ES2589706T3

ES2589706T3 - Agente inductor de inmunidad

Info

Publication number: ES2589706T3
Application number: ES12786721.6T
Authority: ES
Inventors: Akira Kurihara; Fumiyoshi Okano
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2016-11-15
Anticipated expiration: 2032-05-18
Also published as: RU2634862C2; CA2836556A1; US20160106823A1; JPWO2012157736A1; AU2012256756A1; EP2711015B1; KR101988895B1; BR112013029596B1; CA2836556C; BR112013029596A2; JP5954175B2; EP2711015A1; US10537623B2; DK2711015T3; AU2012256756B2; CN103547278A; WO2012157736A1; RU2013156409A; CN103547278B; EP2711015A4

Abstract

Un agente inductor de inmunidad para su uso en un metodo de tratamiento medico o veterinario, comprendiendo el agente inductor de inmunidad, como principio o principios activos eficaces, al menos un polipeptido que tiene actividad inductora de inmunidad seleccionado de los polipeptidos (a) y (b 5 ), a continuacion: (a) un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las secuencias de aminoacidos SEQ ID NO: 4, 2, 22 y 24; (b) un polipeptido que tiene una identidad de secuencia no inferior al 85 % con el polipeptido (a).

Description

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0,001 µg a 1000 µg por animal sujeto al día. El agente puede administrarse una vez, o dividida en varias veces. El agente se administra, preferentemente, dividido en varias veces, cada varios días a varios meses. Como se muestra concretamente en los ejemplos a continuación, el agente inductor de inmunidad de la presente invención puede causar la regresión de un tumor ya producido. Por lo tanto, puesto que el agente puede ejercer su actividad contra el

5 cáncer también contra un pequeño número de células de cáncer en una etapa temprana, el desarrollo o recurrencia del cáncer se puede prevenir mediante el uso del agente antes del desarrollo de cáncer o después del tratamiento para el cáncer. Es decir, el agente inductor de inmunidad de la presente invención es eficaz tanto para el tratamiento como para la profilaxis del cáncer.

El agente inductor de inmunidad de la presente invención puede contener solamente un polipéptido o puede formularse mezclándose según sea apropiado con un aditivo, tal como un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado para cada modo de administración. Los métodos y aditivos de formulación que pueden usarse son bien conocidos en el campo de la formulación de productos farmacéuticos y se puede usar cualquiera de los métodos y aditivos. Ejemplos específicos de los aditivos incluyen, sin limitaciones a los mismos,

15 diluyentes, tales como soluciones fisiológicas tampón; vehículos, tales como azúcar, lactosa, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbitol y glicina; aglutinantes, tales como jarabe, gelatina, goma arábiga, sorbitol, cloruro de polivinilo, y tragacanto; y lubricantes, tales como estearato de magnesio, polietilenglicol, talco, y sílice. Ejemplos de la formulación incluyen preparados orales, tales como comprimidos, cápsulas, gránulos, polvos, y jarabe, y preparados parenterales, tales como inhaladores, preparados para inyección, supositorios, y soluciones. Estas formulaciones se pueden preparar mediante métodos de producción conocidos habitualmente.

El agente inductor de inmunidad de la presente invención se puede usar en combinación con un potenciador inmunológico capaz de aumentar la respuesta inmunitaria en un cuerpo vivo. El potenciador inmunológico puede estar contenido en el agente inductor de inmunidad de la presente invención o administrarse como una composición

25 separada a un paciente en combinación con el agente inductor de inmunidad de la presente invención.

