 인간과 다른 종의 비인간 동물을 치료하는데 사용된다. 인간 세포를 감염시키는 바이러스의 감염을 억제하는 PLA216 억제제는 발명의 여러 측면에서 인간, 비인간 동물, 혹은 양자를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 몇몇 구체예에서, 인간 세포를 감염시키는 바이러스에 의한 감염을 억제하는 PLA216 억제제는 비인간 동물 세포 혹은 이들을 주로 감염시키는 바이러스에 의한 감염을 억제하는데 사용된다.
VII . 약학적 조성물, 치료 방법 및 다른 적용예
여기에서 언급된 방법에 따라 확인, 선택, 디자인된 화합물은 다양하게 쓰일 수 있다. 몇몇 구체예에서 화합물은 치료용 목적을 위해 유용하다. 예. 바이러스의 감염 치료에 필요한 치료제. 몇몇 구체예에서, 개체는 바이러스 개체의 초과수가 존재하거나, 유기체의 체내에 있을 때, 바이러스 개체의 존재가 유기체의 세포나 다른 조직을 손상시킬 때, 감염으로 “고통받는” 것이다. 개체는 예를 들어 (i) 일반 개체 대부분의 구성원, 및/또는 (ii) 일반적으로 그 개체가 경험하는 위험수준과 비교하여 개체가 바이러스 감염으로 고통 받거나 바이러스 감염으로 발달할 위험이 증가할 때, “치료의 필요성”이 될 수 있다.
발명은 인간과 동물 개체의 바이러스 감염에 대한 다양한 치료를 고려한다. 예로 여기에서 논의된 어느 바이러스의 감염이다. 몇몇 구체예에서, 바이러스는 피코르나바이러스(picornavirus), 카디오바이러스(cardiovirus), 에코바이러스(echovirus), 엔테로바이러스(콕시키바이러스(coxsackievirus), 리노바이러스(rhinovirus), 에코바이러스(echovirus)), 헤파토바이러스(hepatovirus), 리노바이러스(rhinovirus )다. 몇몇 구체예에서, 바이러스는 계통발생적으로 엔테로바이러스(enterovirus) 속이다. 몇몇 구체예에서 피코르나바이러스는 인간 엔테로바이러스 A, 인간 엔테로바이러스 B, 인간 엔테로바이러스 C, 인간 엔테로바이러스 D, 시미언 엔테로바이러스 A, 보빈 엔테로바이러스, 폴신 엔테로바이러스 B, 인간 리노 바이러스 A, 인간 리노바이러스 B, 인간 리노바이러스 C로 이뤄진 그룹에서 선택된 종으로 분류된다. 몇몇 구체예에서, 피코르나바이러스는 인간 엔테로바이러스 A, 인간 엔테로바이러스 B, 인간 엔테로바이러스 C, 인간 엔테로바이러스 C, 인간 리노바이러스 A, 인간 리노바이러스 B, 인간 리노바이러스 C로 이뤄진 그룹에서 선택된 종으로 분류된다. 몇몇 구체예에서 혈청형 바이러스는 ATCC (American Type Culture Collection)나 영국 보건국의 NCPV (National Collection of Pathogenic Viruses)에서 저장되며 유통이 가능하다.
본 발명은 바이러스 감염 결과인 질병 및 질병치료방법을 제공한다. 질병 예와 상태는 천식 악화, 세기관지염, 대장염, 일반 감기, 만성 폐색성 폐질환, 뇌염, 뇌척수염, 전장염, 구제역, 수족구병, 위장염, 포진성 구협염, 간염, 수막염, 수막뇌염, 심근염, 췌장염, 소아마비, 폐렴이 있다. 몇몇 구체예에서 발명은 생체 밖에서 PLA2G16억제제의 활용을 고려한다. 예를 들어, 이식(예, 장기이식이나 같은 종에서 개체간 이식)에서 사용되는 기관, 조직, 세포는 수령인에게 바이러스 감염의 전이 가능성을 감소시키기 위해 생체 외에서 PLA2G16 억제제와 접촉될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 기관, 조직, 세포 이식의 수령인은 PLA2G16 억제제로 치료될 수 있다. 예로 이식된 세포, 조직, 기관들로부터 바이러스 감염의 가능성을 감소시키기 위함이다. 그러한 치료는 이식 절차 전, 후, 또는 이식 중에 시작될 수 있다.
몇몇 구체예에서 바이러스는 효과적인 백신이 존재하지 않고, 상업적으로 사용되지 않으며 다양하게 사용되지도 않는다. 예를 들어 콕사키바이러스 B3(coxsackievirus B3)은 인간 개체에 넓게 퍼져 있으며 심근염과, 췌장염과 같은 심각한 질병을 일으킨다. 콕사키바이러스 B4(Coxsackievirus B4)는 무균성 수막염, 수막뇌염, 심근염, 간염, 췌장염, 위장염, 신생아 괴사성 장염, 폐렴을 일으킨다. 그러나, 이러한 바이러스의 임상의 중요성에도 불구하고, 상업적 이용가능성과 임상적으로 적용할 수 있는 예방 백신이 없다. 엔테로바이러스71(Enterovirus 71)은 의학적으로 상당히 중요한 바이러스이나 역시 백신이 없다.
몇몇 구체예에서, 바이러스는 상업적으로 사용 및/또는 이용 가능한 효과적인 백신이다. 비록 백신이 충분한 면역력이 없을지라도 독창적인 방법으로 제한 없이 백신 접종하지 않은 개체가나 면역성 없는 개체의 치료, 바이러스 변형으로 감염된 개체 치료에 사용될 수 있다. 기타 몇몇 구체예에서, 개체는 감쇠바이러스주(attenuated strain )와 같은 백신변종에 의해 감염된다. 몇몇 구체예에서 발명은 폴리오바이러스에 의해 감염되거나 노출된 인간의 치료 방법을 제공한다. 예로 백신접종을 하지 않았거나 비면역성 개체(면역 무방비 상태의 개체)와 같은 인간이다. 소아마비 발생 설정에 있어서, 개체는 소아마비가 퇴치되지 않은 지역으로 이동한다. 기타 몇몇 구체예에서, 발명은 구제역 바이러스의 치료의 필요성에서 구제역 발생의 설정으로 가축의 치료를 고려한다.
몇몇 구체예에서 PLA2G16 억제제(예, 짧은 기간의 발명에 따라 확인된 PLA2G16)는 바이러스 감염의 치료를 위해 하나 이상의 치료법을 가질 수 있다. 몇몇 구체예에서 PLA2G16 억제제는 체지방 과다, 체지방 과다 관련 질병, 대사 장애가 있는 개체를 위한 치료제로 유용하다. 체지방 과다는 개체가 희망하는 것보다 많은 체지방을 가진 상태가 될 수 있는 것이고 또한 의학적 판단으로 따라 질병에 기여하거나 질병의 위험을 증가시키는 체지방량을 갖는 상태가 될 수 있다. 몇몇 구체예에서 화합물은 아테롬성 동맥 경화증이나 관다발병(예, 심혈관계 또는 뇌혈관계 질환)을 치료하는데 유용하다. 몇몇 구체예에서 화합물은 비만 치료에 유용하다. (예로 체질량지수(BMI)가 30이거나 보다 많은 개체) 몇몇 구체예에서 화합물은 대사 장애를 치료하는데 유용하다. 예로는, 당뇨병(진성당뇨병이라 불리우는 타입 II 당뇨병), 당 불내성, 인슐린 저항성, 대사증후군, 렙틴 결핍, 고중성지방혈증이다.
본 발명의 치료방법은 바이러스 감염의 위험에서 혹은 이로부터 고통받는 개체(개체)를 확인하는 단계를 포함한다. 감염을 야기시키는 바이러스로 의심되는 바이러스를 확인하는 단계, 치료제 선택 또는 확인의 최소 일부로서 물질의 결합 또는 의심되는 바이러스 확인, 및/또는 감염의 성질이나 위치, 및/또는 처방, 제공, 개체에 선택된 물질을 투여하는 것을 포함한다. 발명의 몇몇 구체예에서, 방법은 바이러스의 감염(예, 피코르나 바이러스) 위험성이 있는, 혹은 그로부터 고통받을 가능성(최소 5%)이 상당한 개체를 결정하는 것을 포함한다. 개체는 “감염의 위험에 처한” 어느 다양한 환경에라도 놓일 수 있다. “위험에 처한”은 위험의 증가, 개체가 하나 이상의 환경, 상태, 그러한 개체의 기여가 없을 때의 위험 및/또한, 개체가 갖는 건강한 구성 평균의 위험성 및/또한 이전 시기에 개체가 가진 위험과 관련된다. 개체군은 전형적으로 같은 종으로 구성된 그룹개체가다. 그러한 “위험에 처한” 개체의 상태의 예는 면역 결핍(예, 유전적 면역결핍)에 제한되지 않는다; 항체 제제를 이용한 치료에 앞서 감소 또는 제거된 보통의 미생물상이 있을 수 있다; 그러한 물질로 치료하는 것은 면역계를 억제한다(예를 들어 항암 화학요법, 면역억제제); 면역계를 손상시키는 물질에 노출; 당뇨병, COPD, 낭포성 섬유증과 같은 만성 질병; 박테리아나 곰팡이 감염 이전 또는 공존; 수술이나 다른 트라우마; 유아기 또는 노년기; 직업, 사건 또는 병원성 바이러스에 노출되는 생활수준, 기타 위험 증가 시 개체를 치료하는 의료인의 기술과 판단에서 등의 어떤 상태일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 개체는 만약 개체가 최근 병원성 바이러스와 노출되었다면, 예를 들어 개체가 개인적으로 바이러스 감염을 겪는다 여겨지거나 감염자와 접촉한 적이 있으면(예를 들어 바이러스의 “배양기간” 내 또는 1, 2, 3, 4주 안에 노출된) 바이러스 감염의 위험을 증가시킬 수 있다. 한 측면에서 배양기간은 감염의 증상이 발달되는 것으로 보이는 개인 10%~90%가 바이러스에 노출된 기간을 말한다.
