ES2660414T3

ES2660414T3 - Inductor de la respuesta inmunitaria

Info

Publication number: ES2660414T3
Application number: ES08840900.8T
Authority: ES
Inventors: Masaki Ishibashi; Fumiyoshi Okano
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2007-10-25
Filing date: 2008-10-23
Publication date: 2018-03-22
Anticipated expiration: 2028-10-23
Also published as: CA2990264A1; EP3192523B1; CA2703350C; CN104873962B; WO2009054471A1; ES2824684T3; EP2213301A4; PT2213301T; CN104873962A; CA2990255A1; CN104922656A; EP3192522A1; CA2990255C; ES2824154T3; US10493137B2; KR101613140B1; US20170035869A1; EP3192521B1; EP2213301B1; US10493136B2

Abstract

Un agente para su uso en el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un cáncer/cánceres, comprendiendo el agente uno cualquiera de los polipéptidos (a) o (b) posteriores, teniendo dicho polipéptido actividad inductora de citotoxicidad de inducción de actividad citotóxica contra células tumorales in vitro en células T estimuladas con el polipéptido, o un vector recombinante que comprende un polinucleótido que codifica dicho polipéptido y es capaz de expresar in vivo dicho polipéptido: (a) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en las SEQ ID NO: 2 o 4 del LISTADO DE SECUENCIAS; y (b) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de no menos del 98 % con el polipéptido (a).

Description

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para inmovilizar las proteínas derivados de E. coli/fago en la misma. Se permitió que el suero de los pacientes caninos fluyera a través y reaccionara con esta columna con proteínas inmovilizada para retirar los anticuerpos adsorbidos sobre la E. coli y/o el fago. La fracción sérica que pasó a través de la columna estaba diluido 500 veces con TBS que contenía un 0,5 % de leche en polvo desnatada, y el diluyente resultante se utilizó como el material

5 para la inmunoexploración.

La membrana sobre la que se transfirieron el suero tratado de esta manera y la proteína de fusión descrita anteriormente se lavó cuatro veces con TBS-T (0,05 % Tween 20/TBS), y se le permitió que reaccionara con anti-IgG de perro de cabra (anti-IgG-h+I de perro conjugado con HRP: fabricado por BETHYL Laboratories) diluido 5000 veces con TBS que contenía un 0,5 % de leche en polvo desnatada como anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido por la detección por la reacción enzimática colorante utilizando la solución de reacción NBT/BCIP (fabricada por Roche). Se observaron las colonias en las posiciones donde eran positivas las reacciones coloreadas y se recuperaron de la placa de agarosa NZY las que tuvieran un tamaño de Φ90 x 15 mm, y se disolvieron en 500 µl de tampón SM (100 mM de NaCl, 10 mM de MgClSO4, 50 mM de Tris-HCl, 0,01 % de

15 gelatina; pH 7,5). La exploración se repitió como una segunda y tercera exploraciones de la misma manera que se ha descrito anteriormente hasta que se obtuvo una única colonia positiva a la reacción coloreada, aislando de esta manera un clon positivo tras la exploración de 30.940 clones de fagos reactivos con la IgG del suero.