Entre los ejemplos del potenciador inmunológico se incluyen adyuvantes. Los adyuvantes pueden aumentar la respuesta inmunitaria proporcionando un reservorio de antígeno (extracelularmente o dentro de macrófagos), activando macrófagos y estimulando conjuntos específicos de linfocitos, mejorando así la respuesta inmunitaria y, por lo tanto, la acción contra el cáncer. Por lo tanto, especialmente en los casos en que el agente inductor de inmunidad de la presente invención se usa para el tratamiento y/o profilaxis del cáncer, el agente inductor de inmunidad comprende, preferentemente, un adyuvante, además del polipéptido anteriormente descrito anteriormente como ingrediente eficaz. En la técnica se conocen bien muchos tipos de adyuvantes y se puede usar cualquiera de estos adyuvantes. Ejemplos específicos de MPL incluyen (SmithKline Beecham), homólogos del lipopolisacárido Re 35 595 de Salmonella minnesota obtenido por purificación e hidrólisis ácida del lipopolisacárido; QS21 (SmithKline Beecham), saponina QA–21 pura purificada a partir de un extracto de Quillja saponaria; DQS21 descrito en la solicitud PCT WO 96/33739 (SmithKline Beecham); QS–7, QS–17, QS–18 y QS–L1 (So y 10 colaboradores, "Molecules and cells", 1997, Vol. 7, p. 178–186); adyuvante incompleto de Freund; adyuvante completo de Freund; vitamina E; Montanide; alumbre; oligonucleótido CpG (véase, por ejemplo, Kreig y 7 colaboradores, Nature, Vol. 374, pág. 546–549); poi–I:C y derivado del mismo (por ejemplo, poli ICLC); y diversas emulsiones de agua en aceite preparadas a partir de aceites biodegradables, tales como escualeno y/o tocoferol. Entre éstos, se prefieren adyuvante incompleto de Freund; Montanide; poli-I: C y derivados del mismo; y oligonucleótidos CpG. La relación de mezcla entre el adyuvante descrito anteriormente y el polipéptido es normalmente de aproximadamente 1:10 a 10:1, preferentemente de aproximadamente 1:5 a 5:1, más preferentemente de aproximadamente 1:1. Sin embargo,

45 el adyuvante no se limita a los ejemplos descritos anteriormente y también se pueden utilizar adyuvantes conocidos en la técnica distintos de los descritos anteriormente cuando se administra el agente inductor de inmunidad de la presente invención (véase, por ejemplo, Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2ª edición", 1986). Métodos de preparación de mezclas o emulsiones de un polipéptido y un adyuvante son bien conocidos por los expertos en la técnica de la vacunación.

Adicionalmente, además de los adyuvantes descritos anteriormente, los factores que estimulan la respuesta inmunitaria del sujeto se pueden utilizar como el potenciador inmunitario descrito anteriormente. Por ejemplo, se pueden usar diversas citocinas que tienen una propiedad para estimular linfocitos y/o células presentadoras de antígeno como potenciador inmunitario en combinación con el agente inductor de inmunidad de la presente

55 invención. Los expertos en la técnica conocen un número de tales citocinas capaces de potenciar la respuesta inmunitaria y entre los ejemplos de las citocinas se incluyen, pero no se limitan a las mismas, interleucina-12 (IL-12), GM-CSF, IL-18, interferón–α, el interferón–β, interferón–ω, interferón–ω y el ligando de Flt3, que se ha demostrado que potencian la acción profiláctica de las vacunas. Tales factores también pueden usarse como el potenciador inmunitario descrito anteriormente y pueden estar contenidos en el agente inductor de inmunidad de la presente invención o se pueden preparar como una composición separada que debe administrarse a un paciente en combinación con el agente inductor de inmunidad de la presente invención.

Poniendo en contacto el polipéptido descrito anteriormente con células presentadoras de antígeno in vitro, las células presentadoras de antígeno se pueden hacer para presentar el polipéptido. Es decir, los polipéptidos (a) a (c) 65 descritos anteriormente se pueden utilizar como agentes para el tratamiento de las células presentadoras de antígeno. Entre los ejemplos de las células presentadoras de antígeno que se pueden usar preferentemente se

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vacuna génica.

El vector utilizado para la producción de la vacuna del gen no está restringido, siempre que sea un vector capaz de expresar el polipéptido en una célula del animal sujeto (preferentemente en una célula de mamífero), y puede ser o 5 bien un vector plasmídico o un vector viral, y se puede usar cualquier vector conocido en el campo de las vacunas de genes. El polinucleótido tal como ADN o ARN que codifica el polipéptido descrito anteriormente se puede preparar fácilmente como se mencionó anteriormente mediante un método convencional. La incorporación del polinucleótido en el vector puede llevarse a cabo utilizando un método bien conocido para los expertos en la técnica.