다양한 방법 중 어느 것이든 현재 발명에 따라 치료를 필요로 하는 개체의 확인에 이용될 수 있다. (예, 바이러스 감염을 겪거나 감염 위험에 처한 개체. 예를 들어 그러한 방법들에는 증상들, 의료기록(가능하다면), 물리적 검사, 실험실 테스트, 영상검사, 면역진단 분석, 핵산 기초 진단, 및/또는 피, 소변, 가래, 침, 콧물, 대변, 윤활액, 뇌척수액, 기관지 폐포 세척액, 고름 또는 체액, 세포, 조직의 어떤 샘플이라도 이러한 샘플들로부터 잠재적으로 원인이 되는 바이러스의 분리와 배양 등 적어도 이들 일부에 기초한 의학적 진단을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 진단은 적어도 혈청학에 기초한 부분일 수 있다.(예, 바이러스와 특별하게 반응하는 항체의 탐지). 몇몇 구체예에서, 진단은 적어도 바이러스의 분리(isolating )의 일부일 수 있고/또는 바이러스 게놈이나 개체에서 얻은 유전자 생산물일 수 있다. 몇몇 구체예에서 바이러스 게놈이나 유전자 생산물을 위해 샘플이 검사된다. 예를 들어, PCR이나 다른 핵산 증폭 방법이 바이러스의 DNA나 RNA를 증폭하는데 사용된다. 이는 잡종번식에 기초한 방법과 같은 다양한 방법으로 검사된다. 신호증폭분석은 가지사슬 DNA 분석과 하이브리드 캡처분석(hybrid capture assays)을 포함한다. 전사에 기초한 증폭과 핵산서열에 기초한 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다. 마이크로어레이(예. 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이)가 사용될 수 있다. 마이크로어레이는 고체상이나 액상시료형광분석일 수 있다(예, 루미넥스 플랫폼(Luminex platform)과 같이 마이크로스피어에 기초한 접근). 면역학적 방법(예, ELISA나 입자응집반응)은 바이러스 항원을 탐지하는데 사용될 수 있다. 예, 폴리펩타이드. 바이러스 구성에 특별히 결합한 방사성 표지화합물이 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서 바이러스는 세포배양으로 자라고 확인된다. 확인은 배양된 세포에 미치는 형태학 및/또는 특별한 핵산 및/또는 폴리펩타이드의 탐지에 기초할 수 있다. 몇몇 구체예에서 특정한 바이러스는 확인되지 않는 반면 다른 구체예에서 특정한 바이러스가 확인된다.
여기에서 언급된 방법으로 확인 또는 입증된 앞서 밝힌 화합물과 구성들은 어느 적합한 수단- 구강으로, 코로, 피하로, 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 비경구적으로, 복막 내로, 척추강 내로, 기관 내로, 눈으로, 혀 밑으로, 질로, 직장으로, 피부로, 또는 에어로졸로 흡입에 의해-으로 관리된다. 발명의 화합물은 치료받는(예, 바이러스 감염) 구체예에 의존해, 예를 들어, 침투성 방법으로 흡입, 투여되거나 관리될 수 있다. 그래서 다양한 관리 구체예 또는 방법이 이용 가능하다. 특정한 방법 선택은 치료의 효율을 위한 정량 주입, 특정 상태로 치료되는 등의 방법에 의존한다. 일반적으로, 이 발명의 방법은 어떤 투여의 방법이라도 사용해 실행될 수 있다. 이것은 의학적으로 혹은 수의학적으로 수용할 수 있는 것이며, 이는 의학적으로 용납할 수 없는 부작용(예, 의학적 또는 수의학적으로 받아들일 수 없는)을 야기하지 않고 수용할 수 있는 효율 수준을 낳는 어떤 방법을 의미한다. “비경구적인” 이란 용어는 정맥주사로, 근육 내로, 복강 내로, 피하로, 골 내로, 흉골 내 주사, 또는 투여 기술을 포함한다. 몇몇 구체예에서 투여의 방법은 비경구 또는 경구이다. 선택적으로, 방법이나 투여 위치는 최소 부분적인 바이러스 감염 부위 및/또는 감염된 조직의 위치에 기초해 선택된다. 예를 들어, 화합물은 감염된 조직근처로 전달될 수도 있다. 몇몇 구체예에서는 흡입을 이용한 투약이 사용된다. 예를 들어 호흡기 감염 개체과 관련해 비록 침투성 전달을 위해 사용된 것이라고 해도 그러한 투여는 폐까지 직접적으로 들어오게 한다. 계량의 여러 구체예에서, 클로즈 흡입기(close inhaler)가 일반적으로 흡입에 의한 투여에 사용된다. 이러한 장치 구체예는 정량 흡입기(MDI), 호흡 작동식 MDI, 분말식 흡입기(DPI), MDI와 결합한 스페이서/저장실, 기도가습(nebulizers), 이 밖에 이식형 주입기(예로, 중추 신경계의 바이러스 감염 개체에 사용된다)가 사용될 수 있다. 치료제 주입을 위한 다른 적절한 방법과 장치가 일반적 방법 중 하나로 당업계에서 사용될 것이다.
PLA2G16 억제제의 적절한 조제용 물질, 예 상당히 순수한 조제물질, 은 적절한 약학 성분을 생산하기 위해 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 매개체나 부형제 기타와 결합할 수 있다. 발명은 (i) PLA2G16 억제제와 (ii) 약학적으로 허용가능한 매개체 또는 부형제를 구성하는 물질에 투여하기 위해 약학적으로 허용가능한 물질을 다양하게 제공한다. “약학적으로 허용가능한 매개체 또는 부형자”는 매개체(이 용어는 매개체, 매체, 희석액, 용매, 운송 수단 등을 아우르는 말이다), 조성물의 활성물질의 효과나 생물학적 활성을 상당히 방해하는 부형자, 그리고 사용되거나 투여되는 농도에서 숙주에게 지나친 독성이 없는 것을 말한다. 다른 약학적으로 수용가능한 구성들은 조성물에도 존재할 수 있다. 적합한 물질과 약학적으로 활성 화합물의 조합은 당업계에 잘 알려져 있다(예, "Remington 's Pharmaceutical Sciences", E. W. Martin, 19th Ed., 1995, Mack Publishing Co.: Easton, PA, and 최신판 또는 최신버전은 Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 21st Edition. Philadelphia, PA. Lippincott Williams ＆ Wilkins, 2005을 참고하라. 여러 구체예의 약학적으로 허용가능한 물질과 약학적 조성물 준비 방법의 추가 내용은 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다.).
약학적 조성물은 의도한 투여방법과 호환되어 일반적으로 조제된다. 예를 들어, 비경구 투여를 위한 조제용 물질은 살균한 수용액, 혹은 비수용액, 부유물질, 유화액을 포함한다. 수용성 매개체는 물, 수용액 작용을 하는 알코올, 유화액 또는 부유물을 포함하며, 염과 완충용액을 포함한다. 예, 소듐 클로라이드(sodium chloride) 용액, 링거의 덱스트로오즈(Ringer's dextrose), 덱스트로오즈와 소듐 클로라이드, lactated Ringer's 용액을 포함한다. 비수용액의 예는 프로필렌 글라이콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸 올리에이트(ethyl oleate )와 같은 주사용 유기 에스테르를 든다. 고정유, 폴리에틸렌 글라이콜, 글리세린, 프로필렌 글라이콜 또는 다른 합성 용매; 보존료, 예, 벤질알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항세균제; 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌다이아민 사초산(EDTA)과 같은 킬레이트제; 아세테이트(acetate), 시트레이트(citrate) 또는 포스페이트(phosphate)와 같은 완충제, 소듐 클로라이드(sodium chloride )나 덱스트로오즈(dextrose)와 같은 장력(tonicity) 조절물질이 있다. pH 는 염산이나 수산화나트륨 같은 산과 염기로 조절될 수 있다. 그러한 비경구적 물질은 앰플, 일회용 주사기, 유리나 플라스틱으로 만든 주사액 병에 넣어둘 수 있다. 약학적 조성물과 그러한 조성물에 사용되는 화합물은 관리 기관에 의해 정립된 기준이나 척도에 부합하는 상태로 제조될 수 있다. 예를 들어 그러한 조성물과 화합물은 우수제조관리기준(GMP)에 따라 제조되고 및/또는 약학 물질에 적합한 품질관리절차에 영향 받는다.
구강 투여를 위해, 당업계에서 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 매개체를 이용해서 활성 화합물을 조제할 수 있다. 그러한 매개체는 타블렛, 알약, 드라제, 캡슐, 용액, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액, 치료용으로 구강 투여할 수 있는 것으로 조제되어 화합물 발명을 가능하게 한다. 구강제형을 위한 적절한 부형제는 예를 들어, 락토오스, 수크로오즈, 만니톨, 소르비톨과 같은 당 충전제,; 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트래거캔스, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오즈(hydroxypropylmethyl cellulose), 소듐 카복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylceilulose) 및/또는 폴리바이닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone , PVP)과 같은 셀룰로오즈 물질이 있다. 원한다면, 가교 폴리바이닐피롤리돈, 아가, 아르긴산(alginic acid) 또는 소듐 아르긴산(alginate )과 같은 염과 같은 붕해제가 첨가될 수 있다. 선택적으로 경구용 조제는 염이나 체내 산성 상태를 중화하기 위한 완충제로 제조되거나 어떤 매개체 없이 제조될 수 있다. 드라제(dragee) 중심은 적절한 코팅을 제공받는다. 이를 위해, 아라비아 검, 탈크(talc), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 카보풀 젤(carbopol gel), 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol) 및/또는 티타늄 다이옥사이드(titanium dioxide), 래커 용액(lacquer solutions), 그리고 적절한 유기 용매나 유기 혼합물을 선택적으로 함유한 농축된 당액이 사용될 수 있다. 활성화합물의 다른 조합을 특징짓거나 이를 구별하기 위해서 타블렛이나 드라제 코팅에 염료나 착색제가 첨가될 수 있다.
젤라틴으로 만든 끼워맞춤 캡슐(push fit capsule)뿐 아니라 젤라틴(gelatin)과 글리세롤(glycerol) 또는 소르비톨(sorbitol) 같은 가소제를 사용한 밀봉된 캡슐을 포함한 약학 제제는 경구용으로 사용될 수 있다. 끼워맞춤 캡슐은 락토오스와 같은 충전제, 전분과 같은 바인더, 탈크와 마그네슘 스테아르산염(magnesium stearate)과 같은 윤활제, 선택적으로 안정제를 혼합한 활성물질을 포함할 수 있다. 부드러운 캡슐에서, 활성 화합물은 용해되거나 지방유, 액체 파라핀, 액체 폴리에틸렌 글라이콜과 같은 적절한 용액에 부유되어 있을 수 있다. 게다가 안정제가 첨가될 수 있다. 또한 경구투여를 위해 조제된 미소구체가 사용될 수 있다. 그러한 미소구체는 당업계에서 잘 정의되어 왔다.
