ES2603803T3 - Nuevas sustancias fisiológicamente activas - Google Patents

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ES2603803T3
ES2603803T3 ES15157945.5T ES15157945T ES2603803T3 ES 2603803 T3 ES2603803 T3 ES 2603803T3 ES 15157945 T ES15157945 T ES 15157945T ES 2603803 T3 ES2603803 T3 ES 2603803T3
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Yoshihiko Kotake
Jun Niijima
Yoshio Fukuda
Mitsuo Nagai
Mikie Regina Kanada
Takashi Nakashima
Masashi Yoshida
Toshio Tsuchida
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Eisai R&D Management Co Ltd
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Abstract

(8E,12E,14E)-7-((4-Cicloheptilpiperacin-1-il)carbonil)oxi-3,6,16,21-tetrahidroxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,19- epoxitricosa-8,12,14-trien-11-ólido.

Description

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DESCRIPCION
Nuevas sustancias fisiologicamente activas Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un compuesto macrolido anular de 12 miembros util como un medicamento, a la preparacion del mismo y al uso del mismo.
Antecedentes de la invencion
Compuestos que tienen citotoxicidad se han usado como agentes antitumorales, y se han llevado a cabo muchos cribados que usan la citotoxicidad como un mdice. Como resultado, la mayona de los agentes antitumorales preexistentes afectan a las celulas cancerosas y simultaneamente a tejidos normales en los que es activa una proliferacion de celulas, por ejemplo, a la medula osea, el epitelio intestinal y similares. Asf, todavfa no se ha conseguido suficientemente la mejora de la calidad de vida de los pacientes.
Ademas, aunque se puede esperar que los tratamientos mediante los agentes antitumorales sean bastante eficaces para la leucemia, no siempre se puede decir que sean eficaces para un cancer solido. Por lo tanto, se demanda intensamente proporcionar agentes antitumorales que sean eficaces para el cancer solido y muy seguros.
Se han llevado a cabo cribados para productos de fermentacion de un microorganismo usando la citotoxicidad in vitro como un mdice, esperando que se pudieran usar como agentes antitumorales. Se han encontrado muchos compuestos que tienen citotoxicidad, sin embargo, la mayona de ellos muestran actividades citotoxicas solo in vitro, y pocos compuestos de estos muestran actividades antitumorales in vivo, y muy pocos compuestos exhiben eficacia para el cancer solido.
Divulgacion de la invencion
El objetivo de la presente invencion es encontrar compuestos que muestren actividad antitumoral no solo in vitro sino tambien in vivo y tengan actividades antitumorales para el cancer solido a partir de productos de fermentacion de un microorganismo o derivados de los mismos.
Se considera que la tumorigenesis de una celula normal esta provocada por que se produce la mutacion de un gen en la celula y se expresa un gen anormal. Segun esto, los presentes inventores han realizado investigaciones intensivas basadas en la inferencia de que el crecimiento de una celula tumoral se puede suprimir al cambiar la expresion genica de la celula tumoral, a saber, el crecimiento de la celula tumoral se puede controlar al cambiar la expresion genica de un oncogen o un gen supresor de tumor, o al cambiar la expresion genica implicada en el ciclo celular. Los presentes inventores han considerado que un compuesto que cambie la expresion genica, en particular, un compuesto que suprima la produccion de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) en una condicion hipoxica podna suprimir la angiogenesis por un tumor y tiene actividades antitumorales para cancer solido. A continuacion, llevaron a cabo un rastreo para productos de fermentacion de un microorganismo y derivados de los mismos usando la produccion de VEGF mediante celulas U251 bajo estimulacion hipoxica como un mdice. Como resultados, los inventores han encontrado nuevos compuestos fisiologicamente activos, compuestos macrolidos anulares de 12 miembros, a saber 11107, y analogos de los mismos que suprimen la produccion de VEGF con una condicion hipoxica in vitro, y ademas suprimen el crecimiento de un tumor solido in vivo.
Los presentes inventores han encontrado ademas que 11107D entre los 11107 analogos es estable incluso en solucion acuosa, y que los compuestos obtenidos mediante modificaciones qmmicas de 11107D (posteriormente en la presente memoria, estos se denominan derivados de 11107D) heredan la propiedad de estabilidad en solucion acuosa de 11107D e inhiben el crecimiento de celulas de tumores solidos en experimentos in vivo en un grado mucho mayor. La presente invencion se ha efectuado basandose en estos hallazgos.
Como una tecnica relacionada de un compuesto macrolido anular de 12 miembros que es muy estructuralmente similar a los compuestos de la presente invencion, se menciona un compuesto macrolido anular de 12 miembros FD- 895 (documento JP-A 4-352783) representado por la formula (XIV):
imagen1
La publicacion divulga que FD-895 tiene actividades inhibidoras del crecimiento in vitro contra celulas de leucemia de raton P388, celulas de leucemia de raton L-1210 y celulas de leucemia humana HL-60 en medio RPM-1640 (columna 6, Tabla 2). Sin embargo, se ha presentado que FD-895 no mostraba actividades antitumorales en un experimento in vivo usando celulas de leucemia de raton P388 (Seki-Asano M. y cols, J. Antibiotics, 47, 1395-1401, 5 1994).
Ademas, FD-895 es inestable en una solucion acuosa segun se describe posteriormente y se espera que sea inapropiado para mezclar con una solucion en infusion durante la administracion. Asf, no se puede decir que FD-895 tenga suficientes cualidades como un agente antitumoral.
10
Esto es, la presente invencion se refiere a:
(1) (8E,12E,14E)-7-((4-Cicloheptilpiperacin-1-il)carbonil)oxi-3,6,16,21-tetrahidroxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,19- epoxitricosa-8,12,14-trien-11 -olido;
(2) un medicamento que comprende el compuesto descrito en (1), una sal farmacologicamente aceptable del mismo 15 o un hidrato de ellos como un ingrediente activo;
(3) una composicion farmaceutica que comprende el compuesto descrito en (1), una sal farmacologicamente aceptable del mismo o un hidrato de ellos como un ingrediente activo;
(4) el medicamento descrito en (2), que es un agente terapeutico para tratar un cancer solido;
(5) el medicamento descrito en (4), en el que el cancer solido es cancer de pulmon, tumor cerebral, cancer de 20 mama, cancer de prostata, cancer ovarico, cancer de colon o melanoma;
(6) uso del compuesto descrito en (1), una sal farmacologicamente aceptable del mismo o un hidrato de ellos, para la preparacion de un medicamento para tratar canceres solidos;
(7) uso segun (6), en el que el cancer solido es cancer de pulmon, tumor cerebral, cancer de mama, cancer de prostata, cancer ovarico, cancer de colon o melanoma;
25 (8) el compuesto segun (1), una sal farmacologicamente aceptable del mismo o un hidrato de ellos para el uso en
un metodo para tratar canceres solidos;
(9) el compuesto segun (8), en el que el cancer solido es cancer de pulmon, tumor cerebral, cancer de mama, cancer de prostata, cancer ovarico, cancer de colon o melanoma.
En la presente memoria descriptiva, la formula qmmica del compuesto de la presente invencion se ilustra como una 30 formula qmmica planimetrica por comodidad, pero el compuesto puede incluir ciertos isomeros extrafdos de la formula qmmica. La presente invencion puede incluir todos los isomeros y mezclas de los isomeros tales como un isomero geometrico que se genera a partir de la configuracion del compuesto, un isomero optico basado en un carbono asimetrico, un rotamero, un estereoisomero y un tautomero. La presente invencion no se limita a la descripcion conveniente de la formula qmmica, y puede incluir cualquiera de los isomeros o una mezcla de los 35 mismos. Segun esto, cuando el compuesto de la presente invencion tiene un carbono asimetrico en la molecula, y existen su sustancia opticamente activa y racemato, se incluye uno cualquiera. Ademas, cuando existen cristales polimorficos, la forma cristalina de la presente invencion no se limita espedficamente a una forma, y una cualquiera de las formas cristalinas puede ser individual o una mezcla de las formas cristalinas. El compuesto segun la presente invencion o una sal del mismo puede ser un anhidrato o un hidrato, y ambos se incluyen en la presente invencion. El 40 metabolito que se genera in vivo mediante la descomposicion del compuesto segun la presente invencion y el profarmaco del compuesto segun la presente invencion o una sal del mismo tambien se incluyen en la presente invencion.
El compuesto de la presente invencion se caracteriza estructuralmente por la cadena lateral en la posicion 6 y/o la 45 cadena lateral en la posicion 7.
Posteriormente, se ilustrara la preparacion del compuesto segun la presente invencion.
El compuesto de la presente invencion se puede preparar al cultivar una cepa perteneciente al genero Streptomyces 50 que tiene una capacidad de producir la sustancia bioactiva 11107D [el compuesto de la formula (I), en la que R3, R6 y R21 son grupos hidroxilo, y R7 es un grupo acetoxi] bajo condiciones aerobicas, recoger el compuesto de las
celulas y el cultivo del microorganismo, y modificar qmmicamente el compuesto obtenido como un compuesto clave segun un procedimiento convencional.
imagen2
5 Inicialmente, el procedimiento para la preparacion de 11107D se elucidara posteriormente.
La siguiente cepa de microorganismo depositada se puede usar para que el microorganismo produzca 11107D. La cepa se deposito internacionalmente en International Patent Organism Depositary (IPOD) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 10 305-8566 Japon). Espedficamente, Streptomyces sp. Mer-11107 se deposito como FERM P-18144 en the National
Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japon). Ademas, esta se transfirio a International Deposit FERM BP-7812 en International Patent Organism Depositary (IPOD) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japon).
15
La cepa para producir 11107D no esta espedficamente limitada y tambien incluye variantes de tales cepas, con tal de que la cepa pertenezca al genero Streptomyces y tenga la capacidad de producir 11107D. Ejemplos de la cepa son Streptomyces sp. A-1532, Streptomyces sp. A-1533 y Streptomyces sp. A-1534, ademas de la cepa susodicha. Estas cepas tambien se depositaron internacionalmente en International Patent Organism Depositary (IPOD) 20 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japon) como FERM BP-7849, FERM BP-7850 y FERM BP-7851, respectivamente.
Se realizara posteriormente la descripcion detallada de 1. la propiedad del microorganismo separado, 2. el metodo 25 de fermentacion del microorganismo y 3. el metodo de purificacion de una sustancia activa en la preparacion de 11107D.
1. La propiedad del microorganismo separado
Como la cepa para el uso en la presente invencion, se espera que se pueda usar una cualquiera de las cepas pertenecientes al genero Streptomyces y que tienen una capacidad para producir 11107D. Sin embargo, como una 30 cepa tfpica usada en la presente invencion, se ejemplifica una cepa que fue denominada "cepa Mer-11107" por los inventores. Las propiedades taxonomicas de esta cepa son como sigue.
(1) Caractensticas morfologicas
Hifas aereas que forman espirales se extienden desde una hifa vegetativa en esta cepa. Una cadena de esporas que consiste en aproximadamente de 10 a 20 esporas columnares se forma en el borde de las hifas aereas 35 maduradas. El tamano de las esporas es aproximadamente 0,7 * 1,0 pm, la superficie de las esporas es lisa y no se observan organos espedficos tales como esporangio, esclerocio y flagelo.
(2) Caractensticas de cultivo sobre diversos medios
Las caractensticas de cultivo de la cepa despues de la incubacion a 28°C durante dos semanas sobre diversos medios se muestran posteriormente. El tono de color se describe mediante el nombre y los codigos de color que se 40 muestran entre parentesis del Color Harmony Manual (Container Corporation of America).
1) Medio en agar de extracto de levadura-extracto de malta
La cepa creda bien, las hifas aereas credan sobre la superficie y se observaron esporas de color gris claro ("Light gray"; d). El reverso de la colonia era "Light melon yellow" (3ea). No se produda pigmento soluble.
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2) Medio en agar de harina de avena
La cepa creda en el nivel medio, las hifas aereas credan ligeramente sobre la superficie y se observaron esporas grises ("Gray"; g). El reverso de la colonia era "Nude tan" (4gc) o "Putty" (1 1/2ec). No se produda pigmento soluble.
3) Medio en agar de sal inorganica-almidon
La cepa creda bien, las hifas aereas credan sobre la superficie y se observaban esporas grises ("Gray"; e). El reverso de la colonia era "Fawn" (4ig) o "Gray" (g). No se produda pigmento soluble.
4) Medio en agar de glicerol-asparagina
La cepa creda bien, las hifas aereas credan sobre la superficie y se observaban esporas blancas ("White"; a). El reverso de la colonia era "Pearl pink" (3ca). No se produda pigmento soluble.
5) Medio en agar de peptona-extracto de levadura-hierro
La cepa creda mal y las hifas aereas no credan sobre la superficie. El reverso de la colonia era "Light melon yellow" (3ea). No se produda pigmento soluble.
6) Medio en agar de tirosina
La cepa creda bien, las hifas aereas credan sobre la superficie y se observaban esporas blancas ("White"; a). El reverso de la colonia era "Pearl pink" (3ca). No se produda pigmento soluble.
(3) Utilizacion de diversas fuentes de carbono
Diversas fuentes de carbono se anaden en medio en agar de Pridham-Gottlieb, se muestra posteriormente el crecimiento de la cepa despues de la incubacion a 28°C durante dos semanas.

