KR20140107439A - 중추신경계 손상 치료용 인간 단핵구의 서브집단 세포 - Google Patents
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Abstract
본원은 CNS 손상의 치료에 사용되는, 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포가 없고 선택적으로 CD16+세포가 결여된 말초혈액단핵세포(PBMC)의 서브집단이 개시된다.
Description
본 발명은 일반적으로 중추신경계(CNS) 손상에 관한 것으로, 특히 CNS 손상 치료에 유용한 인간 단핵구 서브집단, 상기 서브집단을 분리하는 방법 및 척수 손상으로 고통받는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
척수 손상을 포함한 중추신경계 손상은 가장 충격적인 것이며 장애를 일으킬 수 있는 것 중 하나이다. 손상의 중증성에 따라, 다양한 등급의 마비가 야기될 수 있다. 척수의 중증 손상으로 인해 종종 양측 하지 마비(Paraplegia) 및 사지 마비(quadriplegia)가 야기되기도 한다.
전세계적으로 척수 손상(spinal cord injury = SCI)은 연간 백만명당 22명 꼴로 발생하는 것으로 추정되며 SCI 생존자는 총 2.5백만명인 것으로 추정된다. SCI 대부분은 종종, 비록 받아들일 수 있는 삶의 질을 유지하는 도전이 있더라도, 거의 정상적인 기대 수명이 예상되는 20대 중반의 사람들에게서 발생한다. 이는 중요한 개인적, 사회적 그리고 경제적 비용을 발생시킨다. 비록 기대 수명이 매우 길지만, SCI 환자들은 그들의 삶의 질을 심각하게 감소시키는 몇몇 중요한 핸디캡(병변의 정도와 중증도에 따라 좌우됨)때문에 고통받는다(예를 들어, 마비, 감각 상실, 만성적인 통증(intractable pain), 욕창 및 요로 및 다른 감염). 지난 20년 동안 과학 및 임상 커뮤니티에서 연구한 집중적인 성과에도 불구하고, 아직까지는 SCI 후 손실된 기능을 바꿀 수 있는 약물이나 치료법은 없다.
지금까지, 파괴적인 경우를 예방하는데(신경 보호)에 주로 촛점을 두고 치료하고자 노력했고, SCI에 의해 야기된 자발적 회복을 강화시키는 데는 촛점을 두지 않았다. 나아가 기능의 회복은 효과적 신경보호 및 복원적인 치료 개입을 함께 사용하는 것을 필요로 한다. 이런 측면에서 본 발명자는 인체의 전문적 힐링 시스템, 즉, 중추신경계 손상에 대항하여 신경보호 및 회복으로 이끄는 면역 시스템을 적용시킨 새로운 생리학적 접근법을 취하였다.
본 발명자의 실험실에서는 스킨 세그먼트와 같이 배양시킨 혈액 유래 단핵구는 항염증성 M2 단핵구와 유사한 비-염증성 표현형을 취득한다는 것을 개시하였다(Bomstein et al., 2003). 랫트에서 손상된 척수 내에 단핵구를 주입하였을 때 SCI에서의 회복이 더 잘 유도되었다(US 5,800,812; US 6,117,424; 및 US 6,267,955). 급성 중증 척수 손상으로 고통받는 환자에 대한 임상 연구에서 이러한 접근법을 테스트하여 고무할 만한 결과를 얻었다(WO 03/044037; Knoller et al., 2005). 따라서 상기 치료는 손상된 척수를 노출시키는 척추후궁절제술(laminectomy)을 포함하는 외과적 절차, 및 찾아내기 어려운 병변 부위의 가장자리로의 세포의 주입을 필요로 한다. 본 발명자는, 이러한 병변 부위 찾기의 어려움 및 침습적(invasive) 절차에의 환자의 노출을 극복하는 것이 SCI 치료에 도움이 될 것으로 생각하였다.
본 발명자의 연구실에서 수행된 가장 최근의 연구에서, 척수 손상 3 에서 4일 후에 손상 혈액에서 생긴 단핵구가 자발적으로 손상된 CNS로 스며들어가고, 우선적으로 병변 부위의 가장자리에 축적되어, 회복 과정에서 중추적 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 세포는 손상된 조직에서 면역 활성을 조절하여 염증이 적어지고, 힐링을 도와주는 분자를 생산하고, 그결과 세포를 재생하고 및 조직을 복구하였다 (Shechter et al., 2009). 이들의 긍정적 역할에도 불구하고, 중증 손상에서는 전부 회복 또는 부분적 기능 회복을 유도하기엔 불충분하였다.
병변 부위로의 말초 혈액의 침윤/보충은 병변 부위로부터 유도된 시그널에 의해 조절되는데, 이는 뇌-CSF 장벽에 영향을 미친다. CNS 손상 후 자발적 회복이 제한적인 것은 부분적으로는, 효과적인 단핵구 서브세트의 병변 부위로의 보충이 불충분하고, 시기가 맞지 않은 자발적인 보충(recruitment)인 것에 기인한 것일 수 있다. 이것과 연관되어, 본 발명자는 마우스에서 말초 혈액 단핵구 풀에 골수 유래 CD115 세포를 강화시키면 SCI 후에 기능성 회복이 증강된다는 것을 밝혔다(Shechter et al., 2009).
혈액 단핵구들은 다른 특징과 활성을 가진 이형 세포 집단이다. 치료 목적을 위해 혈액 단핵구를 이용하려면 해로운 기능을 지닌 세포와 유익한 기능을 지닌 세포를 식별하는 것이 필요하다.
인간에 있어서, 단핵구에서 CD16을 발현시키면 3가지 서브세트, 즉 CD14++CD16- (classical) CD14++CD16++ 및 CD14dimCD16++ (non-classical) 간을 구별할 수 있으나, 이들의 생리학적 및 병리학적 상태가 전부 알려진 것은 아니다.
한 양태에서, 본 발명은 중추신경계 손상 치료에 사용되는, 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포가 결여된 말초혈액단핵세포(PBMC)의 서브집단(subpopulation), 또는 CD3+ 세포, CD19+, CD56+ 및 CD16+세포가 없는 PBMC 서브집단 세포를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 중추신경계 손상 치료에 사용되는, 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포가 없는 PBMC 서브집단, 또는 CD3+ 세포, CD19+, CD56+ 및 CD16+세포가 없는 PBMC 서브집단 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포가 없는 PBMC 서브집단, 또는 CD3+ 세포, CD19+, CD56+ 및 CD16+세포가 없는 PBMC 서브집단의 유효한 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 CSN 손상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 세포는 바람직하게는 요추 천자(LP, lumbar puncture) 또는 시스터나 마그나(Cisterna Magna)를 통해 CSF로 주입된다.
다른 양태에서, 본 발명은 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포가 없는 인간 PBMC의 서브집단, 또는 CD3+ 세포, CD19+, CD56+ 및 CD16+세포가 없는 인간 PBMC 서브집단을 혈액으로부터 분리하는 방법을 제공한다.
