ES2589506T3 - Sistema de ensayo para la evaluación de la oncogenicidad, progresión tumoral y eficacia de un tratamiento - Google Patents

Sistema de ensayo para la evaluación de la oncogenicidad, progresión tumoral y eficacia de un tratamiento Download PDF

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ES2589506T3
ES2589506T3 ES13192129.8T ES13192129T ES2589506T3 ES 2589506 T3 ES2589506 T3 ES 2589506T3 ES 13192129 T ES13192129 T ES 13192129T ES 2589506 T3 ES2589506 T3 ES 2589506T3
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Niven Rajin Narain
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Abstract

Método que comprende: medir los niveles de proteínas implicadas en angiogénesis en una muestra de tejido obtenida de un animal, en el que las proteínas comprenden VEGF, HIF-1α, angiostatina y bFGF ; comparar los niveles de las proteínas en la muestra de tejido con un valor de referencia; en el que (A) un aumento en VEGF, un aumento en HIF-1α, un aumento en bFGF y una disminución en angiostatina indica que la muestra es cancerosa; o (B) una disminución en VEGF, una disminución en HIF-1α, una disminución en bFGF y un aumento en angiostatina indica que un tratamiento es eficaz en tratar el cáncer en el animal.

Description

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DESCRIPCION
Sistema de ensayo para la evaluacion de la oncogenicidad, progresion tumoral y eficacia de un tratamiento Antecedentes
El cancer es actualmente una de las principales causas de muerte en los pafses desarrollados. La investigacion reciente ha aumentado enormemente la comprension de muchos de los mecanismos moleculares de la tumorigenesis y ha proporcionado numerosas nuevas vfas para el tratamiento del cancer. Se usan clmicamente sistemas y metodos para evaluar el estadio de un cancer, asf como su oncogenicidad y el grado de progresion tumoral, en un intento por determinar tratamientos apropiados. Tales sistemas y metodos tambien pueden utilizarse para evaluar la eficacia de cualquier tratamiento utilizado.
Siguen siendo deseables metodos mejorados para el tratamiento de enfermedades, incluyendo cancer, que permitan la evaluacion de la oncogenicidad, progresion tumoral y eficacia de un tratamiento.
Wachsberger Phyllis et al. (es decir, Clinical Cancer Research, The American Association For Cancer Research, US, vol. 9, n.° 6, 1 de junio de 2003, paginas 1957 - 1971) comentan las respuestas tumorales a radiacion ionizante combinada con antiangiogenesis o agentes de direccionamiento vascular y exploran mecanismos de interaccion. Singhal S (es decir, Clinical Cancer Research, vol. 11, n.° 11, 1 de junio de 2005, paginas 3974 - 3986) comenta una revision de investigacion clmica del cancer, y en particular implicaciones de pronostico de biomarcadores del ciclo celular, la apoptosis y la angiogenesis en cancer de pulmon de celulas no pequenas. El documento WO 2005/103281 comenta biomarcadores de plaquetas para la deteccion de enfermedad..
Sumario
La presente descripcion proporciona kits de ensayo y sistemas adecuados para su uso en el tratamiento del cancer. Los sistemas y kits de la presente descripcion permiten determinar la naturaleza cancerosa de una muestra de tejido, tal como evaluando el estadio de un cancer, asf como su oncogenicidad y el grado de progresion tumoral. Los kits y sistemas de la presente descripcion tambien pueden utilizarse para determinar tratamientos apropiados asf como la eficacia de cualquier tratamiento utilizado. En realizaciones, sistemas y kits de la presente descripcion pueden utilizarse ensayos, en realizaciones ELISA, para examinar los niveles de marcadores apoptoticos, marcadores de angiogenesis, marcadores de inmunomodulacion y/o marcadores del ciclo celular, y pueden compararse muestras de un paciente tomadas a diferentes tiempos para determinar la oncogenicidad de un cancer, la progresion tumoral y la eficacia de un tratamiento contra el cancer.
