ES2589801T3 - Derivados de dihidroquinolina como inhibidores de bromodominio - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo**Fórmula** en la que P es pirazolilo o triazolilo; R1 es un grupo seleccionado entre fenilo, piridilo, pirazinilo y pirimidinilo, estando dichos grupos opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes seleccionados entre halógeno, alquilo C1-4 y CN; R2 es alquilo C1-4; R3 es alquilo C1-4; R5 es H o alquilo C1-4; R6 es alquilo C1-4; o R5 y R6, junto con el O al que R6 está unido, forman un anillo oxetanilo, tetrahidrofuranoílo o tetrahidropiranilo; m es 1 o 2.
Description
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DESCRIPCION
Derivados de dihidroquinolina como inhibidores de bromodominio Campo de la Invencion
La presente invencion se refiere a compuestos, composiciones farmaceuticas que contienen tales compuestos y a su uso en terapia.
Antecedentes de la Invencion
Los genomas de organismos eucariotas estan altamente organizados dentro del nucleo de la celula. Las largas cadenas de ADN doble estan enrolladas alrededor de un octomero de protemas de histona (comprendiendo la mayona generalmente dos copias de histonas H2A, H2B, H3 y H4) para formar un nucleosoma. A continuacion, la unidad basica se comprime mas mediante la agregacion y pliegue de nucleosomas para formar una estructura de cromatina altamente condensada. Es posible una variedad de diferentes estados de condensacion, y la estrechez de esta estructura varia durante el ciclo celular, siendo muy compacta durante el proceso de division celular. La estructura de la cromatina juega un papel cntico en la regulacion de la transcripcion del gen, la cual no puede ocurrir eficazmente a partir de cromatina altamente condensada. La estructura de la cromatina esta controlada por una serie de modificaciones postraduccionales a protemas de histona, particularmente histonas H3 y H4, y lo mas comunmente en las colas de histona que se extienden mas alla de la estructura central del nucleosoma. Estas modificaciones incluyen acetilacion, metilacion, fosforilacion, ubiquitinilacion, SUMOilacion. Estas marcas epigeneticas son escritas y eliminadas por enzimas espedficas, las cuales colocan las etiquetas sobre residuos espedficos dentro de la cola de histona, formando de ese modo un codigo epigenetico, el cual, a continuacion, es interpretado por la celula para permitir la regulacion espedfica del gen de la estructura de cromatina y de ese modo la transcripcion.
La acetilacion de histona muy normalmente esta asociada con la activacion de la transcripcion del gen, ya que la modificacion afloja la interaccion del ADN y el octomero de histona al cambiar las caractensticas electrostaticas. Ademas de este cambio ffsico, las protemas espedficas se unen a residuos de lisina acetilada dentro de las histonas para leer el codigo epigenetico. Los bromodominios son distintos dominios pequenos (~110 aminoacidos) dentro de las protemas que se unen a residuos de lisina acetilada comunmente pero no exclusivamente en el contexto de histonas. Hay una familia de alrededor 50 protemas conocidas que contienen bromodominios, y tienen una variedad de funciones dentro de la celula.
La familia BET de bromodominio que contiene protemas comprende 4 protemas (BRD2, BRD3, BRD4 y BRD-t) que contienen bromodominios en tandem capaces de unirse a dos residuos de lisina acetilada en proximidad cercana, aumentando la especificidad de la interaccion. Se ha informado que BR2 y BR3 se asocian con histonas a lo largo de genes activamente transcritos y pueden estar implicados en facilitar la elongacion transcripcional (Leroy y col., Mol. Cell. 2008 30(1):51-60), mientras que BRD4 parece estar implicada en el reclutamiento del complejo pTEF-p a genes inducibles, dando como resultado la fosforilacion de ARN polimerasa y rendimiento transcripcional aumentado (Hargreaves y col, Cell, 2009 138(1):129-145). Tambien se ha informado de que BRD4 y BRD3 se pueden fusionar con NUT (protema nuclear en testmulo) formando novedosos oncogenes de fusion, BRD4-NUT o BRD3-NUT, en una forma altamente maligna de neoplasia epitelial (French y col. Cancer Research, 2003, 63, 304-307 y French y col. Journal of Clinical Oncology, 2004, 22(20), 4.135-4.139). Los datos sugieren que las protemas de fusion BRD- NUT contribuyen a carcinogenesis (Oncogene, 2008, 27, 2.237-2.242). BRD-t unicamente se expresa en el testmulo y ovario. Se ha informado que todos los miembros de la familia tienen alguna funcion en controlar o ejecutar aspectos del ciclo celular, y se ha demostrado que siguen en complejo con los cromosomas durante la division celular - sugiriendo un papel en el mantenimiento de la memoria epigenetica. Ademas, algunos virus hacen uso de estas protemas para atar sus genomas a la cromatina de la celula hospedante, como parte del proceso de replicacion vmca (You y col. Cell, 2004 117(3):349-60).
La solicitud de patente japonesa JP2008-156311 describe un derivado de bencimidazol que se dice que es un agente de union a bromodominio BRD2 que tiene utilidad con respecto a infeccion/proliferacion de virus.
La solicitud de patente WO2009084693A1 describe una serie de derivados de tienotriazoldiazepieno que se dice que inhiben la union entre una histona acetilada y un bromodominio que contiene protema que se dice que son utiles como agentes anticancer.
Las solicitudes de patente PCT/EP2010/06693 (publicada como WO2011054841) y PCT/EP2010/066701 (publicada como WO2011054848) ambas describen una serie de derivados de tetrahidroquinolina que inhiben la union de los bromodominios de la familia BET con residuos de lisina acetilada.
Se ha encontrado una clase de compuestos que inhiben la union de bromodominios con sus protemas acetiladas afines, mas particularmente una clase de compuestos que inhiben la union de los bromodominios de la familia BET a residuos de lisina acetilada. Tales compuestos seran referiros a continuacion como “inhibidores de bromodominio”.
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Sumario de la invencion
En un primer aspecto de la presente invencion, se proporciona un compuesto de formula (I), o una sal del mismo, mas particularmente un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo
En un segundo aspecto de la presente invencion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de formula (I), o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo y uno o mas vehiculos, diluyentes o excipientes farmaceuticamente aceptables.
En un tercer aspecto de la presente invencion, se proporciona un compuesto de formula (I), o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso en terapia, en particular en el tratamiento de enfermedades o afecciones para las cuales se indica un inhibidor de bromodominio.
En un cuarto aspecto de la presente invencion, se proporciona un compuesto para su uso en un procedimiento de tratamiento de enfermedades o afecciones para las cuales se indica un inhibidor de bromodominio en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
En un quinto aspecto de la presente invencion, se proporciona el uso de un compuesto de formula (I), o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo en la fabrication de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o afecciones para las cuales se indica un inhibidor de bromodominio.
Description detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a compuestos de formula (I), o una sal de los mismos
en la que
P es pirazolilo o triazolilo;
R1 es un grupo C(O)OR4 en el que R4 es alquilo C1-3 o cicloalquilo C3-7; o
R1 es un grupo seleccionado entre fenilo, piridilo, pirazinilo y pirimidinilo, estando dichos grupos opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes seleccionados entre halogeno, alquilo C1-4 y CN;
R2 es alquilo C1-4;
R3 es alquilo C1-4;
R5 es H o alquilo C1-4;
R6 es alquilo C1-4;
o R5 y R6, junto con el O al que R6 esta unido, forman un anillo oxetanilo, tetrahidrofuranoflo o tetrahidropiranilo; m es 1 o 2.
En una realization, la invencion proporciona compuestos de formula (I) con estereoqmmica relativa cis a traves del anillo de tetrahidroquinolina con respecto a los sustituyentes en la position 2 y 4 del anillo. En una realizacion, el compuesto de formula (I), o una sal del mismo, es el enantiomero (2S, 4R).
En una realizacion P es un grupo
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En una realization P se selecciona entre
En una realizacion, R1 es un grupo C(O)OR4 en el que R4 es isopropilo. En una realizacion, R1 se selecciona entre
En una realizacion, R2 es metilo.
En una realizacion, R3 es metilo.
En una realizacion m es 1.
En una realizacion, R5 es hidrogeno.
En una realizacion, R6 es metilo.
Como se usa en el presente documento, el termino "sustituido" se refiere a una sustitucion con el sustituyente o sustituyentes nombrados, permitiendose multiples grados de sustitucion a menos que se indique otra cosa. Cuando el sustituyente esta en un anillo que comprende un heteroatomo, el sustituyente puede localizarse en un carbono o un heteroatomo, si este ultimo es apropiado.
Aunque las realizaciones para cada variable se han enumerado en general anteriormente por separado para cada variable, esta invention pretende incluir todas las combinaciones de realizaciones que se han descrito en el presente documento anteriormente, incluyendo sales de las mismas.
Los compuestos particulares de acuerdo con la invencion son:
((2S,4R)-1-acetil-2-metil-6-{1-[2-(metiloxi)etil]-1H-pirazol-4-il}-1,2,3,4-tetrahidro-4-quinolinil)carbamato de 1- metiletilo;
6-(((2S,4R)-1-acetil-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo;
6-(((2S,4R)-1-acetil-6-(1-(2-metoxietil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-
il)amino)nicotinonitrilo;
6-(((2S,4R)-1-acetil-6-(2-(2-metoxietil)-2H-1,2,3-triazol-4-il)-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-
il)amino)nicotinonitrilo;
1-((2S,4R)-4-((5-cloropiridin-2-il)amino)-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-ilo);
1 -((2S,4r)-6-(1 -(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-4-((5-metilpiridin-2-il)amino)-3,4-dihidroquinolin-1(2H)- il)etanona;
1-((2S,4R)-4-((3-clorofenil)amino)-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-ilo); y
1-((2S,4R)-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-4-((5-metilpirazin-2-il)amino)-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-
il)etanona
o una sal de los mismos.
A lo largo de toda la presente memoria descriptiva, a menos que se indique otra cosa:
• el termino "halogeno" se usa para describir un grupo seleccionado entre fluor, cloro o bromo;
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• los terminos "alquilo C1-3" y "alquilo C1-4" se usan para describir un grupo o una parte del grupo que comprende un grupo alquilo lineal o ramificado que contiene de 1 a 3 o de 1 a 4 atomos de carbono respectivamente. Otras referencias se interpretaran de forma similar. Los ejemplos adecuados de tales grupos incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo y t-butilo;
• el termino "cicloalquilo C3-7" se usa para describir un anillo carbodclico no aromatico que contiene al menos tres y como mucho siete atomos de carbono. Los ejemplos de cicloalquilo C3-7 incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo.
Se apreciara que la presente invencion incluye compuestos de formula (I) como la base libre y como sales de los mismos, por ejemplo en forma de una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos. Una realizacion la invencion se refiere a compuestos de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos. En una realizacion alternativa, la invencion se refiere a compuestos de formula (I) en forma de una base libre.
Debido a su uso potencial en medicina, las sales de los compuestos de formula (I) son deseablemente farmaceuticamente aceptables. Las sales farmaceuticamente aceptables adecuadas pueden incluir sales de adicion de acidos. Como se usa en el presente documento, la expresion "sal farmaceuticamente aceptable" significa cualquier sal o solvato farmaceuticamente aceptable de un compuesto de formula (I), que tras la administracion al receptor es capaz de proporcionar (directa o indirectamente). En una realizacion, la expresion "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a cualquier sal farmaceuticamente aceptable de un compuesto de formula (I), que tras la administracion al receptor es capaz de proporcionar (directa o indirectamente). Para una revision sobre sales adecuadas, vease Berge y col., J. Pharm. Sci., 66: 1-19, (1977). Tfpicamente, una sal farmaceuticamente aceptable puede prepararse facilmente usando un acido o base deseada segun sea apropiado. La sal resultante puede precipitar de la solucion y recogerse por filtracion, o puede recuperarse por evaporacion del disolvente.
Una sal de adicion de acidos farmaceuticamente aceptable puede formarse por reaccion de un compuesto de formula (I) con un acido inorganico u organico adecuado (tal como bromlddrico, clortndrico, sulfurico, mtrico, fosforico, sucdnico, maleico, acetico, propionico, fumarico, dtrico, tartarico, lactico, benzoico, salidlico, glutamico, aspartico, p-toluenosulfonico, bencenosulfonico, metanosulfonico, etanosulfonico, naftalenosulfonico, tal como acido
2-naftalenosulfonico o hexanoico), opcionalmente en un disolvente adecuado tal como un disolvente organico, para dar la sal que normalmente se afsla por ejemplo por cristalizacion y filtracion. Una sal de adicion de acidos farmaceuticamente aceptable de un compuesto de formula (I) puede comprender o ser, por ejemplo, una sal bromhidrato, clorhidrato, sulfato, nitrato, fosfato, succinato, maleato, acetato, propionato, fumarato, citrato, tartrato, lactato, benzoato, salicilato, glutamato, aspartato, p-toluenosulfonato, bencenosulfonato, metanosulfonato, etanosulfonato, naftalenosulfonato (por ejemplo, 2-naftalenosulfonato) o hexanoato.
Pueden usarse otras sales no farmaceuticamente aceptables, por ejemplo formiatos, oxalatos o trifluoroacetatos, por ejemplo en el aislamiento de los compuestos de formula (I), y se incluyen dentro del alcance de esta invencion.
La invencion incluye dentro de su alcance todas las formas estequiometricas y no estequiometricas posibles de las sales de los compuestos de formula (I).
Se apreciara que muchos compuestos organicos pueden formar complejos con disolventes en los que se hacen reaccionar o a partir de los cuales se precipitan o cristalizan. Estos complejos se conocen como "solvatos". Por ejemplo, un complejo con agua se conoce como un "hidrato". Pueden usarse disolventes con altos puntos de ebullicion y/o capaces de formar enlaces hidrogeno, tales como agua, xileno, W-metil pirrolidinona, metanol y etanol, para formar solvatos. Los metodos para la identificacion de solvatos incluyen, pero sin limitacion, RMN y microanalisis. Los solvatos de los compuestos de formula (I) estan dentro del alcance de la invencion.
La invencion incluye dentro de su alcance todas las formas estequiometricas y no estequiometricas posibles de los solvatos de los compuestos de formula (I).
Los compuestos de formula (I) pueden estar en forma cristalina o amorfa. Ademas, algunas de las formas cristalinas de los compuestos de formula (I) pueden existir como polimorfos, que se incluyen dentro del alcance de la presente invencion. Las formas polimorficas de compuestos de formula (I) pueden caracterizarse y diferenciarse usando varias tecnicas analtticas convencionales, incluyendo, pero sin limitacion, patrones de difraccion de polvo de rayos X (XRPD), espectros de infrarrojos (IR), espectros de Raman, calorimetna diferencial de barrido (DSC), analisis termogravimetrico (TGA) y resonancia magnetica nuclear en estado solido (SSRMN).
Ciertos compuestos descritos en el presente documento contienen atomos quirales, de manera que puedan formarse isomeros opticos, por ejemplo, enantiomeros o diaestereoisomeros. Por consiguiente, la presente invencion incluye todos los isomeros de los compuestos de formula (I) ya sea como isomeros individuales aislados, tales como sustancialmente libres de otro isomero (es decir puros) o como mezclas (es decir, racematos y mezclas racemicas). Un isomero individual aislado tal como sustancialmente libre del otro isomero (es decir puro) puede aislarse de tal forma que esta presente menos del 10%, particularmente menos de aproximadamente el 1 %, por ejemplo menos de aproximadamente el 0,1 % del otro isomero.
La separation de los isomeros puede conseguirse mediante tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica, por ejemplo, por cristalizacion fraccionada, cromatografia o HPLC.
Ciertos compuestos de formula (I) pueden existir en una de varias formas tautomericas. Se entendera que la presente invention incluye todos los tautomeros de los compuestos de formula (I), ya sean tautomeros individuals o 5 como mezclas de los mismos.