도 1은 중증 척수 손상 후 랫트에게 스킨-활성화된 대식세포를 LP 주입하면 기능성 회복이 촉진된다는 것을 보여준다. 야생형 랫트에게 중증 척수 손상(SCI)를 가하였다. 8일 후, 0.5x106 또는 1x106 개의 스킨-활성화된 대식세포 또는 비히클을 CSF(cerebrospinal fluid) 내로 LP를 통해 상기 손상을 입은 동물에게 주입하였다. 대식세포가 고용량 주입된 동물 그룹에서, BBB(Basso-Beattie-Bresnahan) 스코어가 증가하는 것으로 나타나 로코모션이 유의하게 향상된 것으로 관찰되었다.
도 2는 ICV (intracerebroventricular)로 주입된 단핵구가, 척수 손상(SCI)을 입은 야생형 마우스에서의 로코모션 활성을 유의하게 증가시켰다는 것을 나타낸다. BMS: Basso Mouse Scale.
도 3A-D는 CD14, CD16 및 CD115의 발현에 따른 말초 혈액 단핵구의 분포를 나타낸다. 도 3A는 FACS로 측정된 총 라이브 단핵구 집단의 분포를 나타난다(상기 기술한 세포는 라이브 세포(라이브 게이트)임). SSC: side scatter; FSC: forward scatter; 도 3B는 총 라이브 케이트, 즉, 조혈 유래 세포(적혈구 세포, 혈소판 및 이들의 전구세포 제외) 중 CD45 양성 세포의 분포를 나타낸다. 도 3C는 모노클론 항-CD14 및 항-CD16 항체로 표지된 단핵구(CD45 양성 세포로 기술된 단핵구 서브집단 중에서)은 세 개의 구별되는 서브집단으로 나눌 수 있다: CD14+CD16- (80.5%), CD14+CD16+ (4.8%) 및 CD14dimCD16+ (3.5%). 도 3D는 상이한 단핵구 서브집단에 대한 CD115의 발현 정도(평균 (Mean) 형광 강도로 나타냄)을 나타낸다.
도 4A-E는 말초 혈액 단핵구(4A) 및 세 가지 단핵구 서브집단: CD14+CD16- (4B), CD14+CD16+ (4C) 및 CD14dimCD16+ (4D)에 대한 CX3CR1 및 CCR2의 분포를 나타낸다. 4(E)는 상기 세개의 서브집단의 분포를 보여주는 그래프이다.
도 5는 CCR2+ 세포를 고갈시킴으로써 CD14dimCD16+ 세포가 풍부하게 된다는 것을 나타낸다. 컬럼은 총 단핵구 집단 중 각 서브집단의 퍼센트를 나타낸다. PBMC 바는, 피콜 구배(Ficoll gradient)를 사용하여 분리한, 후레쉬 헌혈에서 분리한 말초혈액단핵세포에 있는 단핵구 서브집단의 분포를 나타낸다. CD14 컬럼은, 자력 마이크로비드에 접합된 CD14 항체를 사용하여 CD14 양성 세포를 양성 분리한 후의 단핵구 서브집단의 분포를 나타낸다; CCR2 고갈 바는, CCR2 양성 세포의 음성 선택 및 CD14 양성 세포의 양성 선택 후의 단핵구 서브집단의 분포를 나타낸다.
도 6은 CCR2+ 세포를 고갈시킴으로써 CD14dimCD16+ 세포가 풍부하게된 혈액 유래 단핵구를 ICV 주입하였을 때 SCI를 회복시키지 못했다는 것을 나타낸다. 또한 기능 악화 경향이 있다; PBS(Phosphate Buffered Saline)을 주입한 대조 동물보다 처치한 동물(단핵구)에게서 BMS(Basso Mouse Scale) 스코어가 더 낮다.
도 7은 손상 4일 후 음성 선택으로 분리된 혈액 유래 단핵구를 ICV 주입하면 마우스의 기능 회복이 향상된다는 것을 나타낸다. 그러나, CD14 양성 세포의 양성 선택으로 분리된 혈액 유래 단핵구는 덜 유익하였다. BMS; Basso Mouse Scale.
도 8A-B는 CD14++CD16- 세포의 분리를 위한 연속적 접근을 나타내는데, 즉 처음에는 CD3, CD19 및 CD56 항체를 사용하여 백혈구를 고갈시키고(A), 이어 CD16 양성 세포를 고갈시켰다. 최종 생성물은 CD14++CD16- 세포를 포함하며 CD16+ 세포가 0.1% 미만인 집단 (Bss)이다.
도 9는 조절된 중증 척수 손상을 입은 마우스에게 ICV로 CSF 내로 PBS 또는 0.5*106 CD14++CD16- 스킨-활성화 혈액 단핵구(MQ)를 주입한 효과를 나타낸다. Y-축: 테스트된 총 동물 중 유의한 기능성 회복을 나타낸 동물 %.
도 2는 ICV (intracerebroventricular)로 주입된 단핵구가, 척수 손상(SCI)을 입은 야생형 마우스에서의 로코모션 활성을 유의하게 증가시켰다는 것을 나타낸다. BMS: Basso Mouse Scale.
도 3A-D는 CD14, CD16 및 CD115의 발현에 따른 말초 혈액 단핵구의 분포를 나타낸다. 도 3A는 FACS로 측정된 총 라이브 단핵구 집단의 분포를 나타난다(상기 기술한 세포는 라이브 세포(라이브 게이트)임). SSC: side scatter; FSC: forward scatter; 도 3B는 총 라이브 케이트, 즉, 조혈 유래 세포(적혈구 세포, 혈소판 및 이들의 전구세포 제외) 중 CD45 양성 세포의 분포를 나타낸다. 도 3C는 모노클론 항-CD14 및 항-CD16 항체로 표지된 단핵구(CD45 양성 세포로 기술된 단핵구 서브집단 중에서)은 세 개의 구별되는 서브집단으로 나눌 수 있다: CD14+CD16- (80.5%), CD14+CD16+ (4.8%) 및 CD14dimCD16+ (3.5%). 도 3D는 상이한 단핵구 서브집단에 대한 CD115의 발현 정도(평균 (Mean) 형광 강도로 나타냄)을 나타낸다.
도 4A-E는 말초 혈액 단핵구(4A) 및 세 가지 단핵구 서브집단: CD14+CD16- (4B), CD14+CD16+ (4C) 및 CD14dimCD16+ (4D)에 대한 CX3CR1 및 CCR2의 분포를 나타낸다. 4(E)는 상기 세개의 서브집단의 분포를 보여주는 그래프이다.