1) L-arabinosa ±

2) D-xilosa ±

3) D-glucosa +

4) D-fructosa +

5) sacarosa +

6) inositol +

7) L-ramnosa -

8) D-manitol +

9) D-rafinosa +
(+: positivo, ±: ligeramente positivo, -: negativo)
(4) Propiedades fisiologicas
Las propiedades fisiologicas de la cepa son como se muestran posteriormente.
(a) Intervalo de temperatura de crecimiento (medio en agar de extracto de levadura-extracto de malta, incubacion durante 2 semanas) 12°C a 37°C
(b) Intervalo de temperature optima (medio en agar de extracto de levadura-extracto de malta, incubacion durante 2 semanas) 21°C a 33°C
(c) Licuefaccion de gelatina (medio en agar de glucosa-peptona-gelatina) negativa
(d) Coagulacion de leche (medio en agar de leche desnatada) negativa
5 (e) Peptonizacion de leche (medio en agar de leche desnatada) negativa
(f) Hidrolisis de almidon (medio en agar de sal inorganica-almidon) positiva
(g) Formacion de pigmento melanoide (medio en agar de peptona-extracto de levadura-hierro) negativa (medio de tirosina) negativa
(h) Produccion de sulfuro de hidrogeno (medio en agar de peptona-extracto de levadura-hierro) negativa
10 (i) Reduccion de nitrato (caldo que contiene 0,1% de nitrato potasico) negativa
(j) Tolerancia a cloruro sodico (medio en agar de extracto de levadura-extracto de malta, incubacion durante 2 semanas) crecimiento con un contenido de sal de 4% o menos
(5) Quimiotaxonoirna
Se detectaron acido LL-diaminopimelico y glicina de la pared celular de la presente cepa.
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Se considera que la presente cepa es una cepa del genero Streptomyces a partir de las susodichas caractensticas microbianas. Segun esto, los presentes inventores han denominado la presente cepa microbiana Streptomyces sp. Mer-11107 y han depositado la cepa como FERM P-18144 en the National Institute of Bioscience and Human- Technology Agency of Industrial Science and Technology.
20 2. Metodo de fermentacion para producir el microorganismo
La sustancia fisiologicamente activa 11107D segun la presente invencion se puede producir al inocular la cepa sobre un medio de fuente de nutricion y llevar a cabo fermentacion aerobica. La cepa para producir la sustancia fisiologicamente activa 11107D no se limita a la susodicha cepa, y se puede usar en la presente invencion cualquier cepa perteneciente al genero Streptomyces y que tenga la capacidad de producir 11107D.
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El metodo de fermentacion del susodicho microorganismo es segun el metodo de fermentacion general del microorganismo, pero preferiblemente se lleva a cabo bajo condiciones aerobicas tales como cultivo con agitacion o fermentacion con aireacion-agitacion usando medio lfquido. El medio usado para el cultivo puede ser un medio que contiene una fuente de nutricion que puede ser utilizada por un microorganismo perteneciente al genero 30 Streptomyces, por lo tanto se puede utilizar la totalidad de diversos medios sinteticos, semisinteticos u organicos y similares. Como la fuente de carbono en la composicion del medio, se puede usar uno solo o una combinacion de glucosa, sacarosa, fructosa, glicerina, dextrina, almidon, melazas, aceite de soja y similares. Como la fuente de nitrogeno, se pueden usar una sola o una combinacion de fuentes de nitrogeno organico tales como Pharma Media, peptona, extracto de carne, polvo de soja, casema, un aminoacido, extracto de levadura y urea, y fuentes de 35 nitrogeno inorganico tales como nitrato sodico y sulfato amonico. Adicionalmente, por ejemplo, se pueden anadir y usar sales tales como cloruro sodico, cloruro potasico, carbonato calcico, sulfato magnesico, fosfato sodico, fosfato potasico y cloruro de cobalto; sales de metales pesados, vitaminas tales como vitamina B o biotina, si es necesario. Ademas, cuando la formacion de espuma es notable durante el cultivo, se pueden anadir al medio apropiadamente diversos agentes antiespumantes, segun sea necesario. Cuando se anade el agente antiespumante, se requiere 40 fijarlo a una concentracion que no afecte adversamente a la produccion de una sustancia buscada y, por ejemplo, la concentracion de uso es deseablemente 0,05% o menos.
La condicion de cultivo se puede seleccionar apropiadamente dentro del intervalo en el que la cepa microbiana crece bien y puede producir la susodicha sustancia. Por ejemplo, el pH de un medio es aproximadamente 5 a 9, y 45 preferiblemente cerca de neutro en general. La temperatura de fermentacion se mantiene habitualmente a de 20°C a 40°C y preferiblemente de 28°C a 35°C. El penodo de fermentacion es de aproximadamente 2 a 8 dfas, y habitualmente de aproximadamente 3 a 5 dfas. Las susodichas condiciones de fermentacion se pueden cambiar adecuadamente segun el tipo y la propiedad del microorganismo usado, las condiciones externas y similares, y es
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innecesario decir que se puede seleccionar una condicion optima. La sustancia fisiologicamente activa 11107D de la presente invention que se acumulaba en el caldo de cultivo se puede recoger mediante procedimientos de separation habituales utilizando su propiedad, tales como un metodo de extraction con disolvente y un metodo de resina absorbente.
La sustancia fisiologicamente activa 11107D tambien se puede preparar, por ejemplo, al usar un microorganismo perteneciente al genero Streptomyces (por ejemplo, la cepa de Streptomyces sp. AB-1704 (FERM P-18999)) y usar sustancia 11107B (el compuesto descrito en el Ejemplo A4 del documento WO 02/060890, segun se muestra en los Ejemplos de referencia 6 a 10.
3. Metodo de purification para la sustancia bioactiva
Metodos generales para la separacion y la purificacion que se usan para el aislamiento de metabolitos microbianos del caldo de cultivo se pueden emplear a fin de recoger 11107D del medio de cultivo despues de la fermentation. Por ejemplo, pueden corresponder a todos los metodos tales como extraccion mediante un disolvente organico, fipicamente usando metanol, etanol, butanol, acetato de etilo o cloroformo; diversos tipos de cromatografia de intercambio ionico; cromatografia de filtration en gel usando Sephadex LH-20; el tratamiento de adsorcion y desorcion mediante cromatografia de absorcion, fipicamente usando carbono activo o gel de sflice o mediante cromatografia en capa fina; o cromatografia de fiquidos de alta resolution, fipicamente usando una columna de fase inversa, para esta. Ademas, los metodos de purificacion para 11107D no se limitan espedficamente a los metodos mostrados en la presente memoria.
El compuesto 11107D se puede aislar y purificar al usar estos metodos solos o en combination o usandolos repetidamente.
Posteriormente, se elucidara la preparation para el compuesto de la presente invencion.
El compuesto de la presente invencion se puede sintetizar a partir de 11107D aislado y purificado como un compuesto de partida segun se describe en el ejemplo experimental posteriormente. La introduction y la retirada de un grupo protector para un grupo hidroxilo se puede llevar a cabo segun se necesite mediante el metodo descrito en el documento (Protective Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene, John Wiley & Sons, Inc. 3a Edition) o un metodo analogo al mismo, aunque dependiendo del tipo del grupo protector y la estabilidad del compuesto con relation a la preparacion, El compuesto de la presente invencion se puede preparar al usar las reacciones de introduccion y retirada para el grupo protector de hidroxilo y la preparacion descrita anteriormente en una combinacion adecuada. Mas espedficamente, el compuesto de la presente invencion se puede preparar al usar la preparacion para un derivado de uretano.
Posteriormente, se elucidaran metodos sinteticos para preparar el compuesto de la presente invencion.
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3A 6A 16A 21A
En la formula, R , R , R y R representa cada uno un atomo de hidrogeno o un grupo protector, con la condiciOn de que R3A, R6a, R16A y R21A no representen simultaneamente atomos de hidrOgeno; R3B, R6B, R16B y R21B representa cada uno un atomo de hidrOgeno, un grupo protector o un grupo representado por la formula RfO-CO- (en la que RF representa un grupo arilo C6-14 opcionalmente sustituido), con la condiciOn de que R3B, R6B, R16B y R21B
Op A Op 0-1 p
no representen simultaneamente atomos de hidrOgeno; R , R , R y R representa cada uno un atomo de hidrOgeno, un grupo protector o un grupo representado por la formula Rn1RN2N-CO- (en la que RN1 y RN2 representa
on fin 1 fin 01 n
cada uno el grupo que se define anteriormente); y R , R , R y R representa cada uno un atomo de hidrOgeno
o un grupo representado por la formula RN1RN2N-CO- (en la que RN1 y RN2 representa cada uno el grupo que se define anteriormente).
La etapa A1 es una etapa para preparar el compuesto de la formula (IA). Esta etapa se lleva a cabo al proteger el grupo o los grupos hidroxilo de 11107D.
La reacciOn para proteger el grupo o los grupos hidroxilo se lleva a cabo segun un procedimiento muy conocido en la quimica sintetica organica, aunque seleccionandose dependiendo del tipo del grupo protector.
Ejemplos del grupo protector son 1-etoxietilo, tetrahidropiranilo, 1-metil-1-metoxietilo, 1-(2-cloroetoxi)etilo, 1- metoxiciclohexilo, 4-metoxitetrahidropiranilo, 4-metoxitetrahidrotiopiranilo, S,S-diOxido de 4- metoxitetrahidrotiopiranilo, metoximetilo, metiltiometilo, metoxietoximetilo, tricloroetoximetilo, trimetilsililetilo, trimetilsililetoximetilo, terc-butildimetilsililo, trietilsililo, dietilisopropilsililo, trimetilsililo, triisopropilsililo, metil-di-terc- butilsililo, difenilmetilsililo, bencilo, p-metoxibencilo, p-metilbencilo, p-nitrobencilo, p-clorobencilo y trifenilmetilo. Todos o parte de los grupos hidroxilo pueden estar apropiadamente protegidos por estos grupos protectores.
Por ejemplo, derivados protegidos en el hidroxilo protegidos mediante 1-etoxietilo, tetrahidropiranilo, 1- metoxiciclohexilo, 4-metoxitetrahidropiranilo, 4-metoxitetrahidrotiopiranilo o S,S-diOxido de 4- metoxitetrahidrotiopiranilo se pueden sintetizar al tratar 11107D con un eter vinflico correspondiente tal como etil- vinil-eter o dihidropirano en presencia de un acido. Ejemplos del acido son acidos generales incluyendo acidos organicos tales como p-toluenosulfonato de piridinio (PPTS), acido p-toluenosulfOnico, acido canforsulfOnico, acido acetico, acido trifluoroacetico o acido metanosulfOnico; y sales inorganicas tales como cloruro de hidrOgeno, acido mtrico, acido clorhidrico o acido sulfurico. Entre ellos, un ejemplo preferido es el p-toluenosulfonato de piridinio (PPTS), acido p-toluenosulfOnico o acido canforsulfOnico. El disolvente usado en la reacciOn no esta espedficamente limitado, pero es deseable un disolvente inerte que no pueda reaccionar facilmente con una materia prima. Ejemplos de tales disolventes son eteres tales como tetrahidrofurano, eter dietflico, eter diisopropflico, dioxano y dimetoxietano; hidrocarburos halogenados tales como diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono y 1,2-dicloroetano; hidrocarburos tales como hexano, benceno y tolueno; cetonas tales como acetona y metil-etil- cetona; nitrilos tales como acetonitrilo; amidas tales como N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, N-metil-2- piridona y hexametilfosforamida; y sulfOxidos tales como dimetilsulfOxido, de los que un ejemplo preferido es diclorometano, cloroformo o tetrahidrofurano. El tiempo de reacciOn es 10 minutos a 5 dias y es preferiblemente 1 dia a 2 dias. La temperatura de reacciOn es una temperatura de -78°C hasta el calentamiento bajo reflujo y es preferiblemente temperatura ambiente. Las cantidades del eter vinflico y el acido usadas en la reacciOn son de 1 a 200 equivalentes y de 0,05 a 2 equivalentes, y preferiblemente de 30 a 50 equivalentes y de 0,1 a 0,3 equivalentes, respectivamente, con respecto a 11107D.
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Ejemplos de otros grupos protectores son metoximetilo, metiltiometilo, metoxietoximetilo, tricloroetoximetilo, trimetilsililetilo, trimetilsililetoximetilo, terc-butildimetilsililo, trietilsililo, trimetilsililo, dietilisopropilsililo, triisopropilsililo, di-terc-butilmetilsililo, difenilmetilsililo, bencilo, p-metoxibencilo, p-metilbencilo, p-nitrobencilo, p-clorobencilo y trifenilmetilo. Tales derivados protegidos en el hidroxilo se pueden sintetizar al hacer reaccionar una materia prima con un cloruro, bromuro o trifluorometanosulfonato de los grupos protectores respectivos en presencia de una base. La base es una base organica o base inorganica general. Ejemplos de la base organica son una base aromatica tal como imidazol, 4-(N,N-dimetilamino)piridina (la 4-dimetilaminopiridina, N,N-dimetilaminopiridina y dimetilaminopiridina usada en la presente memoria descriptiva tiene el mismo significado), piridina, 2,6-lutidina o colidina; una amina terciaria tal como N-metilpiperidina, N-metilpirrolidina, trietilamina, trimetilamina, diisopropiletilamina, ciclohexildimetilamina, N-metilmorfolina o 1,8-bis(dimetilamino)naftaleno; una amina secundaria tal como diisobutilamina o diciclohexilamina; un alquil-litio tal como metil-litio o butil-litio; un alcoxido metalico tal como metoxido sodico o etoxido sodico. Ejemplos de la base inorganica son un hidroxido de metal alcalino tal como hidruro sodico o hidruro potasico; un hidroxido de metal alcalinoterreo tal como hidruro calcico; un hidroxido de metal alcalino tal como hidroxido sodico o hidroxido potasico; un carbonato de metal alcalino tal como carbonato sodico, carbonato potasico o carbonato de cesio; y un hidrogenocarbonato de metal alcalino tal como bicarbonato sodico. Ejemplos preferidos de la base para la proteccion del grupo hidroxilo por un grupo protector sililo son una base aromatica tal como imidazol o 4-dimetilaminopiridina; y una amina terciaria tal como trietilamina. El disolvente usado en la reaccion no esta espedficamente limitado, pero es deseable uno que no reaccione facilmente con una materia prima. Ejemplos de tales disolventes son los susodichos disolventes inertes, de los que un ejemplo preferido es tetrahidrofurano, diclorometano o N,N-dimetilformamida. El tiempo de reaccion es de 10 minutos a 3 dfas y es preferiblemente de 1 dfa a 2 dfas. La temperatura de reaccion es una temperatura de -78°C hasta calentamiento bajo reflujo y es preferiblemente de -10°C a 50°C. Las cantidades del cloruro, el bromuro o el trifluorometanosulfato y la base usadas en la reaccion son de 1 a 20 equivalentes y de 0,5 a 30 equivalentes, preferiblemente de 1 a l5 equivalentes y de 0,5 a 20 equivalentes, respectivamente, con respecto a 11107D.
