ES2599503T3

ES2599503T3 - Anticuerpos biespecíficos IgG4 de secuencia simétrica modificada

Info

Publication number: ES2599503T3
Application number: ES13705504.2T
Authority: ES
Inventors: David Paul Humphreys; Shirley Jane Peters
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2012-02-22
Filing date: 2013-02-22
Publication date: 2017-02-02
Anticipated expiration: 2033-02-22
Also published as: EA035050B1; AU2013224003B2; CN104321341A; US20150018529A1; DK2817332T3; SG11201404789XA; CN104321341B; AU2018201232A1; JP6308952B2; KR20140127890A; MX2014010018A; MX356288B; AU2013224003A1; CN108586615B; WO2013124450A1; JP2018117627A; BR112014020627A2; US20190202937A1; JP2015513537A; KR102077331B1

Abstract

Un anticuerpo biespecífico simétrico de la clase IgG4 que comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una un dominio variable, un dominio CH1 y una región bisagra, en donde en cada cadena pesada: la cisteína de la posición 127, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, en el dominio CH1 que forma un enlace disulfuro intercatenario con un cisteína en una cadena ligera es sustituida por un aminoácido que no contiene tiol; y uno o más de los aminoácidos situados en la región bisagra superior es sustituido por cisteína, en donde la secuencia de la región constante de cada cadena pesada es similar o idéntica y la región variable de cada cadena pesada es diferente.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos biespedficos IgG4 de secuencia simetrica modificada

La presente invencion se refiere a un anticuerpo IgG4 biespedfico que tiene una disposicion alterada de los enlaces disulfuro en comparacion con un anticuerpo de tipo salvaje y a un metodo para producir el anticuerpo mejorado. En un aspecto adicional la presente descripcion proporciona un metodo eficaz para preparar anticuerpos biespedficos.

La industria biofarmaceutica que incluye protemas recombinantes, anticuerpos monoclonales (mAb) y farmacos basados en acidos nucleicos esta creciendo rapidamente. La modificacion genetica de anticuerpos ha dado como resultado el diseno y la produccion de fragmentos de anticuerpos o formatos alternativos. El formato molecular preferido junto con otros aspectos tales como el rendimiento de produccion, la calidad de la protema y la estabilidad de almacenamiento se tienen en cuenta cuando se selecciona una protema basada en anticuerpos como agente terapeutico.

La estructura basica de todas las moleculas de inmunoglobulina (Ig) comprende dos cadenas pesadas identicas (HC) y dos cadenas ligeras identicas (LC) que estan acopladas por medio de enlaces disulfuro. Cada LC consiste en un dominio variable (Vl) y uno constante (Cl). Basandose en la HC, se reconocen cinco clases de Ig principales: IgG, IgA, IgD, IgE e IgM. Para la IgG, la HC consiste en un dominio variable (Vh) y tres dominios constantes (Ch1-3). Los dominios Ch2 y Ch3 forman la porcion Fc de la molecula que es responsable de la estimulacion de la funcion efectora y esta conectada al fragmento Fab (VhVl y ChCl) por medio de una region bisagra que confiere flexibilidad a la molecula de IgG. Dos sitios de reconocimiento de antfgeno se encuentran localizados en los extremos de los dominios Vl y Vh. La IgG esta subdividida adicionalmente en 4 isotipos diferentes: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Las funciones efectoras mediadas por Fc, es decir, la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) son dependientes del isotipo. Cada isotipo ha evolucionado para realizar una funcion espedfica en el organismo. El isotipo IgG1 es actualmente el mas ampliamente utilizado como agente terapeutico debido a su prolongada vida media, a su mayor activacion de la ADCC y activacion del complemento. Otros isotipos se emplean como agentes terapeuticos segun sea apropiado para la diana y el efecto deseado. Por ejemplo, cuando los antfgenos diana simplemente van a ser neutralizados y las funciones efectoras son menos importantes, se pueden utilizar isotipos alternativos tales como IgG2 e IgG4. Alternativamente, se puede considerar la IgG con un Fc/funcion efectora re-modificado geneticamente.

La IgG2 tambien tiene una funcion efectora asociada minima pero es propensa a la dimerizacion, que no se comprende completamente.

La IgG4 sigue siendo un isotipo util debido a su relativa carencia de induccion de la funcion efectora. Sin embargo, la IgG4 tambien tiene algunas dificultades practicas inherentes, a saber su corta vida media en suero y su capacidad para experimentar un "intercambio del brazo Fab" (tambien referido como intercambio dinamico de cadena pesada o intercambio de cadena pesada), en donde la cadena pesada y su cadena ligera anclada de un anticuerpo se intercambian por la cadena pesada y su cadena ligera anclada de otro anticuerpo para formar otro anticuerpo completo compuesto por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras ancladas (van der Neut Kolfschoten et al., 2007 Science 317, 1554-1557).

El intercambio del brazo Fab in vivo, da como resultado anticuerpos biespedficos que, debido a sus diferentes dominios variables, pueden interactuar simultaneamente con distintos antfgenos diana. Esto produce un gran porcentaje de IgG4 circulante que se ha observado que es biespedfica, pero funcionalmente monovalente. (Schuurman, J., Van Ree, R., Perdok, G.J., Van Doorn, H.R., Tan, K.Y., Aalberse, R.C., 1999. La inmunoglobulina G4 humana normal puede ser biespedfica: tiene dos sitios de combinacion con el antfgeno diferentes. Immunology 97, 693-698).

In vitro, cuando se analizan los anticuerpos IgG4 por medio de SDS-PAGE no reductora, se ha observado que forman las denominadas 'hemimoleculas' que comprenden cada una un unico par de cadenas pesada-ligera asociadas covalentemente ocasionadas por la ausencia de enlaces disulfuro entre cadenas pesadas debido tfpicamente a la formacion de enlaces disulfuro entre cadenas pesadas dentro de la region bisagra. La cadena pesada de una "hemimolecula" puede asociarse no covalentemente con su cadena pesada emparejada companera, manteniendose la asociacion por interacciones de dominio CH3:CH3. En solucion, tales "hemimoleculas" se observan realmente utilizando metodos tales como la cromatograffa de exclusion por tamanos a tamano real, que es de aproximadamente 150 kDa, pero en una SDS-PAGE no reductora estan formadas por emparejamientos LH:CH de 75 kDa (denominados "hemimoleculas").

Una mutacion de Ser a Pro en la posicion 241 (numerada de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat) en la bisagra reduce la aparicion de estas "hemimoleculas" por una SDS-PAGE no reductora (Angal, S. et al., 1993. Una unica sustitucion de aminoacido anula la heterogeneidad del anticuerpo (IgG4) raton/humano quimerico observada durante el analisis de SDS-PAGE Mol Immunol 30, 105-108). Ademas, esta mutacion puntual no influye en la estructura compacta de IgG4 permitiendo de ese modo que IgG4 conserve su capacidad para activar el complemento.

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Despues del descubrimiento de la mutacion S241P, se han investigado otras mutaciones en IgG4 con el fin de comprender la interaccion entre cadenas pesadas en los anticuerpos IgG4, reducir la funcion efectora de IgG4 y potenciar la estabilidad estructural. En Schuurman et al. (Schuurman, J et al., 2001. The inter-heavy chain disulphide bonds of IgG4 are in equilibrium with intra-heavy chain disulphide bonds. Molecular Immunology 38, 1-8), se investigo la inestabilidad observada de los enlaces disulfuro entre cadenas pesadas de IgG4 utilizando mutantes de IgG4. En el mutante M1, la Cys 131 (numerado de acuerdo con el sistema de numeracion de EU o Cys 127 de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat), que esta implicada en el enlace disulfuro entre cadena pesada- ligera (Cl-Chi), se remplazo por serina y se encontro que este mutante daba como resultado la formacion de dfmeros de cadenas ligeras y dfmeros de cadenas pesadas. En el mutante M2, la cistema 226 (226 numerada de acuerdo con el sistema de numeracion EU o 239 de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat), que esta implicada en el enlace disulfuro entre cadenas pesadas en la bisagra, se remplazo por serina y se encontro que este mutante tema una conexion entre cadenas pesadas mas estable en comparacion con IgG4 y evitaba la formacion de un enlace disulfuro entre cadenas pesadas.

Las mutaciones en los dominios Ch2 y Ch3 de los anticuerpos IgG4 tambien han sido investigadas con el fin de reducir la formacion de productos agregados de anticuerpos IgG4. En el documento US 2008/0063635 Takahashi et al. han investigado un mutante de IgG4 en el que la arginina de la posicion 409 (numerada como 409 de acuerdo con el sistema de numeracion EU o numerada como 440 de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat) en el dominio CH3 es sustituida por lisina, treonina, metionina o leucina con el fin de inhibir la formacion de productos agregados a pH bajo. Tambien se ilustran otras mutaciones en L235, D265, D270, K322, P329 y P331 (L235, D265, D270, K322, P329 y P331 numeradas de acuerdo con el sistema de numeracion EU o L248, D278, D283, K341, P348 y P350 numeradas de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat) con el fin de atenuar la actividad CDC. En el documento WO2008/145142 Van de Winkel et al. describen anticuerpos IgG4 estables que tienen una capacidad reducida para experimentar el intercambio de brazo Fab por sustitucion del residuo de arginina en la posicion 409, el residuo de Phe en la posicion 405 o la Lys en la posicion 370 (R409, F405 y K370 numerados de acuerdo con el sistema de numeracion EU o R440, F436 y K393 numerado de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat) incluso en ausencia de la mutacion S228P (S228 numerado de acuerdo con el sistema de numeracion EU o S241 de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat) en la region bisagra.

La presente invencion proporciona nuevos anticuerpos mutantes que tienen propiedades ventajosas incluyendo mejores propiedades ffsicas en comparacion con los anticuerpos de tipo salvaje, en particular anticuerpos IgG4 de tipo salvaje y fragmentos. En particular se ha descubierto sorprendentemente que un cambio de localizacion del residuo de cistema de la cadena pesada de un anticuerpo IgG4 que forma un enlace disulfuro con una cistema de la cadena ligera proporciona un anticuerpo IgG4 que tiene una estabilidad mejorada en comparacion con un anticuerpo IgG4 de tipo salvaje. Tambien se ha descubierto que los anticuerpos IgG4 mutantes son capaces de formar anticuerpos biespedficos con propiedades de intercambio del brazo Fab ventajosas.

El intercambio de los brazos Fab in vitro puede ser promovido empleando concentraciones elevadas de anticuerpos y/o empleando estimulantes qmmicos tales como glutation para generar un formato biespedfico que sea estable y adecuado para su uso como agente terapeutico. Esto tiene aplicacion en el campo de los productos biologicos farmaceuticos debido a que las entidades biespedficas pueden ser diffciles de expresar como un unico constructo.

Compendio de la invencion

En un aspecto, la presente invencion proporciona un anticuerpo biespedfico de la clase IgG4 que comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1 y una region bisagra, en donde en cada cadena pesada:

a. la cistema de la posicion 127 del dominio Ch1, numerada de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, forma un enlace disulfuro inter-catenario con

una cistema de la cadena ligera es sustituida por un aminoacido que no contiene tiol; y

b. uno o mas aminoacidos situados en la region bisagra superior es sustituido por cistema,

en donde la secuencia de la region constante de cada cadena pesada es similar o identica y la region variable de cada cadena pesada es diferente.

Los uno o mas aminoacidos situados en la region bisagra superior que son sustituidos por cistema se pueden seleccionar entre 226, 227, 228, 229, 230, 237 y 238, numerados de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, como se muestra en la Figura 1b (aminoacidos subrayados en la region bisagra superior). En una realizacion, los uno o mas aminoacidos situados en la region bisagra superior que son sustituidos por cistema son uno o mas de los aminoacidos de las posiciones seleccionadas entre 227, 228, 229 y 230, numerados de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, como se muestra en las Figuras 1b y 2a.

En una realizacion, una mutacion a cistema en la posicion 229 reduce el intercambio del brazo Fab.

En una realizacion, se emplea una mutacion a cistema en la posicion 230 combinada con una mutacion en la

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posicion 241 a un aminoacido no polar, por ejemplo seleccionado entre prolina, alanina, glicina, isoleucina, fenilalanina, triptofano y valina.

En una realizacion, el brazo Fab se puede incrementar empleando una mutacion a un residuo polar, por ejemplo seleccionado entre arginina, acido aspartico, acido glutamico, histidina, lisina, treonina y tirosina, tal como treonina.

En una realizacion, se proporciona una mutacion en la posicion 241 a un aminoacido no polar, por ejemplo seleccionado entre prolina, alanina, glicina, isoleucina, fenilalanina, triptofano y valina.

En un aspecto adicional, la presente descripcion tambien proporciona un anticuerpo biespedfico simetrico de la clase IgG4 que comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1 y una region bisagra, en donde en cada cadena pesada::

a. la cistema de la posicion 127, numerada de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, es sustituida por otro aminoacido; y

b. la cistema de la posicion 239 o la cistema de la posicion 242, numerada de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, son sustituidas por otro aminoacido,

Los anticuerpos proporcionados por la presente invencion no tienen funcion efectora y pueden mostrar propiedades ventajosas en comparacion con un anticuerpo IgG4 de tipo salvaje, por ejemplo mejor estabilidad, tal como mejor estabilidad termica.

Si bien no se desea estar limitado por la teona, se teoriza que la bisagra modificada en los anticuerpos de acuerdo con la presente descripcion alivia la constriccion interna inherente a la molecula de IgG4 y de ese modo promueve una mayor estabilidad.

Los procedimientos naturales de intercambio de la cadena pesada pueden ser promovidos en anticuerpos IgG4 para facilitar la preparacion de anticuerpos IgG4 biespedficos de acuerdo con la presente descripcion, por ejemplo in vitro empleando elevadas concentraciones de anticuerpos y/o empleando un estimulante qmmico del intercambio tal como glutation.

Los anticuerpos de la presente descripcion pueden resultar beneficiosos ya que tienen una mayor estabilidad que las moleculas de IgG4 de tipo salvaje y/o un mejor intercambio de la cadena pesada. Los anticuerpos de la presente invencion pueden demostrar un intercambio de cadena pesada reducido en comparacion con la IgG4 de tipo salvaje, que proporciona un anticuerpo biespedfico que demuestra poco o ningun intercambio con la IgG4 de tipo salvaje in vivo debido a su reducida propension al intercambio en comparacion con IgG4 y tambien debido a la concentracion relativamente baja de un anticuerpo biespedfico in vivo en comparacion con los anticuerpos IgG4 circulantes naturales.

Si bien no se desea estar limitado por la teona, se piensa que el intercambio entre constructos de tipos similares a los descritos de acuerdo con la presente invencion es mas favorable que el intercambio entre un constructo de la presente descripcion y una IgG4 de tipo salvaje.

Los anticuerpos biespedficos de la presente invencion pueden demostrar un intercambio de cadena pesada reducido a concentraciones mayores que las concentraciones in vivo, por ejemplo concentraciones 0,5 mM o menos en comparacion con la IgG4 de tipo salvaje. Si bien los anticuerpos biespedficos de la descripcion demuestran un intercambio reducido de cadena pesada en comparacion con la IgG4 de tipo salvaje, demuestran un grado de intercambio de cadena pesada, en comparacion con IgG1 wt e IgG4 S241P, que es suficiente para crear el anticuerpo biespedfico a partir de dos anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigenicas in vitro. La simetna de la region constante de los constructos de la presente memoria minimizan ventajosamente la tension interna del anticuerpo y por lo tanto ayuda a la estabilidad.

Por consiguiente, la presente descripcion tambien proporciona un metodo para generar un anticuerpo biespedfico simetrico

que comprende la etapa de mezclar un primer anticuerpo IgG4 con un segundo anticuerpo IgG4 ex vivo, en condiciones que conducen a un intercambio de cadena pesada, en donde las especificidades antigenicas de las regiones variables en el primer anticuerpo son diferentes de las especificidades antigenicas de las regiones variables en el segundo anticuerpo.

El metodo de la presente descripcion permite la preparacion eficaz de anticuerpos simetricos biespedficos que emplean solamente tecnicas rutinarias y estimulacion de los procedimientos de origen natural.

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Breve descripcion de las Figuras

La Figura 1a muestra las secuencias de Ch1 humano y de la bisagra de IgG1 de tipo salvaje e IgG4 de tipo salvaje, en donde los residuos de la bisagra estan subrayados, y la secuencia constante de la cadena ligera kappa.

La Figura 1b muestra:

la secuencia constante de la cadena ligera kappa humana que indica la cistema (subrayada) que forma el enlace disulfuro Cl-Ch1 inter-catenario;

los residuos de Ch1 N-terminales de las cadenas pesadas de IgG 1, 2, 3 y 4 humanas y las secuencias de la region bisagra en donde se indica la posicion de la cistema (en la bisagra superior para IgGl y el Ch1 N-terminal para la IgG 2, 3 y 4) (subrayada) que forma el enlace disulfuro Cl-Ch1 intercatenario;

los residuos de Ch1 N-terminales de la cadena pesada de IgD humana y parte de las secuencias de la region bisagra en donde se indica la posicion de la cistema en la secuencia de Ch1 N-terminal (subrayada) que forma el enlace disulfuro Cl-Ch1 intercatenario;

los residuos de Ch1 N-terminal, Ch1 C-terminal de la cadena pesada de IgM humana, y los residuos de Ch2 N- terminal seleccionados en donde se indica la posicion en el Ch1 terminal (subrayado) que forma el enlace disulfuro Cl-Ch1 inter-catenario; y

los residuos de la bisagra superior de IgG3 e IgG4, la bisagra de IgD y el Ch1 y el Ch2 C-terminales de IgM donde los residuos subrayados indican posiciones en las que uno o mas residuos pueden ser sustituidos por cistema en los anticuerpos de la presente invencion.

La Figura 2a muestra el residuo de cistema (C127) de Ch1 que forma el enlace disulfuro intercatenario con una cistema de la cadena ligera y los residuos de la bisagra superior y central de IgG1 de tipo salvaje, IgG4 de tipo salvaje y las posiciones en las que se han introducido mutaciones en los anticuerpos IgG4 de la presente invencion.

La Figura 2b muestra el residuo de cistema (C127) de Ch1 que forma el enlace disulfuro inter-catenario con una cistema en la cadena ligera y los residuos de la bisagra de IgG3 de tipo salvaje y las posiciones en las que uno o mas residuos son sustituidos por cistema en los anticuerpos IgG3 de la presente invencion.

La Figura 2c muestra el residuo de cistema (C127) de Ch1 que forma el enlace disulfuro inter-catenario con una cistema en la cadena ligera y residuos de Ch1 y Ch2 seleccionados de IgM de tipo salvaje y las posiciones en las que uno o mas residuos son sustituidos por cistema en los anticuerpos IgM de la presente invencion.

La Figura 2d muestra el residuo de cistema (C128) de Ch1 que forma el enlace disulfuro inter-catenario con una cistema en la cadena ligera y los residuos de la bisagra de IgD de tipo salvaje y las posiciones en las que uno o mas residuos son sustituidos por cistema en los anticuerpos IgD de la presente invencion.

La Figura 3a muestra las mutaciones introducidas en los anticuerpos IgG4 de acuerdo con la presente invencion.

La Figura 3b muestra las posiciones de los residuos en la cadena pesada mutada de los anticuerpos IgG4 mostrados en la Figura 3a y el enlace disulfuro pronosticado que puede formar con una cistema en la cadena ligera (LC) o con otra cadena pesada mutada (HC). Cuando la cistema puede unirse a una cistema de LC o HC, la cadena subrayada es la disposicion del enlace disulfuro predominante pronosticado.

La Figura 4a muestra las mutaciones introducidas en los anticuerpos IgG4 de acuerdo con la presente invencion.

