PT2790712T - Subpopulação de monócitos humanos para o tratamento de lesões do sistema nervoso central - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

SUBPOPULAÇÃO DE MQNÕCITOS HUMANOS PARA O TRATAMENTO DE LESÕES DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se em geral a lesões do sistema nervoso central (SNC) e, em particular, a subpopulações de monócitos humanos para utilização no tratamento de lesões do SNC, em particular no tratamento de pacientes sofrendo de lesão da medula espinal.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As lesões do sistema nervoso central, incluindo lesões da medula espinal, encontram-se entre as lesões mais devastadoras e incapacitantes possíveis. Dependendo da gravidade da lesão, pode resultar em paralisia de vários graus. A paraplegia e a tetraplegia resultam frequentemente a partir de lesão grave da medula espinal. A incidência mundial anual de lesão da medula espinal (SCI) é estimada em 22 pessoas por milhão e o número total de sobreviventes de SCI é estimado em 2,5 milhões. A SCI ocorre mais frequentemente em pessoas de vinte e poucos anos que podem antecipar uma esperança de vida quase normal embora com desafios para manter uma qualidade de via aceitável. Isto gera custos pessoais, sociais e económicos importantes. Embora a esperança de vida seja muito boa, os pacientes com SCI sofrem de algumas i nc apac i dade s importantes (dependendo do nível e gravidade da lesão) que diminuem seriamente a sua qualidade de vida (por exemplo, paralisia, perda sensorial, dor intratável, úlceras devidas a pressão, e infeções urinárias e outras). Apesar do trabalho intensivo que tem sido investido por parte das comunidades científica e clínica durante as últimas duas décadas, não existe ainda cura ou tratamento que possa reverter as funções perdidas após SCI.

Até à data, os esforços terapêuticos focaram-se principalmente na prevenção dos eventos destrutivos (neuroproteção) e menos no aumento dos eventos de reparação espontânea evocados por SCI. A recuperação adicional da função requererá uma combinação de intervenções terapêuticas neuroprotetoras e de restauração eficazes. As considerações acima levaram os inventores a seguir uma abordagem fisiológica inovadora que emprega o sistema de cura profissional do corpo, o sistema imunitário, para lidar com as consequências do dano ao sistema nervoso central (SNC) levando a neuroproteção e retauração.

Foi mostrado no laboratório dos inventores que monócitos derivados a partir de sangue incubados com segmentos de pele adquiriram um fenótipo não inflamatório semelhante aos monócitos M2 anti inflamatórios descritos na literatura (Bomstein et al., 2003). A injeção dos monócitos na medula espinal lesionada induziu melhor recuperação de SCI em ratos {documentos US 5.800.812; US 6.117.424; e US 6.267.955). Esta abordagem foi testada num estudo clínico em pacientes sofrendo de lesão aguda da medula espinal grave mostrando resultados encorajadores (documento WO 03/044037; Knoller et al., 2005). Consequentemente, o tratamento requereu um procedimento cirúrgico incluindo laminectomia para expor a medula espinal lesionada e injeção das células nos limites do sítio da lesão, que foi difícil de localizar. Os inventores sentiram que a descoberta de vias de superar a dificuldade de localizar o sítio da lesão e a exposição dos pacientes a um procedimento invasivo seriam úteis no tratamento de SCI.

Pesquisas mais recentes realizadas no laboratório dos inventores mostraram que após lesão da medula espinal, três ou quatro dias após a lesão monócitos originários do sangue infiltram espontaneamente o SNC danificado, acumulam-se preferentemente nas margens do sítio da lesão e desempenham um papel crucial no processo de recuperação. Estas células modulam a atividade imune no tecido lesionado para se tornar menos inflamatório, e produzem moléculas que sustentam a cura, e consequentemente favoráveis para a renovação celular e reparação de tecidos (Shechter et al. , 2009) . Apesar do seu papel positivo, em lesões graves foi insuficiente para induzir uma recuperação completa ou inclusive recuperação parcial funcional. A infiltração/recrutamento do sangue periférico no sítio de lesão é controlada por sinais provocados a partir do sítio da lesão, que afeta a barreira cérebro-CSF. A recuperação espontânea limitada após lesão do SNC pode ser atribuída em parte ao recrutamento inadequado, inoportuno, espontâneo do subconjunto eficaz de monócitos para o sítio da lesão. Em conjunto com isto, foi mostrado que o enriquecimento do agrupamento monocítico do sangue periférico com células GDI15 derivadas a partir de medula óssea aumentou a recuperação funcional após SCI em ratinhos (Shechter et al., 2009).

Os monócitos do sangue são uma população celular heterogénica com diferentes características e atividades. A utilização de monócitos do sangue para propósitos terapêuticos requer a identificação das células com funções nocivas e aquelas que são benéficas.

Em seres humanos, foi proposto que a expressão de CD16 em monócitos pode distinguir entre três subconj untos, nomeadamente monócitos CD14++CD16- (clássicos) CD14++CD16++ e CD14dimCD16++ (não clássicos), mas o seu papel em condições fisiológicas e patológicas não é totalmente entendido.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Nalguns aspetos, a presente invenção proporciona uma subpopu1ação de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+ e células 0056% ou uma subpopu 1 aç ão de PBMCs substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+, células CD56+ e células CD16+, para utilização no tratamento de lesões do sistema nervoso central (SNC).

Noutros aspetos, a presente invenção proporciona composições compreendendo uma subpopulação de PBMCs substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+ e células CD56+, ou uma subpopulação de PBMCs que é substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+, células CD56+ e células CD16+, para utilização no tratamento de lesões do SNC.