Los grupos hidroxilo de 11107D se pueden proteger selectivamente al seleccionar el reactivo y la equivalencia del mismo para el uso en la proteccion de los grupos hidroxilo. Por ejemplo, un compuesto en el que los grupos hidroxilo en la posicion 3 y la posicion 21 estan protegidos selectivamente se puede obtener al llevar a cabo la reaccion a temperatura ambiente usando clorotrietilsilano, trietilamina y 4-dimetilaminopiridina en diclorometano o usando terc- butilclorodimetilsilano e imidazol en N,N-dimetilformamida. En este procedimiento, por ejemplo, el grupo hidroxilo en la posicion 3 se puede proteger selectivamente al controlar la equivalencia de clorotrietilsilano o terc- butilclorodimetilsilano. Ademas, es posible que dos o tres de los cuatro grupos hidroxilo esten protegidos por un grupo sililo, y a continuacion los otros dos o el otro grupo hidroxilo se protege mediante el susodicho etoxietilo o similares.
La etapa A2 es una etapa para preparar el compuesto de la formula (IIA). Esta etapa se lleva a cabo al convertir el grupo acetoxi del compuesto de la formula (IA) en el grupo hidroxilo mediante el tratamiento de una base en un disolvente inerte.
Ejemplos de la base usada en la presente memoria son bases inorganicas incluyendo un hidruro de metal alcalino tal como hidruro sodico o hidruro potasico; un hidruro de metal alcalinoterreo tal como hidruro calcico; un hidroxido de metal alcalino tal como hidroxido de litio, hidroxido sodico o hidroxido potasico; un carbonato de metal alcalino tal como carbonato de litio, carbonato sodico o carbonato potasico; un hidrogenocarbonato de metal alcalino tal como bicarbonato sodico; y un alcoxido metalico tal como metoxido de litio, metoxido sodico, etoxido sodico o terc- butoxido potasico, asf como bases tales como guanidina o amomaco. Ejemplos preferidos de la base son carbonato potasico y guanidina.
Ejemplos del disolvente inerte usado en la presente memoria incluyen, ademas de los susodichos disolventes inertes, un disolvente alcoholico tal como metanol, etanol, isopropanol o terc-butanol, y agua. Estos disolventes se pueden usar en combinacion como una mezcla. Un disolvente preferido es un disolvente alcoholico o una mezcla de un alcohol y un disolvente halogenado. El tiempo de reaccion es de 10 minutos a 5 dfas y es preferiblemente de 30 minutos a 1 dfa. La temperatura de reaccion es una temperatura de -78°C hasta calentamiento bajo reflujo y es preferiblemente temperatura ambiente. La cantidad de la base usada en la reaccion es de 1 a 10 equivalentes y preferiblemente de 2 a 5 equivalentes con respecto al compuesto de la formula (IA).
La etapa A3 es una etapa para preparar el compuesto de la formula (IIIA). Esta etapa se lleva a cabo al tratar el grupo hidroxilo del compuesto de la formula (IIA) con un derivado de cloroformiato o carbonildiimidazol en presencia de una base. Ejemplos del derivado de cloroformiato son cloroformiato de 4-nitrofenilo, cloroformiato de fenilo, cloroformiato de 4-clorofenilo, cloroformiato de 4-bromofenilo y cloroformiato de 2,4-dinitrofenilo. Ejemplos de la base son las susodichas bases organicas y bases inorganicas, de las que, por ejemplo, se usa preferiblemente diisopropiletilamina, 4-dimetilaminopiridina, trietilamina, piridina, 2,6-lutidina o hidruro sodico. El disolvente usado en la reaccion no esta espedficamente limitado, pero es deseable un disolvente que no reaccione facilmente con una materia prima. Ejemplos de tales disolventes son los susodichos disolventes inertes, de los cuales, por ejemplo, se usa preferiblemente tetrahidrofurano, diclorometano o N,N-dimetilformamida. Las cantidades del derivado de cloroformiato y la base para el uso en la reaccion son de 1 a 10 equivalentes y de 1 a 20 equivalentes, y
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preferiblemente de 1 a 5 equivalentes y de 1 a 10 equivalentes, respectivamente, con respecto al compuesto de la formula (IIA). El tiempo de reaccion es de 10 minutos a 30 horas y es preferiblemente de 1 a 4 horas. La temperatura de reaccion es una temperatura de -78°C hasta calentamiento bajo reflujo y es preferiblemente de -10°C a 50°C.
Para el compuesto hidroxilado (IA) en el que no se han protegido de uno a tres de OR3A, OR6A, OR16A y OR21A en la etapa A1, los grupos hidroxilo se pueden convertir en grupos ester carbonico mediante la etapa A3. Mas espedficamente, los grupos hidroxilo del compuesto (IA) distintos al grupo hidroxilo en la posicion 7 se pueden convertir en grupos ester carbonico del mismo modo que el grupo hidroxilo en la posicion 7 mediante tratamiento con una base y un derivado de cloroformiato en equivalentes correspondientes al numero de grupos hidroxilo que se van a convertir en grupos ester carbonico.
La etapa A4 es una etapa para preparar el compuesto de la formula (IVA). Esta etapa se lleva a cabo al tratar el ester carbonico de la formula (IIlA) con una amina (RN1RN2H) que puede formar un compuesto deseado de la formula (I) o (I-d) en un disolvente inerte en presencia de una base o con la amina sola.
Ejemplos de la amina usada en la presente memoria son metilamina, etilamina, propilamina, butilamina, octilamina, decilamina, ciclopropilamina, ciclopentilamina, ciclohexilamina, dimetilamina, dietilamina, etilmetilamina, etilendiamina, 1,3-propanodiamina, 1,4-butanodiamina, N,N-dimetiletilendiamina, N,N-dimetil-1,3-propanodiamina, N,N-dimetil-1,4-butanodiamina, N,N-dietiletilendiamina, N,N-dietil-1,3-propanodiamina, N,N-dietil-1,4-butanodiamina, N,N,N'-trimetiletilendiamina, N,N,N'-trimetil-1,3-propanodiamina, N,N,N'-trimetil-1,4-butanodiamina, N-etil-N',N'- dimetiletilendiamina, N-etil-N',N'-dimetil-1,3-propanodiamina, N-etil-N',N'-dimetil-1,4-butanodiamina, N,N,N'- trietiletilendiamina, N,N,N'-trietil-1,3-propanodiamina, N,N,N'-trietil-1,4-butanodiamina, N,N-dietil-N'- metiletilendiamina, N,N-dietil-N'-metil-1,3-propanodiamina, N,N-dietil-N'-metil-1,4-butanodiamina, N,N'-dimetil-N- feniletilendiamina, N,N'-dimetil-N-fenil-1,3-propanodiamina, N-bencil-N,N'-dimetiletilendiamina, N-bencil-N,N'-dimetil-
1.3- propanodiamina, morfolina, tiomorfolina, S-oxido de tiomorfolina, S,S-dioxido de tiomorfolina, pirrolidina,
piperidina, piperacina, homopiperacina, 4-hidroxipiperidina, 4-metoxipiperidina, 1-metilpiperacina, 1 -etilpiperacina, 1- propilpiperacina, 1 -butilpiperacina, 1-isopropilpiperacina, 1 -ciclobutilpiperacina, 1-ciclopentilpiperacina, 1- ciclohexilpiperacina, 1-cicloheptilpiperacina, 1-ciclooctilpiperacina, 1-(ciclopropilmetil)piperacina, 1-bencilpiperacina, 1-metilhomopiperacina, 1-etilhomopiperacina, 1-(2-aminoetil)pirrolidina, 1-(2-(N-metilamino)etil)pirrolidina), 1-(3- aminopropil)pirrolidina, 1-(3-(N-metilamino)propil)pirrolidina), 1-(2-aminoetil)piperidina, 1-(2-(N-
metilamino)etil)piperidina), 1-(3-aminopropil)piperidina, 1-(3-(N-metilamino)propil)piperidina), 4-(2- aminoetil)morfolina, 4-(2-(metilamino)etil)morfolina), 4-(3-aminopropil)morfolina, 4-(3-(N-metilamino)propil)morfolina), 1-(2-aminoetil)-4-metilpiperacina, 1-(3-aminopropil)-4-metilpiperacina, 1-(3-(N-metilamino)propil)-4-metilpiperacina, 1- amino-4-metilpiperidina, 1-metilamino-4-metilpiperidina, 1-etil-4-(N-metilamino)piperidina, 1-metilamino-4- propilpiperidina, 1-butil-4-(N-metilamino)piperidina, 1-(N,N-dimetilamino)piperidina, 1-(N,N-dietilamino)piperidina, 4- (pirrolidin-1 -il)piperidina, 4-(piperidin-1-il)piperidina, 3-aminoquinuclidina, 3-(N-metilamino)quinuclidina, anilina, N- metilanilina, N,N-dimetil-p-fenilendiamina, N,N-dimetil-m-fenilendiamina, N,N,N'-trimetil-p-fenilendiamina, N,N,N'- trimetil-m-fenilendiamina, 1-naftilamina, 2-naftilamina, bencilamina, N-metilbencilamina, fenetilamina, N- metilfenetilamina, 2-picolilamina, 3-picolilamina, 4-picolilamina, N-metil-2-picolilamina, N-metil-3-picolilamina, N-metil- 4-picolilamina, 2,5-diazabiciclo[2.2.1]heptano, 2-metil-2,5-diazabiciclo[2.2.1]heptano, 3,8-diazabiciclo[3.2.1]octano y
1.4- diazabiciclo[4.3.0]nonano.
Ejemplos de la base son las susodichas bases organicas y bases inorganicas, de las que, por ejemplo, se usa preferiblemente diisopropiletilamina, dimetilaminopiridina, trietilamina, piridina, 2,6-lutidina o hidruro sodico. El disolvente usado en la reaccion no esta espedficamente limitado, pero es deseable un disolvente que no reaccione facilmente con una materia prima. Ejemplos de tales disolventes son los susodichos disolventes inertes, de los que, por ejemplo, se usa preferiblemente tetrahidrofurano, diclorometano o N,N-dimetilformamida. Las cantidades de la amina y la base usadas en la reaccion son de 1 a 10 equivalentes y de 2 a 20 equivalentes, y preferiblemente de 1,5 a 5 equivalentes y de 2 a 10 equivalentes, respectivamente, con respecto al compuesto de la formula (IIIA). El tiempo de reaccion es de 10 minutos a 30 horas y es preferiblemente de 1 a 2 horas. La temperatura de reaccion es una temperatura de -78°C hasta el calentamiento bajo reflujo y es preferiblemente de -10°C a 50°C.
El compuesto de la formula (IVA) tambien se puede preparar al tratar el compuesto de la formula (IIA) con un isocianato en un disolvente inerte en presencia de una base y/o cloruro cuproso. El isocianato no esta espedficamente limitado e incluye, por ejemplo, isocianato de etilo, isocianato de metilo e isocianato de fenilo. Ejemplos de la base son las susodichas bases organicas y bases inorganicas, de las cuales, por ejemplo, se usa preferiblemente diisopropiletilamina, dimetilaminopiridina, trietilamina, piridina, 2,6-lutidina o hidruro sodico. El disolvente usado en la reaccion no esta espedficamente limitado, pero es deseable un disolvente que no reaccione facilmente con una materia prima. Ejemplos de tales disolventes son los susodichos disolventes inertes, de los cuales, por ejemplo, se usa preferiblemente tetrahidrofurano, diclorometano o N,N-dimetilformamida. Las cantidades de la base y el isocianato usadas en la reaccion son de 3 a 100 equivalentes y de 1 a 20 equivalentes, preferiblemente de 5 a 20 equivalentes y de 3 a 10 equivalentes, respectivamente, con respecto al compuesto de la formula (IIIA). En caso de que se use cloruro cuproso, la cantidad del mismo es de 1 a 10 equivalentes y preferiblemente de 2 a 6 equivalentes. El tiempo de reaccion es de 10 minutos a 30 horas y es preferiblemente de 1 a 2 horas. La temperatura de reaccion es una temperatura de -78°C hasta el calentamiento bajo reflujo y es preferiblemente de -10°C a 50°C.
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El compuesto hidroxilado en el que no se han protegido de uno a tres de OR3A, OR6A, OR16A y OR21A en la etapa A1 se puede convertir en un derivado que tiene una pluralidad de estructuras de uretano al convertir esos grupos hidroxilo en grupos ester carbonico en la etapa A3 y convertirlos ademas en grupos carbamoiloxi en la etapa A4.
La etapa A5 es una etapa para producir el compuesto de la formula (VA). Esta etapa se lleva a cabo al someter el derivado de uretano de la formula (IVA) a un tratamiento de desproteccion mencionado posteriormente en un disolvente inerte. La reaccion de desproteccion para los grupos protectores de los grupos hidroxilo vana dependiendo del tipo del grupo protector pero se lleva a cabo mediante un metodo muy conocido en la qmmica sintetica organica.
Para el respectivo grupo hidroxilo protegido mediante, por ejemplo, 1 -etoxietilo, tetrahidropiranilo, 1- metoxiciclohexilo, 4-metoxitetrahidropiranilo, 4-metoxitetrahidrotiopiranilo o S,S-dioxido de 4-
metoxitetrahidrotiopiranilo, la reaccion de desproteccion se puede llevar a cabo facilmente mediante tratamiento con un acido en un disolvente inerte. Ejemplos del acido son los susodichos acidos organicos y acidos inorganicos, de los cuales, por ejemplo, se prefiere p-toluenosulfonato de piridinio, acido p-toluenosulfonico o acido canforsulfonico. El disolvente usado en la reaccion no esta espedficamente limitado, pero es deseable un disolvente que no reaccione facilmente con una materia prima. Ejemplos preferidos del mismo son un disolvente alcoholico tal como metanol, etanol, isopropanol o terc-butanol, o una mezcla del alcohol y el susodicho disolvente inerte. La cantidad del acido usada en la reaccion es de 0,5 a 5 equivalentes y es preferiblemente de 1 a 3 equivalentes con respecto al compuesto de la formula (IVA). El tiempo de reaccion es de 10 minutos a 10 dfas y es preferiblemente de 1 dfa a 4 dfas. La temperatura de reaccion es una temperatura de -78°C hasta el calentamiento bajo reflujo y es preferiblemente de -10°C a 50°C.