도 5는 CCR2+ 세포를 고갈시킴으로써 CD14dimCD16+ 세포가 풍부하게 된다는 것을 나타낸다. 컬럼은 총 단핵구 집단 중 각 서브집단의 퍼센트를 나타낸다. PBMC 바는, 피콜 구배(Ficoll gradient)를 사용하여 분리한, 후레쉬 헌혈에서 분리한 말초혈액단핵세포에 있는 단핵구 서브집단의 분포를 나타낸다. CD14 컬럼은, 자력 마이크로비드에 접합된 CD14 항체를 사용하여 CD14 양성 세포를 양성 분리한 후의 단핵구 서브집단의 분포를 나타낸다; CCR2 고갈 바는, CCR2 양성 세포의 음성 선택 및 CD14 양성 세포의 양성 선택 후의 단핵구 서브집단의 분포를 나타낸다.
도 6은 CCR2+ 세포를 고갈시킴으로써 CD14dimCD16+ 세포가 풍부하게된 혈액 유래 단핵구를 ICV 주입하였을 때 SCI를 회복시키지 못했다는 것을 나타낸다. 또한 기능 악화 경향이 있다; PBS(Phosphate Buffered Saline)을 주입한 대조 동물보다 처치한 동물(단핵구)에게서 BMS(Basso Mouse Scale) 스코어가 더 낮다.
도 7은 손상 4일 후 음성 선택으로 분리된 혈액 유래 단핵구를 ICV 주입하면 마우스의 기능 회복이 향상된다는 것을 나타낸다. 그러나, CD14 양성 세포의 양성 선택으로 분리된 혈액 유래 단핵구는 덜 유익하였다. BMS; Basso Mouse Scale.
도 8A-B는 CD14++CD16- 세포의 분리를 위한 연속적 접근을 나타내는데, 즉 처음에는 CD3, CD19 및 CD56 항체를 사용하여 백혈구를 고갈시키고(A), 이어 CD16 양성 세포를 고갈시켰다. 최종 생성물은 CD14++CD16- 세포를 포함하며 CD16+ 세포가 0.1% 미만인 집단 (Bss)이다.
도 9는 조절된 중증 척수 손상을 입은 마우스에게 ICV로 CSF 내로 PBS 또는 0.5*106 CD14++CD16- 스킨-활성화 혈액 단핵구(MQ)를 주입한 효과를 나타낸다. Y-축: 테스트된 총 동물 중 유의한 기능성 회복을 나타낸 동물 %.
본 발명은 CD3, CD19, CD56 그리고 선택적으로 CD16을 발현하는 세포가 없거나 또는 거의 없는 것으로 규정되는 단핵구의 서브집단이 뇌척수액(CSF)에서 척수 손상 부위로 찾아갈 수 있고, 이들 조직의 복원을 촉진시키고 기능 회복을 향상시킬 수 있다는 발견에 근거한 것이다. 종래 방법에는 만족할 만한 효능을 얻기 위하여는 병변 가장자리에 단핵 포식세포를 정확하게 투여하는 것이 필요하다고 개시하고 있다(예를 들어 US Patent No. 5,800,812).
나아가, 본 발명에서는 손상된 척수를 치료할 때, 세포를 스킨 한 조각과 공배양하여 활성화시킨 세포 또는 비활성화된 세포를 손상된 척수의 CSF 내에 투여될때 본원의 세포가 손상된 척수 치료에 유익하다는 것을 발견하였다.
본 명세서에서는 표면에 특정할 수 있는 마커, 예를 들어 CD(Cluster of Differentiation) 분자 X와 같은 마커를 발현하는 세포를 CDX+라고 명명한다. 예를 들어 표면에 CD3 분자를 발현하는 세포는 본 명세서에서는 CD3+라고 칭한다. 세포 표면에 발현되는 CD 분자의 상대적 양은 "+"를 첨가하여 명명하는데, 예를 들어 CD3++은 CD 분자가 고농도이고, "dim"이라는 용어는 CD 분자가 상대적으로 낮은 농도 (레벨)이라는 것을 나타낸다. 특정 CD를 발현하는 것으로 규정되는 세포 타입을 포함하는 세포의 집단, 상기 세포가 상대적으로 풍부한 집단, 또는 이러한 세포가 부족한 집단을 각각 CD+, CD++ 또는 CD-로 표시한다.
따라서, 일 실시예에서, 말초혈액단핵세포(PBMC)의 서브집단은 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포가 없다.
다른 실시예에서, 또한 상기 PBMC 서브집단에서 CD16+ 세포를 제거하면 추가로 실질적으로 CD16+ 세포가 없는 PBMC 서브집단, 즉 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포가 없는 서브집단이 된다.
본원에 사용된 용어 "말초혈액단핵세포(PBMC)"는 림프구, 단핵구 또는 대식세포와 같은 둥근 핵을 가진 임의의 혈액 세포를 말한다. 혈액에서 PBMC를 분리하는 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게는 자명한 것이다. 비제한적 실시예에서, 단핵구 및 림프구는, 플라즈마 층 아래에서 버피코트를 형성시켜 혈액을 층분리하는 친수성 폴리사카라이드인 피콜(ficoll)을 사용하거나, 또는 백혈구를 회수하고 백혈구가 거의 없는 플라즈마 및 적혈구는 헌혈자에게 돌려줌으로써 백혈구 농축액을 제조하는 방법인 백혈구분반술(leukapheresis)을 이용하여 전(whole) 혈액에서 상기 세포를 추출한다.
본원에 사용된 "실질적으로 없는 (또는 결여된 또는 고갈된) 세포 집단"이라는 문구는 "거의 없는"이라는 문구와 교환적으로 사용되며 바람직하게는 특정 세포 타입이 없는 세포 집단을 포함하거나, 또는 때안저으로 특정 세포 타입의 상대적 양이 상기 세포 집단에서 총 세포수 중 약 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5%를 초과하지 않는 것을 포함한다.
따라서, 일 실시예에서, CD3+ 세포, CD19+ 세포, 및 CD56+ 세포 각각의 상대적 양은 PBMC 집단에서의 총 세포수의 약 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5%를 초과하지 않는다. 일 실시예에서, 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포가 없는 서브집단에서 CD16+ 세포의 상대적 양은 총 세포수의 약 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5%를 초과하지 않는다.
일 실시예에서, 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, 및 CD56+ 세포가 없고 또한 선택적으로 실질적으로 CD16+ 세포가 없는 서브집단은 실질적으로 CD14+ 세포가 강화되었다.
본원에 사용된 "실질적으로 강화된 (풍부한, 풍부해진) 집단"이라는 문구는 상기 세포 집단에서 총 세포수 중 특정 세포 타입이 상대적 양으로 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 초과하여 포함된 세포 집단을 말한다.
일 실시예에서, 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, 및 CD56+ 세포가 없는 PBMC 서브집단은 최소 약 60%의 CD14+ 세포를 포함하며, 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포가 없는 서브집단은 최소 약 80%의 CD14+ 세포를 포함한다. 따라서, 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포가 없는 서브집단은 또한 본 명세서에서 CD14++, CD16- 집단으로 불린다.
일 실시예에서, 본 발명의 PBMC 서브집단은 CNS 손상에 의해 야기된 신경성 퇴행을 치료하는데 사용된다.