(3) Búsqueda de homología del gen de antígeno aislado

Para someter el único clon positivo aislado por el método descrito anteriormente al análisis de secuencia de bases, se llevó a cabo una operación de conversión del vector fago a un vector plásmido. Más particularmente, se mezclaron 200 µl de una solución preparada para contener una E. coli huésped (XL 1-Blue MRF’) de manera que la DO600 debería ser de 1,0 con 100 µl de una solución de fago purificado y además con 1 µl de fago auxiliar ExAssist 25 (fabricado por STRATAGENE), y se permitió que se produjera la reacción a 37 ºC durante 15 minutos. A la mezcla de reacción se añadieron 3 ml de medio LB, y se cultivó la mezcla a 37 ºC durante 2,5 a 3 horas, seguido por la incubación inmediata en un baño de agua a 70 ºC durante 20 minutos. La mezcla se centrifugó entonces a 4 ºC a 1000 x g durante 15 minutos, y se recuperó el sobrenadante como una solución de fagémidos. Posteriormente, se mezclaron 200 µl de una solución preparada para que contuviera una E. coli huésped (SOLR) fagémido de manera que la absorbancia DO600 debería ser 1,0 con 10 µl de una solución de fagos purificados, y se permitió que la reacción procediera a 37 ºC durante 15 minutos. A continuación, se colocaron en placas 50 µl de la mezcla de reacción se colocó en una placa que contenía un medio LB agar con ampicilina (concentración final: 50 µg/ml), y se cultivó a 37 ºC durante una noche. Una única colonia de la SOLR transformada se recuperó y se cultivó en medio LB que contenía ampicilina (concentración final: 50 µg/ml) a 37 ºC, seguido por la purificación del ADN plasmídico que

35 tiene una inserción de interés utilizando el Kit plasmid Miniprep QIAGEN (fabricado por Qiagen).

El plásmido purificado se sometió a un análisis de la secuencia completa de la inserción por el método de cebador en avance utilizando el cebador T3 descrito en la SEQ ID NO: 5 y el cebador T7 descrito en la SEQ ID NO: 6. Mediante este análisis de secuencia, se obtuvo la secuencia genética descrita en la SEQ ID NO: 1. Utilizando la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de este gen, se llevó a cabo la búsqueda de homología contra genes conocidos utilizando el programa de búsqueda de homología BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Como resultado, se reveló que el gen obtenido es el gen (Nº de registro XM_535343) que codifica una proteína (Nº de registro XP_535343) cuya función es desconocida. El factor homólogo humano de este gen era el gen (Nº de registro NM_152660) que codifica una proteína (Nº de registro NP_689873) cuya función también es desconocida

45 (homología: secuencia de bases, un 93 %; secuencia de aminoácidos, un 99 %). La secuencia de bases del factor homólogo humano se muestra en la SEQ ID NO: 3, y la secuencia de aminoácidos del mismo se muestra en SEQ ID NO: 4.

(4) Análisis de expresión en cada tejido

La expresión del gen, que se obtiene por el método descrito anteriormente, en tejidos normales y en distintas líneas celulares de perros y seres humanos se investigó por el método RT-PCR (PCR de transcripción inversa). La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo de la siguiente manera. Es decir, el ARN total se extrajo de 50 a 100 mg de cada tejido o de 5 a 10 x 106 células de cada línea celular utilizando el reactivo TRIZOL (fabricado por 55 Invitrogen) de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Utilizando este ARN total, se sintetizó el ADNc por el sistema de síntesis de primera-cadena Superscript para RT-PCR (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Con respecto a los ADNc de tejidos humanos normales (cerebro, hipocampo, testículo, colon y placenta), se utilizaron el agrupamiento genético de ADNc (fabricado por Invitrogen), el ADNc QUICK-Clone (fabricado por CLONTECH) y la biblioteca de ADN de gran inserción (fabricado por CLONTECH). Las reacciones PCR se llevaron a cabo como sigue utilizando cebadores (descritos en las SEQ ID NO: 7 y 8) específicos para el gen canino obtenido y su gen homólogo humano. Es decir, se mezclaron los reactivos respectivos y el tampón adjunto de manera que la mezcla debería contener 0,25 µl de la muestra preparada por la reacción de transcripción inversa, 2 mM de cada uno de los cebadores anteriores, 0,2 mM de cada uno de los dNTP, y 0,65 U de la polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) en un volumen total de 25 µl, y la reacción se llevó a cabo 65 con 30 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 55 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 1 min utilizando el Thermal Cycler (fabricado por BIO RAD). Los cebadores específicos del gen que tienen las secuencias de bases que se