Cuando el grupo hidroxilo esta protegido por el otro grupo protector tal como terc-butildimetilsililo, trietilsililo, dietilisopropilsililo, trimetilsililo, triisopropilsililo, di-terc-butilmetilsililo o difenilmetilsililo, se puede desproteger mediante el tratamiento de un anion fluoruro o un acido. Ejemplos del anion fluoruro son fluoruro de tetrabutilamonio, fluoruro de hidrogeno, fluoruro potasico y fluoruro de hidrogeno-piridina. Ejemplos del acido son los susodichos acidos organicos y acidos inorganicos, de los que un ejemplo preferido es acido acetico, acido formico, acido trifluoroacetico, p-toluenosulfonato de piridinio o acido canforsulfonico. El disolvente usado en la reaccion no esta espedficamente limitado, pero es deseable un disolvente que no reaccione facilmente con una materia prima. Ejemplos del mismo son los susodichos disolventes inertes, de los cuales, por ejemplo, se usa preferiblemente tetrahidrofurano, eter dietflico o agua. Las cantidades del anion fluoruro y el acido usadas en la reaccion son de 1 a 5 equivalentes y de 0,5 a 5 equivalentes, preferiblemente de 1 a 4 equivalentes y de 0,5 a 3 equivalentes, respectivamente, con respecto al compuesto de la formula (IVA). El tiempo de reaccion es de 10 minutos a 30 horas y es preferiblemente de 1 a 2 horas. La temperatura de reaccion es una temperatura de -78°C hasta el calentamiento bajo reflujo y es preferiblemente de -10°C a 50°C.
Mediante una combinacion de los diversos metodos de proteccion para grupos hidroxilo descritos en la etapa A1 y los diversos metodos de desproteccion descritos en la etapa A5, los respectivos grupos hidroxilo en la posicion 3, la posicion 6 y la posicion 21 se pueden convertir en derivados de uretano selectivamente. Por ejemplo, un derivado de uretano que tiene un grupo hidroxilo en la posicion 6 se puede sintetizar al someter al grupo hidroxilo en la posicion 6 del compuesto (IA) en el que R3A, R16A y R21A son grupos trietilsililo a la etapa A3, la etapa A4 y la etapa A5 secuencialmente.
La modificacion selectiva del grupo hidroxilo en la posicion 3, la posicion 6 o la posicion 21 que se lleva a cabo mediante una combinacion de los procedimientos de proteccion y desproteccion tambien se puede aplicar a los otros metodos de modificacion.
Despues de la finalizacion de la reaccion, el producto buscado en la reaccion respectiva se afsla de una mezcla de reaccion segun un procedimiento convencional. Por ejemplo, el compuesto buscado se puede obtener mediante filtracion, si esta presente materia insoluble, y evaporacion del disolvente, o al diluir la mezcla de reaccion con un disolvente organico tal como acetato de etilo, lavar la capa organica con agua, secar sobre sulfato magnesico anhidro y evaporar el disolvente. El compuesto se puede purificar adicionalmente mediante un procedimiento convencional tal como cromatograffa en columna, cromatograffa en capa fina o cromatograffa de ffquidos de alto rendimiento segun requiera el caso.
Para ilustrar la utilidad de la presente invencion espedficamente, se determinaron la actividad supresora de la transcripcion de VEGF, la actividad inhibidora del crecimiento sobre celulas de cancer de colon humano WiDr, la actividad inhibidora del crecimiento sobre cancer solido, la perdida de peso corporal (toxicidad aguda) y la estabilidad en una solucion acuosa del compuesto de la presente invencion.
Ejemplo de prueba 1 Construccion de un sistema indicador para cribar un compuesto que suprime la transcripcion de VEGF
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A fin de preparar un sistema indicador que refleja la transcripcion del promotor de VEGF, la secuencia del promotor de VEGF se clono y se inserto en vector de fosfatasa alcalina (PLAP) secretor para construir el vector indicador.
A fin de obtener la region promotora de VEGF humano, ADN genomico de VEGF se clono de una biblioteca de fagos. Cebadores de PCR que teman las secuencias descritas en los Numeros de Secuencia 1 y 2 se disenaron basandose en ADNc de VEGF (numero de registro del GenBank: X62568) y se obtuvo un fragmento que tema aproximadamente 340 pb llevando a cabo PCR. Una biblioteca de fagos genomica humana (Human genomic library, Clontech Co.) se cribo usando esto como una sonda para obtener ADN genomico de VEGF. El ADN se digirio mediante EcoRI, y los fragmentos resultantes se insertaron en el sitio EcoRI de pUC18. Finalmente, se obtuvo pUC18-VEGFA que contema aproximadamente 5,4 kb de region de flanqueo 5' de VEGF. El pUC18-VEGFA se digirio mediante KpnI/NheI, la region promotora de VEGF de aproximadamente 2,3 kb obtenida se inserto en el sitio de multiclonacion KpnI/Nhel del vector de fosfatasa alcalina (PLAP) secretor (Goto y cols., Mol. Pharmacol., 49, 860873, 1996), y asf, se construyo el vector VEGF-PLAP.
El susodicho vector VEGF-PLAP se transfecto en las celulas U251 cultivadas en el medio de Eagle modificado de DULBECCO (DMEM; fabricado por SIGMA Co., Ltd.) que contiene 10% de suero de ternero fetal, y las celulas se cultivaron en presencia de 1 mg/ml de G418 (Merck Co.) para establecer un clon estable resistente a G418 (celulas U251/1-8).
Se confirmo que las celulas U251/1-8 secretaban PLAP bajo condicion hipoxica (incubadora de O2 al 2%) de la misma manera que en el informe (Cell. Mol. Biol. Res. 40, 35-39, 1994) y era un sistema indicador que reflejaba la transcripcion desde el promotor de VEGF. El cribado del compuesto que suprime la produccion de VEGF que se inducfa por estimulacion hipoxica se llevo a cabo posteriormente usando el clon.
Ejemplo de prueba 2 Actividades supresoras de la transcripcion de VEGF de diversos analogos y derivados de 11107
A fin de eliminar la influencia de fosfatasas alcalinas en suero, celulas U251/1-8 se enjuagaron dos veces con la cantidad adecuada de PBS (solucion salina tamponada con fosfato), se diluyeron en el medio DMEM que contema 10% de suero en el que la fosfatasa alcalina se inactivo mediante el tratamiento de 65°C durante 20 min., y se distribuyeron en placas de 96 pocillos en 4 * 104 celulas/180 pl.
Despues de cultivar a 37°C durante la noche en una incubadora de CO2 (CO2 al 5%), se anadieron 20 pl de la susodicha solucion de incubacion que contema el compuesto de prueba diluido con una sucesion triple, y a continuacion se incubaron en una incubadora hipoxica (CO2 al 2%) durante 18 horas. Con respecto a la actividad de PLAP en los sobrenadantes de cultivo, se anadieron 10 pl de los sobrenadantes a 50 pl de solucion tamponadora de Na2CO3-NaHCO3 0,28 M (pH 10,0, MgSO4 8,0 mM) y finalmente se anadieron 50 pl de sustrato de fosfatasa alcalina (LUMISTEIN, Genomescience Co.). Despues de reaccionar durante una hora, la actividad de fosfatasa alcalina de la PLAP se midio al detectar la luminiscencia qmmica mediante un lector de microplacas (Perkin-Elmer Co.). La actividad de PLAP bajo normoxia se fijo como 0%, la actividad de PLAP de la celula que se trataba bajo hipoxia se fijo como 100%, y la concentracion que suprimfa la actividad de PLAP en 50% se fijo como el valor de IC50 de PLAP. Se midio que el valor de IC50 del compuesto de la presente invencion era 1,9 nM. El compuesto de la presente invencion mostraba una fuerte actividad supresora de la transcripcion de VEGF.
Ejemplo de prueba 3 Actividades inhibidoras del crecimiento sobre celulas de cancer de colon humano WiDr
Celulas de cancer de colon humano WiDr cultivadas en medio de Eagle modificado de DULBECCO (DMEM; fabricado por SIGMA Co., Ltd.) que contema 10% de suero de ternero fetal, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 pg/ml) se distribuyeron en placas de 96 pocillos en 2*103 celulas/pocillo. Despues de cultivar durante la noche en una incubadora de CO2, se anadieron 20 pl de la susodicha solucion de incubacion que contema el compuesto de prueba diluido con una sucesion triple, seguido por incubacion. Despues de tres dfas, se anadieron 50 pl de solucion de 3,3 mg/ml de MTT, seguido por cultivar durante una hora mas. A continuacion, el formazano formado mediante la reduccion por la accion de celulas vivas se extrajo con 100 pl de DMSO, se determino la absorbancia (A540/A660) y se fijo como el mdice del numero de celulas vivas.
Se determinaron las concentraciones del compuesto de la presente invencion a la que el crecimiento de las celulas de cancer de colon humano WiDr se inhibfa 50%. El valor de IC50 del compuesto de la presente invencion era 0,7 nM. El compuesto de la presente invencion mostraba fuertes actividades inhibidoras del crecimiento sobre celulas de cancer de colon humano WiDr.
Ejemplo de prueba 4 Actividades inhibidoras del crecimiento de tumores solidos
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A fin de estudiar la actividades inhibidoras de tumores solidos del compuesto de la presente invencion in vivo, celulas de cancer de colon humano WiDr se implantaron subcutaneamente en los costados de ratones atimicos. Se trasplantaron a los lados corporales subcutaneos de los ratones. Los animales se agruparon de modo que el promedio de los volumenes de los grupos respectivos se hiciera uniforme, cuando alcanzaba aproximadamente 100 mm3. Un grupo de control estaba constituido por 10 ratones y los grupos con administracion de 11107D estaban constituido por 5 ratones. Los derivados se administraron para los grupos con administracion durante 5 dfas consecutivos mediante inyeccion intravenosa a fin de que fuera cualquiera de 0,625 mg, 1,25 mg, 2,5 mg, 5 mg y 10 mg/kg/dfa, y un vetuculo se administro al grupo de control. Se midieron los volumenes de tumor el Dfa 15, y se determinaron las relaciones de volumenes de tumor relativos (T/C%) fijando el volumen del tumor del grupo de control como 100%. La T/C% del compuesto de la presente invencion era 20 con una dosis de 5,0 mg/kg. Se midieron los pesos corporales el Dfa 1, el Dfa 5, el Dfa 8, el Dfa 12 y el Dfa 15 (o 16), y las variaciones relativas de peso corporal se determinaron fijando el peso corporal el Dfa 1 como 100%. Las relaciones de pesos corporales relativos en el dfa en el que el peso corporal alcanzaba el mmimo se definieron como las relaciones de pesos relativos mmimas y se muestran en la tabla posterior.
Dosis (mg/kg)
Actividades inhibidoras del crecimiento en el modelo de tumor solido humano WiDr (T/C%) las relaciones de pesos relativos mmimas
5,0
20 0,90
El compuesto de la presente invencion mostraba actividades inhibidoras del crecimiento en el modelo de tumor de colon humano WiDr incluso en una dosis sin perdida de peso notable tambien in vivo.
Ejemplo de prueba 5 Estabilidad en una solucion acuosa
El compuesto de la presente invencion se disolvio en DMSO en concentraciones de 10 a 20 mM, y estas se diluyeron aproximadamente 500 veces con solucion tamponadora de Britton-Robinson de pH 7. Cada una de las soluciones como soluciones de muestra se incubo a 25°C durante 24 horas.
Las soluciones de muestra se analizaron mediante cromatograffa de Kquidos de alto rendimiento antes y despues de la incubacion, y las relaciones residuales de las sustancias probadas en las soluciones de muestra se determinaron a partir de las areas de los picos de los cromatogramas obtenidos.
Ejemplo
Area del pico (mAU x s) Las relaciones residuales (%)
inicial despues de 24 horas
11107D
3994 3817 95,6
Compuesto reivindicado
5291 5024 95,0
Los resultados muestran que despues de 24 horas el contenido del compuesto de la presente invencion segrna siendo 95%, indicando que es estable en una solucion acuosa.
Como es evidente a partir de los Ejemplos de prueba farmacologicos anteriores, el compuesto de la presente invencion suprime especialmente la produccion de VEGF al variar la expresion genica y se espera que se use como un agente antitumoral, en particular, como un agente de tratamiento para un cancer solido, un supresor de metastasis de carcinomas, asf como un agente para tratar la retinopatfa diabetica, la artritis reumatoide y el anginoma. Ademas, como es evidente a partir de la prueba de toxicidad del Ejemplo de prueba 4, el compuesto de la presente invencion muestra buenas actividades inhibidoras del crecimiento en el modelo de tumor de colon humano WiDr en tal dosis de modo que no provoca una perdida de peso notable de los ratones probados y es un compuesto seguro. Segun esto, es eficaz como un agente para prevenir o tratar una enfermedad contra la que es eficaz el control de la expresion genica, una enfermedad contra la que es eficaz una actividad supresora de la produccion de VEGF y una enfermedad contra la que es eficaz una actividad inhibidora de la angiogenesis. La "prevencion o el tratamiento" indica bien prevenir o bien tratar, o ambos. Mas espedficamente, el compuesto de la presente invencion es eficaz como un agente antitumoral y en particular como un agente antitumoral y un supresor de metastasis de carcinomas para un cancer solido. Como el cancer solido, por ejemplo, se pueden proponer cancer pancreatico, cancer gastrico, cancer de colon, cancer de mama, cancer de prostata, cancer de pulmon, cancer de rinon, tumor cerebral, cancer de cabeza y cuello, cancer esofagico, cancer de piel, cancer de tugado, cancer de utero, cancer del cuello uterino, cancer de la vejiga urinaria, cancer de tiroides, cancer testicular, carcinoma corionico, osteosarcoma, sarcoma de tejidos blandos y cancer ovarico, de los que se prefiere un cancer tal como cancer de colon, cancer de mama, cancer de prostata, cancer de pulmon, cancer de cabeza y cuello o cancer ovarico. Ademas, tambien es eficaz como un agente antitumoral para la leucemia. Ademas, tambien es eficaz como un agente para tratar un