Também são divulgados métodos de tratamento de uma lesão do SNC compreendendo administrar a um indivíduo com necessidade da mesma uma quantidade eficaz de uma subpopulação de PBMCs substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+ e células CD56+, ou uma subpopulação de PBMCs substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+, células CD56+ e células CD16+. As células são preferentemente injetadas no CSF através de punção lombar ou da Cisterna Magna. São adicionalmente divulgadas para isolamento de uma subpopulação de PBMC humanas a partir de sangue substancialmente isenta de células CD3 +, células CD19+ e células CD56+ ou de uma subpopulação de PMBC humanas substancialmente isenta de células CD3 + , células CD19+, células CD56+ e células CD16+.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 mostra que a injeção por punção lombar (LP) de macrõfagos ativados por pele promove a recuperação funcional em ratos após lesão grave da medula espinal. Ratos de tipo selvagem foram submetidos a lesão da medula espinal (SCI) grave. Após 8 dias, os animais lesionados foram injetados com 0,5xl06 ou lxlO6 macrófagos ativados por pele ou com veículo no CSF (fluido cérebroespinal) através de LP. Foi observada uma melhoria significativa da locomoção, representada por um aumento da pontuação de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) no grupo de animais injetados com a dose mais elevada de macrófagos. A Fig. 2 mostra que os monócitos injetados por via intracerebroventricular (ICV) proporcionam uma melhoria significativa da atividade locomotora em ratinhos de tipo selvagem submetidos a lesão da medula espinal (SCI). BMS, Escala de Ratinho de Basso.

As Figs. 3A-D mostram a distribuição de monócitos do sangue periférico de acordo com a sua expressão de CD14, CD16 e CD115. A Fig. 3A mostra a distribuição da população de monócitos vivos totais conforme medido através de FACS (as células delineadas são as células vivas (quadro vivo). SSC, dispersão lateral; FSC, dispersão frontal; a Fig. 3B mostra a distribuição de células CD45 positivas fora do quadro vivo total, isto é, células de origem hematopoiética (exceto células eritrioides, plaquetas, e as suas células precursoras). A Fig. 3C mostra que monócitos (fora da subpopulação de monócitos delineada a partir das células CD45 positivas) etiquetados através de anticorpos monoclonais anti-CD14 e anti-CD16 podem ser separados em três subpopulações diferentes: CD14+CD16~ (80,5%), CD14+CD16+ (4,8%) e CD14dimCD16+ (3,5%). A Fig. 3D mostra o nível de expressão (em Intensidade de Fluorescência Média) de CD115 sobre as diferentes subpopulações de monócitos.

As Figs. 4A-E mostram a distribuição de CX3CR1 e CCR2 sobre monócitos de sangue periférico (4A) e sobre as três subpopulações de monócitos: CD14+CD16~ (4B), CD14+CD16+ (4C) e CD14dimCD16+ (4D) . (4Ξ) um gráfico mostrando a distribuição nas três subpopulações. A Fig. 5 mostra enriquecimento de células CD14dimCD16+ através de esgotamento das células CCR2+. As colunas mostram a percentagem de cada subpopulação a partir da população de monócitos total. A barra de PBMC representa a distribuição da subpopulação de monócitos em Células Mononucleares do Sangue Periférico isoladas a partir de uma doação de sangue fresco separada utilizando gradiente Ficoll. A coluna CD14 representa a distribuição da subpopulação de monócitos após seleção positiva de células CD14 positivas utilizando anticorpos CD14 conjugados com microesferas magnéticas; a barra de esgotamento de CC2 representa a distribuição da subpopulação de monócitos após seleção negativa de células CCR2 positivas e seleção positiva de células CD14 positivas. A Fig. 6 mostra que a injeção ICV de monócitos derivados de sangue enriquecidos para células CD14Q;LmCD16+ através de esgotamento das células CCR2+ não melhorou a recuperação de SCI. Além disso existe uma tendência de pioria do resultado funcional; a pontuação da Escala de Ratinho de Basso (BMS) é inferior nos animais tratados (monócitos) do que nos animais de controlo injetados com Solução Salina de Tampão Fosfato (PBS). A Fig. 7 mostra que a injeção ICV de monócitos derivados de sangue isolados através de seleção negativa no dia 4 após a lesão melhoram a recuperação funcional em ratinhos. Ainda assim, os monócitos derivados de sangue isolados através de seleção positiva de células CD14 positivas foram menos benéficos. BMS, Escala de Ratinho de Basso.

As Figs. 8A-B mostram uma abordagem sequencial para o isolamento de células CD14++CD16-, isto é, primeiro esgotamento dos leucócitos utilizando anticorpos CD3, CD19 e CD56 (A), seguido por esgotamento das células CD16 positivas. 0 produto final é uma população compreendendo células CD14++CD16- e menos de 0,lú de células CD16+ (B). A Fig. 9 mostra o efeito da injeção de 0,5*106 monócitos do sangue CD14++CD16- ativados por pele (MQ) ou PBS no CSF através de ICV em ratinhos submetidos a uma lesão da medula espinal grave controlada. Eixo Y, ú de animais mostrando recuperação funcional significativa da totalidade de animais testados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se na constatação de que uma subpopulação de monócitos que é definida pela ausência, ou quase ausência, de células expressando CD3, CD19, CD56 e opcionalmente CD16, é capaz de retornar a partir do fluido cérebroespinal (CSF) até ao sítio de lesão na medula espinal, e promover a restauração do tecido no local e recuperação funcional melhorada.

Os métodos da técnica anterior ensinam a necessidade de administrar fagócitos mononucleares de forma precisa aos limites da lesão de forma a obter eficácia satisfatória (por exemplo Patente U.S. N.° 5.800.812).

Foi adicionalmente constatado de acordo com a presente invenção que o efeito benéfico das células na cura da medula espinal lesionada é obtido através da administração de células ativadas através de co incubação com um pedaço de pele ou através de administração de células não ativadas no CSF da medula espinal lesionada.

