BR112013029596B1

BR112013029596B1 - Composição imunogênica

Info

Publication number: BR112013029596B1
Application number: BR112013029596-1A
Authority: BR
Inventors: Akira Kurihara; Fumiyoshi Okano
Original assignee: Toray Industries
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2022-01-18
Also published as: AU2012256756A1; RU2013156409A; KR101988895B1; CA2836556A1; EP2711015A4; PL2711015T3; JPWO2012157736A1; CN103547278A; BR112013029596B8; US10537623B2; WO2012157736A1; EP2711015A1; KR20140041566A; AU2012256756B2; US20140154206A1; US20160106823A1; EP2711015B1; JP5954175B2; ES2589706T3; BR112013029596A2

Abstract

AGENTE INDUTOR DE IMUNIDADE. Trata-se de um agente indutor de imunidade inovador útil como um agente terapêutico e/ou profilático para câncer. O agente indutor de imunidade compreende como um ingrediente(s) eficaz(es) pelo menos um polipeptídeo que tem atividade indutora de imunidade selecionada dentre os polipeptídeos (a), (b) e (c) abaixo e/ou um vetor(es) recombinante(s) que compreende um polinucleotídeo(s) que codifica o pelo menos um polipeptídeo, sendo que o vetor (es) recombinante(s) é capaz(es) de expressar o polipeptídeo(s) in vivo: (a) um polipeptídeo composto de 7 ou mais aminoácidos consecutivos em qualquer uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 4, 2, 22 e 24 na LISTAGEM DE SEQUÊNCIA; (b) um polipeptídeo que tem uma identidade de sequência de 90% ou mais em relação ao polipeptídeo (a) e composto de 7 ou mais aminoácidos; e (c) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo (a) ou (b) como uma sequência parcial do mesmo.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente invenção refere-se a um agente indutor de imunidade inovador útil como um agente terapêutico e/ou profilático para câncer.

FUNDAMENTO DA TÉCNICA

[002] O câncer é a causa mais comum de morte dentre todas as causas de morte e a terapia executada para o mesmo no presente é principalmente tratamento cirúrgico, que pode ser executado em combinação com radioterapia e/ou quimioterapia. A despeito dos desenvolvimentos de novos métodos cirúrgicos e constatação de novos agentes anticâncer nos anos recentes, os resultados de tratamento de cânceres não foram muito melhorados até agora exceto para alguns cânceres. Recentemente, em virtude do desenvolvimento na biologia molecular e imunologia de câncer, antígenos de câncer reconhecidos por células T citotóxicas reativas com cânceres, assim como os genes que codificam os antígenos de câncer, foram identificados, e as expectativas para imunoterapia específica para antígeno foram criadas.

[003] Em imunoterapia, a fim de reduzir os efeitos colaterais, o peptídeo ou a proteína a ser reconhecido como o antígeno necessita estar presente em quantidade muito baixa em células normais e estar presente especificamente em células cancerosas. Em 1991, Boon e outros do Instituo Ludwig na Bélgica isolaram um antígeno de melanoma humano MAGE 1, que é reconhecido pelas células T positivas CD8, através de uma expressão de cDNA que clona o método através do uso de umas linhagens celulares cancerosa autólogas e células T reativas a câncer (Documento não patentário 1). Depois disso, o método de SEREX (identificações serológicas de antígenos através de clonagem de expressão recombinante), em que antígenos tumorais reconhecidos pelos anticorpos produzidos no corpo vivo de um paciente com câncer em resposta ao próprio câncer do paciente são identificados através da aplicação de um método de clonagem de expressão de gene, foi reportado (Documento de Patente 1, Documento não patentário 2) e diversos antígenos de câncer têm sido isolados através desse método. Com o uso de uma parte dos antígenos de câncer como alvos, iniciaram-se testes clínicos para imunoterapia de câncer.

[004] Por outro lado, como no ser humano, vários tumores como, por exemplo, tumor de glândula mamária e carcinoma de célula escamosa são conhecidos em cachorros e gatos e os mesmos também têm alta classificação nas estatísticas de doenças em cachorros e gatos. Porém, nenhum agente terapêutico, agente profilático ou agente de diagnostico eficaz para cânceres em cães ou gatos existe no presente. Uma vez que a maioria dos tumores em cachorros e gatos é percebida pelos seus donos apenas após os tumores crescerem mais devido à progressão, sua visita ao hospital já é muito tarde e mesmo que eles recebem excisão cirúrgica ou administração de um fármaco humano (um fármaco anticâncer ou similares), os mesmo muitas vezes morrem imediatamente após o tratamento. Sob tais circunstâncias, se os agentes terapêuticos e os agentes profiláticos para câncer eficaz para cães e gatos se tornarem disponíveis, espera-se que seu uso para cânceres caninos se desenvolva.

[005] A estearoil-CoA desaturase 1 (SCD1) introduz uma ligação dupla para a posição C9-C10 de um ácido graxo saturado. Os substratos preferenciais para a enzima são palmitoil-CoA (16:0) e estearoil-CoA (18:0), e os mesmos são convertidos para palmitoleoil-CoA (18:0) e oleoil-CoA (18:1), respectivamente. O acido graxo monoinsaturado pode então ser usado in vivo para uma preparação de fosfolipídios, triglicerídeos e colesteril ésteres. Adicionalmente, vários cânceres tais como câncer de fígado, câncer de esôfago e câncer de cólon mostram uma expressão aumentada de SCD1, e foi relatado que uma inibição da função de SCD1 com siRNA ou um composto de baixo peso molecular causa uma supressão da proliferação celular ou uma indução de apoptose (documentos não patentários 3, 4 e 5). No entanto, não há relato que sugira que a proteína SCD1 tem uma atividade de indução de imunidade contra células de câncer e, portanto, que a proteína é útil para um tratamento ou uma profilaxia de câncer.DOCUMENTOS DA TÉCNICA ANTERIORDOCUMENTOS DE PATENTEDocumento de Patente 1: US 5698396 BDOCUMENTOS NÃO PATENTÁRIOSDocumento não patentário 1: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643a 1647 (1991)Documento não patentário 2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810 a 11813 (1995)Documento não patentário 3: Scaglia N. et al., PLoS One 4: e6812 (2009)Documento não patentário 4: Morgan-Lappe SE. et al., Cancer Res 67: 4390 a 4398 (2007)Documento não patentário 5: Scaglia N. et al., Biochim Biophys Acta 1687: 141 a 151 (2005)Documento não patentário 6: Ariyama H. et al., J Biol Chem (2010)

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃOPROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO

[006] A presente invenção tem como objetivo constatar um polipeptídeo inovador útil para um agente terapêutico e/ou profilático para câncer e fornecer o polipeptídeo para uso em um agente indutor de imunidade.

MEIOS PARA RESOLVER OS PROBLEMAS

[007] Através do método de SEREX com uso de uma biblioteca de cDNA derivada de testículos de cachorro e soro obtido de um cachorro portador de tumor, os presentes inventores estudaram intensivamente para obter um cDNA que codifica uma proteína que amarra os anticorpos presentes no soro derivado de um corpo vivo portador de tumor e, com base no cDNA, um polipeptídeo de estearoil-CoA desaturase 1 de cachorro (doravante referido como SCD1) que tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2 foi preparado. Ademais, com base em genes homólogos de humano e ratos do gene obtido, a SCD1 humana e de rato que têm as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs:4 e 6 foram preparadas. Ademais, os presentes inventores constataram que esses polipeptídeos de SCD1 são especialmente expressos em tecidos ou células cancerosas da mama, tumor cerebral, câncer de cólon, adenocarcinoma perianal, mastocitoma, neuroblastoma, câncer renal, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de próstata e leucemia. Os presentes inventores constataram ainda que a administração da SCD1 a um corpo vivo permite a indução de imunócitos contra SCD1 no corpo vivo e a regressão de um tumor que expressa a SCD1 no corpo vivo. Ademais, os presentes inventores constataram que um vetor recombinante que pode expressar um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SCD1 ou um fragmento do mesmo induz um efeito antitumoral contra o câncer que expressa a SCD1 em um corpo vivo.

[008] Ademais, os presentes inventores constataram que um polipeptídeo de SCD1 tem uma capacidade para ser apresentado pelas células apresentadoras de antígeno para causar a ativação e o crescimento das células T citotóxicas especificas ao peptídeo (atividade indutora de imunidade), e, portanto, que o polipeptídeo é útil para a terapia e/ou profilaxia de câncer. Ademais, os presentes inventores constataram que as células apresentadoras de antígeno que entraram em contato com o polipeptídeo e as células T que entraram em contato com as células apresentadoras de antígeno, são úteis para terapia e/ou profilaxia de câncer, contemplando, desse modo, a presente invenção.

[009] Assim, a presente invenção tem as seguintes características.(1) Um agente indutor de imunidade que compreende como um ingrediente(s) eficaz(es) pelo menos um polipeptídeo que tem atividade indutora de imunidade selecionado a partir dos polipeptídeos (a) a (c) abaixo, e/ou um vetor(es) recombinante(s) que compreende um polinucleotídeo(s) que codificam o pelo menos um polipeptídeo, em que o vetor(es) recombinante(s) é capaz de expressar o polipeptídeo(s) in vivo:(a) um polipeptídeo composto por 7 ou mais aminoácidos consecutivos de qualquer uma das sequências de aminoácido de SEQ ID NOs:4, 2, 22 e 24 em LISTAGEM DE SEQUÊNCIA,(b) um polipeptídeo que tem uma identidade da sequência de 85% ou mais em relação ao polipeptídeo (a) e composto de 7 ou mais aminoácidos, e(c) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo (a) ou (b)como uma sequência parcial do mesmo.(2) O agente indutor de imunidade de acordo com (1), em que o polipeptídeo que tem a atividade indutora de imunidade é um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:4, 2, 22 ou 24 na listagem de sequência.(3) O agente indutor de imunidade de acordo com (1) ou (2), que é um agente para tratar células apresentadoras de antígeno.(4) O agente indutor de imunidade de acordo com (1) ou (2), que é um agente terapêutico e/ou profilático para um câncer(es). (5) O agente indutor de imunidade de acordo com (4), em que o câncer(es) é um câncer(es) que expressa a SCD1.(6) O agente indutor de imunidade de acordo com (4) ou (5), em que o câncer(es) é câncer de mama, tumor cerebral, câncer de cólon, adenocarcinoma perianal, mastocitoma, neuroblastoma, câncer renal, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de próstata e/ou leucemia.(7) O agente indutor de imunidade de acordo com qualquer uma dentre (1) a (6), que compreende adicionalmente um imunoaprimorador.(8) O agente indutor de imunidade de acordo com (7), em que o imunoaprimorador é pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em adjuvante incompleto de Freund, Montanide, poli-I:C e derivados do mesmo, oligonucleotídeos CpG, interleucina-12, interleucina-18, interferon- α, interferon-β, interferon-w, interferon-Y e ligante Flt3.

