ES2604356T3 - Subpoblación de monocitos humanos para el tratamiento de lesiones del sistema nervioso central - Google Patents
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Abstract
Una subpoblación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) sustancialmente desprovista de células CD3+, células CD19+ y células CD56+, para su uso en el tratamiento de lesiones del sistema nervioso central (SNC).
Description
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DESCRIPCION
Subpoblacion de monocitos humanos para el tratamiento de lesiones del sistema nervioso central Campo de la invencion
La presente invencion se refiere en general a lesiones del sistema nervioso central (SNC) y, en particular, a sub- poblaciones de monocitos humanos para uso en el tratamiento de lesiones del sistema nervioso central, en particular, en el tratamiento de pacientes que padecen lesiones de la medula espinal.
Antecedentes de la invencion
Las lesiones del sistema nervioso central, incluyendo las lesiones en la medula espinal, estan entre las lesiones mas devastadoras e incapacitantes posibles. Dependiendo de la gravedad de la lesion, puede ocurrir una paralisis de diversos grados. La paraplejia y la tetraplejia suelen ser la consecuencia de una lesion grave en la medula espinal.
La incidencia anual mundial de las lesiones de la medula espinal (LME) se estima en 22 personas por millon y el numero total de sobrevivientes de LME se estima en 2,5 millones. Las LME ocurren con mayor frecuencia en personas con unos veinticinco anos que pueden anticipar una esperanza de vida casi normal, aunque con dificultades para mantener una calidad de vida aceptable. Esto genera importantes problemas personales, sociales y economicos. Aunque la esperanza de vida es muy buena, los pacientes con LME sufren de algunas desventajas importantes (en funcion del nivel y la gravedad de la lesion) que disminuyen seriamente su calidad de vida (por ejemplo, paralisis, perdida de la sensibilidad, dolor intratable, ulceras por presion, e infecciones urinarias y otras). A pesar del intenso trabajo que se ha invertido por las comunidades cientificas y clmicas durante las dos ultimas decadas, hasta ahora no existe cura o tratamiento que pueda revertir las funciones perdidas despues de la LME.
Hasta la fecha, los esfuerzos terapeuticos se centraron principalmente en la prevencion de los eventos destructivos (neuroproteccion) y menos en aumentar los sucesos de reparacion espontaneos evocados por las LME. La posterior recuperacion de la funcion requerira una combinacion de intervenciones terapeuticas eficaces de neuroproteccion y restauracion. Las anteriores consideraciones han llevado a los inventores a seguir un nuevo enfoque fisiologico que emplea el sistema de curacion espedfico del cuerpo, el sistema inmunologico, para luchar con las consecuencias del dano del sistema nervioso central (SNC) que conducen a la neuroproteccion y a la restauracion.
Se ha demostrado en el laboratorio de los inventores que los monocitos derivados de la sangre incubados con segmentos de la piel adquieren un fenotipo no inflamatorio similar a los monocitos M2 antiinflamatorios descritos en la literatura (Bomstein et al., 2003). La inyeccion de los monocitos en la medula espinal lesionada indujo una mejor recuperacion de LME en las ratas (documentos de EE.UU. 5.800.812; 6.117.424; y 6.267.955). Este enfoque fue probado en un estudio clmico en pacientes que padedan lesiones de la medula espinal severa aguda mostrando resultados alentadores (documento WO 03/044037; Knoller et al., 2005). En consecuencia, el tratamiento requiere un procedimiento quirurgico que incluye la laminectoirna para exponer la medula espinal danada y la inyeccion de las celulas de las fronteras de la zona de la lesion, lo cual era diffcil de asignar. Los inventores consideraron que el hallazgo de formas de superar la dificultad de asignar el sitio de la lesion y la exposicion de los pacientes a un procedimiento invasivo senan utiles en el tratamiento de la LME.
Una investigacion mas reciente realizada en el laboratorio de los inventores mostro que despues de una lesion de la medula espinal, a los tres o cuatro dfas, los monocitos presentes en la sangre despues de la lesion se infiltraron en forma espontanea al SNC danado, preferentemente se acumulan en los margenes de la zona de la lesion y juegan un papel fundamental en el proceso de recuperacion. Estas celulas modulan la actividad inmune en el tejido lesionado volviendose menos inflamatorias, y producen moleculas que apoyan la curacion y que, por lo tanto, son favorables para la renovacion celular y la reparacion de tejidos (Shechter et al., 2009). A pesar de su papel positivo, en lesiones graves, fue insuficiente inducir una recuperacion completa o incluso la recuperacion funcional parcial.
La infiltracion/reclutamiento de sangre periferica en el lugar de la lesion es controlada por senales provocadas desde el sitio de la lesion, lo que afecta a la barrera cerebro-LCR. La recuperacion espontanea limitada despues de una lesion del SNC se puede atribuir en parte a un inadecuado reclutamiento prematuro y espontaneo del subconjunto eficaz de los monocitos en el sitio de la lesion. En lmea con esto, los inventores han demostrado que el enriquecimiento de un grupo de monocitos de sangre periferica con celulas CD115 derivadas de la medula osea aumentaba la recuperacion funcional despues de LME en ratones (Shechter et al., 2009).
Los monocitos de la sangre son una poblacion celular heterogenea, con diferentes caractensticas y actividades. La utilizacion de los monocitos de la sangre con fines terapeuticos requiere la identificacion de las celulas con funciones daninas y las que son beneficiosas.
En los seres humanos, se propuso que la expresion de CD16 en monocitos puede distinguir entre tres subconjuntos, a saber los monocitos CD14++CD16- (clasicos), CD14++CD16++ y CD14dimCD16++ (no clasicos), pero su papel en condiciones fisiologicas y patologicas no se entiende completamente.