Uma célula expressando sobre a sua superfície um determinado marcador identificável, tal como uma molécula de Agrupamento de Diferenciação (CD) X é referida no presente documento como CD Xs. Por exemplo, uma célula expressando sobre a sua superfície uma molécula CD3 é referida no presente documento como CD3+. A quantidade relativa da molécula CD expressa sobre a superfície celular é referida adicionando "+", por exemplo CD3++ para quantidades elevadas de moléculas CD, ou o termo "dim", mostrando um nível relativamente baixo de moléculas CD. Uma população de células compreendendo um tipo celular definido através da expressão de um determinado CD, uma população relativamente enriquecida com estas células, ou uma população carecendo de tais células, é designada CD+, CD++ or CD", respetivamente.

Consequentemente, em determinadas formas de realização, a subpopulação de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) é substancialmente isenta de células CD3 +, células CD194' e células CD56+.

Noutras formas de realização, também foram removidas as células CD16+ a partir da subpopulação de PBMC resultando numa subpopulação de PBMCs que é adicionalmente substancialmente isenta de CD16+, isto é, uma subpopulação substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+, células CD56+ e células CD16+. 0 termo ãcélula mononuclear do sangue periférico (PBMC)á conforme utilizado no presente documento refere-se a qualquer célula sanguínea tendo um núcleo redondo, tal como um linfócito, um monõcito ou um macrófago. Métodos para isolar PBMCs a partir do sangue são prontamente aparentes para os peritos na especialidade. Um exemplo não limitante é a extração destas células a partir de sangue inteiro utilizando Ficoll, um polissacarídeo hidrofílico que separa camadas de sangue, com monócitos e linfócitos formando uma crosta inflamatória sob uma camada de plasma ou através de leucaférese, a preparação de concentrados de leucócitos com o retorno de glóbulos vermelhos e plasma pobre em leucócitos para o dador. A frase áuma população de células substancialmente isenta deã e utilizada no presente documento indistintamente com a frase áquase ausência deá e preferentemente inclui uma população de células carecendo de um determinado tipo celular, ou compreendendo alternativamente uma quantidade relativa de um determinado tipo celular não excedendo cerca de 0,050 , 0,10 , 00 , 10 , 20 , 30 , 40 , ou 50 do número total de células na adi população de células.

Consequentemente, em determinadas formas de realização, a quantidade relativa de cada uma de células CD3 +, células CD19+ e células CD56+ não excede cerca de 0,050 , 0,10 , 0,50 , 10 , 20 , 30 , 40 , ou 50 dotnúaèrde células na população de PBMC. Em determinadas formas de realização, a quantidade relativa de células CD16+ na subpopulação substancialmente isenta de células CD3 + , células CD19+, células CD56+ e células CD16+ não excede cerca de 0,05ú, 0,lú, 0,5ú, lú, 2ú, 3ú, 4ú, ou 5ú do número total de células.

Em determinadas formas de realização, as subpopulações substancialmente isentas de células CD3+, células CD19+ e células CD56+ e opcionalmente também substancialmente isentas de células CD16+, são substancialmente enriquecidas em células CD14+. A frase ãuma população de células substancialmente enriquecidas emã refere-se a uma população de células compreendendo uma quantidade relativa de um determinado tipo celular excedendo cerca de 60ú, 70ú, 80ú, 90ú, 95ú ou 9 9ú do rM mero total de células na dita população de células.

Em determinadas formas de realização, a subpopulação de PBMCs substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+ e células CD56+ compreende pelo menos cerca de 60ú de células CD14 +, e a subpopulação substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+, células CD56+ e células CD16+ compreende pelo menos cerca de 80ú de células CD14 +. Consequentemente, a subpopulação substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+, células CD56+ e células CD16+ é também referida no presente documento como uma população CD14++, CD16".

Na presente invenção, a subpopulação de PBMCs destina-se a utilização no tratamento da degeneração neuronal causada pela lesão do SNC.

Consequentemente, em determinadas formas de realização, a subopulação de PBMCs da presente invenção pode ser para utilização no tratamento de lesão da medula espinal, e o tratamento pode compreender promoção da restauração do tecido da medula espinal, recuperação funcional, ou ambos.

Noutras formas de realização, a lesão do SNC é trauma tal como trauma contuso, trauma penetrante, golpe ou contragolpe cerebral, trauma sofrido durante uma operação neurocirEl rgica ou outro procedimento, ou acidente scscular cerebral tal como acidente vascular cerebral hemorrágico ou acidente vascular cerebral isquémico.

Numa forma de realização diferente, a subpopulação de PBMCs humanas é isolada a partir de PBMCs autólogas, isto é, é recolhido sangue a partir de um paciente com necessidade de tratamento de lesão do SNC, é preparada uma subpopu1ação de PBMC para utilização de acordo com a presente invenção conforme definido abaixo no presente documento, e posteriormente administrada novamente ao paciente.

Noutra forma de realização, a subpopu1ação de PBMCs humanas é isolada a partir de PBMCs alogénicas, isto é, é recolhido sangue a partir de um dador geneticamente semelhante, mas não idêntico, é preparada uma subpopu1ação de PBMC para utilização de acordo com a presente invenção conforme definido abaixo no presente documento e opcionalmente armazenada num banco de células antes de ser administrada ao paciente.

Em determinadas formas de realização, a subpopulação de PBMCs é formulada para injeção, preferentemente para inj eção no CSF.

Conforme utilizado no presente documento, o termo 12 portador f armaceuticamente aceitávell2 refere-se a um diluente, auxiliar de formulação de qualquer tipo não tóxico, ou simplesmente um meio aquoso estéril, tal como solução salina. Alguns exemplos dos materiais que podem servir como portadores farmaceuticamente aceitáveis são açúcares, tais como lactose, glucose e sacarose, amidos tais como amido de milho e amido de batata, celulose e os seus derivados tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malta, gelatina, talco; excipientes tais como manteiga de cacau e ceras de supositório; óleos tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de sésamo, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja,· glicóis, tal como propilenoglicol, polióis tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; ésteres tais como oleato de éster e etillaurato, agar; agentes tamponantes tais como hidróxido de alumínio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água isenta de agentes pirogénicos; solução salina isotónica, solução de Ringer; álcool etílico e soluções de tampão fosfato, bem como outras substâncias compatíveis não tóxicas utilizadas em formulações farmacêuticas.

