ES2600919T3 - Oligonucleótidos para el tratamiento o alivio de edema - Google Patents

Abstract

Compuesto oligonucleotídico aislado y sustancialmente purificado que comprende una secuencia según SEQ ID NO 6 (IDX 9078).

Description

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DESCRIPCION

Oligonucleotidos para el tratamiento o alivio de edema Campo tecnico

Esta invencion y realizaciones de la misma se refieren al campo de la medicina, y en particular a compuestos novedosos y a metodos para su uso en el tratamiento o alivio de edema, un trastorno o disfuncion en el equilibrio del liquido intersticial en cualquier organo o tejido, que se encuentra en varios estados medicos.

Antecedentes

El edema puede definirse como una acumulacion anomala de liquido en los intersticios de celulas en espacios tisulares o en cavidades corporales. Puede estar provocado o bien por un movimiento excesivo de liquido desde el sistema vascular al interior de los tejidos o bien por un movimiento inadecuado de liquido desde los tejidos de vuelta al sistema vascular. El intercambio normal de liquido entre estos dos compartimentos se regula por la “ecuacion de Starling” de liquido tisular, mediante la cual la generacion de liquido intersticial depende del equilibrio de presion osmotica y presion hidrostatica que actuan en sentidos opuestos a traves de las paredes capilares semipermeables. El edema es el resultado de un desequilibrio en estas fuerzas, que tiende a provocar acumulacion anomala de liquido en los espacios intersticiales.

Las manifestaciones clinicas del edema incluyen hinchamiento de leve a intenso del cuerpo y un aumento de peso corporal. El hinchamiento puede o bien estar provocado por un aumento generalizado (o sistemico) de liquido extracelular o bien deberse a acumulaciones edematosas que se confinan en un sitio localizado. La anasarca, el estado medico para edema generalizado, esta marcada por el hinchamiento de los tejidos subcutaneos, mientras que el edema localizado se denomina normalmente, basandose en el sitio afectado, hidrotorax (liquido seroso en exceso en los espacios entre la en pleura), hidropericardio (liquido en exceso en el pericardio), hidroperitoneo o ascitis (liquido en exceso en la cavidad peritoneal), entre otros.

La composicion del liquido extravascular que se acumula en el edema varia segun su etiologia. En el caso de edema provocado por mecanismos no inflamatorios, el liquido (transudado) comprende una concentracion en proteinas relativamente baja y tiene menor densidad relativa, lo que indica que el endotelio del sitio afectado es normal. En tales casos, el transudado es esencialmente un ultrafiltrado de plasma sanguineo. Esta clase de edema no inflamatorio esta provocado principalmente por alteraciones en las fuerzas hemodinamicas a traves de la pared capilar y tambien se conoce como edema hemodinamico. Por otro lado, en el caso de edema que esta provocado por una respuesta inflamatoria, el liquido extravascular (exudado) comprende una alta concentracion de proteinas, celulas y residuos celulares y tiene una alta densidad relativa. Esto indica una alteracion significativa en la permeabilidad normal de los vasos sanguineos pequenos en la zona afectada.

El edema se produce normalmente como manifestacion funcional importante de la patogenesis de diversas enfermedades, pero tambien puede producirse como resultado de traumatismo y lesion. Insuficiencia cardiaca, cirrosis del higado y enfermedades renales tales como sindrome nefrotico son algunas de las enfermedades sistemicas mas comunes que producen edema. Los principales mecanismos implicados en el desarrollo de edema durante la patogenesis de la enfermedad incluyen aumento de la presion hidrostatica intravascular, alteracion del flujo de linfa, retencion inapropiada de agua y sodio renal, reduccion de la presion osmotica plasmatica y aumento de la permeabilidad vascular.

El aumento en la presion hidrostatica en las venas da como resultado una mala reabsorcion de liquidos desde el tejido, y este desequilibrio da como resultado edema. El aumento en la presion hidrostatica puede o bien producirse como aumento generalizado en la presion venosa o bien afectar solo a un sitio especifico. Un aumento local en la presion hidrostatica puede resultar de un flujo de salida venoso alterado, que se encuentra habitualmente en las extremidades inferiores y es consecuencia del desarrollo de trombosis obstructiva y venas varicosas. El edema resultante esta localizado en las piernas y las extremidades inferiores, conocido comunmente como edema periferico. Un aumento generalizado en la presion venosa da como resultado edema sistemico, que se observa comunmente en el caso de insuficiencia cardiaca congestiva. Especificamente, la insuficiencia en el lado izquierdo del corazon da como resultado acumulacion de liquido en los pulmones (alveolos), dando como resultado disnea y edema pulmonar. Por otro lado, durante la insuficiencia del lado derecho del corazon, se acumula liquido en las extremidades inferiores, provocando edema periferico. A medida que el estado progresa o empeora, las extremidades superiores tambien se hinchan y, finalmente, se produce acumulacion de liquido en la cavidad peritoneal, lo cual da como resultado un estado edematoso conocido como ascitis. Se ha observado que causas del edema, que estan generalizadas por todo el organismo, pueden provocar edema en multiples organos.

El flujo alterado de linfa o la obstruccion linfatica da como resultado un drenaje inadecuado de liquido intersticial, que por consiguiente provoca linfedema localizado. El linfedema es un estado edematoso debilitante comun en el que se acumula linfa en exceso en tejidos. Puede estar provocado por una obstruccion inflamatoria o neoplasica, presion por un cancer o un ganglio linfatico aumentado, destruccion de vasos linfaticos por radioterapia o infiltracion del

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sistema linfatico por infecciones tales como elefantiasis o filariasis, entre otros.

La retencion excesiva de sodio y agua por los rinones provoca un aumento del volumen de liquido intravascular, lo que finalmente aumenta la presion hidrostatica y provoca edema. Estados tales como insuficiencia renal aguda o glomerulonefritis estreptococica, entre otros, afectan directamente a la funcion renal normal y provocan retencion anomala de sales en el organismo. Aparte de esto, la patogenesis de diversos trastornos tales como insuficiencia cardiaca congestiva, hipoalbuminemia, etc., activa el sistema hormonal de renina-angiotensina-aldosterona (RAAS), que fomenta la retencion de sodio y agua. Por tanto, el edema que se inicia mediante un mecanismo se complica por el mecanismo secundario de retencion de sal y liquido. Una carga de liquido adicional en el organismo y el circulo vicioso de retencion de liquido desequilibra adicionalmente el gradiente de presion a traves de las membranas y da como resultado empeoramiento del edema.

La disminucion de la presion osmotica plasmatica dentro de los vasos facilita el movimiento de liquidos hacia los espacios intersticiales, dando como resultado edema. Tal disminucion en la presion osmotica plasmatica puede ser el resultado o bien de una perdida excesiva o bien de una sintesis reducida de proteinas plasmaticas para las que es impermeable la membrana capilar, especialmente albuminas, que contribuyen principalmente a mantener el volumen sanguineo. La causa mas importante de perdida excesiva de albumina es un trastorno renal conocido como el sindrome nefrotico, que se caracteriza por una membrana basal glomerular con fugas, y que finalmente da como resultado edema generalizado. La sintesis reducida de proteinas sericas, especialmente albuminas (o hipoalbuminemia), se produce en enfermedades difusas del higado, tales como cirrosis, o esta asociada con la malnutricion. En todos estos casos, el movimiento de liquido desde el compartimento intravascular hasta el intersticial da como resultado una contraccion del volumen de plasma, lo cual da como resultado sintomas de tipo edema generalizado tales como ascitis y edema periferico, entre otros.

Otra causa importante para la perdida excesiva de proteinas plasmaticas es un aumento en la permeabilidad de los vasos sanguineos frente a proteinas plasmaticas. Esta permeabilidad aumentada provoca movimiento de proteinas y celulas, tales como leucocitos, desde la circulacion hasta el intersticio. La perdida de liquido rico en proteinas del plasma reduce la presion osmotica intravascular y aumenta la presion osmotica del espacio intersticial, lo cual da finalmente como resultado un flujo de salida de liquido desde los vasos sanguineos hasta el intersticio, provocando el edema. Un aumento en la permeabilidad vascular es una de las principales caracteristicas de la respuesta inflamatoria del organismo frente a estimulos, especialmente en el caso de inflamacion aguda. De hecho, el edema es uno de los principales signos de inflamacion aguda. Durante la inflamacion, los factores quimicos derivados del plasma y desencadenados por estimulos inflamatorios median en varias respuestas vasculares y celulares en el sitio afectado. Estos cambios estructurales en la microvasculatura dan como resultado un aumento de la permeabilidad de la membrana de los vasos sanguineos, provocando movimiento de celulas y proteinas plasmaticas, por ejemplo leucocitos desde la circulacion hasta el intersticio, lo cual da como resultado en ultima instancia edema especifico el sitio. El edema inflamatorio puede atribuirse en gran medida a la accion directa de histamina, bradicinina y otras sustancias relacionadas. Los principales mecanismos del aumento de la permeabilidad vascular en la inflamacion incluyen contraccion de celulas endoteliales, retraccion de la union, lesion directa, fugas dependientes de leucocitos, regeneracion del endotelio, entre otros. El aumento de la filtracion de liquido hacia el intersticio se ve potenciado adicionalmente por la accion vasodilatadora arteriolar de los mediadores inflamatorios, lo cual aumenta el flujo sanguineo, el area superficial sometida a perfusion, la presion hidrostatica capilar y tambien facilita el edema mediante otros mecanismos.

En resumen, se conoce el edema como una de las manifestaciones funcionales importantes de la patogenesis de diversas enfermedades. La insuficiencia cardiaca, cirrosis del higado, sindrome nefrotico, entre otros, son algunas de las enfermedades sistemicas mas comunes que finalmente dan como resultado edema. Entender la dinamica del edema y las otras manifestaciones clinicas relacionadas asociadas con estas enfermedades es importante para descifrar su patologia completa y tambien puede ayudar a desarrollar estrategias de diagnostico, terapeuticas y preventivas novedosas y altamente especificas frente a estas enfermedades.