Compendio de la invencion
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En algunos aspectos, la presente invencion proporciona una subpoblacion de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+ y celulas CD56+, o una subpoblacion de PBMC sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+, celulas CD56+ y CD16+, para su uso en el tratamiento de lesiones del sistema nervioso central (SNC).
En otros aspectos, la presente invencion proporciona composiciones que comprenden una subpoblacion de PBMC sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+ y celulas CD56+, o una subpoblacion de PBMC que esta sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+, celulas CD56+ y CD16+, para uso en el tratamiento de una lesion del SNC.
Tambien se describen metodos para el tratamiento de una lesion del SNC que comprende administrar a un individuo en necesidad una cantidad eficaz de una subpoblacion de PBMC sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+ y celulas CD56+, o una subpoblacion de PBMC sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+, celulas CD56+ y celulas CD16+. Las celulas se inyectan preferiblemente al LCR mediante puncion lumbar o la cisterna magna.
Tambien se describen para el aislamiento de una subpoblacion de PBMC humana a partir de sangre sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+ y celulas CD56+ o de una subpoblacion de PMBC humana sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+, celulas CD56+ y celulas CD16+.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra que la inyeccion por puncion lumbar (LP) de macrofagos activados por la piel promueve la recuperacion funcional en ratas despues de una lesion de la medula espinal severa. Ratas de tipo salvaje fueron sometidas a una lesion de la medula espinal grave (LME). Despues de 8 dfas, a los animales lesionados les fue inyectado 0,5x106 o 1x106 macrofagos activados por la piel o con vetnculo en el LCR (lfquido cefalorraqmdeo) a traves de LP. Se observo una mejora significativa en la locomocion, representada por un aumento en la puntuacion de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) en el grupo de animales inyectados con la dosis mas alta de los macrofagos.
La figura 2 muestra que los monocitos inyectados intracerebroventricular (ICV) proporcionan una mejora significativa en la actividad locomotora en ratones de tipo salvaje sometidos a lesion de la medula espinal (LME). BMS, Escala raton Basso.
Las Figs. 3A-D muestran una distribucion de monocitos de sangre periferica de acuerdo con su expresion de CD14, CD16 y CD115. La figura 3A muestra una distribucion de la poblacion total de monocitos vivos como se mide por FACS (las celulas delineadas son las celulas vivas (paso vivo). SSC, dispersion lateral; FSC, dispersion frontal; la figura 3B muestra la distribucion de las celulas CD45 positivas del paso vivo total, es decir, las celulas de origen hematopoyetico (excepto las celulas eritroides, plaquetas y sus celulas precursoras). La figura 3C muestra que los monocitos (de la sub-poblacion de monocitos delineada de las celulas CD45 positivas) marcados por anticuerpos monoclonales anti-CD14 y anti-CD16 se pueden separar en tres subpoblaciones diferentes: CD14+ CD16- (80,5%), CD14+ CD16+ (4,8%) y CD14dim CD16+ (3,5%). La figura 3D muestra el nivel de expresion (en intensidad media de fluorescencia) de CD115 en diferentes subpoblaciones de monocitos.
Las Figs. 4A-E muestran la distribucion de CX3CRI y CCR2 en monocitos de sangre periferica (4A) y en las tres subpoblaciones de monocitos: CD14+ CD16+ (4B), CD14+ CD16+ (4C) y CD14dim CD16+ (4D). (4E) un grafico que muestra la distribucion en las tres subpoblaciones.
La figura 5 muestra el enriquecimiento de celulas CD14dim CD16+ por agotamiento de las celulas CCR2+. Las columnas muestran el porcentaje de cada subpoblacion de la poblacion total de monocitos. La barra de PBMC representa la distribucion de la subpoblacion de monocitos en celulas mononucleares de sangre periferica aisladas a partir de una donacion de sangre fresca separada por medio de un gradiente de Ficoll. La columna CD14 representa la distribucion de la sub-poblacion de monocitos despues de la seleccion positiva de celulas CD14 positivas mediante el uso de anticuerpos CD14 conjugados con microperlas magneticas; la barra de agotamiento de CCR2 representa la distribucion de la sub-poblacion de monocitos despues de la seleccion negativa de celulas positivas cCR2 y la seleccion positiva de celulas CD14 positivas.
La figura 6 muestra que la inyeccion ICV de los monocitos derivados de la sangre enriquecida en celulas CD14dimCD16+ celulas por agotamiento de las celulas CCR2+ no logro mejorar la recuperacion de la LME. Por otra parte, hay una tendencia de empeoramiento en el resultado funcional; la puntuacion en la Escala de Raton Basso (BMS) es menor en los animales tratados (monocitos) que en los animales de control inyectados con tampon fosfato salino (PBS).
La figura 7 muestra que la inyeccion ICV de los monocitos derivados de sangre aislados por seleccion negativa en el dfa 4 despues de la lesion mejora la recuperacion funcional en ratones. Sin embargo, los monocitos derivados de sangre aislados por seleccion positiva de celulas CD14 positivas fueron menos beneficiosos. BMS, Escala de Raton Basso.
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Las Figs. 8A-B muestran un enfoque secuencial para el aislamiento de celulas CD14++CD16-; es dedr, primero el agotamiento de los leucocitos utilizando anticuerpos CD3, CD19 y CD56 (A), seguido por el agotamiento de celulas CD16 positivas. El producto final es una poblacion que comprende celulas CD14++CD16- y menos de 0,1% de las celulas CD16+ (B).