Estes componentes inativos adicionais, bem como formulações e procedimentos de administração eficazes, são bem conhecidos na técnica e são descritos em livros de texto padrão, tais como Goodman and Gillman' s: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a Ed., Gilman et al. Eds. Pergamon Press (1990), e Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990).

Noutro aspeto, a presente invenção proprociona uma composição compreendendo uma subpopulação de PBMCs conforme definido acima para utilização no tratamento de lesão do SNC. A composição pode compreender células de uma subpopulação de PBMCs suspensas num portador farmaceuticamente aceitável adaptado para injeção, preferentemente para administração no CSF. Um exemplo não limitante de um portador farmaceuticamente aceitável é PBS ou um meio de cultura. Contudo, portadores farmaceuticamente aceitáveis alternativos serão prontamente aparentes para os peritos na especialidade.

Em determinadas formas de realização, a administração das células ou da composição no CSF é através de injeção intratecal, punção lombar (LP), injeção através da Cisterna Magna (CM), injeção intracerebroventricular (ICV), ou uma combinação dos mesmos.

Foi adicionalmente constatado de acordo com a presente invenção que a subpopulação de PBMC migra de forma exitosa a partir do CSF até aos limites de uma lesão na medula espinal, mitiga a lesão e melhora a recuperação funcional, quer as células tenham sido previamente ativadas através de co cultura com um pedaço de pele, isto é, sejam células ativadas por pele, ou sejam naive, isto é, não manipuladas ou não ativadas.

Consequentemente, em determinadas formas de realização, as células da subpopulação de PBMCs para utilização de acordo com a presente invenção injetadas no CSF são células ativadas por pele.

Noutras formas de realização, as células da subpopulação para utilização de acordo com PBMCs da presente invenção injetadas no CSF são células não ativadas. A subpopulação de PBMCs para utilização de acordo com a presente invenção, e a composição compreendendo as mesmas, são utilizadas para o tratamento de lesão do SNC, tal como lesão da medula espinal. Em particular, o tratamento compreende promoção da restauração do tecido da medula espinal incluindo, por exemplo, prevenção ou inibição da degeneração neuronal, promoção da sobrevivência neuronal, regeneração e/ou crescimento axonal, neurogénese numa medula espinal lesionada, e/ou promoção da recuperação funcional, conforme medido por exemplo através da pontuação Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) em ratos ou a Escala de Ratinho de Basso (BMS) em ratinhos, conforme definido abaixo no presente documento.

Noutra forma de realização, a lesão do SNC pode ser trauma, tal como trauma contuso, trauma penetrante, golpe ou contragolpe cerebral, trauma sofrido durante uma operação neurocirúrgica ou outro procedimento, ou acidente vascular cerebral tal como acidente vascular cerebral hemorrágico ou acidente vascular cerebral isquémico.

Também é divulgado um método de tratamento de lesão do SNC, particularmente uma lesão da medula espinal, compreendendo administrar a um indivíduo com necessidade uma quantidade eficaz de uma subpopulação de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) conforme definido no presente documento.

Conforme utilizado no presente documento, os termos 13 tratamento® ou ® tratar® de uma lesão abrange avâãção de pelo menos um sintoma da mesma, uma redução da gravidade da mesma, ou o atraso, prevenção, ou inibição da progressão da mesma. 0 tratamento não necessita significar que a lesão está totalmente curada. Para ser um tratamento eficaz, uma composição útil no presente documento somente necessita reduzir a gravidade de uma lesão, reduzir a gravidade dos sintomas associados com a mesma ou proporcionar melhoria da qualidade de vida de um paciente ou indivíduo. É adicionalmente divulgado um método para isolamento de uma subpopulação de PBMC humanas a partir de sangue que é substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+ e células CD56+, compreendendo as etapas: (i) isolar células mononucleares a partir do sangue; e (ii) remover as células CD3+, células CD19+ e células CD56+ a partir das células mononucleares de (i) colocando em contacto as ditas células mononucleares com anticorpos anti-CD3+, anticorpos anti-CD19+ e anticorpos anti-CD56+, cada um dos quais está ligado a microesferas, desta forma ligando as ditas células às ditas microesferas, e remoção das microesferas, obtendo como tal uma subpopulação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) humanas a partir de sangue que é sub s t anc i almente isenta de células CD3+, células CD19+ e células CD56+.

Também é divulgado um método para isolamento de uma subpopulação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) humanas a partir de sangue que é substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+, células CD56+ e células CD16+, compreendendo as etapas: (iii) isolar células mononucleares a partir do sangue; e (iv) remover as células CD3+, células CD19+, células CD56+ e células CD16+ a partir das células mononucleares de (iii) colocando em contacto as ditas células mononucleares com anticorpos anti-CD3+, anticorpos anti-CD19+, anticorpos anti-CD56+ e anticorpos anti-CD16+, cada um dos quais está ligado a microesferas, desta forma ligando as ditas células às ditas microesferas, e remoção das microesferas, obtendo como tal uma subpopulação de PBMC humanas a partir de sangue que é substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+, células CD56+ e c CD16+.

Em determinadas formas de realização, a etapa (iv) , isto é, a remoção de células CD3+, células CD19+, células CD56+ e células CD16+, compreende as subetapas: (v) remover as células CD3+, células CD19+ e células CD56+ a partir das células mononucleares de (iii) obtendo como tal uma subpopulação de PBMC humanas a partir de sangue que é substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+ e células CD56+; e (vi) remover as células CD16+ a partir da populaç4ao de PBMC de (v) , obtendo como tal uma subpopulação de PBMC humanas a partir de sangue que é substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+, células CD56+ e células CD16+.

Numa forma de realização, a etapa (iv) é realizada numa única etapa.