Se apreciara a partir de lo anterior que se incluyen dentro del alcance de la invencion solvatos, isomeros y formas polimorfas de los compuestos de formula (I) y sales de los mismos.
Los compuestos de formula (I), o sales de los mismos pueden hacerse mediante una diversidad de procedimientos, incluyendo la qmmica estandar. Cualquier variable previamente definida continuara teniendo el significado que se ha 10 definido previamente a menos que se indique otra cosa. Los procedimientos sinteticos generales ilustrativos se exponen a continuation y despues, se preparan compuestos espetificos de formula (I) y sales de los mismos, en los Ejemplos.
En un aspecto mas se proporciona un proceso para la preparation de un compuesto de formula (I) que comprende un proceso seleccionado entre (a), (b), (c) y (d) en el que
15 (a) comprende hacer reaccionar un compuesto de formula (II)
en la que R1, R2 y R3 son como se definen en la formula (I) y Hal es cloro, bromo o yodo, con un compuesto de formula (III)
20 en la que P, m, R5 y R6 son como se definen en la formula (I).
(b) comprende hacer reaccionar un compuesto de formula (IV)
en la que R1, R2 y R3 son como se definen en la formula (I) y R es H o B(OR)2 es pinacolatoborano, con un compuesto de formula (V)
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en la que P, m, R5 y R6 son como se definen en la formula (I) y Hal es cloro, bromo o yodo.
(c) comprende hacer reaccionar un compuesto de formula (VI)
en la que P, R1, R2 y R3 son como se definen en la formula (I), con un compuesto de formula (VII)
en la que m, R5 y R6 son como se definen en la formula (I) y Hal es halogeno;
(d) comprende hacer reaccionar un compuesto de formula (VIII)
en la que m, P, R2, R3, R5, y R6 son como se definen en la formula (I) con un compuesto de formula (IX)
R1-Hal (IX)
en la que R1 es como se define en la formula (I) y Hal es halogeno.
Proceso (a)
Para el proceso (a), un halogeno adecuado es bromo. Esta reaction puede realizarse agitando un compuesto de
formula (II) con un compuesto de formula (III) en presencia de un catalizador de paladio adecuado, tal como
Pd(PPh3)4, una base, tal como carbonato sodico o potasico acuoso en un disolvente organico adecuado, tal como etanol o tolueno, o una combination de los mismos.
Los compuestos de formula (II) y (III) pueden prepararse por procedimientos descritos en el presente documento o mediante procedimientos analogos a los mismos.
Proceso (b)
Para el proceso (a), un halogeno adecuado es bromo. Esta reaccion puede realizarse agitando un compuesto de
formula (IV) con un compuesto de formula (V) en presencia de un catalizador de paladio adecuado, tal como
Pd(PPh3)4, una base, tal como carbonato sodico o potasico acuoso en un disolvente organico adecuado, tal como
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etanol o tolueno, o una combinacion de los mismos.
Proceso (c)
Para el proceso (c), un halogeno adecuado es bromo. La reaccion entre el compuesto de formula (VI) y formula (VII) puede realizarse en un disolvente organico adecuado, tal como DMF, en presencia de una base, tal como carbonato potasico.
Los compuestos de formula (VI) y (VII) pueden prepararse mediante procedimientos descritos en el presente documento o mediante procedimientos analogos a los mismos.
Proceso (d)
Para el proceso (d), un halogeno adecuado es bromo. La reaccion entre el compuesto de formula (VIII) y formula (IX) puede realizarse en un disolvente organico adecuado, tal como dioxano, en presencia de un catalizador de paladio, tal como tris(dibencildienoacetona)dipaladio (0), un ligando fosfina y una base, tal como terc-butoxido sodico.
Los compuestos de formula (VIII) pueden prepararse por procedimientos descritos en el presente documento o mediante procedimientos analogos a los mismos. Los compuestos de formula (IX) estan disponibles en el mercado.
Se apreciara por los expertos en la tecnica que puede ser ventajoso proteger uno o mas grupos funcionales de los compuestos que se han descrito anteriormente. Los ejemplos de grupos protectores y los medios para su eliminacion pueden encontrarse en T. W. Greene "Protective Groups in Organic Synthesis" (4a edicion, J. Wiley and Sons, 2006). Los grupos protectores de amina adecuados incluyen acilo (por ejemplo, acetilo, carbamato (por ejemplo, 2',2',2'-tricloroetoxicarbonilo, benciloxicarbonilo o t-butoxicarbonilo) y arilalquilo (por ejemplo, bencilo), que pueden eliminarse por hidrolisis (por ejemplo, usando un acido tal como acido clorhndrico en dioxano o acido trifluoroacetico en diclorometano) o de forma reductora (por ejemplo, hidrogenolisis de un grupo bencilo o benciloxicarbonilo o eliminacion reductora de un grupo 2',2',2'-tricloroetoxicarbonilo usando cinc en acido acetico) segun sea apropiado. Otros grupos protectores amina adecuados incluyen trifluoroacetilo (-COCF3), que puede eliminarse por hidrolisis catalizada por base.
Se apreciara que, en cualquiera de las rutas anteriormente descritas, el orden preciso de las etapas sinteticas mediante el cual se introducen los diversos grupos y restos en la molecula puede variar. Estara dentro de la habilidad del profesional en la tecnica asegurar que los grupos o restos introducidos en una fase del proceso no estara afectado por transformaciones y reacciones posteriores y, por consiguiente, seleccionar el orden de las etapas sinteticas.
Ciertos compuestos intermedios descritos anteriormente forman incluso un aspecto mas de la invencion.
Los compuestos de formula (I) y sus sales son inhibidores de bromodominio y, por tanto, se cree que tienen utilidad potencial en el tratamiento de enfermedades o afecciones para las cuales se indica un inhibidor de bromodominio.
Por tanto, la presente invencion proporciona un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso en terapia. El compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo se puede usar en el tratamiento de enfermedades o afecciones para las cuales se indica un inhibidor de bromodominio.
Por tanto, la presente invencion proporciona un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de cualquier enfermedad o afeccion para la cual se indica un inhibidor de bromodominio. En otra realizacion se proporciona un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de afecciones autoinmunes y/o inflamatorias cronicas. En una realizacion adicional se proporciona un compuesto o su sal farmaceuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de cancer.
Tambien se proporciona el uso de un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o afecciones para las cuales se indica un inhibidor de bromodominio.
Tambien se proporciona un compuesto para su uso en un procedimiento de tratamiento de enfermedades o afecciones para las cuales se indica un inhibidor de bromodominio en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
Adecuadamente el sujeto en necesidad del mismo es un ser humano.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “cantidad eficaz” significa la cantidad de un farmaco o agente farmaceutico que suscitara la respuesta biologica o medica de un tejido, sistema, animal o humano que esta siendo buscada, por ejemplo, por un investigador o medico. Ademas, el termino “cantidad terapeuticamente eficaz” significa cualquier cantidad que, en comparacion con un correspondiente sujeto que no ha recibido tal cantidad, da como resultado mejorado tratamiento, curacion, prevencion o mejora de una enfermedad, trastorno o efecto secundario, o un descenso en el mdice de progreso de una enfermedad o trastorno. El termino tambien incluye dentro de su
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ambito cantidades eficaces para aumentar la funcion fisiologica normal.
Se cree que los inhibidores de bromodominio son utiles en el tratamiento de una diversidad de enfermedades o afecciones relacionadas con la inflamacion sistemica o de tejido, respuestas inflamatorias a infeccion o hipoxia, activacion y proliferacion celular, metabolismo lip^dico, fibrosis y en la prevencion y tratamiento de infecciones vmcas.
Los inhibidores de bromodominio pueden ser utiles en el tratamiento de una amplia diversidad de afecciones autoinmunes e inflamatorias cronicas tales como artritis reumatoide, osteoartritis, gota aguda, psoriasis, lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, enfermedad inflamatoria del intestino (enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa), asma, enfermedad obstructiva cronica de las vfas respiratorias, neumonitis, miocarditis, pericarditis, miositis, eccema, dermatitis (incluyendo dermatitis atopica), alopecia, vitiligo, enfermedades de la piel bullosa, nefritis, vasculitis, aterosclerosis, enfermedad de Alzheimer, depresion, smdrome de Sjogren, sialoadenitis, oclusion de la vena central de la retina, oclusion de la vena lateral de la retina, smdrome de Irvine-Gass (post catarata y post cirugfa), retinitis pigmentosa, pars planitis, retinocloroidopatfa en perdigonada (birdshot), membrana epirretiana, edema macular qmstico, telengiectasis parafoveal, maculopatfas traccional, smdromes de traccion vitreomacular, desprendimiento retinal, neuroretinitis, edema macular idiopatico, retinitis, ojo seco (queratoconjuntivitis sicca), queratoconjuntivitis vernal, queratoconjuntivitis atopica, uveitis anterior, pan uveitis, uveitis posterior, edema macular asociado a uveitis, escleritis, retinopatfa diabetica, edema macular diabetico, distrofia macular relacionada con la edad, hepatitis, pancreatitis, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante, enfermedad de Addison, hipofisitis, tiroiditis, diabetes tipo I y rechazo agudo de organos trasplantados.
Los inhibidores de bromodominio pueden ser utiles en el tratamiento de una amplia diversidad de afecciones inflamatorias agudas tales como gota aguda, arteritis de celula gigante, nefritis incluyendo nefritis lupica, vasculitis relacionada con organo tal como glomerulonefritis, vasculitis incluyendo arteritis de celula gigante, granulomatosis de Wegener, poliarteritis nodosa, enfermedad de Behcet, enfermedad de Kawasaki, arteritis de Takayasu, pioderma gangrenoso, vasculitis relacionada con organo y rechazo agudo de organos trasplantados.
Los inhibidores de bromodominio pueden ser utiles en la prevencion o tratamiento de enfermedades o afecciones que implican respuestas inflamatorias a infecciones con bacterias, virus, hongos, parasitos o sus toxinas, tales como sepsis, smdrome por sepsis, shock septico, endotoxemia, smdrome de respuesta inflamatoria sistemica (SRIS), smdrome de disfuncion multiorganica, smdrome de shock toxico, lesion pulmonar aguda, SDRA (smdrome de dificultad respiratoria en adulta), fallo renal agudo, hepatitis fulminante, quemaduras, pancreatitis aguda, smdromes post cirugfa, sarcoidosis, reacciones Herxheimer, encefalitis, mielitis, meningitis, malaria y SRIS asociado con infecciones vmcas tales como gripe, herpes zoster, herpes simplex y coronavirus.
Los inhibidores de bromodominio pueden ser utiles en la prevencion o tratamiento de afecciones asociadas con lesion de reperfusion de isquemia tal como infarto de miocardio, isquemia cerebro-vascular (apoplejfa), smdromes coronarios agudos, lesion de reperfusion renal, trasplante de organo, injerto bypass de arteria coronaria, procedimientos bypass cardio-pulmonar, embolismo pulmonar, renal, hepatico, gastro-intestinal o de limbo periferico.
Los inhibidores de bromodominio pueden ser utiles en el tratamiento de trastornos del metabolismo lipfdico via la regulacion de APO-A1 tal como hipercolesterolemia, aterosclerosis y enfermedad de Alzheimer.
Los inhibidores de bromodominio pueden ser utiles en el tratamiento de afecciones fibroticas tales como fibrosis pulmonar idiopatica, fibrosis renal, constriccion post operativa, formacion de cicatriz queloide, esclerodermia (incluyendo morfea) y fibrosis cardiacas.
Los inhibidores de bromodominio pueden ser utiles en la prevencion y tratamiento de infecciones vmcas tales como virus de herpes, virus de papiloma humano, adenovirus y poxvirus y otros virus de ADN.
Los inhibidores de bromodominio pueden ser utiles en el tratamiento del cancer, incluyendo hematologico (tal como leucemia, linfoma y mieloma multiple), epitelial (incluyendo carcinomas de pulmon, pecho y colon), carcinomas de lmea media, tumores mesenquimales, hepaticos, renales y neurologicos. En una realizacion el cancer es NUT- carcinoma de lmea media.
Los inhibidores de bromodominio pueden ser utiles en el tratamiento de patologfa dermica tal como melanoma no maligno (queratosis actmica y celula basal), melanoma in situ, carcinoma celular escamoso y linfoma de linfocito T cutaneo.
En una realizacion la enfermedad o afeccion para la cual se indica un inhibidor de bromodominio se selecciona entre enfermedades asociadas con el smdrome de respuesta inflamatoria sistemica, tal como sepsis, quemaduras, pancreatitis, trauma grave, hemorragia e isquemia. En esta realizacion, el inhibidor de bromodominio se administrara en el momento de diagnosis para reducir la incidencia de: SRIS, el inicio del shock, smdrome de disfuncion multiorganica, el cual incluye el inicio de lesion pulmonar aguda, SDRA, lesion renal, hepatica, cardiaca y gastrointestinal aguda y mortalidad. En otra realizacion el inhibidor de bromodominio se administrara antes de cirugfa u otros procedimientos asociados con un alto riesgo de sepsis, hemorragia, extenso dano de tejido, SRIS o SDMO (smdrome de disfuncion multiorganica). En una realizacion particular la enfermedad o afeccion para la cual
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se indica un inhibidor de bromodominio es sepsis, smdrome de sepsis, shock septico y endotoxemia. En otra realizacion, el inhibidor de bromodominio esta indicado para el tratamiento de pancreatitis aguda o cronica. En otra realizacion el bromodominio esta indicado para el tratamiento de quemaduras.
En una realizacion la enfermedad o afeccion para la cual se indica un inhibidor de bromodominio se selecciona entre infecciones y reactivaciones de herpes simplex, calenturas, infecciones y reactivaciones de herpes zoster, varicela, herpes, virus del papiloma humano, virus de inmunodeficiencia humano (VIH), neoplasia cervical, infecciones de adenovirus, incluyendo enfermedad respiratoria aguda, infecciones de poxvirus tales como viruela bovina y viruela y virus de la peste porcina africana. En una realizacion particular un inhibidor de bromodominio esta indicado para el tratamiento de infecciones del virus del papiloma humano de piel o epitelio cervical. En una realizacion adicional el inhibidor del bromodominio esta indicado para el tratamiento de infeccion por VIH latente.
El termino “enfermedades o afecciones para las cuales se indica un inhibidor de bromodominio”, intenta incluir cada uno o todos los anteriores estados de enfermedad.
La invencion proporciona ademas compuestos para su uso en un procedimiento para inhibir un bromodominio que comprende poner en contacto el bromodominio con un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
Mientras que sea posible su uso en terapia, un compuesto de formula (I) asf como sus sales farmaceuticamente aceptables se pueden administras como compuesto qmmico en bruto, es comun presentar el principio activo como una composicion farmaceutica.
Por lo tanto, la presente invencion proporciona en un aspecto adicional una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable y uno o mas vehfculos, diluyentes o excipientes farmaceuticamente aceptables. Los compuestos de formula (I) y las sales farmaceuticamente aceptables, son tal como se han descrito anteriormente. El(los) vetnculo(s), diluyente(s) o excipiente(s) deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la composicion y no perjudiciales a su recipiente. De acuerdo con otro aspecto de la invencion tambien se proporciona un proceso para la preparacion de una composicion farmaceutica que incluye mezclar un compuesto de formula (I), o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, con uno o mas vehfculos, diluyentes o excipientes farmaceuticamente aceptables. La composicion farmaceutica se puede usar en el tratamiento de cualquiera de las afecciones descritas en el presente documento.
Puesto que los compuestos de formula (I) estan destinados a su uso en composiciones farmaceuticas sera facil entender que cada uno se proporciona preferentemente en forma sustancialmente pura, por ejemplo, al menos puro al 60%, mas adecuadamente al menos puro al 75% y preferentemente al menos puro al 85%, especialmente al menos puro al 98% (% en peso por base en peso).