Un objetivo es poner a disposicion compuestos y metodos novedosos para la prevencion, el alivio o el tratamiento de edema. Otros objetivos y sus ventajas asociadas resultaran evidentes a partir del estudio de la descripcion y los ejemplos.

Algunos compuestos oligonucleotidicos se dan a conocer en SPIIK A-K et al., “Abrogated lymphocyte infiltration and lowered CD14 in dextran sulfate induced colitis in mice treated with p65 antisense oligonucleotides”, INTERNATIONAL JOURNAL OF COLORECTAL DISEASE 2002 DE LNKD- 001:10.1 007/S00384-001-0366-3, vol. 17, n.2 4, 2002, paginas 223-232, XP002602711, ISSN: 0179-1958.

El documento WO 2007/004979 A1 del mismo solicitante (Index Pharmaceuticals AB) se refiere a la potenciacion de la eficacia de esteroides en un paciente que no responde al tratamiento con esteroides que padece un estado inflamatorio que no responde o responde mal o de manera inadecuada al tratamiento antiinflamatorio, mediante la administracion de una cantidad eficaz de un oligonucleotido que tiene la secuencia 5’-Xm-TTCGT-Yn-3’ a 5 dicho paciente, en la que X es A, T, C o G, Y es A, T, C o G, m=0-7, n=0-7 y en la que al menos un dinucleotido CG esta desmetilado.

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El documento US 5.968.826 da a conocer composiciones y metodos que se proporcionan para modular la expresion de integrina alfa 4. Se prefieren compuestos antisentido, particularmente oligonucleotidos antisentido, dirigidos a acidos nucleicos que codifican para integrina alfa 4. Tambien se proporcionan metodos de uso de estos compuestos para modular la expresion de integrina alfa 4 y para el tratamiento de enfermedades asociadas con la expresion de integrina alfa 4.

D’ACQUISTO F ET AL: “Local administration of transcription factor decoy oligonucleotides to nuclear factor-kappaB prevents carrageenin-induced inflammation in rat hind paw”, GENE THERAPY OCT 2000 LNKDPUBMED: 11083494, vol. 7, n.2 20, octubre de 2000 (10-2000), paginas 1731 -1737, XP002602712, ISSN: 0969-7128

DATABASE EMBL [en linea], 19 de abril de 2007 (), “WangVSVGgfp-Jurkat-454-Avr-163695_0092_1182 Wang-VSVGgfpJurkat-454-Avr Homo sapiens genomic, genomic survey sequence”, recuperada de EBI con el n.° de registro EM GSS:E1575951, n.° de registro de base de datos E1575951.

El documento WO 02/12894 A1 se refiere a la identificacion de actividad supresora de tumor de una proteina, KLF6 (KLF6), y a composiciones y metodos de diagnostico y terapeuticos relacionados. La solicitud de patente internacional publicada WO 02/12894 parece dar a conocer un oligonucleotido con una identidad del 82,35% con respecto a la SEQ ID NO: 6 de la presente invencion.

Sumario

Los inventores ponen a disposicion un oligonucleotido segun la reivindicacion 1 y metodos para la prevencion, el tratamiento o el alivio de edema tal como se expone en las reivindicaciones adjuntas. Los presentes inventores encontraron sorprendentemente que un compuesto oligonucleotidico que comprende una secuencia segun SEQ ID NO 6 es eficaz en el tratamiento o alivio de edema.

Segun una realizacion de la invencion, el compuesto oligonucleotidico, que comprende la secuencia SEQ ID NO 6, tiene una a longitud total de entre aproximadamente 12 y aproximadamente 30 bases.

Los inventores han identificado y sometido a prueba secuencias oligonucleotidicas individuales, y han mostrado su utilidad en el tratamiento o alivio de edema.

Basandose en estos hallazgos, los inventores presentan compuestos especificos tal como se da a conocer en las reivindicaciones adjuntas. Estos compuestos se han sometido a prueba tanto in vitro como in vivo, y los resultados experimentales respaldan en un principio la teoria de que los compuestos reducen el edema al reducir la permeabilidad vascular.

Breve descripcion de las figuras

A continuacion se describiran realizaciones con mas detalle, en la descripcion, ejemplos y reivindicaciones, que deben estudiarse junto con los dibujos adjuntos en los que:

La figura 1 es un grafico que muestra el efecto antiinflamatorio de farmacos de prueba y de control en un modelo de edema de oreja inducido por 13-acetato de tetradecanoilforbol (TPA). IDX0920 (50 pg), IDX0150 (100 pg), IDX0955 (100 pg) y el farmaco de prueba IDX0001 (100 pg) administrados como una unica inyeccion s.c. 20 minutos antes de la administracion de TPA. Se establece el grosor inicial de las orejas como el 100%. La reduccion del area bajo la curva (AUC) en comparacion con PBS es para IDX0920 del -22,1% (P<0,011), IDX0150 del -38,9% (P<0,011), IDX0955 del -4,8% e IDX0001 del -15,7% (P>0,05). ANOVA de un factor con prueba de comparaciones multiples de Dunnett.

La figura 2 muestra resultados del modelo de edema de oreja inducido por TPA que muestra el valor maximo inflamatorio promedio de hinchamiento tras la administracion de 100 pg de IDX0150 combinado a partir de 10 experimentos con el modelo de TPA en comparacion con control negativo (vehiculo de PBS con TPA). Prueba de la t de Student, ***P <0,001, ± DE.

La figura 3a es un histograma combinado a partir del modelo de edema de oreja inducido por TPA. Reduccion del valor maximo de edema mediante el tratamiento con IDX0150, en comparacion con tratamiento con vehiculo (PBS). Barras negras, administracion intranasal (i.n.), barra blanca, administracion intraperitoneal (i.p.) y barras con sombreado, administracion subcutanea (s.c.).

Tratamiento con IDX0150 a: -4 dias antes de la administracion de TPA (I, E y F), -2 dias antes de la administracion de TPA (D), -20 min antes de la administracion de TPA (H, A, B y C), +2 h tras la administracion de TPA (J y G). En todos los casos, se usaron 100 pg de IDX0150/raton para el tratamiento, excepto por el estudio F en el que se usaron 50 pg de IDX0150/raton. E,F o B,C son la media de dos experimentos.

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La figura 3b es un histograma combinado a partir del modelo de edema de oreja inducido por TPA. Reduccion del area bajo la curva (AUC) de edema mediante tratamiento con IDX0150, en comparacion con tratamiento con vehiculo (PBS). Barras negras, administracion intranasal (i.n.), barra blanca, administracion intraperitoneal (i.p.) y barras con sombreado, administracion subcutanea (s.c.). Tratamiento con IDX0150 a: -4 dias antes de la administracion de TPA (I, E y F), -2 dias antes de la administracion de TPA (D), -20 min antes de la administracion de TPA (H, A, B y C), +2 h tras la administracion de TPA (J y G). En todos los casos se usaron 100 pg de IDX0150/raton para el tratamiento, excepto por el estudio F en el que se usaron 50 pg de IDX0150/raton. E,F o B,C son la media de dos experimentos.

La figura 4 es un histograma que muestra el efecto de fenidona e IDX0150 en el modelo de edema de oreja inducido por acido araquidonico (AA). Fenidona, administrada 30 min antes de la induccion por AA, mostro una reduccion del AUC de -39,1%, P <0,05, que era similar al tratamiento con IDX0150 obtenido anteriormente (vease la figura 2). Fenidona administrada 30 min antes que AA, en combinacion con IDX0150 administrado 20 min antes que AA, dio como resultado una reduccion adicional (-76,8%, P <0,001).

La figura 5a es un grafico que muestra el efecto antiinflamatorio de farmacos de prueba y vehiculo (PBS) en un modelo de edema de oreja inducido por TPA. Se administraron diez pg de IDX9024, IDX9025, IDX9038, IDX9051 e IDX9053 como una unica inyeccion s.c. 20 minutos antes de la administracion de TPA. Se establece el grosor inicial de las orejas como el 100%. Reduccion del AUC para IDX9024 del -47,3%, IDX9025 del -57,8%, IDX9038 del -47,4%, IDX9051 del -54,0% e IDX9053 del -39,0% en comparacion con el control de PBS.

La figura 5b es un grafico que muestra el efecto antiinflamatorio de farmacos de prueba y vehiculo (PBS) en un modelo de edema de oreja inducido por TPA. Se administraron diez pg de IDX9064, IDX9076, IDX9078, IDX9080 e IDX9089 como una unica inyeccion s.c. 20 minutos antes de la administracion de TPA. Se establece el grosor inicial de las orejas como el 100%. Reduccion del AUC para IDX9064 del -59,7%, IDX9076 del -5,1%, IDX9078 del -41,3%, IDX9087 del -40,2% en comparacion con el control de PBS.

La figura 5c es un grafico que muestra el efecto antiinflamatorio de farmacos de prueba y vehiculo (PBS) en un modelo de edema de oreja inducido por AA. Se administraron diez pg de IDX9024, IDX9025 e IDX9051 como una unica inyeccion s.c. 20 minutos antes de la administracion de AA. Se establece el grosor inicial de las orejas como el 100%. Reduccion del AUC para IDX9024 del -58,5%, IDX9025 del -81,9% e IDX9051 del -67,5% en comparacion con el control de PBS.

La figura 5d es un grafico que muestra el efecto antiinflamatorio de farmacos de prueba y vehiculo (PBS) en un modelo de edema de oreja inducido por AA. Se administraron diez pg de IDX9076, IDX9078 e IDX0150 como una unica inyeccion s.c. 20 minutos antes de la administracion de AA. Se establece el grosor inicial de las orejas como el 100%. Reduccion del AUC para IDX9076 del -45,7%, IDX9078 del -79,4% e IDX0150 del -89,4 % en comparacion con el control de PBS.

La figura 6 muestra los protocolos profilactico y terapeutico para el modelo murino de inflamacion alergica de las vias respiratorias inducida por ovalbumina (OVA).