Os anticorpos que capturam as células expressando o antigénio desejado sobre a sua superfície, tais como CD3, CD19, CD56 e/ou CD16, podem ser biotiniladas e posteriormente ligadas a microesferas compreendendo avidina ou estreptavidina ou proteínas de ligação a biotina equivalentes, ou os anticorpos podem ser suplementados às células quando já ligados a microesferas. As microesferas podem ser magnéticas ou não magnéticas e as células, quando ligadas às microesferas, podem ser removidas a partir da solução na qual as células se encontram suspensas, através de centrifugação, se as microesferas não forem magnéticas, ou através de exposição ao campo magnético de um íman, se o forem.

Em formas de realização preferidas, os anticorpos estão ligados a microesferas magnéticas quando colocados em contacto com as células e as células são removidas através da remoção das microesferas às quais as células estão ligadas retirando-as da solução com um íman. A invenção será agora ilustrada através dos seguintes exemplos não limitantes.

EXEMPLOS

Materiais e Métodos (i) Animais. Os animais utilizados nas experiências, se não indicado de outra forma, foram proporcionados pela Harlan Laboratories, criador de Animais de Laboratório SPF com acreditação ISO em Israel, e o Centro de Cria de Animais do Instituto de Ciências Weizmann (Rehovot, Israel). Todos os animais foram manipulados de acordo com os regulamentos formulados pelo Comité de Cuidado e Utilização Animal do Instituto Weizmann. (ii) Lesão da medula espinal. Foram anestesiados ratos (ratos Sprague-Dawley de tipo selvagem) (Quetamina 70 mg/kg, Bedford Laboratories, OH, EUA. Xilazina 10 mg/kg, VMP, Bioulab, França), laminectomizados em T9, e contundidos utilizando um impactor NYU (Gruner (1992) A monitored contusion model of spinal cord injury in the rat. J Neurotrauma. Summer,· 9(2): 123-6; discussion 126-8 . Review) para deixar cair uma haste de metal de 10 g metal desde uma altura de 50 mm na medula espinal exposta (considerado como causando dano grave) . Foram anestesiados ratinhos, as suas medulas espinais foram expostas através de laminectomia em T12, e foi colocada uma força de 200 kdyn durante 1 segundo sobre a medula laminectomizada utilizando o impactor de medula espinal Infinite Horizon (Precision Systems and Instrumentation, Lexington, KY), um dispositivo mostrado como causando uma lesão contundente bem calibrada da medula espinal. (iii) Preparação da pele e co incubação com monõcitos. Foram preparados pedaços pequenos de pele (2x6 mm) a partir dos dorsos dos mesmos ratos dadores que foram sangrados para preparar os monõcitos. O pelo na parte superior do dorso foi rapado e a pele foi esterilizada com etanol antes de ser cortada. Foram colocados dois pedaços de pele com 5xl06 células da fração de monõcitos homóloga (veja-se acima) em 5 ml de DCCM-1 (Biological Industries, Beit HaEmek, Israel) e incubados durante 16 horas a 3 7 °C, C02 a 5ú. No final da incubação, os pedaços de pele foram removidos e as células foram recuperadas através de centrifugação. (v) Pontuação BBB: foi realizada análise comportamental nos ratos utilizando a pontuação de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) de locomoção em campo aberto [Basso, D.M., Beattie, M.S. e Bresnahan, J.C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J. Neurotrauma 12,1-21 (1995).] A análise comportamental nos ratinhos foi realizada utilizando a Escala de Ratinho de Basso (BMS) para avaliação da função motora dos membros posteriores em campo aberto [Basso DM, Fisher LC, Anderson AJ, Jakeman LB, McTigue DM, Popovich PG. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma, maio de 2006,-23(5):635-59]. (vii) Análise Estatística: Foi utilizado ANIVA de medidas repetidas para a pontuação BBB e BMS com comparação de seguimento de tratamentos para cada semana através de contraste por teste t e correção para comparação múltipla através do método de Holm (p=0,05).

Exemplo 1: A injeção por punção lombar de macrófagos ativados por pele promove a recuperação funcional em ratos após lesão grave da medula espinal.

Primeiro, foi procurada uma forma clinicamente fazível de aumentar o número de monócitos derivados a partir de sangue com o fenótipo desejado na medula espinal lesionada utilizando uma forma minimamente invasiva. Foi examinada a eficácia da injeção de monócitos derivados de sangue ativados por pele no fluido cerebrospinal (CSF) através de punção lombar (LP), na redução de défices funcionais após lesão da medula espinal em ratos.

Quadro 1: Recuperação funcional em ratos após lesão grave da medula espinal

Ratos Sprague-Dawley de tipo selvagem foram submetidos a contusão grave da medula espinal (veja-se Materiais e Métodos). Após 8 dias, os animais lesionados foram injetados no CSF com 0,5xl06 ou lxlO6 macrófagos ativados por pele (MQ) ou com veículo (PBS) , através de LP. Foi mostrado um efeito dependente da dose na facilitação da recuperação motora, com uma melhoria significativa da locomoção observada para o grupo e animais inj etados com a dose mais elevada de macrófagos (Fig. 1, Quadro 1).

Exemplo 2: A injeção de monócitos derivados de medula óssea não ativados no CSF promove a recuperação funcional em ratinhos após lesão da medula espinal.

Foi adicionalmente testado se monócitos derivados de medula óssea não ativados injetados no CSF através por via intracerebroventricular (ICV) retornariam ao parênquima da medula espinal lesionada. Ratinhos de tipo selvagem foram submetidos a contusão da medula espinal (veja-se Materiais e Métodos). Após 3 dias, os animais lesionados foram injetados ICV com proteína fluorescente verde (GFP) isolada expressando monócitos derivados de medula óssea naive (0,5xl06 monócitos Cx3crlGFP/+) , e analisados para a presença das células injetadas no sítio da lesão. A análise imunohistoquímica do sítio lesionado 4 dias após a injeção revelou a presença das células de expressão de CFP injetadas no parênquima lesionado, em estreita proximidade com os limites do sítio da lesão (não mostrado [Veja-se a explicação em Breve Descrição dos Desenhos]). Os animais tratados de forma semelhante foram seguidos para a atividade motora avaliada através de uma escala motora (BMS): o aumento do agrupamento de monócitos resultou em recuperação que excedeu os níveis de recuperação espontânea conforme pode ser observado a partir da melhoria significativa da locomoção nos ratinhos (Fig. 2).