En realizaciones, un kit o sistema de la presente descripcion puede utilizar un programa de software para analizar los datos generados por los ensayos de la presente descripcion. En realizaciones, un kit o sistema de la presente descripcion puede incluir un ensayo para medir un nivel de una protema en una muestra de tejido implicada en un proceso celular tal como apoptosis, angiogenesis, inmunomodulacion, desarrollo del ciclo celular y combinaciones de los mismos; y al menos un procesador acoplado a un medio legible por ordenador configurado para almacenar un conjunto de instrucciones que pueden ejecutarse por el al menos un procesador, incluyendo las instrucciones comparar un nivel de la protema en la muestra de tejido con un valor de referencia, y determinar si la muestra de tejido es cancerosa o no.
Tambien se proporcionan metodos que utilizan tales kits y sistemas. En realizaciones, los metodos de la presente descripcion pueden incluir metodos para determinar la naturaleza cancerosa de una muestra de tejido, tal como evaluando la oncogenicidad de un cancer, determinando la progresion de un tumor, determinando la eficacia de un tratamiento contra el cancer, combinaciones de los mismos, y similares.
Descripcion de los dibujos
Se describiran a continuacion en el presente documento diversas realizaciones de la presente descripcion con referencia a las figuras en las que:
la figura 1 incluye el analisis de la apoptosis de una muestra a partir de un informe de ensayo que puede generarse con los sistemas y kits de la presente descripcion;
la figura 2 incluye el analisis de la angiogenesis de una muestra a partir de un informe de ensayo que puede generarse con los sistemas y kits de la presente descripcion;
la figura 3 incluye el analisis de la inmunomodulacion de una muestra a partir de un informe de ensayo que puede generarse con los sistemas y kits de la presente descripcion; y
la figura 4 incluye el analisis del ciclo celular de una muestra a partir de un informe de ensayo que puede generarse con los sistemas y kits de la presente descripcion.
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La invencion se define, entre otros, por los siguientes puntos:
1. Un metodo que comprende:
medir los niveles de protemas implicadas en angiogenesis en una muestra de tejido obtenida de un animal, en el que las protemas comprenden VEGF, HIF-1a, angiostatina y bFGF;
comparar los niveles de las protemas en la muestra de tejido con un valor de referencia; en el que
(A) un aumento en VEGF, un aumento en HIF-1a, un aumento en bFGF y una disminucion en angiostatina indica que la muestra es cancerosa; o
(B) una disminucion en VEGF, una disminucion en HIF-1a, una disminucion en bFGF y un aumento en angiostatina indica que un tratamiento es eficaz en tratar el cancer en el animal.
2. Un sistema para llevar a cabo el metodo del punto 1, que comprende al menos un procesador acoplado a un medio legible por ordenador configurado para almacenar un conjunto de instrucciones que pueden ejecutarse por el al menos un procesador, incluyendo las instrucciones:
comparar los niveles de protemas en una muestra de tejido de un animal con un valor de referencia, en el que las protemas comprenden VEGF, HIF-1a, angiostatina y bFGF; y en el que
(A) un aumento en VEGF, un aumento en HIF-1a, un aumento en bFGF y una disminucion en angiostatina indica que la muestra es cancerosa; o
(B) una disminucion en VEGF, una disminucion en HIF-1a, una disminucion en bFGF y un aumento en angiostatina indica que un tratamiento es eficaz en tratar el cancer en el animal.
3. Un sistema que comprende:
ensayos para medir los niveles de protemas implicadas en angiogenesis en una muestra de tejido, en el que las protemas consisten en VEGF, HIF-1a, angiostatina y bFGF; y al menos un procesador acoplado a un medio legible por ordenador configurado para almacenar un conjunto de instrucciones que pueden ejecutarse por el al menos un procesador, incluyendo las instrucciones las etapas de:
comparar los niveles de las protemas en la muestra de tejido con un valor de referencia; y en el que
(A) un aumento en VEGF, un aumento en HIF-1a, un aumento en bFGF y una disminucion en angiostatina indica que la muestra es cancerosa; o
(B) una disminucion en VEGF, una disminucion en HIF-1a, una disminucion en bFGF y un aumento en angiostatina indica que un tratamiento es eficaz en tratar el cancer en el animal.
4. El metodo del punto 1, realizacion (A), en el que el valor de referencia se obtiene de una muestra anterior obtenida del animal de una region de tejido normal; o en el que el valor de referencia comprende un nivel conocido de las protemas.