La figura 7 es un histograma combinado que muestra el numero total de tipos de celulas diferentes en liquido de lavado alveolar bronquial (BAL) de ratones Balb/c inmunizados con OVA, 48 h tras el ultimo aerosol de OVA. Se trataron los ratones con IDX0150 (50 pg/animal) administrado mediante instilacion intranasal en el dia 16 y 21 en un protocolo profilactico (IDX0150, vease M y M). En un protocolo terapeutico, se administro IDX0150 en el dia 30 y 33 (IDX0150 A, vease M y M), o en el dia 30 y 34 (IDX0150 B). Las instilaciones en los protocolos terapeuticos (A y B) en el dia 30 y 33 se administraron 4 h tras la exposicion a aerosol. La segunda instilacion en el protocolo B, en el dia 34, se administro 24 h tras la ultima exposicion a aerosol. Se trataron controles sanos con PBS y se expusieron a aerosol de OVA. Datos mostrados como media ± DE. * P <0,05, *** P <0,001 usando analisis de la varianza (ANOVA) de un factor, correccion a posteriori de Dunnett. El grupo de PBS se sometio a tratamiento simulado con PBS y se expuso a aerosol de OVA.

La figura 8 es un histograma combinado que muestra los resultados de un protocolo profilactico en el modelo de asma alergico inducido por OVA. El numero total de celulas en liquido de lavado alveolar bronquial (BAL) de ratones Balb/c inmunizados con OVA, 48 h tras el ultimo aerosol de OVA (primero en el dia 0 y ultimo en el dia 12). Se trataron los ratones con IDX9025, IDX9038 o IDX9053 (50 pg/animal) administrados como instilacion intranasal en el dia 16 y 21 tras la primera inmunizacion. El grupo de PBS se inmunizo y se sometio a tratamiento simulado con PBS y se expuso a aerosol de OVA. Datos mostrados como media ± DE. * P<0,05, *** P<0,001 usando analisis de la varianza (ANOVA) de un factor, correccion a posteriori de Dunnett.

La figura 9a es un histograma que muestra el resultado del tratamiento intraperitoneal con 50 pg de IDX0150/raton, administrados 20 min antes de la induccion de pleuresia inducida por tioglicolato. El numero de celulas polimorfonucleares (PMN) en exudados pleurales mostro una reduccion del 40,9% tras el tratamiento con IDX0150

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en comparacion con ratones con inflamacion (PBS). Datos mostrados como media ± DE.

La figura 9b es un histograma que muestra el resultado del tratamiento intraperitoneal con 50 pg de IDX0150/raton, administrados 20 min antes de la induccion de pleuresia inducida por tioglicolato. IDX0150 mostro una reduccion en el volumen de aclaramiento del edema pleural con el 69,2% en comparacion con el tratamiento con tioglicolato. Datos mostrados como media ± DE.

Descripcion detallada

Antes de describir las realizaciones, debe entenderse que la terminologia empleada en el presente documento se usa unicamente con el fin de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitativa, ya que el alcance de las realizaciones se limitara unicamente por las reivindicaciones adjuntas y equivalentes de las mismas.

Debe indicarse que, tal como se usa en la presente descripcion y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Los terminos “alivio”, “tratamiento”, “prevencion”, “terapia”, “uso terapeutico”, “uso profilactico”, “medicamento” y “uso medico” cuando se usan en la descripcion y las reivindicaciones abarcan tanto aplicaciones en seres humanos como en animales o veterinarias. Resulta importante que el termino “tratamiento” se usa en el presente documento en su sentido mas amplio, sin limitarse a revertir o curar una enfermedad, sino que tambien incluye el alivio de los sintomas o el retraso de la progresion de la enfermedad.

Ademas, cuando se usa el termino “metodo de tratamiento” tambien se abarcan etapas de metodo y metodos auxiliares, es decir, casos en los que los metodos dados a conocer como tales no constituyen el metodo exhaustivo. Se contempla que los metodos de la invencion pueden constituir una etapa en una serie de acciones y medidas, que conducen al alivio, la prevencion o el tratamiento de una enfermedad.

El termino “aproximadamente” cuando se usa en el contexto de valores numericos indica un intervalo de precision, con el que esta familiarizado, y resulta aceptable para, un experto en la tecnica relevante. Dicho intervalo puede ser de +/-10% o preferiblemente +/- 5%.

La expresion “cantidad terapeuticamente eficaz” tal como se usa en el presente documento se refiere a una cantidad suficiente para inhibir o reducir el edema en cierto grado beneficioso, preferiblemente hasta en al menos el aproximadamente 10%, mas preferiblemente en al menos el 20% e incluso mas preferiblemente en al menos el 30% o mas, medido como reduccion del valor maximo, u otra medida relevante.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “fisiologicamente aceptable” se refiere a un material que es compatible con un sistema biologico tal como una celula, cultivo celular, tejido u organismo. Preferiblemente, el sistema biologico es un organismo vivo, tal como un vertebrado.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “portador” abarca cualquier excipiente, diluyente, carga, sal, tampon, estabilizador, solubilizador, lipido u otro material bien conocido en la tecnica para su uso en formulaciones farmaceuticas. Se entendera que las caracteristicas del portador, excipiente o diluyente dependeran de la via de administracion para una aplicacion particular. Los ejemplos de portadores particularmente adecuados para administracion mucosa incluyen, pero no se limitan a, solucion salina, liposomas, tensioactivos, compuestos mucoadhesivos, inhibidores enzimaticos, sales biliares, potenciadores de la absorcion y ciclodextrinas. La preparacion de formulaciones farmaceuticamente aceptables que contienen estos materiales se describen, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18s edicion, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990.

Para los fines de esta descripcion, el termino “inmunomodulador “se refiere a las propiedades de un compuesto, por ejemplo un oligonucleotido tal como se define en la presente descripcion y reivindicaciones, para inducir una respuesta inmunitaria o bien estimulando el sistema inmunitario o bien reprimiendo el sistema inmunitario o bien ambas en un organismo cuando se administra a un vertebrado, tal como un mamifero. Tal como se usa en el presente documento, el termino “mamifero” incluye, sin limitacion ratas, ratones, gatos, perros, caballos, ganado, vacas, cerdos, conejos, primates no humanos y seres humanos.

Para los fines de esta descripcion, el termino “oligonucleotido” se refiere a un polinucleosido formado a partir de una pluralidad de unidades de nucleosido individuales unidas. Tales oligonucleotidos pueden obtenerse a partir de fuentes de acido nucleico existentes, incluyendo ADN genomico o ADNc, pero preferiblemente se producen mediante metodos de sintesis. Los residuos de nucleosido pueden acoplarse entre si mediante cualquiera de las numerosas uniones internucleosidicas conocidas. Tales uniones internucleosidicas incluyen, sin limitacion, el enlace de fosfodiester internucleosidico natural o de hecho internucleosidos modificados tales como, pero sin limitarse a, fosforotioato, fosforoditioato, alquilfosfonato, alquilfosfonotioato, fosfotriester, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboalcoxilo, acetamidato, carbamato, morfolino, borano, tioeter, fosforamidato en puente, metilenfosfonato en puente, fosforotioato en puente y uniones internucleosidicas de sulfona. El termino “oligonucleotido” tambien abarca

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polinucleosidos que tienen una o mas uniones internucleosidicas estereoespecificas (por ejemplo, uniones (Rp) o (Sp)-fosforotioato, alquilfosfonato o fosfotriester). Tal como se usa en el presente documento, se pretende expresamente que los terminos “oligonucleotido” y “dinucleotido” incluyan polinucleosidos y dinucleosidos que tienen cualquiera de tales uniones internucleosidicas, tanto si la union comprende un grupo fosfato como si no. En determinadas realizaciones preferidas, estas uniones internucleosidicas pueden ser uniones de fosfodiester, fosforotioato o fosforoditioato, o combinaciones de las mismas.

El termino “oligonucleotido” tambien abarca polinucleosidos que tienen sustituyentes adicionales incluyendo, sin limitacion, grupos proteicos, grupos lipofilos, agentes de intercalacion, diaminas, acido folico, colesterol y adamantano. El termino “oligonucleotido” tambien abarca cualquier otro polimero que contiene nucleobases, incluyendo, sin limitacion, acidos nucleicos peptidicos (PNA), acidos nucleicos peptidicos con grupos fosfato (PHONA), acidos nucleicos bloqueados (LNA), oligonucleotidos con esqueleto de morfolino y oligonucleotidos que tienen secciones del esqueleto con grupos de union alquilo o grupos de union amino.

El termino “administracion mucosa” incluye la administracion a cualquiera de los tipos de mucosa en el cuerpo animal, por ejemplo, pero sin limitarse a, mucosa nasal, bucal, esofagica, gastrica, intestinal, olfatoria, oral, bronquial y urogenital.

Los diferentes ejemplos ponen a disposicion compuestos oligonucleotidicos aislados y sustancialmente purificados que comprenden una secuencia elegida de las secuencias SEQ ID NO 1-10. En las tablas 1 y 2 a continuacion se presentan secuencias especificas. Se indica que las secuencias de la tabla 1, SEQ ID NO 1 - 7, comparten la siguiente secuencia o motivo: 5’-TCGTC-3’

Se considera que compuestos segun diversas realizaciones de la invencion, que comprenden las secuencias, tienen preferiblemente una longitud total de entre aproximadamente 12 y aproximadamente 30 bases.

Tabla 1. Ejemplos de secuencias oligonucleotidicas

Tabla 1

SEQ ID NO

IDX, n.2 Sec. 5’-3’

1

IDX9024 T*G*C*CATTCGTCGTTCTCGTC*G*T*T

2

IDX9025 T*G*C*CATTCGTCGATTTCGT C*G*A*T

3

IDX9038 T*C*G*TCGTTCGGCCGATCG*T*C*C

4

IDX9053 G*G*G*TCGTCTG*C*G*G

5

IDX9076 T*C*C*CAAGATCGTCC*A*G*G

6

IDX9078 T*C*C*GATCGTCC*A*G*G

7

IDX9087 T*C*G*T CT GCTT AGTTCGTT A*G*T*T

* = modificacion de fosforotioato

Tabla 2. Ejemplos de secuencias oligonucleotidicas

Tabla 2

SEQ ID NO

IDX, n.2 Sec. 5’-3’

8

IDX0001 T*C*C*GCGTTCGGCCTCCTGGCG*C*G*G

9

IDX9051 G*G*G*GCGTCTGCC*G*G*G

10

IDX9064 T*C*C*ATGGTCAGGGTCCCGG*G*G*G

* = modificacion de fosforotioato

Los inventores tambien usaron diferentes secuencias oligonucleotidicas como controles positivos y negativos. Estas se indican en la tabla 3.