Las composiciones farmaceuticas pueden estar presentes en formas de dosis unitaria que contienen una cantidad predeterminada de principio activo por dosis unitaria. Las composiciones de dosificacion unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis diaria o subdosis, o una fraccion apropiada de la misma, de un principio activo. Por lo tanto, tales dosis unitarias se pueden administrar mas de una vez al dfa. Las composiciones de dosificacion unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis diaria o subdosis (para la administracion mas de una vez al dfa), tal como se ha relatado anteriormente en el presente documento, o una fraccion apropiada de las mismas, de un principio activo.
Las composiciones farmaceuticas se pueden adaptar para la administracion mediante cualquier via apropiada, por ejemplo, mediante via oral (incluyendo bucal o sublingual), rectal, inhalado, intranasal, topica (incluyendo bucal, sublingual o transdermica), ocular (incluyendo topica, intraocular, subconjuntiva, epiescleral, sub-Tenon), vaginal o parenteral (incluyendo subcutanea, intramuscular, intravenosa o intradermica). Tales composiciones se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica de farmacia, por ejemplo, asociando el principio activo con el(los) vetnculo(s) o excipiente(s).
En una realizacion, la composicion farmaceutica esta adaptada para la administracion parenteral, particularmente administracion intravenosa.
En una realizacion la composicion farmaceutica esta adaptada para la administracion oral.
En una realizacion la composicion farmaceutica esta adaptada para la administracion topica.
Una forma de dosificacion preferida que da como resultado la oclusion y modificacion de la permeacion de la piel para o bien aumentar o disminuir la exposicion sistemica de los compuestos de bromodominio, que incluyen, pero no se limitan, a las formas farmaceuticas aceptables de carboximetilcelulosa, un alginato, gelatina o polivinilpirrolidona.
Composiciones farmaceuticas adaptadas para la administracion parenteral incluyen soluciones de inyeccion esteriles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostaticos y solutos que vuelven la composicion isotonica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones esteriles acuosas y no acuosas
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que pueden incluir agentes de suspension y agentes espesantes. Las composiciones pueden estar presentes en recipientes de dosis unitaria o dosis multiple, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y se pueden almacenar en una condicion de secado por congelacion (liofilizacion) que solamente requiere la adicion del vehnculo Uquido esteril, por ejemplo, agua para las inyecciones, inmediatamente antes de usar. Se pueden preparar soluciones y suspensiones de inyeccion extemporaneas a partir de polvos, granulos y comprimidos esteriles.
Composiciones farmaceuticas adaptadas para la administracion oral se pueden presentar como unidades separadas tales como capsulas o comprimidos; polvos o granulos; soluciones o suspensiones en lfquidos acuosos o no acuosos; espumas o batidos comestibles; o emulsiones lfquidas de aceite en agua o emulsiones lfquidas de agua en aceite.
Por ejemplo, para la administracion oral en la forma de un comprimido o capsula, el farmaco activo se puede combinar con un vehnculo inerte, oral, no toxico farmaceuticamente aceptable tal como etanol, glicerol, agua y similares. Polvos adecuados para incorporar en comprimidos o capsulas se pueden preparar reduciendo el compuesto a un tamano fino adecuado (por ejemplo, mediante micronisacion) y mezclando con un vehnculo farmaceutico preparado de forma similar tal como un carbohidrato comestible, por ejemplo, almidon o manitol. Tambien puede estar presente el agente aromatizante, conservante, dispersante y colorante.
Las capsulas se pueden fabricar preparando una mezcla en polvo, tal como se ha descrito anteriormente, y rellenando fundas de gelatina formadas. Se pueden anadir deslizantes y lubricantes tales como sflice coloidal, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio o polietilenglicol solido a la mezcla en polvo antes de la operacion de relleno. Tambien se puede anadir un agente desintegrador o solubilizante tal como agar-agar, carbonato de calcio o carbonato de sodio para mejorar la disponibilidad del medicamento cuando se ingesta la capsula.
Ademas, cuando se desea o es necesario, tambien se pueden incorporar en la mezcla aglutinantes, deslizantes, lubricantes, edulcorantes, aromatizantes, agentes desintegradores y agentes colorantes adecuados. Aglutinantes adecuados incluyen almidon, gelatina, azucares naturales tales como glucosa o beta-lactosa, edulcorantes de mafz, gomas naturales y sinteticas tales como de acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, ceras y similares. Lubricantes usados en estas formas de dosificacion incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. Desintegradores incluyen, sin limitacion, almidon, metilcelulosa, agar, bentonita, goma xantana y similares. Los comprimidos se formulan, por ejemplo, preparando una mezcla en polvo, granulacion o doble compresion (slugging), anadiendo un lubricante y desintegrador y presionando en comprimidos. Una mezcla en polvo se prepara mezclando el compuesto, adecuadamente desmenuzado, con un diluyente o base tal como se ha descrito anteriormente, y opcionalmente, con un aglutinante tal como carboximetilcelulosa, un aliginato, gelatina, o polivinilpirrolidona, una solucion retardante tal como parafina, un acelerador de resorcion tal como una sal cuaternaria y/o un agente de absorcion tal como bentonita, caolm o fosfato de dicalcio. La mezcla en polvo se puede granular mojando con un aglutinante tal como jarabe, pasta de almidon, mudlago de acadia o soluciones de materiales celulosicos o polimericos y forzando a traves de un filtro. Como alternativa a la granulacion, la mezcla en polvo puede atravesar la maquina de comprimido y el resultado son lingotes (slugs) formados de manera imperfecta rotos en granulos. Los granulos se pueden lubricar para prevenir el pegado al comprimido formando dados por medio de la adicion de acido estarico, una sal de estearato, talco o aceite mineral. A continuacion, se comprime la mezcla lubricada en comprimidos. Los compuestos de formula (I) y sus sales farmaceuticamente aceptables, tambien se pueden combinar con un vehnculo inerte que fluye libre y comprimir en comprimidos directamente sin pasar por las etapas de granulacion o doble compresion. Se puede proporcionar un revestimiento protector claro u opaco que consiste en una capa de sellado de goma laca, un revestimiento de azucar o material polimerico y un revestimiento de brillo de cera. Se pueden anadir tintes a estos revestimientos para distinguir diferentes dosificaciones unitarias.
Se pueden preparar fluidos orales tales como solucion, jarabes y elixires en forma de unidad de dosificacion para que una cantidad dada contenga una cantidad predeterminada del compuesto. Los jarabes se pueden preparar disolviendo el compuesto en una solucion acuosa adecuadamente aromatizada, mientras que los elixires se preparan a traves del uso de un vehiculizante no toxico alcoholico. Las suspensiones se pueden formular dispersando el compuesto en un vehiculizante no toxico. Tambien se pueden anadir solubilizantes y emulsionantes tales como alcoholes isosteanlicos etoxilados y polioxi etilen sorbitol eteres, conservantes, aditivo de sabor tal como aceite de menta o edulcorantes naturales o sacarina u otros edulcorantes artificiales, y similares.
Donde sea apropiado, las composiciones de unidad de dosificacion para la administracion oral pueden estar microencapsuladas. La formulacion tambien se puede preparar para prolongar o sostener la liberacion como, por ejemplo, mediante revestimiento o incrustacion de material particulado en polfmeros, cera o similares.
Los compuestos de formula (I) y sus sales farmaceuticamente aceptables, tambien se pueden administrar en la forma de sistemas de liberacion de liposoma, tal como vesfculas unilamelares pequenas, vesfculas unilamelares grandes y vesfculas multilamelares. Los liposomas pueden estar formados a partir de una diversidad de fosfolfpidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas.
Composiciones farmaceuticas adaptadas para la administracion topica pueden estar formuladas como pomadas, cremas, suspensiones, emulsiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, espumas, pulverizadores, aerosoles
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o aceites. Tales composiciones farmaceuticas pueden incluir aditivos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, conservantes, disolventes para ayudar a la penetracion del farmaco, codisolventes, emolientes, propulsores, agentes modificadores de la viscosidad (agentes gelificantes), tensioactivos y vehuculos. En una realizacion se proporciona una composicion farmaceutica adaptada para la administracion topica que comprende entre 0,01-10 %, o entre 0,01-1 % del compuesto de formula (l), o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en peso de la composicion.
Para tratamientos de los ojos u otros tejidos externos, por ejemplo, boca y piel, las composiciones preferentemente se aplican como una solucion, suspension, emulsion, pomada, crema, gel, pulverizador o espuma topica. Cuando se formula en una pomada, el principio activo se puede emplear con o bien una base de pomada miscible en agua o una parafmica. Alternativamente, el principio activo puede estar formulado en una crema con una base de crema de aceite en agua o una base de agua en aceite.
Composiciones farmaceuticas adaptadas para las administraciones topicas a los ojos incluyen gotas para los ojos en las que el principio activo esta disuelto o suspendido en un vehfculo adecuado, especialmente un disolvente acuoso. Las composiciones para ser administradas a los ojos tendran pH y presion osmotica oftalmicamente compatible. Uno o mas agentes de ajuste de pH oftalmicamente aceptables y/o agentes tampon pueden estar incluidos en una composicion de la invencion, incluyendo acidos tales como acidos acetico, borico, cftrico, lactico, fosforico y clorhudrico; bases tales como hidroxido de sodio, fosfato de sodio, borato de sodio, citrato de sodio, acetato de sodio y lactato de sodio; y tampones tales como citrato/dextrosa, bicarbonato de sodio y cloruro de amonio. Tales acidos, bases y tampones pueden estar incluidos en una cantidad requerida para mantener el pH de la composicion en un intervalo oftalmicamente aceptable. Una o mas sales oftalmicamente aceptables pueden estar incluidas en la composicion en una cantidad suficiente para traer la presion osmotica de la composicion dentro de un intervalo oftalmicamente aceptable. Tales sales incluyen aquellas que tienen cationes de sodio, potasio o amonio y aniones de cloruro, citrato, ascorbato, borato, fosfato, bicarbonato, sulfato, tiosulfato o bisulfito.
El dispositivo de liberacion ocular puede estar disenado para la liberacion controlada de uno o mas agentes terapeuticos con multiples indices de liberacion definidos y cineticas y permeabilidad de dosis sostenida. La liberacion controlada se puede obtener a traves del diseno de matrices polimericas que incorporan diferentes elecciones y propiedades de polfmeros biodegradables/bioerosionables (por ejemplo, acetato de poli(etilen vinil) (EVA), PVA superhidrolizado), hidroxialquil celulosa (HPC), metilcelulosa (MC), hidroxipropil metil celulosa (HPMC), policaprolactona, acido poli(glicolico), acido poli(lactico), polianhudrido, de pesos moleculares de polfmero, cristalinidad de polfmero, proporciones de copolfmero, condiciones de procesamiento, terminado de superficie, geometna, adicion de excipiente y revestimientos polimericos que aumentaran la difusion, erosion, disolucion y osmosis del farmaco.
Las composiciones farmaceuticas para la liberacion ocular tambien incluyen in situ composicion acuosa gelificable. Tal composicion comprende un agente gelificable en una concentracion eficaz para promover la gelificacion tras ponerse en contacto con los ojos o con el fluido lagrimal. Agentes gelificantes adecuados incluyen, pero no se limitan, a polfmeros de termoajuste. El termino “gelificable in situ" tal como se usa en el presente documento incluye no solamente lfquidos de baja viscosidad que forman geles tras ponerse en contacto con los ojos o con el fluido lagrimal, sino tambien incluye lfquidos mas viscosos tales como semifluido y geles tixotropicos que presentan viscosidad sustancialmente aumentada o dureza de gel tras la administracion a los ojos. Vease, por ejemplo, Ludwig (2005) Adv. Drug Deliv. Rev. 3;57:1.595-639, incorporado en el presente documento como referencia para los fines de sus ensenanzas de ejemplos de polfmeros para su uso en liberacion de farmaco ocular.
Las formas de dosificacion para la administracion nasal o inhalada convenientemente pueden estar formuladas como aerosoles, soluciones, suspensiones, geles o polvos secos.
Para composiciones adecuadas y/o adaptadas para la administracion inhalada, se prefiere que el compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, este en una forma de partfcula de tamano reducido por ejemplo obtenida por micronisacion. El tamano de partfcula preferible del compuesto o sal de tamano reducido (por ejemplo, sometido a micronisacion) esta definida por un valor D50 de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 micras (por ejemplo, como lo medido usando difraccion de laser).
Las formulaciones en aerosol, por ejemplo, para la administracion inhalada, pueden comprender una solucion o suspension fina de la sustancia activa en un disolvente acuoso o no acuoso farmaceuticamente aceptable. Las formulaciones en aerosol pueden estar presentes en cantidades de dosis unica o multiple en forma esteril en un recipiente sellado, el cual puede tomar la forma de un cartucho o recambio para su uso con un dispositivo de atomizacion o inhalador. Alternativamente el recipiente sellado puede ser un dispositivo dosificador unitario tal como un inhalador nasal de dosis unica o un dosificador en aerosol fijado con una valvula medidora (inhalador de dosis medida) que esta destinado a ser desechado una vez se hayan acabado los contenidos del recipiente.
Donde la forma de dosificacion comprende un dosificador en aerosol, preferentemente contiene un propulsor adecuado bajo presion tal como aire comprimido, dioxido de carbono o un propulsor organico tal como hidrofluorocarbono (HFC). Propulsores de hFc adecuados incluyen 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano y 1,1,1,2- tetrafluoroetano. Las formas de dosificacion en aerosol tambien pueden tomar la forma de un pulverizador. El
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aerosol presurizado puede contener una solucion o una suspension del compuesto activo. Esto puede requerir la incorporacion de excipientes adicionales, por ejemplo, codisolventes y/o tensioactivos para mejorar las caractensticas de dispersion y homogeneidad de formulaciones de suspension. Las formulaciones en solucion tambien pueden requerir la adicion de codisolventes tales como etanol.
Para composiciones farmaceuticas adecuadas y/o adaptadas para la administracion inhalada, la composicion farmaceutica puede ser una composicion inhalable en polvo seco. Tal composicion puede comprender una base en polvo tal como lactosa, glucosa, trehalosa, manitol o almidon, el compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo (preferentemente en forma de partfcula de tamano reducido, por ejemplo, en forma sometida a micronisacion), y opcionalmente un modificador de rendimiento tal como L-leucina u otro aminoacido y/o sales de metal de acido estearico tal como estearato de magnesio o calcio. Preferentemente, la composicion inhalable en polvo seco comprende una mezcla de polvo seco de lactosa, por ejemplo, monohidrato de lactosa y el compuesto de formula (I) o su sal. Tales composiciones se pueden administrar al paciente usando un dispositivo adecuado como el dispositivo DISKUS®, comercializado por GlaxoSmithKline que, por ejemplo, esta descrito en el documento GB 2242134 A.
Los compuestos de formula (I) y sus sales farmaceuticamente aceptables pueden estar formuladas como una formulacion fluida para la liberacion a partir de un dosificador de fluido, por ejemplo, un dosificador de fluido que tiene una boquilla dosificadora u orificio dosificador a traves del cual se administra una dosis medida de la formulacion fluida tras la aplicacion de una fuerza aplicada por el usuario a un mecanismo de bomba del dosificador de fluido. Tales dosificadores de fluido generalmente estan proporcionados con una reserva de dosis multiples medidas de la formulacion fluida, siendo las dosis administrables tras las actuaciones de bomba secuencial. La boquilla u orificio dosificador puede estar configurado para la insercion en las fosas nasales del usuario para administrar por pulverizacion la formulacion fluida en la cavidad nasal. Un dosificador de fluido del tipo anteriormente mencionado esta descrito e ilustrado en el documento WO-A-2005/044354.