La Figura 4b muestra las posiciones de los residuos de cistema en los anticuerpos IgG4 mostrados en la Figura 4a y el enlace disulfuro pronosticado que puede formar con una cistema de la cadena ligera (LC) o la cadena pesada (HC). Cuando la cistema se puede unir con una cistema de LC o HC, la cadena subrayada es la disposicion del enlace disulfuro predominante pronosticado.

La Figura 5 muestra las secuencias de Ch1 y la region bisagra de los anticuerpos IgG4 de acuerdo con la presente invencion.

La Figura 6 muestra las secuencias de Ch1, la region bisagra, Ch2 y Ch3 de los anticuerpos IgG4 de acuerdo con la presente invencion.

La Figura 7 muestra el analisis de Transferencia Western de los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion mostrando el gel superior los resultados utilizando un Anticuerpo Anti-Fc humano y mostrando el gel inferior los resultados utilizando un Anticuerpo Anti-Kappa.

La Figura 8 muestra el analisis de Transferencia Western de anticuerpos de acuerdo con la presente invencion mostrando el gel superior los resultados utilizando un Anticuerpo Anti-Fc humano y mostrando el gel inferior los resultados utilizando un Anticuerpo Anti-Kappa humano.

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La Figura 9 muestra el analisis de Transferencia Western de anticuerpos de acuerdo con la presente invencion mostrando el gel superior los resultados utilizando un Anticuerpo Anti-Fc humano y mostrando el gel inferior los resultados utilizando un Anticuerpo Anti-Kappa humano.

La Figura 10 muestra el analisis de Transferencia Western de un anticuerpo de acuerdo con la presente invencion mostrando el gel superior los resultados utilizando un Anticuerpo Anti-Fc humano y mostrando el gel inferior los resultados utilizando un Anticuerpo Anti-Kappa humano.

La Figura 11 muestra los resultados de un analisis Thermofluor muestra las termoestabilidades de Fab y el dominio Ch2.

La Figura 12 muestra los resultados de un analisis Thermofluor muestra las termoestabilidades de Fab y el dominio CH2.

La Figura 13 muestra los resultados de un analisis Thermofluor muestra las termoestabilidades de Fab y el dominio CH2.

La Figura 14 muestra los resultados de un analisis Thermofluor muestra las termoestabilidades de Fab y el dominio CH2.

La Figura 15 muestra la clasificacion de las Termoestabilidades invencion.

La Figura 16 muestra el intercambio de cadena pesada para IgG1 de tipo salvaje, IgG4 de tipo salvaje y diversos mutantes a dos concentraciones de GSH y en diversos puntos temporales.

La Figura 17 muestra el intercambio de cadena pesada para IgG4 de tipo salvaje y diversos mutantes a dos concentraciones de GSH en diversos puntos temporales.

La Figura 18 muestra el intercambio de cadena pesada para IgG4 de tipo salvaje y diversos mutantes a dos concentraciones de GSH en diversos puntos temporales.

La Figura 19 muestra el cambio porcentual del intercambio de cadena pesada para diversos mutantes en GSH 0,5 mM en comparacion con IgG4 de tipo salvaje.

La Figura 20 muestra el cambio porcentual del intercambio de cadena pesada para diversos mutantes en GSH 5 mM en comparacion con IgG4 de tipo salvaje.

La Figura 21 muestra el analisis del intercambio de brazo simetrico de mutantes de IgG4 con residuos alternativos en la posicion 241. IgG4 WT se intercambiaba mas que IgG4 P. Las actividades de intercambio de S241G y S241A fueron similares entre sf y significativamente menores y aproximadamente la mitad de la de IgG4 WT. S241T se intercambio a niveles similares a los de IgG4 WT.

Breve descripcion de las secuencias

Los SEQ ID NO: 1-223 muestran diversas bisagras.

El SEQ ID NO: 224 muestra una bisagra de IgG1 natural.

El SEQ ID NO: 225 muestra una bisagra de IgG4 natural.

El SEQ ID NO: 226 muestra la secuencia de CH1 y la region bisagra de un anticuerpo IgG1 de tipo salvaje.

El SEQ ID NO: 227 muestra la secuencia de CH1 y la region bisagra de un anticuerpo IgG4 de tipo salvaje.

El SEQ ID NO: 228 muestra una parte de la region constante de una cadena ligera kappa de tipo salvaje humana.

El SEQ ID NO: 229 muestra una secuencia de la bisagra inferior de IgG4 (descripcion pagina 22)

El SEQ ID NO: 230 muestra una parte de la secuencia N-terminal del dominio Ch1 de un anticuerpo IgG1 humano.

El SEQ ID NO: 231 muestra la region bisagra de un anticuerpo IgG1 humano.

El SEQ ID NO: 232 muestra una parte de la secuencia N-terminal del dominio Ch1 de un anticuerpo IgG2 humano.

El SEQ ID NO: 233 muestra la region bisagra de un anticuerpo IgG2 humano.

El SEQ ID NO: 234 muestra una parte de la secuencia N-terminal del dominio Ch1 de un anticuerpo IgG3 humano.

El SEQ ID NO: 235 muestra la region bisagra de un anticuerpo IgG3 humano.

de anticuerpos de la presente invencion que

de anticuerpos seleccionados de la presente

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El SEQ ID NO: 236 muestra una parte de la secuencia N-terminal del dominio Ch1 de un anticuerpo IgG4 humano.

El SEQ ID NO: 237 muestra la region bisagra de un anticuerpo IgG4 humano.

El SEQ ID NO: 238 muestra una parte de la secuencia N-terminal del dominio Ch1 de un anticuerpo IgGD humano.

El SEQ ID NO: 239 muestra una parte de la region bisagra de un anticuerpo IgGD humano.

El SEQ ID NO: 240 muestra una parte de la secuencia N-terminal del dominio Ch1 de un anticuerpo IgGM humano.

El SEQ ID NO: 241 muestra una parte de la secuencia C-terminal del dominio Ch1 de un anticuerpo IgGM humano.

El SEQ ID NO: 242 muestra una parte del dominio Ch2 de un anticuerpo IgGM humano.

Los SEQ ID NO: 243 a 278 muestran las secuencias del dominio Ch1 y la region bisagra de los anticuerpos6, 7, 8, 15, 16, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 45, 46, 47, 2, 3, 48, 28P, 44P, 1, 4 ,5 ,5P, 9, 10, 11, 12, 13 y 14 respectivamente.

El SEQ ID NO: 279 muestra las secuencias de los dominiosCH2 y Ch3 de IgG4 de tipo salvaje.

El SEQ ID NO: 280 muestra las secuencias del dominio Ch2 de IgG4 de tipo salvaje y del dominio Ch3 de IgG1 de tipo salvaje.

Los SEQ ID NO: 281 a 306 muestran las secuencias del dominio Ch1, la region bisagra, el dominio Ch2 y el dominio CH3 de los anticuerpos 6, 7, 8, 15, 16, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 45, 46, 47, 2, 3, 48, 28P y 44P respectivamente.

Los SEQ ID NO: 306 a 316 muestran las secuencias del dominio Ch1, la region bisagra, el dominio Ch2 y el dominio Ch3 de los anticuerpos 1, 4, 5, 5P, 9, 10, 11, 12, 13 y 14 respectivamente.

Los SEQ ID NO: 317, 318, 320 y 321 muestran diversas secuencias de bisagras.

El SEQ ID NO: 319 es una localizacion en la secuencia del anticuerpo.

Descripcion detallada de las realizaciones preferidas de la invencion

A continuacion se describira la presente invencion con mas detalle.

Un anticuerpo simetrico utilizado en la presente memoria es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo en donde las cadenas pesadas tienen una secuencia similar o identica en la region externa de las regiones variables.

Similar segun se emplea en la presente memoria consiste en una secuencia de aminoacidos que es identica en 95% o mas a lo largo de toda la secuencia analizada, por ejemplo identica en 96, 97, 98 o 99%. El porcentaje de identidad se puede evaluar utilizando un soporte logico conocido por los expertos en la tecnica.

Identico segun se emplea en la presente memoria hace referencia a la existencia de una identidad de secuencia de 100% a lo largo de la secuencia analizada, por ejemplo a lo largo de toda la secuencia.

En una realizacion, las secuencias de la cadena pesada de los anticuerpos de la presente descripcion estan conectadas covalentemente, por ejemplo a traves de un enlace disulfuro intercatenario, por ejemplo un enlace que esta presente naturalmente en el correspondiente fragmento de tipo salvaje o un enlace que ha sido modificado geneticamente para que este presente en la localizacion deseada en las cadenas.

En un aspecto, los anticuerpos de la presente descripcion se caracterizan porque ambas secuencias de las cadenas pesadas o fragmentos tienen una bisagra de tipo IgG1.

La bisagra superior y central de IgG1 de tipo salvaje tiene la secuencia EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 224).

La bisagra superior y central de IgG4 de tipo salvaje tiene la secuencia EPKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 225).

Se pretende que la bisagra de tipo IgG1 empleada en la presente memoria haga referencia al caso en el que uno o mas, por ejemplo de 1 a 5, tal como 1, 2 o 3 aminoacidos se insertan en la bisagra de IgG4, en particular entre EPKYGPP (SEQ ID NO: 319) y CPSC y/o uno o mas de los aminoacidos YGPP de la bisagra de IgG4 se remplazan, por ejemplo para que correspondan a un aminoacido de la bisagra de IgG1, en particular se reemplaza G (de YGPP en la bisagra de IgG4) por C o se reemplaza Y (de YGPP en la bisagra de IgG4) por C o S.

De este modo la presente descripcion tambien proporciona un anticuerpo inespedfico simetrico que comprende

cadenas pesadas de IgG4 con una bisagra superior, central y bisagra inferior, en donde dicha bisagra superior y central en la cadena pesada o cada cadena pesada en ella tiene una longitud de 13 a 17, tal como 15 aminoacidos.

En una realizacion el anticuerpo biespedfico simetrico con una primera cadena pesada de IgG4 tiene una bisagra superior y central de 15 aminoacidos de longitud.

En una realizacion la bisagra superior y central de las cadenas pesadas comprenden los 12 aminoacidos naturales encontrados en una bisagra de IgG4 y tres aminoacidos adicionales, por ejemplo 3 residuos de alanina, o 3 residuos 5 de glicina o una combinacion de los mismos.

En una realizacion la bisagra tiene una de las siguientes secuencias:

ESKYGPPAAACPSCP: SEQ ID NO: 1; ESKYGPPGGGCPSCP SEQ ID NO: 2;

ESKYGPPTHTCPSCP: SEQ ID NO: 3; ESKYGDKTHTCPSCP SEQ ID NO: 4;

EPSKYGPPAAACPSCP: SEQ ID NO: 5; EPSKYGPPGGGCPSCP SEQ ID NO: 6;

EPSKYGPPTHTCPSCP: SEQ ID NO: 7; EPSKYGDKTHTCPSCP SEQ ID NO: 8;

ESKSYGPPAAACPSCP: SEQ ID NO: 9; ESKSYGPPGGGCPSCP SEQ ID NO: 10;

ESKSYGPPTHTCPSCP: SEQ ID NO: 11; ESKSYGDKTHTCPSCP SEQ ID NO: 12;

ESKYGPPAAACPPCP: SEQ ID NO: 13; ESKYGPPGGGCPPCP SEQ ID NO: 14;

ESKYGPPTHTCPPCP: SEQ ID NO: 15; ESKYGDKTHTCPPCP SEQ ID NO: 16;

EPSKYGPPAAACPPCP: SEQ ID NO: 17; EPSKYGPPGGGCPPCP SEQ ID NO: 18;

EPSKYGPPTHTCPPCP: SEQ ID NO: 19; EPSKYGDKTHTCPPCP SEQ ID NO: 20;

ESKSYGPPAAACPPCP: SEQ ID NO: 21; ESKSYGPPGGGCPPCP SEQ ID NO: 22;

ESKSYGPPTHTCPPCP: SEQ ID NO: 23; ESKSYGDKTHTCPPCP SEQ ID NO: 24

En una realizacion la bisagra superior y central de una cadena pesada de IgG4 de la descripcion consiste en una bisagra de tipo IgG1, es decir, EPKSCDKTHTCPPC SEQ ID NO: 25 o un derivado de la misma tal como:

EPKSCDKAAACPPCP: SEQ ID NO: 26; EPKSCDKGGGCPPCP SEQ ID NO: 27;

EPKSCDKTHTSPPCP: SEQ ID NO: 28; EPKSCDKTHTCPPSP SEQ ID NO: 29;

EPKSCDKTHTSPPSP: SEQ ID NO: 30; EPKSCDKAAASPPCP SEQ ID NO: 31;

EPKSCDKAAACPPSP: SEQ ID NO: 32; EPKSCDKAAASPPSP SEQ ID NO: 33;

EPKSCDKGGGSPPCP: SEQ ID NO: 34; EPKSCDKGGGCPPSP SEQ ID NO: 35;

EPKSCDKGGGSPPSP: SEQ ID NO: 36

En una realizacion el anticuerpo de acuerdo con la presente descripcion comprende una bisagra superior y central.

En una realizacion la bisagra superior y la region central se selecciona entre una de las siguientes secuencias:

ESKYGPPCPSCP: SEQ ID NO: 37; ESKYGDKCPSCP SEQ ID NO: 38;

EPSKYGPPCPSCP: SEQ ID NO: 39; EPSKYGDKCPSCP SEQ ID NO: 40;

ESKSYGPPCPSCP: SEQ ID NO: 41; ESKSYGDKCPSCP SEQ ID NO: 42;

ESKYGPPAACPSCP: SEQ ID NO: 43; ESKYGPPGGCPSCP SEQ ID NO: 44;

ESKYGPPHTCPSCP: SEQ ID NO: 45; ESKYGDKHTCPSCP SEQ ID NO: 46;

EPSKYGPPAACPSCP: SEQ ID NO: 47; EPSKYGPPGGCPSCP SEQ ID NO: 48;

EPSKYGPPHTCPSCP: SEQ ID NO: 49; EPSKYGDKHTCPSCP SEQ ID NO: 50;

ESKSYGPPAACPSCP: SEQ ID NO: 51; ESKSYGPPGGCPSCP SEQ ID NO: 52;

ESKSYGPPHTCPSCP: SEQ ID NO: 53; ESKSYGDKHTCPSCP SEQ ID NO: 54;

ESKYGPPACPSCP: SEQ ID NO: 55; ESKYGPPGCPSCP SEQ ID NO: 56;

ESKYGPPTTCPSCP: SEQ ID NO: 57; ESKYGDKTTCPSCP SEQ ID NO: 58;

EPSKYGPPACPSCP: SEQ ID NO: 59; EPSKYGPPGCPSCP SEQ ID NO: 60;

EPSKYGPPTTCPSCP: SEQ ID NO: 61; EPSKYGDKTTCPSCP SEQ ID NO: 62;

ESKSYGPPACPSCP: SEQ ID NO: 63; ESKSYGPPGCPSCP SEQ ID NO: 64;

ESKSYGPPTTCPSCP: SEQ ID NO: 65; ESKSYGDKTTCPSCP SEQ ID NO: 66;

ESKYGPPTHCPSCP: SEQ ID NO: 67; ESKYGDKTHCPSCP SEQ ID NO: 68;

EPSKYGPPTHCPSCP: SEQ ID NO: 69; EPSKYGDKTHCPSCP SEQ ID NO: 70;

ESKSYGPPTHCPSCP: SEQ ID NO: 71; ESKSYGDKTHCPSCP SEQ ID NO: 72;

ESKYGPPHTCPSCP: SEQ ID NO: 73; ESKYGDKHTCPSCP SEQ ID NO: 74;

EPSKYGPPHTCPSCP: SEQ ID NO: 75; EPSKYGDKHTCPSCP SEQ ID NO: 76;

ESKSYGPPHTCPSCP: SEQ ID NO: 77; ESKSYGDKHTCPSCP SEQ ID NO: 78;

ESKYGPPTCPSCP: SEQ ID NO: 79; ESKYGDKTCPSCP SEQ ID NO: 80;

EPSKYGPPTCPSCP: SEQ ID NO: 81; EPSKYGDKTCPSCP SEQ ID NO: 82;

ESKSYGPPTCPSCP: SEQ ID NO: 83; ESKSYGDKTCPSCP SEQ ID NO: 84;

ESKYGPPHCPSCP: SEQ ID NO: 85; ESKYGDKHCPSCP SEQ ID NO: 86;

EPSKYGPPHCPSCP: SEQ ID NO: 87; EPSKYGDKHCPSCP SEQ ID NO: 88;

ESKSYGPPHCPSCP: SEQ ID NO: 89; ESKSYGDKHCPSCP SEQ ID NO: 90;

EPKSCDKAACPPCP: SEQ ID NO: 91; EPKSCDKGGCPPCP SEQ ID NO: 92;

EPKSCDKHTSPPCP: SEQ ID NO: 93; EPKSCDKHTCPPSP SEQ ID NO: 94;

EPKSCDKHTSPPSP: SEQ ID NO: 95; EPKSCDKAASPPCP SEQ ID NO: 96;

EPKSCDKAACPPSP: SEQ ID NO: 97; EPKSCDKAASPPSP SEQ ID NO: 98;

EPKSCDKGGSPPCP: SEQ ID NO: 99; EPKSCDKGGCPPSP SEQ ID NO: 100;

EPKSCDKGGSPPSP: SEQ ID NO: 101; EPKSCDKACPPCP SEQ ID NO: 102;

EPKSCDKGCPPCP: SEQ ID NO: 103; EPKSCDKTSPPCP SEQ ID NO: 104;

EPKSCDKTCPPSP: SEQ ID NO: 105; EPKSCDKTSPPSP SEQ ID NO: 106;

EPKSCDKASPPCP: SEQ ID NO: 107; EPKSCDKACPPSP SEQ ID NO: 108;

EPKSCDKASPPSP: SEQ ID NO: 109; EPKSCDKGSPPCP SEQ ID NO: 110;

EPKSCDKGCPPSP: SEQ ID NO: 111; EPKSCDKGSPPSP SEQ ID NO: 112;

EPKSCDKCPPCP: SEQ ID NO: 113; EPKSCDKCPPCP SEQ ID NO: 114;

EPKSCDKSPPCP: SEQ ID NO: 115; EPKSCDKSPPSP SEQ ID NO: 116;

EPKSCDKSPPCP: SEQ ID NO: 117; EPKSCDKCPPSP SEQ ID NO: 118;

EPKSCDKSPPSP: SEQ ID NO: 119; EPKSCDKSPPCP SEQ ID NO: 120;

EPKSCDKCPPSP: SEQ ID NO: 121; EPKSCDKSPPSP SEQ ID NO: 122;

EPKSCDKTTSPPCP: SEQ ID NO: 123; EPKSCDKTTCPPSP SEQ ID NO: 124;

EPKSCDKTTSPPSP: SEQ ID NO: 125; EPKSCDKTHSPPCP SEQ ID NO: 126;

EPKSCDKTHCPPSP: SEQ ID NO: 127; EPKSCDKTHSPPSP SEQ ID NO: 128;

ESKYGPPCPPCP: SEQ ID NO: 129; ESKYGPPCPPCP SEQ ID NO: 130;

ESKYGPPCPPCP: SEQ ID NO: 131; ESKYGDKCPPCP SEQ ID NO: 132;

EPSKYGPPCPPCP: SEQ ID NO: 133; EPSKYGPPCPPCP SEQ ID NO: 134;

EPSKYGPPCPPCP: SEQ ID NO: 135; EPSKYGDKCPPCP SEQ ID NO: 136;

ESKSYGPPCPPCP: SEQ ID NO: 137; ESKSYGPPCPPCP SEQ ID NO: 138;

ESKSYGPPCPPCP: SEQ ID NO: 139; ESKSYGDKCPPCP SEQ ID NO: 140;

ESKYGPPAACPPCP: SEQ ID NO: 141; ESKYGPPGGCPPCP SEQ ID NO: 142;

ESKYGPPHTCPPCP: SEQ ID NO: 143; ESKYGDKHTCPPCP SEQ ID NO: 144;