Estes resultados sugeriram que os monócitos derivados de medula óssea não ativados podem retornar ao parênquima lesionado a partir do CSF, e como tal, que a barreira sangue-CSF pode ser uma via através da qual os monócitos entram espontaneamente para o SNC danificado.

Exemplo 3: Isolamento de células mononucleares humanas que expressam níveis elevados de CX3CR1 e baixo nível de CCR2 a partir de PBMC

Em seres humanos, são definidas três populações de monócitos através da expressão de CD14 e CD16, nomeadamente, CD14+CD16~, CD14+CD16 + , e CD14dimCD16+. Os monócitos CD14+CD16~ representam 80% a 90% dos monócitos do sangue, e expressam níveis elevados do recetor de quimiocinas CCR2 e níveis baixos do recetor de quimiocinas CX3CR1 (o recetor de fractalquina) . Em contraste com este subconjunto principal, os monócitos CD16+ humanos expressam níveis elevados de CX3CR1 e níveis baixos de CCR2 (Cros et al., 2010). De acordo com Cros et al. (2010), as análises da expressão genica indicaram semelhanças entre monócitos CD14dlmCD16+ humanos e monócitos Grldim de patrulha de ratinho. As células CD14dimCD16+ são monócitos genuínos envolvidos na vigilância local inata de tecidos e na patogénese de doenças autoimunes.

ESQUEMA I

De forma a isolar a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) as células CD14dl,I1CD16+ que expressam nível elevado de CX3CR1 e baixo nível de CCR2, foi utilizado o método combinado de seleção negativa de CCR2 (esgotamento de CCR2 + ) e seleção positiva de CD14+ (CD14+) enquanto foi utilizado isolamento de CD14+ a partir de PBMC como controlo, conforme ilustrado no esquema I. 3.1 Enriquecimento da população de células CD14dlmCD16+: (i) Isolamento de células mononucleares a partir de sangue periférico humano: Sangue fresco (8 ml) recolhido a partir de um dador saudável foi diluído 1:1 com FCS a 2,5% em PBS, e carregado num gradiente Ficoll (Ficoll-Paque plus, Amersham Biosciences). Os tubos foram centrifugados durante 20 min a 1000 g, a 20 °C. A fase celular mononuclear foi recolhida e lavada duas vezes com PBS. (ii) Esgotamento de CCR2+: Primeiro as células mononucleares foram bloqueadas por recetor Fc através de tratamento com reagente de bloqueio FcR (2,5 μ1/106 células) (130-059-901, Miltenyi Biotec) durante 15 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, sem lavagem, foi adicionado o reagente CCR2-biotina anti humano monoclonal (FAB151B, R&D Systems) (10 ml/106 células) e incubado durante 3 5 minutos a 2 o - 8 o C. Posteriormente as células foram lavadas com tampão MACS™ frio (EDTA ImM, FCS 2ú em PBS) e foram adicionadas microesferas de estreptavidina (130-048-101, Miltenyi Biotec) (20 μ1/107 células) durante 20 minutos a 2o - 8o C. As células foram lavadas e ressuspensas com 0,5 ml de tampão MACS™. 0 esgotamento das células CCR2+ foi realizado com coluna LD (130-042-901, Miltenyi Biotec) de acordo com os protocolos do fabricante. (iii) Isolamento de células CD14+: As células foram ressuspensas com tampão MACS™ 80 μ1/107 células) e foram adicionadas microesferas CD14+ (130-050-201, Miltenyi Biotec) (20 μ1/107 células) durante 15 minutos a 2o - 8o C. Posteriormente, as células foram lavadas e ressuspensas com 0,5 ml de tampão MACS™. A seleção positiva das células CD14+ foi realizada utilizando separação magnética em coluna LS (130-042-401, Miltenyi Biotec) de acordo com os protocolos do fabricante. (iv) Coloração de células mononucleares humanas através de classificação de células ativadas por fluorescência (FACSm) Todas as amostras foram coradas de acordo com os protocolos do fabricante. Todas as amostras foram filtradas através de malha de nylon de 70 pm e bloqueadas com reagente de bloqueio FCR (30 μ1/105 células) (130-059-901, Miltenyi Biotec) durante 15 minutos à temperatura ambiente. Foram utilizados os seguintes anticorpos anti-humanos etiquetados com fluorocromo de acordo com os protocolos do fabricante: anti CD45

conjugado com PerCP (345809, BD) , anti CD115 conjugado com FITC (FAB32 9F, R&D Systems) , anti CD14 conjugado com Pacific Blue™ (BLG-325616), anti CD16 conjugado com Alexa Fluor® 700 (BLG-302026) , anti CX3CRlconjugado com PE (MBL-D070-5) e anti CCR2 conjugado com PerCP (BLG-335303). 3.2 Resultados A população de monócitos foi analisada a partir da população celular viva (Fig. 3A) e identificada utilizando a distribuição de dispersão no local das células CD4 5 + (Fig. 3B) , delineada por linha preta fina) . A distribuição da subpopulação de monócitos foi apresentada através da expressão dos seus antigénios CD 14 e CD16 (Fig. 30 . A análise da subpopulação de monócitos de PBMC a partir de dadores saudáveis de acordo com a coloração de CD14 e CD16 através de FACS revela a distribuição das seguintes subpopulações: CD14+CD16" (80,5%), CD14+CD16+ (4,8%) e CD14dimCD16+ (3,5%). Figs. 3A-C. De forma interessante, a subpopulação de CD14dimCD16+ também foi corada com o marcador CD115 que pertence ao recetor CSF-1 e caracteriza os monócitos derivados de medula óssea (Fig. 3D). A análise da subpopulação de monócitos de PBMC a partir de dadores saudáveis de acordo com a coloração de CCR2 e CX3CR1 através de FACS revelou que os monócitos que não expressam CD16 (subpopulação CD16-) expressam CCR2 de forma elevada enquanto os monócitos que expressam CD16 (subpopulações CD14+CD16+ e CD14aitnCD16 + ) mostram baixa expressão de CCR2 e elevado CX3CR1 (Figs. 4A-E).