Una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, dependera de un numero de factores incluyendo, por ejemplo, la edad y el peso del animal, la afeccion precisa que requiere tratamiento y su gravedad, la naturaleza de la formulacion, y la via de administracion, y finalmente estara en el criterio del medico o veterinario que atiende. En la composicion farmaceutica, cada unidad de dosificacion para la administracion oral o parenteral preferentemente contiene entre 0,01 y 3.000 mg, mas preferentemente 0,5 y 1.000 mg, de un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, calculado como base libre. Cada unidad de dosificacion para administracion nasal o inhalada preferentemente contiene entre 0,001 y 50 mg, mas preferentemente 0,01 y 5 mg, de un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, calculado como base libre.
Los compuestos farmaceuticamente aceptables de formula (I) y sus sales farmaceuticamente aceptables, se pueden administrar en una dosis diaria (por paciente adulto) de, por ejemplo, una dosis oral o parenteral de 0,01 mg a 3.000 mg por dfa o 0,5 a 1.000 mg por dfa, o una dosis nasal o inhalada de 0,001 a 50 mg por dfa o 0,01 a 5 mg por dfa, del compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, calculada como la base libre. Esta cantidad se puede dar en una dosis unica por dfa o mas normalmente en un numero (tal como dos, tres, cuatro, cinco o seis) de subdosis por dfa de modo que la dosis diaria total sea la misma. Una cantidad eficaz de una sal del mismo, se puede determinar como una proporcion de la cantidad eficaz del compuesto de formula (I) per se.
Los compuestos de formula (I) y sus sales farmaceuticamente aceptables, se pueden emplear solos o en combinacion con otros agentes terapeuticos. Terapias de combinacion de acuerdo con la presente invencion comprenden por tanto la administracion de al menos un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y el uso de al menos otro agente terapeuticamente activo. Preferentemente, las terapias de combinacion de acuerdo con la presente invencion comprenden la administracion de al menos un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y al menos otro agente terapeuticamente activo. El(los) compuestos(s) de formula (I) y sus sales farmaceuticamente aceptables, y el(los) otro(s) agente(s) terapeuticamente activo(s) se puede(n) administrar juntos en una composicion farmaceutica sencilla o por separado y, cuando se administra(n) por separado esto puede ocurrir simultaneamente o secuencialmente en cualquier orden. Las cantidades del(de los) compuesto(s) de formula (I) y sus sales farmaceuticamente aceptables, y el(los) otro(s) agente(s) terapeuticamente activo(s) y los ritmos relativos de administracion se seleccionaran para alcanzar el efecto terapeutico combinado deseado. Por tanto, en un aspecto adicional, se proporciona una combinacion que comprende un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable, y al menos otro agente terapeuticamente activo.
Por tanto, en un aspecto, el compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y composiciones farmaceuticas que comprenden un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con la invencion se pueden usar en combinacion con o incluir uno u otros mas agentes terapeuticos, por ejemplo, seleccionados entre antibioticos, antivirales, glucocorticoesteroides, beta-2 agonistas de antagonistas muscarmicos y analogos de Vitamina D3. En un aspecto adicional se puede usar un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con la invencion en combinacion con un agente terapeutico adicional que es adecuado para el tratamiento del cancer.
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Se apreciara que cuando el compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, se administra en combinacion con otros agentes terapeuticos normalmente administrados por la via inhalada, intravenosa, oral o intranasal, la composicion farmaceutica resultante se puede administrar por las mismas vfas. Alternativamente los componentes individuales de la composicion se pueden administrar por diferentes v^as.
Una realizacion de la invencion abarca combinaciones que comprenden uno u otros dos agentes terapeuticos.
Resultara evidente para un experto en la tecnica que, cuando se apropiado, puede usarse el otro ingrediente o ingredientes farmaceuticos en forma de sales, por ejemplo, como sales de metales alcalinos o amina, o como sales de adicion de acidos, o profarmacos, o como esteres, por ejemplo, esteres de alquilo inferior, o como solvatos, por ejemplo hidratos, para optimizar la actividad y/o estabilidad y/o caractensticas ffsicas, tal como la solubilidad, del ingrediente terapeutico. Tambien sera evidente que, cuando se apropiado, los ingredientes terapeuticos pueden usarse en forma opticamente pura.
Las combinaciones a las que se ha hecho referencia anteriormente pueden presentarse convenientemente para su uso en forma de una composicion farmaceutica y, por lo tanto, las composiciones farmaceuticas que comprenden una combinacion como se ha definido anteriormente junto con un diluyente o vehnculo farmaceuticamente aceptable representan un aspecto adicional de la invencion.
Los compuestos de formula (I), y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, pueden prepararse mediante los procedimientos descritos a continuacion o mediante procedimientos similares. Por lo tanto, los siguientes Intermedios y Ejemplos sirven para ilustrar la preparacion de los compuestos de formula (I) y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, y no consideraran como limitantes del alcance de la invencion de ningun modo.
Detalles experimentales generales
Todas las temperaturas a las que se hace referencia estan en °C.
Los nombres de los siguientes compuestos se han obtenido usando el programa para nombrar compuestos "ACD Name Pro 6.02" o Chem Draw Ultra 12.0.
Abreviaturas
BINAP
CV
Dave phos
DCM
DIPEA
DMF
DMSO
EtOAc
EtOH
h
KOH
CLEM
MDAP
min
MgSO4
Na2SO4
NMP
Pd2(dba)3
t.a.
Tr
TFA
THF
2,2'-bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftilo
volumenes de columna
[2'-(diciclohexilfosfanil)-2-bifenilil]dimetilamina
diclorometano
Diisopropiletilamina
W,W-dimetilformamida
dimetilsulfoxido
acetato de etilo
etanol
hora(s)
hidroxido potasico
cromatograffa lfquida/espectrometna de masas
HPLC autoprep. dirigida a masas = preparativa dirigida a masas
minuto(s)
sulfato de magnesio
sulfato sodico
N-metil-2-pirrolidona
Tris(dibencildienoacetona)dipaladio (0)
temperatura ambiente
tiempo de retencion
acido trifluoroacetico
tetrahidrofurano
Metodologia de CLEM Procedimiento formiato Condiciones de CL
El analisis por UPLC se realizo en una columna Acquity UPLC BEH C18 (50 mm x 2,1 mm, d.i. 1,7 pm de diametro de relleno) a 40 °C.
Los disolventes empleados fueron:
A = solucion al 0,1 % v/v de acido formico en agua B = solucion al 0,1 % v/v de acido formico en acetonitrilo
El gradiente empleado fue:
- Tiempo (min)
- Caudal (ml/min) % de A % de B
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- 1 3 97
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- 2,0
- 1 0 100
5 La deteccion UV fue una senal sumada de una longitud de onda de 210 nm a 350 nm. Condiciones de EM
Procedimiento HpH
EM
Modo de ionizacion Rango de exploracion Tiempo de exploracion Retardo entre exploraciones
Waters ZQ
Electronebulizacion positiva y negativa de exploracion alterna 100 a 1000 AMU 0,27 s 0,10 s
Condiciones de CL
10 El analisis por UPLC se realizo en una columna Acquity UPLC BEH C18 (50 mm x 2,1 mm, d.i. 1,7 pm de diametro de relleno) a 40 °C.
Los disolventes empleados fueron:
A = carbonado acido de amonio 10 mM en agua ajustada a pH 10 con solucion de amoniaco B = acetonitrilo
15 El gradiente empleado fue:
- Tiempo (min)
- Caudal (ml/min) % de A % de B
- 0
- 1 99 1
- 1,5
- 1 3 97
- 1,9
- 1 3 97
- 2,0
- 1 0 100
La deteccion UV fue una senal sumada de una longitud de onda de 210 nm a 350 nm. Condiciones de EM
EM
Modo de ionizacion Rango de exploracion Tiempo de exploracion Retardo entre exploraciones
Waters ZQ
Electronebulizacion positiva y negativa de exploracion alterna 100 a 1000 AMU 0,27 s 0,10s
20 Se realizo un analisis por CLEM (Procedimiento B) en una columna Acquity UPLC BEH C18 (50 mm x 2,1 mm d.i. 1,7 pm de diametro de relleno) a 40 grados centfgrados, eluyendo con una solucion al 0,1 % v/v de acido formico en agua (Disolvente A) y una solucion al 0,1 % v/v de acido formico en acetonitrilo (Disolvente B) usando el siguiente gradiente de elucion 0-1,5 min al 3-100 % de B, 1,5-1,9 min al 100 % de B, 1,9 - 2,0 min al 3 % de B a un caudal de
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1 ml/min. La deteccion UV fue una senal sumada de una longitud de onda de 210 nm a 350 nm. Los espectros de masas se registraron en un espectrometro de masas Waters ZQ usando electronebulizacion positiva y negativa de exploracion alterna. Los datos de ionizacion se redondearon al numero entero mas cercano.
Se realizo un analisis por CLEM (Procedimiento C) en una columna Acquity UPLC BEH C18 (50 mm x 2,1 mm d.i. 1,7 pm de diametro de relleno) a 40 grados centfgrados, eluyendo con una solucion al 0,1% v/v de acido trifluoroacetico en agua (Disolvente A) y una solucion al 0,1 % v/v de acido trifluoroacetico en acetonitrilo (Disolvente B) usando el siguiente gradiente de elucion 0-1,5 min al 3-100 % de B, 1,5-1,9 min al 100 % de B, 1,9-2,0 min al 3 % de B a un caudal de 1 ml/min. La deteccion UV fue una senal sumada de una longitud de onda de 210 nm a 350 nm. Los espectros de masas se registraron en un espectrometro de masas Waters ZQ usando electronebulizacion positiva. Los datos de ionizacion se redondearon al numero entero mas cercano.
Metodologia de MDAP
Formiato del procedimiento
Condiciones de CL
El analisis por HPLC se realizo en una columna Sunfire C18 (100 mm x 19 mm, d.i. 5 pm de diametro de relleno) o una columna Sunfire C18 (150 mm x 30 mm, d.i. 5 pm de diametro de relleno) a temperatura ambiente.
Los disolventes empleados fueron:
A = solucion al 0,1 % v/v de acido formico en agua
B = solucion al 0,1 % v/v de acido formico en acetonitrilo
Realizacion como un gradiente durante 15 o 25 min (realizacion extendida) con un caudal de 20 ml/min (100 mm x 19 mm, d.i. 5 pm de diametro de relleno) o 40 ml/min (150 mm x 30 mm, d.i. 5 pm de diametro de relleno).
La deteccion UV fue una senal sumada de una longitud de onda de 210 nm a 350 nm.
Condiciones de EM
Procedimiento HpH
EM
Modo de ionizacion Rango de exploracion Tiempo de exploracion Retardo entre exploraciones
Waters ZQ
Electronebulizacion positiva y negativa de exploracion alterna 100 a 1000 AMU 0,50s 0,20 s
Condiciones de CL
El analisis por HPLC se realizo en una columna Xbridge C18 (100 mm x 19 mm, d.i. 5 pm de diametro de relleno) o una columna Xbridge C18 (100 mm x 30 mm, d.i. 5 pm de diametro de relleno) a temperatura ambiente.
Los disolventes empleados fueron:
A = bicarbonato de amonio 10 mM en agua, ajustado a pH 10 con una solucion de amoniaco B = acetonitrilo
Realizacion como un gradiente durante 15 o 25 min (realizacion extendida) con un caudal de 20 ml/min (100 mm x 19 mm, d.i. 5 pm de diametro de relleno) o 40 ml/min (100 mm x 30 mm, d.i. 5 pm de diametro de relleno).
La deteccion UV fue una senal sumada de una longitud de onda de 210 nm a 350 nm.
Condiciones de EM
Procedimiento TFA
EM
Modo de ionizacion Rango de exploracion Tiempo de exploracion Retardo entre exploraciones
Waters ZQ
Electronebulizacion positiva y negativa de exploracion alterna 100 a 1000 AMU 0,50s 0,20 s
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ondiciones de CL
El analisis por HPLC se realizo en una columna Sunfire C18 (100 mm x 19 mm, d.i. 5 ^m de diametro de relleno) o una columna Sunfire C18 (150 mm x 30 mm, d.i. 5 ^m de diametro de relleno) a temperatura ambiente.
Los disolventes empleados fueron:
A = solucion al 0,1 % v/v de acido trifluoroacetico en agua B = solucion al 0,1 % v/v de trifluoroacetico en acetonitrilo
Realization como un gradiente durante 15 o 25 min (realization extendida) con un caudal de 20 ml/min (100 mm x 19 mm, d.i. 5 ^m de diametro de relleno) o 40 ml/min (150 mm x 30 mm, d.i. 5 ^m de diametro de relleno).
La detection UV fue una senal sumada de una longitud de onda de 210 nm a 350 nm.
Condiciones de EM
EM : Waters ZQ
Modo de ionization : Electronebulizacion positiva
Rango de exploration : 100 a 1000 AMU
Tiempo de exploracion : 0,50 s
Retardo entre exploraciones : 0,20 s
Metodologia de HPLC preparativa Procedimiento HpH Condiciones de CL
El analisis por HPLC se realizo en una columna Xbridge C18 (100 mm x 30 mm, d.i. 5 ^m de diametro de relleno) a temperatura ambiente.
Los disolventes empleados fueron:
A = bicarbonato de amonio 10 mM en agua, ajustado a pH 10 con una solucion de amoniaco B = acetonitrilo
Realizacion como un gradiente durante 30 min con un caudal de 30 ml/min La deteccion UV fue una senal sumada de una longitud de onda de 210 nm a 350 nm.
Intermedio 1
[(2S,4R)-1-Acetil-6-bromo-2-metil-1,2,3,4-tetrahidro-4-quinolinil]carbamato de 1-metiletilo
Se recogio [(2S,4R)-6-bromo-2-metil-1,2,3,4-tetrahidro-4-quinolinil]carbamato de 1-metiletilo (para una preparation, vease el Intermedio 2) (14,1 g, 43,1 mmol) en DCM (400 ml) en una atmosfera de nitrogeno a temperatura ambiente. Se anadieron piridina (10,46 ml, 129 mmol) y despues cloruro de acetilo (4,60 ml, 64,6 mmol), y la reaction se agito a temperatura ambiente durante 16 h, y despues se repartio entre acetato de etilo (2,0 l) y carbonato acido sodico acuoso saturado (800 ml). Las fases se separaron y la fase organica se lavo con agua y despues con salmuera (1500 ml cada vez), despues se seco con Na2SO4 y se concentro al vatio, produciendo un solido de color purpura. El producto en bruto se recogio en el mmimo de DCM y se aplico a una columna de 330 g Companion XL y se eluyo con un gradiente de acetato de etilo al 12-63% en ciclohexano, dando el producto en forma de un solido de color blanquecino (12,37 g).
CLeM (Procedimiento B), Tr 1,03 min, MH+ 369
[alfa]D = +281,1025° (T = 20,7 °C, celula de 10 mm, c = 0,508 g/100 ml, etanol).