EFEITO DA INVENÇÃO

[010] Através da presente invenção, um agente indutor de imunidade inovador útil para a terapia, profilaxia e/ou similares de câncer é fornecido. Conforme concretamente descrito nos Exemplos mencionados posteriormente, a administração do polipeptídeo usado na presente invenção para um corpo vivo permite a indução de imunócitos no corpo vivo e um câncer que já tenha ocorrido pode ser reduzido ou regredido. Portanto, o polipeptídeo é útil para a terapia e/ou a profilaxia de câncer.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[011] A Figura 1 mostra os padrões de expressão do gene SCD1 identificados em tecidos normais de cachorro, tecidos tumorais e linhagens celulares cancerígenas. Numeral de referência 1, os padrões de expressão do gene SCD1 de cachorro em vários tecidos de cachorro e linhagens celulares, numeral de referência 2, os padrões de expressão do gene GAPDH canino em vários tecidos caninos e linhagens celulares.

[012] A Figura 2 mostra os padrões de expressão do gene SCD1 identificados em tecidos normais de ser humano, tecidos tumorais e linhagens celulares cancerígenas. Numeral de referência 3, os padrões de expressão do gene SCD1 humano em vários tecidos humanos e linhagens celulares, numeral de referência 4, os padrões de expressão do gene GAPDH humano em vários tecidos humanos e linhagens celulares.

[013] A Figura 3 mostra os padrões de expressão do gene SCD1 identificados em tecidos normais de rato, tecidos tumorais e linhagens celulares cancerígenas. Numeral de referência 5, os padrões de expressão do gene SCD1 de rato em vários tecidos de rato e linhagens celulares, numeral de referência 6, os padrões de expressão do gene GAPDH de rato em vários tecidos de rato e linhagens celulares.

MELHOR MODO PARA EXECUTAR A INVENÇÃO

[014] Os exemplos do polipeptídeo contido no agente indutor de imunidade da presente invenção conforme um ingrediente eficaz inclui o seguinte. Na presente invenção, o termo “polipeptídeo” significa uma molécula formada por uma pluralidade de aminoácidos enlaçados juntos pelas ligações de peptídeo e inclui não apenas as moléculas de polipeptídeo que têm grandes números de aminoácidos que constituem as mesmas, mas também moléculas de baixo peso molecular que têm pequenos números de aminoácidos (oligopeptídeos) e proteínas de comprimento total. A presente invenção também inclui as proteínas SCD1 de comprimento total que têm a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:4, 2, 22 ou 24.(a) Um polipeptídeo que é composto de 7 ou mais aminoácidos consecutivos em um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:4, 2, 22 ou 24 na LISTAGEM DA SEQUÊNCIA e tem uma atividade indutora de imunidade. (b) Um polipeptídeo composto por 7 ou mais aminoácidos, em que o polipeptídeo tem uma identidade da sequência de 85% ou mais em relação ao polipeptídeo (a) e uma atividade indutora de imunidade.(c) Um polipeptídeo que compreende polipeptídeo (a) ou (b) conforme uma sequência parcial do mesmo e tem uma atividade indutora de imunidade.

[015] Na presente invenção, o termo “que tem uma sequência de aminoácido” significa que os resíduos de aminoácidos são arrumados em tal ordem. Portanto, por exemplo, “o polipeptídeo que tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2” significa que o polipeptídeo que tem a sequência de aminoácido de Met Pro Ala His ... (snip) ... Tyr Lys Ser Gly mostrado naSEQ ID NO:2, em que o polipeptídeo tem um tamanho de 360 resíduos deaminoácidos. Ademais, por exemplo, “o polipeptídeo que tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2” pode ser referido como “o polipeptídeo de SEQID NO:2” para encurtar. Isso também se aplica para o termo “que tem umasequência de base”. Nesse caso, o termo “que tem” pode ser substituído pela expressão “composto de”.

[016] Conforme usado no presente documento, o termo “atividade indutora de imunidade” significa uma habilidade para induzir os imunócitos que secretam citocinas como, por exemplo, interferon em um corpo vivo.

[017] Se o polipeptídeo tem ou não uma atividade indutora de imunidade que pode ser confirmada com o uso, por exemplo, do ensaio ELISPOT conhecido. Mais especificamente, por exemplo, conforme descrito nos Exemplos abaixo, as células como, por exemplo, as células mononucleares de sangue periférico, são obtidas a partir de um corpo vivo sujeito à administração do polipeptídeo, cuja atividade indutora de imunidade deve ser avaliada e as células obtidas são, então, cocultivadas com o polipeptídeo, seguidas pela medição da(s) quantidade(s) de uma(umas) citocina(s) produzida(s) pelas células através do uso de um anticorpo/anticorpos especifico(s), permitindo, desse modo, a medição das várias quantidades de imunócitos entre as células. Através disso, a avaliação da atividade indutora de imunidade é possível.

[018] Alternativamente, conforme descrito nos Exemplos mencionados posteriormente, a administração do polipeptídeo recombinante de qualquer um dentre (a) a (c) descritos acima para um portador de tumor animal possibilita a regressão do tumor através de sua atividade indutora de imunidade. Assim, a atividade indutora de imunidade acima pode ser avaliada também como uma habilidade para suprimir o crescimento das células cancerosas ou para causar a redução ou desaparecimento de um tecido canceroso (tumor) (doravante referido como “atividade antitumoral”). A atividade antitumoral de um polipeptídeo pode ser confirmada através de, por exemplo, conforme mais especificamente descrito nos Exemplos abaixo, observação se um tumor é ou não reduzido quando o polipeptídeo for de fato administrado a um corpo vivo portador de tumor.

[019] Alternativamente, a atividade antitumoral de um polipeptídeo pode ser avaliada também através de observação se as células T estimadas com o polipeptídeo (isto é, as células T trazida em contato com as células apresentadoras de antígeno que apresentam o polipeptídeo) mostra ou não uma atividade citotóxica contra as células tumorais in vitro. O contato entre as células T e as células apresentadoras de antígeno pode ser executado através de suas coculturas em um meio líquido, conforme mencionado abaixo. A medição da atividade citotóxica pode ser executada através, por exemplo, do método conhecido chamado de ensaio de liberação de 51Cr descrito em Int. J. Câncer, 58: página 317, 1994. Em casos em que o polipeptídeo deve ser usado para terapia e/ou profilaxia de câncer, a avaliação da atividade indutora de imunidade é executada preferencialmente através do uso da atividade antitumoral conforme um índice, embora o índice não seja limitado à mesma.

[020] Cada uma das sequências de aminoácido de SEQ ID NOs:2, 4, 22 e 24 na LISTAGEM DA SEQUÊNCIA revelados na presente invenção são uma sequência de aminoácido de SCD1 que foi isolada, através do método SEREX que usa uma biblioteca de cDNA derivada de testículos de cachorro e o soro de um cachorro portador de tumor, conforme um polipeptídeo que se amarra especificamente a um anticorpo existente no soro de um cachorro portador de tumor ou um fator homólogo do polipeptídeo em humano, vaca ou cavalo (consultar Exemplo 1). A SCD1 humana, que é o fator homólogo humano da SCD1 de cachorro, tem uma identidade da sequência de 89% em termos da sequência de base e 90% em termos da sequência de aminoácido, a SCD1 bovina, que é o fator homólogo bovino, tem uma identidade da sequência de 88% em termos da sequência de base e 87% em termos da sequência de aminoácido; e a SCD1 equina, que é o fator homólogo equino, tem uma identidade da sequência de 90% em termos da sequência de base e 87% em termos da sequência de aminoácido.

[021] O polipeptídeo (a) é um polipeptídeo composto por 7 ou mais aminoácidos consecutivos, preferencialmente 8, 9 ou 10 ou maisconsecutivos, no polipeptídeo que tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2, 4, 22 ou 24 e tem uma atividade indutora de imunidade. O polipeptídeo é mais preferencialmente um polipeptídeo composto de uma sequência de aminoácido que tem uma identidade da sequência de 85% ou mais em relação à sequência de aminoácido de SEQ ID NO:4 e o polipeptídeo preferencialmente de modo especial tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2, 4, 22 ou 24. Como é sabido na técnica, um polipeptídeo que tem aproximada 7 ou mais resíduos de aminoácidos pode exercer sua antigenicidade e imunogenicidade. Assim, um polipeptídeo que tem 7 ou mais resíduos de aminoácidos consecutivos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2 ou 4 pode ter uma atividade indutora de imunidade, de modo que o polipeptídeo possa ser usado para preparação do agente indutor de imunidade da presente invenção.

[022] Como um princípio da indução imune através da administração de um polipeptídeo antigênico de câncer, o processo a seguir é conhecido: um polipeptídeo é incorporado em uma célula apresentadora de antígeno e, então, degradado em fragmentos menores através de proteases na célula, seguido por se apresentar na superfície da célula. Os fragmentos são, então, reconhecidos por uma célula T citotóxica ou similar que seletivamente mata as células que apresentam o antígeno. O tamanho do polipeptídeo apresentado na superfície da célula apresentadora de antígeno é relativamente pequeno e de aproximadamente 7 a 30 aminoácidos. Portanto, a partir do ponto de vista de apresentar o polipeptídeo na superfície da célula apresentadora de antígeno, um modo preferido do polipeptídeo descrito acima (a) é um polipeptídeo composto de aproximadamente 7 a 30 aminoácidos consecutivos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2, 4, 22 ou 24 e, mais preferencialmente, um polipeptídeo composto de aproximadamente 8 a 30 ou aproximadamente 9 a 30 aminoácidos é suficiente como o polipeptídeo (a). Em alguns casos, esses polipeptídeos relativamente pequenos são apresentados diretamente na superfície de células apresentadoras de antígeno sem que sejam incorporados nas células apresentadoras de antígeno.

[023] Ademais, um polipeptídeo incorporado em uma célula apresentadora de antígeno é clivado em sítios aleatórios através de proteases na célula para render vários fragmentos de polipeptídeo, que são, então, apresentados na superfície da célula apresentadora de antígeno. Portanto, a administração de um grande polipeptídeo como, por exemplo, o comprimento total da região de SEQ ID NO:2, 4, 22 ou 24 causa inevitavelmente a produção de fragmentos de polipeptídeo degradando-se na célula apresentadora de antígeno, em que os fragmentos são eficazes para a indução imune através da célula apresentadora de antígeno. Portanto, também para a indução imune através das células apresentadoras de antígeno, um grande polipeptídeo pode ser preferencialmente usado e o polipeptídeo pode ser composto de 30 ou mais, preferencialmente 100 ou mais, mais preferencialmente 200 ou mais, ainda mais preferencialmente 250 ou mais aminoácidos. O polipeptídeo ainda pode ser mais preferencialmente composto pelo comprimento total da região de SEQ ID NO:2, 4, 22 ou 24.

[024] O polipeptídeo (b) é o mesmo polipeptídeo que o polipeptídeo (a) exceto que um pequeno número de (preferencialmente, um ou diversos) resíduos de aminoácidos são substituídos, apagados e/ou inseridos, que têm uma identidade da sequência de 90% ou mais, preferencialmente 95% ou mais, mais preferencialmente 98% ou mais, ainda mais preferencialmente 99% ou mais ou 99.5% ou mais em relação à sequência original e têm uma atividade indutora de imunidade. Conhece-se bem na técnica que, em geral, esses são casos em que um antígeno de proteína retém quase a mesma antigenicidade que a proteína original mesmo que a sequência de aminoácido da proteína seja modificada de modo que um pequeno número de resíduos de aminoácidos sejam substituídos, apagados e/ou inseridos. Portanto, uma vez que o polipeptídeo (b) também possa exercer uma atividade indutora de imunidade, o mesmo pode ser usado para preparação do agente indutor de imunidade da presente invenção. Ademais, o polipeptídeo (b) também é preferencialmente um polipeptídeo que tem a mesma sequência de aminoácido que a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2, 4, 22 ou 24 exceto um ou diversos resíduos de aminoácidos são substituídos, apagados e/ou inseridos. Conforme usado no presente documento, o termo “diversos” significa um número inteiro de 2 a 10, preferencialmente um número inteiro de 2 a 6, mais preferencialmente um número inteiro de 2 a 4.