Este resultado encorajou a eliminação da subpopulação de células CCR2+ de modo a enriquecer a subpopulação de células CD16+.

Conforme pode ser visto a partir da Fig. 5, o esgotamento de células CCR24' revela um enriquecimento da subpopulação CD14dimCD16+ por cerca de 9 vezes (desde 8% até 73%) e enriquecimento da subpopulação CD14+CD16+ por 10 vezes (desde lú até 10Ú) enquanto reduzindo a subpopulação CD14+CD16"por cerca de 5 vezes (desde 91ú até 17ú) .

Para examinar o papel dos monócitos CD16+ no processo de recuperação após lesão da medula espinal, foram injetados monócitos para a subpopulação CD16+ ICV (no CSF) em ratinhos 4 dias após a lesão. A atividade motora dos membros posteriores foi monitorizada duas vezes por semana durante até 4 semanas após a lesão utilizando o sistema de escalonamento BMS. Os animais de controlo tratados com o veículo (PBS) mostraram uma recuperação espontânea moderada com o tempo, alcançando cerca de 2,5 na escala BMS em média. As pontuações do grupo tratado (monócitos enriquecidos com CD16+) foram menores do que o grupo de controlo em cada ponto de tempo após a lesão indicando que a sua atividade motora foi reduzida em comparação com o grupo de controlo. Foi concluído que esta subpopulação, após injeção no CSF de animais no dia 4 após SCI atenua a recuperação espontânea (Fig. 76).

Ao contrário do efeito destrutivo sobre a recuperação que foi encontrado para os monócitos CD16+, o tratamento com subpopulações monocíticas totais foi benéfico para a recuperação de lesão da medula espinal, dependendo do método de isolamento (Fig. 7).

Discussão. Para o isolamento de monócitos, foi utilizada tecnologia MACS desenvolvida pela Miltenyi Biotec que é baseada na separação magnética. Em princípio, a amostra de sangue é etiquetada com microesferas magnéticas conjugadas com diferentes anticorpos. As células são carregadas numa coluna MACS colocada num campo magnético. As células etiquetadas magne tic ament e são retidas dentro da coluna enquanto as células não etiquetadas a atravessam. As células retidas podem ser eluídas ao remover a coluna do campo magnético, denominado seleção positiva. A fração não etiquetada, denominada seleção negativa, pode também ser recolhida.

Foram isolados monócitos utilizando duas abordagens; seleção positiva ou negativa. Para a seleção positiva foram utilizadas microesferas CD14 da Miltenyi e para a seleção negativa foi utilizado o Kit de Isolamento de Monócitos II da Miltenyi. Aparentemente, os monócitos que foram isolados utilizando seleção negativa mostram efeitos benéficos melhores e mais consistentes sobre a recuperação dos animais a partir de lesão da medula espinal do que células isoladas através de seleção positiva.

Em resumo, relativamente ao tratamento após lesão da medula espinal, CD16 pode ser utilizado como um marcador para distinguir entre monócitos do sangue benéficos (CD16-) e destrutivos (CD16+). Os monócitos CD16- são conhecidos como monócitos clássicos e os CD16+ como os monócitos proinflamatórios que representam somente 10Ú de todos os monócitos.

Exemplo 4: A injeção de uma subpopulação de monócitos, isenta de células CD3, CD19, CD56 e CD16, no CSF promove a recuperação funcional em ratinhos após lesão da medula espinal. À luz das observações acima, foi desenvolvido um procedimento para o isolamento de monócitos CD16-utilizando o procedimento de seleção negativa MACS. Foram etiquetadas PBMCs com microesferas conjugadas com CD3, CD19 and CD56 para esgotar as células T, células B e células NK. As células não etiquetadas que passaram através da coluna magnética foram recolhidas. Esta fração foi etiquetada com microesferas CD16 e carregada novamente na coluna magnética. As células que passaram através da coluna foram recolhidas e coradas para análise em FACS com anticorpos fluorescentes CD14 e CD16. A figura à esquerda representa as PBMC antes do isolamento (Fig. 8A) e a figura à direita representa o produto final após seleção negativa conforme descrito anteriormente. Nas PBMCs, 19ú das células vivas totais são monócitos (CD14 + ) . De entre os monócitos, cerca de ΙΟύ são CD16+. No produto final cerca de 90ú das células vivas são monócitos de entre os quais CD16+ são menos de 0, lú.

As duas subpopulações foram mostradas como alcançando diferentes estádios de maturação após estimulação in vitro (Carmen Sánchez-Torres, et al. CD16+ and CD16- human blood monocyte subsets differentiate in vitro to dendritic cells with different abilities to stimulate CD4+ T cells. Int. Immunol. (2001) 13 (12): 1571-1581) e consequentemente pode tal explicar o efeito diferente sobre a medula espinal lesionada.

Foi então examinado o efeito sobre a subpopulação descrita acima sobre a redução dos défices funcionais após lesão da medula espinal em ratinhos nus CD1-. Os ratinhos foram submetidos a uma lesão da medula espinal grave utilizando o dispositivo de contusão OSU ESCID (Ma M, Basso DM, Walters P, Stokes BT, Jakeman LB. Behavioral and histological outcomes following graded spinal cord contusion injury in the C57B1/6 mouse. Exp Neurol. Jun 2001,-169(2):239-54). Foram aplicadas células ou PBS no CSF através de injeção ICV no dia 4 após a lesão. A recuperação locomotora após SCI foi medida duas vezes por semana durante 4 semanas após a lesão utilizando a Escala de Ratinho de Basso para a Locomoção (BMS).