EPSKYGPPAACPPCP: SEQ ID NO: 145; EPSKYGPPGGCPPCP SEQ ID NO: 146

EPSKYGPPHTCPPCP: SEQ ID NO: 147; EPSKYGDKHTCPPCP SEQ ID NO: 148;

ESKSYGPPAACPPCP: SEQ ID NO: 149; ESKSYGPPGGCPPCP SEQ ID NO: 150;

ESKSYGPPHTCPPCP: SEQ ID NO: 151; ESKSYGDKHTCPPCP SEQ ID NO: 152;

ESKYGPPACPPCP: SEQ ID NO: 153; ESKYGPPGCPPCP SEQ ID NO: 154;

ESKYGPPTTCPPCP: SEQ ID NO: 155; ESKYGDKTTCPPCP SEQ ID NO: 156;

EPSKYGPPACPPCP: SEQ ID NO: 157; EPSKYGPPGCPPCP SEQ ID NO: 158;

EPSKYGPPTTCPPCP: SEQ ID NO: 159; EPSKYGDKTTCPPCP SEQ ID NO: 160;

ESKSYGPPACPPCP: SEQ ID NO: 161; ESKSYGPPGCPPCP SEQ ID NO: 162;

ESKSYGPPTTCPPCP: SEQ ID NO: 163; ESKSYGDKTTCPPCP SEQ ID NO: 164;

ESKYGPPTHCPPCP: SEQ ID NO: 165; ESKYGDKTHCPPCP SEQ ID NO: 166;

EPSKYGPPTHCPPCP: SEQ ID NO: 167; EPSKYGDKTHCPPCP SEQ ID NO: 168;

ESKSYGPPTHCPPCP: SEQ ID NO: 169; ESKSYGDKTHCPPCP SEQ ID NO: 170;

ESKYGPPHTCPPCP: SEQ ID NO: 171; ESKYGDKHTCPPCP SEQ ID NO: 172;

EPSKYGPPHTCPPCP: SEQ ID NO: 173; EPSKYGDKHTCPPCP SEQ ID NO: 174;

ESKSYGPPHTCPPCP: SEQ ID NO: 175; ESKSYGDKHTCPPCP SEQ ID NO: 176;

ESKYGPPTCPPCP: SEQ ID NO: 177; ESKYGDKTCPPCP SEQ ID NO: 178;

EPSKYGPPTCPPCP: SEQ ID NO: 179; EPSKYGDKTCPPCP SEQ ID NO: 180;

ESKSYGPPTCPPCP: SEQ ID NO: 181; ESKSYGDKTCPPCP SEQ ID NO: 182;

ESKYGPPHCPPCP: SEQ ID NO: 183; ESKYGDKHCPPCP SEQ ID NO: 184;

EPSKYGPPHCPPCP: SEQ ID NO: 185; EPSKYGDKHCPPCP SEQ ID NO: 186;

ESKSYGPPHCPPCP: SEQ ID NO: 187; ESKSYGDKHCPPCP SEQ ID NO: 188;

EPKSCDKTHTCPPCP: SEQ ID NO: 189; EPKSCDKTHTCPSCP SEQ ID NO: 190;

ESKYCPPACPSCP: SEQ ID NO: 191; ESKYCPPAACPSCP SEQ ID NO: 192;

ESKYCPPAAACPSCP: SEQ ID NO: 193; ESKYCPPAAASPSCP SEQ ID NO: 194;

ESKYCPPAAACPSSP: SEQ ID NO: 195; ESKCGPPAAACPSCP SEQ ID NO: 196;

5

10

15

20

25

ESKYCPPAAAACPSCP: SEQ ID NO: 197; ESKYCPPAAAAACPSCP SEQ ID NO: 198;

ESKYCPPGGGCPSCP: SEQ ID NO: 199; ESKYCPPSSSCPSCP SEQ ID NO: 200;

ESKYCPPTCPSCP: SEQ ID NO: 201; ESKYCPPTHCPSCP SEQ ID NO: 202;

ESKYCPPTHTCPSCP: SEQ ID NO: 203; ESKYCPKTHTCPSCP SEQ ID NO: 204;

ESKYCDKTHTCPSCP: SEQ ID NO: 205; ESKYCDKTHCPSCP SEQ ID NO: 206;

ESKYCDKTCPSCP: SEQ ID NO: 207; ESKYCDKAAACPSCP SEQ ID NO: 208;

ESKYCDKCPSCP: SEQ ID NO: 209; ESKSCDKTHTCPSCP SEQ ID NO: 210;

EPKYCDKTHTCPSCP: SEQ ID NO: 211; EPKSCPPCPSCP SEQ ID NO: 212;

ESKSCPPCPSCP: SEQ ID NO: 213; EPKYCPPCPSCP SEQ ID NO: 214;

ECKYGPPCPSCP: SEQ ID NO: 215; ECKYGPPSPSCP SEQ ID NO: 216;

ECKYGPPCPSSP: SEQ ID NO: 217; ESCYGPPCPSCP SEQ ID NO: 218;

ESCYGPPSPSCP: SEQ ID NO: 219; ESCYGPPCPSSP SEQ ID NO: 220;

ESKCGPPCPSCP: SEQ ID NO: 221; ESKCGPPSPSCP SEQ ID NO: 222;

ESKCGPPCPSSP: SEQ ID NO: 223; EPKSCDKCPPSP SEQ ID NO: 317.

En una realizacion la region bisagra central en una o ambas secuencias de la cadena pesada o fragmentos de las mismas tiene la secuencia CPPCP SEQ ID NO: 318.

Si bien no se desea estar limitado por la teona, se piensa que es probable que esta secuencia bloquee el intercambio dinamico de los brazos del anticuerpo a concentracion de tipo "in vivo", por ejemplo se piensa que una concentracion de reductor menor de 0,5 mM, en particular concentraciones de reductor del orden de 5 pM es fisiologicamente relevante (Zilmer et al., 2005 Drug Design Reviews vol. 2, num. 2, pags. 121-127, 2005).

En una realizacion de la presente descripcion cada cadena pesada del anticuerpo biespedfico

tiene regiones bisagra superior y central identicas seleccionadas entre las secuencias anteriores, y tambien puede tener una region bisagra inferior identica. En una realizacion adicional, cada cadena pesada del anticuerpo biespedfico tiene regiones Ch1 identicas, y tambien puede tener regiones Ch2 y Ch3 identicas. Por consiguiente, cada cadena pesada puede tener secuencias de la region constante de la cadena pesada identicas.

Se pretende que "regiones variables diferentes" segun se emplea en la presente memoria haga referencia al caso en el que dichas regiones variables tienen especificidad por diferentes antfgenos. Es decir, que el antfgeno para el cual es espedfica cada region variable es un antfgeno diferente o una parte de antfgeno diferente, p. ej. un epttopo diferente.

"Espedfico" segun se emplea en la presente memoria hace referencia al hecho de que los dominios de union reconodan un antfgeno diana con mayor afinidad y avidez que otros antfgenos para los cuales no es espedfico (por ejemplo 10, 20, 50, 10 o 1000 mayor). Esto no implica necesariamente que la region de union espedfica no se una a ninguno de los antfgenos no diana, sino que la interaccion con la diana es tal que se puede utilizar para purificar el antfgeno diana (para el cual es espedfico) de una mezcla compleja de antfgenos, incluyendo antfgenos de la misma familia de protemas.

En una realizacion se afsla el anticuerpo de acuerdo con la presente descripcion.

Se pretende que aislado, segun se emplea en la presente memoria haga referencia a un anticuerpo que esta aislado del organismo humano, por ejemplo: preparado mediante tecnicas recombinantes, purificado utilizando una tecnica tal como cromatograffa, y/o en una formulacion farmaceutica.

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La presente invencion tambien proporciona un vector de expresion que comprende una secuencia que codifica los anticuerpos de la presente invencion y una celula anfitriona que comprende el vector de expresion.

La presente invencion tambien proporciona un anticuerpo como se ha definido anteriormente para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno. Adicionalmente se proporciona un metodo para el tratamiento de una enfermedad o trastorno que comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo como se ha definido anteriormente.

En una realizacion el anticuerpo de acuerdo con la presente descripcion comprende una o dos secuencias de cadena pesada seleccionadas independientemente entre una secuencia de cadena pesada descrita en la presente memoria. Los terminos "protema" y "polipeptido" se utilizan indistintamente en la presente memoria, a menos que el contexto indique lo contrario. Se pretende que "peptido" haga referencia a 10 o menos aminoacidos.

El termino "polinucleotido" incluye un gen ADN, ADNc, ARN, ARNm etc. a menos que el contexto indique lo contrario.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "que comprende" en el contexto de la presente memoria descriptiva debe ser interpretado como "que incluye".

El termino "de tipo salvaje" en el contexto de la presente invencion representa un anticuerpo tal como se puede encontrar en la naturaleza o se puede aislar del entorno, que no comprende ninguna de las mutaciones modificadas geneticamente.

La designacion para un mutante por sustitucion en la presente memoria consiste en una letra seguida de un numero seguido de una letra. La primera letra designa el aminoacido en la protema de tipo salvaje. El numero hace referencia a la posicion de aminoacido en la que se esta realizando la sustitucion del aminoacido, y la segunda letra designa el aminoacido que se utiliza para remplazar al aminoacido de tipo salvaje. Los residuos de los dominios variables y constantes de un anticuerpo se numeran de manera convencional de acuerdo con un sistema ideado por Kabat et al. Este sistema se expone en Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (en adelante "Kabat et al. (supra)").

Las denominaciones de los residuos de Kabat no siempre corresponden directamente con la numeracion lineal de los residuos de aminoacido. La secuencia lineal de aminoacidos real puede contener menos o mas aminoacidos que la numeracion de Kabat estricta correspondiente a un acortamiento de, o insercion en, un componente estructural, region marco o region determinante de la complementariedad (CDR), de la estructura del dominio variable basico. La numeracion de Kabat correcta de los residuos se puede determinar para un anticuerpo dado por medio de un alineamiento de residuos de homologfa en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "convencional". Alternativamente, la numeracion de los residuos de aminoacido se puede llevar a cabo por medio del mdice EU o sistema de numeracion EU tambien descrito en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Un sistema adicional de numeracion de residuos de aminoacidos de anticuerpos es el sistema de numeracion IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005)).

El sistema de numeracion de Kabat se utiliza en la presente memoria descriptiva excepto cuando se indica, por el contrario, que se utiliza el sistema de numeracion EU o el sistema de numeracion IMGT.

Entre los cuatro isotipos de IgG4, las disposiciones de los enlaces disulfuro intracatenarios en las cadenas pesada y ligera son similares mientras las disposiciones de los enlaces disulfuro intercatenarios son unicas para cada isotipo [Revisado por (Wypych, J., Li, M., Guo, A., Zhang, Z., Martinez, T., Allen, M.J., Fodor, S., Kelner, D.N., Flynn, G.C., Liu, Y.D., Bondarenko, P.V., Ricci, M.S., Dillon, T.M., Balland, A., 2008. Los anticuerpos IgG2 humanos presentan isoformas estructurales mediadas por disulfuro. J Biol Chem. 283, 16194-16205)].

Como se muestra en la Figura 1b, las secuencias de la region bisagra de los cuatro isotipos de IgG4 son diferentes. La region bisagra completa o genetica consiste tfpicamente en los residuos 226 a 251 (numeracion basada en el sistema de numeracion de Kabat). La Figura 1b muestra las secciones superior, central e inferior de las regiones bisagra de los cuatro isotipos de IgG4. Para el isotipo IgG1, la region bisagra superior consiste en los residuos 226 a 238, la region bisagra central consiste en los residuos 239 a 243 y la region bisagra inferior consiste en los residuos 244 a 251. Para el isotipo de IgG4, la region bisagra superior consiste en los residuos 226 a 238, la region bisagra central consiste en los residuos 239 a 243 y la region bisagra inferior consiste en los residuos 244 a 251. Los nuevos anticuerpos IgG4 mutantes de acuerdo con la presente invencion han sido desarrollados modificando las disposiciones del enlace disulfuro intercatenario dentro de IgG4, espedficamente se ha modificado la disposicion del enlace disulfuro intercatenario Cl-Ch1 entre la cadena ligera (LC) y la cadena pesada (HC).

La Figura 1b muestra secciones de las secuencias de las cadenas pesada y ligera de IgG humana para los isotipos IgG 1-4 que indican las posiciones de la cistema (subrayadas) que forman los enlaces disulfuro intercatenarios Cl- Ch1. El enlace disulfuro inter Cl-Ch1 de IgG1 esta formado entre la C214 de LC (sistema de numeracion de Kabat) y la C233 (sistema de numeracion de Kabat) de la HC inmediatamente antes de la region bisagra. Por el contrario, el enlace disulfuro Ch1-Cl para IgG2, 3 y 4 esta formado entre la C214 de LC y la C127 N-terminal para el enlace

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disulfuro intracatenario de la HC. Las secuencias de LC y HC colindantes a los residuos de cistema implicados en la formacion del enlace disulfuro Cl-Ch1 se muestran y se alinean en la Figura 1b.

La presente invencion ha investigado como afecta el enlace disulfuro Cl-Ch1 a las propiedades de un anticuerpo IgG4 incluyendo la termoestabilidad, la estabilidad estructural y la afinidad del anticuerpo.

Los mutantes de IgG4 fueron generados por sustitucion del residuo de cistema en la Chi en la posicion 127 por otro aminoacido as^ como la sustitucion de uno o mas de los aminoacidos en la region de la bisagra superior, preferiblemente los aminoacidos de las posiciones seleccionadas entre 227, 228, 229 y 230, numeradas de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, por cistema. Las posiciones 227, 228, 229 o 230 estan en o cerca de la posicion en la que esta situada la cistema 233 de IgG1.

Cada cadena pesada puede comprender mutaciones adicionales incluyendo la sustitucion de uno o ambos residuos de cistema 239 y 242 en la region bisagra de IgG4 por otro aminoacido. Tambien se inclma una mutacion para alargar la region bisagra de IgG4 en tres aminoacidos entre las posiciones 238 y 239 para que tuviera la misma longitud que la bisagra de IgG1 en algunos anticuerpos. Tambien se introdujo la mutacion S241P en algunos anticuerpos.

La formacion de hemimoleculas de IgG4 se puede reducir mediante la introduccion de una mutacion de Ser a Pro en la posicion 241 (numerada de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat) en la bisagra (Angal, S. et al., 1993. Una unica sustitucion de aminoacido anula la heterogeneidad del anticuerpo quimerico raton/humano (IgG4). Mol Immunol 30, 105-108). Ademas, esta mutacion puntual no influyo en la estructura compacta de IgG4 permitiendo de ese modo que IgG4 conserve su menor capacidad para activar el complemento.

No obstante, el intercambio in vitro de estos anticuerpos mutados se puede promover utilizando elevadas concentraciones de anticuerpos, por ejemplo 1-10mM o mas, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 mM. Se ha descubierto que los anticuerpos IgG4 mutantes de acuerdo con la presente invencion muestran propiedades ventajosas, por ejemplo una mejor estabilidad.

En una realizacion, los anticuerpos IgG4 mutantes de acuerdo con la presente invencion muestran una mayor termoestabilidad en comparacion con un anticuerpo IgG4 de tipo salvaje. Se ha descubierto sorprendentemente que los anticuerpos IgG4 mutantes que han sido mutados para remplazar la cistema de la posicion 127 en el dominio Ch1 por otro aminoacido y en los que se ha introducido una cistema en la region bisagra de la cadena pesada entre las posiciones 227 a 230 muestran una mayor termoestabilidad en comparacion con un anticuerpo IgG4 de tipo salvaje. La mutacion para eliminar una cistema de la posicion 127 altera la posicion en la cual se forma el enlace disulfuro intercatenario entre la cadena pesada y la cadena ligera (Cl-Chi) y obliga a la cadena ligera a formar un enlace disulfuro con una cistema que se introduce entre las posiciones 227 y 230 en la region bisagra de la cadena pesada. Por consiguiente, en una realizacion, se proporciona un anticuerpo IgG4 en el que la cistema 127 es sustituida por otro aminoacido y la cistema de la cadena ligera esta conectada a traves de un enlace disulfuro a una cistema modificada geneticamente en la posicion 227, 228, 229 o 230.

Tambien se encontro sorprendentemente una mejora adicional de la termoestabilidad al anadir tres aminoacidos en la region bisagra de IgG4 con el fin de alargar la region bisagra de IgG4.

Tambien se ha descubierto sorprendentemente que los anticuerpos IgG4 mutantes que han sido mutados para remplazar la cistema de la posicion 127 en el dominio Ch1 por otro aminoacido y para remplazar la cistema de la posicion 239 o la posicion 242 en la region bisagra de la cadena pesada por otro aminoacido mostraban una mayor termoestabilidad en comparacion con un anticuerpo IgG4 de tipo salvaje.

En una realizacion los anticuerpos de la presente invencion muestran una reduccion de la formacion de las denominadas hemimoleculas, que estan constituidas por una sola cadena ligera y una sola cadena pesada (HL). Los anticuerpos que comprenden una mutacion en C239 pero no portan una mutacion en C242 generalmente muestran una reduccion de la formacion de hemimoleculas. Sin desear estar limitados por la teona, se piensa que esto se debe a que la eliminacion de la Cistema de la posicion 239 reduce la formacion del enlace disulfuro intracatenario en la cadena pesada y por lo tanto reduce el numero de hemimoleculas en comparacion con los anticuerpos que no portan una mutacion en la C239 o la C242. Los anticuerpos que portan una mutacion en C242 pero no portan una mutacion en C239 parecen formar mas hemimoleculas en comparacion con los anticuerpos que portan una mutacion en C239 pero no portan una mutacion en C242. Sin desear estar limitado por la teona, se cree que la cistema de la posicion 239 es mas reactiva en comparacion con la cistema de la posicion 242 y es capaz de formar un enlace disulfuro con una cistema de la bisagra de la cadena pesada o la cistema de la cadena ligera.

Los anticuerpos que portan una mutacion tanto en C239 como en C242 forman una elevada proporcion de hemimoleculas debido a la no formacion de enlace disulfuro intercatenario entre dos cadenas pesadas. No obstante, los anticuerpos que comprenden mutaciones tanto en C239 como en C242 todavfa son capaces de formar moleculas completas de anticuerpos debido a la union de las cadenas pesadas por medio de enlaces no covalentes. La reduccion de la formacion de hemimoleculas tambien se observa en anticuerpos que portan la mutacion S241P.

Los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion tambien muestran una afinidad comparable hacia el antfgeno

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diana en comparacion con el anticuerpo IgG4 de tipo salvaje.

Las mutaciones en las regiones constantes de la cadena pesada de los anticuerpos biespedficos de la presente invencion se describen con mas detalle mas abajo. Los metodos para remplazar aminoacidos son bien conocidos en la tecnica de la biologfa molecular. Tales metodos incluyen por ejemplo la mutagenesis dirigida al sitio utilizando metodos tales como la PCR para suprimir y/o sustituir aminoacidos o diseno de novo de secuencias sinteticas.

La Figura 2a muestra los residuos de la bisagra de IgG1 de tipo salvaje, IgG4 de tipo salvaje y las posiciones en las que se han introducido mutaciones en los anticuerpos de la presente invencion. Numeracion basada en el sistema de numeracion de Kabat.

Los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion comprenden una mutacion en la posicion 127 (C127), en donde el residuo de cistema es remplazado por otro aminoacido que no contiene un grupo tiol. Por remplazar o sustituir, los autores de la presente invencion quieren significar que donde normalmente se encontrana la cistema 127 intercatenaria de la cadena pesada del anticuerpo, se encuentra otro aminoacido. La mutacion en C127 puede ser cualquier mutacion adecuada para uno, dos, o tres de los nucleotidos que codifican el aminoacido de la posicion 127 que cambia el residuo de aminoacido de cistema a otro aminoacido adecuado. Los ejemplos de los aminoacidos adecuados incluyen serina, treonina, alanina, glicina o cualquier aminoacido polar. Un aminoacido particularmente preferido es la serina.