Tabla 3. Ejemplos de oligonucleotidos usados como controles

Tabla 3

SEQ ID NO

IDX, n.2 Sec. 5’-3’

11

IDX0150 G*G*A*ACAGTTCGTCCAT*G*G*C

12

IDX0500 G*G*A*A*C*A*G*T*T*C*G*T*C*C*A*T*G*G*C

13

IDX0526 G*G*A*ACAGTT GCTCCAT*G*G*C

14

IDX0920 T*C*C*A*T*G*A*C*G*T*T*C*C*T*G*A*C*G*T*T

15

IDX0955 G*G*G*GAACAGTTCGTCCAT*G*G*C

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

* = modificacion de fosforotioato

Segun una realizacion de la invencion, el oligonucleotido puede estar qmmicamente modificado. Esta modificacion qmmica es por ejemplo una modificacion en el esqueleto de fosfato de al menos un nucleotido. Preferiblemente, la modificacion en el esqueleto de fosfato es una modificacion de fosforotioato o fosforoditioato.

Otras realizaciones ponen a disposicion composiciones farmaceuticas que comprenden el oligonucleotido que comprende una secuencia segun SEQ ID NO 6. Tales composiciones farmaceuticas comprenden preferiblemente ademas un excipiente o portador farmacologicamente compatible y fisiologicamente aceptable.

Segun una realizacion de la invencion, una composicion farmaceutica que comprende un oligonucleotido tal como se definio anteriormente comprende ademas un excipiente o portador farmacologicamente compatible y fisiologicamente aceptable elegido de solucion salina, liposomas, tensioactivos, compuestos mucoadhesivos, inhibidores enzimaticos, sales biliares, potenciadores de la absorcion, ciclodextrinas, etc. Un experto elegira facilmente el excipiente o portador necesario sin necesidad de un esfuerzo inventivo.

Una realizacion actualmente preferida se refiere a una formulacion farmaceutica para su administracion mucosa, que comprende un oligonucleotido segun SEQ ID NO 6. Las realizaciones de la invencion tambien se refieren al uso de un oligonucleotido segun SEQ ID NO 6, para la preparacion de una composicion farmaceutica para la prevencion, el tratamiento y/o el alivio de edema.

Este uso segun una realizacion de la invencion se centra preferiblemente en la prevencion, el tratamiento y/o el alivio de un estado o trastorno que implica edema, en el que el edema se define como un trastorno o disfuncion en el equilibrio del lfquido intersticial en cualquier organo o tejido, asociado con un estado elegido, por ejemplo, de insuficiencia cardiaca, cirrosis hepatica, enfermedades renales tales como smdrome nefrotico, malnutricion, cancer, asma, rinitis alergica, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), isquemia, traumatismo y choque septico.

En tal uso segun realizaciones de la invencion, dicho oligonucleotido se administra en una cantidad fisiologicamente aceptable y terapeuticamente eficaz, es decir una cantidad eficaz para lograr uno de regulacion de la permeabilidad vascular, inhibicion o reduccion de la migracion de leucocitos, inhibicion o reduccion de la migracion o activacion de neutrofilos, inhibicion o reduccion de la migracion de eosinofilos e inhibicion o reduccion de la migracion de linfocitos.

Segun una realizacion de la invencion, el oligonucleotido es SEQ ID NO 6, y se usa para tratar asma mediante inhibicion o reduccion de la migracion o activacion de neutrofilos.

Las realizaciones de la invencion tambien ponen a disposicion metodos para la prevencion, el tratamiento y/o el alivio de edema, en los que el oligonucleotido de SEQ ID NO 6 se administra en una dosis eficaz para lograr uno o varios de modificacion de permeabilidad vascular, inhibicion de la migracion y/o activacion de neutrofilos, inhibicion o reduccion de la migracion de eosinofilos, inhibicion o reduccion de la migracion de leucocitos e inhibicion o reduccion de la migracion de linfocitos.

En terminos generales, las realizaciones de la invencion ponen a disposicion metodos para la prevencion, el tratamiento y/o el alivio de edema, en los que una composicion farmaceutica que comprende el oligonucleotido segun SEQ ID NO 6 se administra a un paciente. Se eligen vfas de administracion adecuadas de la administracion mucosa, administracion transdermica, administracion subcutanea y administracion intraperitoneal.

Segun una realizacion, la administracion mucosa se elige de administracion gastrica, administracion nasal, inhalacion, administracion ocular, administracion rectal, administracion urogenital y vaginal.

Basandose en los efectos significativos anti-hinchamiento y anti-edema registrados en los experimentos con animales realizados por los inventores, los metodos de prevencion, tratamiento y/o alivio de edema pueden extenderse a cualquier enfermedad o estado en el que el edema es un componente, tal como una enfermedad o un estado elegido de insuficiencia cardiaca, cirrosis hepatica, enfermedades renales tales como smdrome nefrotico, malnutricion, cancer, asma, rinitis alergica, EPOC, lesion pulmonar aguda, estados que implican la acumulacion de exudado en el pulmon o los pulmones, isquemia, traumatismo y choque septico.

Entre los estados que implican la acumulacion de exudado en el pulmon, pueden mencionarse los siguientes estados: efusion plural de diferente etiologfa, infecciones de las vfas respiratorias inferiores, neumonfa, infecciones bacterianas agudas del pulmon, tuberculosis, enfermedades pulmonares ocupacionales, principalmente neumoconiosis (enfermedades pulmonares fibroticas, cronicas, provocadas por la inhalacion de polvo inorganico y material particulado, por ejemplo asbestosis, silicosis) y neumonitis por hipersensibilidad (enfermedad pulmonar alergica, tal como una inflamacion resultante de la inhalacion de polvos organicos, por ejemplo pulmon del granjero), dano pulmonar resultante de la exposicion a radiactividad, etc.

En un metodo segun una realizacion de la invencion, el oligonucleotido se administra en una cantidad de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

aproximadamente 5 a aproximadamente 500 pg por kg de peso corporal, preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 10 a 100 pg por kg de peso corporal.

Otras realizaciones ponen a disposicion metodos en los que el oligonucleotido se administra de manera profilactica, por ejemplo antes de un procedimiento quirurgico invasivo, radioterapia, tratamiento hormonal, cirugia de injerto y trasplante. El experimento con animales muestra que los compuestos tambien tienen un efecto pronunciado cuando se administran antes de la induccion del edema.

Los inventores tambien ponen a disposicion un metodo en el que el oligonucleotido se administra de manera profilactica, antes de una exposicion prevista a un irritante o un alergeno. Por tanto, los compuestos segun realizaciones de la invencion pueden usarse para aliviar o prevenir alergias estacionales, o bien solos o bien en combinacion con otros productos farmaceuticos usados de manera convencional.

Otra realizacion es un metodo en el que el oligonucleotido se administra en combinacion con medicacion antiinflamatoria, por ejemplo medicacion con esteroides.

Otra realizacion es un metodo en el que el oligonucleotido se administra en combinacion con un farmaco diuretico.

De manera interesante, se contempla que el efecto anti-hinchamiento o anti-edema logrado con los compuestos actualmente sometidos a prueba tambien puede observarse cuando se administran otros compuestos inmunomoduladores, variaciones estructurales de los mismos, tales como oligonucleotidos ramificados, constructos oligonucleotidicos con forma de pesas, constructos oligonucleotidicos unidos a glicina y similares, que comprenden las secuencias presentadas en las tablas 1 y 2.

Sin embargo, sin desear limitarse a ninguna teoria especifica, los presentes inventores creen que los oligonucleotidos basados en ADN en el presente documento muestran una especificidad superior, eficacia mejorada frente al hinchamiento o edema, y estan mejor adaptados para su uso clinico en seres humanos debido a sus secuencias especificas.

Ejemplos

1. Efectos sobre edema de oreja murino inducido por acetato de forbol (13-acetato de tetradecanoilforbol, TPA) o acido araquidonico (AA) de compuestos oligonucleotidicos experimentales administrados mediante diferentes esquemas de administracion

Materiales y metodos

Productos quimicos

Se almaceno 13-acetate de tetradecanoilforbol (TPA), CAS 16561-29-8, pureza de aproximadamente el 99% mediante CCF (Sigma-Aldrich Sweden AB, Estocolmo, Suecia) como un polvo liofilizado. Dimetilsulfoxido (DMSO), CAS 67-68-5, esterilizado por filtracion, Hybri-Max® (Sigma-Aldrich Sweden AB, Estocolmo, Suecia). Acetona, calidad analitica, CAS 67-64-1, Labora AB, Sollentuna, Suecia.

Se preparo una disolucion madre de TPA disolviendo TPA en DMSO, 1 mg/ml, y se almaceno congelada a -80°C. Para el estudio B-E, se preparo una disolucion de trabajo con 200 pl de la disolucion madre de TPA anadidos a 800 pl de acetona. La disolucion de trabajo se uso el mismo dia que se preparo.

Acido araquidonico (AA), CAS 506-32-1, lote 106K1432, aceite, pureza de aproximadamente el 99% mediante CCF (Sigma-Aldrich Sweden AB, Estocolmo, Suecia). Acetona, calidad analitica, CAS 67-64-1, Labora AB, Sollentuna, Suecia.

Se preparo una disolucion madre de AA diluyendo AA en acetona, 4 mg/10 pl, y se almaceno congelada a -80°C. Se preparo una disolucion de trabajo final, 1 mg/10 pl, en acetona. La disolucion de trabajo se uso en el plazo de una hora tras la preparacion.