La vía de administración de la vacuna genética es, preferentemente, una ruta parenteral tal como administración intramuscular, subcutánea, intravenosa o administración intraarterial. La dosis puede seleccionarse apropiadamente dependiendo del tipo de antígeno y similares, y es habitualmente de aproximadamente 0,1 µg a 100 mg, preferentemente de aproximadamente 1 µg a 10 mg en términos del peso de la vacuna génica por kg de peso corporal.

15 Entre los ejemplos del método que usan un vector de virus se incluyen aquellos en los que un polinucleótido que codifica el polipéptido descrito anteriormente se incorpora en un virus de ARN o virus de ADN, tal como un retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus herpes, virus vacunal, virus de la viruela, poliovirus o virus Sindbis, y, después, se infecta a un sujeto con el virus resultante. Entre estos métodos, los que utilizan un retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus vacunal o similar son especialmente preferentes.

Entre los ejemplos de otros métodos se incluyen un método en el que un plásmido de expresión se administra directamente por vía intramuscular (método de vacuna de ADN), y el método de liposomas, método de lipofectina, método de microinyección, método de fosfato de calcio y método de electroporación. El método de la vacuna de

25 ADN y el método de liposomas son especialmente preferentes.

Los métodos para hacer que el gen que codifica el polipéptido descrito anteriormente utilizados en la presente invención actúe realmente como producto farmacéutico incluyen métodos in vivo en los que el gen se introduce directamente en el cuerpo, y métodos ex vivo en los que un cierto tipo de células se recogen del animal sujeto y el gen se introduce después las células ex vivo, seguido de la devolución de las células al cuerpo (Nikkei Science, 1994, abril, pág. 20-45; The Pharmaceutical Monthly, 1994, Vol. 36, No. 1, pág. 23–48; Experimental Medicine, Edición extra, 1994, Vol.12, n.º 15; y las referencias citadas en estas literaturas, y similares. Son preferentes los métodos in vivo.

35 En los casos en que el gen se administra por un método in vivo, el gen puede administrarse a través de una vía de administración apropiada dependiendo de la enfermedad a tratar, los síntomas y similares. El gen se puede administrar, por ejemplo, administración intravenosa, intraarterial, subcutánea o intramuscular. En los casos en que el gen se administra por un método in vivo, el gen puede formularse en una preparación tal como una solución, y en general, se formula en una solución de inyección o similar que contiene el ADN que codifica el péptido anteriormente descrito de la presente invención como ingrediente eficaz. Un vehículo de uso habitual también se puede añadir a la misma según se requiera. En los casos de un liposoma de liposomas de membrana de fusión (liposoma de virus Sendai (HVJ) o similares) que contiene el ADN, el liposoma se puede formular en una preparación de liposomas tal como una suspensión, la preparación congelada o la preparación congelada concentrada de forma centrífuga.

45 En la presente invención, "la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 1" incluye no solo la secuencia de bases real de la SEQ ID NO: 1, sino también la secuencia complementaria de la misma. Por lo tanto, "el polinucleótido que tiene la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 1" incluye el polinucleótido monocatenario que tiene la secuencia de bases real de la SEQ ID NO: 1, el polinucleótido monocatenario que tiene la secuencia de bases complementaria a la misma, y el polinucleótido bicatenario compuesto por estos polinucleótidos monocatenarios. Cuando se prepara un polinucleótido que codifica el polipéptido usado en la presente invención, una cualquiera de estas secuencias de bases se selecciona apropiadamente, y los expertos en la técnica pueden llevar a cabo la selección fácilmente.

Ejemplos

55 La presente invención se describirá a continuación con más detalle mediante los ejemplos.

Ejemplo 1: Obtención de una nueva proteína antigénica del cáncer mediante el método SEREX

(1) Preparación de biblioteca de ADNc

El ARN total se extrajo del tejido testicular de un perro mediante el método de ácido-guanidinio-fenolcloroformo y el ARN poli (A) se purificó usando el kit de purificación de ARNm Oligotex-dT3 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) de acuerdo con los protocolos incluidos en el kit.