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(2) Purificación de la proteína recombinante

Las células de E. coli recombinantes que expresaban la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente, se cultivaron en 100 µg/ml de medio LB que contenía ampicilina a 37 ºC hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzaba

5 aproximadamente 0,7, y entonces se añadió al mismo isopropil-P-D-1-tiogalactopiranósido de manera que su concentración final debería ser de 1 mM, seguido por el cultivo a 37 ºC durante 4 horas. Posteriormente, las células se recolectaron por centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos. El aglomerado de células se suspendió en solución salina tampón fosfato y adicionalmente se sometió a centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos para lavar las células.

Las células se suspendieron en 50 mM de tampón Tris-HCl (pH 8,0) y se sometieron a sonicación en hielo. La solución de E. coli sonicada se centrifugó a 6.000 rpm durante 20 minutos para obtener el sobrenadante como fracción soluble y el precipitado como fracción insoluble.

15 La fracción insoluble se suspendió en 50 mM de tampón Tris-HCl (pH 8,0) y se centrifugó a 6.000 rpm durante 15 minutos. Esta operación se repitió dos veces y se llevó a cabo una operación de retirada de proteasas.

El resto se suspendió en hidrocloruro de guanidina 6 M, 50 M de tampón Tris-HCl (pH 8,0) que contenía cloruro sódico 0,15 M, y la suspensión resultante se dejó en reposo a 4 ºC durante 20 horas para desnaturalizar las proteínas. A continuación, se centrifugó la suspensión a 6.000 rpm durante 30 minutos, y la fracción soluble obtenida se colocó en una columna con quelante de níquel preparada por un método convencional (vehículo: Fast Flow Sepharose Chelating (marca registrada) (GE Healthcare); volumen de columna: 5 ml; tampón de equilibración: hidrocloruro de guanidina 6 M, 50 M de tampón Tris-HCl, que contenía 0,15 M de cloruro sódico (pH 8,0)), seguido por un reposo a 4 ºC durante una noche permitiendo la adsorción del vehículo de níquel quelado. Se recuperó el

25 sobrenadante por centrifugación de este vehículo de la columna a 1.500 rpm durante 5 minutos, y el vehículo de la columna se suspendió en solución salina tampón fosfato, seguido por rellenado de la columna con la suspensión resultante.

La fracción que no se adsorbió a la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de 0,1 M de tampón de acetato (pH 4,0) que contenía 0,5 M de cloruro sódico, y se llevó a cabo inmediatamente la elución con 0,1 M de tampón de acetato (pH 3,0) que contenía 0,5 M de cloruro sódico para obtener una fracción purificada, que se utilizó como material para los ensayos de administración a continuación. Las proteínas de interés en las fracciones eluídas respectivas se confirmaron por tinción de Coomasie llevada a cabo de acuerdo con un método convencional. Entre estas, la proteína canina de interés se muestra en la Fig. 2.

35 El tampón contenido en la preparación purificada obtenida por el método descrito anteriormente se sustituyó con un tampón de reacción (50 mM de Tris-HCl, 100 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2; pH 8,0) y se llevó a cabo la escisión del marcador His por la proteasa Factor Xa y la purificación de la proteína de interés, utilizando el kit de captura de escisión FactorXa (fabricado por Novagen), de acuerdo con los protocolos adjuntos al kit. Posteriormente, el tampón contenido en 1,2 ml de la preparación purificada obtenida por el método descrito anteriormente se sustituyó con tampón de fosfato fisiológico (fabricado por Nissui Pharmaceutical) por ultrafiltración utilizando NANOSEP 10K OMEGA (fabricado por PALL), y se utilizó en los siguientes experimentos.