Compuestos de prueba

En total, se sometieron a prueba 15 compuestos en los experimentos de TPA y/o AA, vease la tabla 1-3. Los oligonucleotidos se sintetizaron por biomers.net GmbH, Ulm, Alemania, y se almacenaron congelados a -20°C.

Formulation

Se diluyeron los compuestos hasta la concentracion de trabajo con PBS (Fluka, Sigma) a temperatura ambiente. Se ajusto la concentracion con ayuda de espectrofotometria UV (SmartSpec® 3000, BIO-RAD, Hercules, EE.UU.) hasta

5

10

15

20

25

30

35

40

45

una precision del 95%.

Experimentos con animales y dosificacion Animales

Ratones SPF NMRI/KS machos y hembras (animales para reproduccion propios de InDex Pharmaceutical AB de ratones SPF NMRI, MTC, Karolinska Institutet, Estocolmo, Suecia) o ratones BALB/cJ hembras (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, EE.UU.). Se agruparon los animales y se aclimataron durante al menos una semana antes de entrar en el experimento.

Alojamiento

Se mantuvieron los animales en salas a 21°C, ± 3°C, y con una humedad relativa del 55% ± 15%. El sistema de ventilacion se diseno para proporcionar 10 cambios de aire por hora. Se ilumino la sala para proporcionar un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. La luz se proporciono desde las 06:00 hasta las 18:00 horas.

Se mantuvieron los ratones en jaulas de policarbonato transparente (Macrolone tipo III) (area de suelo: 810 cm2), 8 en cada jaula.

Lecho

El lecho de la jaulas era lecho Beekay (B&K, Sollentuna, Suecia).

Mejora del entorno

Para la mejora del entorno, a los animales se les proporciono un suministro de Sizzele Nest o Happy-Mat, (Scanbur A.S, Lellinger, Dinamarca).

Dieta

Se suministro una dieta para roedores de pienso completa, R36 (Laktamin AB, Estocolmo, Suecia) a voluntad.

Agua potable

Los animales tenian libre acceso a botellas para beber para animales con agua potable de calidad domestica. Identificacion, agrupamiento y tratamiento de animales

Cada jaula se identifico mediante una tarjeta de jaula marcada con un numero de estudio, numero de grupo, numero de aprobacion del comite etico, sexo y numeros de orejas de animales. Se marcaron individualmente los animales en la cola con lineas transversales correspondientes al numero de animal, usando un rotulador de tinta permanente. En la tabla 4 se resume una ilustracion de los protocolos usados para los diferentes tratamientos. Los compuestos se sometieron a prueba segun los mismos protocolos con modificaciones necesarias.

Tabla 4. Ejemplos de protocolos usados en los experimentos

Tabla 4

Estudio A

TPA

Grupo

n inyeccion i.p. Dia Dosis

1

4 PBS, control 0 -

2

4 IDX0920 0 50 pg

3

4 IDX0150 0 100 pg

4

4

IDX0955 0 100 pg

5

4 IDX0001 0 100 pg

Estudio B

TPA

Grupo

n Una unica inyeccion s.c. Dia Dosis

1

4 PBS, control -4 -

2

4 IDX0920 -4 50 pg

3

4 IDX0150 -4 100 pg

4

4

IDX0955 -4 100 pg

5

4 IDX0001 -4 100 pg

Estudio C

TPA

Grupo

n Una unica inyeccion s.c. Dia Dosis

1

4 PBS, control -4 -

2

4 IDX0920 -4 50 pg

3

4 IDX0150 -4 100 pg

4

4

IDX0955 -4 100 pg

5

4 IDX0001 -4 100 pg

Estudio D

TPA

Grupo

n Una unica inyeccion s.c. Dia Dosis

1

4 PBS, control -2 -

2

4 IDX0920 -2 50 pg

3

4 IDX0150 -2 100 pg

4

4

IDX0955 -2 100 pg

5

4 IDX0001 -2 100 pg

Estudio E

TPA

Grupo

n Una unica inyeccion s.c. Dia Dosis

1

4 PBS, control 0 -

2

4 IDX0920 0 50 pg

3

4 IDX0150 0 100 pg

4

4

IDX0955 0 100 pg

5

4 IDX0001 0 100 pg

Estudio F

TPA

Grupo

n Una unica inyeccion s.c. Dia Dosis

1

4 PBS, control 0 -

2

4 IDX0920 0 50 pg

3

4 IDX0150 0 50 pg

4

4

IDX0955 0 50 pg

5

4 IDX0001 0 50 pg

Estudio G

TPA

Grupo

n Una unica inyeccion s.c. Dia Dosis

1

4 PBS, control 0,+2 h -

2

4 IDX0920 0,+2 h 50 pg

3

4 IDX0150 0,+2 h 100 pg

4

4

IDX0955 0,+2 h 100 pg

5

4 IDX0001 0,+2 h 100 pg

Estudio H

TPA

Grupo

n Una unica inyeccion i.n. Dia Dosis

1

4 PBS, control -4 -

2

4 IDX0920 -4 50 pg

3

4 IDX0150 -4 100 pg

4

4

IDX0955 -4 100 pg

5

4 IDX0001 -4 100 pg

Estudio I

TPA

Grupo

n Una unica inyeccion i.n. Dia Dosis

1

4 PBS, control 0 -

2

4 IDX0920 0 50 pg

3

4 IDX0150 0 100 pg

4

4

IDX0955 0 100 pg

5

4 IDX0001 0 100 pg

Estudio J

TPA

Grupo

n Una unica inyeccion i.n. Dia Dosis

1

4 PBS, control 0,+2 horas -

2

4 IDX0920 0,+2 horas 50 pg

3

4 IDX0150 0,+2 horas 100 ug

4

4

IDX0955 0,+2 horas 100 ug

5

4 IDX0001 0,+2 horas 100 ug

Estudio K

TPA

Grupo

n Una unica inyeccion s.c. Dia Dosis

1

4 PBS, control 0 -

2

4 IDX0150 0 0,1 ug

3

4 IDX0150 0 1 ug

4

4

IDX0150 0 10 ug

5

4 IDX0150 0 100 ug

Estudio L

TPA

Grupo

n Una unica inyeccion i.n. Dia Dosis

1

4 PBS, control 0 -

2

4 IDX0526 0 0,1 ug

3

4 IDX0526 0 1 ug

4

4

IDX0526 0 10 ug

5

4 IDX0526 0 100 ug

Estudio M

TPA

Grupo

n Una unica inyeccion i.n. Dia Dosis

1

4 PBS, control 0 -

2

4 IDX0500 0 0,1 ug

3

4 IDX0500 0 1 ug

4

4

IDX0500 0 10 ug

5

4 IDX0500 0 100 ug

Estudio N

TPA

Grupo

n Una unica inyeccion i.n. Dia Dosis

1

4 PBS, control 0 -

2

4 IDX0500 0 0,005 ug

3

4 IDX0500 0 0,01 ug

4

4

IDX0500 0 0,1 ug

5

4 IDX0500 0 1 ug

Estudio O

TPA

Grupo

n Una unica inyeccion i.n. Dia Dosis

1

4 PBS, control 0 -

2

4 IDX0500 0 10 ug

3

4 IDX0500 0 100 ug

4

4

IDX0150 0 10 ug

5

4 IDX0150 0 100 ug

Procedimiento de prueba

Administration de dosis 5

Se realizaron inyecciones intraperitoneales (i.p.) administrando 100 ul en el cuadrante inferior derecho del abdomen. Se realizaron inyecciones subcutaneas con 100 ul en la region del cuello. Se realizo la administracion intranasal dejando que el raton inhalara gotitas en los orificios nasales, con un volumen total de 40 ul. Todas las administraciones se realizaron con ratones no anestesiados.

10

Induction del edema

Se lavaron ambas oidos externos de un raton no anestesiado con jabon suave (Palmolive, Suecia) usando un cepillo de dientes suave, se secaron las orejas con tejido y se limpiaron con tejido empapado con acetona. Tras dejar que 15 se evaporara la acetona, se aplico TPA o AA en ambos lados, 10 ul, en cada lado de la oreja con cuidado de cubrir toda la oreja. Se sujeto al raton durante 20 segundos para permitir que el disolvente se evaporara.

Tratamiento farmacologico

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Se administraron inyecciones intraperitoneales en el cuadrante inferior derecho del abdomen con el animal sujeto en una posicion en decubito supino. Se administraron inyecciones subcutaneas (s.c.) en el cuello de los animales. Se administraron administraciones intranasales a ratones sujetos en una posicion ligeramente reclinada. Con una micropipeta ajustable, se administraron 40 pl de la sustancia de prueba en gotitas en los orificios nasales y se dejo que el raton aspirara por voluntad propia.

Signos clinicos

Se observo diariamente cada raton hasta que se sacrifico. Se registraron todos los signos de enfermedad, salud y cualquier cambio en el comportamiento.

Parametros clinicos

Se midieron las orejas de ratones no anestesiados en diferentes puntos de tiempo durante hasta 96 horas tras administrarse el TPA, o hasta 24 horas para el modelo de AA. Las primeras mediciones se realizaron antes de inducirse el edema. Se registro el grosor con un micrometro de esfera cargado con resorte (Limit, calibre de grosor, precision de 0,01 mm, area de contacto de 0 6 mm, Luna AB, Allingsas, Suecia) por triplicado en todos los puntos de tiempo por oreja.

Se calculo el grosor promedio para ambas orejas en un raton y se comparo con el grosor promedio de las orejas en el punto de tiempo de partida. Se establecio el valor obtenido al comienzo del experimento como el 100%. Se calcularon los valores maximos y los valores del area bajo la curva (AUC) para los grupos de tratamiento y se compararon con el grupo de control con inflamacion, tratado con PBS (establecido al 100%), y se expreso como cambio en porcentaje (A de % de AUC).

Datos estadisticos

Se uso la prueba de la t de Student para calcular la significacion estadistica (funciones estadisticas de Excel, Microsoft® Excel 2002, Microsoft Corp., Redmond, EE.UU.).