[025] Conforme usado no presente documento, o termo “identidade da sequência” das sequências de aminoácido ou sequências de base quer dizer que o valor calculado alinhando-se duas sequências de aminoácido (ou sequências de base) a serem comparadas de modo que o número de resíduos de aminoácidos (ou bases) correspondentes seja o máximo entre as sequências de aminoácido (ou sequências de base) e dividindo-se o número de resíduos de aminoácidos correspondentes (ou o número de bases correspondentes) pelo número total de resíduos de aminoácidos (ou o número total de bases), o qual o valor é representado como uma porcentagem. Quando o alinhamento é executado, uma ou mais lacunas são inseridas em uma ou ambas dentre as duas sequências a serem comparadas conforme exigido. Tal alinhamento das sequências pode ser executado através do uso de um programa bastante conhecido como, por exemplo, BLAST, FASTA ou CLUSTAL W. Quando uma ou mais lacunas são inseridas, o número total de resíduos de aminoácidos descritos acima é o número de resíduos calculados através da contagem de uma lacuna como um resíduo de aminoácidos. Quando o assim contado número total de resíduos de aminoácidos for diferente entre as duas sequências a serem comparadas, a identidade da sequência (%) será calculada dividindo-se o número de resíduos de aminoácidos correspondentes pelo número total de resíduos de aminoácidos na sequência mais longa.

[026] Os 20 tipos de aminoácidos que constituem as proteínas que ocorrem naturalmente podem ser classificados em grupos, cada um dos quais compartilham propriedades similares, por exemplo, em aminoácidos neutros com correntes com ligações naturais que têm baixa polaridade (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), os aminoácidos neutros que têm correntes hidrofílicas com ligações naturais (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), aminoácidos ácidos (Asp, Glu), os aminoácidos básicos (Arg, Lys, His) e os aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp). Sabe-se que, em muitos casos, a substituição de um aminoácido dentro do mesmo grupo não muda as propriedades do polipeptídeo. Portanto, em casos em que um resíduo de aminoácidos no polipeptídeo (a) da presente invenção é substituído, a probabilidade de que a atividade indutora de imunidade possa ser mantida pode ser aumentada executando-se a substituição dentro do mesmo grupo, o que é preferido.

[027] O polipeptídeo (c) é um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo (a) ou (b) como uma sequência parcial e tem uma atividade indutora de imunidade. Isto é, o polipeptídeo (c) é um polipeptídeo em que um ou mais aminoácidos e/ou um ou mais polipeptídeos são adicionados em uma ou ambas as extremidades do polipeptídeo (a) ou (b) e têm uma atividade indutora de imunidade. Uma vez que um polipeptídeo também pode ser usado para preparação de o agente indutor de imunidade da presente invenção.

[028] Os polipeptídeos descritos acima podem ser sintetizados através, por exemplo, de um método de síntese química tal como o método Fmoc (método fluorenilmetiloxicarbonil) ou o método tBoc (método t- butiloxicarbonil). Ademais, os mesmos podem ser sintetizados através de métodos convencionais que usam vários tipos de sintetizadores de peptídeo disponíveis comercialmente. Ademais, o polipeptídeo de interesse pode ser obtido através do uso de técnicas de engenharia genética preparando-se um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo e que incorpora o polinucleotídeo em um vetor de expressão, seguido por instruir o vetor resultante em uma célula hospedeira e permitir a célula hospedeira produzir o polipeptídeo na mesma.

[029] O polinucleotídeo que codifica a polipeptídeo acima pode ser facilmente preparado através de uma técnica de engenharia genética conhecida ou um método convencional que usa um sintetizador de ácido nucleico disponível comercialmente. Por exemplo, o DNA que tem a sequência de base de SEQ ID NO:1 pode ser preparado executando-se a PCR com o uso de um DNA cromossômico de cachorro ou biblioteca de cDNA como um modelo e um par de iniciadores projetados de modo que a sequência de base de SEQ ID NO:1 possa ser ampliada com a mesma. O DNA que tem a sequência de base de SEQ ID NO:3 pode ser similarmente preparado com o uso de um DNA cromossômico humano ou biblioteca de cDNA como o modelo. As condições de reação para a PCR podem ser definidas apropriadamente e os exemplos das condições de reação incluem, mas não são limitados, repetir o processo de reação de 94 °C por 30 segundos (desnaturação), 55 °C por 30 segundos a 1 minuto (recozimento) e 72 °C por 2 minutos (extensão), por exemplo, por 30 ciclos, seguida pela reação a 72 °C por 7 minutos. Ademais, o DNA desejado pode ser isolado preparando-se uma sonda ou iniciador apropriado com base na informação da sequência de base ou na sequência de aminoácido de SEQ ID NO:1 ou 3 na LISTAGEM DA SEQUÊNCIA na presente descrição e na triagem de uma biblioteca de cDNA de cachorro, humano ou similar com o uso da sonda ou do iniciador. A biblioteca de cDNA é preferencialmente preparada a partir de células, um órgão ou um tecido que expressa a proteína de SEQ ID NO:2 ou 4. As operações descritas acima como, por exemplo, a preparação da sonda ou iniciador, a construção da biblioteca de cDNA, a triagem da biblioteca de cDNA e a clonagem do gene de interesse são conhecidas para aqueles versados na técnica e podem ser executadas de acordo com os métodos descritos em Molecular Cloning, Second Edition, Current Protocols in Molecular Biology e/ou similar. A partir do DNA obtido assim, o DNA que codifica o polipeptídeo (a) pode ser obtido. Ademais, uma vez que os códons que codificam cada um dos aminoácidos são conhecidos, a sequência de base de um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido especifica pode ser facilmente especificada. Portanto, já que a sequência de base de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo (b) ou o polipeptídeo (c) também pode ser facilmente especificada, tal polinucleotídeo também pode ser facilmente sintetizado através do uso de um sintetizador de ácido nucleico disponível comercialmente de acordo com um método convencional. As células hospedeiras não são restringidas contanto que as células possam expressar o polipeptídeo descrito acima e os exemplos das células incluem, mas não são limitados, às células procarióticas como, por exemplo, E. coli, e células eucarióticas como, por exemplo, células cultivadas de mamíferos que incluem células de rim de macaco COS1 e células de ovário de hamster Chinês CHO, levedura em desenvolvimento, levedura de fissão, células de bicho-da-seda e células de ovo de Xenopus laevis.

[031] Em casos em que as células procarióticas são usadas como as células hospedeiras, um vetor de expressão que contém uma origem que permite a replicação do vetor em uma célula procariótica, promotor, sítio de ligação de ribossomo, sítio de clonagem de DNA, terminador e/ou similares é usado. Os exemplos do vetor de expressão para E. coli incluem o sistema pUC, pBluescriptII, o sistema de expressão pET e o sistema de expressão pGEX. Incorporando-se um DNA que codifica o polipeptídeo acima em tal vetor de expressão e transformando-se as células procarióticas hospedeiras com o vetor, seguido por cultivar os transformantes resultantes, o polipeptídeo codificado pelo DNA pode ser expresso nas células procarióticas hospedeiras. Em tal caso, o polipeptídeo também pode ser expresso como uma proteína de fusão com outra proteína.

[032] Em casos em que as células eucarióticas são usadas como as células hospedeiras, um vetor de expressão para as células eucarióticas, que compreende um promotor, sítio de emenda, sítio de adição de poli(a) e/ou similares, é usado como o vetor de expressão. Os exemplos de tal vetor de expressão incluem pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, vetor EBV, pRS, pcDNA3, pMSG e pYES2. Similarmente ao caso acima, incorporando-se um DNA que codifica o polipeptídeo acima em tal vetor de expressão e transformando-se as células eucarióticas hospedeiras com o vetor, seguido por cultivar os transformantes resultantes, o polipeptídeo codificado pelo DNA pode ser expresso nas células eucarióticas hospedeiras. Em casos em que pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 ou similares são usados como o vetor de expressão, o polipeptídeo acima pode ser expresso como uma proteína de fusão que compreende um etiqueta como, por exemplo, uma etiqueta His, etiqueta FLAG, etiqueta myc, etiqueta HA ou GFP.

[033] Para a introdução do vetor de expressão em células hospedeiras, um método bem conhecido como, por exemplo, eletroporação, o método de fosfato de cálcio, o método lipossomo ou o método dextrano DEAE podem ser usados.

[034] A isolação e a purificação do polipeptídeo de interesse das células hospedeiras podem ser executadas através de uma combinação de operações de separação conhecidas. Os exemplos das operações de separação conhecidas incluem, mas não são limitados, o tratamento com um desnaturante como, por exemplo, ureia ou com um surfactante, tratamento ultrassónico, digestão de enzima, remoção por sal ou precipitação fracionária de solvente, diálise, centrifugação, ultrafiltração, filtração em gel, SDS-PAGE, focalização isoelétrica, cromatografia de troca de íon, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de afinidade e cromatografia de fase reversa.

[035] Os polipeptídeos obtidos através dos métodos acima também incluem, conforme mencionado acima, aqueles na forma de uma proteína de fusão com outra proteína arbitrária. Os exemplos de tais polipeptídeos incluem as proteínas de fusão com glutationa-S-transferase (GST) e as proteínas de fusão com uma etiqueta His. Tal polipeptídeo na forma de uma proteína de fusão também é incluído dentro do escopo da presente invenção conforme o polipeptídeo descrito acima (c). Ademais, em alguns casos, o polipeptídeo expresso em uma célula transformada é modificado de várias maneiras na célula após a translação. Tal polipeptídeo modificado pós- translacionalmente também é incluído dentro do escopo da presente invenção contanto que o mesmo tenha uma atividade indutora de imunidade. Os exemplos de tal modificação pós-translacionalmente inclui: a eliminação de metionina N-terminal, acetilação N-terminal, glicosilação, degradação limitada por uma protease intracelular, miristoilação, isoprenilação e fosforilação.

[036] Conforme descrito mais concretamente nos Exemplos mencionados posteriormente, a administração do polipeptídeo que tem uma atividade indutora de imunidade em relação a um corpo vivo portador de tumor permite a regressão de um tumor já existente. Portanto, o agente indutor de imunidade da presente invenção pode ser usado como um agente terapêutico e/ou profilático para câncer. Ademais, o polipeptídeo que tem uma atividade indutora de imunidade pode ser usado para um método de terapia e/ou profilaxia de câncer através de indução imune.

[037] Conforme usado no presente documento, os termos “tumor” e “câncer” significam uma neoplasma maligna e são usados intercambiavelmente.

[038] Nesse caso, o câncer a ser tratado não é restrito contanto que o SCD1 seja expresso no câncer e o câncer é preferencialmente câncer de mama, tumor cerebral, adenocarcinoma perianal, mastocitoma, neuroblastoma, câncer renal, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de próstata ou leucemia.

[039] O animal em questão é preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um mamífero como, por exemplo, um primata, animal de estimação, animal doméstico ou animal de esporte, de modo preferencialmente especial humano, cachorro ou gato.