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Intermedio 2
[(2S,4R)-6-Bromo-2-metiM,2,3,4-tetrahidro-4-qumolmil]carbamato de 1-metiletilo
Se recogio {(3S)-3-[(4-bromofenil)amino]butanoil}carbamato de 1-metiletilo (para una preparacion, vease el Intermedio 3) (17,9 g, 52,2 mmol) en etanol (150 ml) y se enfrio por debajo de -10 °C (temperatura interna) en un bano de CO2/acetona. Se anadio borohidruro sodico (1,381 g, 36,5 mmol) seguido de magnesio cloruro hexahidrato (11,35 g, 55,8 mmol) en agua (25 ml) manteniendo la temperatura por debajo de -5 °C. La mezcla se dejo en agitacion a <0 °C durante 1 h, despues se calento a temperatura ambiente y se agito durante 1 h. La suspension espesa resultante se vertio en una mezcla de acido dtrico (25,05 g, 130 mmol), acido clorddrico (1 M, 205 ml, 205 mmol) y DCM (205 ml). La mezcla bifasica se agito a temperatura ambiente durante 1 h. Las fases se separaron y la fase organica se seco con Na2SO4, se filtro y se concentro, produciendo el producto en forma de un solido de color pardo claro (14,1 g). CLEM (Procedimiento B), Tr 1,13 min, Mh+327
Intermedio 3
{(3S)-3-[(4-Bromofenil)amino]butanoil}carbamato de 1-metiletilo
Se agito (2£)-2-butenoilcarbamato de 1-metiletilo (para una preparacion, vease el Intermedio 4) (9,38 g, 54,8 mmol) en tolueno (281 ml) en una atmosfera de nitrogeno y se anadio (R-BINAP)ditriflatobis(acetonitrilo)paladio (II) (para una preparacion, vease el Intermedio 5) (3,35 g, 3,01 mmol). El catalizador formo una bola gomosa, la solucion se convirtio en una mezcla de color amarillo opaca y se agito durante 20 min. Se anadio 4-bromoanilina (14,14 g, 82 mmol), la solucion se volvio de color pardo claro transparente y el catalizador gomoso se disolvio adicionalmente. La mezcla se agito durante 16 h. De forma analoga, se agito un segundo lote de (2£)-2-butenoilcarbamato de 1- metiletilo (Intermedio 4, 8,51 g, 49,7 mmol) en tolueno (255 ml) en una atmosfera de nitrogeno y se anadio (R- BINAP)ditriflatobis(acetonitrilo)paladio (II) (3,04 g, 2,73 mmol). El catalizador formo una bola gomosa, la solucion se convirtio en una mezcla de color amarillo opaco y se agito durante 20 min. Se anadio 4-bromoanilina (12,83 g, 74,6 mmol), la solucion se volvio de color pardo claro transparente y el catalizador gomoso se disolvio adicionalmente. La mezcla se agito durante 16 h. Las dos mezclas de reaccion se combinaron y se cargaron sobre una columna de 1,5 kg Isco silica Redisep. La columna se eluyo con DCM/metanol (0%->0,5%, 19 VC). Las fracciones que conteman el producto limpio se evaporaron, dando un aceite de color pardo palido. La mezcla se seco en una estufa de vado durante una noche a 40 °C, dando {(3S)-3-[(4-bromofenil)amino]butanoil}carbamato de 1-metiletilo en forma de un solido de color blanco (24,2 g, 67 % total).
CLEM (Procedimiento C), Tr 0,91, MH+ 343, e.e. = 92 %.
Intermedio 4
(2E)-2-Butenoilcarbamato de 1-metiletilo
Se cargo carbamato de isopropilo (30 g, 291 mmol, disponible en TCI) en un recipiente de 3 l de Lara y se anadio THF seco (150 ml). Se anadio cloruro de (2£)-2-butenoflo (31,2 ml, 326 mmol, disponible en Aldrich) en una atmosfera de nitrogeno y la camisa se enfrio a -30 °C. Cuando la temperatura de la solucion alcanzo -17 °C, se anadio terc-butoxido de litio (1 M, 655 ml, 655 mmol) mediante una bomba peristaltica durante 2 h, manteniendo la temperatura de reaccion entre -10 °C y -18 °C. Una vez completa la adicion, la mezcla se agito durante 30 min y se llevo a 0 °C. Se anadieron eter dietflico (450 ml) y acido clorddrico (1 M, 375 ml) y la mezcla se llevo a 20 °C con agitacion vigorosa. La agitacion se detuvo, se dejo que las fases se separasen y la fase acuosa se evacuo. Se anadio salmuera (375 ml) y la mezcla se agito vigorosamente. La agitacion se detuvo, se dejo que las fases se separasen y la fase acuosa se evacuo. La fase organica se seco (MgSO4), se filtro y se evaporo, dando un aceite de color pardo (60 g). El aceite se aplico a una columna de sflice (40+M Biotage) y se eluyo con DCM/acetato de etilo
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(1:1 a 0:1, 10 VC). Las fracciones que conteman el producto se evaporaron a sequedad, se cargaron sobre una columna de sflice (1500 g, Redisep Isco) y se eluyeron con un gradiente de acetato de etilo en ciclohexano (0-40 %). Las fracciones que conteman el producto limpio se evaporaron, dando un solido de color blanquecino (15,41 g). CLEM (Procedimiento C), Tr 0,68, MH+ 172
Intermedio 5
(R-BINAP)ditriflatobis(acetonitrilo)paladio (II)
Se agito R-(+)-BINAP (6,08 g, 9,76 mmol, disponible en Avocado) en DCM (626 ml) y se anadio diclorobis(acetonitrilo)paladio (II) (2,5 g, 9,64 mmol, disponible en Aldrich). La mezcla se agito en una atmosfera de nitrogeno durante 30 min, la suspension no se convirtio en una solucion y se anadio mas cantidad de DCM (100 ml). La mezcla se agito durante 30 min mas y se anadio triflato de plata (5,00 g, 19,47 mmol, disponible en Aldrich) disuelto en acetonitrilo (250 ml). La mezcla cambio de una suspension turbia de color naranja a una suspension de color amarillo. La mezcla se agito durante 1 h, se filtro a traves de Celite™ y se evaporo, dando un solido de color naranja. El residuo se seco al vado (a aproximadamente 14 mbar) a temperatura ambiente durante el fin de semana, dando el producto deseado (10,69 g).
RMN 1H (400 MHz, MeCN-cf3) 5 ppm 2,0 (s, 6 H), 6,7 (d, 2H), 6,9 (m a, 4H), 7,1 (t a, 2H), 7,2 (t, 2H), 7,5 - 7,9 (m, 22H)
Intermedio 6
6-(((2S,4R)-1-Acetfl-6-bromo-2-metiM,2,3,4-tetrahidroqumolm-4-fl)ammo)mcotmomtrflo
A una mezcla de 1-((2S,4R)-4-amino-6-bromo-2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)etanona (para una preparacion, vease el Intermedio 7) (2,28 g, 8,05 mmol) y 6-cloronicotinonitrilo (2,231 g, 16,10 mmol) se le anadio nMp (20 ml) y la mezcla se trato con DIPEA (4,22 ml, 24,16 mmol). La mezcla se dividio entre 2 matraces y cada matraz se lavo abundantemente con nitrogeno, se cerro hermeticamente y se agito con irradiacion de microondas a 200 °C durante 2 h. Las mezclas de reaccion se combinaron y se repartieron entre agua y acetato de etilo. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (x 4) y las fases organicas combinadas se lavaron con agua (x 3), despues con salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron al vado. El residuo solido de color pardo se purifico por cromatografia (gradiente de acetato de etilo/hexanos), dando 6-(((2S,4R)-1-acetil-6-bromo-2-metil-1,2,3,4- tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo (1,940 g, 5,04 mmol, rendimiento del 62,5 %) en forma de una espuma de color amarillo palida. CLEM (HpH), Tr 1,02 min, MH+ = 386 (1 Br).
Intermedio 6, preparacion alternativa
6-(((2S,4R)-1-acetfl-6-bromo-2-metiM,2,3,4-tetrahidroqumolm-4-fl)ammo)mcotmomtrflo
Se disolvio 1-((2S,4R)-4-amino-6-bromo-2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)etanona (para una preparacion, vease el Intermedio 7) (18 g, 63,6 mmol) en NMP seco (90 ml). Se anadieron 6-cloronicotinonitrilo (13,21 g, 95 mmol) y DIPEA (22,20 ml, 127 mmol), la mezcla se agito a 150 °C en una atmosfera de nitrogeno durante 8 h, y despues se dejo en reposo durante una noche a temperatura ambiente. La solucion se anadio a agua (1 l) y la mezcla se extrajo con EtOAc (2 x 400 ml). La fase organica se lavo con agua (2 x 500 ml), se seco y se evaporo al vado, dando una espuma de color pardo. Esta espuma de color pardo se purifico por cromatografia en columna sobre gel de sflice (columna de 750 g, eluyendo con EtOAc al 0-100 %/ciclohexano). Las fracciones apropiadas se combinaron y se evaporaron al vado, dando 6-(((2S,4R)-1-acetil-6-bromo-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo (18,7 g, 48,5 mmol, rendimiento del 76 %) en forma de un solido de color amarillo palido.
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CLEM (formiato): Tr 0,99 min, MH+ 385/387.
Intermedio 7
1-((2S,4R)-4-Ammo-6-bromo-2-metil-3,4-dihidroqumolin-1(2H)-il)etanona
Una suspension de cloruro de aluminio (41,2 g, 309 mmol) en DCM (480 ml) a 0 °C en una atmosfera de nitrogeno se trato con una solucion de ((2S,4R)-1-acetil-6-bromo-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)carbamato de 1- metiletilo (para una preparation, vease el Intermedio 1) (30 g, 81 mmol) en DCM (80 ml) mediante una canula y la mezcla resultante se agito a esta temperatura durante 30 min. Despues, la mezcla de reaction se trato lentamente con una mezcla de trietilamina (136 ml, 975 mmol) y metanol (48 ml) mediante una canula. La torta resultante formada se agito en acetato de etilo (800 ml), se aislo por filtration y posteriormente se repartio entre DCM (800 ml) y una solucion saturada de carbonato acido sodico (800 ml). Se anadio tartrato potasico sodico (300 g) y la mezcla resultante se agito vigorosamente durante 2 h. Las fases se separaron y la fase de DCM se filtro a traves de un embudo sinterizado. El filtrado se seco (MgSO4) y se concentro al vado, dando un primer extracto de 1-((2S,4R)-4- amino-6-bromo-2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)etanona (19,6 g, 69,2 mmol, rendimiento del 85%) en forma de una espuma de color amarillo. La fase acuosa se trato adicionalmente con DCM (800 ml) y la mezcla bifasica se agito durante una noche. Despues, las fases se separaron y la fase organica se seco sobre (MgSO4) y se concentro al vado, dando un segundo extracto de 1-((2S,4R)-4-amino-6-bromo-2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)etanona (3,4 g, 12,01 mmol, rendimiento del 14,78 %). CLEM (HpH), Tr 0,77 min, MH+ 283 (1 Br).
Intermedio 7, preparacion alternativa
1-((2S;4R)-4-ammo-6-bromo-2-metil-3,4-dihidroqumolin-1(2H)-il)etanona
Se suspendio tricloruro de aluminio (31,6 g, 237 mmol) en DCM (320 ml) y se enfrio en un bano de hielo. Se anadio gota a gota una solucion de ((2S,4R)-1-acetil-6-bromo-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)carbamato de 1 -metiletilo (para una preparacion, vease el Intermedio 1) (25 g, 67,7 mmol) en DCM (100 ml) durante aproximadamente 45 min y la mezcla se dejo en agitation en el bano de hielo durante 1 h mas. La mezcla de reaccion se inactivo mediante la adicion gota a gota de NaOH (28,4 g, 711 mmol) en agua (350 ml), dando como resultado la formation de un precipitado espeso que se descompuso para asegurar que la agitacion continuara. Se anadio una solucion de tartrato sodico potasico (100 g, 354 mmol) en agua (400 ml) y la mezcla se agito durante una noche. La fase organica se separo y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con DCM (2 x 200 ml). Las fases organicas combinadas se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron, dando 1-((2S,4R)-4-amino-6-bromo-2-metil-3,4- dihidroquinolin-1(2H)-il)etanona (20,71 g, 65,8 mmol, rendimiento del 97%) en forma de un aceite de color pardo pegajoso.
CLEM (formiato): Tr 0,49 min, MH+ 266/268.
Intermedio 8
6-(((2S,4R)-1-acetil-2-metil-6-(1H-1,2,3-triazol-4-il)-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo
Un vial para microondas se cargo con 6-(((2S,4R)-1-acetil-6-etinil-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4- il)amino)nicotinonitrilo (para una preparacion, vease el Intermedio 9) (527 mg, 1,595 mmol), yoduro de cobre (I) (30 mg, 0,158 mmol), metanol (0,333 ml), DMF (3 ml). A la solucion se le anadio azidotrimetilsilano (0,423 ml, 3,19 mmol), el vial se cerro hermeticamente y se calento a 100 °C durante 1 h (microondas). En el vial se anadio azidotrimetilsilano (0,211 ml, 1,59 mmol) y la mezcla se calento durante 1 h mas (vial cerrado hermeticamente, microondas). Se anadieron azidotrimetilsilano (0,211 ml, 1,590 mmol) y yoduro de cobre (I) (30 mg, 0,158 mmol). El vial se cerro hermeticamente de nuevo y se calento durante 1 h mas. La solucion de reaccion se concentro al vado, se diluyo con agua (15 ml) y se extrajo con DCM (3 x 10 ml). Los extractos organicos se combinaron y se secaron (frita hidrofoba). La mezcla se concentro y la muestra se purifico por cromatografia sobre un cartucho de sflice (50 g) eluyendo con un gradiente de metanol/DCM (0-10%). Las fracciones apropiadas se combinaron y el disolvente se
evaporo al vado, dando 6-(((2S,4R)-1-acetil-2-metil-6-(1H-1,2,3-triazol-4-il)-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-
il)amino)nicotinonitrilo (50 mg). CLEM (formiato): Tr 0,71 min, MH+ 374
Intermedio 9
6-(((2S,4R)-1-acetil-6-etinil-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo
5
Se trato 6-(((2S,4R)-1-Acetil-2-metil-6-((trimetilsilil)etinil)-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo (para una preparacion, vease el Intermedio 10) (l,69g, 4,20 mmol) con cloruro de tetrabutilamonio (1 M en THF, 4,62 ml, 4,62 mmol) y THF (18 ml) y la solucion se agito a condiciones ambiente durante 30 min. La reaccion se concentro al vado, se diluyo con agua (25 ml) y se extrajo con DCM (3 x 30 ml). Los extractos organicos se combinaron, se 10 secaron (frita hidrofoba) y el disolvente se evaporo al vado. El residuo se purifico por cromatografia sobre un cartucho de sflice (100 g) eluyendo con un gradiente de acetato de etilo/ciclohexano (0-75%). Las fracciones apropiadas se recogieron y el disolvente se evaporo al vado, dando 6-(((2S,4R)-1-acetil-6-etinil-2-metil-1,2,3,4- tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo (990 mg) en forma de una espuma de color amarillo. CLEM (formiato), Tr 0,92 min, MH+ 331.