따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 PBMC 서브집단은 척수 손상의 치료에 사용될 수 있고, 상기 치료는 척수 조직 복원, 기능 회복, 또는 둘다를 촉진시키는 것을 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, CNS 손상은 둔기 외상(blunt trauma), 관통성 외상(penetrating trauma), 두부 직접 또는 간접 타격, 신경외과 수술 또는 기타 치료 과정에서의 지속된 외상, 또는 출혈성 뇌졸중 또는 허혈성 뇌졸중과 같은 뇌졸중이다.
다른 실시예에서, 인간 PBMC 서브집단은 자가유래 PBMC로부터 분리되며, 즉 CNS 손상의 치료를 필요로 하는 환자로부터 혈액을 모으고, 본 발명에 따른 PBMC 서브집단을 본 명세서 하기에 정의된 바와 같이 제조하여, 그리고나서 다시 상기 환자에게 투여된다.
다른 실시예에서, 인간 PBMC 서브집단은 동종이계 PBMC로부터 분리되고, 즉 유전적으로 유사한 그러나 동일하지 않은 기증자(donor)로부터 혈액을 모으고, 본 발명에 따르는 PBMC 서브집단을 본 명세서 하기에 정의된 바와 같이 제조하여, 그리고 선택적으로 환자에게 투여하기 전에 세포 은행에 저장된다.
일 실시예에서, PBMC 서브집단은 주사제로, 바람직하게는 CSF 내로 주사될 수 있도록 제형화된다.
본 명세서에 사용된 용어, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 타입의 비독성의, 희석하는 제형 보조제, 또는 식염수와 같은 단순한 멸균된 수용성 배지를 말한다. 약제학적으로 허용가능한 담체로 사용되는 물질 몇몇 예에는, 락토즈, 글루코즈 및 수크로즈와 같은 당류, 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분, 소디움 카르복시메틸 셀룰로오즈, 에틸 셀룰로오즈 및 셀룰로오즈 아세테이트와 같은 셀룰로오즈 및 이의 유도체; 분말 트라가칸스; 몰트, 젤라틴, 탈크; 코코아버터 및 좌제 왁스와 같은 부형제; 피넛 오일, 코튼씨드 오일, 잇꽃(safflower) 오일, 쎄서미 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 소이빈 오일과 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜; 에틸 올리에이트 및 에틸라우레이트와 같은 에스터; 마그네슘 히드록사이드 및 알루미늄 히드록사이드와 같은 버퍼 용제; 알긴산; 피로젠 프리 워터; 등장액(isotonic saline), 링거액; 에틸 알코올 및 포스페이트 버퍼액 뿐만 아니라 약제학 제형에 사용되는 기타 비독성 양립가능한 물질이 있다.
이러한 비활성 성분뿐만 아니라 효과적인 제형 및 투여 절차는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 기초 교과서, 예를 들면 Goodman and Gillman's : The Pharmacological Bases of Therapeutics , 8th Ed., Gilman et al. Eds. Pergamon Press (1990), 및 Remington's Pharmaceutical Sciences , 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990)에 잘 기술되어 있는데, 이 둘다 참조에 의해 본 명세서에 그 전문이 포함된다.
다른 양태에서, 본 발명은 CNS 손상의 치료에 사용되는, 상기에서 정의된 PBMC의 서브집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 주사제, 바람직하게는 CSF 내로 투여하는 주사제에 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체에 현탁된 PBMC의 서브집단의 세포를 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 담체의 예로는 PBS 또는 배양 배지가 있으나 이에 제한되지 않는다. 한편 다른 약제학적으로 허용가능한 담체도 당연히 당해 기술분야의 당업자에게 자명할 것이다.
일 실시예에서, 상기 세포 또는 상기 조성물의 CSF 내로의 투여에는 뇌척수강내 주입(intrathecal injection), 요추 천자(lumbar puncture (LP)), 시스터나 마그나를 통한 주입, ICV(intracerebroventricular) 주입, 또는 이들의 조합이 있다.
나아가, 본원에서는 상기 세포가, 미리 스킨 한 조각과의 공배양에 의해 활성화되었는지 즉 스킨-활성화된 세포인지, 또는 이들이 원래의 즉 처리되지 않거나 활성화되지 않았는지에 상관없이, PBMC 서브집단이 CSF에서 척수의 손상부위 가장자리로 성공적으로 이동하여, 손상을 완화시키고 그리고 기능 회복을 향상시킨다는 것을 발견하였다.
따라서, 일 실시예에서, CSF 내로 주입된, 본 발명의 PBMC의 서브집단의 세포는 스킨-활성화된 세포이다.
다른 실시예에서 CSF 내로 주입된, 본 발명의 PBMC의 서브집단의 세포는 비활성화된 세포이다.
본 발명에 따른 PBMC 서브집단, 및 이들을 포함하는 조성물은 척수 손상과 같은 CNS 손상의 치료에 유용하다. 특히 상기 치료는 척수 조직 복원을 촉진하는 것을 포함하는데, 예를 들어 신경성 퇴행을 예방하거나 저해하고, 신경 생존(neuronal survival)을 촉진하거나, 신경돌기 재생 및/또는 발아(sprouting), 손상 척수에서의 신경 생성, 및/또는, 하기에 정의된 바와 같이 예를 들어 랫트에서 BBB(Basso-Beattie-Bresnahan) 스코어 또는 마우스에서 BMS(Basso Mouse Scale)로 측정되는 기능 회복의 촉진을 포함한다.
다른 실시예에서, CNS 손상은 둔기 외상(blunt trauma), 관통성 외상(penetrating trauma), 두부 직접 또는 간접 타격, 신경외과 수술 또는 기타 치료 과정동안 지속된 외상, 또는 출혈성 뇌졸중 또는 허혈성 뇌졸중과 같은 뇌졸중과 같은 외상일 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 또한 본 명세서에서 정의된 말초혈액단핵세포(PBMC) 서브집단의 유효한 양을 이를 필요로하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, CNS 손상, 특히 척수 손상을 치료하는 방법을 제공한다.
본원에서 사용된 용어 손상의 "치료" 또는 "치료하는"은 이들 증상을 최소 하나라도 경감시키거나, 이들의 중증도를 감소시키거나 또는 지연, 예방, 또는 이들의 진행을 억제하는 것을 포함한다. 치료는 손상이 완전히 없어지는 것을 의미하지 않는다. 효과적인 치료는 본원의 유용한 조성물이 단지 손상의 중증도를 감소시키거나 연관된 증상의 중증도를 완화시키거나 또는 환자 또는 치료 대상의 삶의 질을 향상시키는 정도면 된다.