5. El sistema del punto 2 o 3, realizacion (A), en el que el valor de referencia se obtiene de una muestra anterior obtenida del animal de una region de tejido normal; o en el que el valor de referencia comprende un nivel conocido de las protemas.
6. El metodo del punto 1, realizacion (B), en el que el valor de referencia se obtiene de una muestra anterior obtenida del animal antes o durante el tratamiento del cancer.
7. El sistema del punto 2 o 3, realizacion (B), en el que el valor de referencia se obtiene de una muestra anterior obtenida del animal antes o durante el tratamiento del cancer.
Descripcion detallada
La presente descripcion proporciona un sistema de ensayo que examina protemas celulares que desempenan un papel vital en la apoptosis (muerte celular programada), angiogenesis (crecimiento de nuevos vasos sangumeos), inmunomodulacion y factores del ciclo celular contribuyendo de ese modo al nivel global de oncogenicidad. Una
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celula cancerosa presenta senalizacion alterada de la expresion genica/proteica de factores relacionados con los procesos mencionados anteriormente. Esto conduce a: un desequilibrio de la homeostasis; perdida de vigilancia inmunitaria y control apoptotico; mutaciones de la autorregulacion inducida por tumores; y aumento de la vasculatura. Estos se combinan para convertirse en los factores desencadenantes que impulsan la aparicion de oncogenesis. Por ejemplo, un aumento de la expresion de Bcl-2, que previene la apoptosis, combinado con una regulacion por disminucion de la expresion Bax, puede ser indicativo de resistencia apoptotica. Por tanto, la medicion de la expresion de protemas como Bax y Bcl-2 antes y despues de un tratamiento contra el cancer puede proporcionar una perspectiva de si un regimen de tratamiento restaura eficazmente el potencial apoptotico en tejido maligno.
Segun la presente descripcion, se proporcionan sistemas y kits que incluyen multiples ensayos que pueden utilizarse para evaluar la malignidad de un cancer, incluyendo su oncogenicidad, asf como la progresion de tumores y la eficacia de tratamientos. Puede utilizarse un componente del ensayo de apoptosis del sistema para indicar si las celulas estan experimentando muerte celular programada a una tasa normal, o si las celulas no estan muriendo como debenan, lo que podna ser indicativo de la naturaleza maligna de las celulas. Una parte del ensayo de angiogenesis del sistema puede medir las secreciones y los receptores celulares de celulas cancerosas para determinar su capacidad para estimular la formacion de nuevos vasos sangumeos que pueden proporcionar nutrientes para facilitar el crecimiento tumoral.
Estos valores pueden utilizarse para cuantificar la progresion de un tumor y la eficacia de tratamientos antiangiogenicos. Pueden utilizarse mediciones de la inmunomodulacion para indicar la respuesta inmunitaria para el crecimiento no controlado de celulas y el nivel de infiltracion en el microentorno tumoral. Finalmente, pueden utilizarse factores del ciclo celular para evaluar la tasa de recambio celular, que es indicativa de la agresividad con la que el tumor puede estar creciendo.
Las cuatro categonas (apoptosis, angiogenesis, inmunomodulacion y factores del ciclo celular) pueden clasificarse en una escala numerica individualmente, sin embargo, un medico puede evaluar los cuatro valores dados conjuntamente, para monitorizar y elegir y seguir un regimen de tratamiento para un tumor maligno.
Una ventaja tecnologica de un kit o sistema de ensayo de la presente descripcion incluye el software que acompana al kit o sistema que analizara las protemas para clasificar la progresion tumoral y la eficacia de un tratamiento en una lectura numerica sencilla. En una realizacion, pueden analizarse los niveles de tantas como 25 protemas para clasificar la progresion tumoral y la eficacia de un tratamiento en una lectura numerica sencilla.
Construccion de un kit de ELISA:
En realizaciones, el sistema de ensayo de la presente descripcion puede incluir un kit de ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA). Puede utilizarse cualquier sistema de ELISA dentro del ambito de los expertos en la tecnica. En realizaciones, el kit de ELISA puede prepararse usando una ruta directa. En otras realizaciones, el kit de ELISA puede prepararse usando una ruta indirecta.