Ejemplo A-3: Ensayo de Administración de una proteína recombinante a perros que albergan un cáncer

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(1) Ensayo antitumoral

El efecto antitumoral de los dos tipos de proteínas recombinantes que se purificaron como se ha descrito anteriormente se evaluó en dos individuos caninos que albergaban un tumor, que tenían un tumor epidérmico (los 2 individuos tenían tumores de glándulas mamarias).

Se mezcló una cantidad igual de adyuvante incompleto de Freund (fabricado por Wako Pure Chemicals) con 100 µg (0,5 ml) de los polipéptidos recombinantes (derivados de perro y ser humano), respectivamente, para preparar dos tipos de agentes terapéuticos para un cáncer(es). Cada uno de estos agentes se administró en un ganglio linfático

55 en la vecindad del tumor un total de 3 veces, llevando a cabo las administraciones posteriores a los 3 días y 7 días después de la primera administración. Como resultado los tumores con un tamaño de aproximadamente 25 mm3 y 50 mm3 en el momento de la administración de los agentes terapéuticos para un cáncer(es) (derivados de perro y ser humano), respectivamente, se redujeron en tamaño a 20 mm3 y 42 mm3, respectivamente, 10 días después de la primera administración; 13 mm3 y 26 mm3, respectivamente 20 días después de la primera administración; y a 5 mm3 y 10 mm3, respectivamente 30 días después de la primera administración.

Adicionalmente, se administró por vía intra-cutánea a un paciente canino que padecía un melanoma maligno, una mezcla de 100 µg (0,5 ml) del polipéptido descrito anteriormente derivado del perro y 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund en la periferia del tumor un total de 3 veces en los mismos intervalos descritos anteriormente. 65 Además, simultáneamente a las respectivas administraciones, se administraron por vía subcutánea 10 mU de “Intercat” que es un interferón recombinante felino. Como resultado el tumor, con un tamaño de aproximadamente

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Ejemplo de referencia B-3: Ensayo de Administración de una proteína recombinante a perros que albergan un cáncer

(1) Ensayo antitumoral

5 El efecto antitumoral de los dos tipos de proteínas recombinantes que se purificaron como se ha descrito anteriormente se evaluó en dos individuos caninos que albergaban un tumor, que tenían un tumor epidérmico (los 2 individuos tenían tumores de glándulas mamarias).

Se mezcló una cantidad igual de adyuvante incompleto de Freund (fabricado por Wako Pure Chemicals) con 100 µg (0,5 ml) de las proteínas recombinantes calmegina canina y calmegina humana, respectivamente, para preparar agentes terapéuticos para un cáncer(es). Cada uno de estos agentes se administró en un ganglio linfático en la vecindad del tumor un total de 3 veces, llevando a cabo las administraciones posteriores a los 3 días y 7 días después de la primera administración. Como resultado los tumores con un tamaño de aproximadamente 45 mm3 y

15 78 mm3, respectivamente, en el momento de la administración de los agentes terapéuticos, se redujeron a 27 mm3 y 46 mm3, respectivamente, 10 días después de la primera administración; 15 mm3 y 26 mm3, respectivamente, 20 días después de la primera administración; y a 7 mm3 y 15 mm3, respectivamente 30 días después de la primera administración.

Adicionalmente, se administró a un paciente canino que padecía un melanoma maligno, una mezcla de 100 µg (0,5 ml) de la proteína calmegina canina descrita anteriormente y 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund un total de 3 veces de la misma manera descrita anteriormente. Además, simultáneamente a las respectivas administraciones, se administraron por vía subcutánea 100 µg de interleucina 12 canina. Como resultado el tumor, con un tamaño de aproximadamente 38 mm3 en el momento de la administración del agente terapéutico remitió completamente 21 días

25 después de la primera administración del agente terapéutico.

(2): Ensayo de inducción de la inmunidad

Se obtuvo sangre del paciente canino en el que se obtuvo el efecto antitumoral en el ensayo de administración de

(1): descrito anteriormente antes de la administración del agente terapéutico para un cáncer(es), y 10 días y 30 días después de la primera administración. Se aislaron las células mononucleares de sangre periférica de acuerdo con un método convencional, y usándolas en el ensayo ELISPOT para IFNγ, se ensayó la inducción de inmunidad de cada proteína recombinante administrada.