Os ratinhos demonstraram ligeira recuperação locomotora espontânea nas primeiras 3 semanas após a lesão. A recuperação superior a 3 (a colocação da planta da pata e suporte do peso em posição de pronação foi pontuada como 4 numa escala de 0 a 9) na BMS foi considerada uma recuperação funcional significativa. 0 tratamento com os monócitos purificados aumentou a taxa de recuperação locomotora dos animais (Fig. 8). 42ú dos animais tratados com monócitos recuperaram (5 de 12) conforme comparado com 14ú (2 de 14) no grupo de controlo tratado com PBS.

REFERENCIAS

Bomstein Y, Harder J. B. , Vitner K, Smirnov I, Lisaey G, Butovsky 0, Fulga V, Yoles E. (2003) Features of skin-coincubated macrophages that promote recovery from spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology 142:10-16 Cros J, Cagnard N, Woollard K, Patey N, Zhang SY, Senechal B, Fuel A, Biswas SK, Moshous D, Picard C, Jais JP, D'Cruz D, Casanova JL, Trouillet C, Geissmann F. Human CD14dlra monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 2010 Sep 24,-33 (3) :375-86

Knoller N, Auerbach G, Fulga V, Zelig G, Attias J, Bakimer R, Harder J.B., Yoles E, Belkin H, Schwartz M, and Hadani H (2005) Clinical experience using incubated autologous macrophages as a treatment for complete spinal cord injury: Phase I study results J Neurosurg Spine 3:173-181 .

Shechter R, London A, Varol C, Raposo C, Cusimano M, Yovel G, Rolls A, Hack H, Pluchino S, Hartino G, Jung S, Schwartz M. (2009) Infiltrating blood-derived macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from spinal cord injury in mice. 6(7)

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 5800812 A [0005] [0015] • US 6117424 A [0005] • US 6267955 B [0005] • WO 03044037 A [0005]

Documentos de não patente citados na descrição • Goodman and Gillman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics. Pergamon Press, 1990 [0033] • Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co, 1990 [0033] • GRUNER. A monitored contusion model of spinal cord injury in the rat. J Neurotrauma. Summer, 1992, vol. 9 (2), 123-6 [0050]

• BASSO, D.M. ; BEATTIE, M.S. ; BRESNAHAN, J.C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J. Neurotrauma, 1995, vol. 12, 1-21 [0050] mouse strains. J Neurotrauma, May 2006, vol. 23 (5), 635-59 [0050] • CARMEN SANCHEZ-TORRES. CD16+ and CD16- human blood monocyte subsets differentiate in vitro to dendritic cells with different abilities to stimulate CD4+ T cells. Int. Immunol., 2001, vol. 13 (12), 1571- 1581 [0068] • MA M; BASSO DM ; WALTERS P ; STOKES BT ; JAKEMAN LB.

Behavioral and histological outcomes following graded spinal cord contusion injury in the C57B1/6 mouse. Exp Neurol., June 2001, vol. 169 (2), 239-54 [0069] • BOMSTEIN Y ; MARDER J. B. ; VITNER K ; SMIRNOV I ; LISAEY G ; BUTOVSKY 0 ; FULGA V ; YOLES E. Features of skin-coincubated macrophages that promote recovery from spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology, 2003, vol. 142, 10-16 [0071] • CROS J ; CAGNARD N ; WOOLLARD K ; PATEY N ; ZHANG SY ; SENECHAL B ; PUEL A ; BISWAS SK ; MOSHOUS D ; PICARD C.

Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity, 24 September 2010, vol. 33 (3), 375-86 [0071] • KNOLLER N ; AUERBACH G ; FULGA V ; ZELIGG ; ATTIAS J ;

BAKIMER R ; MARDER J.B. ; YOLES E ; BELKIN M ; SCHWARTZ M. Clinical experience using incubated autologous macrophages as a treatment for complete spinal cord injury. Phase I study results J Neurosurg Spine, 2005, vol. 3, 173-181 [0071]

• SHECHTER R ; LONDON A ; VAROL C ; RAPOSO C ; CUSIMANO M ; YOVEL G ; ROLLS A ; MACK M ; PLUCHINO S ; MARTINO G.

Infiltrating blood-derived macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from spinal cord injury in mice, 2009, vol. 6 (7 [0071]

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uma subpopulação de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+ e células CD56+, para utilização no tratamento de lesões do sistema nervoso central (SNC).
2. 2. A subpopulação de PBMCs para utilização de acordo com a reivindicação 1, adicionalmente subctancialmente isenta de células CD16+.
3. 3. Uma subpopulação de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) substancialmente isenta de células CD3+, células CD19+, células CD56+ e células CD16+, para utilização no tratamento de lesão do SNC.
4. 4. A subpopulação de PBMCs para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 3, substancialmente enriquecida em células CD14+.
5. 5. A subpopulação de PBMCs para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, para utilização no tratamento da degeneração neuronal causada pela dita lesão do SNC.
6. 6. A subpopulação de PBMCs para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, para utilização no tratamento de lesão da medula espinal.
7. 7. A subpopulação de PBMCs para utilização de acordo com a reivindicação 5 ou 6, em que o dito tratamento compreende promoção da restauração do tecido da medula espinal, recuperação funcional, ou ambas.
8. 8. A subpopulação de PBMCs para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a dita lesão do SNC é trauma tal como trauma contuso, trauma penetrante, golpe ou contragolpe cerebral, trauma sofrido durante uma operação neurocirúrgica ou outro procedimento, ou acidente vascular cerebral tal como acidente vascular cerebral hemorrágico ou acidente vascular cerebral isquémico.
9. 9. A subpopulação de PBMCs para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, formulada para inj eção.
10. 10. A subpopulação de PBMCs para utilização de acordo com a reivindicação 9, formulada para injeção no fluido cérebroespinal (CSF).