La sustitucion de la cistema de la posicion 127 por otro aminoacido elimina la cistema del dominio Ch1 que normalmente forma un enlace disulfuro con una cistema de la cadena ligera de IgG4 de tipo salvaje. Por lo tanto, con el fin de formar un emparejamiento de cadena ligera y cadena pesada a traves de un enlace disulfuro intercatenario, la cadena ligera debe formar un enlace disulfuro con una cistema que se situa en la region bisagra de la cadena pesada.

En un primer aspecto de la invencion, los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion comprenden una cadena pesada en donde uno o mas de los aminoacidos de las posiciones seleccionadas entre 227, 228, 229 y 230, numeradas de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, son sustituidos por cistema. Por consiguiente, los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion pueden portar una o mas de las siguientes mutaciones: S227C; K228C; Y229C; G230C

En una realizacion solamente un residuo seleccionado entre 227, 228, 229 y 230 es sustituido por un residuo de cistema.

En una realizacion los anticuerpos de la presente invencion portan la mutacion Y229C o G230C.

La inclusion de un residuo de cistema en la posicion seleccionada entre 227, 228, 229 y 230, en la region bisagra de la cadena pesada proporciona una nueva posicion para que se forme un enlace disulfuro intercatenario entre la cadena pesada y la cadena ligera. Los autores de la presente invencion han descubierto que esta nueva disposicion del enlace disulfuro intercatenario proporciona anticuerpos IgG4 que tienen una mayor estabilidad en comparacion con un anticuerpo IgG4 de tipo salvaje.

Se pueden introducir mutaciones adicionales en los anticuerpos de este aspecto de la presente invencion. En una realizacion la cistema de la posicion 239 (C239) y/o la cistema de la posicion 242 (C242), numeradas de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, en la cadena pesada son sustituidas por otro aminoacido, preferiblemente un aminoacido que no contiene un grupo tiol. Por remplazar o sustituir los autores de la presente invencion quieren significar que donde se encontranan normalmente la cistema 239 y/o la cistema 242 en la cadena pesada del anticuerpo, se encuentra otro aminoacido. La mutacion en C239 y/o C242 puede ser cualquier mutacion adecuada en uno, dos o tres de los nucleotidos que codifican el aminoacido que cambia el residuo de aminoacido de cistema a otro aminoacido adecuado. Los ejemplos de aminoacidos adecuados incluyen serina, treonina, alanina, glicina o cualquier aminoacido polar. Un aminoacido particularmente preferido es la serina.

En una realizacion la cistema de la posicion 239 de la cadena pesada es sustituida por otro aminoacido y la cistema de la posicion 242 de la cadena pesada es sustituida por otro aminoacido. En esta realizacion, la sustitucion de C239 y C242 elimina ambos residuos de cistema en la region bisagra de la cadena pesada que normalmente forman enlaces disulfuro intercatenarios con las correspondientes cistemas de otra cadena pesada. Las hemimoleculas resultantes pueden formar moleculas de anticuerpo completas a traves de enlaces no covalentes entre dos cadenas pesadas.

En una realizacion alternativa, la cistema de la posicion 239 de la cadena pesada es sustituida por otro aminoacido. En esta realizacion, la cistema de la posicion 242 no es sustituida por otro aminoacido.

En una realizacion alternativa mas, la cistema de la posicion 242 de la cadena pesada es sustituida por otro aminoacido. En esta realizacion, la cistema de la posicion 239 no es sustituida por otro aminoacido.

La sustitucion de C239 o C242, deja una cistema en la cadena pesada que es capaz de formar un enlace disulfuro entre cadenas pesadas con una cistema de otra cadena pesada. Sin desear estar limitado por la teona, se piensa

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que la sustitucion de una cistema de la region bisagra, concretamente la sustitucion de C239, reduce la formacion de un enlace disulfuro intracatenario en la region bisagra y por lo tanto puede reducir la formacion de moleculas de medio anticuerpo.

En una realizacion de la presente invencion, en donde la serina de la posicion 227 es sustituida por una cistema, preferiblemente el anticuerpo no comprende mutaciones en las posiciones C239 y C242. En otra realizacion, en donde la serina de la posicion 227 es sustituida por una cistema, preferiblemente la cistema de la posicion 239 de la cadena pesada es sustituida por otro aminoacido, pero la cistema de la posicion 242 no es sustituida por otro aminoacido.

En una realizacion los anticuerpos de la presente invencion comprenden una cadena pesada de IgG4 que es mutada para insertar uno o mas aminoacidos entre los aminoacidos 226-243. El numero de aminoacidos insertado puede ser de 1 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, preferiblemente se insertan 1, 2, 3 o 4 aminoacidos. Los aminoacidos se insertan preferiblemente entre los aminoacidos 238 y 239. Cualquiera de los aminoacidos adecuados puede ser insertado en la region bisagra, tales como alaninas, glicinas, serinas o treoninas y combinaciones de los mismos. Preferiblemente se insertan tres alaninas (AAA), tres glicinas (GGG), tres serinas (SSS) o tres treoninas (TTT) o una treonina, una histidina y otra treonina (THT). Se ha descubierto que los anticuerpos de la presente invencion que comprenden una cadena pesada de IgG4 que ha sido mutada para insertar tres aminoacidos en la region bisagra muestran una mayor termoestabilidad.

Una mutacion adicional que puede ser introducida en los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion es la mutacion S241P. Se ha demostrado previamente que esta mutacion reduce la formacion de hemimoleculas (Angal, S. et al., 1993. Una sustitucion de un solo aminoacido anula la heterogeneidad del anticuerpo quimerico de raton/humano (IgG4). Mol Immunol 30, 105-108). Se ha descubierto sorprendentemente que los anticuerpos mutantes de la presente invencion que comprenden la mutacion S241P demuestran cierto intercambio de la cadena pesada in vitro en condiciones reductoras fuertes en comparacion con IgG4 P (IgG4 con S241P). Esto permite la creacion de anticuerpos biespedficos in vitro a partir de anticuerpos IgG4 mutantes de la presente invencion. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion pueden comprender una o mas mutaciones adicionales en la region bisagra. Por ejemplo, los anticuerpos pueden comprender adicionalmente una o mas de las siguientes mutaciones S227P, Y229S, P237D y P238K.

En una realizacion el anticuerpo de acuerdo con la presente descripcion comprende eficazmente una region bisagra de IgG1 del residuo 226 al 243 (bisagra superior y bisagra central). Por consiguiente, el anticuerpo de la presente invencion comprende una region bisagra en donde la glicina de la posicion 230 es sustituida por cistema, la serina de la posicion 227 es sustituida por prolina, la tirosina de la posicion 229 es sustituida por serina, la prolina de la posicion 237 es sustituida por acido aspartico, la prolina de la posicion 238 es sustituida por lisina, la secuencia de aminoacidos treonina-histidina-treonina es insertada entre las posiciones 238 y 239 y la serina de la posicion 241 es sustituida por prolina. Estas mutaciones tambien pueden ser escritas como S227P, Y229S, G230C, P237D, P238KTHT y S241P, como se muestra en la Figura 2a. Se ha descubierto que la introduccion de estas mutaciones adicionales en la region bisagra de IgG4 proporciona un anticuerpo con una mejor termoestabilidad.

El anticuerpo de acuerdo con la presente invencion tiene una bisagra inferior de IgG4 desde el residuo 244 al 251 (APEFLGGP SEQ ID NO: 229). Sin desear estar limitado por la teona, se cree que la region bisagra inferior de IgG4 contribuye a la carencia de funcion efectora de un anticuerpo IgG4.

En un segundo aspecto de la presente descripcion se proporciona un anticuerpo biespedfico simetrico

en donde en una o ambas cadenas pesadas la cistema intercatenaria de la posicion 127 es sustituida por otro aminoacido, como se ha descrito anteriormente, y la cistema de la posicion 239 o la cistema de la posicion 242, numeradas de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, de la cadena pesada son sustituidas por otro aminoacido. En este segundo aspecto, ninguno de los residuos de las posiciones 227, 228, 229 y 230 es sustituido por un residuo de cistema.

Un anticuerpo biespedfico asimetrico de la clase IgG4 que comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una un dominio variable, un dominio Ch1 y una region bisagra, en donde en cada cadena pesada la cistema intercatenaria de la posicion 127, numerada de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, es sustituida por otro aminoacido; y la cistema de la posicion 239 y/o la cistema de la posicion 242, numerada de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, es sustituida por otro aminoacido, en donde la secuencia de la region constante de cada cadena pesada es similar o identica y la region variable de cada cadena pesada es diferente.

Se ha descubierto sorprendentemente que los anticuerpos de acuerdo con el segundo aspecto de la presente descripcion

tienen una mejor termoestabilidad en comparacion con un anticuerpo IgG4 de tipo salvaje.

En el segundo aspecto de la presente invencion, el anticuerpo puede comprender una o mas mutaciones adicionales. En una realizacion el anticuerpo comprende una cadena pesada de IgG4 que es mutada para insertar tres aminoacidos entre los aminoacidos 226-243, preferiblemente entre los aminoacidos 238 y 239, como se ha

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descrito anteriormente. En una realizacion adicional el anticuerpo comprende la mutacion S241P. En una realizacion adicional, el anticuerpo puede comprender adicionalmente una o mas de las siguientes mutaciones S227P, Y229S, P237D y P238K.

Las Figuras 3a y 4a tambien muestran las mutaciones introducidas en los anticuerpos IgG4 de acuerdo con la presente invencion. Las Figuras 3b y 4b muestran las posiciones de los residuos de cistema en los anticuerpos IgG4 de la presente invencion y tambien muestran los enlaces pronosticados de la cistema a una cistema de la cadena ligera (LC) u otra cadena pesada (HC). Para los residuos de cistema que muestran (LC o HC), es posible que la cistema se este uniendo a una cistema de la cadena ligera o la cadena pesada pero donde la LC o la HC estan subrayadas, este es el enlace disulfuro que se cree que aparece predominantemente.

En una realizacion, la presente descripcion proporciona un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas

que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1 y una region bisagra y cada cadena pesada comprende las mutaciones de un anticuerpo seleccionado entre 2, 3, 6, 7, 8, 15, 16, 28, 28P, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 44P, 45, 46, 47 y 48, como se muestra en la Tabla 1. Por consiguiente, la presente invencion proporciona un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1 y una region bisagra y cada cadena pesada comprende una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245 , SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247 , SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO:258, SEQ ID NO:259, SEQ ID NO:260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO:263, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO:266, SEQ ID NO: 267 y SEQ ID NO: 268.

En una realizacion preferida, el anticuerpo de la presente descripcion comprende dos cadenas pesadas

que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1 y una region bisagra, y comprende una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO:257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267 y SEQ ID NO: 268. Mas preferiblemente, el anticuerpo de la presente invencion comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1 y una region bisagra y cada cadena pesada comprende una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245 , SEQ ID NO: 246 , SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258,SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO:267 y SEQ ID NO: 268.

En una realizacion adicional preferida, la presente descripcion proporciona un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1, una region bisagra, un dominio Ch2 y un dominio Ch3 y cada cadena pesada comprende las mutaciones de un anticuerpo seleccionado entre 2, 3, 6, 7, 8, 15, 16, 28, 28P, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 44P, 45, 46, 47 y 48, como se muestra en la Tabla 1. Por consiguiente, la presente invencion proporciona un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1, una region bisagra, un dominio Ch2 y un dominio Ch3 y cada cadena pesada comprende una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283 , SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 304,SEQ ID NO: 305 y SEQ ID NO: 306.

Un anticuerpo particularmente preferido de la presente invencion comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1 y una region bisagra, en donde la cadena pesada comprende el SEQ ID NO: 36 (anticuerpo 28P), SEQ ID NO: 37 (anticuerpo 44P) o SEQ ID NO: 35 (anticuerpo 48). Un anticuerpo particularmente preferido adicional de la presente invencion comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1, una region bisagra, un dominio Ch2 y un dominio Ch3 en donde la cadena pesada comprende el SEQ ID NO:62 (anticuerpo 28P), SEQ ID NO: 63 (anticuerpo 44P) o SEQ ID NO:61 (anticuerpo 48). Los anticuerpos 28P, 44P y 48 son particularmente preferidos porque muestran una termoestabilidad significativamente mejor y muestran adicionalmente una reduccion de la formacion de hemimoleculas.

La Tabla 1 siguiente enumera anticuerpos ilustrativos con mutaciones que han sido introducidas en comparacion con la secuencia de IgG4 de tipo salvaje. La Tabla 1 tambien incluye anticuerpos IgG1 e IgG4 de tipo salvaje y anticuerpos de control. Tabla 1:

Numero de anticuerpo: Mutaciones de la Cadena Pesada (Numeracion de Kabat) Dominio Ch1 & bisagra SEQ ID NO: Ch1, Bisagra Ch2 & Ch3 SEQ ID NO:

1: C127S 269 307

2: C127S,C239S 264 302

3: C127S,C242S 265 303

4: C127S, C242S, C239S 270 308

5: G230C 271 309

5P: G230C, S241P 272 310

6: C127S, G230C, C239S 243 281

7: C127S, G230C, C242S 244 282

8: C127S, G230C, C239S, C242S 245 283

9: G230C, C239S 273 311

10: G230C, C242S 274 312

11: G230C, C239S, C242S 275 313

12: C239S 276 314

13: C242S 277 315

14: C239S,C242S 278 316

15: C127S, G230C 246 284

16: C127S, G230C, S241P 247 285

17: IgG4 humana de tipo salvaje 227 -

18: S241P - -

19: IgG1 humana de tipo salvaje 226 -

28: C127S Y229C 248 286

28P: C127S Y229C, S241P 267 305

29: C127S Y229C C239S 249 287

30: C127S Y229C C242S 250 288

31: C127S Y229C C239S C242S 251 289

32: C127S K228C 252 290

33: C127S K228C C239S 253 291

34: C127S K228C C242S 254 292

35: C127S K228C C239S C242S 255 293

36: C127S S227C 256 294

37: C127S S227C C239S 257 295

38: C127S S227C C242S 258 296

39: C127S S227C C239S C242S 259 297

44: C127S G230C P238PAAA 260 298

44P: C127S G230C P238PAAA, S241P 268 306

45: C127S G230C P238PAAA C239S 261 299

46: C127S G230C P238PAAA C242S 262 300

47: C127S G230C P238PAAA C239S C242S 263 301

48: C127S, S227P, Y229S, G230C, P237D, P238KTHT, S241P 266 304

49: C127S G230C P238PA

50: C127S G230C P238PAA S241P

51: C127S, G230C, P238PAAAA

52: C127S, G230C, P238PAAAAA

55: C127S, G230C, P238PTHT

56: C127S, G230C, P237D, P238KTHT

57: C127S, G230C, P238PGGG

60: C127S, S227P, G230C

62: C127S, Y229S, G230C

64: C127S, S227P, Y229S, G230C

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65: C127S, S227P, Y229S, G230C, P237D, P238KTHT

66: C127S, G230C,P237D, P238KTH

67: C127S, G230C,P237D, P238KT

68: C127S, G230C, P237D, P238K

69: C127S, G230C P237D, P238KAAA

71: C127S, S227P, G230C, P237D, P238KTHT

73: C127S, Y229S, G230C, P237D, P238KTHT

74: C127S Y229C bisagra central SPPCP

75: C127S G230C bisagra central CPPSP

76: C127S Y229C bisagra central CPPSP

77: C127S G230C bisagra central SPPCP

Las Figuras 3a y 4a tambien muestran las mutaciones introducidas en los anticuerpos IgG4 de acuerdo con la presente invencion. Las Figuras 3b y 4b muestran las posiciones de los residuos de cistema en los anticuerpos IgG4 de la presente invencion y tambien muestran los enlaces pronosticados de la cistema a una cistema de la cadena ligera (LC) u otra cadena pesada (HC). Para los residuos de cistema que muestran (LC o HC), es posible que la cistema se este uniendo a una cistema de la cadena ligera o la cadena pesada, pero cuando LC o HC estan subrayadas, este es el enlace disulfuro que se cree que aparece de manera predominante.

En una realizacion preferida, la presente descripcion proporciona un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1 y una region bisagra y cada cadena pesada comprende las mutaciones de un anticuerpo seleccionado entre 2, 3, 6, 7, 8, 15, 16, 28, 28P, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 44P, 45, 46, 47 y 48, como se muestra en la Tabla 1. Por consiguiente, la presente invencion proporciona un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1 y una region bisagra y cada cadena pesada comprende una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267 y SEQ ID NO: 268.

En una realizacion preferida el anticuerpo de la presente descripcion comprende dos cadenas pesadas

que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1 y una region bisagra, y comprende una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO:261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267 y SEQ ID NO: 268. Mas preferiblemente, el anticuerpo de la presente invencion comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1 y una region bisagra y cada cadena pesada comprende una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 243, SEQ iD NO: 244, SEQ ID No: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247 , SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267 y SEQ ID NO: 268.

En una realizacion preferida adicional, la presente descripcion proporciona un anticuerpo

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que comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1, una region bisagra, un dominio Ch2 y un dominio Ch3 y cada cadena pesada comprende las mutaciones de un anticuerpo seleccionado entre 2, 3, 6, 7, 8, 15, 16, 28, 28P, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 44, 44P, 45, 46, 47 y 48, como se muestra en la Tabla 1. Por consiguiente, la presente invencion proporciona un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1, una region bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 y cada cadena pesada comprende una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283 , SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 305 y SEQ ID NO: 306.

Un anticuerpo particularmente preferido de la presente invencion comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1 y una region bisagra, en donde la cadena pesada comprende el SEQ ID NO: 267 (anticuerpo 28P), SEQ ID NO: 268 (anticuerpo 44P) o SEQ ID NO: 266 (anticuerpo 48). Un anticuerpo particularmente preferido adicional de la presente invencion comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una una region variable, un dominio Ch1, una region bisagra, un dominio Ch2 y un dominio Ch3 en donde la cadena pesada comprende el SEQ ID NO: 305 (anticuerpo 28P), SEQ ID NO: 306 (anticuerpo 44P) o SEQ ID NO: 304 (anticuerpo 48). Los anticuerpos 28P, 44P y 48 son particularmente preferidos debido a que muestran una termoestabilidad significativamente mejor y adicionalmente muestran una reduccion de la formacion de hemimoleculas.

Se ha demostrado que los anticuerpos 2, 3 y 8 forman una cantidad significativa de las denominadas hemimoleculas (HL). Estos mutantes pueden formar moleculas de anticuerpo completas (H2L2) in vitro en condiciones no desnaturalizantes pero cualquier asociacion no covalente entre las cadenas pesadas y/o entre las cadenas pesada y ligera se elimina en condiciones de SDS-PAGE no reductoras. Si bien a menudo se ensena que es deseable reducir la formacion de hemimoleculas, los anticuerpos que tienen una mayor tendencia a formar hemimoleculas pueden ser ventajosos para ciertos usos. Los anticuerpos que forman hemimoleculas estables (HL) y poco o ningun anticuerpo completo (H2L2) debido a que la cadena pesada del anticuerpo es incapaz de formar una asociacion covalente o no covalente con otra cadena pesada son de especial interes. Los anticuerpos que forman hemimoleculas estables pueden ser ventajosos para la produccion de anticuerpos monovalentes. Los anticuerpos que forman hemimoleculas tambien pueden proporcionar un modo util de producir un anticuerpo biespedfico debido a la formacion de anticuerpos completos a partir de hemimoleculas que tienen diferentes especificidades, en donde el anticuerpo completo es biespedfico y monovalente para cada antfgeno. Las cadenas pesadas de semejante anticuerpo biespedfico deberian estar asociadas no covalentemente.