35 En una placa de 96 pocillos fabricada por Millipore (MultiScreen-IP, MAIPS 4510), se colocaron 100 µl/pocillo de etanol al 70 % y la placa se dejó en reposo durante 5 minutos, seguido por la retirada del etanol por aspiración. La placa se lavó con agua estéril y se colocaron 300 µl/pocillo de Bicarbonato sódico 200 mM (pH 8,2) en los mismos. Después de dejarlo en reposo durante 5 minutos se retiró el Bicarbonato Sódico por aspiración, y entonces la placa se lavó. Posteriormente, se colocaron 0,5 µg/pocillo de anticuerpo monoclonal anti-interferón γ canino (fabricado por R&D, clon 142529, MAB781) mezclado con 200 mM de Bicarbonato Sódico, y la placa se incubó a 37 ºC durante una noche para inmovilizar el anticuerpo primario. Después de retirar el anticuerpo primario por aspiración, se añadieron a los pocillos 300 µl/pocillo de una solución bloqueante (un 1 % de BSA-5 % de sacarosa-200 mM de Bicarbonato Sódico (pH 8,2)), y la placa se incubó a 4 ºC durante una noche para bloquear la placa. Después de retirar la solución bloqueante por aspiración se colocaron 300 µl/pocillo de medio RPMI que contenía un 10 % de

45 suero fetal bovino (fabricado por Invitrogen) en los pocillos, y la placa se dejó en reposo durante 5 minutos, seguido por la retirada del medio por aspiración. Posteriormente, se colocaron en la placa 5 x 105 células /pocillo de las células mononucleares de sangre periférica caninas suspendidas en medio RPMI que contenía un 10 % de suero fetal bovino, y se añadieron a las mismas 10 µl/pocillo la proteína calmegina canina o calmegina humana que se utilizada en cada administración, seguido por el cultivo de las células en condiciones de 37 ºC y un 5 % de CO2 durante 24 horas, para permitir que los inmunocitos que pudieran existir en las células mononucleares de sangre periférica produjeran interferón γ. Después del cultivo, se retiró el medio, y los pocillos se lavaron 6 veces con una solución de lavado (un 0,1 % de Tween 20-200 mM de Bicarbonato Sódico (pH 8,2). En cada pocillo se colocaron 100 µl de anticuerpo policlonal de conejo anti-perro diluido 1000 veces con la solución bloqueante descrita anteriormente, y la placa se incubó a 4 ºC durante una noche. Después de lavar los pocillos 3 veces con la solución

55 de lavado descrita anteriormente, se colocaron en cada pocillo 100 µl de anticuerpo anti-conejo marcado con HRP diluido 1000 veces con la solución bloqueante descrita anteriormente, y se permitió proceder la reacción a 37 ºC durante 2 horas. Después de lavar los pocillos 3 veces con la solución de lavado descrita anteriormente, el resultado se coloreó con inmunotinción de Konica (fabricado por Konica), y los pocillos se lavaron con agua para parar la reacción. A continuación, se secó la membrana, y se hizo el recuento del número de puntos que aparecían utilizando el KS ELISPOT (fabricado por Carl Zeiss, Inc., Alemania).

Como resultado, en cualquier paciente canino al que se administró calmegina canina o calmegina humana, la muestra de células mononucleares de sangre periférica que se había extraído antes de la administración no presentaba puntos. Por otra parte, en el paciente canino al que se había administrado la calmegina canina, las 65 muestras de células mononucleares de sangre periférica extraídas 10 días y 30 días después de la administración presentaban 15 y 45 puntos, respectivamente. En el paciente canino en el que se había administrado la calmegina

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Claims

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