경구 투여를 위한 조제는 위장관 안정성 향상 및/또는 흡수 강화를 위한 매개체를 포함할 수 있다.
흡입제에 의한 투여에는, 적절한 추진제를 포함한 조제제나 압축 컨테이너로부터 에어로졸 스프레이의 형태인 독창적인 성분이 운반될 수 있다. 추진제의 예로 이산화 탄소 같은 가스, 플루오르화 탄소, 의료용 분무기가 있다. 액체나 건조 에어로졸(예, 건조 파우더, 거대 다공성 입자 등)이 사용될 수 있다. 지금의 발명은 또한 비강 스프레이 또는 비강투여 형식을 이용한 구성성분의 전달을 고려한다.
국소처리법으로, 약학적 조성물은 조성물의 이용에 적합하도록 약학적으로 수용할 수 있는 하나 이상의 운반체에 용해되거나 현탁된 활성 물질을 포함한 적절한 연고, 로션, 젤, 크림으로 조제될 수 있다.
눈으로의 국지적 전달을 위해, 약학적으로 허용가능한 조성물은 용액이나 등장성 용액, 식염수로 조절된 pH에서 미분화된 현탁물일 수 있다. 예, 연고나 안약에서 사용하려는 목적.
약학적 조성물은 경점막이나 경피형 전달을 위해 조제될 수 있다. 경점막이나 경피용 투여로는, 장벽에 투과되기 적당한 투과제가 조제과정에서 사용된다. 그러한 투과제는 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 독창적인 약학적 조성물은 좌약(예, 코코아 버터와 다른 글리세리드와 같은 평범한 좌약에 근거함) 이나 직장으로의 전달을 위한 체류 관장제로 조제될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 약학적 조성물은 방출조절제, 임플란트, 마이크로캡슐화된 전달 체계 등과 같은 몸에서의 급속한 제거에 대항하여 활성 매개체를 보호하기 위한 하나 이상의 매개체를 포함한다. 화합물은 입자로 캡슐에 넣어지거나 포함된다. 예, 마이크로입자 또는 나노입자. 생분해성의, 생체에서 거부반응을 일으키지 않는 고분자는 에틸렌 비닐 아세테이트(ethylene vinyl acetate), 폴리엔하이드라이드(polyanhydrides), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), PLGA, 콜라겐, 폴리올소에스테르(polyorthoesters), 폴리에테르(polyethers) 그리고 폴리락트산(polylactic acid)이 있다. 그러한 조제 준비 방법은 당업계에 연구된 것으로 명백할 것이다. 예를 들어, 그리고 제한 없이, siRNA의 전달을 위한 많은 입자 기반 전달 체계가 당업계에 알려져 있다. 발명은 그러한 물질들의 사용을 고려한다. 리포좀(liposome)이나 다른 지질 기반 입자가 약학적으로 수용가능한 전달체로 사용될 수 있다.
몇몇 구체예에서 본 발명은 약학적으로 허용가능한 PLA2G16억제제의 파생물을 제공한다. 예, 여기서 언급되거나 확인되거나 독창적인 방법으로 입증된 PLA2G16억제제. 현재 발명에 따라, 부분적인 화합물의 약학적으로 허용가능한 파생물은 약학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 에스테르의 염 또는 어떤 다른 부가체 또는 파생물(직접적 혹은 간접적으로 화합물을 제공할 수 있는 그들의 필요에서 개체에 투여됨)을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 그래서 약학적으로 수용할 수 있는 파생물은 염, 전구약물 및/또는 대사 활성제를 포함할 수 있다. “약학적으로 수용할 수 있는 염”은 의학적 판단의 긍정적인 범위 내에서 그러한 염이 지나친 독성, 염증, 알러지 반응 없이 인간 조직 및/또는 하등동물과 접촉해 사용하는데 적합한지, 적정한 이익/위험 비율과 비례하는지를 말한다. 약학적으로 허용가능한 염은 당업계에 폭넓고 다양하게 알려져 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 적절한 무기, 유기 산염기로부터 파생된 것을 포함하며 이에 제한되지 않는다. PLA2G16 억제제의 약학적으로 허용가능한 파생물은 일반적으로 동일한 목적으로 사용되기 위해 제조된다.
개체으로 투여될 때, 본 발명의 약학적 조성물은 투여 받기 위한 그들의 상태 또는 질병 치료를 위한 효율적인 양으로 일정 시간 동안 적절히 투여된다. 예로는 바이러스 감염이 있다. 치료의 효능과 활성매개체의 독성은 세포배양이나 동물실험에서 표준 약학 절차에 의해 평가 될 수 있다. 세포배양 분석과 동물 연구로 얻어진 데이터는 인간이나 다른 개체에 사용되기 적절한 양의 범위를 조제하는데 사용될 수 있다. 인간에 투여하기 위한 각기 다른 양들은 당업계에서 알려진 임상실험으로 더 검사된다. 그러한 양은 내성 최대량과 최저량으로 사용될 것이다. 약학적 조성물에서 활성 매개체의 치료상으로 효과적인 양은 약0.001에서 100 mg/kg 중량, 약 0.01에서 25 mg/kg중량, 약 0.1에서 20mg/kg중량, 약 1에서 1.0mg/kg 중량의 범위 내에 있을 수 있다. 다른 투약 예는 약 1에서 500mg/kg, 약 100에서 5mg/kg이 있다. 몇몇 구체예에서는 일회량이 투여되는 반면 다른 구체예에서는 다량이 투여된다. 그러한 당업계에서의 그러한 일반적인 기술은 어떤 일부 환경에서의 적절한 투여량이 사용된 중개자의 효능에 의존한다는 것에 감사할 것이며, 선택적으로는 일부 잔재물에 맞춰지게 될 수 있다. 개체를 위한 특정한 양의 기준은 사용된 특정 중개자, 심각한 질병이나 장애, 나이, 체중, 개체의 일반적 건강상태 등을 포함한 다양한 요인에 의존될 수 있다.
투여가 편한 단위제형과 균등한 양으로 약학적 조성물(특히 경구 또는 비경구 조성물)을 조제하는 것은 바람직할 수 있다. 여기에서 사용된 용어인 단위제형은 개체 치료를 위해 단위 복용량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 말한다; 미리 결정한 활성 중개자의 양을 포함하는 각각의 단위는 약학적으로 허용가능한 적절한 매개체와 관련해 원하는 치료 효과를 생산하기 위해 계산된다. 발명은 PLA2G16의 미리 정한 양을 포함한 약학적으로 수용할 수 있는 단위제형을 제공한다. 그러한 양은 바이러스 감염 치료의 필요성이 있는 개체의 치료에 적절하다.
최적의 투약방식은 장시간에 걸쳐 복수의 단위제형의 투여를 포함하는 것으로 이해된다. 몇몇 구체예에서, 개체는 1~7일에 걸쳐 치료된다. 몇몇 구체예에서 개체는 7-14일에 걸쳐 치료된다. 몇몇 구체예에서 개체는 14~28일 동안 치료된다. 다른 구체예에서, 다른 구체예에서는 약 4에서 10주에 걸쳐 치료에 더 오랜 기간이 걸린다. 몇몇 구체예에서 개체는 최소 한가지 증상이 있을 때까지나, 바이러스 감염이 감소되기 시작하거나, 감염의 극심함이 상당히 감소되거나 또는 개체가 바이러스 감염의 위험이 더 이상 없을 때까지 치료된다. 몇몇 구체예에서, 치료는 무기한 계속될 수 있다. 예, 예방을 위한 목적. 예를 들어, 바이러스 감염의 재발 위험에 있는 개체가나 바이러스 감염을 피하기를 원하는 개체는 그러한 위험이 존재하거나 개체가 바이러스 감염을 피하길 원하는 어떤 기간 동안이라도 치료될 수 있다. 개체는 치료기간 동안 매일, 하루 걸러서 또는 빈번하지 않을 정도로 하나 이상의 양을 받을 수 있다.
몇몇 구체예에서, 두 개 이상의 다른 PLA2G16 억제제가 부여된다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16 억제제는 바이러스 감염 치료에 유용한 두 번째 화합물과 결합하게 된다. 복합치료법과 관련해 “여기에 사용된 조합에서”의 문구는 첫 번째와 두 번째 화합물의 투여에 관한 것을 의미한다. 이는 (i) 두 번째 화합물의 불활성형으로 대사된 가장 최근에 투여된 첫 번째 중개자의 양의 90%이상이 되기 전에 투여되거나 일회분이 몸에서 분비된다. 또는 (ii) 첫 번째와 두 번째 화합물의 정량이 각각 48시간 안에 투여된다. 또는 (iii) 매개체는 중복되는 기간 동안 투여된다(예, 지속적이거나 간헐적인 주입에 의함) 또는 (iv) 앞서 언급한 어느 조합이든지 가능하다. 그러나 그럴 필요 없이 화합물은 단위 구성 요소로 함께 투여될 수 있다. 몇몇 구체예에서 그들은 상당히 동시에(이는 서로 간에 10분 이내를 의미한다) 각각 투여될 수 있다. 몇몇 구체예에서 그들은 서로 짧은 시간 내(3시간 내를 의미하며 때때로 한 시간 이내를 의미한다.)에 각각 투여된다. 그러나 그럴 필요 없이 화합물은 동일 투여 방법으로 투여될 수 있다. 두 번째 화합물과 결합하여 투여될 때, 두 번째 화합물의 부재에서 첫 번째 화합물이 특정한 생물학적 반응을 끌어내기 위해 필요한 효과적인 양보다 많거나 적을 수 있다. (또는 반대), 그렇게 함으로써 만약 다른 쪽의 부재에서 투여된 한가지 화합물의 필요한 양과 관련해 둘 중 하나 또는 양자의 매개체의 복용량 조절이 허용된다. 예를 들어, 발명의 화합물이 결합되어 투여될 때(에, PLA2G16 억제제와 두 번째 항바이러스 화합물), 양자의 후보 치료량은 바이러스 감염의 치료의 필요가 있는 개체의 치료에 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서 두 개의 화합물이 조합으로 사용된다. 몇몇 구체예에서 두 번째 항바이러스 화합물이 원하는 치료 결과를 생산하기 위한 후보 치료량으로 투여될 수 있다. 여기서 사용된 “후보 치료량”은 만약 다른 화합물의 부재에서 투여된 개체의 치료 결과를 위해 기대되는 양보다 적은 양을 말한다. 예, 권장량보다 적은 양. 복합적인 화합물의 효과는 합쳐지거나 시너지 효과가 있을 수 있으나 그럴 필요까지 있는 것은 아니다. 하나 이상의 화합물은 여러 번 투여될 수 있다.