15 Intermedio 10
6-(((2S,4R)-1-Acetil-2-metil-6-((trimetilsilil)etinil)-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo
Se mezclaron 6-(((2S,4R)-1-Acetil-6-bromo-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo (para una preparacion, vease el Intermedio 6) (1,62 g, 4,20 mmol), etiniltrimetilsilano (17,5 ml, 124 mmol), trietilamina (23 ml, 20 165 mmol), cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio (II) (0,590 g, 0,841 mmol) y yoduro de cobre (I) (0,080 g, 0,420 mmol)
en DMF (18 ml) y calentaron a 90 °C durante una noche. La reaccion se concentro al vado, se diluyo con agua (30 ml) y se extrajo con DCM (3 x 30 ml). Los extractos organicos se combinaron y se secaron (frita hidrofoba). La solucion se concentro al vado, y el residuo se purifico por cromatografia sobre un cartucho de sflice (100 g) eluyendo con un gradiente de acetato de etilo/ciclohexano (0-75% sobre 14 VC). Las fracciones apropiadas se 25 recogieron y el disolvente se evaporo al vado, dando 6-(((2S,4R)-1-acetil-2-metil-6-((trimetilsilil)etinil)-1,2,3,4- tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo (881 mg) en forma de una espuma de color negro, que se uso sin purificacion adicional. CLEM (formiato), Tr 1,24 min, MH+ 402
Intermedio 11
1 -((2S,4R)-4-amino-6-(1 -(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)etanona
30
Se combinaron (2S,4R)-1-acetil-6-bromo-2-metil-1,2,3,4-tetrahidro-4-quinolinamina (para una preparacion, vease el Intermedio 7) (900 mg, 2,82 mmol),1-(2-metoxietil)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1H-pirazol (852 mg, 3,38 mmol), [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio (II) (309 mg, 0,422 mmol) y K2CO3 (895 mg, 6,48 mmol) en 1,4-dioxano (12 ml) y agua (4,0 ml) y calentaron a 110 °C durante 60 min (microondas). La reaccion se calento 35 durante 10 min mas y despues, durante 30 min mas en las mismas condiciones. Se anadieron PdCh(dppf) (309 mg, 0,422 mmol), K2CO3 (895 mg, 6,48 mmol) y agua (1,5 ml) y la mezcla se calento a 110 °C durante 30 min (microondas). La mezcla de reaccion se repartio entre carbonato acido sodico acuoso saturado (150 ml) y DCM (3 x
150 ml). Los extractos organicos se combinaron, se secaron (frita hidrofoba) y se evaporaron al vado. El residuo se disolvio en DCM, la solucion se aplico a un cartucho de sflice (100 g) y se purifico el cartucho eluido con un gradiente de acetato de etilo/ciclohexano (0-100 % sobre 10 VC seguido de acetato de etilo al 100 % sobre 5 VC). El cartucho se lavo usando un gradiente de metanol/DCM (0-20 % sobre 10 VC seguido de mantenimiento en metanol 5 al 20 %/DCM sobre 5 VC). El cartucho se lavo adicionalmente usando un gradiente de amoniaco 2 M en metanol/DCM (0-20 % sobre 10 VC, seguido de amoniaco 2 M en metanol/DCM 20 % sobre 5 VC). Las fracciones apropiadas se combinaron y se evaporaron al vado, dejando 1-((2S,4R)-4-amino-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)- 2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)etanona (631 mg, 1,921 mmol, rendimiento 68%) en forma de un vidrio de color pardo. CLEM (HpH), Tr 0,68 min, MH+ 329
10 Ejemplo 1
((2S,4R)-1-acetil-2-metil-6-{1-[2-(metiloxi)etil]-1H-pirazol-4-il}-1,2,3,4-tetrahidro-4-quinolinil)carbamato de 1- metiletilo
Se combinaron [(2S,4R)-1-acetil-6-bromo-2-metil-1,2,3,4-tetrahidro-4-quinolinil]carbamato de 1 -metiletilo (para la 15 preparacion, vease el Intermedio 1) (185 mg), 1-[2-(metiloxi)etil]-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1 H- pirazol (para una preparacion, vease Journal of Heterocyclic Chemistry, 41(6), 931-939; 2004) (151 mg), carbonato potasico (90 mg) y tetragu/s(trifenilfosfina)paladio (0) (28,9 mg) en etanol y tolueno en una atmosfera de nitrogeno y se calentaron a 80 °C durante 18 h. La reaccion se concentro, el residuo se repartio entre acetato de etilo (10 ml) y agua (10 ml) y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (10 ml). Los extractos organicos combinados se lavaron 20 con salmuera (25 ml), se secaron con sulfato sodico, se filtraron y se concentraron. El residuo se purifico por MDAP (formiato x 2) y el producto recogido se disolvio en 1,4-dioxano (0,5 ml), se enfrio en un bano de CO2 y despues se dejo en un liofilizador durante una noche. El solido de color blanco resultante se seco a 40 °C al vado durante una noche, dando ((2S,4R)-1-acetil-2-metil-6-{1-[2-(metiloxi)etil]-1H-pirazol-4-il}-1,2,3,4-tetrahidro-4-quinolinil)carbamato de 1 -metiletilo (84,7 mg). CLEM (formiato), Tr 0,84 min, Mh+ 415
25 Ejemplo 2
6-(((2S,4R)-1-acetil-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-
il)amino)nicotinonitrilo
Un vial para microondas se cargo con 6-(((2S,4R)-1-acetil-6-bromo-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4- 30 il)amino)nicotinonitrilo (para una preparacion, vease el Intermedio 6) (74 mg, 0,192 mmol), 1-(2-metoxietil)-4-(4,4,5,5- tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1H-pirazol (CAS n.° 847818-71-7 disponible en Milestone PharmTech uSA Inc.) (63 mg, 0,250 mmol), [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio (II) (21 mg, 0,029 mmol), carbonato potasico (56 mg, 0,405 mmol), agua (0,5 ml), y 1,4-dioxano (1,5 ml). El vial se cerro hermeticamente y se calento a 120 °C durante 30 min (microondas). La solucion de reaccion se diluyo con agua (10 ml), se extrajo con acetato de etilo (3 x 35 15 ml). Los extractos organicos se combinaron, se secaron (frita hidrofoba). El disolvente se evaporo al vado. El
residuo se disolvio en metanol/DMSO (1:1, 1 ml) y se purifico por MDAP (TFA). El disolvente se evaporo en una corriente de nitrogeno, el residuo se disolvio de nuevo en metanol y se filtro a traves de un aminopropil SPE (2 g). El disolvente se evaporo al vado, dando 6-(((2S,4R)-1-acetil-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-1,2,3,4- tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo (40 mg) en forma de un solido de color blanco.
40 CLEM (formiato): Tr 0,82 min, MH+ 431.
5
10
15
20
25
30
35
40
Ejemplo 2, preparacion alternativa
6-(((2S,4ft)-1-acetil-6-(1-(2-metoxietil)-1W-pirazol-4-il)-2-metiM,2,3,4-tetrahidroqumolm-4-
il)amino)nicotinonitrilo
Se combinaron 6-(((2S,4R)-1-acetil-6-bromo-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo (Intermedio 6) (10 g, 26,0 mmol), PEPPSI™ (1,764 g, 2,60 mmol), KOH (4,37 g, 78 mmol) y 1-(2-metoxietil)-4-(4,4,5,5-tetrametil- 1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1H-pirazol (CaS n.° 847818-71-7 disponible en Milestone PharmTech uSA Inc.) (11,78 g, 46,7 mmol) en una mezcla de tolueno (80 ml), EtOH (40 ml) y agua (50 ml). La mezcla se desgasifico y despues se calento a reflujo en una atmosfera de nitrogeno durante 6 h. La solucion se enfrio, se diluyo con EtOAc (200 ml) y se lavo con agua (200 ml). La fase organica se seco sobre sulfato sodico y se concentro al vado, dando una goma de color amarillo palido. Esta goma de color amarillo se purifico por cromatografia en columna sobre gel de sflice (columna de 330 g, eluyendo con EtOAC al 0-100 %/ciclohexano seguido de MeOH al 10 %/EtOAc). Las fracciones apropiadas se recogieron y el disolvente se evaporo al vado, dando el producto en bruto que se purifico adicionalmente por HPLC preparativa (Procedimiento HpH) y despues se seco durante una noche en un horno de vado a 55 °C, dando 6-(((2S,4R)-1-acetil-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4- il)amino)nicotinonitrilo (4,62 g).
CLEM (formiato): Tr 0,82 min, MH+ 431.
RMN 1H (DMSO-d6): 8,42 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,97 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,79 (dd, J = 8,8, 2,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,48 (dd, J = 8,1,2,2 Hz,1H), 7,33 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,27 (s, 1H), 6,79 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,99 (s a, 1H), 4,62 - 4,77 (m, 1H), 4,26 (t, J = 5,3 Hz, 2H), 3,63 - 3,71 (m, 2H), 3,21 (s,3H), 2,56 (ddd, J = 12,7, 8,3, 4,6 Hz, 1H), 2,09 (s, 3H), 1,24 - 1,38 (m, 1H), 1,08 (d, J = 6,2 Hz, 3H)
Ejemplo 3
6-(((2S,4ft)-1-acetil-6-(1-(2-metoxietil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)-2-metiM,2,3,4-tetrahidroqumolm-4-
il)amino)nicotinonitrilo
Ejemplo 4
6-(((2S,4R)-1-acetil-6-(2-(2-metoxietil)-2H-1,2,3-triazol-4-il)-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-
il)amino)nicotinonitrilo
Una solucion de 6-(((2S,4R)-1-acetil-2-metil-6-(1H-1,2,3-triazol-4-il)-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-
il)amino)nicotinonitrilo (para una preparacion, vease el Intermedio 8) (50 mg, 0,134 mmol) en DMF (3 ml) se enfrio a 0 °C en un bano de hielo-agua. A la solucion se le anadieron 1-bromo-2-metoxietano (0,04 ml, 0,420 mmol) y carbonato potasico (56 mg, 0,405 mmol). Despues, la solucion se dejo calentar a temperatura ambiente, y se agito a condiciones ambientales durante 2 h. A la solucion de reaccion se le anadio yoduro sodico (61 mg, 0,407 mmol) y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante una noche. A la reaccion se le anadieron 1-bromo-2-metoxietano (0,013 ml, 0,134 mmol), carbonato potasico (21 mg, 0,152 mmol) y yoduro sodico (21 mg, 0,140 mmol), que se calento a 60 °C durante 1 h. A la reaccion se le anadieron porciones adicionales de 1-bromo-2-metoxietano (0,013 ml, 0,134 mmol), carbonato potasico (21 mg, 0,152 mmol) y yoduro sodico (21 mg, 0,140 mmol) y el calentamiento continuo durante 3 h. La mezcla de reaccion se concentro al vado, se diluyo con agua (10 ml) y se extrajo con DCM (3 x 15 ml). Los extractos organicos se combinaron y se secaron (frita hidrofoba). Despues, el disolvente se evaporo al vado, la muestra se disolvio de nuevo en metanol/DMSO (1:1, 1 ml) y se purifico por MDAP
5
10
15
20
25
30
35
(formiato). Ambos regioisomeros se recogieron, dando 6-(((2S,4R)-1-acetil-6-(1-(2-metoxietil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)-2- metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo (8 mg) y 6-(((2S,4R)-1-acetil-6-(2-(2-metoxietil)-2H-1,2,3- triazol-4-il)-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo (18 mg).
6-(((2S,4R)-1-acetil-6-(1-(2-metoxietil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo CLEM (formiato), Tr 0,78 min, MH+ 432, 6-(((2S,4R)-1-acetil-6-(2-(2-metoxietil)-2H-1,2,3-triazol-4-il)-2-metil-1,2,3,4- tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo ClEm (formiato), Tr 0,86 min, MH+ 432.
Ejemplo 5
1-((2S,4R)-4-((5-doropiridin-2-il)amino)-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-
il)etanona
Se combinaron 1-((2S,4R)-4-amino-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)etanona (para una preparacion, vease el Intermedio 11) (l00mg, 0,304 mmol), 2-bromo-5-cloropiridina (117 mg, 0,609 mmol), Davephos (23,97 mg, 0,061 mmol), Pd2(dba)3 (27,9 mg, 0,030 mmol) y terc-butoxido sodico (58,5 mg, 0,609 mmol) en 1,4-dioxano (3 ml) y la mezcla se desgasifico durante un periodo de 20 min antes de calentarse a 120 °C durante 25 min (microondas). La mezcla de reaccion se repartio entre agua (100 ml) y DCM (3 x 100 ml). Los extractos organicos se combinaron, se secaron (frita hidrofoba) y se evaporaron al vado. El aceite de color pardo residual se disolvio en DMSO (2 x 1 ml) y se purifico por MDAP (HpH x 2). El disolvente se evaporo al vado, dando 1-((2S,4R)-4-((5-cloropiridin-2-il)amino)-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)etanona (51 mg, 0,116 mmol, rendimiento del 38 %) en forma de un vidrio de color amarillo. CLEM (formiato), Tr 0,87 min, MH+ 440.
Ejemplo 6
1 -((2S,4R)-6-(1 -(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-4-((5-metilpiridin-2-il)amino)-3,4-dihidroquinolin-1(2H)- il)etanona
Se combinaron 1-((2S,4R)-4-amino-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)etanona (para una preparacion, vease el Intermedio 7) (100 mg, 0,304 mmol), 2-bromo-5-metilpiridina (105 mg, 0,609 mmol), Davephos (23,97 mg, 0,061 mmol), Pd2(dba)3 (27,9 mg, 0,030 mmol) y terc-butoxido sodico (58,5 mg, 0,609 mmol) en 1,4-dioxano (3 ml) y la mezcla se desgasifico durante un periodo de 20 min. La mezcla se calento a 120 °C durante 25 min (microondas). La mezcla de reaccion se repartio entre agua (100 ml) y DCM (3 x 100 ml). Los extractos organicos se combinaron, se secaron (frita hidrofoba) y se evaporaron al vado. El aceite de color pardo residual se disolvio en DMSO (2 x 1 ml) y se purifico por MDAP (HpH x 2). El disolvente se evaporo al vado, dando 1-((2S,4R)-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-4-((5-metilpiridin-2-il)amino)-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)etanona (49 mg, 0,117 mmol, rendimiento del 38 %) en forma de un vidrio de color amarillo. CLEM (formiato), Tr 0,61 min, MH+ 420.
Ejemplo 7
1 -((2S,4R)-4-((3-clorofenil)amino)-6-(1 -(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-3,4-dihidroqumolm-1(2H)- il)etanona
5
Se combinaron 1-((2S,4R)-4-Amino-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)etanona (para una preparacion, vease el Intermedio 7) (lOomg, 0,304 mmol), 1-bromo-3-dorobenceno (0,072 ml, 0,609 mmol), Davephos (24 mg, 0,061 mmol), Pd2(dba)3 (27,9 mg, 0,030 mmol) y terc-butoxido sodico (58,5 mg, 0,609 mmol) en 1,4-dioxano (3 ml) y la mezcla se desgasifico durante un periodo de 20 min. La mezcla se calento a 10 120 °C durante 25 min (microondas). La mezcla de reaccion se repartio entre agua (100 ml) y DCM (3 x 100 ml). Los
extractos organicos se combinaron, se secaron (frita hidrofoba) y se evaporaron al vado. El aceite de color pardo residual se disolvio en DMSO (2 x 1 ml) y se purifico por MDAP (formiato x 2). El disolvente se evaporo al vado, el residuo se disolvio en DCM y se aplico a un cartucho de sflice (10 g). El cartucho se eluyo con un gradiente de acetato de etilo/ciclohexano (0-100 % sobre 10 VC seguido de mantenimiento en acetato de etilo al 100 % durante 15 5 VC). Las fracciones apropiadas se combinaron y se evaporaron al vado, dando 1-((2S,4R)-4-((3-clorofenil)amino)-
6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)etanona (39 mg, 0,089 mmol, rendimiento del 29 %) en forma de un vidrio incoloro. CLEM (formiato), Tr 1,05 min, MH+ 438.
Ejemplo 8
1-((2S,4R)-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-4-((5-metilpirazin-2-il)amino)-3,4-dihidroquinolin-1(2H)- 20 il)etanona
Se combinaron 1-((2S,4R)-4-Amino-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)etanona (para una preparacion, vease el Intermedio 7) (150 mg, 0,457 mmol), 2-cloro-5-metilpirazina (147 mg, 1,142 mmol), Davephos (71,9 mg, 0,183 mmol), Pd2(dba)3 (84 mg, 0,091 mmol) y terc-butoxido sodico (132 mg, 1,370 mmol) en 25 1,4-dioxano (4 ml) y la mezcla se calento a 120 °C durante 25 min (microondas). La mezcla de reaccion se repartio entre agua (75 ml) y DCM (3 x 75 ml). Los extractos organicos se combinaron, se secaron (frita hidrofoba) y se evaporaron al vado. El aceite de color pardo resultante se disolvio en DMSO (3 x 1 ml) y se purifico por MDAP (formiato x 3). El disolvente se evaporo al vado, dando 1-((2S,4R)-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-4-((5- metilpirazin-2-il)amino)-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)etanona (91 mg, 0,216 mmol, rendimiento del 47%) en forma de 30 un vidrio de color amarillo. CLEM (formiato), Tr 0,75 min, MH+ 421.