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hematoma. Por otra parte, tambien es eficaz como un agente para tratar la retinopatfa diabetica, la artritis reumatoide y los hematomas, lo que se basa en la accion supresora de la produccion de VEGF. Ademas, tambien es eficaz como un agente para tratar enfermedades inflamatorias que consisten en osteoartritis, psoriasis y reaccion de hipersensibilidad prolongada, y aterosclerosis.
Cuando el compuesto se prepara como una inyeccion, se anaden al farmaco principal un regulador del pH, un tampon, un estabilizante, un solubilizante y similares, si es necesario, para preparar una inyeccion subcutanea, intramuscular, intraarticular o intravenosa segun un procedimiento convencional.
Cuando el compuesto se administra como un agente preventivo o terapeutico para diversas enfermedades, se puede administrar oralmente como comprimidos, polvos, granulos, capsulas, jarabes y similares, y se puede administrar parenteralmente como un aerosol, un supositorio, una inyeccion, una preparacion externa o un gotero. La dosis vana notablemente segun la gravedad del smtoma, la edad, el tipo de enfermedad hepatica, etc., y de aproximadamente 1 mg a 100 mg al dfa para un adulto se administran en general en una o varias veces.
Se usan excipientes convencionales en la produccion de productos farmaceuticos, y los productos farmaceuticos se preparan mediante un metodo convencional. A saber, cuando se prepara una formulacion solida para uso oral, se anade una carga al farmaco principal y, si es necesario, se anade a esto un aglutinante, un desintegrante, un lubricante, un colorante, un agente saborizante y similares, y a continuacion se preparan comprimidos, comprimidos revestidos, granulos, polvos, capsulas y similares. No es necesario decir que se puede efectuar un revestimiento con azucar, un revestimiento con gelatina o un revestimiento adecuado sobre el comprimido y el granulo, si es necesario.
Segun la presente invencion, el compuesto de la presente invencion suprime, en particular, la produccion de VEGF al variar la expresion genica y muestra excelentes actividades antitumorales en modelos de tumores solidos in vivo. Ademas, el compuesto de la presente invencion es estable en una solucion acuosa y puede proporcionar, por ejemplo, un agente para tratar el cancer, en particular, un agente para tratar un cancer solido, un supresor de metastasis de carcinomas, un agente para tratar la retinopatfa diabetica, la artritis reumatoide y el angioma.
Ejemplos
La presente invencion se ilustrara con mas detalle posteriormente.
Los sfmbolos usados en las formulas estructurales qmmicas en los Ejemplos se ilustraran posteriormente.
DEIPS: grupo dietilisopropilsililo
Et: grupo etilo
EE: grupo 1 -etoxietilo
Me: grupo metilo
TES: grupo trietilsililo
Ejemplo 1 Fermentacion de la cepa Mer-11107 y purificacion de 11107D
Un asa del cultivo inclinado (ISP-2) de cepa Mer-11107 se inoculo en un matraz de Erlenmeyer de 500 ml que contema 50 ml de medio de siembra (2% de glicerina, 2% de glucosa, 2% de harina de soja (ESUSAN-MEAT fabricada por Ajinomoto Co. Ltd.), 0,5% de extracto de levadura, 0,25% de cloruro sodico, 0,32% de carbonato calcico, 0,0005% de sulfato de cobre, 0,0005% de cloruro de manganeso, 0,0005% de sulfato de cinc, pH 7,4), y se cultivo a 28°C durante tres dfas en un agitador para dar el primer cultivo de siembra. El cultivo de siembra (0,6 ml) se inoculo en un matraz de Erlenmeyer de 500 ml que contema 60 ml del medio de produccion (5% de almidon soluble, 0,5% de licor de maceracion de mafz, 0,5% de levadura seca, 0,5% de harina de gluten, 0,1% de carbonato calcico) y se fermento a 28°C durante cuatro dfas en un agitador giratorio para dar un caldo de cultivo de fermentacion.
El caldo de cultivo (10 l) se extrajo con 1-butanol (10 l), a continuacion, la capa de butanol asf adquirida se evaporo hasta sequedad para dar 100 g de fraccion activa en bruto. La fraccion activa en bruto se aplico sobre Sephadex LH- 20 (1.500 ml; fabricada por Pharmacia Co. Ltd.), y se eluyo con tetrahidrofurano-metanol (1:1) como un disolvente. Una fraccion eluida de 540 ml a 660 ml se concentro hasta sequedad, para dar un residuo (660 mg). El residuo resultante se disolvio en una mezcla de acetato de etilo y metanol (9:1; v/v) y se sometio a cromatograffa en columna de gel de sflice (WAKO GEL C-200, 50 g). La columna se eluyo con una mezcla (2 l) que consistfa en n-hexano y acetato de etilo (1:9, v/v), las fracciones eluidas de 1.440 ml a 1.566 ml se recogieron, se evaporaron para dar 15 mg de una fraccion activa en bruto.
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La fraccion activa en bruto obtenida se sometio a cromatograffa de Kquidos de alto rendimiento (HPLC) preparativa bajo la siguiente condicion de HPLC preparativa (A), y las fracciones eluidas en el tiempo de retencion de 17 minutos se recogieron. Despues de retirar el acetonitrilo, las fracciones respectivas se desalaron mediante HPLC bajo la siguiente condicion de HPLC preparativa (B) para dar 11107D (Tiempo de retencion: 36 minutos, 1,8 mg).
Condiciones de HPLC preparativa A:
Columna: YMC-PACK ODS-AM F20 mm * 250 mm (fabricada por YMC Co.)
Caudal: 10 ml/min.
Deteccion: 240 nm
Eluyente: acetonitrilo/dihidrogenofosfato potasico acuoso al 0,15% (pH 3,5) (de 2:8 a 8:2, v/v, de 0 a 50 min., gradiente lineal)
Condiciones de HPLC preparativa B:
Columna: YMC-PACK ODS-AM F20 mm * 250 mm (fabricada por YMC Co.)
Caudal: 10 ml/min.
Deteccion: 240 nm
Eluyente: metanol/agua (de 2:8 a 10:0, v/v, de 0 a 40 min., gradiente lineal)
Ejemplo 2 Propiedades fisicoqmmicas de 11107D
Las propiedades fisicoqmmicas de 11107D se muestran posteriormente. La estructura de 11107D se determino segun se muestra posteriormente.
1. Apariencia: polvo incoloro
2. Peso molecular: 552, ESI-MS m/z 551 (M-H)‘, 575 (M+Na)+
3. Formula molecular: C30H48O9
4. Solubilidad: soluble en dimetilsulfoxido, piridina, metanol y acetona, y ligeramente soluble en agua
5. Reaccion cromatica: positiva para yodo y acido sulfurico
6. Espectro de absorcion ultravioleta (metanol, valer maximo) nm: 239 (£ 33100)
7. Espectro de absorcion infrarrojo (KBr) cm’1: 3417, 2967, 1732, 1714, 1455, 1372, 1248, 1176
8. Espectro de 1H-NMR (CD3OD, 500MHz) : 6 ppm (integral, multiplicidad, constante de acoplamiento J (Hz)):
0,93 (3H, d, J=7,0Hz), 0,95 (3H, d, J=6,8Hz), 0,98 (3H, t, J=8,0Hz),
1,23 (3H, s), 1,30 (1H, m), 1,36-1,66 (9H, m), 1,70 (1H, dd, J=6,4, 14,2Hz), 1,82 (3H, d, J=1,0Hz), 1,90 (1H, dd, J=6,4, 14,2Hz), 2,10 (3H, s), 2,52 (2H, m), 2,62 (1H, m), 2,72 (1H, dd, J=2,4, 8,3Hz), 2,94 (1H, dt, J=2,4, 5,7Hz), 3,55 (1H, dt, J=8,3, 4,4Hz), 3,82 (1H, m), 5,10 (1H, d, J=9,8Hz), 5,11 (1H, d, J=10,8Hz), 5,60 (1H, dd, J=9,8, 15,2Hz), 5,74 (1H, dd, J=8,3, 15,2 Hz), 5,92 (1H, d, J=15,2Hz), 6,18 (1H, d, J=10,8Hz), 6,57 (1H, dd, J=10,8, 15,2Hz)
9. Espectro de 13C-NMR (CD3OD, 125MHz) : 6 ppm (multiplicidad): 10,52 (q), 10,82 (q), 11,98 (q), 16,84 (q), 21,07 (q), 24,21 (q), 28,62 (t), 28,79 (q), 30,46 (t), 37,53 (t), 40,10 (t), 41,80 (d), 42,58 (d), 45,97 (t), 55,99 (d), 62,53 (d),
70,42 (d), 73,09 (s), 74,11 (s), 75,30 (d), 80,31 (d), 84,19 (d), 123,64 (d), 127,10 (d), 131,76 (d), 133,81 (s), 141,61 (d), 143,22 (d), 171,75 (s), 172,18 (s)
imagen5
Ejemplo 3 (8E,12E,14E)-7-((4-Cicloheptilpiperacin-1-il)carbonil)oxi-3,6,16,21-tetrahidroxi-6,10,12,16,20-pentametil- 5 18,19-epoxitricosa-8,12,14-trien-11-olido
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Primera etapa
(8E,12E,14E)-7-((4-Cicloheptilpiperacin-1-il)carbonil)oxi-6-(1-etoxietoxi)-6,10,12,16,20-pentametil-3,16,21- tris(trietilsiloxi)-18,19-epoxitricosa-8,12,14-trien-11-olido (Compuesto 45-1)
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imagen7
Se anadieron secuencialmente gota a gota 1-cicloheptilpiperacina (462 mg, 2,51 mmol) y trietilamina (513 mg, 5,02 mmol) a una solucion del Compuesto 46-4 (8E,12E,14E)-6-(1-etoxietoxi)-6,10,12,16,20-pentametil-7-(4-
nitrophenoxi)carboxi-3,16,21-tris(trietilsiloxi)-18,19-epoxitricosa-8,12,14-trien-11-olido (1,368 g, 1,254 mmol) obtenido 15 en la cuarta etapa del Ejemplo 46 en tetrahidrofurano (20 ml). A continuacion, se anadio a esto tetrahidrofurano (8 ml) y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1,5 horas. La mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo y se lavo con una solucion acuosa de bicarbonato sodico y salmuera. La capa organica se seco sobre sulfato magnesico anhidro, se filtro y se concentro. El residuo resultante se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (Kanto silica gel 60N, 40 - 50 pm; acetato de etilo-hexano, 1:9 a 1:4 a 1:3) para dar el 20 compuesto del epfgrafe (1,455 g, 99%) como un aceite incoloro.
Segunda etapa
(8E,12E,14E)-7-((4-Cicloheptilpiperacin-1-il)carbonil)oxi-6-(1-etoxietoxi)-3,16,21-trihidroxi-6,10,12,16,20-pentametil- 18,19-epoxitricosa-8,12,14-trien-11-olido (Compuesto 45-2)
imagen8
Una solucion de Compuesto 45-1 (8E,12E,14E)-7-((4-cicloheptilpiperacin-1-il)carbonil)oxi-6-(1-etoxietoxi)- 6,10,12,16,20-pentametil-3,16,21-tris(trietilsiloxi)-18,19-epoxitricosa-8,12,14-trien-11-olido (1,454 g, 1,254 mmol) obtenido en la primera etapa en tetrahidrofurano (30 ml) se enfrio hasta 5°C, se anadio gota a gota a esto fluoruro de tetrabutilamonio (solucion en tetrahidrofurano 1,0 M, 4,5 ml, 4,5 mmol) y la mezcla de reaccion se agito a 5 temperature ambiente durante 1,5 horas. Se anadio adicionalmente gota a gota fluoruro de tetrabutilamonio (solucion en tetrahidrofurano 1,0 M, 0,52 ml, 0,52 mmol) y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante horas. La mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo y se lavo con una solucion acuosa de bicarbonato sodico y salmuera. La capa organica se seco sobre sulfato magnesico anhidro, se filtro y se concentro. El residuo resultante se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (Fuji Silysia, NH Silica gel, malla 10 200 - 350; acetato de etilo-hexano, 1:1 a 4:1 a 9:1 a 1:0) para dar el compuesto del epfgrafe (965 mg, 97%) como un
aceite incoloro.
ESI-MS m/z 791 (M+H)+
Tercera etapa
15 (8E,12E,14E)-7-((4-Cicloheptilpiperacin-1-il)carbonil)oxi-3,6,16,21-tetrahidroxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,19- epoxitricosa-8,12,14-trien-11-olido (Compuesto 45)
imagen9
Se anadio p-toluenosulfonato de piridinio (459 mg, 1,827 mmol) a una solucion de Compuesto 45-2 (8E,12E,14E)-7- 20 ((4-cicloheptilpiperacin-1-il)carbonil)oxi-6-(1-etoxietoxi)-3,16,21-trihidroxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,19-
epoxitricosa-8,12,14-trien-11-olido (964 mg, 1,218 mmol) obtenido en la segunda etapa en una mezcla de tetrahidrofurano:2-metil-2-propanol=1:1 (22 ml) y la mezcla de reaccion se removio a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo y se lavo con una solucion acuosa de bicarbonato sodico y salmuera. La capa organica se seco sobre sulfato magnesico anhidro, se filtro y se concentro. El residuo 25 resultante se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (Fuji Silysia, Nh Silica gel, malla 200 a 350; acetato de etilo-hexano-metanol, 2:1:0 a 4:1:0 a 99:0:1 a 98:0:1 a 97:0:1) y la fraccion en bruto se concentro. El residuo resultante se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (gel de sflice Kanto 60N, 40 - 50 pm; metanol-diclorometano, 1:29 a 1:19 a 1:17 a 1:14 a 1:9) para dar el compuesto del epfgrafe (866 mg, 99%) como un aceite incoloro.
30
Espectro de 1H-NMR (CD3OD, 400MHz) 6 (ppm): 0,89 (3H, d, J=6,8Hz), 0,90 (3H, d, J=6,8Hz), 0,94 (3H, t, J=7,2Hz), 1,10-1,77 (24H, m), 1,77 (3H, s an), 1,79-1,90 (3H, m), 2,42-2,74 (9H, m), 2,85-2,92 (1H, m), 3,36-3,70 (5H, m), 3,723,84 (1H, m), 4,92 (1H, d, J=10,0Hz), 5,06 (1H, d, J=10,8Hz), 5,57 (1H, dd, J=9,6, 15,2Hz), 5,71 (1H, dd, J=10,0, 15,2Hz), 5,87 (1H, d, J=15,2Hz), 6,13 (1H, d, J=11,2Hz), 6,52 (1H,dd, J=11,2, 15,2Hz); ESI-MS m/z 719 (M+H)+.
35 Ejemplos de formulacion
Ejemplos de formulacion del compuesto de la presente invencion se ilustraran posteriormente, pero la formulacion del compuesto de la presente invencion no se limita a estos Ejemplos de formulacion.
Ejemplo de formulacion 1
Compuesto of Ejemplo 3 0,6 (partes)
Tensioactivo no ionico 2,4
Solucion isotonica de cloruro sodico 97
40 se calentaron, se mezclaron y se cargaron en una ampolla, la ampolla se esterilizo para producir una inyeccion.