65 La biblioteca de fagos de ADNc se sintetizó utilizando el ARNm obtenido (5 µg). Para la preparación de una biblioteca de fagos de ADNc se usaron el kit de síntesis de ADNc, kit de síntesis ZAP-cDNA y el kit ZAP-cDNA

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Gigapacklll Gold Cloning Kit (fabricado de STRATAGENE) de acuerdo con los protocolos incluidos en los kits. El tamaño de la biblioteca de fagos de ADNc preparada era 1 × 106 ufp/ml.

(2) Detección selectiva de la biblioteca de ADNc con suero

5 La detección selectiva inmunológica se llevó a cabo utilizando la biblioteca de fagos de ADNc preparada de este modo. En concreto, las células huésped E. coli (XL1–Blue MRF') se infectaron con la biblioteca de modo que 2.340 clones aparecieron en una placa de agarosa NZY con un tamaño de 90 mm diam. × 15 mm, y se cultivaron a 42 ºC durante de 3 a 4 horas para permitir que los fagos formaran placas. La placa se cubrió con la membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: fabricada por GE Healthcare Bio-Science) impregnada con IPTG (isopropil-β-Dtiogalactósido) a 37 ºC durante 4 horas para inducir y expresar proteínas y las proteínas se transfirieron a la membrana. Posteriormente, la membrana se recuperó y se sumergió en TBS (Tris-HCI 1 mM, NaCI 15 mM, pH 7,5) suplementado con 0,5 % de leche desgrasada seca. A continuación, la membrana se agitó a 4 ºC durante la noche para suprimir las reacciones no específicas. Después, se dejó que este filtro reaccionara con suero de paciente

15 canino diluido 500 veces a temperatura ambiente durante de 2 a 3 horas.

Como suero del paciente canino descrito anteriormente se utilizó el suero recogido de un paciente canino con un tumor perianal. El suero se almacenó a -80 ºC y se trató previamente inmediatamente antes de usar. El método de pretratamiento de suero fue el siguiente. Es decir, el huésped E. coli (XL1–Blue MRF') se infectó con el fago λ ZAP Express que no tiene ningún gen extraño insertado y, después, se cultivó en medio de placa NZY a 37 ºC durante la noche. Posteriormente, a la placa se añadió tampón NaHCO3 0,2 M (pH 8,3) suplementado con NaCl 0,5,5M y la placa se dejó en reposo a 4 ºC durante 15 horas, seguido de la recuperación del sobrenadante como un extracto de

E. coli/fago. A continuación, el extracto de E. coli/fago recogido se pasó a través de una columna de NHS (fabricada por GE Healthcare Bio-Science) para inmovilizar las proteínas derivadas de E. coli/fago sobre la misma. El suero del

25 paciente canino se pasó a su través y se hizo reaccionar con esta columna de proteína inmovilizada para eliminar los anticuerpos que se adsorben en E. coli y/o el fago. La fracción de suero que se pasó a través de la columna se diluyó 500 veces con TBS suplementado con leche desgrasada seca al 0,5 %, y el diluyente resultante se utilizó como material para la inmunoselección.

La membrana sobre la cual se transfirió dicho suero tratado y la proteína de fusión descrita anteriormente se transfirió y se lavó 4 veces con TBS-T (0,05 % de Tween 20/TBS), y se hizo reaccionar con IgG de cabra anti-perro (conjugado de IgG-h de cabra anti-perro +I HRP: fabricado por BETHYL Laboratories) diluido 5.000 veces con TBS suplementado con 0,5 % de leche desgrasada seca como anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de detección mediante reacción de coloración enzimática usando una solución de reacción NBT/BCIP

35 (fabricada por Roche). Las colonias en las posiciones correspondientes a los sitios positivos a la reacción de coloración se recuperaron de la placa con agarosa NZY que tiene un tamaño de 90 mm de diámetro. × 15 mm y se disolvieron en 500 µl de tampón SM (NaCl 100 mM, MgClSO4 10 mM, Tris–HCl 50 mM, 0,01 % de gelatina; pH 7,5). La detección selectiva se repitió como la segunda y tercera detección selectiva de la misma manera que se ha descrito anteriormente hasta que se obtuvo una sola colonia positiva a la reacción de coloración. El aislamiento del único clon positivo se logró después de la detección selectiva de 9110 clones de fagos reactivos con IgG en el suero.