Compuesto de referencia A: 2-metil-6-(metiloxi)-4H-3,1-benzoxacm-4-ona
Una solucion de acido 5-metoxiantranflico (Lancaster) (41,8 g, 0,25 mol) se calento a reflujo en anddrido acetico (230 ml) durante 3,5 h antes de concentrarse a presion reducida. Despues, el compuesto en bruto se concentro dos 35 veces en presencia de tolueno antes de filtrarse y lavarse dos veces con eter, produciendo el compuesto del tUulo (33,7 g, rendimiento del 71 %) en forma de un solido de color pardo; CL/EM (Procedimiento D): m/z 192 [M+H]+, Tr 1,69 min.
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Compuesto de referencia B: [2-amino-5-(metiloxi)fenil](4-dorofenil)metanona
A una solucion de 2-metil-6-(metiloxi)-4H-3,1-benzoxacin-4-ona (para una preparation, vease el Compuesto de referencia A) (40,0 g, 0,21 mol) en una mezcla de tolueno/eter (2/1) (760 ml) a 0 °C se anadio le gota a gota una solucion de bromuro de 4-clorofenilmagnesio (170 ml, 1 M en eter dietflico, 0,17 mol). La mezcla de reaction se dejo calentar a temperatura ambiente y se agito durante 1 h antes de inactivarse con HCl 1 N (200 ml). La fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 150 ml) y los extractos organicos combinados se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presion reducida. Despues, el compuesto en bruto se disolvio en etanol (400 ml) y se anadio HCl 6 N (160 ml). La mezcla de reaccion se calento a reflujo durante 2 h antes de concentrarse hasta un tercio en volumen. El solido resultante se filtro y se lavo dos veces con eter antes de suspenderse en EtOAc y neutralizarse con hidroxido sodico 1 N. La fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 150 ml) y los extractos organicos combinados se lavaron con salmuera (150 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presion reducida. El compuesto del trtulo se obtuvo en forma de un solido de color amarillo (39 g, rendimiento del 88 %) CL/EM (Procedimiento D): m/z 262 [M+H]+, Tr 2,57 min.
Compuesto de referencia C: W1-[2-[(4-clorofeml)carboml]-4-(metiloxi)feml]-W2-{[(9W-fluoren-9-
ilmetil)oxi]carbonil}-L-a-asparaginato de metilo
Se disolvio N-{[(9H-fluoren-9-ilmetil)oxi]carbonil}-L- a-aspartil cloruro de metilo (Int. J. Peptide Protein Res. 1992, 40, 13-18) (93 g, 0,24 mol) en CHCh (270 ml) y se anadio [2-amino-5-(metiloxi)fenil](4-clorofenil)metanona (para una preparacion, vease el Compuesto de referencia B) (53 g, 0,2 mol). La mezcla resultante se agito a 60 °C durante 1 h antes de enfriarse y concentrarse al 60 % en volumen. Se anadio eter a 0 °C y el precipitado resultante se filtro y se descarto. El filtrado se concentro a presion reducida y se uso sin purification adicional.
Compuesto de referencia D: [(3S)-5-(4-Clorofenil)-7-(metiloxi)-2-oxo-2,3-dihidro-1W-1,4-benzodiazepm-3- il]acetato de metilo
A una solucion de N1-[2-[(4-clorofenil)carbonil]-4-(metiloxi)fenil]-N2-{[(9H-fluoren-9-ilmetil)oxi]carbonil}-L-a- asparaginato de metilo (para una preparacion, vease el Compuesto de referencia C) (asumidos 0,2 mol) en DCM (500 ml) se le anadio Et3N (500 ml, 3,65 mol) y la mezcla resultante se calento a reflujo durante 24 h antes de concentrarse. La amina en bruto resultante se disolvio en 1,2-DCE (1,5 l) y se anadio cuidadosamente AcOH (104 ml, 1,8 mol). Despues, la mezcla de reaccion se agito a 60 °C durante 2 h antes de concentrarse al vatio y disolverse en dCm. La fase organica se lavo con HCl 1 N y la fase acuosa se extrajo con DCM (x 3). Las fases organicas combinadas se lavaron dos veces con agua, y salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presion reducida. El solido en bruto se recristalizo en MeCN, conduciendo al compuesto del trtulo (51 g) en forma de un solido de color amarillo palido. El filtrado pudo concentrarse y recristalizarse en MeCN, dando 10 g mas del producto deseado Fr = 0,34 (DCM/MeOH:95/5).
EMAR MH+ calculado para C1gH1835CIN2O4 373,0955; observado 373,0957.
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Compuesto de referencia E: [(3S)-5-(4-Clorofeml)-7-(metiloxi)-2-tioxo-2,3-dihidro-1H-1,4-benzodiazepin-3- il]acetato de metilo
Una suspension de P4Si0 (36,1 g, 81,1 mmol) y Na2CO3 (8,6 g, 81,1 mmol) en 1,2-DCE (700 ml) a temperatura ambiente se agito durante 2h antes de anadir [(35)-5-(4-clorofenil)-7-(metiloxi)-2-oxo-2,3-dihidro-1H-1,4- benzodiazepin-3-il]acetato de metilo (para una preparacion, vease el Compuesto de referencia D) (16,8 g, 45,1 mmol). La mezcla resultante se agito a 70 °C durante 2 h antes de enfriarse y filtrarse. El solido se lavo dos veces con DCM y el filtrado se lavo con carbonato acido sodico sat. y salmuera. La fase organica se seco sobre Na2SO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El producto en bruto se purifico por cromatografia ultrarrapida sobre gel de sflice (DCM/MeOH:99/1), proporcionando el compuesto del trtulo (17,2 g, rendimiento del 98%) en forma de un solido de color amarillento. Cl/Em (Procedimiento D): m/z 389 [M(35Cl)+H]+, Tr 2,64 min EMAR MH+ calculado para C1gH1s35CIN2O3S 389,0727; observado 389,0714.
Compuesto de referencia F: [(3S)-2-[(1Z)-2-acetilhidrazmo]-5-(4-clorofeml)-7-(metiloxi)-3W-1,4-benzodiazepm-
3-il]acetato de metilo
A una suspension de [(3S)-5-(4-clorofenil)-7-(metiloxi)-2-tioxo-2,3-dihidro-1H-1,4-benzodiazepin-3-il]acetato de metilo (para una preparacion, vease el Compuesto de referencia E (9,0 g, 23,2 mmol) en THF (300 ml) a 0 °C se le anadio gota a gota hidrazina monohidrato (3,4 ml, 69,6 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 5 h entre 5 °C y 15 °C antes de enfriarse a 0 °C. Despues, se anadio lentamente Et3N (9,7 ml, 69,6 mmol) y se anadio gota a gota cloruro de acetilo (7,95 ml, 69,6 mmol). Despues, la mezcla se dejo calentar a temperatura ambiente durante 16 h antes de concentrarse a presion reducida. El producto en bruto se disolvio en DCM y se lavo con agua. La fase organica se seco sobre Na2SO4, se filtro y se concentro al vado, dando el compuesto del trtulo en bruto (9,7 g, rendimiento del 98 %) que se uso sin purificacion adicional. Fr = 0,49 (DCM/MeOH:90/10).
Compuesto de referencia G: [(4S)-6-(4-clorofeml)-1-metil-8-(metiloxi)-4W-[1,2,4]triazolo[4,3-
a][1,4]benzodiazepin-4-il]acetato de metilo
El [(3S)-2-[(1Z)-2-acetilhidrazino]-5-(4-clorofenil)-7-(metiloxi)-3H-1,4-benzodiazepin-3-il]acetato de metilo en bruto (para una preparacion, vease el Compuesto de referencia F) (asumidos 9,7 g) se suspendio en THF (100 ml) y se anadio AcOH (60 ml) a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se agito a esta temperatura durante 2 dias antes de concentrarse a presion reducida. El solido en bruto se trituro en /-Pr2O y se filtro, dando el compuesto del trtulo (8,7 g, 91 % en 3 etapas) en forma de un solido de color blanquecino.
EMaR MH+ calculado para C21H20CIN4O3 411,1229; observado 411,1245.
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Compuesto de referencia H: Acido [(4S)-6-(4-clorofeml)-1-metM-8-(metMoxi)-4H-[1,2,4]triazolo[4,3-
a][1,4]benzodiazepin-4-il]acetico
A una solucion de [(4S)-6-(4-clorofenil)-1-metil-8-(metiloxi)-4H-[1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]benzodiazepin-4-il]acetato de metilo (para una preparacion, vease el Compuesto de referencia G) (7,4 g, 18,1 mmol) en THF (130 ml) a temperatura ambiente se le anadio hidroxido sodico 1 N (36,2 ml, 36,2 mmol). La mezcla de reaccion se agito a esta temperatura durante 5 h antes de inactivarse con HCl 1 N (36,2 ml) y concentrarse al vado. Despues, se anadio agua y la fase acuosa se extrajo con DCM (x 3) y las fases organicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presion reducida, dando el compuesto del trtulo (7 g, rendimiento del 98 %) en forma de un solido de color amarillo palido.
Compuesto de referencia H: [5-({[(4S)-6-(4-clorofeml)-1-metN-8-(metNoxi)-4H-[1,2,4]triazolo[4,3-
a][1,4]benzodiazepm-4-N]acetN}ammo)pentM]carbamato de 1,1-dimetiletilo
Una mezcla de acido [(4S)-6-(4-clorofenil)-1-metil-8-(metiloxi)-4H-[1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]benzodiazepin-4-il]acetico (para una preparacion, vease el Compuesto de referencia G) (1,09, 2,5 mmol), hAtU (1,9 g, 5 mmol) y DIPEA (0,88 ml, 5 mmol) se agito durante 80 minutos a temperatura ambiente, a esta se le anadio (4-aminobutil)carbamato de 1,1-dimetiletilo (1,05 ml, 5,0 mmol, disponible en Aldrich). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 h antes de concentrarse. El residuo se recogio en diclorometano y se lavo con HCl 1 N. La fase acuosa se extrajo dos veces con diclorometano. Se lavo la fase organica con hidroxido sodico 1 N seguido de una solucion saturada de cloruro sodico, se seco sobre sulfato sodico y se concentro. El residuo se purifico por cromatografia ultrarrapida sobre sflice usando 95/5 de diclorometano/metanol, dando el compuesto del trtulo en forma de un solido de color amarillo (1,2 g). CL/EM (Procedimiento D): Tr = 3,04 min.
Compuesto de referencia J: Trifluoroacetato de N-(5-aminopentil)-2-[(4S)-6-(4-clorofenil)-1-metil-8-(metiloxi)- 4H-[1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]benzodiazepin-4-il]acetamida
A una solucion de [5-({[(4S)-6-(4-clorofenil)-1-metil-8-(metiloxi)-4H-[1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]benzodiazepin-4- il]acetil}amino)pentil]carbamato de 1,1-dimetiletilo (para una preparacion, vease el Compuesto de referencia H) (0,2 g, 0,34 mmol) en diclorometano (3 ml) se le anadio gota a gota acido trifluoroacetico (0,053 ml, 0,68 mmol) a 0 °C. La mezcla de reaccion se agito durante 3 h de 0 °C a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se concentro a sequedad, proporcionando el compuesto del tUulo en forma de un aceite de color amarillo higroscopico (200 mg)
Cl/EM (Procedimiento D): Tr = 2,33 min.
EMAR MH+ calculado para C25H29CIN6O2 481,2119; observado 481,2162.
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Compuesto de referencia K: Mezcla de isomeros 5 y 6 de Alexa Fluor 488-N-(5-aminopentil)-2-[(4S)-6-(4- clorofenil)-1-metil-8-(metiloxi)-4H-[1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]benzodiazepin-4-il]acetamida
Se disolvio trifluoroacetato de N-(5-aminopentil)-2-[(4S)-6-(4-clorofenil)-1-metil-8-(metiloxi)-4H-[1,2,4]triazolo[4,3- a][1,4]benzodiazepin-4-il]acetamida (para una preparation, vease el Compuesto de referencia J) (7,65 mg, 0,013 mmol) en N,N-dimetilformamida (DMF) (300 ^l) y se anadio a succinimidil ester del acido carboxflico Alexa Fluor 488 (5 mg, 7,77 pmol, mezcla de isomeros 5 y 6, disponible en Invitrogen, producto numero A-20100) en un tubo de centrifuga Eppendorf. Se anadio base de Hunig (7,0 pl, 0,040 mmol) y la mezcla se mezclo vorticialmente durante una noche. Despues de 18 h, la mezcla de reaction se evaporo a sequedad y el residuo se disolvio de nuevo en DMSO/agua (50 %, <1 ml total), se aplico a una columna preparativa Phenomenex Jupiter C18 y se diluyo con un gradiente de 95 % de A: 5 % de B a B al 100 % (A = acido trifluoroacetico al 0,1 % en agua, B = TFA al 0,1 %/acetonitrilo al 90 %/agua al 10 %) a un caudal de 10 ml/min durante 150 minutos. Las fracciones impuras se combinaron y se purificaron de nuevo usando el mismo sistema. Las fracciones se combinaron y se evaporaron, produciendo el producto del trtulo (2,8 mg) en forma de una mezcla de los 2 regioisomeros mostrados. CL/EM (Procedimiento F):, MH+ = 999, tr = 1,88 min.
Procedimientos de ensayo biologico
Ensayo de unido por anisotropia de fluorescencia
La union de los compuestos de formula (I) a Bromodominio BRD2, BRD3 y BRD4 se puede valorar usando un Ensayo de Union por Anisotropia de Fluorescencia.
Se incuban juntos la protema de Bromodominio, el ligando fluorescente (compuesto de referencia K vease anteriormente) y una concentration variable de compuesto de ensayo para alcanzar el equilibrio termodinamico bajo condiciones de modo que la ausencia de compuesto de ensayo el ligando fluorescente este significativamente (>50 %) unido y en presencia de una concentracion suficiente de un inhibidor potente la anisotropia del ligando fluorescente no unido sea apreciablemente diferente del valor del unido.
Todos los datos se normalizaron a la media de 16 de altos pocillos control y 16 bajos en cada placa. A continuation, se aplico un ajuste de curva de cuatro parametros de la siguiente forma:
en la que "a” es el mmimo, "b” es la pendiente Hill, "c” es pICso y "d” es el maximo.
Se expresaron Bromodominios Humanos Recombinantes (Bromodominio BRD2 (1-473), Bromodominio BRD3 (1435) y Bromodominio BRD4 (1-477)) en celulas de E. coli (en el vector pET15b) con una etiqueta de 6-Histidina (6- His Tag) en el N-terminal. El bromodominio marcado con Histidina se extrae de las celulas de E. coli usando 0,1 mg/ml de lisozima y sonicacion. A continuacion, se purifico el bromodominio mediante cromatografia de afinidad en una columna HP HisTRAP, eluyendo con un gradiente de imidazol 10-500 Mm lineal, sobre 20 Cv. Se completo la purification adicional por columna de exclusion por tamano de Superdex 200 prep grade. La protema purificada se almaceno a -80 °C en HEPES 20 mM pH 7,5 y NaCl 100 mM.