다른 양태에서, 본 발명은, (i) 혈액에서 단핵 세포를 분리하고; (ii) 각각 마이크로 비드와 연결되어 있는 항- CD3+ 항체, 항-CD19+ 항체 및 항-CD56+ 항체와 (i)의 상기 단핵 세포를 접촉시키고, 그럼으로써 상기 세포가 상기 마이크로비드와 결합하고, 상기 마이크로비드를 제거함으로써, 단핵세포에서 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포를 제거하여, 그럼으로써 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포가 없는 인간 말초혈액단핵세포(PMBC)의 서브집단을 혈액으로부터 얻게 되는 단계를 포함하는, 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포가 없는 인간 PBMC의 서브집단을 분리하는 방법을 제공한다.
한편 다른 양태에서, 본 발명은 (iii) 혈액에서 단핵 세포를 분리하고; (iv) 각각 마이크로 비드와 연결되어 있는 항- CD3+ 항체, 항-CD19+ 항체, 항-CD56+ 항체, 및 CD16+ 항체와 (iii)의 상기 단핵 세포를 접촉시키고, 그럼으로써 상기 세포가 상기 마이크로비드와 결합하고, 상기 마이크로비드를 제거함으로써,단핵세포에서 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포를 제거하여, 그럼으로써 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포가 없는 인간 말초혈액단핵세포(PMBC)의 서브집단을 혈액으로부터 얻게 되는 단계를 포함하는, 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포가 없는 인간 말초혈액단핵세포(PBMC)의 서브집단을 분리하는 방법을 제공한다.
한 실시예에서, 단계 (iv), 즉 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포를 제거하는 단계는, 하부 단계로 (v) (iii)의 단핵세포에서 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포를 제거하고 그럼으로써 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포가 없는 인간 PMBC의 서브집단을 혈액으로부터 얻고; 그리고 (vi) (v)의 PMBC 집단에서 CD16+ 세포를 제거하고, 그럼으로써 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포가 없는 인간 PMBC 서브집단을 혈액으로부터 얻는 단계를 포함한다.
한 실시예에서 단계 (iv)는 한 단계로 수행된다.
CD3, CD19, CD56 및/또는 CD16와 같은, 표면에 원하는 항원을 발현하는 세포를 포획하는 항체는 바이오티닐화될 수 있고 이어 아비딘 또는 스트렙타비딘 또는 등가의 바이오틴-결합 단백질을 포함하는 마이크로비드와 결합될 수 있거나, 또는 항체는 미리 마이크로비드와 결합된 세포에 제공될 수 있다. 상기 마이크로비드는 자성 또는 비자성일 수 있으며, 그리고 마이크로비드와 결합되었을 때 만일 마이크로비드가 자성이 아니라면 상기 세포가 현탁된 용액을 원심분리함으로써 상기 세포를 제거할 수 있고, 또는 만일 마이크로비드가 자성이라면 상기 세포를 자석을 자기장에 노출시킴으로써 상기 세포를 제거할 수 있다.
바람직한 실시예에서, 상기 항체는 세포와 접촉할 때는 자성 마이크로비드와 결합되고 그리고 세포가 결합된 마이크로비드를 용액으로부터 자석으로 풀다운하여 제거된다.
이하 본 발명은 하기 실시예를 들어 예시하나, 이에 제한되지 않는다.
실시예
물질 및 방법
(i) 동물. 본 실험에 사용된 동물은, 달리 지시되지 않는 한, 이스라엘에 있는 할란 연구소(Harlan Laboratories), ISO 공인 SPF 연구소 동물 브리더(breeder) 및 와이즈만 연구소 (Weizmann Institute of Science)의 동물교배 센터 (Rehovot, Israel)에서 공급받았다. 모든 동물은 Weizmann 연구소의 ACUC(Animal Care and Use Committee)의 매뉴얼에 따라 다루었다.
( ii ) 척수 손상. 랫트(wild-type Sprague-Dawley rats)를 마취시켜(Ketamine 70 mg/kg, Bedford Laboratories, OH, US, Xylazine 10 mg/kg, VMP, Bioulab, France), T9에서 척추후궁절제하고(laminectomize), NYU 임팩터(Gruner (1992) A monitored contusion model of spinal cord injury in the rat. J Neurotrauma. Summer;9(2):123-6; discussion 126-8. Review)를 사용하여 노출된 척수위에 50 mm높이에서 10g 금속 로드(rod)를 떨어뜨려 타박상을 가하였다(중증 손상이 생긴 것으로 여겨짐). 마우스는 마취시키고, 이의 척수를 T12에서 척추후궁절제술을 하여, 척수에 잘 계측된 타박상을 가할 수 있는 장치인 인피니트 호리즌 척수 임팩터(Precision Systems and Instrumentation, Lexington, KY)를 사용하여 척추후궁절제술이 된 척수 위에 1초 동안 200kdyn의 힘을 가하였다.
( iii ) 스킨 제조 및 단핵구 와의 공배양. 단핵구를 제조하기 위하여 출혈시킨 동일한 도너(doner) 랫트의 등에서 작은 조각의 스킨(2 x 6 mm)를 취하였다. 상부 등의 털(fur)을 면도하여 컷팅하기 전에 에탄올로 스킨을 멸균시켰다. 5 ml DCCM-1 (Biological Industries, Beit HaEmek, Israel)에 5x106 세포의 균일한 단핵구 분획 (위 참조)와 함께 스킨 조직 두 조각을 두고, 5% CO2, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양 마지막에 스킨 조각을 제거하고 세포는 원심분리하여 회수하였다.
(v) BBB 스코어: 오픈-필드 로코모션(locomotion) BBB(Basso-Beattie-Bresnahan) 스코어[Basso, D.M., Beattie, M.S. & Bresnahan, J.C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J. Neurotrauma 12,1-12 (1995).]를 사용하여 랫트의 행동을 분석하였다. 마우스의 행동 분석은 오픈 필드에서의 뒷다리 운동 기능 측정을 위한 BMS(Basso Mouse Scale)[Basso DM, Fisher LC, Anderson AJ, Jakeman LB, McTigue DM, Popovich PG. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 2006 May;23(5):635-59]를 사용하여 수행하였다.
(vii) 통계 분석: 반복 측정 ANOVA를 사용하여 BBB 및 BMS 스코어링을 하고, 대조 t-테스트를 사용하여 매주 치료효과를 추적 비교하고, Holm 방버으로 다단계 비교에 대하여 보정하였다.
실시예
1 :
랫트에서
중증 척수 손상 후에
스킨
-활성화 대식세포
의
요추 천자(
lumbar
puncture
(
LP
)) 주사로 인한 기능 회복 촉진
우선, 본 발명자는 최소로 침습적인 방법으로 손상된 척수에 원하는 표현형을 가진 혈액-유래 단핵구의 수를 증강시키는, 임상적으로 가능한 방법을 연구하였다. 본 발명자는 스킨-활성화된 혈액-유래의 단핵구를 요추 천자(LP)를 통해 척수액(CSF)내로 주입하는 효능을 연구하였다.