[040] A rota de administração do agente indutor de imunidade da presente invenção em relação a um corpo vivo pode tanto ser administração oral ou administração parenteral e é preferencialmente a administração parenteral como, por exemplo, administração intramuscular, administração subcutânea, administração intravenosa ou administração intra-arterial. Em casos em que o agente indutor de imunidade é usado para terapia de câncer, o mesmo pode ser administrado a um linfonodo regional na proximidade do tumor a ser tratado, conforme descrito nos Exemplos abaixo, a fim de intensificar sua atividade anticâncer. A dose pode ser qualquer dose contanto que a dose seja eficaz para a indução imune e, por exemplo, em casos em que o agente é usado para terapia e/ou profilaxia de câncer, a dose pode ser uma dose eficaz para terapia e/ou profilaxia de o câncer. A dose eficaz para terapia e/ou profilaxia de câncer é selecionada de maneira apropriada dependendo do tamanho, dos sintomas e similares do tumor e a dose eficaz é usualmente de 0,001 μg a 1.000 μg, preferencialmente 0,001 μg a 1.000 μg por animal em questão por dia. O agente pode ser administrado uma vez ou de forma dividida em diversas vezes. O agente é preferencialmente administrado de forma dividida em diversas vezes, cada diversos dias a diversos meses. Conforme concretamente mostrado nos Exemplos abaixo, o agente indutor de imunidade da presente invenção pode causar a regressão de um tumor já ocorrido. Portanto, uma vez que o agente possa exercer sua atividade anticâncer também contra um pequeno número de células cancerosas em um estágio primário, o desenvolvimento ou a ocorrência de câncer pode ser prevenida através do uso do agente antes do desenvolvimento do câncer ou após a terapia para o câncer. Isto é, o agente indutor de imunidade da presente invenção é eficaz para tanto a terapia como a profilaxia de câncer.

[041] O agente indutor de imunidade da presente invenção pode conter apenas um polipeptídio ou pode ser formulado sendo misturado conforme apropriado com um aditivo tal como um diluente, veículo ou carreador farmaceuticamente aceitável adequado para modo de administração. Aditivos e métodos de formulação que podem ser usados são bem conhecidos no campo de formulação de agentes farmacêuticos, e qualquer um dos métodos e aditivos pode ser usado. Exemplos específicos dos aditivos incluem, mas sem se limitar, diluentes tais como soluções de tampão fisiológicas; veículos tais como açúcar, lactose, amido de milho, fosfato de cálcio, sorbitol e glicina; aglutinantes tais como xarope, gelatina, goma arábica, sorbitol, cloreto de polivinila e tragacanto; e lubrificantes tais como estearato de magnésio, polietileno glicol, talco e sílica. Exemplos da formulação incluem preparações orais tais como tabletes, cápsulas, grânulos, pós e xaropes; e preparações parenterais tais como inalantes, soluções de injeção, supositórios e soluções. Essas formulações podem ser preparadas através de métodos de produção comumente conhecidos.

[042] O agente indutor de imunidade da presente invenção pode ser usado em combinação com um imunoaprimorador que tem a capacidade de intensificar a resposta imune em um corpo vivo. O imunoaprimorador pode estar contido no agente indutor de imunidade da presente invenção ou administrado como uma composição separada a um paciente em combinação com o agente indutor de imunidade da presente invenção.

[043] Exemplos do imunoaprimorador incluem adjuvantes. Os adjuvantes podem intensificar a resposta imune fornecendo-se um reservatório de antígeno (de modo extracelular ou dentro de macrófagos), ativando-se macrófagos e estimulando-se conjuntos específicos de linfócitos, intensificando, desse modo, a resposta imune e consequentemente a ação anticâncer. Portanto, especialmente em casos em que o agente indutor de imunidade da presente invenção é usado para a terapia e/ou a profilaxia de câncer, o agente indutor de imunidade compreende preferencialmente um adjuvante, além do polipeptídio descrito acima como um ingrediente eficaz. Muitos tipos de adjuvantes são bem conhecidos na técnica, e qualquer um desses adjuvantes pode ser usado. Exemplos específicos dos adjuvantes incluem MPL (SmithKline Beecham), homólogos de lipopolissacarídeo de Salmonella minnesota Re 595 obtidos após purificação e hidrólise de ácido do lipopolissacarídeo; QS21 (SmithKline Beecham), saponina de QA-21 purificada a partir de um extrato de Quillja saponaria; DQS21 descrito no Pedido PCT no WO 96/33739 (SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 e QS-L1 (So e 10 colegas, “Molecules and cells”, 1997, Volume 7, página 178 a 186); um adjuvante incompleto de Freund; um adjuvante completo de Freund; vitamina E; Montanide; alúmen; oligonucleotídeos CpG (consulte, por exemplo, Kreig e 7 colegas, Nature, Volume 374, página 546 a 549); poli-I:C e derivados dos mesmos (por exemplo, poli ICLC); e várias emulsões de água em óleo preparada a partir de óleo biodegradáveis tais como esqualeno e/ou tocoferol. Dentre esses, um adjuvante incompleto de Freund; Montanide; poli-I:C e derivados dos mesmos; e oligonucleotídeos de CpG são preferenciais. A razão de misturação entre o adjuvante descrito acima e o polipeptídio é tipicamente cerca de 1:10 a 10:1, preferencialmente cerca de 1:5 a 5:1, mais preferencialmente cerca de 1:1. Entretanto, o adjuvante não é limitado aos exemplos descritos acima, e adjuvantes conhecidos na técnica diferentes daqueles descritos acima também podem ser usados quando o agente indutor de imunidade da presente invenção é administrado (consulte, por exemplo, Goding, “Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", 2a edição, 1986). Os métodos de preparação para misturas ou emulsões de um polipeptídio e um adjuvante são bem conhecidos por aqueles versados na técnica de vacinação.

[044] Ademais, além dos adjuvantes descritos acima, fatores que estimulam a resposta imune do indivíduo podem ser usados como o imunoaprimorador descrito acima. Por exemplo, várias citocinas que têm uma propriedade para estimular linfócitos e/ou células apresentadoras de antígeno podem ser usadas como o imunoaprimorador em combinação com o agente indutor de imunidade da presente invenção. Várias de tais citocinas que têm a capacidade de intensificar a resposta imune são conhecidas por aqueles versados na técnica, e exemplos das citocinas incluem, mas sem se limitar, interleucina-12 (IL-12), GM-CSF, IL-18, interferon-α, interferon-β, interferon-w, interferon-Y, e ligante de Flt3, as quais têm sido demostradas como intensificadoras da ação profilática de vacinas. Tais fatores podem ser usados, ainda, como o imunoaprimorador descrito acima, e podem estar contidos no agente indutor de imunidade da presente invenção, ou podem ser preparados como uma composição separada a ser administrada a um paciente em combinação com o agente indutor de imunidade da presente invenção.

[045] Colocando-se o polipeptídio descrito acima em contato com células apresentadoras de antígeno in vitro, as células apresentadoras de antígeno podem ser criadas para apresentar o polipeptídio. Ou seja, os polipeptídios (a) a (c) descritos acima podem ser usados como agentes para tratar células apresentadoras de antígeno. Exemplos das células apresentadoras de antígeno que podem ser usadas preferencialmente incluem células dendríticas e células B que têm moléculas de classe I de MHC. Várias moléculas de classe I de MHC foram identificados e são bem conhecidas. As moléculas de MHC em humanos são chamadas HLA. Exemplos de moléculas de classe I de HLA incluem HLA-A, HLA-B e HLA-C, mais especificamente, HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA- A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA- B37, HLA-Cw0401 e HLA-Cw0602.

[046] As células dendríticas ou células B que têm moléculas de classe I de MHC podem ser preparadas a partir de sangue periférico através de um método bem conhecido. Por exemplo, células dendríticas específicas a um tumor podem ser incluídas induzindo-se células dendríticas a partir de medula óssea, sangue de cordão umbilical ou sangue periférico de um paciente com o uso de um fator de estimulação de colônia de granulócitos-macrófagos (GM- CSF) e IL-3 (ou IL-4), e em seguida adicionando-se um peptídeo relacionado a um tumor ao sistema de cultura.

[047] Administrando-se uma quantidade eficaz de tais células dendríticas, uma resposta desejada para terapia de um câncer pode ser induzida. Como as células, a medula óssea ou o sangue de cordão umbilical dados por um individual saudável, ou a medula óssea, sangue periférico ou similares do paciente podem ser usados. Quando células autólogas do paciente são usadas, alta segurança pode ser alcançada e espera-se que efeitos colaterais sérios sejam evitados. O sangue periférico ou a medula óssea pode ser qualquer um dentre uma amostra nova, uma amostra armazenada a frio e uma amostra criopreservada. Em relação ao sangue periférico, o sangue total pode ser cultivado ou os componentes de leucócito sozinhos podem ser separados e cultivados, e o último é mais eficiente e, assim, preferencial. Além disso, dentre os componentes de leucócito, células mononucleares podem ser separadas. Em casos em que as células são originadas de medula óssea ou de sangue de cordão umbilical, as células totais que constituem a medula óssea podem ser cultivadas, ou células mononucleares podem ser separadas das mesmas e cultivadas. Sangue periférico, os componentes de leucócito do mesmo e células de medula óssea contêm células mononucleares, células- tronco hematopoiéticas e células dendríticas imaturas, a partir das quais células dendríticas são originadas, e também Células CD4-positivas e similares. O método de produção para a citocina não é restrito, e uma citocina de ocorrência natural ou recombinante ou similares pode ser empregada contanto que a segurança e atividade fisiológica tenham sido confirmadas. Preferencialmente, uma preparação com qualidade garantida para uso médico é usada na quantidade mínima necessária. A concentração da(s) citocina(s) a ser(em) adiciona(s) não é restrita contanto que as células dendríticas sejam induzidas na concentração e, normalmente, a concentração total da(s) citocina(s) é preferencialmente cerca de 0,01 a 1 g/m3 (10 a 1.000 ng/ml), mais preferencialmente cerca de 0,02 a 05 g/m3 (20 a 500 ng/ml). A cultura pode ser realizada com o uso de um meio bem conhecido normalmente usado para a cultura de leucócitos. A temperatura de cultura não é restrita contanto que a proliferação de leucócitos seja possível na temperatura, e uma temperatura de cerca de 37 °C, que é a temperatura corporal de um humano, tem a máxima preferência. O ambiente atmosférico durante a cultura não é restrito contanto que a proliferação dos leucócitos seja possível sob o ambiente, e a cultura seja preferencialmente realizada sob um fluxo de 5% de CO2. O período de cultura não é restrito contanto que um número necessário das células seja induzido, e é normalmente de 3 dias a 2 semanas. Em relação aos aparelhos usados para a separação e cultura das células, aparelhos apropriados, preferencialmente aqueles cuja segurança mediante aplicação para usos médicos foi confirmada e cujas operações são estáveis e simples, podem ser empregados. Em particular, exemplos do aparelho de cultura celular incluem não apenas vasos gerais tais como placas de Petri, frascos e garrafas, mas também vasos do tipo camada, vasos de estágios múltiplos, garrafas de rolos, garrafas do tipo girador, vasos de cultura do tipo saco e colunas de fibra oca.