La figura 9 muestra el efecto de la inyeccion de 0,5 x 106 monocitos de sangre activados por la piel CD14++CD16- (MQ) o PBS al LCR a traves de ICV en ratones sometidos a una lesion de la medula espinal severa controlada. Eje Y, % de animales que muestran una recuperacion funcional significativa respecto a los animales totales probados.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se basa en el hallazgo de que una subpoblacion de monocitos que se define por la ausencia, o casi la ausencia, de celulas que expresan CD3, CD19, CD56 y opcionalmente CD16, es capaz de guiarse desde el lfquido cefalorraqmdeo (LCR) al sitio de la lesion en la medula espinal, y promover allf la restauracion de tejido y la mejora de la recuperacion funcional. Los metodos de la tecnica anterior ensenan la necesidad de administrar los fagocitos mononucleares con precision a los bordes de la lesion con el fin de obtener una eficacia satisfactoria (por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.800.812).
Ademas, se ha encontrado de acuerdo con la presente invencion que el efecto beneficioso de las celulas en la curacion de la medula espinal danada se obtiene ya sea mediante la administracion de celulas activadas por la co- incubacion con un pedazo de piel o mediante la administracion de celulas de no activadas en el LCR de la medula espinal lesionada.
Una celula que expresa en su superficie un determinado marcador identificable, tal como una molecula X de un grupo de diferenciacion (CD) se denomina en este documento CD X+. Por ejemplo, una celula que expresa en su superficie una molecula CD3 se denomina en este documento CD3+. La cantidad relativa de la molecula de CD expresada en la superficie celular se conoce mediante la adicion de "+", por ejemplo, CD3++ para altas cantidades de moleculas de CD, o el termino "dim", que muestra un bajo nivel relativo de moleculas de CD. Una poblacion de celulas que comprende un tipo de celula definida por la expresion de un determinado CD, una poblacion relativamente enriquecida con estas celulas, o una poblacion que carece de tales celulas, se designa CD+, CD++ o CD", respectivamente.
Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la subpoblacion de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) esta sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+ y celulas CD56+.
En otras realizaciones, tambien han sido retiradas celulas CD16+ de la sub-poblacion de PBMC resultante en una subpoblacion de PBMC que esta ademas sustancialmente desprovista de celulas CD16+, es decir, una subpoblacion sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+, celulas CD56+ y celulas CD16+.
La expresion "celula mononuclear de sangre periferica (PBMC)" tal como se utiliza en este documento, se refiere a cualquier celula de sangre que tiene un nucleo redondo, tal como un linfocito, un monocito o un macrofago. Los metodos para aislar las PBMC de la sangre son facilmente evidentes para los expertos en la tecnica. Un ejemplo no limitativo es la extraccion de estas celulas de la sangre entera utilizando Ficoll, un polisacarido hidrofilo que separa capas de sangre, formando los monocitos y los linfocitos una capa leucocitaria bajo una capa de plasma o por leucaferesis; la preparacion de concentrados de leucocitos con el retorno de globulos rojos y plasma pobre en leucocitos al donante.
La frase "una poblacion de celulas sustancialmente desprovista de" se usa en el presente documento de manera intercambiable con la frase "casi ausencia de" y, preferiblemente, incluye una poblacion de celulas que carecen de un cierto tipo de celula, o que comprenden, alternativamente, una cantidad relativa de un determinado tipo de celula que no excede de aproximadamente 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, o 5% del numero total de celulas en dicha poblacion de celulas.
Asf, en ciertas realizaciones, la cantidad relativa de cada una de las celulas CD3+, celulas CD19+ y celulas CD56+ no es superior a aproximadamente 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, o 5% del numero total de celulas en la poblacion de PBMC. En ciertas realizaciones, la cantidad relativa de celulas CD16+ de la subpoblacion sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+, celulas CD56+ y celulas CD16+ no es superior a aproximadamente 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, o 5% del numero total de celulas.
En ciertas realizaciones, las subpoblaciones sustancialmente desprovistas de celulas CD3+, celulas CD19+ y CD56+ y opcionalmente tambien sustancialmente desprovistas de celulas CD16+, se enriquecen sustancialmente en celulas CD14+.
La frase "una poblacion de celulas enriquecidas sustancialmente en" se refiere a una poblacion de celulas que comprende una cantidad relativa de un determinado tipo de celula superior a aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% del numero total de celulas de dicha poblacion de celulas.
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En ciertas realizaciones, la subpoblacion de PBMC sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+ y celulas CD56+ comprende al menos aproximadamente 60% de celulas CD14+, y la subpoblacion sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+, celulas CD56+ y celulas CD16+ comprende al menos aproximadamente 80% de celulas CD14+. Asf, la subpoblacion sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+, celulas CD56+ y celulas CD16+ tambien se denomina en este documento como una poblacion de CD14++, CD16-.
En la presente invencion, la subpoblacion de PBMC es para uso en el tratamiento de la degeneracion neuronal provocada por la lesion del SNC.
En consecuencia, en ciertas realizaciones, la subpoblacion de PBMC de la presente invencion puede ser para uso en el tratamiento de una lesion de la medula espinal, y el tratamiento puede comprender la promocion de la restauracion del tejido de la medula espinal, la recuperacion funcional, o ambas.
En otras realizaciones, la lesion del SNC es un traumatismo, tal como un traumatismo cerrado, traumatismo penetrante, golpe o contragolpe cerebral, trauma sufrido durante una operacion de neurocirugfa u otro procedimiento, o un derrame cerebral tal como un accidente cerebrovascular hemorragico o accidente cerebrovascular isquemico.
En una realizacion diferente, la subpoblacion de PBMC humanos se afsla de PBMC autologos, es decir, se recoge la sangre de un paciente en necesidad de tratamiento de una lesion del SNC, se prepara una subpoblacion PBMC para uso de acuerdo con la presente invencion como se define en este documento mas abajo, y despues se administra de nuevo al paciente.
En otra realizacion, la subpoblacion de PBMC humanos se afsla de PBMC alogenicos, es decir, la sangre se recoge de un donante geneticamente similar, pero no identico, se prepara una subpoblacion de PBMC para uso segun la presente invencion como se define en este documento a continuacion y opcionalmente se almacena en un banco de celulas antes de ser administradas al paciente.