몇몇 구체예에서 항바이러스 매개체는 특정 바이러스(예, 피코르나바이러스)에 감염된 개체를 치료하는데 유용한 당업계에 잘 알려진 것으로 PLA2G16 억제제와 결합한 두번째 화합물로 사용된다. 몇몇 구체예에서, 바이러스를 억제하거나 무력화하기 위한 항체가 사용된다. 몇몇 구체예에서, 바이러스 퓨전을 억제하는 화합물이 사용된다. 몇몇 구체예에서 프로테아제 억제제나 키나아제 억제제가 사용된다. 몇몇 구체예에서 RNAi 매개체가 사용된다(예, siRNA, 바이러스 유전자를 목표개체으로 한 것). 몇몇 구체예에서 캡시드 결합 매개체가 사용된다. 몇몇 구체예에서 두 번째 화합물은 예를 들어, 루프린트리버(ruprintrivir), 플레코나릴(pleconaril), 피리다지닐 옥심 에터(pyridazinyl oxime ether), 또는 알비돌(arbidol)이다. 예, Barnard DL., 안티-피코르나바이러스 치료의 현위치. Curr Pharm Des. l2(11): 1379-90, 2006; DePalma, AM, et al, Medicinal Research Reviews, 28(6): 823 - 884, 2008을 참고하라.
몇몇 구체예에서 치료에 유용하게 충분히 활성화되지 않은 화합물은 PLA2G16 억제제와 결합하여 투여될 때 치료에 유용하게 된다. 몇몇 구체예에서는 PLA2G16 억제제와 결합하여 투여될 때 그러한 화합물의 저용량이 사용될 수 있다.
몇몇 구체예에서 발명은 PLA2G16 억제제를 구성하는 조성물과 바이러스 감염을 억제하는 데 유용한 두 번째 화합물을 제공한다. 몇몇 구체예에서 두 개(혹은 그 이상)의 매개체를 구성하는 단위체형이 제공된다.
현재의 발명은 약학적으로 허용가능한 PLA2G16 억제제와 선택적으로 하나 이상의 또 다른 약학적으로 허용가능한 구성요소를 포함하는 하나 이상의 컨테이너(예제, 유리병, 앰플, 병)를 구성하는 약학적인 포장이나 키트를 제공한다. 선택적으로 그러한 컨테이너와 관련된 약품의 사용이나 판매는 제조를 규제하는 정부기관에서 정해진 형태로 공지될 수 있다. 이러한 공지는 인사 행정직에 의한 판매 또는 사용, 제조의 대행자에 의한 승인을 반영한다. 공지는 예를 들어 양, 방법 및/또는 관리방법, 승인된 지시(예, 바이러스 감염에 대한 약학적 조성물이 치료를 위해 승인되었는지), 활성 메커니즘, 의사 및/또는 환자에게 사용되는 다른 정보를 말한다. 다른 조성물은 고체(예, 감압 동결 건조)나 액체 형태로 공급될 수 있다. 각각의 조성물은 일반적으로 농축된 형태로 제공되거나 각각의 컨테이너에 부분 표본 되는 것이 적합할 수 있다. 키트는 또한 감압 동결 건조의 복원을 위한 매개체를 포함한다. 키트의 개별 컨테이너는 상업적 판매를 위해 중금고에서 유지되는 것이 좋다.
짧은 기간 동안의 발명에 따라 억제된 바이러스는 세포형, 기관 또는 관심 있는 기관계를 감염시킬 수 있다. 예를 들어 몇몇 구체예에서는 위장관에 바이러스 감염 세포가 있다. 몇몇 구체예에서 바이러스는 간을 감염시킨다. 예, 간세포. 몇몇 구체예에서 바이러스는 기관계를 감염시킨다, 예, 상부 및/또는 하부 기도 세포. 몇몇 구체예에서 바이러스는 근육 세포를 감염시킨다. 예, 심근 세포. 몇몇 구체예에서 바이러스는 신경계를 감염시킨다(예, 뉴런). 몇몇 구체예에서 바이러스는 중추 신경계를 감염시킨다. 몇몇 구체예에서 바이러스는 피부세포를 감염시킨다. (예, 각질형성세포(keratinocytes)). 몇몇 구체예에서 바이러스는 점막세포를 감염시킨다. 몇몇 구체예에서 바이러스는 면역계 세포를 감염시킨다. 예, 림프구나 대식세포. 몇몇 구체예에서, 바이러스 감염은 세포형, 기관, 또는 흥미로운 기관계를 손상시키는 것과 관련 있다. 그러한 손상은 바이러스에 의한 세포감염 및/또는 면역 매개성 메커니즘에 기인해 일어난다.
몇몇 구체예에서, 화합물은 연구용으로 유용하다. 예, 일반 생리학적 과정이나 병리학 과정에서 PLA2G16의 역할에 대한 추가 연구. 예를 들어 화합물은 대사 및/또는 바이러스 감염에서 PLA2G16의 역할을 더 연구하는데 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 발명은 비인간 다세포 생물을 생성하는 방법을 제공한다. 예, 바이러스 감염에 저항을 증가시키는 비인간 동물(예, 비인간 척추동물), 예, 피코르나바이러스(picornavirus )에 의해. 어떤 측면에서 비인간 다세포 생물은 평범한, 동종의 비형질전환 생물과 비교해 내생 PLA2G16 활성을 감소시킨다. 몇몇 구체예에서, 유기체는 주입을 목표로 하거나, 최소 일부의 PLA2G16 유전자의 제거를 목표로 하는 형질전환 비인간 척추동물이다. 그래서 동물은 기능적 PLA2G16의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서 형질전환 비인간 동물은 RNAi 매개체를 발현한다. 예, shRNA, 이는 PLA2G16 발현을 감소시킨다. 몇몇 구체예에서 유기체는 설치류가 아니다. 몇몇 구체예에서 유기체는 쥐가 아니다. 몇몇 구체예에서 척추동물은 상업적으로 중요한 동물이다. 예를 들어, 유기체는 최소 한 국가의 국민총생산(GNP)의 최소 1만 달러에 기여할 수 있고 또는 주(state) 간의 또는 국제통상의 개체가다. 상업적으로 중요한 동물 예는 소, 말, 양, 염소, 돼지, 닭, 칠면조, 물고기가 있다. 몇몇 구체예에서 동물은 가축이다. 예, 경작용 동물, 예, 소, 돼지, 양, 염소나 말 같은 가축. 몇몇 구체예에서 바이러스 저항 동물은 가축이 아닌 종이다. 선택적으로 종들은 위험에 처하게 된다. 이 방법은 바이러스 감염에 저항하는 개체를 확인하는데 사용될 수 있고, 야생에서나 사육될 때의 생존 가능성을 향상시킨다. 바이러스에 대한 동물 저항은 동물과 인간 숙주 양자를 감염시킬 수 있는 바이러스의 확산을 감소시킬 수 있다. 변형이나 제거가 예, 상동재조합, 유전자 가위(zinc finger nuclease) 매개한 재조합, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)-매개 유전자 변형 등을 통해 일어날 수 있다. 형질전환 생물은 그러한 유기체의 생산을 위해 당업계에서 알려진 표준방법을 사용해 생성될 수 있다. 예를 들어, 체세포 핵 이식(SCNT)이 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 발명은 비인간 다세포 생물 (예, 비인간 척추동물, 기능적 PLA2G16이 부재하거나 감소된 비인간 동물)을 확인하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 유기체는 설치류가 아니다. 몇몇 구체예에서 유기체는 쥐가 아니다. 몇몇 구체예에서, 유기체는 PLA2G16의 발현이 감소된다. 몇몇 구체예에서 유기체는 기능적으로 불활성인 PLA2G16의 변종이나 절편을 발현한다. 예를 들어, 유기체는 활성에 필요한 최소 몇몇 잔기의 틀 이동 돌연변이나 결실 또는 변형을 갖는다. 유기체는 예로, 유전자형 검사(예, 감소되거나 변형된 PLA2G16의 결과로 돌연변이나 동질이상 갖는 동물 확인을 위해) 및/또는 조직에서 발현 또는 활성수준의 검사를 사용해 확인될 수 있다. 몇몇 구체예에서는, 변이다형 예, 당업계에서 알려진 단일 염기 변이다형(SNPs)이 실험된다. 예를 들어, 동물 유전체에서 게놈 프로젝트와 다른 서열 연구가 SNPs로 행해지고 있다. PLA2G16 유전자나 그 근처에 위치한 SNP는 예, 기능적 PLA2G16이 감소되거나 부재하는 등의 그러한 변형된 것과 관련해 검사될 수 있다. 그러한 SNPs를 가진 동물이 확인될 수 있다. 몇몇 구체예에서, PLA2G16의 감소나 부재는 바이러스에 의해 감염의 개체가 되는 적어도 몇몇 조직들 및/또는 세포에서 일어난다. 몇몇 구체예에서, 감소되거나 부재하는 PLA2G16은 거의 대부분의 조직이나 모든 조직에서 일어난다. 원하는 특성을 가진(예, 감소되거나 부재하는 PLA2G16) 유기체가 선택될 수 있다. 특히 낮은 PLA2G16 발현 및/또는 활성을 가진 동물을 생산하기 위해 표준번식기술이 사용될 수 있다. 예를 들어 가축 사육에서 표준 방법이 사용될 수 있다. 전통적인 사육 제도 및/또는 표시선택법이 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 돌연변이나 다형성은 저절로 일어나는 변형이다. 즉, 인간에 의해 생성되지 않는다. 몇몇 구체예에서 돌연변이는 예로, 방사선과 화학적 돌연변이 생성을 사용해 인간에 의해 생성된다. 그래서 발명은 비 유전적으로 변형된 비인간 유기체를 생산하는 방법을 제공한다. 예, 기능적 PLA2G16이 감소되거나 없는 비인간 동물. 몇몇 구체예에서 기능적 PLA2G16이 감소되거나 없는 유기체를 확인하거나 선택하는 방법이 있다. 몇몇 구체예에서 비인간 유기체는 까다로운 사육 기술을 사용해 생산된다. 발명은 그러한 유기체와 그것을 사용하는 방법을 더 제공한다.