[048] O método em si a ser usado para colocar o polipeptídiodescrito acima em contato com as células apresentadoras de antígeno in vitro pode ser aquele bem conhecido na técnica. Por exemplo, as célulasapresentadoras de antígeno podem ser cultivadas em um meio de cultura que contém o polipeptídio descrito acima. A concentração do peptídeo no meio não é restrita, e é normalmente cerca de 1 a 100 μg/ml, preferencialmente cerca de 5 a 20 μg/ml. A densidade celular durante a cultura não é restrita e é normalmente cerca de 103 a 107 células/ml, preferencialmente cerca de 5x104 a 5x106 células/ml. A cultura é preferencialmente realizada de acordo com um método convencional a 37 °C sob a atmosfera de 5% de CO2. O comprimento máximo do peptídeo que pode ser apresentado na superfície das células apresentadoras de antígeno é normalmente cerca de 30 resíduos de aminoácido. Portanto, em casos em que as células apresentadoras de antígeno são colocadas em contato com o polipeptídio in vitro, o polipeptídio pode ser preparado de modo que o comprimento do mesmo seja inferior a cerca de 30 resíduos de aminoácido, embora o comprimento não seja restrito.

[049] Cultivando-se as células apresentadoras de antígeno na coexistência do polipeptídio descrito acima, o polipeptídio é incorporado nas moléculas de MHC das células apresentadoras de antígeno e apresentado na superfície das células apresentadoras de antígeno. Portanto, com o uso do polipeptídio descrito acima, células apresentadoras de antígeno isoladas que contêm o complexo entre o polipeptídio e a molécula de MHC podem ser preparadas. Tais células apresentadoras de antígeno podem apresentar o polipeptídio contra células T in vivo ou in vitro, para induzir, e permitir a proliferação, de células T citotóxicas específicas ao polipeptídio.

[050] Colocando-se as células apresentadoras de antígeno assim preparadas que têm o complexo entre o polipeptídio descrito acima e a molécula de MHC em contato com células T in vitro, células T citotóxicas específicas ao polipeptídio podem ser induzidas e permitidas a proliferar. Isso pode ser realizado através de cocultura das células apresentadoras de antígeno e células T descritas acima em um meio líquido. Por exemplo, as células apresentadoras de antígeno podem ser suspensas em um meio líquido e colocadas em um vaso tal como uma cavidade de uma microplaca, seguido da adição de células T à cavidade e, em seguida, realizando-se a cultura. A razão de misturação das células apresentadoras de antígeno para as células T na cocultura não é restrita, e é normalmente cerca de 1:1 a 1:100, preferencialmente cerca de 1:5 a 1:20 em termos no número de célula. A densidade das células apresentadoras de antígeno a serem suspensas no meio líquido não é restrita, e é normalmente cerca de 100 a 10.000,000 células/ml, preferencialmente cerca de 10.000 a 1.000.000 células/ml. A cocultura é preferencialmente realizada através de um método convencional a 37°C sob a atmosfera de 5% de CO2. O período de cultura não é restrito, e é de normalmente 2 dias a 3 semanas, preferencialmente cerca de 4 dias a 2 semanas. A cocultura é preferencialmente realizada na presença de uma ou mais interleucinas tais como IL-2, IL-6, IL-7 e/ou IL-12. Em tais casos, aconcentração de IL-2 ou IL-7 é normalmente cerca de 5 a 20 U/ml, aconcentração de IL-6 é normalmente cerca de 500 a 2.000 U/ml, e aconcentração de IL-12 é normalmente cerca de 0,005 a 0,02 g/m3 (5 a 20ng/ml), mas as concentrações das interleucinas não é restrita a esses valores. A cocultura acima pode ser repetida de uma a diversas vezes com a adição de células apresentadoras de antígeno novas. Por exemplo, a operação de descarte do sobrenadante de cultura após a cocultura e a adição de uma suspensão nova de células apresentadoras de antígeno para conduzir adicional a cocultura podem ser repetidas de uma a diversas vezes. As condições para cada cocultura podem ser iguais àquelas descritas acima.

[051] Através da cocultura descrita acima, as células T citotóxicas específicas ao polipeptídio são induzidas e permitidas a proliferar. Assim, com o uso do polipeptídio descrito acima, podem ser preparadas células T isoladas que se ligam seletivamente ao complexo entre o polipeptídio e a molécula de MHC.

[052] Conforme descrito nos Exemplos abaixo, o gene SCD1 é expresso especificamente em células cancerosas de mama, tecidos de câncer de mama, células de tumor cerebral, tecidos de tumor cerebral, células cancerosas de cólon, tecidos de câncer de cólon, tecidos de adenocarcinoma perianal, células de adenocarcinoma perianal, tecidos de mastocitoma, células de mastocitoma, células de neuroblastoma, células cancerosas renais, tecidos de câncer renal, células cancerosas de fígado, tecidos de câncer de fígado, células cancerosas de pulmão, tecidos de câncer de pulmão, células cancerosas de próstata, tecidos de câncer de próstata e células de leucemia. Portanto, considera-se que, nessas espécies de câncer, existe uma quantidade significativamente maior de SCD1 do que em células normais. Quando as células T citotóxicas assim preparadas são administradas a um corpo vivo tal como uma parte de polipeptídio de SCD1 presente em células cancerosas é apresentada pelas moléculas de MHC na superfície das células cancerosas, as células T citotóxicas podem danificar as células cancerosas com o uso do polipeptídio apresentado como um marcador. Visto que as células apresentadoras de antígeno que apresentam uma parte do polipeptídio de SCD1 descrito acima podem induzir, e permitir a proliferação, de células T citotóxicas específicas ao polipeptídio também in vivo, as células cancerosas podem ser danificadas, ainda, através da administração das células apresentadoras de antígeno a um corpo vivo. Ou seja, as células T citotóxicas e as células apresentadoras de antígeno preparadas com o uso do polipeptídio também são eficazes como agentes terapêuticos e/ou profiláticos para câncer, de modo semelhante ao agente indutor de imunidade da presente invenção.

[053] Em casos em que as células apresentadoras de antígeno isoladas ou células T isoladas descritas acima são administradas a um corpo vivo, essas são preferencialmente preparadas tratando-se as células apresentadoras de antígeno ou células T coletadas do paciente a ser tratado, com o uso do polipeptídio (a), (b) ou (c) conforme descrito acima a fim de evitar a resposta imune no corpo vivo que ataca essas células como corpos estranhos.

[054] O agente terapêutico e/ou profilático para câncer que compreende como um ingrediente eficaz as células apresentadoras de antígeno ou as células T é preferencialmente administrado através de uma rota de administração parenteral, por exemplo, por administração intravenosa ou intra-arterial. A dose é selecionada de modo apropriado dependendo do sintoma, da finalidade de administração e similares, e é normalmente de 1 célula a 10.000.000.000.000 células, preferencialmente 1.000.000 células a 1.000.000.000 células, sendo que a dose é preferencialmente administrada uma vez a cada vários dias a uma vez a cada vários meses. A formulação pode ser, por exemplo, as células suspensas em solução salina fisiologicamente tamponada, e a formulação pode ser usada em combinação com outra(s) preparação/preparações anticâncer e/ou citocina(s). Além disso, um ou mais aditivos bem conhecidos no campo de formulação de agentes farmacêuticos também podem ser adicionados.

[055] Além disso, expressando-se um polinucleotídeo que codifica qualquer um dos polipeptídios (a) a (c) no corpo do animal em questão, a produção de anticorpo e células T citotóxicas pode ser induzida no corpo vivo, e um efeito comparável àquele obtido no caso de administração do polipeptídio pode ser obtido. Ou seja, o agente indutor de imunidade da presente invenção pode ser um que compreende como um ingrediente eficaz um vetor recombinante que tem um polinucleotídeo que codifica qualquer um dos polinucleotídeos (a) a (c), sendo que o vetor recombinante tem a capacidade de expressar o polipeptídio em um corpo vivo. Tal vetor recombinante que tem a capacidade de expressar um polipeptídio antigênico conforme mostrado nos Exemplos posteriormente mencionados também é chamado de uma vacina gênica.

[056] O vetor usado para a produção da vacina gênica não é restrito contanto que seja um vetor que tem a capacidade de expressar o polipeptídio em uma célula do animal em questão (preferencialmente em uma célula de mamífero), e pode ser um vetor plasmídico ou um vetor viral, e qualquer vetor conhecido no campo de vacinas gênicas pode ser usado. O polinucleotídeo tal como DNA ou RNA que codifica o polipeptídio descrito acima pode ser facilmente preparado conforme mencionado acima através de um método convencional. A incorporação do polinucleotídeo no vetor pode ser realizada com o uso de um método bem conhecido por aqueles versados na técnica.

[057] A rota de administração da vacina gênica é preferencialmente uma rota parenteral tal como administração intramuscular, subcutânea, intravenosa ou intra-arterial. A dose pode ser selecionada de modo apropriado dependendo do tipo do antígeno e similares, e é normalmente cerca de 0,1 μg a 100 mg, preferencialmente cerca de 1 μg a 10 mg em termos do peso da vacina gênica por quilo de peso corporal.

[058] Exemplos do método que usa um vetor viral incluem aqueles em que um polinucleotídeo que codifica o polipeptídio descrito acima é incorporado em um vírus de RNA ou um vírus de DNA, tal como um retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associado, vírus de herpes, vírus vaccinia, vírus de catapora, poliovírus ou vírus Sindbis, e em seguida um animal em questão é infectado com o vírus resultante. Dentre esses métodos, aqueles que usam um retrovírus, adenovírus, um vírus adeno-associado, vírus vaccinia ou similares são especialmente preferenciais.

[059] Exemplos de outros métodos incluem um método em que um plasmídeo de expressão é administrado diretamente de modo intramuscular (método de vacina de DNA), e o método de lipossoma, método de lipofectina, método de microinjeção, método de fosfato de cálcio e método de eletroporação. O método de vacina de DNA e o método de lipossoma são especialmente preferenciais.

[060] Métodos para produzir o gene que codifica o polipeptídio descrito acima usado na presente invenção que na verdade atuam como um agente farmacêutico incluem métodos in vivo em que o gene é introduzido diretamente no corpo, e métodos ex vivo em que um determinado tipo de células é coletado do animal em questão e o gene é, então, introduzido nas células ex vivo, seguido do retorno das células ao corpo (Nikkei Science, 1994, abril, página 20 a 45; The Pharmaceutical Monthly, 1994, Volume 36, no 1, página 23 a 48; Experimental Medicine, Edição Extra, 1994, Volume 12, no 15; e referências citadas nessas literaturas, e similares). Os métodos in vivo são mais preferenciais.

[061] Em casos em que o gene é administrado através de um método in vivo, o gene pode ser administrado através de uma rota de administração apropriada dependendo da doença a ser tratada, do sintoma e similares. O gene pode ser administrado, por exemplo, através de administração intravenosa, intra-arterial, subcutânea ou intramuscular. Em casos em que o gene é administrado através de um método in vivo, o gene pode ser formulado em uma preparação tal como uma solução e, em geral, é formulado em uma solução de injeção ou similares que contêm DNA que codifica o peptídeo da presente invenção descrito acima como um ingrediente eficaz. Um carreador comumente usado também pode ser adicionado à mesma, conforme requerido. Em casos de um lipossoma ou lipossoma de fusão de membrana ((HVJ)-lipossoma de vírus Sendai ou similares) que contém o DNA, o lipossoma pode ser formado em uma preparação de lipossoma tal como uma suspensão, preparação congelada ou uma preparação congelada concentrada de modo centrífugo.