En ciertas realizaciones, la subpoblacion de PBMC se formula para inyeccion, preferiblemente para inyeccion en el LCR.
Tal como se utiliza en este documento, la expresion "vetnculo farmaceuticamente aceptable" se refiere a un diluyente no toxico, auxiliar de formulacion de cualquier tipo, o simplemente un medio acuoso esteril, tal como una solucion salina. Algunos ejemplos de los materiales que pueden servir como vehfculos farmaceuticamente aceptables son azucares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa, almidones tales como almidon de mafz y almidon de patata, celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa sodica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta, gelatina, talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon, aceite de cartamo, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de mafz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol, polioles tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; esteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo, agar; agentes tamponantes tales como hidroxido de magnesio e hidroxido de aluminio; acido algmico; agua sin pirogenos; solucion salina isotonica, solucion de Ringer; alcohol etflico y soluciones de tampon fosfato, asf como otras sustancias compatibles no toxicas utilizadas en formulaciones farmaceuticas.
Estos componentes adicionales inactivos, asf como las formulaciones eficaces y los procedimientos de administracion, son bien conocidos en la tecnica y se describen en libros de texto estandar, tales como Goodman y Gillman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a Ed, Gilman et al.. Eds. Pergamon Press (1990), y Remington Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990).
En otro aspecto, la presente invencion proporciona una composicion que comprende una subpoblacion de PBMC como se define en este documento anteriormente para uso en el tratamiento de la lesion del SNC. La composicion puede comprender celulas de una subpoblacion de PBMC en suspension en un vetnculo farmaceuticamente aceptable adaptado para la inyeccion, preferiblemente para la administracion en el LCR. Un ejemplo no limitante de un vetnculo farmaceuticamente aceptable es PBS o un medio de cultivo. Sin embargo, vetnculos farmaceuticamente aceptables alternativos seran facilmente evidentes para los expertos en la tecnica.
En ciertas realizaciones, la administracion de las celulas o la composicion en el LCR es a traves de una inyeccion intratecal, puncion lumbar (LP), inyeccion a traves de la cisterna magna (CM), inyeccion intracerebroventricular (ICV), o una combinacion de las mismas.
Ademas, se ha encontrado de acuerdo con la presente invencion que la subpoblacion PBMC migra con exito desde el LCR a los lfmites de una lesion en la medula espinal, mitiga la lesion y mejora la recuperacion funcional, tanto si las celulas han sido previamente activadas por co-cultivo con un pedazo de piel, es decir, son las celulas activadas por la piel como si son indiferenciadas, es decir, no manipuladas o no activadas.
Por lo tanto, en ciertas realizaciones, las celulas de la subpoblacion de PBMC de acuerdo con la presente invencion inyectadas en el LCR son celulas activadas por la piel.
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En otras realizaciones, las celulas de la subpoblacion para uso de acuerdo con las PBMC de la presente invencion inyectadas en el LCR son celulas no activadas.
La subpoblacion de PBMC para uso de acuerdo con la presente invencion, y la composicion que la comprende, se usan para el tratamiento de una lesion del SNC, tal como una lesion de la medula espinal. En particular, el tratamiento comprende la promocion de la restauracion del tejido de la medula espinal, incluyendo, por ejemplo, prevenir o inhibir la degeneracion neuronal, la promocion de la supervivencia neuronal, la regeneracion y/o el brote axonal, la neurogenesis en una medula espinal lesionada, y/o la promocion de la recuperacion funcional, tal como se mide por ejemplo por la puntuacion de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) en ratas o por la escala de raton Basso (BMS) en ratones, tal como se define en el presente documento a continuacion.
En otra realizacion, la lesion del SNC puede ser un traumatismo, como un traumatismo cerrado, traumatismo penetrante, golpe o contragolpe cerebral, trauma sufrido durante una operacion de neurocirugfa u otro procedimiento, o un derrame cerebral, tal como un accidente cerebrovascular hemorragico o accidente cerebrovascular isquemico.
Ademas se describe un metodo para el tratamiento de una lesion del SNC, particularmente una lesion de la medula espinal, que comprende administrar a un individuo en necesidad una cantidad eficaz de una subpoblacion de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) como se define en este documento.
Tal como se utiliza en este documento, los terminos "tratamiento" o "tratar" de una lesion abarcan el alivio de al menos un smtoma de la misma, una reduccion en la gravedad de la misma, o el retraso, la prevencion o inhibicion de la progresion de la misma. El tratamiento no tiene por que significar que la lesion este totalmente curada. Para ser un tratamiento eficaz, una composicion util en la presente memoria solo tiene que reducir la gravedad de una lesion, reducir la gravedad de los smtomas asociados con la misma o proporcionar una mejora a un paciente o la calidad de vida del sujeto.
Ademas se describe un metodo para el aislamiento de una subpoblacion de PMBC humanas de la sangre que esta sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+ y celulas CD56+, que comprende las etapas: (i) aislar las celulas mononucleares de la sangre; y (ii) retirar las celulas CD3+, celulas CD19+ y celulas CD56+ de las celulas mononucleares de (i) poniendo en contacto dichas celulas mononucleares con anticuerpos anti-CD3+, anticuerpos anti-CD19+ y anticuerpos anti-CD56+, cada uno de los cuales esta unido a microperlas, mediante lo cual se unen dichas celulas a dichos microperlas, y eliminando las microperlas, obteniendo de este modo una subpoblacion de celulas mononucleares de sangre periferica humana (PMBC) a partir de sangre que esta sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+ y celulas CD56+.