Se calculo el area bajo la curva (AUC) con la linea de base fijada a 100 usando GraphPad Prism version 4.03 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California, EE.UU.,
www.graphpad.com).

Resultados

El protocolo del experimento se ilustra por los ejemplos facilitados en la tabla 4. Se calculo la reduccion del AUC y los valores de P con respecto al control positivo (TPA o AA + PBS).

Estudio A

Este estudio mostro una reduccion del edema cuando se administraron los compuestos de la invencion por via i.p., comenzandose la induccion del edema en el dia 0. En este experimento la sustancia de control, IDX0150, mostro una remision casi completa de la inflamacion y redujo el AUC en un -38,9%.

Estudio B

El estudio B investigo el efecto profilactico de los compuestos cuando se administraron por via s.c. 4 dias antes de la induccion del edema. IDX0920, IDX0955 e IDX0001 mostraron una reduccion del AUC con el -19,3%, -22,7% y -16,3% respectivamente, sin embargo no fueron estadisticamente significativos (NS). IDX0150 no mostro ninguna reduccion del AUC. A causa del mal desenlace debido a la gran variacion entre mediciones, este estudio se repitio (estudio C).

Estudio C

En un estudio repetido del estudio B, los ODN administrados por via s.c. 4 dias antes de la induccion del edema, mostraron una reduccion del AUC con el -3%, -22%, -24,3% y -17,9% respectivamente, estadisticamente significativo para IDX0150 (P <0,01), IDX0955 (P <0,01) e IDX0001 (P <0,05).

Estudio D

En un regimen profilactico mas corto, administrado por via s.c., 2 dias antes de la induccion del edema, se obtuvieron resultados casi similares a los del estudio C. Estadisticamente significativo para IDX0920, IDX0150, IDX0955 (P <0,01) y no significativo para IDX0001. La reduccion del AUC fue del -19,1%, -16,5%, -17,8% y - 12,4% respectivamente.

Estudio E

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En este estudio los compuestos se administraron en el mismo dia que se indujo el edema. La induccion fue escalonada para permitir aproximadamente 20 minutos de tiempo de espera para cada raton. En este estudio hubo una reduccion relativamente uniforme del AUC, IDX0920 del -19,4%, IDX0150 del -27,3%, IDX0955 del -17,7% e IDX0001 del -16,7%. Todos los compuestos dieron como resultado una reduccion estadisticamente significativa (P <0,01).

Estudio F

En este estudio, los compuestos se administraron en el mismo dia que se indujo el hinchamiento, a dosis iguales (50 pg) a cada animal. Esto tambien dio como resultado una reduccion del AUC, IDX0920 del -17%, IDX0150 del -31,1%, IDX0955 del -18,3% e IDX0001 del -13,2%. Excepto por IDX0920 que mostro una pendiente descendente retrasada, todos los demas compuestos mostraron una reduccion significativa del hinchamiento, IDX0150 e IDX0955 con P <0,01 e IDX0001, con P <0,05.

Estudio G

Para investigar un regimen terapeutico, los compuestos se administraron 2 horas tras la induccion del edema. Esto dio como resultado una reduccion significativa del AUC en IDX0920 del -43,8% (P <0,01), IDX0150 del -42,3% (P <0,01) e IDX0955 del -40,7% (P <0,05). IDX0001 mostro una reduccion del -17,9%, lo cual no fue estadisticamente significativo.

Estudio H

Para estudiar vias de administracion alternativas, se investigo la administracion intranasal. En comparacion con la administracion s.c., se eligieron puntos de tiempo y dosis similares. En el estudio H, se administro la administracion intranasal en un protocolo profilactico, 4 dias antes de inducirse el hinchamiento. Esto dio como resultado una reduccion eficaz del hinchamiento en comparacion con lo que se obtuvo con la administracion s.c. La reduccion del AUC fue, IDX0920 del -33,8% (P <0,01), IDX0150 del -25,7% (P <0,01), IDX0955 del -17,4% (P <0,05) e IDX0001 del - 25,7% (P <0,05).

Estudio I

Cuando se administro la administracion intranasal en el dia 0, en el mismo dia que se indujo el edema, se encontro una reduccion eficaz del hinchamiento. La reduccion del aUc fue, IDX0920 del -27,3% (P <0,01), IDX0150 del -28,4% (P <0,01), IDX0955 del -28,8% (P <0,05) e IDX0001 del -6,4% (NS).

Estudio J

En el protocolo terapeutico tal como se uso en el estudio G, la administracion intranasal tambien dio como resultado una buena reduccion del hinchamiento. Se mostro que el AUC se reducia en IDX0920 con el -28,7% (P <0,05), IDX0150 con el -28,8% (P <0,01), IDX0955 con el -17,2% (P <0,05) e IDX0001 con el -25,2% (P <0,05).

Estudio K

Se investigo la respuesta a la dosis en los estudios K-O. En el estudio K, se administraron 0,1, 1, 10 y 100 pg de IDX0150. El resultado mostro la reduccion del hinchamiento de una manera dependiente de la dosis. La reduccion del AUC fue; del -13,9% (P <0,05) con 0,1 pg, del -16,3% (P <0,05) con 1 pg, del -27,9% (P <0,05) con 10 pg, y del -45% (P <0,01) con 100 pg.

Estudio L

Se investigo el control negativo IDX0526, que tenia el motivo CpG sustituido por GC, en un protocolo de respuesta a la dosis similar al estudio K. Se encontro que no habia ninguna actividad anti-hinchamiento usando IDX0526. Las diferencias en el AUC fueron; con 0,1 pg del +1,24%, con 1 pg del -1,24%, con 10 pg del -0,26% y con 100 pg del +6,18%, todos cambios no estadisticamente significativos.

Estudio M

Para investigar la significacion del grado de modificacion de fosforotioato en el esqueleto del oligonucleotido, se uso un oligonucleotido completamente modificado con fosforotioato, IDX0500. Este compuesto mostro propiedades anti- hinchamiento estadisticamente significativas a todas las dosis sometidas a prueba, con una reduccion del AUC para; 0,1 pg del -46,9%, 1 pg del -41,3%, 10 pg del -40,9% y 100 pg del -59,1% (todos P <0,01).

Estudio N

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Para estudiar adicionalmente el intervalo terapeutico para IDX0500, se emprendio el estudio N. Las dosis fueron de 0,005 pg, 0,01 pg, 0,1 pg y 1 pg. El compuesto mostro un efecto estadisticamente significativo a las dosis de 0,1 y 1 pg lo cual concordaba con el estudio M. La reduccion del AUC fue; del -15% para 0,005 pg (NS), del -15,3% para 0,01 pg (NS), del -18,2% para 0,1 pg (P <0,01), y del -54,1% para 1 pg (P <0,01).

Estudio O

En este experimento, se compararon IDX0500 e IDX0150 a dosis iguales de 10 y 100 pg administradas por via s.c. en el dia 0. Se obtuvieron resultados similares entre dosis y los dos compuestos, mostrando una reduccion estadisticamente significativa del AUC para IDX0500; 10 pg dieron el -25,5%; 100 pg el -39,9%, y para IDX0150 10 pg dieron el -25,5%; 100 pg el -39,9% (todas las dosis P <0,01).

Ademas de los experimentos realizados con los compuestos de control e IDX0001, todos los demas compuestos de prueba se investigaron de una manera similar en los modelos de edema de oreja de TPA y/o AA, en los que los compuestos de prueba se administraron por via subcutanea (10 pg) 20 minutos antes de la induccion del edema. Los resultados se expresan como reduccion de valor maximo y reduccion del area bajo la curva (AUC) en la tabla 5.

Tabla 5. Resultados obtenidos para los compuestos sometidos a prueba

Tabla 5

SEQ ID NO

IDX, n.2 Secuencia 5’-3’ Reduccion maxima (%) Reduccion del AUC (%)

TPA AA TPA AA

1

IDX9024 T*G*C*CATT CGTCGTTCTCGT C*G*T* T -30,9 -14,4 -47,3 -58,5

2

IDX9025 T*G*C*CATT CGT CGATTTCGT C*G*A* T -23,5 -14,9 -57,8 -81,9

3

IDX9038 T*C*G*TCGTTCGGCCGATCG*T*C*C -37,9 NR -47,4 NR

4

IDX9053 G*G*G*TCGTCTG*C*G*G -30,5 NR -39,0 NR

5

IDX9076 T*C*C*CAAGATCGTCC*A*G*G -2,6 -20,1 -5,1 -45,7

6

IDX9078 T*C*C*GATCGTCC*A*G*G -26,1 -16,4 -41,3 -79,4

7

IDX9087 T*C*G*TCTGCTTAGTTCGTTA*G*T*T +0,9 NR -40,2 NR

9

IDX9051 G*G*G*GCGTCTGCC*G*G*G -29,5 -17,7 -54,0 -67,5

10

IDX9064 T*C*C*ATGGTCAGGGTCCCGG*G*G* G -41,7 NR -59,7 NR

NR = no realizado Valores maximos

Tambien se compararon los valores maximos y de AUC con el fin de estratificar la eficacia anti-hinchamiento de los diferentes esquemas de tratamiento.

Discusion

Los presentes experimentos abordaron regimenes de tratamiento profilactico y terapeutico prolongados usando vias intraperitoneal, subcutanea e intranasal. Ademas, se investigo la respuesta a la dosis usando los compuestos IDX0150 e IDX0500 (SEQ ID NO 11 y 12, respectivamente).

Puede realizarse un seguimiento del grado de edema midiendo la formacion de edema o el hinchamiento tras el tratamiento con TPA topico del oido externo en ratones. Este hinchamiento presenta normalmente un maximo tras 24 horas y despues disminuye gradualmente durante una semana.