[062] Na presente invenção, “a sequência-base de SEQ ID NO:1” inclui não apenas uma sequência-base real de SEQ ID NO:1, mas também a sequência complementar a essa. Assim, “o polinucleotídeo que tem a sequência-base de SEQ ID NO:1” inclui o polinucleotídeo de fita única que tem a sequência-base real de SEQ ID NO:1, o polinucleotídeo de fita única que tem a sequência-base complementar à mesma, e o polinucleotídeo de fita dupla composto desses polinucleotídeos de fita única. Quando um polinucleotídeo que codifica o polipeptídio usado na presente invenção é preparado, qualquer uma dessas sequências-base é selecionada de modo apropriado, e aqueles versados na técnica podem facilmente realizar a seleção.

EXEMPLOS

[063] A presente invenção será descrita agora de modo mais concreto por meio de Exemplos.

EXEMPLO 1: OBTER UMA PROTEÍNA ANTIGÊNICA CANCEROSA INOVADORA ATRAVÉS DO MÉTODO SEREX(1) Preparação de Biblioteca de cDNA

[064] O RNA total foi extraído dos testículos de um cão através do método de ácido-guanídio-fenol-clorofórmio, e o RNA poli(A) foi purificado com o uso do kit de purificação Oligotex-dT30 mRNA (fabricado pela Takara Shuzo Co., Ltd.) em conformidade com o protocolo anexo ao kit.

[065] Com o uso do mRNA obtido (5 μg), uma biblioteca de fago de cDNA foi sintetizada. Para a preparação de uma biblioteca de fago de cDNA, um kit de Síntese de cDNA, kit de Síntese de Zap-cDNA e um Kit de Clonagem de ZAP-cDNA Gigapack III Gold (fabricado pela STRATAGENE) foram usados em conformidade com os protocolos anexos aos kits. O tamanho da biblioteca de fago de cDNA preparada foi de 1 x 106 pfu/ml.(2) Triagem de Biblioteca de cDNA com Soro

[066] Com o uso da biblioteca de fago de cDNA preparada dessa maneira, uma imunotriagem foi realizada. Mais especificamente, o hospedeiro E. coli (XL1-Blue MRF’) foi infectado com a biblioteca de modo que 2.340 clones aparecessem em uma placa de agarose NZY com um tamanho de 90 mm dia. x 15 mm, e cultivada a 42 °C por 3 a 4 horas para permitir que o fago formasse placas. A placa foi coberta com uma membrana de nitrocelulose (Hybond C Extra: fabricada pela GE Healthcare Bio-Science) impregnada com IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosideo) a 37 °C por 4 horas para permitir a indução e expressão de proteínas, e as proteínas foram transferidas para a membrana. Subsequentemente, a membrana foi recoberta e embebida em TBS (Tris-HCl 10 μM, NaCl 150 μM; pH 7,5) suplementada em 0,5% de leite em pó desnatado. A membrana foi, então, agitada a 4 °C de um dia para o outro para suprimir reações não específicas. Esse filtro foi então permitido a reagir com o soro de um paciente canino diluído 500 vezes em temperatura ambiente por 2 a 3 horas.

[067] Como o soro de paciente canino descrito acima, soro coletado de um paciente canino com um tumor perianal foi usado. O soro foi armazenado a -80 °C e pré-tratado imediatamente antes do uso. O método do pré-tratamento do soro foi como segue. Ou seja, o hospedeiro E. coli (XL1-Blue MRF’) foi infectado com fago À ZAP Express que não tem qualquer gene estranho inserido, e em seguida cultivado em um meio de placa NZY a 37 °C de um dia para o outro. Subsequentemente, um tampão de NaHCO3 0,2 M (pH 8,3) suplementado com NaCl 0,5 M foi adicionado à placa, e a placa ficou em repouso a 4 °C por 15 horas, seguido da coleta do sobrenadante com um extrato de fago/E. coli. Depois disso, o extrato de fago/E. coli foi passado através de uma coluna de NHS (fabricada pela GE Healthcare Bio-Science) para imobilizar proteínas derivadas do E. coli/fago na mesma. O soro do paciente canino foi passado através dessa coluna de imobilização de proteínas, e reagido com a mesma, para remover anticorpos que adsorvem para E. coli e/ou o fago. A fração de soro que passou através da coluna foi diluída 500 vezes com TBS suplementada com 0,5% de leite em pó desnatado, e o diluente resultante foi usado como o material para a imunotriagem.

[068] A membrana na qual o soro assim tratado e a proteína de fusão descrita acima foram engarrafados foi lavada 4 vezes com TBS-T (0,05% de Tween 20/TBS), e reagida com IgG anticanino de cabra (Conjugado de HRP de IgG-h+I Anticanino de Cabra: fabricado pelos BETHYL Laboratories) diluído 5.000 vezes com TBS suplementada com 0,5% leite em pó desnatado como um anticorpo secundário em temperatura ambiente por 1 hora, seguido da detecção através de reação de coloração de enzima com o uso de uma solução de reação NBT/BCIP (fabricado pela Roche). As colônias em posições que correspondem a sítios positivos para reação de coloração foram recobertas a partir da placa de agarose NZY que tem um tamanho de 90 mm dia. x 15 mm, e dissolvidas em 500 μl de tampão de SM (NaCl 100 μM, MgClSO4 10 μM, Tris-HCl 50 μM, 0,01% de gelatina; pH 7,5). A triagem foi repetida como a segunda e a terceira triagem da mesma maneira conforme descrito acima até que uma colônia positiva para reação de coloração foi obtida. O isolamento da colônia positiva única foi alcançado após a triagem de 9.110 clones de fago reativos com IgG no soro.(3) Pesquisa de Homologia de Sequência de Gene Antigênico Isolado

[069] Para submeter o clone positivo único isolado através do método descrito acima a uma análise de sequência-base, foi realizada uma operação de conversão do vetor fágico a um vetor plasmídico. Mais especificamente, 200 μl de uma solução preparada de modo que o hospedeiro E. coli (XL1-Blue MRF’) fosse contido em uma absorvência OD600 de 1,0 foram misturados com 100 μl de uma solução de fago purificada e adicionalmente com 1 μl de fago auxiliador ExAssist (fabricado pela STRATAGENE), e a reação foi então permitido a prosseguir a 37 °C por 15 minutos. Isso foi seguido pela adição de 3 ml de meio LB à mistura de reação, e a cultura foi realizada com a mistura resultante a 37 °C por 2,5 a 3 horas. A cultura resultante foi incubada imediatamente em um banho de água a 70 °C por 20 minutos. A cultura foi, então, centrifugada a 4 °C a 1.000 xg por 15 minutos, e o sobrenadante foi recuperado como uma solução fagomídica. Subsequentemente, 200 μl de uma solução preparada de modo que o hospedeiro de fagomídeo de E. coli (SOLR) fosse contido em uma absorvência OD600 de 1,0 foram misturadas com 10 μl de uma solução de fago purificada, e a reação foi permitida a prosseguir a 37 °C por 15 minutos. Depois disso, 50 μl da mistura de reação foram plaqueados em um meio de ágar LB suplementado com ampicilina (concentração final: 50 μg/ml), e a cultura foi realizada a 37 °C de um dia para o outro. Uma colônia única de SOLR transformada foi recuperada e cultivada em meio LB suplementado com ampicilina (concentração final: 50 μg/ml) a 37 °C, seguida da purificação de DNAplasmídico que tem o inserto de interesse com o uso de um Kit Miniprep de plasmídeo QIAGEN (fabricado pela Qiagen).

[070] O plasmídeo purificado foi submetido a análise da sequência de comprimento completo do inserto através do método de deslocamento de iniciador com o uso do iniciador de T3 de SEQ ID NO:7 e o iniciador de T7 de SEQ ID NO:8. Através dessa análise de sequência, a sequência gênica de SEQ ID NO:1 foi obtida. Com o uso da sequência-base e da sequência de aminoácido desse gene, uma pesquisa de homologia contra genes conhecidos foi realizada com o uso de um programa de pesquisa de homologia de sequência BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Como resultado, foi revelado que o gene obtido é o gene SCD1. SCD1 humano, que é um fator homólogo humano de SCD1 canino, teve uma identidade de sequência de 89% em termos da sequência-base e 90% em termos dasequência de aminoácido; SCD1 de camundongo, que é um fator homólogo de camundongo, teve uma identidade de sequência de 84% em termos dasequência-base e 84% em termos da sequência de aminoácido. A sequência- base e a sequência de aminoácido de SCD1 humano são mostrados na SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, respectivamente, e a sequência-base e a sequência de aminoácido de SCD1 de camundongo são mostradas na SEQ ID NO:5 e na SEQ ID NO:6, respectivamente.(4) Análise de Expressão em Vários Tecidos

[071] A expressão dos genes obtidos através do método acima em tecidos normais de camundongo, humanos e cães, e várias linhagens celulares, foram investigadas através do método de PCR de RT (PCR de Transcrição Reversa). A reação de transcrição reversa foi realizada como segue. Ou seja, de 50 a 100 mg de cada tecido ou 5 x 106 a 10 x io6 células de cada linhagem celular, o RNA total foi extraído com o uso do reagente TRIZOL (fabricado pela Invitrogen) de acordo com protocolo descrito nas instruções anexas. Com o uso desse RNA total, o cDNA foi sintetizado com o Sistema de Síntese de Primeira Fita Sobrescrita para PCR de RT (fabricado pela Invitrogen) de acordo com o protocolo descrito nas instruções anexas. Como os cDNAs de tecidos humanos normais (cérebro, hipocampo, testículos, cólon e placenta), cDNA Gene Pool (fabricado pela Invitrogen), cDNA QUICKClone (fabricado pela CLONETECH) e Biblioteca de cDNA Large-Insert (fabricado pela CLONETECH) foram usados. A reação PCR foi realizada com o uso de iniciadores específicos ao gene obtido (os iniciadores de cão mostrados nas SEQ ID NOs:9 e 10, os iniciadores de humano mostrados nas SEQ ID NOs:11 e 12, e os iniciadores de camundongo mostrados nas SEQ ID NOs:13 e 14) conforme descrito abaixo. Ou seja, os reagentes e o tampão anexo foram misturados de modo que 0,25 μl da amostra preparada através da reação de transcrição reversa, 2 μM de cada um dos iniciadores acima, 0,2 μM de cada um dos dNTPs e 0,65 U de ExTaq polimerase (fabricada pela Takara Shuzo Co., Ltd.) fossem contidos na mistura resultante em um volume final de 25 μl, e a reação foi realizada por 30 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 55 °C por 30 segundos e 72 °C por 1 minuto com o uso de um Termociclador (fabricado pela BIO RAD). Como um controle para comparação, iniciadores específicos a GAPDH (os iniciadores de GAPDH de humano e de cão são mostrados nas SEQ ID NOs:15 e 16; e os iniciadores de GAPDH de camundongo são mostrados nas SEQ ID NOs:17 e 18) foram usados ao mesmo tempo. Como resultado, conforme mostrado na Figura 1, o SCD1 de gene canino não foi expresso na maior parte dos tecidos de cão saudáveis, enquanto o gene foi fortemente expresso nos tecidos tumorais caninos. Além disso, em termos dos SCD1s de gene de camundongo e de humano, a expressão não foi observada na maior parte dos tecidos de camundongo e humanos normais, enquanto a expressão foi detectada na maior parte das linhagens celulares de câncer (Figuras 2 e 3), como no caso do gene SCD1 canino.(5) Análise Quantitativa de Expressão em Vários Tecidos