Tambien se describe un metodo para el aislamiento de una subpoblacion de celulas mononucleares de sangre periferica humana (PMBC) a partir de sangre que esta sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+, celulas CD56+ y celulas CD16+, que comprende las etapas de: (iii) aislar las celulas mononucleares de la sangre; y (iv) eliminar las celulas CD3+, celulas CD19+, celulas CD56+ y celulas CD16+ de las celulas mononucleares de (iii) poniendo en contacto dichas celulas mononucleares con anticuerpos anti-CD3+, anticuerpos anti-CD19+, anticuerpos anti-CD56+ y anticuerpos anti-CD16+, cada uno de los cuales esta unido a microperlas, mediante lo cual se unen dichas celulas a dichos microperlas, y eliminando las microperlas, obteniendo de ese modo una subpoblacion de PMBC humanas de la sangre que esta sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+, celulas CD56+ y CD16+.
En ciertas realizaciones, la etapa (iv), es decir, la eliminacion de celulas CD3+, celulas CD19+, celulas CD56+ y CD16+, comprende las subetapas: (v) retirar las celulas CD3+, celulas CD19+ y celulas CD56+ de las celulas mononucleares de (iii) obteniendo de esta manera una subpoblacion de PMBC humanas de sangre que esta sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+ y celulas CD56+; y (vi) retirar las celulas CD16+ de la poblacion PMBC de (v), obteniendo con ello una subpoblacion de PMBC humana de la sangre que esta sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+, celulas CD56+ y celulas CD16+.
En una realizacion, la etapa (iv) se realiza en un solo paso.
Los anticuerpos que capturan las celulas que expresan el antfgeno deseado en su superficie, tales como CD3, CD19, CD56 y/o CD16, pueden ser biotinilados y luego ligados a microperlas que comprenden avidina o estreptavidina o protemas de union a biotina equivalentes, o los anticuerpos pueden ser suministrados a las celulas cuando ya esten unidos a las microperlas. Las microperlas pueden ser magneticas o no magneticas y las celulas, cuando se unen a las microperlas, pueden ser retiradas de la solucion en la que se suspenden las celulas, por centrifugacion, si las microperlas no son magneticas, o por la exposicion al campo magnetico de un iman, si lo son.
En realizaciones preferidas, los anticuerpos estan unidos a microperlas magneticas cuando se ponen en contacto con las celulas y las celulas se separan mediante la eliminacion de las microperlas a las que las celulas se unen tirando de ellas desde la solucion con un iman.
La invencion se ilustrara ahora mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
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Ejemplos
Materiales y metodos
(i) Animales. Los animales utilizados en los experimentos, si no se indica otra cosa, fueron suministrados por Harlan Laboratories, SPF Animales de Laboratorio en Israel, criador ISO acreditado, y el Centro de Reproduccion Animal del Instituto de Ciencia de Weizmann (Rehovot, Israel). Todos los animales fueron manipulados de acuerdo a los reglamentos formulados por el Comite del Cuidado y Uso de Animales del Instituto Weizmann.
(ii) Lesion de la medula espinal. Ratas (ratas de tipo salvaje Sprague-Dawley) fueron anestesiadas (ketamina 70 mg/kg, Bedford Laboratories, OH, EE.UU., xilacina 10 mg/kg, VMP, Bioulab, Francia), laminactomizadas en T9, y contusionadas utilizando un impactador NYU (Gruner (1992). Un modelo de contusion de la lesion medular monitoreado en rata. J Neurotrauma. Summer; 9 (2): 123-6; discusion 126-8. Revision) que deja caer una barra de metal de 10 g desde una altura de 50 mm sobre la medula espinal expuesta (considerado que causa un grave dano). Las ratas fueron anestesiadas, sus medulas espinales fueron expuestas por laminectoirna a nivel de T12, y una fuerza de 200 kdyn (2 N) se coloco durante 1 s sobre la columna laminactomizada utilizando el impactador de la medula espinal Infinite Horizon (Precision Systems and Instrumentacion, Lexington, KY), un dispositivo que se ha mostrado que infringe una lesion contusiva bien calibrada de la medula espinal.
(iii) Preparacion de la piel e incubacion conjunta con monocitos. Pequenos trozos de piel (2 x 6 mm) se preparan a partir de las partes posteriores de las mismas ratas donantes a las que se les habfa sacado sangre para preparar los monocitos. El pelaje de la espalda superior se afeito y la piel se esterilizo con etanol antes de cortar. Dos piezas del tejido de la piel se colocaron con 5 x 106 celulas de la fraccion de monocitos homologa (vease arriba) en 5 ml de DCCM-1 (Biological Industries, Beit HaEmek, Israel) y se incubaron durante 16 horas a 37°C, 5% CO2. Al final de la incubacion, las piezas de piel se retiraron y las celulas se recuperaron por centrifugacion.
(V) Puntuacion BBB: el analisis del comportamiento de las ratas se realizo mediante la locomocion en campo abierto de la puntuacion de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) [Basso, D. M., Beattie, M. S. y Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J. Neurotrauma 12,1-21 (1995).] El analisis del comportamiento de los ratones se realizo utilizando la Escala de raton Basso (BMS) para la evaluacion de la funcion motora de las extremidades posteriores en campo abierto [Basso MS, LC Fisher, Anderson AJ, Jakeman LB, McTigue DM, Popovich PG. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neuro trauma. 2006 May; 23 (5): 635-59].
(vii) Analisis estadfstico: se utilizo ANOVA de medidas repetidas para la puntuacion BBB y BMS con la comparacion de seguimiento de los tratamientos para cada semana por el contrario t-test y correccion para comparaciones multiples por el metodo de Holm (p = 0,05).
Ejemplo 1: La inyeccion por puncion lumbar de macrofagos activados de la piel promueve la recuperacion funcional en ratas despues de una lesion de medula espinal severa.