Ejemplo de referencia 2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Un asa del cultivo inclinado [0,5% de almidon soluble, 0,5% de glucosa, 0,1% de extracto de carne de pescado (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0,1% de extracto de levadura (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.), 0,2% de NZ-case (fabricado por Humko Sheffield Chemical Co.), 0,2% de cloruro sodico, 0,1% de carbonato calcico y 1,6% de agar (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] de la cepa de Streptomyces sp. AB- 1704 (FERM P-18999) aislada del suelo se inoculo en un tubo de ensayo de 65 ml que contema 7 ml de un medio de siembra [2,0% de almidon soluble, 1,0% de glucosa, 0,5% de polipeptona (fabricada por Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0,5% de extracto de levadura (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.) y 0,1% de carbonato calcico] y se cultivo a 28°C durante tres dfas en una incubadora agitada para dar un cultivo de siembra.
Ademas, 0,5 ml del cultivo de siembra se inocularon en un tubo de ensayo de 65 ml que contema 7 ml de un medio de produccion [2,0% de almidon soluble, 1,0% de glucosa, 0,5% de polipeptona (fabricada por Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0,5% de extracto de levadura (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.) y 0,1% de carbonato calcico] y se cultivo a 28°C durante tres dfas en una incubadora agitada.
Posteriormente, se preparo una solucion de 25 mg/ml de la sustancia 11107B de sustrato (el compuesto del Ejemplo A4 del documento Wo 02/060890) en etanol y se anadieron 0,2 ml de la solucion al cultivo. Despues de la adicion, se agito a 28°C durante 48 horas para llevar a cabo la reaccion de conversion.
Despues de la reaccion, la mezcla de reaccion se analizo mediante HPLC bajo la siguiente condicion de HPLC analftica (a) para verificar que se formaba la sustancia 11107D en la mezcla de reaccion.
Condicion de HPLC analftica (a)
Columna: CAPCELL PAK C18 SG120 94.6 mm * 250 mm (fabricada por SHISEIDO Co.)
Temperatura: 40°C Caudal: 1 ml/min.
Deteccion: 240 nm
Eluyente: acetonitrilo/dihidrogenofosfato potasico al 0,15% (pH 3,5) (3:7 a 5:5, v/v, 0 a 18 minutos, gradiente lineal), acetonitrilo/dihidrogenofosfato potasico al 0,15% (pH 3,5) (5:5 a 85:15, v/v, 18 a 22 minutos, gradiente lineal)
Tiempo de retencion: sustancia 11107D 9,9 min., sustancia 11107B 19,4 min.
Ejemplo de referencia 3
Un asa del cultivo inclinado (medio en agar de levadura-malta) de la cepa A-1545 (FERM P-18944) aislada del suelo se inoculo en un matraz de Erlenmeyer de 250 ml que contema 20 ml de un medio de siembra [2,4% de almidon soluble, 0,1% de glucosa, 0,5% de harina de soja (ESUSAN-MEAT fabricada por Ajinomoto Co., Ltd.), 0,3% de extracto de ternero (fabricado por Difco), 0,5% de extracto de levadura (fabricado por Difco), 0,5% de triptona- peptona (fabricado por Difco) y 0,4% de carbonato calcico] y se cultivo a 28°C durante tres dfas en una incubadora agitada para dar un cultivo de siembra.
Ademas, 0,6 ml del cultivo de siembra se inocularon en un matraz de Erlenmeyer de 500 ml que contema 60 ml de un medio de produccion [2% de almidon soluble, 2% de glucosa, 2% de harina de soja (ESUSAN-MEAT fabricada por Ajinomoto Co., Ltd.), 0,5% de extracto de levadura (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.), 0,25% de cloruro sodico, 0,32% de carbonato calcico, 0,0005% de sulfato de cobre, 0,0005% de cloruro de manganeso, 0,0005% de sulfato de cinc, pH 7,4 antes de la esterilizacion] y se cultivo a 28°C durante cuatro dfas en una incubadora agitada. Cada 2 ml del cultivo resultante se distribuyeron en tubos de ensayo de 15 ml. Posteriormente, se preparo una solucion de 20 mg/ml de la sustancia 11107B de sustrato en dimetilsulfoxido y se anadieron 0,05 ml de la solucion. Despues de la adicion, se agito a 28°C durante 23 horas para llevar a cabo la conversion. Despues de la reaccion, la mezcla de reaccion se analizo mediante HPLC bajo la siguiente condicion de HPLC analftica (b) para verificar que se formaba la sustancia 11107D en la mezcla de reaccion.
Condicion de HPLC analftica (b)
Columna: CAPCELL PAK C18 SG120 9 4.6 mm * 250 mm (fabricada por SHISEIDO Co.)
Temperatura: 40°C
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Caudal: 1 ml/min.
Deteccion: 240 nm
Eluyente: acetonitrilo/agua (50:50, v/v) isocratico
Tiempo de retencion: sustancia 11107B 7,2 min., sustancia 11107D 3,6 min.
Ejemplo de referencia 4
Un asa del cultivo inclinado [0,5% de almidon soluble, 0,5% de glucosa, 0,1% de extracto de carne de pescado (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0,1% de extracto de levadura (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.), 0,2% de NZ-case (fabricado por Humko Sheffield Chemical Co.), 0,2% de cloruro sodico, 0,1% de carbonato calcico y 1,6% de agar (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] de cepa de Streptomyces sp. AB-1704 (FERM P-18999) aislada del suelo se inoculo en un matraz de Erlenmeyer de 500 ml que contema 100 ml de un medio de siembra [2,0% de almidon soluble, 1,0% de glucosa, 0,5% de polipeptona (fabricada por Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0,5% de extracto de levadura (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.) y 0,1% de carbonato calcico] y se cultivo a 28°C durante tres dfas en una incubadora agitada para dar un cultivo de siembra. Ademas, cada 2 ml del cultivo de siembra se inocularon en un matraz de Erlenmeyer de 500 ml (150 matraces) que contema cada uno 100 ml de un medio de produccion [2,0% de almidon soluble, 1,0% de glucosa, 0,5% de polipeptona (fabricada por Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0,5% de extracto de levadura (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.), y 0,1% de carbonato calcico] y se cultivo a 28°C durante dos dfas en una incubadora agitada.
Se preparo una solucion de 20 mg/ml de la sustancia 11107B de sustrato en etanol, y cada 0,44 ml de la solucion se anadieron al cultivo (100 ml/matraz de Erlenmeyer de 500 ml, 150 matraces). Despues de la adicion, se agito a 28°C durante 9 horas para llevar a cabo la conversion. Despues de la finalizacion de la reaccion, los cultivos se recogieron y se separaron en el sobrenadante de cultivo y la torta micelar mediante centrifugacion a 2.700 rpm durante 10 minutos. La torta micelar se extrajo con 5 l de metanol y se filtro para dar el extracto de metanol. Este extracto de metanol se evaporo para retirar el metanol, se combino con el sobrenadante de cultivo y se extrajo con 10 l de acetato de etilo. La solucion de acetato de etilo resultante se evaporo para dar 2.090 mg de una fraccion activa en bruto. La fraccion activa en bruto se disolvio en 4 ml de una mezcla de tetrahidrofurano-metanol (1:1, v/v) y 6 ml de una solucion acuosa al 50% de acetonitrilo, se sometio a cromatograffa en columna ODS (fabricada por YMC Co., ODS-AM 120-S50 93,6 cm x 43 cm) y se eluyo con una solucion acuosa al 40% de acetonitrilo. Una fraccion eluida de 336 ml a 408 ml se concentro hasta sequedad bajo presion reducida para dar 560 mg de un residuo. Ademas, el residuo se disolvio en 10 ml de una solucion acuosa al 50% de metanol, se sometio a cromatograffa en columna ODS (fabricada por YMC Co., ODS-AM 120-S50 93.,6 cm x 40 cm) y se eluyo con una solucion acuosa al 50% de metanol. Una fraccion eluida de 1.344 ml a 1.824 ml se concentro hasta sequedad bajo presion reducida para dar 252 mg de sustancia 11107D.
Ejemplo de referencia 5
Un asa del cultivo inclinado (medio de levadura-malta-agar) de la cepa A-1544 (FERM P-18943) se inoculo en un matraz de Erlenmeyer de 250 ml que contema 25 ml de un medio de siembra [2% de almidon soluble, 2% de glucosa, 2% de harina de soja (ESUSAN-MEAT fabricada por Ajinomoto Co., Ltd.), 0,5% de extracto de levadura (fabricado por Difco), 0,25% de cloruro sodico y 0,32% de carbonato calcico, pH 7,4 antes de la esterilizacion] y se cultivo a 28°C durante dos dfas en una incubadora agitada para dar un cultivo de siembra. Cada 0,75 ml del cultivo se distribuyeron en tubos para suero de 2 ml (fabricados por Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) y se anadio una cantidad igual de una solucion acuosa al 40% de glicerol. Despues de remover, se congelo a -70°C para dar un cultivo de siembra congelado. El cultivo de siembra congelado se fundio, se inocularon 0,25 ml del mismo en un matraz de Erlenmeyer de 250 ml que contema 25 ml de un medio de siembra [2% de almidon soluble, 2% de glucosa, 2% de harina de soja (ESUSAN-MEAT fabricada por Ajinomoto Coa., Ltd.), 0,5% de extracto de levadura (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.), 0,25% de cloruro sodico y 0,32% de carbonato calcico, pH 7,4 antes de la esterilizacion] y se cultivo a 28°C durante dos dfas en una incubadora agitada para dar un cultivo de siembra. Ademas, el cultivo de siembra (0,5 ml) se inoculo en un matraz de Erlenmeyer de 500 ml que contema 100 ml de medio de produccion [2% de almidon soluble, 2% de glucosa, 2% de harina de soja (ESUSAN-MEAT fabricada por Ajinomoto Co., Ltd.), 0,5% de extracto de levadura (fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd.), 0,25% de cloruro sodico y 0,32% de carbonato calcico, pH 7,4 antes de la esterilizacion] y se cultivo a 28°C durante tres dfas en una incubadora agitada.
Cada uno de los cultivos resultantes (100 ml/matraz de Erlenmeyer de 500 ml, 10 matraces) se sometio a centrifugacion a 3.000 rpm durante 10 minutos para recoger las celulas, y las celulas se suspendieron en 100 ml de una solucion tamponadora de fosfato 50 mM (pH 6,0). Posteriormente, se preparo una solucion de 100 mg/ml de la sustancia 11107B de sustrato en dimetilsulfoxido, y se anadieron cada uno de 0,5 ml de la solucion. Despues de la adicion, se agito a 28°C durante 24 horas para llevar a cabo la conversion. Despues de la finalizacion de la reaccion,
las mezclas de reaccion se recogieron y se separaron en el sobrenadante y la torta micelar mediante centrifugacion a 5.000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se extrajo con 1 l de acetato de etilo. La torta micelar se extrajo con 500 ml de metanol y a continuacion se filtro para dar un extracto de metanol. El extracto de metanol se evaporo para retirar el metanol y se extrajo con 1 l de acetato de etilo. Cada una de las capas de acetato de etilo se lavo con 5 agua, se seco sobre sulfato sodico anhidro y las capas combinadas se evaporaron para dar 937 mg de una fraccion activa en bruto. La fraccion activa en bruto se sometio a cromatograffa en columna de gel de sflice (Kiesel gel 60, 50 g) y se eluyo con 1.200 ml de una mezcla de acetato de etilo y n-hexano (90:10; v/v) para dar 234 mg de una fraccion activa. La fraccion activa resultante se sometio a cromatograffa de ftquidos de alta resolucion (HPLC) preparativa bajo las siguiente condicion de HPLC preparativa (C), y el eluato resultante se analizo mediante HPLC 10 bajo la siguiente condicion de HPLC analftica (c). El disolvente se retiro de la fraccion que contema la sustancia 11107D asf obtenida, para dar 80 mg de la sustancia 11107D.
Condicion de HPLC preparativa (C)
Columna: CAPCELL PAK C18 UG120 9 30 x 250 mm (fabricada por SHISEIDO Co.)
Caudal: 20 ml/min.
15 Deteccion: 240 nm
Eluyente: acetonitrilo/agua (30:70, v/v) isocratico Condicion de HPLC analftica (c)
Columna: CAPCELL PAK C18 SG120 9 4.6 mm x 250 mm (fabricada por SHISEIDO Co.)
Temperatura: 40°C 20 Caudal: 1 ml/min.
Deteccion: 240 nm
Eluyente: acetonitrilo/agua (35:65, v/v) isocratico Tiempo de retencion: sustancia 11107D 7,8 min.
Ejemplo de referencia 6
25 Cada uno de los cultivos de la cepa A-1545 (FERM P-18944) (100 ml/matraz de Erlenmeyer de 500 ml, 10 matraces) obtenidos mediante un metodo similar al descrito para el Ejemplo de referencia 9 se sometio a centrifugacion a 3.000 rpm durante 10 minutos para recoger las celulas, y las celulas se suspendieron en 100 ml de una solucion tamponadora de fosfato 50 mM (pH 6,0). Posteriormente, se preparo una solucion de 100 mg/ml del sustrato 11107B en dimetilsulfoxido, y se anadio cada 1 ml de la solucion. Despues de la adicion, se agito a 28°C durante 24 horas 30 para llevar a cabo la conversion. Despues de la finalizacion de la reaccion, las mezclas de reaccion se recogieron y se separaron en el sobrenadante y la torta micelar mediante centrifugacion a 5.000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se extrajo con 1 l de acetato de etilo. La torta micelar se extrajo con 500 ml de acetona y a continuacion se filtro para dar un extracto de acetona. El extracto de acetona se evaporo para retirar la acetona y se extrajo con 1 l de acetato de etilo. Cada una de las capas de acetato de etilo se lavo con agua, se seco y se 35 deshidrato sobre sulfato sodico anhidro y las capas combinadas se evaporaron para dar 945 mg de una fraccion activa en bruto. La fraccion activa en bruto se sometio a cromatograffa en columna de gel de sflice (Kiesel gel 60, 50 g), se eluyo con 100 ml de una mezcla de acetato de etilo y n-hexano (50:50; v/v), 200 ml de una mezcla de acetato de etilo y n-hexano (75:25; v/v) y 600 ml de una mezcla de acetato de etilo y n-hexano (90:10; v/v), para dar 463 mg de una fraccion activa. La fraccion activa obtenida se sometio a cromatograffa de ftquidos de alto rendimiento 40 (HPLC) preparativa bajo la condicion de HPLC preparativa (C) descrita en el Ejemplo 4, el eluato resultante se analizo mediante HPLC bajo la condicion de HPLc analftica descrita en el Ejemplo 4. El disolvente se retiro de la fraccion que contema la sustancia 11107D asf obtenida, para dar 304 mg de sustancia 11107D.