Se encontro que todos los valores de AUC y maximos eran inferiores a los del control positivo. En la mayoria de los casos esta reduccion del hinchamiento era estadisticamente significativa (P <0,05). Sin embargo, en algunos experimentos, no se alcanzo una reduccion estadisticamente significativa. Esto se ha observado en relacion con la induccion de edema de grado bajo en todo el experimento como tal. Para evitar esto, se tuvo especial cuidado de optimizar la dosis de TPA y usando ratones inmunologicamente maduros.

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El edema de oreja puede estudiarse obteniendo el valor maximo de edema inducido por TPA y calculando el area bajo la curva (AUC) a partir de todas las medidas de edema. Por tanto, el AUC representa tanto la induccion como la remision del edema.

Calculando el valor maximo promedio a partir de los diez experimentos con IDX0150 (figura 2), se encontro una reduccion estadistica significativa muy alta de los valores maximos (P < 0,001).

Por tanto, se uso IDX0150 como norma para comparaciones con los demas compuestos en este estudio.

Los efectos anti-hinchamiento de IDX0150 (0,1 - 100 pg) e IDX0500 (0,005 - 100 pg) mostraron un amplio intervalo de respuesta a la dosis. El efecto anti-hinchamiento de IDX0150 administrado en diferentes puntos de tiempo, calculado como la reduccion del valor maximo, disminuyo en el siguiente orden: 2 h > dia -2 > dia 0 > dia -4.

La reduccion del AUC disminuyo en el siguiente orden: 2 h > dia 0 > dia -2 > dia -4. Estos resultados indican que estos compuestos pueden usarse tanto para la administracion profilactica como para el tratamiento tras haber comenzado el hinchamiento. Los resultados muy buenos con la administracion intranasal muestran que la administracion mucosa es eficaz para presentar compuestos oligonucleotidicos al sistema inmunitario en el organismo.

Conclusion

Los estudios A-O respaldan de manera colectiva el efecto anti-hinchamiento de los compuestos de la invencion en el modelo de edema de oreja inducido por TPA en ratones. Estos compuestos son agentes inmunomoduladores eficaces cuando se administran por vias de administracion intraperitoneal, subcutanea e intranasal, y su eficacia para reducir el edema tambien se demostro en diferentes esquemas profilacticos y terapeuticos tal como se muestra a modo de ejemplo mediante IDX0150 en las figuras 1-3. El efecto anti-hinchamiento de los compuestos no se limita a una ruta inflamatoria general, sino que tambien puede regular por disminucion la inflamacion inducida por AA que, por ejemplo, activa el sistema de prostaglandina. Todos los compuestos de prueba SEQ ID NO 1 - 10 pudieron reducir el edema tal como se muestra en el modelo de TPA y/o AA.

2. La administracion nasal de sustancias de prueba oligonucleotidicas inmunomoduladoras en un modelo murino de ovalbumina (OVA) indujo inflamacion de las vias respiratorias: una comparacion de diferentes protocolos profilacticos y terapeuticos

Materiales y metodos

Animales

Se usaron ratones Balb/c hembra (8 semanas), obtenidos de B&K (Sollentuna, Estocolmo, Suecia), en el experimento. Se alimentaron los ratones con una dieta para roedores de pienso completa, R36 (Laktamin AB, Estocolmo, Suecia) y agua de calidad potable domestica a voluntad. Se mantuvieron los animales en salas para animales a 21°C ± 3°C, y con una humedad relativa del 55% ± 15%. El sistema de ventilacion se diseno para proporcionar 10 cambios de aire por hora. Se ilumino la sala para proporcionar un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. La luz se proporciono desde las 07:00 h hasta las 19:00 h. Se mantuvieron los ratones en jaulas de policarbonato transparente (Macrolone tipo III) (area de suelo: 820 cm2), 5 en cada jaula. El lecho en las jaulas era lecho 4HV Aspen (Tapvei, Finlandia). Cada jaula se identifico mediante una tarjeta de jaula marcada con el numero de estudio, numero de grupo, sexi y numeros de animales.

Sensibilizacion y exposicion a aerosol

Se sensibilizaron los ratones por via intraperitoneal con 200 pl de OVA/gel de hidroxido de aluminio (1:3) en el dia 0 y 12 (vease la figura 6). Se disolvio OVA (albumina de huevo de pollo de calidad V, Sigma, St. Louis, MO) en solucion salina y se mezclo con gel de hidroxido de aluminio hasta una concentracion de 50 pg/ml mediante rotacion a 4°C durante 3 h. En los dias 23, 26, 30 y 33 (vease la figura 6), se expusieron los pulmones de los ratones mediante inhalacion de OVA en aerosol durante 30 minutos usando una camara de exposicion Batelle. Se generaron aerosoles mediante un nebulizador de aire comprimido (Collison de 6 chorros) a un flujo de aire de 7,4 l/min usando una concentracion de nebulizador de 10 pg/ml de OVA disuelto en PBS (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.). El grupo de control con animales sin sensibilizar no recibio ningun otro tratamiento distinto de OVA en aerosol en los dias 23, 26, 30 y 33. Tambien hubo un grupo de control de ratones sensibilizados que no recibieron exposicion a aerosol.

Oligonucleotidos

En este modelo de OVA (figura 6), se sometio a prueba un total de 4 oligonucleotidos, IDX9025, IDX9038, IDX9053 (tabla 1, SEQ ID NO 2-4) e IDX0150 (tabla 3, sEq ID NO 11). Los oligonucleotidos se sintetizaron por biomers.net GmbH, Ulm, Alemania, y se almacenaron congelados a -20°C. Se diluyeron los oligonucleotidos con PBS hasta la

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concentracion de trabajo (1,247 pg/ml) y se mantuvieron a -20°C hasta el primer dia de instilacion, despues de eso se colocaron a 4°C.

Tratamiento de inflamacion de las vias respiratorias inducida por OVA

En un primer experimento, se sometieron a prueba protocolo tanto profilactico como terapeutico (vease la figura 6). El tratamiento con farmaco consistio en instilaciones intranasales de IDX0150 (1,247 pg/ml, proporcionado por InDex Pharmaceuticals AB, Estocolmo, Suecia) en los dias 16 y 21 (protocolo profilactico), en los dias 30 y 33 (protocolo terapeutico A) o en los dias 30 y 34 (protocolo terapeutico B). Las instilaciones en los protocolos terapeuticos (A y B) en los dias 30 y 33 se administraron 4 h tras la exposicion a aerosol. La segunda instilacion en el protocolo B en el dia 34 se administro 24 h tras la ultima exposicion a aerosol. El farmaco se administro en 40 pl de PBS administrando una dosis de ~50 pg/raton (49,88 pg/raton). Los dos grupos de tratamiento simulado sensibilizados recibieron instilaciones con PBS, el mismo volumen total que para los grupos de tratamiento, segun o bien el protocolo profilactico (dias 16 y 21) o bien el protocolo terapeutico A (dias 30 y 33).

Tabla 6. Grupos experimentales en la inflamacion de las vias respiratorias inducida por OVA

Tabla 6

Grupos

n Inmunizado con OVA Aerosol de OVA Tratamiento Dosis

1

4 No Si PBS -

2

5 Si Si 2 x PBS profilactico -

3

5 Si Si IDX0150 profilactico 2 x 50 pg

4

5 Si Si 2 x PBS terapeutico A -

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Si Si IDX0150 terapeutico A 2 x 50 pg

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5 Si Si IDX0150 terapeutico B 2 x 50 pg

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4 Si No PBS -

En un segundo experimento, dado que la administracion de IDX0150 en el primer experimento usando el protocolo profilactico (figura 6) dio una a reduccion significativa de la inflamacion de las vias respiratorias (figura7), se sometieron a prueba otras tres sustancias con el mismo protocolo. El tratamiento farmacologico consistio en instilaciones intranasales de IDX9025, IDX9038 e IDX9053 (tabla 1) (1,247 pg/ml, proporcionados por InDex Pharmaceuticals AB) en los dias 16 y 21 (vease la figura 6, protocolo profilactico). Todas las sustancias se administraron en 40 pl de PBS administrando una dosis de ~50 pg/raton (49,88 pg/raton). Los dos grupos de tratamiento simulado sensibilizados recibieron instilaciones con PBS, el mismo volumen total que para los grupos de tratamiento, segun el protocolo profilactico (dias 16 y 21).

Analisis de parametros de inflamacion de las vias respiratorias

Se sacrificaron los ratones mediante dislocacion cervical 42 h tras la ultima exposicion a aerosol de OVA. Se introdujeron canulas en la traquea con tubos de polietileno (Becton Dickinson, Sparks, MD, EE.UU.) y se realizo un lavado bronquioalveolar (BAL) usando 4 x alicuotas de 1 ml de solucion salina equilibrada de Hank helada (HBSS) (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.). Se centrifugo el liquido de BAL (400 g, 10 min, 4°C) y se resuspendieron las celulas del liquido de BAL en 0,4 ml de PBS. Se conto el numero total de leucocitos usando exclusion con azul de tripano en una camara de Burker. Se tineron preparaciones de Cytospin por duplicado (Cytospin 3, Shandon, Runcorn, R.U.) de celulas de liquido de BAL con May Grunewald Giemsa para determinar el recuento diferencial, usando criterios morfologicos convencionales.

Analisis estadistico

Se realizaron comparaciones estadisticas usando analisis de la varianza (ANOVA) de un factor usando correccion a posteriori de Dunnett para la comparacion con ratones de control tratados con PBS sensibilizados (GraphPad Prism 3). Se muestran los datos como media ± desviacion estandar. Se considero P< 0,05 como significativo.

Resultados

El modelo de asma alergico inducido por ovalbumina es un modelo ampliamente usado para reproducir la inflamacion pulmonar encontrada durante el asma. Los resultados obtenidos en este caso se correlacionan con el hinchamiento de la membrana mucosa de las vias respiratorias, y por tanto los resultados son una medida relevante de la reduccion del edema. El analisis de este modelo se basa en indicadores generales del asma tales como analisis de BAL en el que se identifica y se cuenta el tipo y la cantidad de celulas inflamatorias infiltrantes tales como celulas polimorfonucleares (PMN).