[표 1]
야생형 스프래그-다우리(Sprague-Dawley) 랫트에게 심한 척수 타박상을 입혔다(물질 및 방법 참조). 8일 후, 0.5x106 또는 1x106 스킨-활성화된 대식세포(MQ) 또는 비히클(PBS)를 LP를 통해 장애를 입은 동물의 CSF 내에 주입하였다. 운동 회복을 촉진시키는 데에 용량 의존적 효능이 나타났으며, 대식세포를 최고 용량을 주입한 동물 그룹에서 로코모션의 유의한 향상이 관찰되었다(도 1, 표 1).
실시예
2 :척수 손상 후
마우스에게
비활성화된 골수 유래 마우스 단핵구의
CSF
내로 주사로 인한 기능 회복 촉진
나아가 본 발명자는 비활성화 골수 유래 단핵구를 ICS(intracerebro-ventricles)를 통해 CSF 내로 주입하면 손상된 척수 실질 (parenchyma)에 도달하는지 여부를 실험하였다. 야생형 마우스에게 척수 타박상을 가하였다(물질 및 방법 참조). 3일 후, 녹색 형광 단백질(GFP) 발현-나이브 골수 유래 단핵구(0.5x106 Cx 3 cr1 GFP/+ monocytes)를 분리하여 손상을 입은 동물에게 ICV 주입을 하여, 손상 부위에 주입된 세포가 존재하는지를 분석하였다. 주입 후 4일 손상부위를 면역 조직학적 분석하여 주입된 GFP 발현 세포가, 손상부위 가장자리와 인접한 곳에, 손상된 실질에 존재한다는 것이 알아냈다(결과는 나타내지 않음, 도면의 간단한 설명 부분 참조). 이어서 유사하게 처리한 동물을 로코모터 활성을 측정하여 모터 스케일(BMS)로 평가하였다: 마우스의 로코모션이 유의하게 향상된 것으로 관찰할 수 있는 바와 같이, 단핵구 풀이 증강되면서 자발적 회복 레벨을 초과하는 수준까지 회복되었다(도 2).
이러한 결과는, 비활성화 골수 유래 단핵구가 CSF에서 손상된 실질로 찾아갈 수 있고, 따라서 혈액-CSF 장벽이 단핵구가 자발적으로 손상된 CNS로 들어가는 경로일 수 있다는 것을 의미한다.
실시예
3 : 고-레벨의
CX
3
CR1
및 저-레벨의
CCR2
를 발현하는 인간
단핵
세포의
PBMC
로부터의 분리
인간에게 있어서, CD14 및 CD16의 발현여부로 단핵구를 세 가지 서브집단, 즉 CD14+CD16-, CD14+CD16+, 및 CD14dimCD16+ 로 정의한다. CD14+CD16- 단핵구는 80% 내지 90%의 혈액 단핵구를 나타내며 케모카인 수용체 CCR2를 고-레벨로 그리고 케모카인 수용체 CX3CR1 (the receptor of Fractalkine)를 저레벨로 발현한다. 이러한 주요 서브세트(subset)와는 대조적으로 인간 CD16+ 단핵구는 CX3CR1를 고 레벨로 CCR2를 저 레벨로 발현한다(Cros et al., 2010). Cross 등(2010)에 의하면, 유전자 발현 분석을 보면, 인간 CD14dimCD16+ 및 뮤린 패트롤링(murine patrolling) Gr1dim 단핵구 사이에 유사점이 있는 것으로 나타났다. CD14dimCD16+ 세포는 내인성 국소 서베일런스 (surveillance)와 자가면역 질환의 병인과 관련이 있는 보나파이드 단핵구 조직이다.
말초혈액단핵세포(PBMC)에서, 고 레벨의 CX3CR1 및 저 레벨의 CCR2를 발현하는 CD14dimCD16+ 세포를 분리하기 위하여, 본 발명자는 CCR2 음성 선택 (CCR2+ depletion) 및 CD14+ 양성 선택(CD14+)을 결합한 방법을 사용하였으며 반면 스킴 1에 나타난 바와 같이, PBMC에서 CD14+ 분리한 것을 대조군으로 사용하였다.
3.1
CD14
dim
CD16
+
세포 집단 강화(enrichment)
(i) 인간 말초 혈액으로부터 단핵 세포의 분리 : 후레쉬한 혈액(8 ml)을 건강한 기증자로부터 수집하여 PBS내 2.5% FCS로 희석하여, 피콜(ficoll) 구배(Ficoll-Paque plus, Amersham Biosciences)에 로딩하였다. 튜브를 20℃, 1000g 에서 20분간 원심분리하였다. 단핵 세포 상을 수집하여 PBS로 2번 세척하였다.
( ii ) CCR2 + 고갈: 우선 단핵세포를 FcR 차단 시약(2.5 ㎕/106 cells) (130-059-901, Miltenyi Biotec)으로 실온에서 15분동안 처리하여 Fc- 수용체를 차단시켰다. 그 후, 세척과정없이, 모노클론 항-인간 CCR2-바이오틴 시약(FAB151B, R&D Systems)을 첨가하여(10 ㎕/106 cells), 2℃-8℃에서 35분동안 배양하였다. 그후 상기 세포를 차가운 MACSTM 버퍼(1mM EDTA, 2% FCS in PBS)로 세척하고 스트렙타비딘 마이크로비드(130-048-101, Miltenyi Biotec)(20 ㎕/107 cells)를 2℃-8℃에서 20분간 첨가하였다. 상기 세포를 세척하여 0.5ml의 MACSTM 버퍼로 재-현탁시켰다. LD 컬럼(130-042-901, Miltenyi Biotec)을 매뉴얼에 따라 사용하여 CCR2+ 세포를 고갈시켰다.
( iii ) CD14 + 세포의 분리: 상기 세포를 MACSTM 버퍼에 재현탁시켜(80 ㎕/107 cells) CD14+ 마이크로비드(130-050-201, Miltenyi Biotec)(20 ㎕/107 cells)를 2℃-8℃에서 15분간 첨가하였다. 그 후, 상기 세포를 세척하여 0.5ml MACS 버퍼로 재현탁시켰다. LS 컬럼(130-042-401, Miltenyi Biotec)상에서 매뉴얼에 따라 자성 분리(magnetic separation)를 하여 CD14+ 세포를 양성 선택하였다.
( iv ) 인간 단핵 세포의 FACS ( Fluorescence - activated cell sorting ) 염색 모든 샘플을 제조자의 방법에 따라 염색하였다. 모든 샘플을 70㎛ 나일론 메쉬로 여과시켜 FCR 차단 시약(30 ㎕/106 cells)(130-059-901, Miltenyi Biotec)으로 실온에서 15분간 차단하였다. 이어 형광색소로 표지된 항-인간 모노클론 항체를 제조자의 방법에 따라 사용하였다: PerCP conjugated anti CD45 (345809, BD), FITC conjugated anti CD115 (FAB329F, R&D Systems), Pacific BlueTM conjugated anti CD14 (BLG-325616), Alexa Fluor®700 conjugated anti CD16 (BLG-302026), PE conjugated anti CX3CR1 (MBL- D070-5) 및 PerCP conjugated anti CCR2 (BLG-335303).