Para un kit de ELISA preparado usando una ruta directa, un metodo adecuado para producir el kit de ELISA incluye la union de un anticuerpo de interes a la base de una placa de 96 pocillos de plastico. Entonces se dispensa una muestra al pocillo y la protema diana se unira a los anticuerpos. Tras eliminar por lavado las protemas que no reaccionaron, puede anadirse a los pocillos en la placa un segundo anticuerpo monoclonal unido a una enzima de registro. Este anticuerpo se une al complejo de protema en el fondo de los pocillos. Se eliminan las protemas que no se unen al complejo lavando los pocillos. Posteriormente, se anade un sustrato enzimatico a los pocillos para iniciar una reaccion con la enzima de registro. La intensidad del cambio de color depende de la concentracion de la enzima de registro unida que se correlaciona con la concentracion de la protema diana.
Para un kit de ELISA preparado usando una ruta indirecta, un metodo indirecto mide los anticuerpos presentes en muestras de un paciente (por ejemplo suero). Se absorbe un antfgeno en la pared de las placas de 96 pocillos. Se anade la muestra del paciente al pocillo y si esta presente el anticuerpo de interes (en el suero del paciente), se unira al antfgeno. Tras lavar las protemas que no reaccionaron, se anade un segundo anticuerpo con una enzima de registro para que se una con los anticuerpos presentes en la muestra del paciente. La adicion de un sustrato enzimatico producira un cambio colorimetrico y la intensidad del cambio de color se medira usando un espectrometro UV-Vis.
En algunas realizaciones, un sistema de ensayo de la presente descripcion puede basarse en un metodo de ELISA directo. Los pocillos de la placa pueden recubrirse con anticuerpos de interes y pueden anadirse muestras homogeneizadas a la placa para cuantificar la expresion proteica de las protemas apoptoticas, angiogenicas, inmunomoduladoras y del ciclo celular.
Otras tecnologfas que pueden utilizarse con un sistema de ensayo de la presente descripcion estan dentro del ambito de los expertos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, tincion inmunohistoqmmica, kits de inmunotransferencia de tipo Western, expresion genica para las protemas correspondientes (incluyendo constructos
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genicos para la expresion proteica) y estudios de proteonomica que, en realizaciones, podnan incluir espectroscopfa de masas.
Las tecnologfas anteriores pueden usarse de manera similar para cuantificar la expresion de protemas apoptoticas, angiogenicas, inmunomoduladoras y del ciclo celular, permitiendo de ese modo determinar la naturaleza cancerosa de una muestra de tejido, tal como evaluando el estadio de un cancer, asf como su oncogenicidad y el grado de progresion tumoral.
Marcadores celulares examinados mediante el sistema de ensayo Marcadores apoptoticos
Puede examinarse cualquier marcador apoptotico usando los sistemas de ensayo de la presente descripcion. Tales marcadores incluyen, pero no se limitan a:
1) Bcl-2: El linfoma de celulas B 2 es una protema antiapoptotica y se regula por incremento en celulas
oncogenicas.
2) Bax: Un miembro proapoptotico de la familia de la protema Bcl-2, se inhibe su actividad por niveles de
Bcl-2 aumentados en > 65% de todos los canceres.
3) Bid: Una protema de la subfamilia BH3 que forma dfmeros con miembros pro/anti y anti-Bcl-2 para
desencadenar que la mitocondria libere factores para iniciar el dano al ADN.
4) Citocromo c: Se libera en presencia de senales proapoptoticas y forma un complejo con Apaf-1 (factor de
activacion de proteasa apoptotica 1: una protema que participa en la apoptosis) para iniciar la actividad de la familia CARD (CARD es el dominio de reclutamiento de caspasas: dominios encontrados en protemas que median en la formacion de complejos mayores y desempenan un papel en procesos incluyendo, por ejemplo, apoptosis). (Por ejemplo Casp-9, Casp-6 y Casp-3).
5) Caspasa-3: Miembro clave de la familia CARD que es el mediador citosolico de punto final que precede al
inicio de la fragmentacion del ADN en el nucleo.
6) p53:
p53 es un factor de transcripcion que regula el ciclo celular y por tanto funciona como supresor de tumores. Es importante en organismos multicelulares ya que ayuda a suprimir el cancer.