몇몇 구체예에서 방법은 농업 및/또는 축산업에서 기능적 PLA2G16이 감소되거나 부재하는 유기체를 제공하거나 이를 사용하는 것으로 구성된다. 유기체는 유전적으로 변형된 유기체나 비 유전적으로 변형된 유기체일 수 있다. 유기체는 바이러스의 감염가능성을 줄일 수도 있고 또한 감염의 극심함을 감소시킬 수 있다. 예를 들어 몇몇 구체예에서 동물은 구제역 바이러스에 의한 감염 가능성 감소 및/또는 감염의 극심함이 감소된다. 몇몇 구체예에서 동물은 소나 돼지 엔테로바이러스에 의한 감염가능성이 감소되고 또는 감염의 극심함이 감소된다. 몇몇 구체예에서 발명은 (a) 기능적 PLA2G16이 감소되거나 부재하는 동물의 제공; (b) 동물을 이용해 축산업에 종사하는 것으로 구성된 방법을 제공한다. 축산업은 축산물(우유, 계란, 양모와 같은)을 거두기 위한 것이나 고기를 얻기 위한 동물의 번식과 사육을 포함하는 것뿐만 아니라 동료애 및/또는 직업을 위해 종을 돌보고 사육시키는 것을 포함한다. 농업은 음식 및/또는 농사를 이용한 상품의 생산을 말한다.
당업자는 본 발명이 그 안에 내재하는 것처럼 목적을 수행하기 위해 및 언급한 결말 및 이점을 얻기 위해 잘 적용됨을 쉽게 안다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예는 일부 구체예을 대표하고, 예시하나, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다. 그 안의 변형 및 다른 이용이 당업계에서 발생할 것이다. 이러한 변형은 본 발명의 정신 안에 포함된다. 다른 대체 및 변형이 본 발명의 범위 및 정신에 벗어남 없이 본 발명에 기재된 발명에 포함됨이 당업계의 당업자에게 명백할 것이다.
본 명세서 및 청구항에 사용된 정관사 “a” 및 “an”은 반대로 나타내지 않는 한, 복수 개체(plural referents)을 포함한 것으로 이해되어야 한다. 만일 하나, 하나 이상의, 또는 모든 “또는”을 포함하는 청구항 또는 설명은, 그룹 일원이 존재하고, 사용되고, 또는 그렇지 않으면 주어진 산물 또는 과정에 관련되면, 반대를 나타내거나 문맥으로부터 눈에 띄지 않는 한 납득되는 것으로 고려된다. 본 발명은 정확히 그룹의 하나의 일원이 존재하고, 사용되고, 또는 주어진 산물 또는 과정이 관련된 구체예을 포함한다. 또한, 본 발명은 그룹 일원이 존재하고, 사용되며, 또는 주어진 산물 또는 과정에 관련된 하나 이상의, 또는 모든 구체예을 포함한다. 또한 본 발명은 하나 이상, 또는 모든 그룹 일원이 존재하고, 사용되며, 또는 주어진 산물 또는 과정이 관련된 구체예을 포함한다. 또한, 모순 또는 불일치가 생기는 것이 명시되지 않는 한 또는 당업계의 당업자에 있어서 명백하지 않은 한, 본 발명이 하나 또는 그 이상의 나열된 청구항으로부터 하나 또는 그 이상의 제한사항(limitations), 요소, 조항(clauses), 묘사 용어들, 등이 같은 기본 청구항 (또는, 관련된, 다른 청구항)에 따라 또 다른 청구항에 도입되는 변화, 조합, 및 치환(permutations)을 제공하는 것이 이해된다. 본 발명에 기재된 모든 구체예이 본 발명의 적절한 곳에서 모든 다른 측면에 적용 가능한 것이 고려된다. 또한, 구체예 또는 측면이 적절하면 하나 또는 그 이상의 다른 구체예 또는 측면과 자유롭게 조합되는 것이 고려된다. 요소들이, 예를 들어, Markush 그룹에서와 같은 목록으로 또는 유사한 형태로 존재하며, 각각의 요소의 서브그룹이 또한 포함되고, 어떤 요소(들)이 그룹으로부터 제거될 수 있음이 이해된다. 일반적으로, 본 발명, 또는 본 발명의 측면에서, 특정 요소, 특성, 등을 포함하는 것으로 불리는 본 발명의 어떤 구체예 또는 측면이 그런 요소, 특성, 등으로 구성되거나 필수적으로 구성됨이 이해되어야 한다. 단순한 목적을 위해, 상기 구체예은 본 발명의 많은 단어로 명확하게 제시된 모든 경우를 가지지 않는다. 또한, 본 발명의 어떤 구체예 또는 측면이 특정 배제가 명세서에서 재인용되는 것을 막론하고 명백하게 청구항에서 제외될 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 어느 하나 또는 그 이상의 바이러스 속들, 바이러스 종들, 바이러스들, 분석들, 화합물들, 질병들, 개체들, 또는 그의 조합들이 제외될 수 있다.
조성물, 예를 들어, 화합물과 관련된 실시예 또는 설명에서, 모순 또는 불일치가 생기는 것이 명시되지 않는 한 또는 당업계의 당업자에 있어서 명백하지 않은 한, 본 발명에 기재된 방법에 따른 조성물의 제조 또는 이용 방법, 및 본 발명에 기재된 어떤 목적을 위해 사용하는 조성물의 이용 방법이 본 발명의 측면인 것이 이해된다. 방법, 예를 들어, 화합물 동정 방법과 관련된 청구항 또는 설명에서, 본 발명에 기재된 화합물의 이용 방법 또는 상기 화합물을 포함하는 조성물을 만드는 것이 모순 또는 불일치가 생기는 것이 명시되지 않는 한 또는 당업계의 당업자에 있어서 명백하지 않은 한, 본 발명의 측면임이 이해된다.
본 발명에 주어진 범위에서, 본 발명은 종점(endpoints)이 포함된 구체예, 두 종점이 포함된, 및 한 종점이 포함된 및 다른 종점은 제외된 구체예을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한 두 종점이 포함되는 것이 추정되어야 한다. 또한, 명시되지 않는 한 또는 당업계의 당업자에 있어서 명백하지 않은 한, 범위를 나타내는 값들이 본 발명의 다른 구체예에서 고정된 범위 내의 특정한 값 또는 부분 범위가 문맥상 명백하게 구술하지 않는 한 범위의 하한 단위의 열배인 것으로 추정할 수 있음이 이해된다. 또한, 본 발명에서 정해진 일련의 수치에서, 본 발명이 일련의 어떤 두 값에서 정의한 값 또는 범위 사이에 유사하게 관련된 구체예 및 가장 낮은 값이 최소로 취해질 수 있는 것 및 가장 큰 값이 최대로 취해질 수 있는 것을 포함하는 것이 이해된다. 본 발명에서 사용된 수치는 퍼센트로 표현된 값을 포함한다. “약” 또는 “거의”로 기술되는 본 발명의 어떤 구체예의 수치에 대해, 본 발명은 정확한 값이 재인용된 구체예을 포함한다. 수치가 “약” 또는 “거의”로 기술된 본 발명의 어떤 구체예에 대해, 본 발명은 값이 “약” 또는 “거의”로 기술된 구체예을 포함한다. “거의” 또는 “약”은 별도로 언급이 없거나 문맥에 드러나지 않는 한 일반적으로 1%의 범위에 들어가는 수 또는 몇몇 구체예에서 어느 방향으로든 (더 크거나 더 적은 수) 5%의 범위의 수 또는 몇몇 구체예에서 10%의 범위의 수를 포함한다 (가능 값의 100%를 허용 불가능하게 초과하는 수는 제외하고). 명확하게 반대로 나타내지 않는 한, 본 발명에서 청구된 방법이 하나 이상의 작용, 작용 방법의 순서는 반드시 재인용된 작용 방법 차례대로는 아니나, 본 발명이 그렇게 나열된 순서의 구체예을 포함하는 것이 이해되어야 한다. 또한, 나타내어지지 않는 한 또는 문맥에서 명백하지 않은 한, 본 발명에 기재된 산물 또는 조성물이 “분리된”것이 고려될 것임이 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1: KBM7 서브클론의 특성 묘사 및 레스토바이러스 감염
본 발명자들은 우선 효율적인 정방향 유전적 접근에 대해 관대할 것이라 믿어진 인간 세포의 반수체 게놈의 특성을 묘사했다. CML 세포주 KBM7의 서브클론이 거의 반수체 염색체 세트(haploid chromosome set)가 되도록 기재되었다 (Kotecki, M., Reddy, P.S., and Cochran, B.H. Isolation and characterization of a near-haploid human cell line. Exp Cell Res 252, 273-280, 1999). 우선 본 발명자들은 상기 세포주 (Dr. B.H. Cochran, Tufts University School of Medicine, Boston, Massachusetts에 의해 제공된)가 쉽게 번식되면, 바이러스 감염에 저항성을 가지는지고 효과적으로 서브클로닝될 수 있는지 검사하였다. 본 발명에서 사용된 상기 용어 “KBM7 세포주”는 BM7 세포주의 세포들의 근접-반수체 세포주 또는 서브클론(subclone) 또는 "KBM7 세포"로 불리울 수 있는 세포의 서브클론을 말한다. KBM7 세포들은 높은 서브클로닝 효율 (약 -80%)을 가졌으며, 상기 서브클론들 중 몇몇이 더 검사되었다. BM7 서브클론들은 약 24 hrs의 세대 시간으로 빠르게 증식되었으며 희박하고 매우 높은 세포 밀도로 (예를 들어, ~lxl07 cells/ml) 유지될 수 있고, 중요하게, 유세포분석(flow cytometric analysis)이 BM7 서브클론이 이배체 HCT116 결장암(colorectal carcinoma) 세포에 비해 반수체 핵형(hypodiploid karyoty)을 가지는 것을 나타냈다. 한 서브클론이24-색 FISH 분광 핵형법(spectral karyotyping)으로 더 검사되었으며 염색체 8을 제외한 모든 염색체에 대해 반수체인 것 및 BCR-ABL 전환된 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia) 특유한 필라델피아 염색체(Philadelphia chromosome) (t(9;22))를 함유하는 것을 나타냈다. 또는 PCT 공개 번호. WO 201 1/006145 및 Carette JE, et al., Haploid genetic screens in human cells identify host factors used by pathogens, Science. 2009 Nov 27;326(5957): 1231 -5를 참조하라.