(3) Búsqueda de homología de secuencia del gen del antígeno aislado

45 Con el fin de someter el único clon positivo aislado mediante el método descrito anteriormente a análisis de la secuencia de bases se llevó a cabo una operación de conversión del vector de fagos en un vector plasmídico. Más específicamente, 200 µl de una solución preparada de tal forma que E. coli huésped (XL1–Blue MRF') estaba contenida a una absorbancia de DO600 de 1,0 se mezcló con 100 µl de la solución de fago purificado y también 1 µl del fago colaborador ExAssist (fabricado por STRATAGENE), y después se dejó que la reacción progresara a 37 ºC durante 15 minutos. A esto le siguió la adición de 3 ml de medio LB a la mezcla de reacción, y el cultivo se realizó con la mezcla resultante a 37 ºC durante 2,5 a 3 horas. El cultivo resultante se incubó inmediatamente en un baño de agua a 70 ºC durante 20 minutos. Después, el cultivo se centrifugó a 4 ºC a 1.000 × g durante 15 minutos, y el sobrenadante se recuperó como una solución de fagemido. Posteriormente, 200 µl de una solución preparada de tal manera que el huésped fagemido E. coli (SOLR) estaba contenido a una absorbancia DO600 de 1,0 se mezcló con

55 10 µl de una solución de fago purificado, y la reacción se dejó proceder a 37 ºC durante 15 minutos. A partir de entonces, 50 µl de la mezcla de reacción se sembraron en placas con medio agar LB suplementado con ampicilina (concentración final: 50 µg/ml), y el cultivo se llevó a cabo a 37 °C durante la noche. Se recuperó una sola colonia de la SOLR transformado y se cultivó en medio LB suplementado con ampicilina (concentración final: 50 µg/ml) a 37 °C, seguido de purificación de ADN plásmido que tiene el inserto de interés usando el kit QIAGEN Plasmad Miniprep Kit (fabricado por Qiagen).

El plásmido purificado se sometió a análisis de la secuencia de longitud completa del inserto por el método de paseo con cebador utilizando el cebador T3 de la SEQ ID NO: 7 y el cebador T7 de la SEQ ID NO: 8. Mediante este análisis de secuencias, se obtuvo la secuencia del gen de la SEQ ID NO: 1. Usando la secuencia de bases y la 65 secuencia de aminoácidos de este gen, la búsqueda de homología frente a genes conocidos se llevó a cabo usando un programa de búsqueda de homología BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Como resultado, se reveló

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que el gen obtenido es el gen de SCD1. La SCD1 humana, que es un factor homólogo humano de SCD1 de perro, tenía una identidad de secuencia del 89 % en términos de la secuencia de bases y del 90 % en términos de la secuencia de aminoácidos; la SCD1 de ratón, que es un factor homólogo de ratón, tenía una identidad de secuencia del 84 % en términos de la secuencia de bases y del 84 % en términos de la secuencia de aminoácidos. La

5 secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de SCD1 humana se muestran en las SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente, y la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de SCD1 de ratón se muestran en las SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente.

(4) Análisis de la expresión en diversos tejidos

La expresión de los genes obtenidos por el método anterior en tejidos normales de perro, humanos y de ratón y varias líneas celulares se investigó por el método de RT–PCR (transcripción inversa-PCR). La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo como sigue: Es decir, de 50 a 100 mg de cada tejido o de 5 × 106 a 10 × 106 cells células de cada línea celular, se extrajo el ARN total usando el reactivo TRIZOL (fabricado por Invitrogen) de 15 acuerdo con el protocolo descrito en las instrucciones adjuntas. Mediante el uso de este ARN total, se sintetizó ADNc con el sistema de síntesis de primera hebra Superscript para RT-PCR (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con el protocolo descrito en las instrucciones adjuntas. Como los ADNc de tejidos normales humanos (cerebro, hipocampo, testículo, colon y placenta), se usaron ADNc de Gene Pool (fabricado por Invitrogen), ADNc de QUICK– Clone (fabricado por CLONETECH) y la biblioteca de ADNc de Large–Insert (fabricada por CLONETECH). La reacción de PCR se realizó usando cebadores específicos para el gen obtenido (los cebadores de perros muestran en las SEQ ID NOs: 9 y 10, los cebadores humanos que se muestran en las SEQ ID NO: 11 y 12, y los cebadores de ratón mostrados en las SEQ ID NOs: 13 y 14) como se describe a continuación. Es decir, los reactivos y el tampón unido se mezclaron de tal manera que 0,25 µl de la muestra preparada por la reacción de transcripción inversa, 2 µM de cada uno de los cebadores anteriores, 0,2 mM de cada uno de los dNTP, y 0,65 U de polimerasa