El anticuerpo 3 conserva la C239 en la region bisagra pero parece incapaz de formar enlaces disulfuro de cadenas pesadas interbisagra, presumiblemente debido a la formacion eficaz de un disulfuro entre la cistema de la cadena ligera C-terminal y la C29 de la bisagra. Una comparacion de los anticuerpos 2 y 3 muestra el grado de 'alcance'de la cistema C-terminal de la cadena ligera, ya que el disulfuro de la cadena ligera se une mas eficazmente a C239 que a C242 en la region bisagra. Ademas, el anticuerpo 3 muestra una mayor estabilidad en comparacion con el anticuerpo 2.

Si bien los anticuerpos mutados de acuerdo con la presente invencion se han descrito anteriormente con respecto al isotipo IgG4, el experto en la tecnica apreciara que las mutaciones realizadas en el anticuerpo IgG4 tambien se pueden aplicar a otros isotipos o clases de anticuerpos que tienen la misma disposicion de enlaces disulfuro que un anticuerpo IgG4 con el fin de proporcionar un anticuerpo mejorado. Los ejemplos espedficos de los anticuerpos que tienen la misma disposicion de enlaces disulfuro que un anticuerpo IgG4 son los anticuerpos IgG3, los anticuerpos IgM y los anticuerpos IgD. Como se muestra en la Figura 1b, IgG3 e IgM tienen una cistema en la posicion 127 en el dominio Ch1 e IgD tiene una cistema en la posicion 128 en el dominio Ch1 que es equivalente a la C127 del dominio Ch1 de IgG4 que forma un enlace disulfuro intercatenario con una cistema de la cadena ligera. Adicionalmente, tambien se puede observar en la Figura 1b que las regiones de la bisagra superior de IgG3 e IgD y la region C- terminal del dominio Ch1 y la region N-terminal del dominio Ch2 de IgM no contiene un residuo de cistema que sea equivalente a los residuos de la region bisagra superior de IgG1. Por consiguiente, la presente descripcion proporciona adicionalmente un anticuerpo IgG3, un anticuerpo IgD y un

anticuerpo IgM en donde la cistema del dominio Ch1 que forma un enlace disulfuro intercatenario con una cistema de la cadena ligera es sustituida por otro aminoacido y en donde uno o mas aminoacidos que estan en una posicion estructuralmente analoga a la region bisagra superior de IgG1 o IgG4 son sustituidos por cistema.

En este aspecto de la presente invencion, el anticuerpo es de la clase IgG4.

El termino 'anticuerpo' segun se utiliza en la presente memoria incluye anticuerpos intactos (completos) y fragmentos funcionalmente activos que comprenden dos cadenas pesadas que comprenden cada una un dominio Vh, un dominio Ch1 y una region bisagra. El anticuerpo de acuerdo con la presente invencion comprende preferiblemente al menos una cadena ligera. Por consiguiente, el termino "anticuerpo" en la presente invencion abarca anticuerpos bi-, tri- o tetra-valentes, un dfmero de fragmentos Fab' y F(ab')2 y moleculas de anticuerpos completos que comprenden dos emparejamientos de cadena ligera y cadena pesada.

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Como es bien sabido en la tecnica, una molecula de Fab' tipica comprende un par de cadenas pesada y ligera en el que la cadena pesada comprende una region variable Vh, un dominio constante Ch1 y una region bisagra y la cadena ligera comprende una region variable Vl y un dominio constante Cl.

En una realizacion se proporciona un dfmero de Fab' de acuerdo con la presente descripcion, por ejemplo puede haber dimerizacion en la bisagra.

En una realizacion la cadena pesada comprende un dominio Ch2 y un dominio Ch3 y opcionalmente un dominio Ch4. En una realizacion el anticuerpo comprende dos cadenas pesadas cada una de las cuales se define como anteriormente en el primer o segundo aspectos de la presente invencion. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion tambien comprenden preferiblemente dos cadenas ligeras, en donde las regiones constantes de las cadenas ligeras son preferiblemente identicas. En esta realizacion en donde el anticuerpo comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, preferiblemente ambas secuencias de la region constante de la cadena pesada son identicas como se ha definido anteriormente por el primer o segundo aspectos de la presente invencion, y ambas secuencias de la region constante de la cadena ligera son identicas.

En una realizacion preferida, el anticuerpo de la presente invencion es un anticuerpo completo que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en donde cada cadena pesada comprende un Ch1 de IgG4 en donde la cistema de la posicion 127, numerada de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat es sustituida por otro aminoacido, una region bisagra superior y media de IgG1, una region bisagra inferior de IgG4, un dominio Ch2 y un dominio CH3.

La region bisagra completa de un anticuerpo IgG4 consiste tipicamente en los residuos 226 a 251 (numeracion basada en el sistema de numeracion de Kabat. Sin embargo, la region bisagra puede ser acortada o alargada segun se requiera. Por ejemplo, en los anticuerpos de acuerdo con el primer aspecto de la presente invencion, el aminoacido de tipo salvaje es sustituido por un residuo de cistema de la posicion 227, 228, 229 o 230, la region bisagra puede terminar despues del nuevo residuo de cistema de la posicion 227, 228, 229 o 230. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion tambien pueden comprender uno o mas aminoacidos adicionales situados en posicion N-terminal y/o C-terminal de la region bisagra. Ademas otras caractensticas de la bisagra pueden ser controladas, tales como la distancia de las cistemas de la bisagra de la cistema intercatenaria de la cadena ligera, la distancia entre las cistemas de la bisagra y la composicion de otros aminoacidos de la bisagra que pueden afectar a las propiedades de la bisagra tales como la flexibilidad p. ej. se pueden incorporar glicinas a la bisagra para incrementar la flexibilidad rotacional o se pueden incorporar prolinas para reducir la flexibilidad. Alternativamente se pueden incorporar combinaciones de residuos cargados o hidrofobos a la bisagra para conferir propiedades de multimerizacion o purificacion. Otras regiones bisagra modificadas pueden ser completamente sinteticas y se pueden disenar para que posean propiedades deseadas tales como longitud, composicion y flexibilidad.

Los dominios de la region constante, en particular en el dominio Fc, cuando esta presente, empleados en la presente invencion, son preferiblemente de isotipo IgG4 cuando no se requieren funciones efectoras del anticuerpo. Por consiguiente, cada cadena pesada comprende preferiblemente un dominio Ch2 y un dominio Ch3 de IgG4, como se muestra en el SEQ ID NO: 64.

Se apreciara que tambien se pueden utilizar las variantes de secuencia de los dominios de la region constante Fc.

En una realizacion cada cadena pesada comprende los dominios Ch2 y Ch3 de IgG4 en donde la arginina de la posicion 409 (numeracion EU) es sustituida por lisina, treonina, metionina o leucina con el fin de inhibir la formacion de agregados a pH bajo (documento US 2008/0063635 Takahashi et al.) Asimismo se ilustran mutaciones en L235, D265, D270, K322, P331 y P329 (numeradas de acuerdo con el sistema de numeracion EU) con el fin de atenuar la actividad CDC (documento US 2008/0063635 Takahashi et al.).

Cada cadena pesada puede comprender las mutaciones ilustradas en el documento WO2008/145142 Van de Winkel et al. que describen anticuerpos IgG4 estables que tienen una capacidad reducida para experimentar intercambio del brazo Fab por sustitucion del residuo de arginina de la posicion 409, el residuo de Phe de la posicion 405 o la Lys de la posicion 370 (numerados de acuerdo con el sistema de numeracion EU).

En una realizacion cada cadena pesada comprende un dominio Ch2 de IgG4 y un dominio Ch3 de IgG1, como se muestra en el SEQ ID NO: 280.

En una realizacion las mutaciones en la C127 del dominio Ch1 se puede realizar en posiciones equivalentes en otro isotipo IgG (1, 2, 3) o en otras clases de anticuerpos. Estos anticuerpos mutantes

pueden comprender una o mas mutaciones adicionales, por ejemplo en la region bisagra y/o el dominio Ch2 y/o el dominio Ch3. Los ejemplos de las mutaciones espedficas en la region bisagra y en los dominios Ch2 y Ch3 se han descrito anteriormente con respecto a otros aspectos de la presente invencion.

Los ejemplos espedficos de los anticuerpos mutantes anteriores son los anticuerpos IgG4 mutantes 4, 5, 5P, 9, 10, 11 y 14 enumerados en la Tabla 1.

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Por consiguiente la presente descripcion proporciona un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas,

en donde cada cadena pesada comprende un dominio Ch1 y una region bisagra y cada cadena pesada comprende las mutaciones de un anticuerpo seleccionado entre 4, 5, 5P, 9, 10, 11 y 14, como se muestra en la Tabla 1. Por consiguiente, la presente invencion proporciona un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas, en donde cada cadena pesada comprende un dominio Ch1 y una region bisagra y cada cadena pesada comprende una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 275 y SEQ ID NO: 276.

En una realizacion adicional, la presente descripcion proporciona un anticuerpo que comprende dos

cadenas pesadas, en donde cada cadena pesada comprende un dominio Ch1, una region bisagra, un dominio Ch2 y un dominio Ch3 y cada cadena pesada comprende las mutaciones de un anticuerpo seleccionado entre 4, 5, 5P, 9, 10, 11 y 14, como se muestra en la Tabla 1. Por consiguiente, la presente invencion proporciona un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas, en donde cada cadena pesada comprende un dominio Ch1, una region bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 y cada cadena pesada comprende una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 313 y SEQ ID NO: 316.

Se ha demostrado que los anticuerpos 4 (C127S, C239S y C242S) y 14 (C239S y C242S) forman una cantidad significativa de las denominadas hemimoleculas (HL). Estos mutantes pueden formar moleculas de anticuerpo completas (H2L2) in vitro en condiciones no desnaturalizantes pero cualquier asociacion no covalente entre las cadenas pesadas y/o entre cadenas pesadas y ligeras se elimina en condiciones de SDS-PAGE no reductoras. Si bien a menudo se ilustra que es deseable reducir la formacion de hemimoleculas, los anticuerpos que tienen una mayor tendencia a formar hemimoleculas pueden ser ventajosas para ciertos usos, por ejemplo la formacion in vitro de hemimoleculas puede facilitar el intercambio de cadena pesada y facilitar la preparacion de anticuerpos IgG4 biespedficos de acuerdo con la presente descripcion.

Tambien se ha demostrado que los anticuerpos 2, 3 y 8, descritos anteriormente, forman cantidades significativas de hemimoleculas y, por lo tanto, se pueden utilizar en situaciones en las que es deseable la formacion de una hemimolecula.

El anticuerpo 3 conserva la C239 en la region bisagra pero parece incapaz de formar enlaces disulfuro de cadena pesada interbisagra, presumiblemente debido a la formacion eficaz de un disulfuro entre la cistema de la cadena ligera C-terminal y la C239 de la bisagra. Una comparacion de los anticuerpos 2 y 3 muestra el grado de 'alcance' de la cistema C-terminal de la cadena ligera, ya que el disulfuro de la cadena ligera se une mas eficazmente a C239 que a C242 en la region bisagra. Ademas, el anticuerpo 3 muestra una mayor estabilidad en comparacion con el anticuerpo 2.

Los anticuerpos 5 (G230C), 5P (G230C y S241P), 9 (G230C y C239S), 10 (G230C y C242S) y 11 (G230C, C239S y C242S) comprenden dos cistemas (una cistema en la posicion 127 en CH1 y en 230 en la bisagra superior) con las cuales la cistema de la cadena ligera puede formar un enlace disulfuro. Por consiguiente, estos anticuerpos pueden comprender una cistema no unida a disulfuro en Ch1 o la region bisagra de la cadena pesada que se puede utilizar ventajosamente para el anclaje de una molecula efectora a la cistema no unida a disulfuro. Otro anticuerpo 5 comprende dos cistemas en la bisagra en C239 y C242 y, por lo tanto, sera resistente a una etapa de reduccion suave requerida para activar el tiol libre de la cistema no unida a disulfuro para insertar una molecula efectora. Otro anticuerpo 11, comprende cistemas que no estan en la bisagra en 239 y 242, y por lo tanto esto reduce la oportunidad de que cualquier molecula efectora se ancle a estas posiciones en la bisagra.

El termino 'anticuerpo' segun se utiliza en la presente memoria incluye anticuerpos intactos (completos) y fragmentos funcionalmente activos que comprenden dos cadenas pesadas que comprenden cada una un dominio Vh, un dominio Ch1 y una region bisagra. El anticuerpo de acuerdo con la presente invencion preferiblemente comprende al menos una cadena ligera. Por consiguiente, el termino "anticuerpo" en la presente invencion abarca anticuerpos bi, tri o tetra-valentes, fragmentos Fab' y F(ab')2, hemimoleculas de anticuerpo o hemimoleculas que comprenden un solo emparejamiento de cadena ligera y cadena pesada y moleculas de anticuerpo completas que comprenden dos emparejamientos de cadena ligera y cadena pesada.

Como es bien sabido en la tecnica, una molecula Fab' tfpica comprende un par de cadenas pesada y ligera en el que la cadena pesada comprende una region variable Vh, un dominio constante Ch1 y una region bisagra y la cadena ligera comprende una region variable Vl y un dominio constante Cl.

En una realizacion se proporciona un dfmero de Fab' de acuerdo con la presente descripcion, por ejemplo la dimerizacion puede ser en la bisagra.

En una realizacion la cadena pesada comprende un dominio Ch2 y un dominio Ch3 y opcionalmente un dominio Ch4. En una realizacion el anticuerpo comprende dos cadenas pesadas cada una de las cuales se define como antes en el primer o segundo aspectos de la presente invencion. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion tambien comprenden preferiblemente dos cadenas ligeras. En esta realizacion en donde el anticuerpo comprende dos cadenas pesadas, preferiblemente ambas secuencias de las cadenas pesadas son identicas como se ha

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definido anteriormente mediante el primer o segundo aspectos de la presente invencion. En una realizacion preferida el anticuerpo de la presente invencion es un anticuerpo completo que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en donde cada cadena pesada comprende un Ch1 de IgG4 en donde la cistema de la posicion 127, numerada de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat es sustituida por otro aminoacido, una region bisagra superior y media de IgG1, una region bisagra inferior de IgG4, un dominio Ch2 y un dominio Ch3.

La region bisagra completa de un anticuerpo IgG4 consiste tipicamente en los residuos 226 a 251 (numeracion basada en el sistema de numeracion de Kabat. Sin embargo, la region bisagra se puede acortar o alargar segun se requiera. Por ejemplo, en los anticuerpos de acuerdo con el primer aspecto de la presente invencion, el aminoacido de tipo salvaje es sustituido por un residuo de cistema de la posicion 227, 228, 229 o 230, la region bisagra puede terminar despues del nuevo residuo de cistema de la posicion 227, 228, 229 o 230. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion tambien pueden comprender uno o mas aminoacidos adicionales situados en posicion N- terminal y/o C-terminal de la region bisagra. Ademas se pueden controlar otras caractensticas de la bisagra, tales como la distancia de las cistemas de la bisagra de la cistema intercatenaria de la cadena ligera, la distancia entre las cistemas de la bisagra y la composicion de otros aminoacidos de la bisagra que pueden afectar a las propiedades de la bisagra tales como la flexibilidad, p. ej., se pueden incorporar glicinas a la bisagra para aumentar la flexibilidad rotacional o se pueden incorporar prolinas para reducir la flexibilidad. Alternativamente se pueden incorporar combinaciones de residuos cargados o hidrofobos a la bisagra para conferir propiedades de multimerizacion o purificacion. Otras regiones bisagra modificadas pueden ser completamente sinteticas y se pueden disenar para que posean propiedades deseadas tales como longitud, composicion y flexibilidad.

Los dominios de la region constante, en particular en el dominio Fc, cuando esta presente, empleados en la presente invencion, son preferiblemente de isotipo IgG4 cuando no se requieren funciones efectoras del anticuerpo. Por consiguiente cada cadena pesada comprende preferiblemente un dominio Ch2 y un dominio Ch3 de IgG4, como se muestra en el SEQ ID NO: 279.

En una realizacion, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo monoclonal completamente humano, humanizado o quimerico. En una realizacion el anticuerpo es completamente humano o humanizado.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, tal como la tecnica del hibridoma (Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256, 495-497), la tecnica del trioma, la tecnica del hibridoma de celulas B humanas (Kozbor et al., Immunology Today, 1983, 4, 72) y la tecnica del EBV-hibridoma (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", pags. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).

Los anticuerpos para su uso en la invencion tambien pueden ser generados utilizando metodos de anticuerpos de linfocitos mediante la clonacion y expresion de ADNc de la region variable de inmunoglobulina generados a partir de linfocitos individuales seleccionados para la produccion de anticuerpos espedficos, por ejemplo, mediante los metodos descritos por Babcook, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93(15), 7843-7848, el documento WO 92/02551, el documento WO2004/051268 y el documento WO2004/106377.

Los anticuerpos humanizados son moleculas de anticuerpos de especies no humanas que tienen una o mas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la especie no humana y una region marco de una inmunoglobulina humana que comprende opcionalmente uno o mas residuos donadores de la especie no humana (vease, por ejemplo, el documento US 5.585.089).

Los anticuerpos para su utilizacion en la presente invencion tambien pueden ser generados utilizando diversos metodos de presentacion en fagos conocidos en la tecnica e incluyen los descritos por Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 1995, 182, 41-50; Ames et al., J. Immunol. Methods, 1995, 184, 177-186; Kettleborough et al. Eur. J. Immunol., 1994, 24, 952-958; Persic et al., Gene, 1997 187, 9-18; y Burton et al., Advances in Immunology, 1994, 57, 191-280; documento WO 90/02809; documento WO 91/10737; documento WO 92/01047; documento WO 92/18619; documento WO 93/11236; documento WO 95/15982; y documento WO 95/20401; y documentos US 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908;5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743; y 5.969.108. Asimismo se pueden utilizar ratones transgenicos, u otros organismos, incluyendo otros mairnferos, para generar anticuerpos humanizados.

Los anticuerpos completamente humanos son aquellos anticuerpos en los que las regiones variables y las regiones constantes (cuando estan presentes) de las cadenas pesadas y ligeras son en su totalidad de origen humano, o sustancialmente identicas a secuencias de origen humano, no necesariamente del mismo anticuerpo. Los ejemplos de los anticuerpos completamente humanos pueden incluir anticuerpos producidos por ejemplo mediante los metodos de presentacion en fagos descritos anteriormente y anticuerpos producidos por ratones en los que los genes de las regiones variables y/o constantes de la inmunoglobulina murina han sido remplazados por sus contrapartes humanas p. ej. como se describe en terminos generales en los documentos EP0546073 B1,US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.661.016, US 5.770.429, EP 0438474 B1 y EP0463151 B1. El anticuerpo material de partida para su uso en la presente invencion se puede preparar mediante el uso de tecnicas de ADN recombinante que implican la manipulacion y la re-expresion de aDn que codifica las regiones variables y constantes del anticuerpo. Se pueden utilizar las tecnicas convencionales de la biologfa molecular para modificar, anadir o suprimir aminoacidos o dominios segun se desee. Cualquier alteracion de las regiones variables

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o constantes todavfa estara incluida en los terminos region 'variable' y 'constante' segun se utilizan en la presente memoria.