실시예 2: KBM7 세포의 레트로바이러스 감염
본 발명자들은 그 다음에 KBM-7 세포들이 레트로바이러스로 감염될 수 있음을 보여주었다. 바이러스는 293T 세포 (ATCC에서 얻은)에 패키징 벡터(packaging vectors)와 함께 GFP 발현 레트로바이러스 벡터의 형질감염(transfection)에 의해 생산되었다. 상기 레트로바이러스 벡터는 pLIB-GFP (Clontech)이나, 많은 다른 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있음이 이해되어야 할 것이다. 바이러스를 함유하는 상등액이 KBM7 세포를 감염시키기 위해 사용되었다. KBM7 세포의 레트로바이러스 감염 효율을 향상시키기 위해, 각각 다른 조건이 시험되었다. 24-웰 세포 배양 접시에서 세포가 2,000 rpm에서 상온에서 45분 동안 수행한 원심분리가 감염 효율을 원심분리 안한 것에 비해 2-배 증가시켰다. 그 다음 레트로넥틴(retronectin), 폴리브렌(polybrene) 및 프로타민 설페이트(protamine sulphate) 첨가에 의한 효과가 시험되어, 각각 25%, 33% 및 44%>의 효율을 산출하였다. 배양 배지 밀리리터 당 8 마이크로그람의 프로타민 설페이트 첨가가 바람직하다. Beckman SW28 로터(rotor)에서의 1.5 h 동안 25,000 r.p.m에서의 울트라원심분리에 의한 바이러스의 농축(concentration)은 희석하지 않은 바이러스에 비해 극적으로 감염률을 향상시켰으며, Amicon 필터에 의한 과 농도(over concentration)가 바람직하다. 결론적으로, KBM-7 세포들은 프로타민 설페이트의 존재하에 스핀-감염(spin-infection)에 농축된 바이러스가 사용되었을 때 최적으로 감염되었다. 이런 서브클론들이 GFP 발현 레트로바이러스 또는 VSV-G 슈도타입인 렌티바이러스로 효과적으로 (-70-90%) 감염될 수 있으며 높은 GFP 발현 정도로 여러 달 동안 유지된다.
실시예 3: 퓨로마이신 및 GFP 선별 마커를 함유하는 벡터를 함유하는유전자 트랩 벡터 제조
불활성화된 LTR을 함유하는 레트로바이러스 유전자 트랩 벡터, 아데노바이러스 혈청형 40의 장섬유 유전자(long fiber gene)에서 유래된 강력한 스플라이스-수용 위치(splice-acceptor site) (Carette et al. 2005 The Journal of Gene Medicine 7(8) 1053-1062), 및 SV40 폴리아데닐화 신호가 뒤따르는 GFP 또는 퓨로마이신 저항성 유전자 (PURO) 중 하나가 하기와 같이 제조되었다. PURO 또는 GFP를 암호화하는 서열이 부분적인 스플라이스 수용 위치뿐만 아니라 Clal 및 Nhel 제한 자리 돌출부를 함유하는 프라이머와 함께 PCR 증폭에 의해 얻어졌다 : (GFP : 5 ' -GATCGCTAGCCGC ATTTCTTTTTTCC AGATGGTGAGC AAGGGCGAGG-3 ' 및 5'-GATCGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC -3' PURO: 5'-GATCGCTAGCCGC ATTTCTTTTTTCC AGATGACCGAGTACAAGCCCAC-3' 및 5'-GATCGGATCCTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTC-3 '). 상기 PCR 산물들은 EGFP를 대체하는 pEGFPCl (Clontech)로 도입되었다. 순차적인 PCR이 스플라이스 수용 신호의 5’ 말단 뿐만 아니라 Clal 및 BamHI 돌출부 자리를 함유하는 프라이머들을 이용하여 컴플릿(complete) 스플라이스 수용 위치를 도입하기 위해 및 폴리아데닐화 신호가 뒤따르는 GFP 아니면 PURO를 얻기 위해 수행되었다 (GFP: 5'- GATC ATCGATCGCAGGCGCAATCTTCGC ATTTCTTTTTTCC AG ATGG-3' 및 5'-GATCGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3' PURO: 5'-GATCATCGATCGCAGGCGCAATCTTCGCATTTCTTTTTTCCAGATGAC-3' 및 5'-GATCGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3'). 상기 PCR 산물은 polIII 프로모터를 대체하는 pRETRO-SUPER (Brummelkamp et al. 2002 Cancer Cell. 2(3):243-7)로 도입되었다. 그 결과 생긴 플라스미드는 pGT-GFP 및 pGT-PURO로 명명되었다. 모든 세 리딩 프레임에 GFP 또는 퓨로마이신 수용체 유전자를 함유하는 유전자 트랩 컨스트럭트가 만들어졌다.
상기 바이러스 벡터들은 프로모터 없는 리포터 및 폴리아테닐화 신호의 상류(upstream) 바로 옆에 아데노 바이러스 스플라이스 수용 위치(adenoviral splice acceptor site)를 함유하여 활성 유전자의 인트론(intron)으로의 벡터 도입이 원래 자리(native locus)를 불활성화시키고, 유전자의 프로모터 유래 전사체가 상류 엑손(exon)(들)이 GFP 또는 PURO 유전자로 스플라이싱된 융합 전사체를 초래한다. GFP 유전자를 암호화하는 유전자가 리포터 유전자의 역할을 하는 유전자 트랩 벡터에 대해 도 1 B의 도식에서 보여진 바와 같이, 전사가 도입된 polyA 위치에서 종료하기 때문에, 융합 전사 결과물은 잘리고 기능없는 세포 단백질 및 GFP 아니면 PURO를 암호화한다.
실시예 4: 돌연변이 세포 라이브러리 생성
거의 모든 유전자에서 낙-아웃 형질(knock-out alleles)을 갖는 세포 라이브러리를 만들기 위해, 근접-반수체(near-haploid) KBM7-세포들이 실시예 3에 기재된 바와 같이 만들어진 유전자 트랩으로 감염되었다. 유전자 트랩 바이러스는 T175 디쉬에서 pGT-GFP 아니면 pGT-PURO가 조합된 레트로바이러스 패키징 플라스미드로 293T 세포가 감염되어 만들어졌다. 상기 바이러스-함유 상등액이 울트라원심분리를 이용하여 1.5 h 동안 25,000 r.p.m.으로 Beckman SW28 로터에서 농축되었다. 돌연변이 KBM7 세포의 배치(Batches)는 대개 웰 당 1.5 백만 세포들을 함유하는 하나의 24-웰 조직 배양 디쉬의 실시예 2에 기재된 방법을 사용한 감염에 의해 만들어진다. 퓨로마이신 저항성 유전자를 함유하는 유전자 트랩으로 감염된 세포들이 감염 2일 후에 밀리리터 당 500ng의 퓨로마이신을 이용해 선별되었다. 한계 희석(limiting dilution)에 의한 선별 후에, 세포들은 추가적인 조사(screens)를 위해 확장되고 정착되었다. 조사를 위해 사용된 세포들은 감염시킨 GFP 유전자 트랩이 활동적으로 발현된 유전자에 대해 편향 도입된 유전자 트랩을 무효화시키기 위해 선별되지 않거나, GFP-발현하는 세포들에 대한 FACS 분류를 이용하여 선별되었다. 몇몇 경우에서, 추가적인 GFP 발현 기반 분류(stratification)가 GFP 수준이 다른 세포 배치를 얻기 위해 수행되었다. 비교적 긴 반감기(half-life)를 갖는 유전자 산물을 암호화하는 유전자의 동정 가능성을 증가시키기 위해, 유전자 트랩 감염 6일째에 또는 후에 조사가 수행되었으며, 그렇게 함으로써 유전자 산물이 세포 증식 동안 희석되도록 하였다.
실시예 5: 반수체 유전자( haploid genetics )에 유용한 새로운 세포 타입의 제작
본 발명자들은 예를 들어, OCT4, SOX2, KLF4 및 c-Myc와 같은 전분화능-유도(pluripotency-inducing) 전사 인자를 도입하여 분화된 세포 상태의 재프로그래밍 하도록 최근에 만들어진, 체세포 재프로그래밍(somatic cell reprogramming) 방법을 이용하여 반수체 유전자에 적합한 추가 세포 타입을 만들었다 (Zaehres, H? and Scholer, H.R. (2007). Induction of pluripotency: from mouse to human. Cell 131 , 834-835). 레트로바이러스 감염에 의한 상기 네 전사 인자의 KBM-7 세포로의 도입 (Takahashi, K., et al., Cell, 131 (5):861 -72, 2007에 기재된 바와 같이)은 부착 세포 클론의 형성을 초래했다. 이런 클론들의 일부 또는 대부분은 조혈세포 표면 마커인 CD43 및 CD45를 잃는다. 이런 세포들의 대다수가 유도만능하지 않다. 서브클론이 분리되고 “HAP1”로 명명되었다. HAP1 세포는 10% FCS를 함유하는 배지에서 배양될 수 있었고 트립신(trypsin)을 이용하여 확장되었다. 상기 세포들은 유도만능하지 않고 상기 세포의 대다수가 염색체 8을 포함하는 염색체 각각의 단일 카피를 가졌다.
인플루엔자(influenza) 바이러스와 상반되게, KBM7 세포들은 폴리오바이러스로 생산적으로 감염될 수 없다(도 1B, 왼쪽 패널). 그러나, HAP1 세포들은 폴리오바이러스 감염에 매우 민감하였으며 몇일 내로 방대한 세포 사멸을 겪었다 (도 1B, 오른쪽 위 및 오른쪽 아래 패널 비교). 그 수, 새로운 HAP1 세포들이 본 발명의 유전자 트랩 레트로바이러스 컨스트럭트로 감염되었고 폴리오바이러스에 노출되었다. 두 저항 콜로니가 확장되었고 인테그레이션(integrations)이 맵핑되었다(mapped). 두 돌연변이는 따라서, 그들의 저항성을 설명하는 폴리오바이러스 진입 수용체(poliovirus entry receptor), PVR,에서 알려진 독립적인 인테그레이션을 함유하였다. 이러한 결과는 폴리오바이러스 감염에 필수적인 인자들이 KBM7 세포 유래한, HAPl 세포와 같은 재프로그래밍된, 비-조혈 세포주에서 반수체 유전자 조사를 통해 발견될 수 있음을 나타냈다.