Al principio, los inventores estaban buscando una manera clmicamente factible para aumentar el numero de monocitos derivados de la sangre con el fenotipo deseado en la medula espinal lesionada usando una forma mmimamente invasiva. Se examino la eficacia de la inyeccion de los monocitos derivados de la sangre activados de la piel en el lfquido cefalorraqrndeo (LCR) por puncion lumbar (PL) en la reduccion de los deficits funcionales despues de una lesion de la medula espinal en la rata.
Tabla 1: Recuperacion funcional en ratas despues de una lesion de medula espinal severa
- Tratamiento
- No. total de animales No. de animales recuperados (BBB >6) % recuperacion
- PBS
- 20 6 30%
- 0.5 x 106 MQ
- 17 3 18%
- 1 x 106 MQ
- 16 10 63%
Fueron sometidas ratas tipo salvaje Sprague-Dawley a contusion severa de la medula espinal (vease Materiales y Metodos). Despues de 8 dfas, a los animales danados les fueron inyectados en el lCr 0,5 x 106 o 1 x 10° macrofagos activados por la piel-(MQ) o con vetnculo (PBS), a traves de LP. Un efecto dependiente de la dosis se muestra en la facilitacion de la recuperacion motora, con una mejora significativa en la locomocion observada para el grupo de animales inyectados con la dosis mas alta de los macrofagos (Fig. 1, Tabla 1).
Ejemplo 2: La inyeccion de monocitos de raton derivados de medula osea no activados en el LCR promueve la recuperacion funcional en ratones despues de una lesion de medula espinal.
Ademas los inventores probaron si los monocitos derivados de medula osea no activados inyectados en el lfquido cefalorraqrndeo via intracerebro-ventnculos (ICV) se guianan al parenquima de la medula espinal lesionada. Los ratones tipo salvaje fueron sometidos a contusion de la medula espinal (vease Materiales y Metodos). Despues de 3
dfas, a los animales danados les fueron inyectados por ICV monocitos derivados de la medula osea sin diferenciar que expresaban protema aislada fluorescente verde (GFP) (0,5x106 monocitos Cx3cr1GFP/+), y se analizaron para detectar la presencia de las celulas inyectadas en el sitio de la lesion. El analisis inmunohistoqmmico del sitio de la lesion 4 dfas despues de la inyeccion revelo la presencia de celulas que expresaban GFP inyectadas en el 5 parenquima lesionado, en las proximidades de los margenes de la zona de la lesion (no mostrada [Vease la explicacion en Breve descripcion de los dibujos). Del mismo modo, los animales tratados fueron seguidos segun su actividad locomotora evaluada mediante una escala motora (BMS): el aumento del grupo de monocitos dio como resultado una recuperacion que supero los niveles de recuperacion espontanea como puede verse a partir de la mejora significativa en la locomocion en los ratones (Fig. 2).
10 Estos resultados sugieren que los monocitos derivados de medula osea no activados se pueden guiar al parenquima lesionado desde el LCR, y por lo tanto, que la barrera sangre-LCR podna ser una ruta mediante la cual los monocitos entren espontaneamente al SNC danado.
Ejemplo 3: Aislamiento de celulas mononucleares humanas que expresan un alto nivel de CX3CRI y un bajo nivel de CCR2 a partir de PBMC
15 En los seres humanos, tres poblaciones de monocitos se definen por la expresion de CD14 y CD16, a saber: CD14+CD16", CD14+CD16+ y CD14dimCD16+. Los monocitos CD14+CD16' representan del 80% al 90% de los monocitos de la sangre, y expresan altos niveles del receptor de quimioquinas CCR2 y niveles bajos del receptor de quimioquinas CX3CRI (el receptor de fractalquina). En contraste con este importante subconjunto, los monocitos CD16+ humanos expresan altos niveles de CX3CRI y bajos niveles de CCR2 (Cros et al., 2010). Segun Cros et al
20 (2010), los analisis de la expresion genica indicaron similitudes entre monocitos CD14dimCD16+ humano y Gr1dim
murino de patrullaje. Las celulas CD14dimCD16+ son monocitos “de buena fe” que participan en la vigilancia local innata de los tejidos y la patogenesis de enfermedades autoinmunes.
Esquema I
25 Con el fin de aislar a partir de celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) las celulas CD14dimCD16+ que expresan altos niveles de CX3CR1 y bajos niveles de CCR2, se ha utilizado el metodo combinado de la seleccion negativa de CCR2 (agotamiento de CCR2+) y seleccion positiva de CD14+ (CD14+), mientras que el aislamiento de CD14+ a partir de PBMC se utilizo como control, como se ilustra en el Esquema I.
3.1 Enriquecimiento de la poblacion de celulas CD14dimCD16+:
30 (i) Aislamiento de celulas mononucleares de sangre periferica humana: Sangre fresca (8 ml) recogida de donantes
sanos se diluyo 1:1 con 2,5% de FCS en PBS, y se cargo en un gradiente de Ficoll (Ficoll-Paque plus, Amersham Biosciences). Los tubos se centrifugaron durante 20 min a 1000 g, a 20°C. Se recogio la fase de celulas mononucleares y se lavo dos veces con PBS.
(ii) Agotamiento de CCR2+: En primer lugar las celulas mononucleares se bloquearon a traves del receptor Fc por el 35 tratamiento con reactivo de bloqueo FcR (2,5 pl/106 celulas) (130-059-901, Miltenyi Biotec) durante 15 minutos a
temperatura ambiente. Entonces, sin lavado, el reactivo de CCR2-biotina anti-humano monoclonal (FAB151B, R & D Systems) se anadio (10 pl/106 celulas) y se incubo durante 35 minutos a 2°- 8°C. A continuacion, se lavaron las celulas con tampon Macs™ frio (EDTA 1 mM, 2% de FCS en PBS) y microperlas de estreptavidina (130-048-101, Miltenyi Biotec) se anadieron (20 pl/107 celulas) durante 20 minutos a 2°- 8°C. La celulas se lavaron y se 40 resuspendieron con 0,5 ml de tampon MACS™. El agotamiento de las celulas CCR2+ se realizo con una columna LD (130-042-901, Miltenyi Biotec) de acuerdo con los protocolos de los fabricantes.