Protocolo para Bromodominio BRD2: Todos los componentes se disolvieron en composition tampon de HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mm y CHAPS 0,5 mM con concentraciones finales de Bromodominio 2, 75 nM, ligando fluorescente 5 nM. Se anadieron 10 pl de esta mezcla de reaccion usando un micro multidrop a pocillos que conteman 100 nl de diversas concentraciones de compuesto de ensayo o vehiculizante DMSO (1 % final) en placa de microtitulacion (microtiter) de bajo volumen negra de 384 pocillos Greiner y se calibro en oscuridad 60 min a temperatura ambiente. La anisotropia de fluorescencia se leyo en Envision (Aex = 485 nm, AEM = 530 nm; Dicroico - 505 nM).
Protocolo para Bromodominio BRD3: Todos los componentes se disolvieron en tampon de composicion HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mm y CHAPS 0,5 mM con concentraciones finales de Bromodominios 3 75 nM, ligando fluorescente 5 nM. Se anadieron 10 pl de esta mezcla de reaccion usando un micro multidrop a pocillos que
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conteman 100 nl de diversas concentraciones de compuesto de ensayo o vehiculizante DMSO (1 % final) en placa de microtitulacion (microtiter) de bajo volumen negra de 384 pocillos Greiner y se calibro en oscuridad 60 min a temperatura ambiente. La anisotrc^a de fluorescencia se leyo en Envision (Aex = 485 nm, AEM = 530 nm; Dicroico - 505 nM).
Protocolo para Bromodominio BRD4: Todos los componentes se disolvieron en tampon de composicion HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mm y CHAPS 0,5 mM con concentraciones finales de Bromodominio 4 75 nM, ligando fluorescente 5 nM. Se anadieron 10 pl de esta mezcla de reaccion usando un micro multidrop a pocillos que conteman 100 nl de diversas concentraciones del compuesto de ensayo o vehiculizante DMSO (1 % final) en placa de microtitulacion (microtiter) de bajo volumen negra de 384 pocillos Greiner y se calibro en oscuridad 60 min a temperatura ambiente. La anisotropfa de fluorescencia se leyo en Envision (Aex = 485 nm, AEM = 530 nm; Dicroico - 505 nM).
Se ensayo el Ejemplo 1 en uno o mas de los ensayos anteriores y se encontro que tema un pIC50 > 6,5.
Ensayo de transferencia de energia por resonancia de fluorescencia resuelta en tiempo (TR-FRET)
La union de los compuestos de formula (I) a Bromodominios BRD2, BRD3 y BRD4 se valoro usando un ensayo de union por transferencia de energfa de resonancia fluorescente resuelta en tiempo, que mide la union de un peptido de histona acetilada a la protema del bromodominio.
Se incuban juntos la protema de bromodominio, el peptido de histona y una concentracion variable de compuesto de ensayo para alcanzar el equilibrio termodinamico. El ensayo se configura de modo que en ausencia de compuesto de ensayo el bromodominio y el peptido esten significativamente unidos (~30 %) y en presencia de una concentracion suficiente de un inhibidor potente esta interaccion este interrumpida conduciendo a una bajada apreciable en la transferencia de energfa por resonancia fluorescente.
Peptido de histona:
H-Ser-Gly-Arg-Gly-Lys(Ac)-Gly-Gly-Lys(Ac)-Gly-Leu-Gly-Lys(Ac)-Gly-Gly-Ala-Lys(Ac)-Arg-His-Gly-Ser-Gly-Ser-
Lys(Biotina)-OH. 3TFA
El peptido protegido se monto sobre un sintetizador de fase solida usando resina Wang precargada y utilizando protocolos de smtesis de Fmoc estandares. Se protegio la lisina C-terminal mediante un hiper grupo labil de acido que permite su separacion selectiva en el extremo del montaje y union de la biotina. El peptido en bruto se obtuvo despues de la escision de la resina con una mezcla de acido trifluoroacetico (TFA), triisopropilsilano y agua (95:2,5:2,5) durante 3 h a temperatura ambiente y, a continuacion, se purifico usando una columna de fase inversa C18 utilizando un gradiente de agua/acetonitrilo tamponado con TFA al 0,1 %. Se analizaron las fracciones resultantes y las fracciones que eran puras a >95 % mediante HPLC analftica y que daban el pm correcto (mediante espectroscopia de masa MALDITOF) se juntaron y se liofilizaron. El material final se analizo mediante HPLC para confirmar la pureza.
Produccion de protema: Se expresaron Bromodominios Humanos Recombinantes (BRD2 (1-473), BRD3 (1-435) y BRD4 (1-477)) en celulas de E. coli (en el vector pET15b) con una etiqueta de 6-Histidina (6-His tag) en el N- terminal. El bromodominio marcado con Histidina se extrajo de las celulas de E. coli usando sonicacion y se purifico usando una columna de sefarosa de mquel 6FF, las protemas se lavaron y, a continuacion, se eluyeron con Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, p-mercaptoetanol 1 mM e imidazol 20 mM. La purificacion adicional se realizo mediante cromatograffa de afinidad sobre una columna HP HisTRAP, eluyendo con un gradiente lineal de cloruro de sodio 0-500 mM, sobre 20 volumenes de columna. La purificacion final se completo por columna de exclusion por tamano Superdex 200 prep grade. La protema purificada se almaceno a -80 °C en HEPES 20 mM pH 7,5 y NaCl 100 Mm. La identidad de protema se confirmo mediante identificacion por huella de masa de peptido y el peso molecular previsto se confirmo por espectrometna de masa.
Protocolo para ensayos de Bromodominio BRD2, 3 y 4: Todos los componentes del ensayo se disolvieron en una composicion tampon de HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 50 mM y CHAPS 0,5 mM. La concentracion final de las protemas de bromodominio eran de 100 nM y el peptido de histona era de 300 nM, estos componentes estan premezclados y se dejaron equilibrarse durante 1 hora en oscuridad. Se anadieron 8 pl de esta mezcla de reaccion a todos los pocillos que conteman 50 nl de diversas concentraciones de compuestos de ensayo o vehiculizante DMSO (final al 0,5 %) en placas de microtitulacion (microtiter) de bajo volumen negra de 384 pocillos Greiner y se incubo en oscuridad durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron 2 pl de la mezcla de investigacion que contema anticuerpo marcado anti-6his XL665 y estreptavidina marcada con criptato de europio a todos los pocillos y se realizo una incubacion en oscuridad adicional de al menos 30 min. A continuacion, las placas se leyeron en el lector de placa Envision, (Aex = 317 nm, AEM donante = 615 nm; AEM aceptor = 665 nm; LANCE dual dicroico). Se realizaron mediciones de la intensidad fluorescente resuelta en tiempo a ambas longitudes de onda de emision y se calculo la proporcion de aceptor/donante y se uso para el analisis de datos. Todos los datos se normalizaron a la media de 16 pocillos control altos y 16 bajos en cada placa. A continuacion, se aplico un ajuste de curva de cuatro parametros de la siguiente forma:
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en la que "a” es el mmimo, "b” es la pendiente Hill, "c” es pIC50 y "d” es el maximo.
Se ensayaron los Ejemplos 2-8 en cada uno de los ensayos anteriores y se encontro que teman pIC50s en el intervalo de 6,5-7,2. Se encontro que el Ejemplo 2 tenia pic50 en el intervalo de 6,9-7,2 en cada uno de los ensayos anteriores.
Medicion de la secrecion de IL-6 inducida por LPS a partir de la sangre total
La activacion de monocitos mediante agonistas de receptores tipo toll tales como lipopolisacaridos (LPS) bacterianos dan como resultado la production de mediadores inflamatorios claves incluyendo IL-6. Ampliamente se considera que tales rutas son fundamentales a la patofisiologia de una variedad de trastornos autoinmunes e inflamatorios.
Se diluyeron los compuestos a ensayar para dar un intervalo de concentraciones apropiadas de las cuales se anadieron ^l de los stocks diluidos a una placa de 96 pocillos. Despues de la adicion de la sangre total (130 ^l) se incubaron las placas a 37 grados (CO2 al 5%) durante 30 min antes de la adicion de 10 ^l de 2,8 ^g/ml de LPS, diluido en RPMI 1640 completo (concentration final = 200 ng/ml), para dar un volumen total de 140 ^l por pocillo. Despues de incubation adicional durante 24 horas a 37 grados, se anadieron 140 ^l de PBS a cada pocillo. Las placas se sellaron, se agitaron durante 10 minutos y a continuation se centrifugaron (2.500 rpm x 10 min). Se separaron 100 ^l del sobrenadante y se analizaron los niveles de IL-6 mediante inmunoensayo (generalmente por Meso Scale Discovery technology) o bien inmediatamente o despues de almacenamiento a -20 grados. Las curvas de la respuesta de concentracion para cada compuesto se generaron a partir de los datos y se calculo un valor IC50.
Se ensayaron los Ejemplos 1-8 en el ensayo anterior y se encontro que teman pIC50s en el intervalo de 6,0-6,9. El Ejemplo 2 se encontro que tenia un pIC50 de 6,7 en el ensayo anterior.
Modelo de endotoxemia en raton in vivo
Altas dosis de endotoxina (lipopolisacarido bacteriano) administrado a animales producen un smdrome de shock intenso incluyendo una fuerte respuesta inflamatoria, desregulacion de la funcion cardiovascular, fallo de organo y finalmente mortalidad. Este patron de respuesta es muy similar a la sepsis humana y al shock septico, donde la respuesta del cuerpo a una infection bacteriana significante puede estar del mismo modo amenazando la vida.
Para ensayar los compuestos para su uso en la invencion se da a grupos de ochos ratones macho Balb/c una dosis letal de 15 mg/kg de LPS por inyeccion intraperitoneal. Noventa minutos despues, se medican los animales intravenosamente con vehiculizante (ciclodextrina al 20 %, etanol al 1 % en agua de apirogena) o compuesto (10 mg/kg). Se hace un seguimiento de la supervivencia de los animales a los 4 dias.
Ensayo del crecimiento celular de oncologia
Se cultivaron lmeas celulares humanas (n = 33 comprendiendo 15 lmeas de hemoglobina, 14 lmeas de celulas de pecho y 4 de otras lmeas celulares) en RPMI-1640 que contema suero bovino fetal al 10 %, se sembraron en placa 1.000 celulas viables por pocillo en placas de poliestireno de fondo plano negras de 384 pocillos (Greiner N°781086) en 48 ^l de medios de cultivo. Todas las placas se colocaron en CO2 al 5%, 37 °C durante la noche. Al dia siguiente se recogio una placa con CellTiter-Glo (CGT, Promega N°G7573) para una medicion a tiempo igual a 0 (TO) y se anadio el compuesto (20 titulacion puntual desde 14,7 ^M a 7 pM) a las placas restantes. La concentracion final de DMSO en todos los pocillos era de 0,15 %. Las celulas se incubaron durante 72 horas o el tiempo indicado y cada placa se mostro con reactivo CellTiter-Glo usando un volumen equivalente al volumen de cultivo celular en los pocillos. Las placas se agitaron durante aproximadamente 2 minutos y la senal quimioluminiscente se leyo en el Analyst GT (Molecular Devices) o lector de placa EnVision (Perkin Elmer).
Los resultados se expresaron como porcentaje del T0 y se trazaron frente a la concentracion de compuesto. El valor T0 se normalizo al 100 % y representa el numero de celulas en el momento de la adicion del compuesto y los datos de respuesta de concentracion se ajustaron con un ajuste de curva de 4 parametros usando el programa informatico XLfit (modelo 205). La concentracion que presento crecimiento celular por el 50 % (gIC50) es el punto medio de la "ventana de crecimiento” (entre el T0 y DMSO control). El valor Ymin-T0 se determina mediante la resta del valor T0 (100 %) al valor Ymin (%) determinado a partir del ajuste de la curva de respuesta de concentracion. Los valores de los pocillos sin celulas se restaron de todas las muestras para correction del ruido de fondo.
Medicion de celulas infectadas por HPV
El clon de celula W12 N°20850, derivado de un carcinoma cervical de bajo grado (Stanley y col., Int. J. Cancer. V. 43. P.672-676. 1989), lleva genomas HPV16 episomales, mantenidos en aproximadamente 100 copias por celula. Se uso la lmea celular epitelial C33A, que no estaba infectada con ninguna cepa de HPV como celula control negativo para valorar la citotoxicidad no espetifica.
Se cultivaron celulas W12 y C33A con el compuesto del Ejemplo 2 durante 2 dfas y se hizo un seguimiento del contenido celular viable mediante la valoracion [ATP] al final de este periodo. Los datos se normalizaron a las celulas tratadas control con DMSO en el dfa 2.
El compuesto redujo la viabilidad de la celula W12 de una manera dependiente de concentracion (valor de pIC50 5 medio de 7,09 ± 0,14, n=4) (con efecto limitado sobre las celulas control negativas C33A). La viabilidad a la maxima concentracion ensayada (3 jM) era de 34,8 % y 73,5 % en celulas W12 y C33A respectivamente. Estos datos muestran un efecto espedfico sobre las celulas vmcamente infectadas y por lo tanto esos compuestos de la invencion pueden tener utilidad en el tratamiento de celulas epiteliales infectadas por HPV.
Claims (15)
- 51015202530REIVINDICACIONES1. Un compuesto de formula (I) o una sal del mismo
imagen1 en la queP es pirazolilo o triazolilo;R1 es un grupo seleccionado entre fenilo, piridilo, pirazinilo y pirimidinilo, estando dichos grupos opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes seleccionados entre halogeno, alquilo C1-4 y CN;R2 es alquilo C1-4;R3 es alquilo C1-4;R5 es H o alquilo C1-4;R6 es alquilo C1-4;o R5 y R6, junto con el O al que R6 esta unido, forman un anillo oxetanilo, tetrahidrofuranoflo o tetrahidropiranilo; m es 1 o 2. - 2. Un compuesto, o una sal del mismo, de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que P es un grupo
- 3. Un compuesto, o una sal del mismo, de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que P es un grupo seleccionado entre
imagen2 1 - 4. Un compuesto, o una sal del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que R se selecciona entre
imagen3 2 - 5. Un compuesto, o una sal del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en el que R es metilo.
- 6. Un compuesto, o una sal del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en el que R3 es metilo.
- 7. Un compuesto, o una sal del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en el que m es 1.
- 8. Un compuesto, o una sal del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7, en el que R5 es hidrogeno.510152025
- 9. Un compuesto, o una sal del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, en el que R6 es metilo.
- 10. Un compuesto, o una sal del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, en el que el compuesto de formula (I) es el enantiomero (2S, 4R).
- 11. Un compuesto que se selecciona entre((2S,4R)-1-acetil-2-metil-6-{1-[2-(metiloxi)etil]-1H-pirazol-4-il}-1,2,3,4-tetrahidro-4-quinolinil)carbamato de 1 -metiletilo; 6-(((2S,4r)-1 -acetil-6-(1-(2-metoxietil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo; 6-(((2S,4R)-1-acetil-6-(2-(2-metoxietil)-2H-1,2,3-triazol-4-il)-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo; 1-((2s,4R)-4-((5-cloropiridin-2-il)amino)-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-ilo);1 -((2S,4r)-6-(1 -(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-4-((5-metilpiridin-2-il)amino)-3,4-dihidroquinolin-1(2H)- il)etanona;1-((2S,4R)-4-((3-clorofenil)amino)-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-ilo); y1-((2S,4R)-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-4-((5-metilpirazin-2-il)amino)-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)etanona;6-(((2S,4R)-1-acetil-6-(1-(2-metoxietil)-1H-pirazol-4-il)-2-metil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)amino)nicotinonitrilo o una sal del mismo.
- 12. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 11, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
- 13. Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo como el definido en la reivindicacion 11 y uno o mas vehfculos, diluyentes o excipientes farmaceuticamente aceptables.
- 14. Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo como se define en la reivindicacion 12 para su uso en terapia.
- 15. Un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo como se define en la reivindicacion 12 para su uso en el tratamiento de cancer o una afeccion autoinmune y/o inflamatoria cronica.
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