실시예 6: 폴리오바이러스에 대한 숙주인자로서의 PLA2G16의동정
폴리오바이러스에 대한 새로운 숙주 인자를 동정하기 위해, 더 큰 조사가 HAPl 세포를 이용하여 행해졌다 (도 1C). 실시예 4에 기재된 바와 같이 레트로바이러스가 제조되었고 돌연변이 HAPl 세포 라이브러리가 제작되었다. 일억 개의 돌연변이된 반수체 HAPl 세포들이 폴리오바이러스와 접촉되었고 저항성 콜로니들이 자라도록 하였다. 유전자 트랩 도입 위치(gene trap insertion sites)를 동정하기 위해, 역 PCR(inverse PCR) 방법이 대량 병렬 시퀀싱 기술(massively parallel sequencing techniques) 이용을 위해 적용되었다. 그렇게 하기 위해서, 유전체 DNA가 유전자 트랩 벡터로 감염된 3천만 개의 세포로부터 분리되었다. 둘은 NlaⅢ를 이용하고 둘은 MseⅠ를 이용하여, 네 제한효소 반응이 각 시료 별로 수행되었다. 그 뒤에, 잘린 DNA가 컬럼-정제 (Qiagen) 되었으며 1 DNA 마이크로그램이 T4 DNA 라이게이즈 (NEB)를 이용하여 상온에서 하룻밤 동안 300 마이크로리터 부피로 라이게이션되었다. 또 다른 컬럼 정제 라운드 후에, DNA가 외향 프라이머들(outward facing primer)과 함께 역 PCR의 주형으로 사용되었다. 올리고뉴클레오티드가 대량 병렬 시퀀싱 기술 플랫폼(platform)인, "일루미나 게놈 분석기(Illumina Genome Analyzer)"와 함께 이용하기 위해 필요한 어답터 서열(adaptor sequences)을 함유하도록 설계되었다. NlaⅢ로 절단된 주형에 대해 사용된 올리고뉴클레오티드는: 5 ' - AATGATACGGCGACC ACCGAG ATCTGATGGTTCTCTAGCTTGCC-3 ' 5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGACCCAGGTTAAGATCAAGGTC-3 ' 이다. MseⅠ로 절단된 주형에 대해 사용된 올리고뉴클레오티드는: 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTGATGGTTCTCTAGCTTGCC-3 ' 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGACGTTCTGTGTTGTCTCTGTCTG -3'이다. 네 PCR 반응이 수행되었고 분석을 위해 제조자의 프로토콜에 따라 일루미나 게놈 분석기에서 사용되고 인간 게놈에 대해 매핑되었다. 인간 게놈에서의 다른 위치에 대해 맵핑된 전형적인 -20,000개의 삽입 위치(insertions sites)가 상기 분석으로부터 얻어졌다. 유전자 트랩 삽입에 의해 많아진 게놈 위치(genomic loci)의 동정이 가능하게 하기 위해서 “삽입 밀도(insertion density)”가 그래프로 도시되었다. 삽입 밀도는 1 / (뒤따른 세 삽입 위치의 거리 평균) 계산에 의해 모든 삽입에 대해 측정되었다.
도 2의 도표는 각각의 유전자 트랩 돌연변이를 x-축에 및 특정 돌연변이와 그 이웃한 돌연변이와의 거리의 역수를 y-축에 맵핑하기 위해 인간 염색체 위에서 위치를 보여준다. 돌연변이가 폴리오바이러스 수용체 (PVR)가 있는 것으로 알려진 염색체 19 및 본 발명자들이 포스포리파아제 PLA2G16를 암호화하는 유전자 지역으로 밝힌 염색체 11에서 매우 많이 발견되었다. 이 유전자는 42 개의 비의존적 유전자 트랩 삽입을 함유하였다.
실시예 7: 유전자 트랩 삽입이 PLA2G16 발현을 제거하는 것의 확인
113 아미노산의 C에서 A로의 변화 (C113A 돌연변이)는 PLA2G16를 촉매적으로 비활성화 되게 한다 (상기, Duncan). HAPl 세포에서의 FLAG 태그와 함께 또는 없이 야생형 또는 돌연변이 인간 PLA2G16 발현에 적합한 레트로바이러스 컨스트럭트가 표준 방법을 이용하여 만들어졌으며 PLA2G16 자리(locus) (PLA2G 16GT)에 유전자 트랩 삽입을 함유하는 HAPl 세포로 도입되었다. pMX 레트로바이러스 벡터가 Flag-태깅된 인간 PLA2G16 및 IRES-블라스트사이딘(Blasticidin) 선별 마커 유전자의 발현에 사용되었다. 태깅안된(non-tagged version) PLA2G16를 위해, 인간 PLA2G16 cDNA가 pBABEpuro 레트로바이러스 벡터로 클로닝되었다. PLA2G16 발현을 시험하기 위해 웨스턴 블롯이 PLA2G16에 대한 다중클론 항체를 이용하여 수행되었다 (도 3). PLA2G16가 야생형 (WT) HAPl 세포 (즉, 유전자 트랩 벡터에 노출되지 않은 HAPl 세포들)에서 검출되었다 (레인 1). 예상된 바와 같이, PLA2G16GT 세포들이 검출 가능한 PLA2G16가 부족했다 (레인 2). 레인 3-6에서 보인 바와 같이, PLA2G16가 PLA2G16를 암호화하는 컨스트럭트를 받은 PLA2G16GT 세포 (야생형 또는 C113A 돌연변이)에서 쉽게 검출되었다. 예상된 바와 같이, FLAG-태깅된 PLA2G16가 태깅안된 PLA2G16 보다 크기가 약간 더 컸다 (레인 5 및 6에 대해 레인 3 및 4를 비교하라). 본 실험은 상기 유전자 트랩이 실제로 효과적으로 PLA2G16 발현을 제거하고 상기 컨스트럭트가 HAPl PLA2G16GT 세포로 도입되었을 때 PLA2G16 발현을 회복함을 증명했다.
실시예 8: PLA2G16 결핍이 폴리오바이러스에 대한 세포 저항성을 구축하는 것의 확인
PLA2G16 발현 제거가 폴리오바이러스에 의한 감염을 억제하는 것을 확인하기 위해, 반수체 PLA2G16GT 세포가 PLA2G16 또는 촉매 불활성화 돌연변이 (C113A 변화를 함유하는)를 암호화하는 레트로바이러스로 감염되었다. PLA2G16GT는 폴리오바이러스가 없을 때 활발하게 성장한다 (도 4, 왼쪽 패널). 도 4 (왼쪽에서 두 번째 패널)에서 보여진 바와 같이, PLA2G16GT 세포들 (PLA2G16 유전자 트랩 삽입을 함유하는)은 폴리오바이러스가 있을 때도 자란다. PLA2G16GT 세포에서의 야생형 PLA2G16의 레트로바이러스 과발현에 의한 PLA2G16의 보완이 상기 세포들의 폴리오바이러스에 대한 민감도를 회복한다 (오른쪽에서 두 번째 패널). 촉매 위치 돌연변이 (C113A)가 민감도를 회복하지 못하기 때문에 PLA2G16의 촉매 활성을 요구한다.
도 6A는 유전자 트랩 돌연변이 세포의 폴리오바이러스에 대한 민감도를 그래프로 보여준다. 세포들은 나타낸 MOI로 감염되었으며 감염 삼일 후에 MTT 분석을 이용하여 생존 능력이 측정되었다. PLA2G16로의 유전자 트랩 삽입은 세포를 폴리오바이러스 감염에 민감하게 바꾸며, 민감도는 야생형 발현에 의해 회복될 수 있으나, 촉매 불활성 돌연변이 PLA2G16 세포에서는 아니다. 예상된 바와 같이, 폴리오바이러스 수용체로의 유전자 트랩 삽입은 폴리오바이러스 감염에 저항성을 가진 반수체 세포를 만든다. PLA2G16으로의 유전자 트랩 삽입은 폴리오바이러스 수용체로의 유전자 트랩 삽입한 것과 본질적으로 동일한 효과를 가진다.
실시예 9: PLA2G16 삽입은 콕사키바이러스에 저항성을 가지는 반수체 세포를 만듬
도 5는 콕사키바이러스 B1의 야생형 반수페 세포 및 기능성 PLA2G16가 결핍된 세포에서의 효과를 보여준다. 세포는 24-웰에 플레이팅되었고 웰과 단층(monolayers)은 나타낸 MOI에 콕사키바이러스 B1으로 처리되었다. 감염 실행 사일 후에, 부착된 세포들은 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 이용하여 염색되었다. 야생형 세포들은 시험된 모든 MOI에서 바이러스에 높은 민감도를 가졌다 (제일 윗 줄). 유전자 트랩 삽입으로 인한 PLA2G16 돌연변이 세포들은 높은 바이러스 농도에서 조차 본질적으로 콕사키바이러스 B1으로부터 영향을 받지 않는다 (제일 위에서 두 번째 줄). 레트로바이러스 과발현에 의한 PLA2G16의 보완은 상기 세포들의 콕사키바이러스 B1에 대한 민감도를 회복한다 (위에서 세 번째 줄). 촉매 부위 돌연변이 (C113A) 보완이 민감도를 회복시키지 않기 때문에 PLA2G16의 촉매 활성을 요구한다 (아래 줄). 따라서, PLA2G16 유전자 트랩 삽입을 함유하는 세포는 콕사키바이러스 B1에 저항성을 가지며, 민감도는 야생형 발현에 의해 회복될 수 있으나, 촉매 불활성 돌연변이 PLA2G16는 그렇지 않다.
도 6B는 유전자 트랩 돌연변이 세포의 콕사키바이러스 B1에 대한 민감도를 그래프 형태로 보여준다. 세포들은 나타낸 MOI에서 바이러스와 접촉되었고 삼일 후에 생존 능력이 MTT 분석을 이용하여 측정되었다. PLA2G16로의 유전자 트랩 삽입은 세포를 콕사키바이러스 B1에 의한 감염에 민감하게 만들고, 민감도는 야생형 발현에 의해 회복될 수 있으나, 촉매 불활성 돌연변이 PLA2G16는 그렇지 않다. 예상된 바와 같이, 폴리오바이러스 수용체로의 유전자 트랩 삽입이 콕사키바이러스 B1에 대한 민감도에 유효하게 영향을 끼치지 않는다.