(iii) Aislamiento de celulas CD14+: Las celulas se resuspendieron con tampon de MACS™ (80 pl/107 celulas) y se anadieron microperlas de CD14+ (130-050-201, Miltenyi Biotec) (20 pl/107 celulas) durante 15 minutos a 2°- 8°C. A continuacion, las celulas se lavaron y se resuspendieron con 0,5 ml de tampon MACS. La seleccion positiva de las
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celulas CD14+ se realizo mediante el uso de la separacion magnetica en la columna LS (130-042-401, Miltenyi Biotec) de acuerdo con los protocolos del fabricante.
(iv) Tincion por clasificacion de celulas activada por fluorescencia (FACS ™) de las celulas mononucleares humanas
Todas las muestras se tineron de acuerdo con los protocolos de los fabricantes. Todas las muestras se filtraron a traves de una de malla de nylon de 70pm y se bloquearon con reactivo de bloqueo FCR (30 pl/106 celulas) (130-059901, Miltenyi Biotec) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los siguientes anticuerpos monoclonales anti- humanos marcados con fluorocromo se utilizaron de acuerdo con los protocolos del fabricante: anti CD45 PerCP conjugado (345809, BD), anti CD115 FITC conjugado (FAB329F, R & D Systems), anti CD14 Pacific Blue™ conjugado (BLG-325616 ), anti CD16 Alexa Fluor® 700 conjugado (BLG-302026), anti CX3CR1 PE conjugado (MBL- D070-5) y antiCCR2 PerCP conjugada (BLG-335303).
3.2 Resultados
La poblacion de monocitos se analizo de la poblacion celular en vivo (Fig. 3A) y se identifico usando la distribucion de dispersion de sitio de las celulas CD45+ (Fig. 3B), delimitada por la lmea negra delgado). La distribucion de la sub-poblacion de monocitos fue presentada por su expresion de antfgenos CD14 y CD16 (Fig. 3C). El analisis de la subpoblacion de monocitos de PBMC de donante sano de acuerdo con la tincion de CD 14 y CD16 por FACS revela la distribucion de las siguientes subpoblaciones: CD14+CD16' (80,5%), CD14+CD16+ (4,8%) y CD14dimCD16+ (3,5%), las Figs. 3A-C. Curiosamente, la subpoblacion de la CD14dimCD16+ tambien se tino con el marcador CD115 que pertenece al receptor LCR-1 y caracteriza los monocitos derivados de medula osea (Fig. 3D).
El analisis de la subpoblacion de monocitos de PBMC de donante sano de acuerdo con la tincion de CCR2 y CX3CR1 por FACS revelo que los monocitos que no expresan CD16 (subpoblacion CD16-) expresan CCR2 altamente mientras que los monocitos que expresan CD16 (subpoblaciones CD14+CD16+ y CD14dimCD16+) muestran una baja expresion de CCR2 y CX3CR1 alta (Figs. 4A-E).
Este resultado animo a los inventores a eliminar la subpoblacion de celulas CCR2 + con el fin de enriquecer la subpoblacion de celulas CD16+.
Como se puede ver en la Fig. 5, el agotamiento de las celulas CCR2+ revela un enriquecimiento de la subpoblacion CD14dimCD16+ de aproximadamente 9 veces (de 8% a 73%) y un enriquecimiento de la subpoblacion CD14+ CD16+ de 10 veces (de 1% a 10%), mientras una reduccion de la subpoblacion CD14+ CD16+ de aproximadamente 5 veces (de 91% a 17%).
Para examinar el papel de los monocitos CD16+ en el proceso de recuperacion despues de una lesion de la medula espinal, los monocitos enriquecidos para la subpoblacion CD16+ se inyectaron ICV (en el LCR) en ratones 4 dfas despues de la lesion. La actividad motora de las extremidades posteriores se monitorizo dos veces por semana durante un maximo de 4 semanas despues de la lesion mediante el sistema de escalado de BMS. Los animales de control tratados con el vehfculo (PBS) mostraron una recuperacion espontanea moderada con el tiempo, alcanzando aproximadamente 2,5 en la escala de BMS en promedio. Las puntuaciones del grupo tratado (monocitos enriquecidos con CD16+) fueron mas bajos que el grupo de control en cada punto de tiempo despues de la lesion lo que indica que su actividad motora se redujo en comparacion con el grupo control. Se llego a la conclusion de que esta subpoblacion, tras la inyeccion en el LCR de los animales en el dfa 4 post LME atenua la recuperacion espontanea (fig. 6).
Contrariamente a los efectos destructivos sobre la recuperacion que se han encontrado para los monocitos CD16+, el tratamiento con el total de las sub-poblaciones monocfticas fue beneficioso para la recuperacion de la lesion de la medula espinal, dependiendo del metodo de aislamiento (Fig. 7).
Discusion. Para el aislamiento de monocitos, se utilizo la tecnologfa de MACS desarrollada por Miltenyi Biotec que se basa en la separacion magnetica. En principio, la muestra de sangre se marca con microperlas magneticas conjugadas a anticuerpos diferentes. Las celulas se cargan en una columna MACS colocada en un campo magnetico. Las celulas marcadas magneticamente se retienen dentro de la columna mientras que las celulas no marcadas corren a traves de esta. Las celulas retenidas se pueden eluir mediante la retirada de la columna del campo magnetico, denominado seleccion positiva. La fraccion no marcada, denominada como la seleccion negativa, se puede recoger tambien.