3.2
결 과
단핵구 집단(population)을 살아있는 세포 집단에서 분석하여(도 3A) 싸이트 스캐터를 사용하여 CD45+ 세포의 분포를 사용하여 확인하였다(도 3B), 가는 검은선으로 표시함). 단핵구 서브집단의 분포는 이들의 CD14 및 CD16 항원 발현으로 나타내었다(도 3C). 건강한 기증자로부터 얻은 PBMC로부터의 단핵구 서브집단을 FACS에 의한 CD14 및 CD16 염색에 따라 분석하면, 하기 서브집단의 분포가 나타난다: CD14+CD16- (80.5%), CD14+CD16+ (4.8%) 및 CD14dimCD16+ (3.5%), 도 3A-C. 흥미롭게도, CD14dimCD16+ 서브집단 역시, CSF-1 수용체에 속하며 골수 유래 단핵구를 특정화하는 마커 CD115로 염색되었다(도 3D).
건강한 기증자로부터 얻은 PBMC로부터의 단핵구 서브집단을 FACS에 의한 CCR2 및 CX3CR1 염색에 따라 분석하여보면, CD16을 발현하지 않는 단핵구(CD16-서브집단)는 CCR2를 높이 발현하며 반면 CD16을 발현하는 단핵구(CD14+CD16+ 및 CD14dimCD16+ 서브집단)는 CCR2는 낮게 그리고 CX3CR1는 높게 발현한다는 것으로 나타났다(도 4A-E).
이러한 결과에 따라 본 발명자는 CD16+ 세포의 서브집단을 강화시키기 위하여 CCR2+ 세포의 서브집단을 제거하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, CCR2+ 세포 고갈에 의해 CD14dimCD16+ 서브집단이 약 9배(8% 에서 73%으로) 증강되고 CD14+CD16+ 서브집단이 약 10배(1% 에서 10%로) 증강되었으나 반면 CD14+CD16- 서브집단은 약 5배(91% 에서 17%로) 감소한 것으로 나타났다.
척수 손상 후의 회복 과정에서의 CD16+ 단핵구의 역할을 연구하기 위하여, CD16+ 서브집단이 증강된 단핵구를 손상후 4일에 마우스에게 icv(CSF 내로) 주입하였다. 손상 후 4주까지 BMS 스케일 (scaling) 시스템을 사용하여 1주일에 2번 뒷다리(Hind-limb) 운동 능력을 모니터하였다. 비히클(PBS)로 처리된 대조군 동물은, BMS 스케일이 평균 약 2.5에 달하여, 시간이 지남에 따라 적당히 자발적으로 회복되는 것으로 나타났다. 처치가 된 그룹(CD16+ 증강된 단핵구)의 스코어는 손 상후 각 시점에서 대조군보다 낮았는데 이는 이들의 운동 능력이 대조군과 비교하여 감소하였다는 것을 나타낸다. 본 발명자는, 이러한 서브집단이, SCI 4일 후 동물의 CSF내에 주입할 때 자발적 회복을 약화시킨다고 결론을 내렸다(도 6).
회복에 대한 파괴적인 효과와는 반대로 본 발명자는 CD16+ 단핵구가, 총 단핵구 서브집단으로 처리하였을때, 분리 방법에 따라 척수손상 회복에 유익하다는 것을 발견하였다(도 7).
논의 ( Discussion ). 단핵구를 분리하기 위하여, 본 발명자는, 자성 분리를 근거로 하는 Miltenyi Biotec에 이해 개발된 MACS 기술을 사용하였다. 기본적으로, 혈액 샘플을 상이한 항체와 결합된 자성 마이크로비드로 표지하였다. 세포를 자기장내에 위치한 MACS 컬럼위에 로딩하였다. 자성으로 표지된 세포는 컬럼내에 잡혀 있는 반면 표지되지 않는 세포는 컬럼을 통과하여 나왔다. 자기장에서 컬럼을 제거시키면 잡혀있던 세포를 용출시킬 수 있는데, 이를 양성 선택이라 한다. 표지되지 않은 분획은, 음성 선택이라 하는데, 수집이 역시 가능하다.
단핵구는 두 가지 방법으로 분리하였다: 양성 또는 음성 선택. 양성 선택을 하기 위하여 본 발명자는 Miltenyi의 CD14 마이크로비드를 사용하였으며, 음성 선택을 하기 위하여 Miltenyi의 단핵구 분리 킷트 II를 사용하였다. 척수 손상에서 동물이 회복되는 데에는, 양성 선택을 통해 분리한 세포보다 음성 선택을 사용하여 분리한 단핵구가 더 좋고 더 많은 유익한 효과를 나타내는 것으로 보인다.
요약하면, 척수 손상 후 처리를 비교하여 보면, CD16은 유익한 혈액 단핵구(CD16-)와 파괴적인 혈액 단핵구(CD16+) 사이를 구별하는 마커로 사용할 수 있다. CD16- 단핵구는 전통적인 단핵구로 그리고 CD16+는 모든 단핵구의 단 10%만을 차지하는 향(pro) 염증성 단핵구로 알려져 있다.
실시예
4:
CD3
,
CD19
,
CD56
및
CD16
세포가 고갈된 단핵구
서브집단의
CSF
내로 주입에 의한 척수 손상 후의 마우스의 기능 회복 촉진
상기 결과를 감안하여, 본 발명자는 MACS 음성 선택 절차를 사용하여 CD16- 단핵구를 분리하는 절차를 개발하였다. T-세포, B-세포 및 NK 세포를 없애기 위하여 CD3, CD19 및 CD56이 접합된 마이크로비드로 PBMC를 표지하였다. 자성 컬럼을 통과하는 표지되지 않은 세포를 모았다. 상기 분획을 CD16 마이크로비드로 표지하여 다시 자성 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 통과하는 세포를 모은 후 FACS로 분석하기 위하여 CD14 및 CD16 형광 항체로 염색하였다. 왼쪽 도면이 분리전 PBMC(도 8A)를 그리고 오른쪽 도면(도 8B)이 상기한 바와 같은 음성 선택 후의 최종 생성물을 나타낸다. PBMC에서 총 라이브 세포의 19%는 단핵구(CD14+)이다. 단핵구 중에서 약 10%는 CD16+이다. 최종 생성물에서 라이브 세포의 약 90%는 단핵구이고, 이 중 CD16+가 0.1% 미만인 단핵구이다.
두 개의 서브집단은 인-비트로 자극 후에 다른 성숙 단계에 도달한 것으로 나타났으며(Carmen Sanchez-Torres, et. al. CD16+ and CD16- human blood monocyte subsets differentiate in vitro to dendritic cells with different abilities to stimulate CD4+ T cells. Int. Immunol. (2001) 13 (12): 1571-1581) 따라서 이로써 손상된 척수에 대한 효과가 다른 것을 설명할 수 있다.