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1. (8E,12E,14E)-7-((4-Cicloheptilpiperacin-1-il)carbonil)oxi-3,6,16,21-tetrahidroxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,19- epoxitricosa-8,12,14-trien-11 -olido.
  2. 2. Un medicamento que comprende el compuesto segun la reivindicacion 1, una sal farmacologicamente aceptable del mismo o un hidrato de ellos como un ingrediente activo.
  3. 3. Una composicion farmaceutica que comprende el compuesto segun la reivindicacion 1, una sal farmacologicamente aceptable del mismo o un hidrato de ellos como un ingrediente activo.
  4. 4. El medicamento segun la reivindicacion 2, que es un agente terapeutico para tratar un cancer solido.
  5. 5. El medicamento segun la reivindicacion 4, en el que el cancer solido es cancer de pulmon, tumor cerebral, cancer de mama, cancer de prostata, cancer ovarico, cancer de colon o melanoma.
  6. 6. Uso del compuesto segun la reivindicacion 1, una sal farmacologicamente aceptable del mismo o un hidrato de ellos, para la preparacion de un medicamento para tratar canceres solidos.
  7. 7. Uso segun la reivindicacion 6, en el que el cancer solido es cancer de pulmon, tumor cerebral, cancer de mama, cancer de prostata, cancer ovarico, cancer de colon o melanoma.
  8. 8. El compuesto segun la reivindicacion 1, una sal farmacologicamente aceptable del mismo o un hidrato de ellos para el uso en un metodo para tratar canceres solidos.
  9. 9. El compuesto para el uso segun la reivindicacion 8, en el que el cancer solido es cancer de pulmon, tumor cerebral, cancer de mama, cancer de prostata, cancer ovarico, cancer de colon o melanoma.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CA2507641A1 (en) 2002-11-29 2004-06-17 Mercian Corporation Method of producing macrolide compound
KR20060110865A (ko) * 2003-11-27 2006-10-25 에자이 가부시키가이샤 매크로라이드계 화합물의 수산화에 관여하는 ｄｎａ
CA2553573A1 (en) * 2004-01-29 2005-08-11 Eisai R & D Management Co., Ltd. Method for stabilizing macrolide compound
ATE469985T1 (de) * 2004-02-06 2010-06-15 Eisai R&D Man Co Ltd Verfahren zur untersuchung der empfindlichkeit einer krebszelle gegenüber einem antikrebsmittel
US8008049B2 (en) 2004-07-20 2011-08-30 Eisai R&D Management Co., Ltd. DNA coding for polypeptide participating in biosynthesis of pladienolide
JPWO2007043621A1 (ja) 2005-10-13 2009-04-16 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 プラジエノライドｂ及びプラジエノライドｄの全合成方法
EP2053393A1 (en) * 2006-08-02 2009-04-29 Eisai R&D Management Co., Ltd. Pladienolide target molecule, compound capable of binding to the target molecule, and screening method for the compound
AU2007285215A1 (en) * 2006-08-14 2008-02-21 Eisai R & D Management Co., Ltd. Stable lyophilized preparation
CL2008000231A1 (es) * 2007-01-29 2008-05-30 Eisai R&D Man Co Ltd Forma solida de (8e,12e,14e)-7-((4-cicloheptilpiperazin-1-il)carbonil)oxi-3,6,16,21-tetrahidroxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,19-epoxitricosa-8,12,14-trien-il-olido; proceso de preparacion; composicion farmaceutica; y uso en el tratamiento del cancer.
US20100086931A1 (en) * 2007-03-05 2010-04-08 Eisai R&D Management Co., Ltd. Method for assaying action of antitumor agent using decrease in gene expression level as index
JPWO2008111464A1 (ja) 2007-03-05 2010-06-24 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 スプライシング異常を指標とする抗ガン剤の作用検定方法
US20080312317A1 (en) * 2007-04-12 2008-12-18 Eisai R&D Management Co., Ltd. 12 membered-ring macrolactam derivatives
WO2009008492A1 (ja) 2007-07-06 2009-01-15 Eisai R & D Management Co., Ltd. マクロライド系化合物の製造方法およびその製造中間体
GB0821539D0 (en) * 2008-11-25 2008-12-31 Merlion Pharmaceuticals Pte Ltd Therapeutic compounds and their use
UA119458C2 (uk) 2014-05-15 2019-06-25 Ейсей Р Енд Д Менеджмент Ко., Лтд. Сполуки піридину пладієноліду та способи застосування
WO2017040526A2 (en) 2015-09-01 2017-03-09 Eisai R&D Management Co., Ltd. Splice variants associated with neomorphic sf3b1 mutants
MD3377485T2 (ro) 2015-11-18 2020-02-29 Eisai R&D Man Co Ltd Formă în stare solidă a unor compuși de piridină pladienolidă și metode de utilizare
JP2020514348A (ja) 2017-03-15 2020-05-21 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 スプライセオソーム変異及びその使用
JP7335265B2 (ja) * 2018-04-09 2023-08-29 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 ある種のプラジエノライド化合物及び使用方法
CN112368270B (zh) 2018-04-12 2023-10-13 卫材R&D管理有限公司 作为用于治疗癌症的剪接体靶向剂的普拉二烯内酯衍生物
EP3801632A1 (en) 2018-06-01 2021-04-14 Eisai R&D Management Co., Ltd. Splicing modulator antibody-drug conjugates and methods of use
BR112020024551A2 (pt) 2018-06-01 2021-03-02 Eisai R&D Management Co., Ltd. métodos para usar moduladores de splicing
RU195959U1 (ru) * 2019-09-23 2020-02-11 Анна Александровна Золотенкова Устройство для механической нейростимуляции языка
KR20230020441A (ko) 2020-06-05 2023-02-10 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 항-bcma 항체-약물 컨쥬게이트 및 이용 방법
TW202233187A (zh) 2020-11-04 2022-09-01 日商衛材R&D企管股份有限公司 骨髓發育不良症候群（ｍｄｓ）之生物標記物及其使用方法
WO2023131866A1 (en) 2022-01-05 2023-07-13 Eisai R&D Management Co., Ltd. Biomarkers for myelodysplastic syndrome (mds) and methods of using the same