25 ExTaq (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) estaban contenidos en la mezcla resultante en un volumen final de 25 µl y la reacción se llevó a cabo mediante 30 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 55 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 1 minuto usando un ciclador térmico (fabricado por BIO RAD). Como control para la comparación, cebadores específicos para GAPDH (los cebadores de GAPDH de perros y de ser humano se muestran en las SEQ ID NOs: 15 y 16; y los cebadores de GAPDH de ratón se muestran en las SEQ ID NOs: 17 y 18) se usaron al mismo tiempo. Como resultado, como se muestra en la Figura 1, el gen de SCD1 de perro no se expresó en la mayoría de los tejidos de perro sano, mientras que el gen se expresa fuertemente en los tejidos tumorales de perro. También en términos de los genes de SCD1 de ratón humanos, la expresión no se observó en la mayoría de los tejidos humanos y de ratón normales, mientras que se detectó la expresión en la mayoría de las líneas celulares de cáncer (figuras 2 y 3), como en el caso del gen de SCD1 de perro.

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(5) Análisis cuantitativo de la expresión en diversos tejidos

El gen obtenido por el método anterior se sometió a investigación de la expresión en tejidos normales humanos por el método de RT-PCR. (PCR con transcripción inversa). Como ADNc de tejidos normales y tejidos cancerosos humanos, se utilizó el Panel de exploración de cáncer de Tiempo Real en barridos de tejidos (fabricado por ORIGENE). La RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando el ciclador térmico CFX96 Real Time Cystem – C1000 Thermal Cycler, fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc. La reacción de PCR se llevó a cabo como sigue usando cebadores específicos para el gen obtenido (mostrados en las SEQ ID NO: 11 y 12). Es decir, 5 µl de la muestra de ADNc, 2 µM de cada uno de los cebadores y los reactivos y el tampón contenido en 2 × SYBR Premezcla Ex TaqII

45 polimerasa (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) se mezclaron conjuntamente para preparar una mezcla en un volumen final de 20 µl y la reacción se llevó a cabo mediante 30 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 55 º C durante 30 segundos y 72 ºC durante 1 minuto. Como resultado, el nivel de expresión del gen de SCD1 en cada uno de cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata y cáncer de pulmón no fue menos de 4 veces más alto que el nivel de expresión en su tejido normal correspondiente. Basándose en estos resultados, se puede esperar que no haya preocupación porque aparezcan efectos secundarios por los agentes antitumorales dirigidos a SCD1 en tejidos normales y que el beneficio del efecto farmacológico de los agentes exceda en gran medida el riesgo de sus efectos secundarios.

Ejemplo 2: Análisis de antigenicidad del cáncer de SCD1 in vivo 55

(1) Preparación del vector recombinante que expresa SCD1 in vivo

Basándose en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 5, se preparó un vector recombinante que expresa SCD1 in vivo. La PCR se preparó a partir de la línea celular de cáncer de ratón N2a (adquirida de la ATCC), que mostró la expresión en el ejemplo 1. Los reactivos y el tampón unido se mezclaron de tal manera que 1 µl del ADNc, 0,4 µM de cada uno de dos tipos de cebadores que tenían los sitios de restricción HindIIIy XbaI (que se muestran en las SEQ ID NO: 19 y 20), dNTP 0,2 mM y 1,25 U de polimerasa PrimeStar SA (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) estuvieran contenidos en la mezcla resultante en un volumen final de 50 µl y la PCR se llevó a cabo durante 30 ciclos de 98 ºC durante 10 segundos, 55 ºC durante 15 segundos y 72 ºC durante 4 minutos usando un ciclador 65 térmico (fabricado por BIO RAD). Los dos tipos de cebadores descritos anteriormente fueron los de amplificación de la región que codifica la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Después de la PCR, el

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