실시예 10: PLA2G16 낙다운은 리노바이러스에 저항성을 증가시킴
PLA2G16의 RNAi-매개 낙다운의 리노바이러스(rhinovirus) 감염 억제 능력이 HeLa 세포에서 연구되었다. PLA2G16 발현은 PLA2G16를 표적으로 하는 두 개의 다른 siRNA를 이용하여 HeLa 세포에서 억제되었고, 인간 리노 바이러스 HRV-2 및 HRV-14에 노출 후의 세포의 생존 및 증식 능력이 검사되었다. siRNA는 Ambion siRNA 223200, 서열 5 '-CAAGAAAC AAGCGACAAAtt-3 ' 및 siRNA 21977 서열 5 '-GUACCAGGUC AACAACAAAtt-3 '이다. siRNA 또는 대조군 siRNA로 형질감염된 HeLa 세포는 이간 리노바이러스 HRV-2 및 HRV-14 감염에 매우 민감했다 (도 7, 왼쪽 두 컬럼). Hela 세포에서의 PLA2G16의 낙다운은 두 HRV-2 및 HRV-14에 대한 저항성을 유의미하게 증가시키는 결과를 낳았다 (도 7, 오른쪽 두 컬럼). PLA2G16를 표적화하는 siRNA로 형질감염된 세포들은 HRV-2 및 HRV-14로 노출된 이후에 잘 생존 및 증식이 가능했다.

Claims (71)

  1. 세포를 PLA2G16 억제제(inhibitor)와 접촉시키는 것을 포함하는 세포의 바이러스 감염을 억제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 피코르나바이러스(Picornavirus)인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 피코르나바이러스는 엔터로바이러스(enterovirus)인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 피코르나바이러스는 콕사키바이러스(coxsackievirus)인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 피코르나바이러스는 헤파토바이러스(hepatovirus)인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 피코르나바이러스는 리노바이러스(rhinovirus)인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세포는 척추동물 세포인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 억제제는 PLA2G16의 발현을 억제하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 억제제는 PLA2G16의 효소 활성을 억제하는 것인 방법.
  12. PLA2G16 억제제를 바이러스 감염 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체의 바이러스 감염 치료 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 바이러스 감염은 피코르나바이러스 감염인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 피코르나바이러스는 엔터로바이러스인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 피코르나바이러스는 콕사키바이러스인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 피코르나바이러스는 헤파토바이러스인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 피코르나바이러스는 리노바이러스인 방법.
  18. 제12항에 있어서, 상기 개체는 척추동물인 방법.
  19. 제12항에 있어서, 상기 개체는 포유동물인 방법.
  20. 제12항에 있어서, 상기 개체는 인간인 방법.
  21. 제12항에 있어서, 상기 억제제는 PLA2G16의 발현을 억제하는 것인 방법.
  22. 제12항에 있어서, 상기 억제제는 PLA2G16의 효소 활성을 억제하는 것인 방법.
  23. (a) PLA2G16 폴리펩타이드 및 테스트 화합물을 포함하는 조성물을 제공하고; (b) 상기 테스트 화합물이 PLA2G16 폴리펩타이드를 억제하면 상기 화합물을 항바이러스 화합물 후보로 동정하여, 상기 테스트 화합물이 PLA2G16 폴리펩타이드를 억제하는지 결정하는 단계;를 포함하는 항바이러스 화합물 후보 동정 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 테스트 화합물이 상기 PLA2G16 폴리펩타이드의 발현을 억제하는지를 결정하는 것을 포함하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 테스트 화합물이 상기 PLA2G16 폴리펩타이드의 효소 활성을 억제하는지를 결정하는 것을 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 효소 활성은 포스포리파아제(phospholipase) A2 활성인 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 (a) 단계의 조성물은 정제 PLA2G16을 포함하는 셀-프리 조성물이고, 그리고 상기 (b) 단계는 상기 테스트 화합물이 PLA2G16의 효소 활성을 억제하는지 결정하는 것을 포함하는 방법.
  28. 제23항에 있어서, 상기 (a) 단계의 조성물은 PLA2G16 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 포함하고, 그리고 상기 (b) 단계는 상기 테스트 화합물이 PLA2G16의 발현 또는 효소 활성을 억제하는지 결정하는 것을 포함하는 방법.
  29. 제23항에 있어서, 상기 화합물은 PLA2G16 폴리펩타이드를 억제하고, 상기 화합물은 피코르나바이러스에 의한 바이러스 감염 억제에 유용한 항바이러스 후보 화합물로 동정되는 것인 방법.
  30. 제23항에 있어서, 상기 화합물이 세포 또는 개체의 바이러스 감염을 억제하는 능력이 있는지 평가하는 것을 더 포함하는 방법.
  31. 제23항에 있어서, 세포를 상기 화합물 및 바이러스에 접촉시키는 단계를 더 포함하고, 상기 세포는 상기 화합물이 없을 때 상기 바이러스에 민감할 수 있는 것인 방법.
  32. 제23항에 있어서, 개체에 상기 화합물 투여하는 단계를 더 포함하고, 상기 개체는 상기 화합물이 없을 때 상기 바이러스 감염에 민감할 수 있는 것인 방법.
  33. 제23항에 있어서, 상기 바이러스에 감염된 세포를 상기 화합물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  34. 제23항에 있어서, 상기 화합물을 바이러스에 감염된 개체에 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  35. (a) 제23항의 방법에 따라 동정된 항바이러스 후보 화합물을 제공하고; (b) 상기 화합물이 바이러스에 의한 세포 또는 생물체의 감염을 억제하면 상기 화합물을 항바이러스 화합물로 평가하여, 상기 화합물이 바이러스에 의한 세포 또는 생물체의 감염을 억제하는지를 결정하는 단계;를 포함하는 항바이러스 화합물 후보 확인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 바이러스는 피코르나바이러스인 방법.
  37. (a) PLA2G16 억제제; (b) 바이러스 및 (c) 세포 집단(population)을 포함하는 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 바이러스는 적어도 0.01의 MOI(multiplicity of infection)를 가지는 조성물.
  39. 제37항에 있어서, 상기 바이러스는 피코르나바이러스인 조성물.
  40. 제37항에 있어서, 상기 세포는 배양세포인 조성물.
  41. 제37항에 있어서, 상기 세포는 척추동물 세포인 조성물.
  42. 제37항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인 조성물.
  43. 제37항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인 조성물.
  44. 제37항에 있어서, 상기 세포의 적어도 일부는 바이러스에 감염된 것인 조성물.
  45. 제37항에 있어서, 상기 PLA2G16 억제제는 PLA2G16에 결합하는 것인 조성물.
  46. 제37항에 있어서, 상기 PLA2G16 억제제는 PLA2G16의 발현을 억제하는 것인 조성물.
  47. 제37항에 있어서, 상기 PLA2G16 억제제는 PLA2G16의 효소 활성을 억제하는 것인 조성물.
  48. 제37항에 있어서, 상기 PLA2G16 억제제는 소분자인 조성물.
  49. 제37항에 있어서, 상기 PLA2G16 억제제는 상기 바이러스에 의한 세포의 감염을 억제하는 것을 감지할 수 있을 만큼 충분한 양으로 존재하는 것인 조성물.
  50. PLA2G16 억제제를 포함하는, 개체의 바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 PLA2G16 억제제는 PLA2G16에 결합하는 것인 조성물.
  52. 제50항에 있어서, 상기 PLA2G16 억제제는 PLA2G16의 발현을 억제하는 것인 조성물.
  53. 제50항에 있어서, 상기 PLA2G16 억제제는 PLA2G16의 효소 활성을 억제하는 것인 조성물.
  54. 제50항에 있어서, 상기 PLA2G16 억제제는 소분자인 조성물.
  55. 제50항에 있어서, 상기 바이러스 감염은 피코르나바이러스 감염인 조성물.
  56. 제50항에 있어서, 상기 개체는 척추동물인 조성물.
  57. 제50항에 있어서, 상기 개체는 포유동물인 조성물.
  58. 제50항에 있어서, 상기 개체는 인간인 조성물.
  59. PLA2G16을 암호화하는 유전자에 돌연변이를 가지는 반수체에 근접한 포유동물 세포(near-haploid mammalian cell).
  60. 제59항에 있어서, 상기 세포는 PLA2G16의 돌연변이형을 발현하는 것인 반수체에 근접한 포유동물 세포.
  61. 제60항에 있어서, 상기 세포는 PLA2G16읠 돌연변이형을 발현하고, 상기 돌연변이형은 비돌연변이형과 비교하여, 감소된 촉매 활성을 가지는 것인 반수체에 근접한 포유동물 세포.
  62. 생물체가 PLA2G16의 발현 또는 활성이 감소하였는지를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 생물체가 PLA2G16 발현 또는 활성이 감소되면 상기 생물체의 바이러스 감염 저항성이 증가하는 것인, 바이러스 감염 저항성이 증가된 비인간 다세포 생물체(non-human multicellular organism)를 동정하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 바이러스는 피코르나바이러스인 방법.
  64. 제62항에 있어서, 상기 생물체는 상업적으로 중요한 척추동물인 방법.
  65. (a) 기능성 PLA2G16이 감소되었거나 없는 다세포 생물체를 제공하고; 그리고 (b) 상기 생물체를 농업 및/또는 축산에 사용하는 것을 포함하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 생물체는 상업적으로 중요한 척추동물인 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 생물체는 유전적으로 변형된 것이 아닌 방법.
  68. 제65항에 있어서, 상기 생물체는 기능성 PLA2G16이 감소되었거나 없는 생물체와 비교하여 피코르나바이러스에 대한 감염 저항성이 증가된 것인 방법.
  69. 감소된 기능성 PLA2G16 또는 기능성 PLA2G16이 없는 동물로, 상기 동물은 바이러스 감염에 대한 저항성이 증가한 농장 동물.
  70. 제69항에 있어서, 상기 바이러스는 피코르나바이러스인 농장 동물.
  71. 제69항에 있어서, 상기 농장 동물은 소, 돼지, 양, 고트, 말, 닭 또는 칠면조인 농장 동물.
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