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL27183A (en) 1966-02-01 1970-07-19 Upjohn Co Parenteral composition comprising freeze dried mannitol
JPS6054933B2 (ja) 1978-01-27 1985-12-03 小野薬品工業株式会社 プロスタグランジン及びプロスタグランジン類似化合物製剤の安定化法
JPH04352783A (ja) 1991-05-27 1992-12-07 Taisho Pharmaceut Co Ltd １２員環マクロライド系化合物
CN1046516C (zh) 1994-04-25 1999-11-17 协和发酵工业株式会社 化合物dx－52－1的稳定方法和其冻干组合物
AU5179800A (en) * 1999-06-03 2000-12-28 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The Mycolactone and related compounds, compositions and methods of use
JP3240129B1 (ja) 1999-09-09 2001-12-17 三共株式会社 トリアゾール抗真菌剤
US6391903B1 (en) 1999-09-09 2002-05-21 Sankyo Company, Limited Triazole derivatives having antifungal activity
JP4953501B2 (ja) 1999-09-30 2012-06-13 大塚化学株式会社 ３−セフェム誘導体結晶の製造方法
WO2002012533A2 (en) 2000-08-03 2002-02-14 Kosan Biosciences, Inc. Fermentation and purification of mycolactones
TWI312681B (en) * 2001-02-01 2009-08-01 Novel physiologically active substance
TWI233361B (en) * 2001-04-13 2005-06-01 Gen Hospital Corp Methods of preventing UVB-induced skin damage
TWI334866B (en) 2002-05-29 2010-12-21 Mercian Corp Novel physiologically active substances
JP2004269488A (ja) 2002-06-06 2004-09-30 Hayashibara Biochem Lab Inc 結晶α−Ｄ−グルコシルα−Ｄ−ガラクトシドとこれを含有する糖質及びこれらの製造方法並びに用途
AU2003252445B2 (en) * 2002-07-31 2009-09-17 Eisai R & D Management Co., Ltd. Novel physiologically active substances
US7576204B2 (en) 2002-07-31 2009-08-18 Mercian Corporation Heterocyclic macrolide pharmaceutical agent, a method of producing the same and use of the same
CA2507641A1 (en) 2002-11-29 2004-06-17 Mercian Corporation Method of producing macrolide compound
US20050106275A1 (en) 2003-05-02 2005-05-19 Chen Su Morinda citrifolia-based formulation for inhibiting metastasis of carcinogenic cells
CA2521928A1 (en) 2003-05-07 2004-11-18 Eisai Co., Ltd. Freeze-dried preparation containing methylcobalamin and process for producing the same
CA2553573A1 (en) 2004-01-29 2005-08-11 Eisai R & D Management Co., Ltd. Method for stabilizing macrolide compound
JP2007269628A (ja) 2004-05-28 2007-10-18 Takeda Chem Ind Ltd 医薬化合物の結晶
JPWO2006075690A1 (ja) 2005-01-14 2008-06-12 小野薬品工業株式会社 安定な医薬組成物
KR20080007649A (ko) 2005-05-11 2008-01-22 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 피페리딘환을 가지는 인돌 유도체의 결정 및 그의 제조방법
JPWO2007043621A1 (ja) * 2005-10-13 2009-04-16 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 プラジエノライドｂ及びプラジエノライドｄの全合成方法
AU2007285215A1 (en) 2006-08-14 2008-02-21 Eisai R & D Management Co., Ltd. Stable lyophilized preparation
CL2008000231A1 (es) * 2007-01-29 2008-05-30 Eisai R&D Man Co Ltd Forma solida de (8e,12e,14e)-7-((4-cicloheptilpiperazin-1-il)carbonil)oxi-3,6,16,21-tetrahidroxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,19-epoxitricosa-8,12,14-trien-il-olido; proceso de preparacion; composicion farmaceutica; y uso en el tratamiento del cancer.

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