Los monocitos se aislaron utilizando dos enfoques; la seleccion positiva o negativa. Para la seleccion positiva se utilizaron microperlas de CD14 de Miltenyi y para la seleccion negativa se utilizo el Kit II de Aislamiento de monocitos de Miltenyi. Al parecer, los monocitos que se aislaron mediante seleccion negativa muestran mejores efectos beneficiosos y con mas consistencia respecto a la recuperacion de los animales de una lesion de medula espinal que las celulas aisladas mediante seleccion positiva.
En resumen, con respecto al tratamiento despues de una lesion de medula espinal, se puede utilizar CD16 como marcador para distinguir entre monocitos de sangre beneficiosos (CD16-) y destructivos (CD16+). Los monocitos
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CD16 son conocidos como los monocitos clasicos y los CD16+ como los monocitos proinflamatorios que comportan solo el 10% de todos los monocitos.
Ejemplo 4: La inyeccion de una subpoblacion de monocitos, agotados de celulas CD3, CD19, CD56 y CD16, en el LCR promueve la recuperacion funcional en ratones despues de una lesion de medula espinal.
A la luz de las observaciones anteriores, se desarrollo un procedimiento para el aislamiento de monocitos CD16- utilizando el procedimiento de seleccion negativa MACS. Fueron marcadas las PBMC con microperlas conjugadas con CD3, cD19 y CD56 para agotar las celulas T, celulas B y celulas NK. Se recogieron las celulas no marcadas que pasaron a traves de la columna magnetica. Esta fraccion se marco con microperlas CD16 y se cargo de nuevo en la columna magnetica. Se recogieron las celulas que pasaron a traves de la columna y se tineron para el analisis en el FACS con anticuerpos fluorescentes de CD14 y CD16. La figura de la izquierda representa las PBMC antes del aislamiento (fig. 8A) y la figura de la derecha (Fig. 8B) representa el producto final despues de la seleccion negativa como se describio anteriormente. En las PBMC, el 19% de celulas vivas totales son monocitos (CD14+). Fuera de los monocitos, alrededor del 10% son CD16+. En el producto final aproximadamente el 90% de las celulas vivas son monocitos, de los cuales CD16+ es menor que el 0,1%.
Las dos subpoblaciones mostraron que alcanzaban diferentes etapas de maduracion despues de una estimulacion in vitro (Carmen Sanchez-Torres, et. al. CD16+ and CD16- human blood monocyte subsets differentiate in vitro to dendritic cells with different abilities to stimulate CD4+ T cells. Int. Immunol. (2001) 13 (12): 1571-1581) y por lo tanto que puede explicar el efecto diferente en la medula espinal lesionada.
A continuacion, se examino el efecto de la subpoblacion descrita anteriormente en la reduccion de los deficits funcionales despues de una lesion de medula espinal en ratones CD1 desnudos. Los ratones fueron sometidos a una lesion en la medula espinal severa controlada usando el dispositivo de contusion OSU ESCID (Ma M, Basso DM, Walters P, BT Stokes, Jakeman LB. Behavioral and histological outcomes following graded spinal cord contusion injury in the C57B1/6 mouse. Exp Neurol. 2001 Jun; 169 (2): 239-54). Las celulas o PBS se aplicaron al LCR a traves de la inyeccion ICV en el dfa 4 despues de la lesion. La recuperacion locomotora despues de la lesion se midio dos veces a la semana durante 4 semanas despues de la lesion utilizando la Escala de raton Basso para la locomocion (BMS).
Los ratones mostraron una ligera recuperacion locomotora espontanea en las primeras 3 semanas despues de la lesion. Una recuperacion por encima de 3 (colocacion plantar de la pata y apoyo del peso en la postura se obtuvo con una puntuacion 4 en una escala de 0 a 9) en el BMS se considero una recuperacion funcional significativa. El tratamiento con los monocitos purificados incremento la tasa de recuperacion del aparato locomotor de los animales (Fig 9). El 42% de los animales tratados con monocitos se recupero (5 de 12) en comparacion con el 14% (2 de 14) en el grupo tratado con PBS de control.
Referencias
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Claims (9)
- REIVINDICACIONES1. Una subpoblacion de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+ y celulas CD56+, para su uso en el tratamiento de lesiones del sistema nervioso central (SNC).
- 2. La subpoblacion de PBMC de acuerdo con la reivindicacion 1, que esta ademas sustancialmente desprovista de 5 celulas cDl6+.
- 3. Una subpoblacion de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) sustancialmente desprovista de celulas CD3+, celulas CD19+, celulas CD56+y celulas CD16+, para su uso en el tratamiento de una lesion del SNC.
- 4. La subpoblacion de PBMC de acuerdo con la reivindicacion 1 o 3, enriquecida sustancialmente en celulas CD14+.
- 5. La subpoblacion de PBMC para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso en 10 el tratamiento de la degeneracion neuronal causada por dicha lesion del SNC.
- 6. La subpoblacion de PBMC para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso en el tratamiento de una lesion de medula espinal.
- 7. La subpoblacion de PBMC de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6, en la que dicho tratamiento comprende la promocion de la restauracion del tejido de la medula espinal, la recuperacion funcional, o ambos.15 8. La subpoblacion de PBMC de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha lesion delSNC es un traumatismo, tales como traumatismo cerrado, traumatismo penetrante, golpe contragolpe cerebral o, traumatismo sufrido durante una operacion de neurocirugfa u otro procedimiento, o un derrame cerebral tal como un accidente cerebrovascular hemorragico o accidente cerebrovascular isquemico.
- 9. La subpoblacion de PBMC para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, formulada 20 para inyeccion.
- 10. La subpoblacion de PBMC para su uso de acuerdo con la reivindicacion 9, formulada para la inyeccion en el lfquido cefalorraqrndeo (LCR).
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