[072] O gene obtido através do método acima foi submetido à investigação de expressão em tecidos normais humanos através do método de PCR de RT quantitativa (PCR de Transcrição Reversa). Como cDNAs para tecidos normais humanos e tecidos de câncer, o Painel I de Análise de Câncer em Tempo Real de Varredura de Tecido (fabricado pela ORIGENE) foi usado. A PCR de RT quantitativa foi realizada com o uso do Termociclador CFX96 Real Time Cystem - C1000, fabricado pelos Bio-Rad Laboratories, Inc. A reação PCR foi realizada como segue com o uso de iniciadores específicos ao gene obtido (mostrados nas SEQ ID NOs:11 e 12). Ou seja, 5 μl da amostra de cDNA, 2 μM de cada um dos iniciadores, e os reagentes e o tampão contido em 2 x SYBR Premix Ex TaqII polimerase (fabricada pela Takara Shuzo Co., Ltd.) foram misturados juntos para preparar uma mistura em um volume final de 20 μl, e a reação foi realizada por 30 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 55 °C por 30 segundos e 72 °C por 1 minuto. Como resultado, o nível de expressão do gene SCD1 em cada um dentre câncer de mama, câncer de cólon, câncer renal, câncer de fígado, câncer de próstata e câncer de pulmão foi superior a 4 vezes maior que o nível de expressão em seu tecido normal correspondente. Com base nesses resultados, é possível esperar que não exista qualquer problema de ocorrência de efeitos colaterais por agentes antitumorais direcionados a SCD1 humano em tecidos normais, e que o benefício do efeito farmacológico dos agentes seja amplamente superior ao risco dos efeitos colaterais dos mesmos.

EXEMPLO 2: ANÁLISE QUANTO À ANTIGENICIDADE DE CÂNCER DE SCD1 IN VIVO(1) Preparação de Vetor Recombinante que expressa SCD1 in vivo

[073] Com base na sequência-base de SEQ ID NO:5, um vetor recombinante que expressa SCD1 in vivo foi preparado. A PCR foi preparada a partir da linhagem celular N2a de câncer de camundongo (adquirida da ATCC), que mostrou a expressão no Exemplo 1. Os reagentes e o tampão anexo foram misturados de modo que 1 μl do cDNA, 0,4 μM de cada um dos dois tipos de iniciadores que têm os sítios de restrição HindIII e XbaI (mostrados nas SEQ ID NOs:19 e 20), dNTP 0,2 μM e 1,25 U de PrimeSTAR HS polimerase (fabricada pela Takara Shuzo Co., Ltd.) fossem contidos na mistura resultante em um volume final de 50 μl, e a PCR foi realizada por 30 ciclos de 98 °C por 10 segundos, 55 °C por 15 segundos e 72 °C por 4 minutos com o uso de um Termociclador (fabricado pela BIO RAD). Os dois tipos de iniciadores descritos acima foram aqueles para amplificação da região que codifica o comprimento completo da sequência de aminoácido de SEQ ID NO:5. Após a PCR, o DNA amplificado foi submetido a eletroforese com o uso de 1% de gel de agarose, e um fragmento de DNA de cerca de 1.000 bp foi purificado com o uso do Kit de Extração de Gel QIAquick (fabricado pela QIAGEN).

[074] O fragmento de DNA purificado foi ligado em um vetor de clonagem pCR-Blunt (fabricado pela Invitrogen). O E. coli foi transformado com o produto de ligação resultante, e o plasmídeo foi, então, recuperado. A sequência do fragmento de gene amplificado foi confirmada como sendo igual à sequência de interesse através de sequenciamento. O plasmídeo que tem a sequência de interesse foi tratado com enzimas de restrição HindIII e XbaI, e purificado com o uso do Kit de Extração de Gel QIAquick, seguido da inserção da sequência gênica de interesse em um vetor de expressão de mamífero pcDNA3.1 (fabricado pela Invitrogen) que tinha sido tratado com as enzimas de restrição HindIII e XbaI. O uso desse vetor permite a produção de proteína de SCD1 em células de mamífero.

[075] A 100 μg do DNA plasmídico assim preparado, 50 μg de partículas douradas (fabricadas pela Bio Rad), 100 μl de espermidina (fabricada pela SIGMA) e 100 μl de CaCl2 1 M (fabricado pela SIGMA) foram adicionados, e a mistura resultante foi agitada através de aplicação de vórtice, seguido do repouso da mistura por 10 minutos em temperatura ambiente (as partículas resultantes são doravante chamadas de partículas de DNA douradas). A mistura foi, então, centrifugada a 3.000 rpm por 1 minuto e o sobrenadante foi descartado, seguido de enxágue do precipitado 3 vezes com etanol a 100% (fabricado pela WAKO). Às partículas de DNA douradas, foram adicionados 6 ml de etanol 100%, e a mistura resultante foi agitada de modo suficiente através de aplicação de vórtice, seguido do despejamento das partículas de DNA douradas em uma Tubulação Tefzel (fabricada pela Bio Rad) e permitindo-se que as partículas fossem precipitadas na superfície de parede. O etanol foi removido através de secagem por ar da Tubulação Tefzel à qual as partículas de DNA douradas foram fixadas, e o tubo foi então cortado em pedaços que têm um comprimento que é apropriado para uma pistola gênica.(2) Efeito Antitumoral de SCD1 Através do Método de Vacina de DNA

[076] O tubo preparado acima foi fixado em uma pistola gênica, e a vacina de DNA foi administrada de modo transdérmico, através de aplicação de uma pressão de 2,76 MPa (400 psi) com o uso de gás hélio puro, um total de 3 vezes em intervalos de 7 dias à cavidade abdominal de cada um dos 10 indivíduos de camundongos A/J (7 semanas de idade, machos, adquiridos da Japan SLC) e camundongos Balb/c (7 semanas de idade, machos, adquiridos da Japan SLC) sujo pelo tinha sido raspado (isso corresponde à inoculação de 2 μg/individuo do DNA plasmídico). Depois disso, uma linhagem celular N2a de neuroblastoma de camundongo ou uma linhagem celular CT26 de câncer de cólon foi transplantada para cada camundongo em uma quantidade de 1 x 106 células para avaliar o efeito antitumoral (modelo profilático). Para cada modelo, o DNA plasmídico que não contém qualquer gene SCD1 inserido foi administrado a 10 camundongos para fornecer um controle.

[077] O efeito antitumoral foi avaliado com base no tamanho do tumor (eixo geométrico maiorx eixo geométrico menor2 / 2) e a razão de camundongos vivos. Como resultado desse estudo, no modelo profilático que EUA a linhagem celular de neuroblastoma, o tamanho do tumor se tornou 2.966 mm3 e 759 mm3 no Dia 43 no grupo de controle e o grupo administrado com plasmídeo de SCD1, respectivamente. Assim, uma regressão notável do tumor foi observada no grupo administrado com plasmídeo de SCD1. Além disso, como resultado da observação de sobrevivência no modelo profilático que EUA a linhagem celular de neuroblastoma, constatou-se que todos os casos morreram por volta do Dia 74 após a administração no grupo de controle, enquanto 60% dos camundongos sobreviveram no grupo administrado com plasmídeo de SCD1. Esses resultados indicam um efeito antitumoral significativo no grupo administrado com plasmídeo de SCD1 em comparação com o grupo de controle. De modo semelhante, no modelo profilático que EUA a linhagem celular de câncer de cólon, o tamanho do tumor se tornou 2.518 mm3 e 604 mm3 no Dia 33 no grupo de controle e no grupo administrado com plasmídeo de SCD1, respectivamente. Assim, uma regressão notável do tumor foi observada no grupo administrado com plasmídeo de SCD1. Além disso, como resultado de observação de sobrevivência, constatou-se que todos os casos morreram por volta do Dia 54 após a administração no grupo de controle, enquanto 50% dos camundongos sobreviveram no grupo administrado com plasmídeo de SCD1. Esses resultados indicam um efeito antitumoral significativo no grupo administrado com plasmídeo de SCD1 em comparação com o grupo de controle.

EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE PROTEÍNA DE SCD1 RECOMBINANTE HUMANA E AVALIAÇÃO DA HABILIDADE DE INDUÇÃO DE IMUNIDADE DA MESMA(1) Preparação de Proteína de SCD1 Recombinante Humana

[078] Com base na sequência-base de SEQ ID NO:3, uma proteína recombinante de SCD1 humano foi preparada. OS regentes e o tampão anexo foram misturados de modo que 1 μl do cDNA preparado no Exemplo 1 cuja expressão pôde ser confirmada para cDNAs de vários tecidos e células através do método de PCR de RT, 0,4 μM de cada um dos dois tipos de iniciadores que têm os sítios de restrição EcoRI e XhoI (mostrados na SEQ ID NOs:25 e 26), dNTP 0,2 μM e 1,25 U de PrimeSTAR HS polimerase (fabricada pela Takara Shuzo Co., Ltd.) fossem contidos na mistura resultante em um volume final de 50 μl, e a PCR foi realizada por 30 ciclos de 98 °C por 10 segundos, 55 °C por 15 segundos e 72 °C por 4 minuto com o uso de um Termociclador (fabricado pela BIO RAD). Os dois tipos de iniciadores descritos acima foram aqueles para amplificação da região que codifica o comprimento completo da sequência de aminoácido da SEQ ID NO:4. Após a PCR, o DNA amplificado foi submetido a eletroforese com o uso de 1% de gel de agarose, e um fragmento de DNA de cerca de 1.000 bp foi purificado com o uso do Kit de Extração de Gel QIAquick (fabricado pela QIAGEN).

[079] O fragmento de DNA purificado foi ligado a um vetor de clonagem pCR-Blunt (fabricado pela Invitrogen). O E. coli foi transformado com o produto de ligação resultante, e o plasmídeo foi, então, removido. A sequência do fragmento de gene amplificado foi confirmada como sendo igual à sequência de interesse através de sequenciamento. O plasmídeo que tem a sequência de interesse foi tratado com enzimas de restrição EcoRI e XhoI, e purificado com o uso do Kit de Extração de Gel QIAquick, seguido da inserção da sequência gênica de interesse em um vetor de expressão para E. coli, pET30a (fabricado pela Novagen) que tinha sido tratado com as enzimas de restrição EcoRI e XhoI. O uso desse vetor permite a produção de uma proteína recombinante fundida de etiqueta de His. O E. coli para expressão, BL21 (DE3), foi transformado com esse plasmídeo, e a expressão foi induzida com IPTG 1 μM, para permitir a expressão da proteína de interesse m E. coli.(2) Purificação de Proteína de SCD1 Recombinante

[080] O E. coli recombinante assim obtido que expressa a SEQ ID NO:4 foi cultivado em um meio LB suplementado com 100 μg/ml de ampicilina a 37 °C até que a absorvência a 600 nm alcançasse cerca de 0,7, e isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosideo foi, então, adicionado à cultura em uma concentração final de 1 μM, seguida da cultura adicional do E. coli recombinante a 37 °C por 4 horas. Subsequentemente, as células bacterianas foram coletadas através de centrifugação a 4.800 rpm por 10 minutos. A pelota das células bacterianas foi suspensa em uma solução salina tamponada com fosfato e submetida adicionalmente à centrifugação a 4.800 rpm por 10 minutos, para lavar as células bacterianas.