Por consiguiente, se contaron las celulas de liquido de BAL derivadas de cada raton tal como se describio y se representan los valores graficamente como un histograma combinado que proporciona valores medios para los

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diferentes grupos de tratamiento (figura 7).

En terminos generales, el nivel de inflamacion de las vias respiratorias inducida fue alto tal como se indica mediante un gran flujo entrante de los 4 tipos de celulas analizados en los pulmones de los animales (grupo de PBS) en ambos experimentos. Los grupos de control (“sin aerosol” y “sin exposicion”) no demostraron ningun signo de inflamacion inducida, confirmando que los animales no mostraban una respuesta alergica natural a la proteina ovalbumina en aerosol y que la proteina ovalbumina usada no estaba contaminada, por ejemplo, con LPS.

La competa ausencia de cualquier signo de inflamacion en los grupos de control “sin aerosol” confirmo que el propio procedimiento experimental de inmunizacion con OVA no inducia inflamacion pulmonar.

Tras el tratamiento nasal en un protocolo profilactico cuando se administro dos veces, 7 y 2 dias antes de la exposicion de inflamacion, el elemento de prueba IDX0150 pudo reducir significativamente la migracion de leucocitos y eosinofilos al interior del liquido de BAL (P<0,05 y P<0,001 respectivamente) (figura 7).

En la rama terapeutica de este protocolo, cuando se administro IDX0150 7 y 11 dias tras la exposicion de inflamacion, es decir muy tarde en el periodo del experimento, no se demostro estadisticamente ningun efecto.

Tras el tratamiento nasal en el segundo experimento (figura 8), la sustancia de prueba IDX9038 pudo reducir significativamente la migracion de leucocitos (P<0,05) y eosinofilos (P<0,001) al interior del liquido de BALF. IDX9025 e IDX9053 no mostraron ninguna reduccion significativa de la migracion celular al interior del liquido de BALF en este experimento.

Conclusiones

Este estudio in vivo proporciona la siguiente conclusion: Se observo una reduccion estadisticamente significativa en el numero de leucocitos, eosinofilos y linfocitos que se infiltran en el liquido de BAL en animales cuando se trataron con los compuestos de la invencion. En este modelo, resulto mas apropiado medir la inflamacion, pero los resultados son igualmente aplicables para el edema. Ademas, el estudio confirmo la idoneidad de la administracion nasal como via eficaz.

3. Pleuresia inducida por tioglicolato en ratones C57/BI6 Materiales y metodos

Se configuro un modelo animal para estudiar el efecto de oligonucleotidos segun una realizacion de la presente invencion sobre la migracion celular y la permeabilidad vascular.

Se anestesiaron ratones mediante una inyeccion intraperitoneal de 0,15-0,20 ml de una mezcla de ketamina (Ketalar® Parke-Davis; 25 pg/ml) y xilazina (Narcoxilo vet.® Veterinaria AG; 5 mg/ml).

Se introdujeron canulas en la vena yugular izquierda con tubos de polietileno (PE10) para la administracion intravenosa (i.v.). Se realizo una incision en la piel en el lado derecho del torax. Tras la diseccion del musculo subyacente, se indujo pleuresia (inflamacion del saco pulmonar) mediante una unica inyeccion intrapleural de 100 pl de tioglicolato (Sigma). Se uso PBS esteril como control negativo.

Se inyecto por via i.v. dextrano conjugado con FITC en PBS (100 pl, 30 mg/ml). Tras 4 h, se sacrificaron los animales con una sobredosis de anestesia, se abrio cuidadosamente el torax y se extrajo el exudado mediante aspiracion y se anoto el volumen. Entonces se aclaro el torax con 1 ml de EDTA 3 mM helado en PBS. Se descarto el exudado que estaba contaminado con globulos rojos.

Se centrifugo el exudado y el material aclarado a 1500 g durante 5 min y se uso el sobrenadante para medir la intensidad de fluorescencia en un fluorimetro (Fluoroskan Acsent, LabSystems) y se calculo el volumen de aclaramiento de FITC-dextrano. Se resuspendio el sedimento en PBS con BSA al 0,1% durante 15 min para bloquear la union de anticuerpos no especificos. Se usaron 10 pl de suspension celular para determinar el recuento diferencial de globulos blancos (WBC) en una camara Burker.

Se tineron las celulas del exudado con anticuerpos especificos para neutrofilos y macrofagos y se analizaron mediante citometria de flujo (FACSort y software CellQuest, BD). El analisis incluyo el recuento total de globulos blancos, basandose en sus apariciones tipicas en la dispersion frontal y lateral. Se identificaron adicionalmente PMN y macrofagos mediante su expresion de Ly6G y F4/80, respectivamente.

Con el fin de someter a prueba el efecto de oligonucleotidos segun realizaciones de la presente invencion, el compuesto que iba a someterse a prueba se administro por via intraperitoneal, a una dosis de 100 pl, es decir 50 pg/raton, aproximadamente 20 minutos antes de la induccion de pleuresia. En este estudio, el compuesto

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sometido a prueba fue IDX0150 (SEQ ID NO 11, tabla 3).

Resultados

El modelo de pleuresfa inducida por tioglicolato es uno de los modelos de eleccion para el examen practico de nuevos farmacos en desarrollo, aunque es tecnicamente complicado y puede mostrar valores discrepantes individuales ocasionales. Sin embargo, este modelo esta limitado en cuanto al numero de animales que pueden someterse a prueba simultaneamente.

Los resultados mostraron que los animales respondieron al agente que inducfa la inflamacion, tioglicolato, mediante una alta inmigracion de PMN al interior de la cavidad pleural. Esta reaccion celular se vio reflejada en la acumulacion de edema pleural observado como un alto volumen de aclaramiento. El tratamiento con IDX0150 redujo el reclutamiento de PMN (reduccion del 42%) tras la induccion de inflamacion por tioglicolato (figura 9a). El tratamiento con IDX0150 tambien demostro un bajo nivel de permeabilidad vascular (reduccion del 68,2%) similar al control de PBS (figura 9b). Los resultados representan la media ± DE.

Hu et al., (2008) investigaron la contribucion de la ruta vesicular transendotelial a la formacion de edema. El grupo mostro que la permeabilidad vascular pulmonar puede verse inducida mediante activacion de PMN adherentes a la pared del vaso, y el edema mas intenso se observo con el mayor numero de PMN. Los compuestos segun realizaciones de la presente invencion muestran claramente una reduccion de los PMN (figuras 7, 8 y 9a), y por consiguiente una reduccion del edema (figura 9b). Los experimentos usando un anticuerpo anti-PMN mostraron que el Ac anti-PMN podfa reducir igualmente PMN y el edema hasta niveles similares a los compuestos de la invencion (datos no mostrados).

Conclusion

Estos resultados en el modelo animal de pleuresfa indican el hecho de que el compuesto tiene un perfil de tratamiento preferible adecuado para pruebas adicionales y desarrollo de farmacos.

Bibliografi'a

Guochang Hu, Stephen M. Vogel, David E. Schwartz, Asrar B. Malik, Richard D. Minshall. (2008) Intercellular Adhesion Molecule-1-Dependent Neutrophil Adhesion to Endothelial Cells Induces Caveolae-Mediated Pulmonary Vascular Hyperpermeability. Circ Res. 102:e120-e131.

A. Gennaro (Ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18s edicion, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990

Claims (9)

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5. 5.

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   35 11.

   40 12.

   45 13.

   REIVINDICACIONES

   Compuesto oligonucleotfdico aislado y sustancialmente purificado que comprende una secuencia segun SEQ ID NO 6 (IDX 9078).

   Compuesto oligonucleotfdico segun la reivindicacion 1, en el que la longitud total del compuesto es de entre 12 y 30 bases.

   Oligonucleotido segun la reivindicacion 1, en el que dicho oligonucleotido esta quimicamente modificado.

   Oligonucleotido segun la reivindicacion 1, en el que al menos un nucleotido tiene una modificacion en el esqueleto de fosfato.

   Oligonucleotido segun la reivindicacion 6, en el que la modificacion en el esqueleto de fosfato es una modificacion de fosforotioato o fosforoditioato.

   Composicion farmaceutica que comprende un oligonucleotido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

   Composicion farmaceutica que comprende un oligonucleotido segun la reivindicacion 6, que comprende ademas un excipiente o portador farmacologicamente compatible y fisiologicamente aceptable.

   Composicion farmaceutica que comprende un oligonucleotido segun la reivindicacion 6, que comprende ademas un excipiente o portador farmacologicamente compatible y fisiologicamente aceptable elegido de solucion salina, liposomas, tensioactivos, compuestos mucoadhesivos, inhibidores enzimaticos, sales biliares, potenciadores de la absorcion y ciclodextrinas.

   Formulacion farmaceutica para su administracion mucosa, que comprende un oligonucleotido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

   Uso de un oligonucleotido aislado y sustancialmente purificado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la preparacion de una composicion farmaceutica para la prevencion, el tratamiento y/o el alivio de edema.

   Uso segun la reivindicacion 10, en el que edema es un trastorno o disfuncion del equilibrio del liquido intersticial en cualquier organo o tejido, asociado con un estado elegido de insuficiencia cardiaca, cirrosis hepatica, enfermedades renales tales como sindrome nefrotico, malnutricion, cancer, asma, rinitis alergica, EPOC, isquemia, traumatismo y choque septico.

   Uso segun la reivindicacion 10, en el que dicho oligonucleotido se administra en una cantidad eficaz para lograr uno de regulacion de la permeabilidad vascular; inhibicion o reduccion de la migracion de leucocitos; inhibicion o reduccion de la migracion o activacion de neutrofilos; inhibicion o reduccion de la migracion de eosinofilos; e inhibicion o reduccion de la migracion de linfocitos.

   Uso de un oligonucleotido aislado y sustancialmente purificado para la preparacion de una composicion farmaceutica para la prevencion, el tratamiento y/o el alivio de edema, en el que el oligonucleotido es SEQ ID NO 6, y se administra en una dosis y forma de administracion eficaz para tratar o aliviar asma mediante inhibicion o reduccion de la migracion o activacion de neutrofilos.