El anticuerpo material de partida puede ser obtenido a partir de cualquier especie incluyendo por ejemplo raton, rata, conejo, hamster, camello, llama, cabra o ser humano. Se pueden obtener partes del anticuerpo de mas de una especie, por ejemplo el anticuerpo puede ser quimerico. En un ejemplo, las regiones constantes son de una especie y las regiones variables de otra. El anticuerpo material de partida puede ser modificado. En otro ejemplo, la region variable del anticuerpo ha sido creada utilizando tecnicas de modificacion de ADN recombinante. Tales versiones modificadas incluyen aquellas creadas por ejemplo a partir de regiones variables de anticuerpos naturales por medio de inserciones, deleciones o cambios en o para las secuencias de aminoacidos de los anticuerpos naturales. Los ejemplos concretos de este tipo incluyen aquellos dominios de la region variable modificados geneticamente que contienen al menos una CDR y, opcionalmente, uno o mas aminoacidos del marco de un anticuerpo y el resto del dominio de la region variable de un segundo anticuerpo. Los metodos para crear y elaborar estos anticuerpos son bien conocidos en la tecnica (veanse por ejemplo, Boss et al., documento US 4.816.397; Cabilly et al., documento US 6.331.415; Shrader et al., documento WO 92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341, 544; Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323; Bird et al., 1988, Science, 242, 423; Queen et al., documento US 5.585.089; Adair, documento WO91/09967; Mountain y Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10, 1-142; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181).

En una realizacion el anticuerpo comprende un par de dominios variables que forman un dominio de union que es un par cognado. Se pretende que par cognado segun se emplea en la presente memoria haga referencia a un par natural de dominios variables, es decir, aislado de un unico anticuerpo o una celula que expresa un anticuerpo.

Los dominios variables pueden haber sido optimizados y/o humanizados.

Los dominios variables optimizados/humanizados derivados de un par cognado todavfa seran considerados un par cognado despues de la optimizacion/humanizacion.

De este modo la invencion se amplfa a moleculas humanas, humanizadas o quimericas.

En una realizacion la molecula se une espedficamente a un antfgeno diana. Se pretende que se une espedficamente segun se emplea en la presente memoria haga referencia a moleculas que tienen una elevada afinidad por un antfgeno diana (para el cual son espedficas) y que se unen a antfgenos para los cuales no son espedficas con una afinidad baja o mucho menor (o no se unen en absoluto). Los metodos para medir la afinidad son conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen analisis tales como BIAcore™.

Las moleculas de anticuerpo de la presente invencion tienen adecuadamente una elevada afinidad de union, en particular, nanomolar o picomolar. La afinidad se puede medir utilizando cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica, incluyendo BIAcore™. En una realizacion la molecula de la presente invencion tiene una afinidad de union de aproximadamente 100 pM o mejor. En una realizacion la molecula de la presente invencion tiene una afinidad de union de aproximadamente 50pM o mejor. En una realizacion la molecula de la presente invencion tiene una afinidad de union de aproximadamente 40pM o mejor. En una realizacion la molecula de la presente invencion tiene una afinidad de union de aproximadamente 30 pM o mejor. En una realizacion la molecula de la presente invencion es completamente humana o humanizada y tiene una afinidad de union de aproximadamente 100 pM o mejor.

Se pretende que un derivado de un dominio de origen natural empleado en la presente memoria haga referencia al caso en el que uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoacidos en una secuencia de origen natural han sido remplazados o suprimidos, por ejemplo para optimizar las propiedades del dominio, por ejemplo eliminando propiedades no deseables pero en donde los rasgos caractensticos del dominio se conservan. En una realizacion las moleculas de anticuerpo de la presente invencion comprenden uno o mas peptidos de union a albumina. In vivo el peptido se une a albumina, lo que incrementa la vida media de la molecula.

El peptido de union a albumina puede ser anexado desde una o mas regiones variables, una bisagra o extremo C de la molecula o cualquier localizacion que no interfiera en las propiedades de union del antfgeno a las moleculas.

Los ejemplos de los peptidos de union a albumina se proporcionan en el documento WO 2007/106120.

Un experto en la tecnica tambien entendera que el anticuerpo puede experimentar una variedad de modificaciones post-traduccionales. El tipo y el grado de estas modificaciones a menudo dependen de la lmea celular anfitriona utilizada para expresar la molecula asf como de las condiciones de cultivo. Tales modificaciones pueden incluir variaciones en la glicosilacion, la oxidacion de metionina, la formacion de diceto piperazina, la isomerizacion de aspartato y la desamidacion de asparragina. Una modificacion frecuente es la perdida de un residuo alcalino carboxi- terminal (tal como lisina o arginina) debido a la accion de carboxipeptidasas (como describe Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995).

Si se desea se puede conjugar una molecula para su uso en la presente invencion con una o mas moleculas efectoras. Se apreciara que la molecula efectora puede comprender una unica molecula efectora o dos o mas de tales moleculas conectadas de manera que formen un unico radical que pueda ser anclado a la molecula de

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anticuerpo de la presente invencion. Cuando se desea obtener un anticuerpo de acuerdo con la invencion conectado a una molecula efectora, este puede ser preparado mediante procedimientos qmmicos o de ADN recombinante convencionales en los que el anticuerpo esta conectado directamente o a traves de un agente de acoplamiento a la molecula efectora. Las tecnicas para conjugar tales moleculas efectoras a un anticuerpo son bien conocidas en la tecnica (veanse, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2a Ed., Robinson et al., eds., 1987, pags. 623-53; Thorpe et al., l982, Immunol. Rev., 62:119-58 y Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Los procedimientos qmmicos concretos incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en los documentos WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 y WO03031581. Alternativamente, cuando la molecula efectora es una protema o un polipeptido la conexion se puede lograr utilizando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo como se describe en los documentos WO 86/01533 yEP0392745.

El termino molecula efectora segun se utiliza en la presente memoria incluye, por ejemplo, agentes antineoplasicos, farmacos, toxinas, protemas biologicamente activas, por ejemplo enzimas, otro anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, polfmeros de origen sintetico o natural, acidos nucleicos y fragmentos de los mismos p. ej. ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionuclidos, particularmente radioyoduro, radioisotopos, metales quelados, nanopartmulas y grupos informadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos que pueden ser detectados mediante espectroscopfa NMR o ESR.

Los ejemplos de las moleculas efectoras pueden incluir citotoxinas o agentes citotoxicos que incluyen cualquier agente que sea perjudicial (p. ej. destruye) para las celulas. Los ejemplos incluyen combrestatinas, dolastatinas, epotilones, estaurosporina, maitansinoides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, teniposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi-antracino-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- deshidrotestosterona, glucocorticoides, procama, tetracama, lidocama, propranolol, y puromicina y analogos u homologos de los mismos.

Las moleculas efectoras tambien incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (p. ej. metotrexato, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil- descarbazina), agentes alquilantes (p. ej. mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamino-platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (p. ej. daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibioticos (p. ej. dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicinas o duocarmicinas), y agentes anti-mitoticos (p. ej. vincristina y vinblastina).

Otras moleculas efectoras pueden incluir radionuclidos quelados tales como In e Y, Lu , Bismuto ,

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Californio , Iridio y Tungsteno /Rhenio ; o farmacos tales como, pero no limitados a, alquilfosfocolinas, inhibidores de topoisomerasa I, taxoides y suramina.

Otras moleculas efectoras incluyen protemas, peptidos y enzimas. Las enzimas de interes incluyen, pero no se limitan a, enzimas proteoltticas, hidrolasas, liasas, isomerasas, transferasas. Las protemas, polipeptidos y peptidos de interes incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulinas, toxinas tales como abrina, ricina A, exotosina de pseudomonas, o toxina de difteria, una protema tal como insulina, factor de necrosis tumoral, interferon a, interferon p, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador de plasminogeno tisular, un agente trombotico o un agente anti-angiogenico, p. ej. angiostatina o endostatina, o, un modificador de la respuesta biologica tal como una linfoquina, interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-2 (IL-2), factor estimulador de colonias de granulocitos macrofagos (GM-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otro factor de crecimiento e inmunoglobulinas.

Otras moleculas efectoras pueden incluir sustancias detectables utiles por ejemplo en el diagnostico. Los ejemplos de las sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, nuclidos radiactivos, metales emisores de positrones (para su uso en la tomograffa de emision de positrones), e iones metalicos paramagneticos no radiactivos. Vease en general la Patente de los Estados Unidos Num. 4.741.900 para los iones metalicos que pueden ser conjugados con anticuerpos para su uso como diagnostico. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, beta- galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los grupos prosteticos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluorescema, isotiocianato de fluorescema, rodamina, diclorotriazinilamin-fluorescema, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina; y los nuclidos

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radiactivos adecuados incluyen I, I, In y Tc.

En otro ejemplo, la molecula efectora puede incrementar la vida media del anticuerpo in vivo, y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o potenciar el suministro de un anticuerpo a traves de la barrera epitelial al sistema inmunitario. Los ejemplos de las moleculas efectoras de este tipo adecuadas incluyen polfmeros, albumina, protemas de union a albumina o compuestos de union a albumina tales como los descritos en el documento WO 05/117984.

Cuando la molecula efectora es un polfmero, este puede ser, en general, un polfmero sintetico o de origen natural, por ejemplo un polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente

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sustituida o un polisacarido ramificado o no ramificado , p. ej. un homo- o hetero-polisacarido.

Los sustituyentes opcionales espedficos que pueden estar presentes en los polfmeros sinteticos anteriormente mencionados incluyen uno o mas grupos hidroxi, metilo o metoxi.

Los ejemplos espedficos de los polfmeros sinteticos incluyen poli(etilenglicol), poli(propilenglicoll) poli(alcohol vimlico) de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituida o derivados de los mismos, especialmente poli(etilenglicol) opcionalmente sustituido tal como metoxipoli(etilenglicol) o derivados de los mismos.

Los polfmeros de origen natural espedficos incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glicogeno o derivados de los mismos.

Se pretende que "derivados" segun se utiliza en la presente memoria incluya derivados reactivos, por ejemplo grupos selectivos reactivos con tiol tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo puede estar conectado directamente o a traves de un segmento conector al polfmero. Se apreciara que el residuo de semejante grupo formara parte, en algunos casos, del producto como grupo conector entre el anticuerpo de la descripcion y el polfmero.

El tamano del polfmero se puede variar segun se desee, pero generalmente estara en un intervalo de peso molecular promedio entre 500 Da y 50000 Da, por ejemplo de 5000 a 40000 Da tal como de 20000 a 40000 Da. El tamano del polfmero se puede seleccionar en particular basandose en el uso pretendido del producto, por ejemplo la capacidad para localizar ciertos tejidos tales como tumores o ampliar la vida media en la circulacion (para una revision vease Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). De este modo, por ejemplo, cuando se pretende que el producto deje la circulacion y penetre en el tejido, por ejemplo para su uso en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso utilizar un polfmero de bajo peso molecular, por ejemplo con un peso molecular de alrededor de 5000 Da. Para aplicaciones en las que el producto permanece en la circulacion, puede ser ventajoso utilizar un polfmero de mayor peso molecular, por ejemplo con un peso molecular en el intervalo de 20000 Da a 40000 Da.

Los polfmeros adecuados incluyen un polfmero de polialquileno, tal como un poli(etilenglicol) o, especialmente, un metoxipoli(etilenglicol) o un derivado del mismo, y especialmente con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 15000 Da a aproximadamente 40000 Da.

En un ejemplo, se ancla un anticuerpo para su uso en la presente invencion a radicales de poli(etilenglicol) (PEG). En un ejemplo concreto, las moleculas de PEG se pueden anclar a traves de cualquier cadena lateral de aminoacido disponible o grupo funcional de aminoacido terminal localizado en el anticuerpo, por ejemplo cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Tales aminoacidos pueden existir de forma natural en el anticuerpo o pueden ser modificados geneticamente en el anticuerpo utilizando metodos de ADN recombinante (vease por ejemplo el documento US 5.219.996; el documento US 5.667.425; el documento WO 98/25971). En un ejemplo, la molecula de la presente invencion es un anticuerpo modificado en donde la modificacion es la adicion al extremo C-terminal de su cadena pesada de uno o mas aminoacidos para permitir el anclaje de una molecula efectora. Se pueden utilizar multiples sitios para anclar dos o mas moleculas de PEG.

En una realizacion, se conecta una molecula de PEG a una cistema 171 de la cadena ligera, por ejemplo vease el documento WO2008/038024 incorporado a la presente memoria como referencia.

Adecuadamente las moleculas de PEG se conectan covalentemente a traves de un grupo tiol de al menos un residuo de cistema localizado en el anticuerpo. Cada molecula de polfmero anclada al anticuerpo modificado puede conectarse covalentemente al atomo de azufre de un residuo de cistema localizado en el anticuerpo. La conexion covalente sera generalmente un enlace disulfuro o, en particular, un enlace azufre-carbono. Cuando se utiliza un grupo tiol como punto de anclaje, se pueden utilizar moleculas efectoras apropiadamente activadas, por ejemplo derivados selectivos de tiol tales como maleimidas y derivados de cistema. Se puede utilizar un polfmero activado como material de partida en la preparacion de un anticuerpo modificado con polfmero como se ha descrito anteriormente. El polfmero activado puede ser cualquier polfmero que contenga un grupo reactivo con tiol tal como un acido o ester a-halocarboxflico, p. ej. yodoacetamida, una imida, p. ej. maleimida, una vinilsulfona o un disulfuro. Tales materiales de partida se pueden obtener comercialmente (por ejemplo de Nektar, antes Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) o se pueden preparar a partir de materiales de partida disponibles en el mercado utilizando procedimientos qmmicos convencionales. Las moleculas de PEG concretas incluyen 20K metoxi-PEG-amina (obtenible de Nektar, antes Shearwater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (obtenible de Nektar, antes Shearwater).

La presente invencion tambien proporciona ADN aislado que codifica una molecula de anticuerpo descrita en la presente memoria.

En un aspecto adicional se proporciona un vector que comprende dicho ADN.

Los metodos generales por medio de los cuales se pueden construir los vectores, los metodos de transfeccion y los metodos de cultivo son bien conocidos por los expertos en la tecnica. En este sentido, se hace referencia a "Current

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Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nueva York y el Manual de Maniatis producido por Cold Spring Harbor Publishing.

En un aspecto adicional, se proporciona una celula anfitriona que comprende dicho vector y/o ADN.

Se puede utilizar cualquier sistema de celula anfitriona/vector adecuado para la expresion de las secuencias de ADN que codifican la molecula de la presente invencion. Se pueden utilizar sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli, y otros sistemas microbianos o tambien se pueden utilizar sistemas de expresion de celulas anfitrionas eucarioticos, por ejemplo de mairnfero. Las celulas anfitrionas de mairnfero adecuadas incluyen celulas CHO, de mieloma o de hibridoma.

La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para la produccion de una molecula de anticuerpo como se describe en la presente memoria que comprende cultivar una celula anfitriona que contiene un vector (y/o ADN) de la presente invencion en condiciones adecuadas para conducir a la expresion de la protema a partir del ADN que codifica una molecula de anticuerpo de la presente invencion, y aislar una molecula de anticuerpo.

Para la produccion de productos que comprenden cadenas tanto pesadas como ligeras, se puede transfectar la lmea celular con dos vectores, un primer vector que codifica un polipeptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipeptido de cadena pesada. Alternativamente, se puede utilizar un unico vector, incluyendo el vector secuencias que codifica los polipeptidos de cadena ligera y cadena pesada.

Las moleculas de anticuerpo de acuerdo con la presente descripcion se expresan en niveles adecuados a partir de las celulas anfitrionas haciendolas propicias para el procesamiento comercial.

El anticuerpo puede ser espedfico para cualquier antigeno diana. El antigeno puede ser una protema asociada a la celula, por ejemplo una protema de la superficie celular sobre celulas tales como celulas bacterianas, celulas de levadura, celulas T, celulas endoteliales o celulas tumorales, o puede ser una protema soluble. Los antigenos de interes tambien pueden ser cualquier protema medicamente relevante tales como las protemas reguladas al alza durante una enfermedad o infeccion, por ejemplo receptores y/o sus correspondientes ligandos. Los ejemplos concretos de las protemas de la superficie celular incluyen moleculas de adherencia, por ejemplo integrinas tales como integrinas p1 p. ej. VLA-4, E-selectina, P selectina o L-selectina, CD2, CD3, CD4, CD5, Cd7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 o Receptor de CSF1, DPCR1, DPCR1, dudulina 2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, nectina tipo 2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, antfgeno carcinoembrionario (CEA), globulina de grasa de leche humana (HMFG1 y 2), antfgenos de MHC de Clase I y MHC de Clase II, KDR y VeGf, PD-1, DC- SIGN, TL1A, DR3, receptor A de iL-7 y cuando sea apropiado, receptores de las mismas.

Los antfgenos solubles incluyen interleuquinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL- 16 o IL-17, tales como IL17A y/o IL17F, antfgenos virales, por ejemplo antfgenos de virus respiratorio sincitial o de citomegalovirus, inmunoglobulinas, tales como IgE, interferones tales como interferon a, interferon p o interferon y, factor de necrosis tumoral TNF (conocido antes como factor de necrosis tumoral a y referido en la presente memoria como TNF o TNFa), factor de necrosis tumoral p, factores estimuladores de colonias tales como G-CSF o GM-CSF, y factores de crecimiento derivados de plaquetas tales como PDGF-a, y PDGF-p, WISP-1 y cuando sea apropiado receptores de los mismos. Otros antfgenos incluyen antfgenos de superficie celular bacteriana, toxinas bacterianas, virus tales como influenza, EBV, HepA, B y C, agentes de terrorismo biologico, radionuclidos y metales pesados, y venenos y toxinas de serpientes y aranas.

En una realizacion se proporciona un metodo para generar un anticuerpo biespedfico simetrico que comprende la etapa de mezclar un primer anticuerpo IgG4 con un segundo anticuerpo IgG4 ex vivo, en condiciones propicias para el intercambio de la cadena pesada, en donde la especificidad antigenica de las regiones variables en el primer anticuerpo es diferente de la especificidad antigenica de las regiones variables en el segundo anticuerpo.

Las condiciones in vitro propicias para el intercambio de la cadena pesada incluyen condiciones reductoras. Los agentes reductores adecuados incluyen GSH, 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina, TBP, TCEP, cistema-HCl y DTT.

Las concentraciones adecuadas de los agentes reductores se encuentran en el intervalo de 0,01 a 10 mM por ejemplo de 0,5 a 5 mM. Ademas, la reduccion se puede lograr utilizando tampones redox, es decir diferentes razones relativas de variantes oxidadas y reducidas de los reactivos tales como por ejemplo: GSH:GSSG y Cys:diCys

Las condiciones adecuadas incluyen razones de anticuerpos que estan entre 0,5:5 a 5:05, tal como 1:1 o 1:2.

La temperatura adecuada incluye de 15 a 40°C, tal como 37°C.

Las condiciones reductoras se pueden seleccionar para que esten entre las estabilidades reductoras de los homodfmeros y los heterodfmeros.

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En una realizacion alternativa los anticuerpos de la descripcion se preparan empleando un cultivo mixto de celulas, por ejemplo se produce un intercambio ~50%. Esto puede producir un rendimiento en el intervalo de 1-2 g/l del biespedfico deseado.

En una realizacion se proporciona un anticuerpo o fragmento obtenido u obtenible a partir de un procedimiento o metodo descritos en la presente memoria.

En una realizacion, se puede utilizar el anticuerpo para alterar funcionalmente la actividad del antigeno de interes. Por ejemplo, el anticuerpo puede neutralizar, suscitar antagonismo, o suscitar agonismo de la actividad de dicho antigeno directamente o indirectamente.

Las moleculas de anticuerpo de la presente invencion son utiles en el tratamiento y/o la profilaxis de una afeccion patologica.

De este modo se proporciona un anticuerpo de acuerdo con la presente invencion para su uso en el tratamiento, mediante la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz del mismo, por ejemplo en una formulacion farmaceutica. En una realizacion el anticuerpo de acuerdo con la invencion se administra topicamente a los pulmones, por ejemplo mediante inhalacion.

Los anticuerpos proporcionados por la presente invencion son utiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos incluyendo enfermedades y trastornos inflamatorios, enfermedades y trastornos inmunitarios, trastornos fibroticos y canceres.