본 발명자는 이어 CD1-누드 마우스에서 척수 손상 후의 기능적 결함이 감소하는 데에 대한 상기 서브 집단의 효과를 연구하였다. OSU ESCID 타박 장치(Ma M, Basso DM, Walters P, Stokes BT, Jakeman LB. Behavioral and histological outcomes following graded spinal cord contusion injury in the C57Bl/6 mouse. Exp Neurol. 2001 Jun;169(2):239-54)를 사용하여 조절된 중증 척수 손상을 마우스에게 가하였다. 손상 후 4일에 ICV 주입을 통하여 세포 또는 PBS를 CSF 내로 주입하였다. BMS(Basso Mouse Scale for Locomotion)를 사용하여 손상 후 4주 동안 1주일에 두 번씩 SCI후의 로코모터 회복을 측정하였다.
손상 후 처음 3주는 마우스에서 약학 자발적 로코모션 회복을 나타내었다. BMS에서 3 이상의 회복(앞발의 바닥 올려놓기 및 스탠스에 체중 지지와 앞발 바닥 올려놓기는 0 내지 9의 스케일에서 4점을 기록함) 은 유의한 기능 회복으로 간주되었다. 정제된 단핵구로 처리하면 동물의 로코모터 회복 속도가 증가하였다(도 9). PBS 처리된 대조군에서 14%(14 마리 중 2 마리)가 회복된 것과 비교하면, 단핵구 처리된 동물 중에서 42%가 회복되었다(12 마리 중 5 마리).
참고문헌
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Claims (28)
- 중추신경계 (Central Nervous System, CNS) 손상 치료에 사용되는, 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포가 결여된 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포.
- 제 1 항에 있어서, 상기 서브집단 세포는 추가로 실질적으로 CD16+ 세포가 결여된, 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포.
- 중추신경계 손상 치료에 사용되는, 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 및 CD16+ 세포가 결여된 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포.
- 제 1 항 또는 제 3 항에서, 실질적으로 CD14+ 세포가 강화된, 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중추신경계 손상에 의해 야기되는 신경 퇴행성 치료에 사용되는, 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 척수 손상의 치료에 사용되는, 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포.
- 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 치료가 척수 조직 복원, 기능 회복 또는 상기 모두를 촉진하는 것을 포함하는 것인, 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CNS 손상은 둔기 외상, 관통성 외상, 두부 직접 또는 간접 타격, 신경외과 수술 또는 기타 처치 동안의 지속적 외상과 같은 외상, 또는 출혈성 뇌졸중 또는 허혈성 뇌졸중과 같은 뇌졸중인 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서브집단 세포는 자가유래인, 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서브집단 세포는 동종이계인, 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포.
- 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 서브집단 세포는 주사제로 제형화된 것인, 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포.
- 제 11 항에 있어서, 상기 말초혈액단핵세포의 서브집단은 뇌척수액 (CSF, cerebro spinal fluid)으로의 주사제로 제형화된 것인, 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포.
- CNS 손상 치료에 사용되는, 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포가 결여된 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포를 포함하는 조성물.
- 제 13 항에 있어서, 상기 서브집단 세포는 추가로 실질적으로 CD16+ 세포가 결여된 것인, 조성물.
- CNS 손상 치료에 사용되는, 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 및 CD16+ 세포가 결여된 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포를 포함하는 조성물.
- 제 13 항 또는 제 15 항에 있어서, 상기 말초혈액단핵세포 서브집단 세포는 실질적으로 CD14+ 세포가 강화된 것인, 조성물.
- 제 13 항 또는 제 15 항에 있어서, 상기 말초혈액단핵세포 서브집단 세포는 주사제에 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체에 현탁된 것인, 조성물
- 제 17 항에 있어서, 상기 주사제가 CSF로 투여되는 것인, 조성물.
- 제 18 항에 있어서, 상기 CSF로의 투여는 척수강내 주사, 요추천자(LP, lumbar puncture), 시스터나 마그나(CM, Cisterna Magna))을 통한 주사, 뇌실 (ICV,intracerebroventricular) 주사, 또는 이들의 조합에 의한 것인, 조성물.
- 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포가 결여된 말초혈액단핵세포서브집단 세포의 유효한 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 CNS 손상을 치료하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 상기 말초혈액단핵세포 서브집단 세포는 추가로 실질적으로 CD16+ 세포가 결여된 것인, 방법.
- 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+세포 및 CD16+ 세포가 결여된 말초혈액단핵세포 서브집단 세포의 유효한 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 CNS 손상을 치료하는 방법.
- 제 20 항 또는 22 항에 있어서, 상기 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포는 실질적으로 CD14+ 세포가 강화된 것, 방법.
- 제 23 항에 있어서, 상기 방법은 상기 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포를 CSF 로 주입하는 것을 포함하는 것인, 방법.
- (i) 혈액에서 단핵 세포를 분리하고,
(ii) 각각이 마이크로 비드와 연결되어 있는 항- CD3+ 항체, 항-CD19+ 항체 및 항-CD56+ 항체와 (i)의 단핵 세포를 접촉시켜 상기 세포가 상기 마이크로비드와 결합하도록 하고 상기 마이크로비드를 제거함으로써, 단핵세포에서 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포를 제거하고,
그 결과 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포가 결여된 인간 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포를 혈액으로부터 수득하는 것을 포함하는, 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포가 결여된 인간 말초혈액단핵세포의 서브집단을 혈액으로부터 분리하는 방법.
- (iii) 혈액에서 단핵 세포를 분리하고;
(iv) 각각이 마이크로비드와 연결되어 있는 항- CD3+ 항체, 항-CD19+ 항체, 항-CD56+ 항체 및 CD16+항체와 (iii)의 단핵 세포를 접촉시켜 상기 세포가 상기 마이크로비드와 결합하도록 하고 상기 마이크로비드를 제거함으로써, 단핵세포에서 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포를 제거하고,
그 결과 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포가 결여된 인간 말초혈액단핵세포의 서브집단 세포를 혈액으로부터 수득하는 것을 포함하는 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포가 결여된 인간 말초혈액단핵세포의 서브집단을 혈액으로부터 분리하는 방법.
- 제 26 항에 있어서,
상기 단계 (iv) 단계는, (v) (i)의 단핵 세포로부터 CD3+ 세포, CD19+ 세포 및 CD56+ 세포를 제거하고 그 결과 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포가 결여된 인간 말초 혈액 단핵세포의 서브집단을 혈액으로부터 수득하고; 그리고
(vi) (v)의 PMBC 집단으로부터 CD16+ 세포를 제거하여, 그 결과 실질적으로 CD3+ 세포, CD19+ 세포, CD56+ 세포 및 CD16+ 세포가 결여된 인간 PMBC 서브집단을 혈액으로부터 수득하는 것을 포함하는 하위-단계를 포함하는 것인 방법.
- 제 27 항에 있어서, 상기 (iv) 단계는 단일 단계로 수행되는 것인, 방법.
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