[081] As células bacterianas foram suspensas em tampão de Tris- HCl 50 μM (pH 8,0) e submetidas à sonicação em gelo. O líquido obtido pela sonicação de E. coli foi centrifugado a 6.000 rpm por 20 minutos, para obter o sobrenadante como a fração solúvel e o precipitado como a fração insolúvel.

[082] A fração insolúvel foi suspensa em tampão de Tris-HCl 50 μM (pH 8,0) e em seguida centrifugada a 6.000 rpm por 15 minutos. Essa operação foi repetida duas vezes para remoção de proteases.

[083] O resíduo foi suspenso em tampão de Tris-HCl 50 μM (pH 8,0) suplementado com 6 M de cloridrato de guanidina e 0,15 M de cloreto de sódio, e deixado para repousar a 4 °C por 20 horas para desnaturar a proteína. Depois disso, a suspensão foi centrifugada a 6.000 rpm por 30 minutos, e a fração solúvel obtida foi colocada em uma coluna quelada com níquel preparada através de um método convencional (carreador: Chelating Sepharose (marca comercial) Fast Flow (GE Health Care); volume de coluna: 5 ml; tampão de equilíbrio: tampão de Tris-HCl 50 μM (pH 8,0) suplementado com cloridrato de guanidina 6 M e cloreto de sódio 0,15 M), seguido do repouso do resultante a 4 °C de um dia para o outro para permitir a adsorção do carreador quelado com níquel. O carreador da coluna foi centrifugado a 1.500 rpm por 5 minutos e o sobrenadante resultante foi recoberto. O carreador da coluna foi, então, suspenso em uma solução salina tamponada com fosfato e repreenchido na coluna.

[084] A fração não adsorvida à coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de tampão de acetato 0,1 M (pH 4,0) suplementado com cloreto de sódio 0,5 M e, imediatamente depois disso, elução com tampão de acetato 0,1 M (pH 3,0) suplementado com cloreto de sódio 0,5 M foi realizada para obter uma fração purificada, que foi usada posteriormente como o material para um teste de administração. A presença da proteína de interesse em cada fração eluída foi confirmada através de coloração com Coomassie realizada de acordo com um método convencional.

[085] O tampão da preparação purificada obtida através do método acima foi substituído com um tampão de reação (Tris-HCl 50 μM, NaCl 100 μM, CaCl2 5 μM (pH8,0)), e a amostra resultante foi submetida a clivagem da etiqueta de His com a fator Xa protease e a purificação da proteína de interesse, com o uso de um Kit de Captura de Clivagem de Fator Xa (fabricado pela Novagen) em conformidade com o protocolo anexo ao kit. Subsequentemente, o tampão de 12 ml da preparação purificada obtida através do método acima foi substituído com um tampão de fosfato fisiológico (fabricado pela Nissui Pharmaceutical) com o uso de ultrafiltração NANOSEP 10K OMEGA (fabricada pela PALL), e a amostra resultante foi submetida a uma filtração asséptica através de 0,22 μm de HT Tuffryn Acrodisc (fabricado pela PALL) e usada no experimento.(3) Indução de Células T Citotóxicas CD8-positivas Reativas com Proteína de SCD1 Recombinante Humana.

[086] A partir de um indivíduo saudável, o sangue periférico foi separado e o sangue periférico foi coberto em um meio de separação de Linfócito (OrganonpTeknika, Durham, NC), seguido da centrifugação do resultante a 1.500 rpm em temperatura ambiente por 20 minutos. Uma fração que contém células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foi recuperada e lavada 3 (ou mais) vezes em tampão de fosfato frio, para obter PBMCs. As PBMCs obtidas foram suspensas em 20 ml de meio AIM-V (Life Technololgies, Inc., Grand Island, NY, EUA), e as células foram permitidas a aderir a um frasco de cultura (Falcon) a 37 °C em 5% de CO2 por 2 horas. As células não aderentes foram usadas para a preparação de células T e as células aderentes foram usadas para a preparação de células dendríticas.

[087] Por outro lado, as células aderentes foram cultivadas em um meio AIM-V na presença de IL-4 (1.000 U/ml) e GM-CSF (1.000 U/ml). As células não aderentes obtidas 6 dias depois foram coletas, e a proteína de SCD1 recombinante humana foi adicionada às células em uma concentração de 10 μg/ml, seguido da cultura das células a 37 °C em 5% de CO2 por 4 horas. Depois disso, o meio foi substituído com o meio AIM-V suplementado com IL-4 (1.000 U/ml), GM-CSF (1.000 U/ml), IL-6 (1.000 U/ml, Genzima, Cambridge, MA), IL-1β (0,01 g/m3 (10 ng/ml), Genzima, Cambridge, MA) e TNF-α (0,01 g/m3 (10 ng/ml), Genzima, Cambridge, MA), e a cultura foi realizada por 2 dias adicionais para obter uma população de células não aderentes a serem usadas como células dendríticas.

[088] As células dendríticas preparadas foram suspensas em um meio AIM-V em uma densidade celular de 1 x 106 células/ml, e a proteína de SCD1 recombinante humana foi adicionada novamente em uma concentração de 10 μg/ml à suspensão. Com o uso de uma placa de 96 cavidades, as células foram cultivas a 37 °C em 5% de CO2 por 4 horas. Após a cultura, a irradiação de raio X (3.000 rads) foi realizada, e as células foram lavadas com um meio AIM-V, seguido da suspensão em um meio AIM-V suplementado com 10% de soro AB humano (Nabi, Miami, FL), IL-6 (1.000 U/ml) e IL-12 (0,01 g/m3 (10 ng/ml), Genzima, Cambridge, MA). As células foram colocadas, então, em uma placa de 24 cavidades em uma quantidade de 1x105 células/cavidade. Além disso, a população de célula T preparada foi adicionada a cada cavidade em uma quantidade de 1x 106 células, e cultivada a 37 °C em 5% de CO2. Cada sobrenadante de cultura foi descartado 7 dias depois, e as células dendríticas obtidas da mesma maneira, conforme descrito acima, através do tratamento com a proteína SCD1 humana e a subsequente irradiação de raio X, foram suspensas em um meio AIM-V suplementado com 10% de soro AB humano (Nabi, Miami, FL), IL-7 (10 U/ml, Genzima, Cambridge, MA) e IL-2 (10 U/ml, Genzima, Cambridge, MA) (densidade celular, 1 x 105 células/ml). A suspensão resultante foi adicionada à placa de 24 cavidades em uma quantidade de 1x 105 células/cavidade, e as células foram cultivadas adicionalmente. Após a repetição da mesma operação 4 a 6 vezes em intervalos de 7 dias, as células T estimuladas foram recuperadas, e a indução de células T CD8-positivas foi confirmada por citometria de fluxo.

[089] Como um controle negativo, uma proteína que tem uma sequência que está fora do escopo da presente invenção foi usada (SEQ ID NO:27).

[090] Subsequentemente, foi estudado se as células T CD8- positivas estimuladas com o presente polipeptídio podem danificar ou não as células tumorais de expressão por SCD1.

[091] Em um tubo de centrífuga de 50 ml, 105 células de uma linhagem celular de glioma humano, U-87MG (adquiridas de ATCC), em que a expressão de SCD1 foi confirmada, foram coletadas, e 100 μCi de cromo 51 foram adicionados às células, seguido da incubação da mistura resultante a 37 °C por 2 horas. Depois disso, as células foram lavadas 3 vezes com o meio AIM-V suplementado com 10% de soro AB humano, e colocadas em uma placa de fundo em V de 96 cavidades em uma quantidade de 103 células por cavidade. Subsequentemente, 105, 5x104, 2,5x104 ou 1,25x104 células TCD8-positivas que foram estimuladas com a proteína SCD1 recombinante humana e suspensas em um meio AIM-V suplementado com 10% de soro AB humano foram adicionadas a cada cavidade, e a cultura foi realizada a 37 °C em 5% de CO2 por 4 horas. Depois disso, a quantidade de cromo 51 liberada a partir das células tumorais danificadas no sobrenadante de cultura foi mensurada com o uso de um contador de gama para calcular a atividade citotóxica das células T CD8-positivas estimuladas com a proteína SCD1 recombinante humana.

[092] Como resultado, observou-se que as células T CD8-positivas estimuladas com a proteína SCD1 recombinante humana tiveram atividade citotóxica contra U-87MG. Por outro lado, as células T CD8-positivas induzidas com o uso da proteína de controle negativo (SEQ ID NO:27) não mostraram atividade citotóxica. Assim, foi revelado que a proteína SCD1 recombinante humana usada na presente invenção tem uma capacidade de induzir células T citotóxicas CD8- positivas que podem danificar as células tumorais.

[093] A atividade citotóxica significa a atividade citotóxica das células T CD8-positivas contra U-87MG determinada: misturando-se 105 células T CD8-positivas estimuladas e induzidas, conforme descrito acima, com 103 células da linhagem celular de tumor cerebral maligno U-87MG em que o cromo 51 foi incorporado; cultivando-se a mistura resultante por 4 horas; mensurando-se a quantidade de cromo 51 liberada ao meio após a cultura; e, em seguida, realizando-se o cálculo de acordo com a Equação 1.

[094] Equação 1: Atividade citotóxica (%) = quantidade de cromo 51 liberada a partir de U-87MG após a adição de células T CD8-positivas (cpm)/ quantidade de cromo 51 liberada a partir de células alvo após a adição de ácido clorídrico 1 N (cpm) * 100.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[095] A presente invenção é útil para a terapia e/ou a profilaxia de câncer, visto que a presente invenção fornece um agente indutor de imunidade que contém um polipeptídio que exerce atividade antitumoral contra vários cânceres. 1/1

Claims

1. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, caracterizada porcompreender pelo menos um polipeptídeo que tem atividade indutora de imunidade selecionado dentre os polipeptídeos de sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 4, 22 e 24 em um veículo farmaceuticamente aceitável.

2. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com areivindicação 1, caracterizada por ser um agente para tratar células apresentadoras de antígeno.

3. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 2, caracterizada por ser um agente terapêutico e/ou profilático para câncer(es).

4. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com areivindicação 3, caracterizada pelo(s) dito(s) câncer(es) ser(em) câncer(es) que expressa(m) SCD1.

5. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com qualqueruma das reivindicações 3 a 4, caracterizada pelo(s) dito(s) câncer(es) ser(em) câncer de mama, tumor cerebral, câncer de cólon, adenocarcinoma perianal, neuroblastoma, mastocitoma, câncer renal, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de próstata e/ou leucemia.

6. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por compreender ainda uma molécula imunoestimulatória.

7. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com areivindicação 6, caracterizada pela dita molécula imunoestimulatória ser pelo menos uma selecionada dentre o grupo que consiste em adjuvante incompleto de Freund; Montanide; poli-I:C e derivados dos mesmos; oligonucleotídeos CpG; interleucina-12; interleucina-18; interferon-α; interferon-β; interferon-w; interferon-Y; e ligante Flt3.