El termino "enfermedad o trastorno inflamatorio" y "enfermedad o trastorno inmunitario" incluye artritis reumatoide, artritis psoriasica, enfermedad de Still, enfermedad de Muckle Wells, psoriasis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, LEG (Lupus Eritematoso Generalizado), asma, rinitis alergica, dermatitis atopica, esclerosis multiple, vasculitis, diabetes mellitus Tipo I, transplantes y enfermedad injerto versus anfitrion.

El termino "trastorno fibrotico" incluye fibrosis pulmonar idiopatica (FPI), esclerosis sistemica (o escleroderma), fibrosis renal, nefropatfa diabetica, nefropatia por IgA, hipertension, enfermedad renal en fase terminal, fibrosis peritoneal (dialisis peritoneal ambulatoria continua), cirrosis hepatica, degeneracion macula asociada con la edad (DMAE), retinopatfa, fibrosis reactiva cardfaca, cicatrizacion, queloides, quemaduras, ulceras de la piel, angioplastia, cirugfa de bypass coronario, artroplastia y cirugfa de cataratas.

El termino "cancer" incluye un nuevo crecimiento maligno que resulta del epitelio, se encuentra en la piel, o mas comunmente, en el revestimiento de los organos corporales, por ejemplo: mama, ovario, prostata, pulmon, rinon, pancreas, estomago, vejiga o intestino. Los canceres tienden a infiltrarse en el tejido adyacente y a propagarse (metastatizar) a organos distantes, por ejemplo: a hueso, tugado, pulmon o el cerebro. La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica o de diagnostico que comprende un anticuerpo de la presente invencion combinado con uno o mas de un excipiente, diluyente o portador farmaceuticamente aceptable. Por consiguiente, se proporciona el uso de un anticuerpo de la invencion para la fabricacion de un medicamento. La composicion se suministrara normalmente como parte de una composicion farmaceutica, esteril que incluira normalmente un portador farmaceuticamente aceptable. Una composicion farmaceutica de la presente invencion puede comprender adicionalmente un coadyuvante farmaceuticamente aceptable.

La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para la preparacion de una composicion farmaceutica o de diagnostico que comprende anadir y mezclar el anticuerpo de la presente invencion junto con uno o mas de un excipiente, diluyente o portador farmaceuticamente aceptable.

El anticuerpo de la descripcion puede ser el unico ingrediente activo de la composicion farmaceutica o de diagnostico o puede estar acompanado de otros ingredientes activos incluyendo otros ingredientes de anticuerpos, por ejemplo anticuerpos anti-TNF, anti-IL-1 p, anti-celulas T, anti-IFNY o anti-LPS, o ingredientes que no son anticuerpos tales como xantinas. Otros ingredientes activos adecuados incluyen anticuerpos que son capaces de inducir tolerancia, por ejemplo, anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4.

En una realizacion adicional el anticuerpo o composicion de acuerdo con la descripcion se emplean combinados con un agente farmaceuticamente activo adicional, por ejemplo un corticosteroide (tal como propionato de fluticasona) y/o un agonista beta-2 (tal como salbutamol, salmeterol o formoterol) o inhibidores del crecimiento y la proliferacion celulares (tales como rapamicina, ciclofosfamida, metotrexato) o un inhibidor de CD28 y/o CD40 alternativo. En una realizacion el inhibidor es una molecula pequena. En otra realizacion el inhibidor es un anticuerpo espedfico para la diana.

Las composiciones farmaceuticas comprenden adecuadamente una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo de la invencion. El termino "cantidad terapeuticamente eficaz" segun se utiliza en la presente memoria hace referencia a una cantidad de un agente terapeutico necesaria para tratar, aliviar o prevenir una enfermedad o afeccion elegidas como diana, o para mostrar un efecto terapeutico o preventivo detectable. La cantidad terapeuticamente eficaz puede ser estimada inicialmente en analisis de cultivo de celulas o en modelos animales, normalmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal tambien se puede utilizar para

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determinar el intervalo de concentracion y la ruta de administracion apropiados. Semejante informacion se puede utilizar a continuacion para determinar las dosis y rutas utiles para la administracion en seres humanos.

La cantidad terapeuticamente eficaz exacta para un sujeto humano dependera de la gravedad del estado de enfermedad, de la salud general del sujeto, de la edad, el peso y el genero del sujeto, de la dieta, el tiempo y la frecuencia de administracion, de la combinacion de farmacos, de las sensibilidades de reaccion y de la tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede ser determinada mediante experimentacion rutinaria y esta dentro del criterio del profesional clmico. Generalmente, una cantidad terapeuticamente eficaz estara entre 0,01 mg/kg y 50 mg/kg, por ejemplo entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg. Las composiciones farmaceuticas se pueden presentar convenientemente en formas de dosificacion unitarias que contienen una cantidad previamente determinada de un agente activo de la invencion por dosis.

Las composiciones se pueden administrar individualmente a un paciente combinadas (p. ej. simultaneamente, secuencialmente o por separado) con otros agentes, farmacos u hormonas.

La dosis a la cual se administra un anticuerpo de la presente invencion depende de la naturaleza de la afeccion a tratar, por ejemplo el grado de la enfermedad/inflamacion presente y de que la molecula se este utilizando profilacticamente o para tratar una afeccion existente. La frecuencia de las dosis dependera de la vida media del anticuerpo y de la duracion de su efecto. Si el anticuerpo tiene una vida media corta (p. ej. de 2 a 10 horas) puede ser necesario administrar una o mas dosis al dfa. Alternativamente, si el anticuerpo tiene una vida media larga (p. ej. de 2 a 15 dfas) puede ser necesario administrar solamente una dosificacion una vez al dfa, una vez a la semana, o incluso una vez cada 1 o 2 meses. El portador farmaceuticamente aceptable no debe inducir por sf mismo la produccion de anticuerpos nocivos para el individuo que recibe la composicion y no debe ser toxico. Los portadores adecuados pueden ser macromoleculas grandes, metabolizadas lentamente tales como protemas, polipeptidos, liposomas, polisacaridos, poli(acidos lacticos), poli(acidos glicolicos), aminoacidos polimericos, copolfmeros de aminoacidos y partfculas de virus inactivas.

Se pueden utilizar sales farmaceuticamente aceptables, por ejemplo sales de acidos minerales, tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos y sulfatos, o sales de acidos organicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.

Los portadores farmaceuticamente aceptables de las composiciones terapeuticas pueden contener adicionalmente lfquidos tales como agua, solucion salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, pueden estar presentes en tales composiciones sustancias coadyuvantes, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tamponadoras del pH. Tales portadores permiten que las composiciones farmaceuticas sean formuladas en forma de comprimidos, pfldoras, grageas, capsulas, lfquidos, geles, jarabes, suspensiones de partfculas solidas y suspensiones, para la ingestion por parte del paciente.

Las formas de administracion adecuadas incluyen formas adecuadas para la administracion parenteral, p. ej. mediante inyeccion o infusion, por ejemplo mediante inyeccion en embolada o infusion continua. Cuando el producto es para inyeccion o infusion, puede adoptar la forma de una suspension, solucion o emulsion en un vetuculo oleoso o acuoso y puede contener agentes de formulacion, tales como agentes de suspension, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la molecula de la descripcion puede estas en forma seca, para su reconstitucion antes del uso con un lfquido esteril apropiado.

Una vez formuladas, las composiciones de la invencion se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos que se van a tratar pueden ser animales. Sin embargo, en una o mas realizaciones, las composiciones se adaptan para la administracion a sujetos humanos.

De manera adecuada, en las formulaciones de acuerdo con la presente descripcion, el pH de la formulacion final no es similar al valor del punto isoelectrico del anticuerpo, por ejemplo si el pH de la formulacion es 7, puede ser apropiado un pi de 8-9 o superior. Si bien no se desea estar limitado por la teona, se piensa que esto puede proporcionar por ultimo una formulacion final con una estabilidad mejorada, por ejemplo el anticuerpo permanece en solucion.

Las composiciones farmaceuticas de esta invencion se pueden administrar mediante cualquiera de las numerosas rutas que incluyen, pero no se limitan a, las rutas oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdermica, transcutanea (por ejemplo, vease el documento WO98/20734), subcutanea, intraperitoneal, intranasal, enterica, topical, sublingual, intravaginal o rectal. Tambien se pueden utilizar inyectores a chorro para administrar las composiciones farmaceuticas de la invencion. Tfpicamente, las composiciones terapeuticas pueden ser preparadas en forma de inyectables, ya sea como soluciones lfquidas o como suspensiones. Tambien se pueden preparar formas solidas adecuadas para la solucion en, o la suspension en, vetuculos lfquidos antes de la inyeccion.

El suministro directo de las composiciones generalmente se completara por medio de inyeccion, subcutaneamente, intraperitonealmente, intravenosamente o intramuscularmente, o se suministrara en el espacio intersticial de un tejido. Las composiciones tambien se pueden administrar en una lesion. La dosificacion del tratamiento puede ser un programa de una sola dosis o un programa de multiples dosis.

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Se apreciara que el ingrediente activo de la composicion sera un anticuerpo. Como tal, sera susceptible de degradacion en el tracto gastrointestinal. De este modo, si la composicion se va a administrar mediante una ruta que utiliza el tracto gastrointestinal, sera necesario que la composicion contenga agentes que protejan el anticuerpo de la degradacion pero que liberen el anticuerpo una vez que haya sido absorbido desde el tracto gastrointestinal.

Se encuentra disponible una discusion completa de los portadores farmaceuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

En una realizacion se proporciona la formulacion en forma de una formulacion para administraciones topicas, incluyendo la inhalacion.

Las preparaciones inhalables adecuadas incluyen polvos inhalables, aerosoles medidos que contienen gases propelentes o soluciones inhalables libres de gases propelentes. Los polvos inhalables de acuerdo con la descripcion que contienen la sustancia activa pueden consistir solamente en las sustancias activas anteriormente mencionadas o en una mezcla de las sustancias activas anteriormente mencionadas con un excipiente fisiologicamente aceptable.

Estos polvos inhalables pueden incluir monosacaridos (p. ej. glucosa o arabinosa), disacaridos (p. ej. lactosa, sacarosa, maltosa), oligo- y polisacaridos (p. ej. dextranos), polialcoholes (p. ej. sorbitol, manitol, xilitol), sales (p. ej. cloruro de sodio, carbonato de calcio) o mezclas de estos entre sf. Se utilizan adecuadamente mono- o di-sacaridos, utilizandose lactosa o glucosa, concretamente, pero no exclusivamente, en forma de sus hidratos.

Las partfculas para el deposito en el pulmon requieren un tamano de partfcula menor de 10 micras, tal como 1-9 micras por ejemplo de 0,1 a 5 pm, en particular de 1 a 5 pm. El tamano de partfcula del ingrediente activo (tal como el anticuerpo) es de una importancia primordial.

Los gases propelentes que se pueden utilizar para preparar los aerosoles inhalables son conocidos en la tecnica. Los gases propelentes adecuados se seleccionan entre hidrocarburos tales como n-propano, n-butano o isobutano e hidrocarburos halogenados tales como derivados clorados y/o fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propelentes anteriormente mencionados se pueden utilizar como tales o en mezclas de los mismos.

Concretamente los gases propelentes adecuados son derivados de alcano halogenados seleccionados entre TG 11, TG 12, TG 134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados mencionados anteriormente, TG134a (1,1,1,2- tetrafluoroetano) y TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) y las mezclas de los mismos son particularmente adecuados.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propelente tambien pueden contener otros ingredientes tales como co- disolventes, estabilizadores, agentes tensioactivos (surfactantes), antioxidantes, lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes son conocidos en la tecnica.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propelente de acuerdo con la invencion pueden contener hasta 5% en peso de sustancia activa. Los aerosoles de acuerdo con la invencion contienen, por ejemplo, de 0,002 a 5 % en peso, de 0,01 a 3 % en peso, de 0,015 a 2 % en peso, de 0,1 a 2 % en peso, de 0,5 a 2 % en peso o de 0,5 a 1 % en peso de ingrediente activo.

Alternativamente las administraciones topicas en el pulmon tambien pueden ser mediante la administracion de una solucion lfquida o una formulacion en suspension, por ejemplo empleando un dispositivo tal como un nebulizador, por ejemplo, un nebulizador conectado a un compresor (p. ej., el nebulizador Pari LC-Jet Plus(R) conectado a un compresor Pari Master(R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

El anticuerpo de la invencion puede ser suministrado dispersado en un disolvente, p. ej., en forma de una solucion o una suspension. Se puede suspender en una solucion fisiologica apropiada, p. ej., solucion salina u otro disolvente o solucion tamponada farmacologicamente aceptable. Las soluciones tamponadas conocidas en la tecnica pueden contener de 0,05 mg a 0.15 mg de edetato disodico, de 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, de 0,15 mg a 0,25 mg de polisorbato, de 0,25 mg a 0,30 mg de acido cftrico anhidro, y de 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sodio por 1 mL de agua con el fin de alcanzar un pH de aproximadamente 4,0 a 5,0. Se puede emplear una suspension, por ejemplo, una molecula liofilizada.

Las suspensiones o formulaciones en solucion terapeuticas tambien pueden contener uno o mas excipientes. Los excipientes son bien conocidos en la tecnica e incluyen tampones (p. ej., tampon de citrato, tampon de fosfato, tampon de acetato y tampon de bicarbonato), aminoacidos, urea, alcoholes, acido ascorbico, fosfolfpidos, protemas (p. ej., albumina de suero), EDTA, cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol, y glicerol. Las soluciones o suspensiones se pueden encapsular en liposomas o microesferas biodegradables. La formulacion se proporcionara generalmente en una forma sustancialmente esteril empleando procedimientos de fabricacion esteriles.

Esto puede incluir la produccion y esterilizacion por filtracion del disolvente/solucion tamponados utilizados para la formulacion, la suspension aseptica de la molecula en la solucion disolvente tamponada esteril, y la dispensacion de

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Numero de anticuerpo: Mutaciones de la Cadena pesada (Numeracion de Kabat) Dominio Ch1 & Bisagra SEQ ID NO: Ch1, Bisagra, Ch2 & Ch3 SEQ ID NO:

1: C127S 269 307

2: C127S,C239S 264 302

3: C127S,C242S 265 303

4: C127S, C242S, C239S 270 308

5: G230C 271 309

5P: G230C, S241P 272 310

6: C127S, G230C, C239S 243 281

7: C127S, G230C, C242S 244 282

8: C127S, G230C, C239S, C242S 245 283

9: G230C, C239S 273 311

10: G230C, C242S 274 312

11: G230C, C239S, C242S 275 313

12: C239S 276 314

13: C242S 277 315

14: C239S,C242S 278 316

la formulacion en receptaculos esteriles mediante metodos familiares para los expertos en la tecnica.

La formulaciOn nebulizable de acuerdo con la presente descripciOn puede ser proporcionada, por ejemplo, en forma de unidades de una sola dosis (p. ej., recipientes de plastico o viales sellados) envasados en sobres de aluminio. Cada vial contiene una dosis unitaria en un volumen, p. ej., 2 mL, de disolvente/tampOn de soluciOn.

Se piensa que el anticuerpo de la presente descripciOn es particularmente adecuado para el suministro por medio de nebulizaciOn.

Se pretende que "que comprende" en el contexto de la presente memoria descriptiva represente que incluye. Cuando sea tecnicamente apropiado, se pueden combinar las realizaciones de la invenciOn.

La invenciOn se describira mediante la referencia a los siguientes ejemplos, que son meramente ilustrativos y no se deben considerar limitantes del alcance de la presente invenciOn.

Ejemplos

1 Mutagenesis de la cadena pesada de IgG4 y generacion de vectores de un solo gen de la cadena pesada de IgG4 mutada.

Se realizaron mutaciones de aminoacidos utilizando el kit Quickchange® Lightening Multi Site Directed Mutagenesis (SDM) o el kit Quickchange® II DSM (obtenido de Stratagene®) (numeros de catalogo 210516 y 200521 respectivamente) y se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

Las mutaciones se verificaron mediante secuenciaciOn de ADN. Se produjeron las cadenas pesadas de IgG4 de los anticuerpos 1 a 47 de la siguiente Tabla:

15: C127S, G230C 246 284

16: C127S, G230C, S241P 247 285

17: IgG4 humana de tipo salvaje 227 -

18: S241P - -

19: IgG1 humana de tipo salvaje 226 -

28: C127S Y229C 248 286

28P: C127S Y229C, S241P 267 305

29: C127S Y229C C239S 249 287

30: C127S Y229C C242S 250 288

31: C127S Y229C C239S C242S 251 289

32: C127S K228C 252 290

33: C127S K228C C239S 253 291

34: C127S K228C C242S 254 292

35: C127S K228C C239S C242S 255 293

36: C127S S227C 256 294

37: C127S S227C C239S 257 295

38: C127S S227C C242S 258 296

39: C127S S227C C239S C242S 259 297

44: C127S G230C P238PAAA 260 298

44P: C127S G230C P238PAAA, S241P 268 306

45: C127S G230C P238PAAA C239S 261 299

46: C127S G230C P238PAAA C242S 262 300

47: C127S G230C P238PAAA C239S C242S 263 301

48: C127S, S227P, Y229S, G230C, P237D, P238KTHT, S241P 266 304

La cadena pesada del anticuerpo 48 (SEQ ID NO: 266) fue generada mediante PCR y clonacion con enzimas de restriccion. El producto de la PCR fue generado por un oligo directo que codificaba la secuencia de la region bisagra

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superior y central de IgG1 y un sitio de restriccion BglII y un oligo inverso que codificaba la enzima de restriccion DraIII. El fragmento de PCR se digirio a continuacion con las enzimas mencionadas anteriormente y se ligo en el vector de un solo gen de hG4 que contema la region variable apropiada.

2. Expresion de los anticuerpos IgG4 mutados

Todo el ADN mutante fue transfectado a celulas CHOK1. Las celulas (2x108 celulas/ml) se resuspendieron en 1 ml de Solucion Salina Equilibrada de Earle (Sigma) y se mezclaron con 400 |jg de ADN (200 |jg de ADN de la cadena pesada y 200 jg de ADN de la cadena ligera kappa). Se transfirieron almuotas de 800 jl a cubetas de 0,4 cm (Biorad). Para un cultivo de 500 ml, se sometieron a electroporacion seis cubetas bajo los siguientes parametros: 1 ms, 9,6 Amps; 10 ms, 0 Amps; 40 ms, 3,2 Amps. Las celulas transfectadas se incubaron durante 24 hrs, agitando a 140 rpm en un entorno humidificado con CO2 al 0,5% a 37°C y se continuo desde el dfa 2 despues de la transfeccion a 32°C durante 10-13 dfas. El dfa 4 despues de la transfeccion se anadieron al cultivo 1,6 ml de butirato de sodio 1 M. Una vez que las celulas alcanzaron una viabilidad de 40% o hasta el dfa 13, se cosecho el sobrenadante. Los cultivos se centrifugaron durante 45 minutos a 4000 rpm. El sobrenadante se hizo pasar a traves de un filtro de 0,22 jM Stericup (Millipore) para ser purificados.

3. Purificacion de anticuerpos IgG4 mutados

Los sobrenadantes (200-500 ml) se purificaron utilizando una columna de Protema A de 5 ml HiTrap MabSelect SuRe (GE Healthcare, Amersham Reino Unido). Las muestras se prepararon anadiendo 1/50° del volumen del sobrenadante de Tris-HCl 2 M pH 8,5. Las muestras se cargaron sobre la columna a 1 ml/min. La columna se lavo con PBS de pH 7.4. Para hacer eluir las muestras, se hizo circular citrato de sodio 0,1 M, pH 3,4 a traves de la columna a 1 ml/min y se recogieron fracciones de 0,5 ml. Las fracciones pico se neutralizaron anadiendo 0,125 ml de Tris-HCl 2 M pH 8,5 a cada una. La deteccion UV se ajusto a 280 nm.

4. Caracterizacion de anticuerpos IgG4 mutados purificados Analisis SDS PAGE:

El sobrenadante bruto se centrifugo a 1200 rpm durante 5 mins y se cuantifico con OCTET. Las muestras de anticuerpo (25-30 ng) se prepararon anadiendo las cantidades apropiadas de anticuerpo, 4x Tampon de Carga (Invitrogen) y 2 jl de NEM 100 mM. Se elaboro un volumen total de 20 jl utilizando dH2O. Las muestras se hirvieron a continuacion durante 3 mins a 100°C y se cargaron sobre un gel de Tris-Glicina al 40-20% de 1,5 mm de 15 pocillos. Los geles se hicieron circular a 150 V durante 1,5 hrs en 1x tampon Tank. Los anticuerpos se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando el sistema de transferencia en seco iBlot ajustado para transferir durante 8 mins. La membrana se incubo durante 1 hr a la temperatura ambiente (RT) en PBS-TM sobre una plataforma con sacudimiento, seguido de incubacion con un anticuerpo conjugado con HRP anti-Fc de IgG humana de conejo (Jackson Immunoresearch) o un anticuerpo conjugado con HRP anti-cadena ligera Kappa humana de cabra (Bethyl) durante 1 hr, con sacudimiento a RT. Esto estuvo seguido de 3 lavados de 5 mins cada uno con PBS-T. Las transferencias se revelaron utilizando un kit de sustrato de DAB potenciado con metal de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce).

Los resultados del analisis de transferencia Western se muestran en las Figuras 7, 8, 9 y 10. En la Figura 7-10, H representa la cadena pesada y L la cadena ligera, H2L2 es una molecula de anticuerpo completo que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras y HL es una hemimolecula que comprende una cadena pesada y una cadena ligera.

La Figura 7 muestra el analisis de transferencia Western para los anticuerpos 15, 16, 6, 7, 8, 17, 18, 19, 5, 5P, 9, 10, 11, 1, 2, 3, 4, 12, 13 y 14. Se puede observar a partir de la Figura 7 que los anticuerpos muestran un buen nivel de H2L2 excepto los anticuerpos 4, 8 y 14 que muestran poco o ningun H2L2 debido a la presencia de mutaciones C239S y C242S en ambas bisagras. No obstante, los anticuerpos 4, 8 y 14 pueden formar H2L2 por medio de enlaces no covalentes entre las cadenas pesadas. El mutante 3 tambien muestra poco H2L2, este mutante conserva C239 pero es incapaz de formar disulfuros entre las cadenas pesadas en la bisagra, presumiblemente debido a la formacion eficaz de un disulfuro entre la cistema de la cadena ligera (LC) C-terminal y la C239 de la bisagra. Tambien se puede observar que los anticuerpos que comprenden la mutacion C239S pero no C242S (anticuerpos 2, 6, 9 y 12) muestran una reduccion de la formacion de hL en comparacion con los anticuerpos que no comprenden C239S ni C242S o los anticuerpos que comprenden C242S pero no C239S. Los anticuerpos 5P y 16 que comprende la mutacion S241P tambien muestran una reduccion de la formacion de HL. Una comparacion de los mutantes 2 y 3 muestra el grado de 'alcance' de la cistema C-terminal de la cadena ligera para formar un enlace disulfuro con la cadena pesada, parece que la cistema de la cadena ligera se une mas eficazmente a C239 que a C242 en la cadena pesada.

La Figura 8 muestra el analisis de transferencia Western para los anticuerpos 15, 6, 7, 8, 28, 29, 30, 31, 17, 19, 32, 33, 33, 34, 35, 36, 37, 38 y 39. Se puede observar a partir de la Figura 8 que los anticuerpos muestran un buen nivel de H2L2 excepto para los anticuerpos 8, 31, 35 y 39 que no muestran ningun o muestran muy poco H2L2 debido a la presencia de mutaciones C239S y C242S en la region bisagra y por lo tanto no forman enlaces disulfuro entre dos cadenas pesadas. Sin embargo, los anticuerpos 8, 31, 35 y 39 pueden formar H2L2 por medio de enlaces no

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covalentes entre las cadenas pesadas. Tambien se puede observar que los anticuerpos que comprenden la mutacion C239S pero no C242S (anticuerpos 6, 29, 33 y 37) muestran una reduccion de la formacion de HL en comparacion con los anticuerpos que no comprenden C239S ni C242S o los anticuerpos que comprenden C242S pero no C239S. El mutante 15 es capaz de formar un enlace disulfuro entre la cadena ligera y G230C en CH1 y los disulfuros entre cadenas pesadas dando como resultado por consiguiente una protema unida por disulfuro y completamente ensamblada. Ademas, una comparacion de los mutantes 15(C127S G230C), 28(Cl27S Y229C), 32(C127S K228C) y 36(C127S S227C) muestra que la posicion de la cistema introducida en la bisagra superior mejora la formacion de enlaces disufuro entre LC-HC. G230 e Y229 son las posiciones particularmente preferidas para introducir una cistema. El mutante 28 (C127S Y229C) muestra un nivel bajo de HL y H2 y por lo tanto tiene poca heterogeneidad de enlaces disulfuro.

La Figura 9 muestra el analisis de transferencia Western para los anticuerpos 15, 6, 7, 8, 44, 45, 46, 47, 17 y 19. Se puede observar a partir de la Figura 9 que los anticuerpos muestran un buen nivel de H2L2 excepto para los anticuerpos 8 y 47 que no muestran ninguno o muestran muy poco H2L2 debido a la presencia de mutaciones C239S y C242S en la region bisagra y por lo tanto no forman enlaces disulfuro entre dos cadenas pesadas.

No obstante, los anticuerpos 8 y 47 pueden formar H2L2 por medio de enlaces no covalentes entre las cadenas pesadas. Tambien se puede observar que los anticuerpos que comprenden la mutacion C239S pero no la C242S (anticuerpos 6 y 45) muestran una reduccion de la formacion de HL en comparacion con los anticuerpos que no comprenden ni C239S ni C242S o los anticuerpos que comprenden C242S pero no C239S. En particular, el mutante 44 muestra que la insercion de tres aminoacidos en la bisagra superior tambien puede reducir la formacion de HL y H2 y por consiguiente tiene niveles inferiores de heterogeneidad de disulfuros que el mutante 15 comparable.

La Figura 10, muestra el analisis de transferencia Western para los anticuerpos 48, 17, 18 y 19. Se puede observar a partir de la Figura 10, que el anticuerpo 48 muestra un buen nivel de H2L2 y muy poca HL. El mutante 48 contiene la secuencia de la bisagra superior de IgG1 EPKSCDKTHT SEQ ID NO: 320 en lugar de la secuencia de la bisagra superior de IgG4 junto con una mutacion S241P en la bisagra central. Por lo tanto, el mutante 48 tiene la secuencia de la bisagra superior y central EPKSCDKTHTCPPCP SEQ ID NO: 321. El mutante 48 muestra niveles inferiores de heterogeneidad de enlaces disulfuro en comparacion con el anticuerpo 17 IgG4 de tipo salvaje y niveles bajos aproximadamente equivalentes de heterogeneidad de enlaces disulfuro en comparacion con el mutante 18 S241P de IgG4 y el anticuerpo 19 de IgG1 de tipo salvaje.

Analisis Thermofluor:

Las termoestabilidades de los mAb purificados se analizaron en un analisis Thermofluor utilizando SYPRO® Orange para controlar el proceso de desplegamiento termico de las protemas. Se anadieron juntos 5 jl de mAb a 1 mg/ml, 5 |jl de 30x colorante, y 40 jl de PBS. Se dispensaron 10 jl de la mezcla por cuadruplicado en una placa optica para PCR de 384 pocillos y se hizo funcionar en el 7900HT Fast Real-Time PCR System (Agilent Technologies UK Ltd, Wokingham Reino Unido). Este Sistema de PCR contiene un dispositivo termico para un control exacto de la temperatura ajustado de 20°C a 99°C; un dispositivo acoplado cargado controla simultaneamente los cambios de fluorescencia en los pocillos.

Las Figuras 11, 12, 13, 14 y 15 muestran los resultados del analisis de termoestabilidad de los mutantes del anticuerpo IgG4 en comparacion con los anticuerpos IgG1 e IgG4 de tipo salvaje.

Una comparacion del mutante 15 con la IgG4 de tipo salvaje (mutante 17) muestra un incremento en la Tm del Fab debido a la disposicion alterada del disulfuro. Una comparacion del mutante 15 y el 28 muestra una mejora adicional en la Tm del Fab para el mutante 28 que comprende la mutacion Y229C en comparacion con el mutante 15 que comprende la mutacion G230C. Una comparacion del mutante 15 y el 44 muestra que la Tm del Fab de un mutante G230C se puede incrementar adicionalmente mediante la insercion de tres aminoacidos en la bisagra superior. La comparacion de los mutantes 17 y 18 muestra que la mutacion en la bisagra media S241P no incrementa la Tm del Fab ni cuando se reduce significativamente la formacion de HL. El mutante 48 tambien muestra una Tm de Fab significativamente mejorada cuando se compara con la IgG4 de tipo salvaje (mutante 17) y el mutante 15.

La Figura 15 muestra la clasificacion general de las termoestabilidades de los mutantes de IgG4 seleccionados de acuerdo con la presente invencion. Los mutantes 48, 44, 44P, 46, 45, 6, 29, 30, 28, 28P, 31, 8, 47 y 15 muestran todos valores de Tm de Fab significativamente mas altos en comparacion con la IgG4 de tipo salvaje (mutante 17) y la IgG4 de tipo salvaje S241P (mutante 18).

5. Intercambio del brazo Fab

a) Intercambio de cadena pesada in vitro

Se mezclaron un primer anticuerpo IgG4 y su companero de intercambio potencial a una razon molar 1:1 a una concentracion total de 100 ug/ml en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) (en mM: NaCl 150, NaH2PO4 10; pH 7,4). Para permitir la reduccion del enlace disulfuro, las muestras se complementaron con Glutation reducido (GSH; Sigma) a una concentracion final de 0, 0,5 o 5 mM. Al inicio del experimento (t = 0 horas) se tomo una almuota de la mezcla, se sofoco con N-etilmaleimida (NEM; Sigma) a una concentracion final de 10 mM (para

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inactivar los grupos tiol potencialmente reactivos) y se incubo junto con el resto de la mezcla durante 16 horas a 37°C (t = 16 horas). Tras la incubacion, la muestra de t = 16 horas se sofoco como antes.

b) Deteccion y cuantificacion del intercambio de cadena pesada in vitro

La presencia de anticuerpos biespedficos funcionalmente activos se determino utilizando un analisis MSD sandwich en el que las muestras de reaccion sofocadas proporcionadas en el Ejemplo 5 a), se diluyeron seriadamente en BSA en PBS (PB) al 1%, se pre-incubaron con 1 ug/ml de antigeno 1 biotinilado (antigeno del primer anticuerpo) en PB durante 1 h a RT con agitacion (200 r.p.m) antes de ser transferidas a placas de MSD recubiertas con estreptavidina pre-bloqueadas con PB (Meso Scale Diagnostics). Despues de una hora de incubacion a RT con agitacion, los pocillos se lavaron tres veces con PBS/Tween-20 al 0,1% antes de incubarlos con 1 ug/ml de antfgeno 2 etiquetado con sulfo (antigeno del segundo anticuerpo en PB. Despues de la incubacion, las placas se lavaron como antes y las senales se revelaron y se midieron utilizando tampon de lectura y el aparato Image Sector 6000 del fabricante, respectivamente. Los valores de fondo obtenidos de las reacciones de control paralelas en las que el antfgeno biotinilado fue sustituido por una alternativa no biotinilada, fueron sustrafdos de todas las senales. Se utilizaron valores por duplicado de al menos 3 experimentos independientes en todos los calculos.

A mayor senal MSD mayor cantidad de intercambio de cadena pesada se ha producido.

Se analizaron los siguientes anticuerpos:

Anticuerpo: Mutaciones en comparacion con IgG4 de tipo salvaje

IgG1 wt (tipo salvaje): -

IgG4 wt (tipo salvaje): -

IgG4 P: S241P

IgG4 mutante 28: C127S Y229C

IgG4 mutante 28 P: C127S Y229C S241P

IgG4 mutante 15: C127S G230C

IgG4 mutante 44: C127S G230C P238PAAA

IgG4 mutante 44P: C127S G230C P238PAAA, S241P

IgG4 mutante 48: C127S, S227P, Y229S, G230C, P237D, P238KTHT, S241P

Las Figuras 16 a 20 muestran los resultados de la cuantificacion del intercambio del brazo Fab in vitro, donde el eje y muestra la senal MSD, en donde a mayor nivel de la barra, mayor cantidad de intercambio del brazo Fab.

La Figura 16 muestra el intercambio de cadena pesada para IgG1 de tipo salvaje, IgG4 de tipo salvaje y los mutantes IgG4P, 28, 28P, 15, 44, 44P y 48 a dos concentraciones de GSH y en diversos puntos temporales.

La Figura 17 muestra el intercambio de cadena pesada para IgG4 de tipo salvaje y los mutantes 15, 44 y 48 a dos concentraciones de GSH en diversos puntos temporales. Se puede observar que cuanta mas bisagra de IgG4 se muta para que sea de tipo IgG1, mas se reduce el intercambio, como se muestra por medio del mutante 48 que tiene el menor intercambio.

La Figura 18 muestra el intercambio de cadena pesada para IgG4 de tipo salvaje y los mutantes 15 y 28 a dos concentraciones de GSH en diversos puntos temporales. Se puede observar que la mutacion de la posicion 229 (mutante 28) reduce el intercambio a lo largo de 4 a 16 horas a ambas concentraciones de agente reductor en un grado mayor en comparacion con la mutacion de la posicion 230 (mutante 15).

La Figura 19 muestra el cambio porcentual para los mutantes IgG4P, 15, 28, 44 y 48 en GSH 0,5 mM en comparacion con la IgG4 de tipo salvaje. El intercambio se puede clasificar como sigue: IgG4 wt > 15 = 44 > 48 > 28.

La Figura 20 muestra el cambio porcentual para diversos mutantes en GSH 5 mM en comparacion con la IgG4 de tipo salvaje. El intercambio se puede clasificar IgG4 wt > 15 = 44 > 48 > 28.

De acuerdo con la bibliograffa (Labrijn 2011, Lewis 2009, Stubenrauch 2010, Labrijn 2009) los autores de la presente invencion demuestran que la mutacion S241P en la bisagra central de IgG4 representa una herramienta para prevenir el intercambio del brazo Fab. Tambien se puede observar que los anticuerpos biespedficos mutantes de la presente invencion demostranan menos intercambio del brazo Fab del mostrado con GSH 0,5 mM, que es 100 5 veces mayor que la concentracion de GSH fisiologica de 4-6 pM en plasma (Zilmer. et al, 2005. Drug Design Reviews). Por consiguiente, se pueden crear anticuerpos biespedficos in vitro por medio de intercambio del brazo Fab en condiciones reductoras, que tendna en ese caso un intercambio del brazo Fab significativamente reducido in vivo en comparacion con IgG4 wt.

Afinidad del anticuerpo:

10 La afinidad de los anticuerpos IgG4 mutantes seleccionados de la presente invencion para la citoquina soluble diana se puede medir mediante Biacore™. El formato de analisis es la captura de las IgG sobre una superficie anti-Fc seguida de titulacion de la citoquina soluble.

El termino "kd" (s'1), hace referencia a la constante de la velocidad de disociacion de la interaccion anticuerpo- antigeno. Dicho valor tambien es referido como el valor de koff.

15 El termino "ka" (M'1 s'1), segun se utiliza en la presente memoria, hace referencia a la constante de la velocidad de asociacion de la interaccion anticuerpo-antigeno.

El termino "Kd" (M) o "Kd" (pM), segun se utiliza en la presente memoria, hace referencia a la constante de equilibrio de disociacion de la interaccion anticuerpo-antfgeno.

Analisis HPLC de exclusion por tamanos (SEC):

20 Se hicieron circular aproximadamente 50 ug de anticuerpo purificado en la HPLC utilizando una columna S200. Se utilizaron los Ab 1 a 19 para el analisis. Este resultado demuestra que el H2L2 asociado no covalentemente se forma a pesar de las alteraciones en las disposiciones DSB de una molecula de IgG4 humana.

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REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo biespedfico simetrico de la clase IgG4 que comprende dos cadenas pesadas que comprenden cada una un dominio variable, un dominio Ch1 y una region bisagra, en donde en cada cadena pesada:

la cistema de la posicion 127, numerada de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, en el dominio Ch1 que forma un enlace disulfuro intercatenario con un cistema en una cadena ligera es sustituida por un aminoacido que no contiene tiol; y

uno o mas de los aminoacidos situados en la region bisagra superior es sustituido por cistema, en donde la secuencia de la region constante de cada cadena pesada es similar o identica y la region variable de cada cadena pesada es diferente.
2. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la region bisagra es una bisagra de tipo IgG1.
3. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde el anticuerpo esta aislado.
4. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde los uno o mas aminoacidos situados en la region bisagra superior de la primera cadena pesada sustituidos por cistema se seleccionan entre S227, K228, Y229 y G230, numerada de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat.
5. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la cistema de la posicion 239 y la cistema de la posicion 242, numeradas de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, en una o ambas cadenas pesadas son sustituidas por un aminoacido que no contiene tiol.
6. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la cistema de la posicion 239, numerada de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, en la primera cadena pesada es sustituida por un aminoacido que no contiene tiol.
7. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la cistema de la posicion 242, numerada de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, en la primera cadena pesada es sustituida por un aminoacido que no contiene tiol.
8. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde el aminoacido que no contiene tiol es serina.
9. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en donde la cistema de la posicion 127 es sustituida por serina.
10. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en donde una o ambas cadenas pesadas esta/estan mutadas para insertar tres aminoacidos entre los aminoacidos 226-243, numerados de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat.
11. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde una o ambas cadenas pesadas esta/estan mutadas para insertar tres aminoacidos entre las positions 238 y 239, numeradas de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat.
12. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde se insertan tres alaninas entre las posiciones 238 y 239, de la primera cadena pesada numeradas de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat.
13. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde se insertan una treonina, una histidina y una treonina adicional entre las posiciones 238 y 239, de una o ambas cadenas pesadas numeradas de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat.
14. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en donde la serina de la posicion 241, de una o ambas cadenas pesadas numeradas de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, es/son sustituidas por prolina.
15. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en donde en una o ambas cadenas pesadas la glicina de la posicion 230 es sustituida por cistema, la serina de la posicion 227 es/son sustituidas por prolina, la tirosina de la posicion 229 es sustituida por serina, la prolina de la posicion 237 es sustituida por acido aspartico, la prolina de la posicion 238 es sustituida por lisina, la secuencia de aminoacidos treonina-histidina-treonina es insertada entre las posiciones 238 y 239 y la serina de la posicion 241 es sustituida por prolina.
16. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en donde ambas cadenas pesadas comprenden un dominio Ch2 y/o un dominio Ch3.
17. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en donde la region bisagra de cada cadena pesada es identica.
18. Un anticuerpo biespedfico simetrico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde cada cadena pesada comprende una region bisagra superior y una region central de 12 a 17 aminoacidos de

5 longitud, por ejemplo 15 aminoacidos de longitud.
19. Un vector de expresion que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
20. Una celula anfitriona que comprende un vector como se define en la reivindicacion 19.
21. Un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para su uso en el tratamiento de

10 una enfermedad

o trastorno.
22. Un metodo para generar un anticuerpo biespedfico simetrico que comprende la etapa de mezclar un primer anticuerpo IgG4 con un segundo anticuerpo IgG4 ex vivo, en condiciones reductoras propicias para el intercambio de cadena pesada, en donde la especificidad antigenica de las regiones variables del primer anticuerpo es diferente

15 de la especificidad antigenica de las regiones variables del segundo anticuerpo y el primer anticuerpo IgG4 el segundo anticuerpo IgG4 comprenden cada uno un dominio Ch1 y una region bisagra como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.