Marcadores angiogenicos
Puede examinarse cualquier marcador angiogenico y/o constructo genico usando los sistemas de ensayo de la presente descripcion. Tales marcadores incluyen, pero no se limitan a:
1) VEGF: Factor de crecimiento endotelial vascular. Principal protema responsable del desarrollo de lechos
vasculares que alimentan nutrientes a los tumores y proporciona fundamento para las metastasis. Liberado por celulas para promover la formacion de nuevos vasos.
2) HIF-1 a: Factor 1 alfa inducido por hipoxia. Liberado por las paredes endoteliales del tumor para disminuir
los niveles de oxfgeno (hipoxia), lo que conduce a fuentes alternativas de ATP por medio de flujo glicolftico. Tambien regula por incremento VEGF y por tanto la angiogenesis.
3) bFGF: Factor de crecimiento de fibroblastos basico. Induce replicacion, migracion y proteolisis extracelular
de celulas endoteliales.
4) Angiostatina: Factor antiangiogenico que inhibe la formacion de nuevos vasos.
Inmunomodulacion
Puede examinarse cualquier marcador indicativo de inmunomodulacion usando los sistemas de ensayo de la presente descripcion. Tales marcadores incluyen, pero no se limitan a:
1) TNF -a: Factor de necrosis tumoral-alfa. Una citocina pleiotropica que provoca necrosis en algunos tipos de
celulas tumorales y promueve el crecimiento en otras celulas.
2) IL-6: Interleucina-6. Una respuesta proinflamatoria secretada por celulas T. Se ha mostrado que IL-6
promueve el crecimiento tumoral y es un indicador de pronostico de muchos canceres ya que mitiga la implicacion inmunitaria aumentando posiblemente el efecto angiogenico.
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Ciclo celular
Puede examinarse cualquier marcador indicativo de la situacion de una celula en el desarrollo del ciclo celular usando los sistemas de ensayo de la presente descripcion. Tales marcadores incluyen, pero no se limitan a:
1) p21: un inhibidor de cinasas dependientes de ciclinas (cdk), y es un mediador clave de la detencion del
ciclo celular dependiente de p53 tras dano al ADN.
2) p27: un inhibidor de cinasas dependientes de ciclinas que controla la progresion del ciclo celular en la
fase G1. (La fase G1 es el periodo en el ciclo celular durante la interfase, antes de la mitosis, citocinesis y la fase S. Para muchas celulas, esta fase es el periodo principal de crecimiento celular durante su vida).
Biopsias de pacientes
Segun la presente descripcion, en realizaciones, pueden tomarse muestras de tejido de un paciente y someterse a los ensayos descritos anteriormente. Puede utilizarse cualquier metodo dentro del ambito de un experto en la tecnica para obtener muestras de tejido. En realizaciones, puede utilizarse una biopsia para obtener una muestra de tejido.
Para una biopsia, pueden extraerse dos tipos de muestras de un paciente. La primera muestra puede tomarse de una lesion sospechosa de crecimiento anomalo. La segunda muestra puede tomarse de una region de tejido normal. Estas muestras pueden someterse a ensayo para detectar las diferencias en los marcadores oncogenicos descritos anteriormente para determinar la diferencia celular y el grado de oncogenicidad. Las muestras pueden homogeneizarse y colocarse en un tampon de lisis fno que contiene inhibidores de proteasas y fosfatasas para impedir la escision y degradacion de protemas. En realizaciones, las muestras pueden congelarse antes de las pruebas. Esto puede ser deseable cuando hay un periodo de tiempo prolongado entre la obtencion de las muestras y las pruebas. Cualquier proceso de congelacion utilizado puede ayudar en el lisado de las celulas.
Una vez que las muestras estan listas para las pruebas, pueden descongelarse y homogeneizarse. Las muestras pueden centrifugarse a aproximadamente 4°C para eliminar cualquier residuo celular no homogeneizado. Entonces pueden cuantificarse las protemas usando los ensayos de protemas que acompanan al kit de ensayo.
Diseno del kit
El kit de ensayo puede utilizar cualquier ensayo adecuado, incluyendo un ensayo ELISA tal como se describio anteriormente. En realizaciones, el kit puede utilizar un ensayo preparado mediante el metodo de ELISA directo descrito anteriormente. Pueden fijarse anticuerpos para cada protema a la placa de 96 pocillos para las protemas apoptoticas, de angiogenesis, de inmunomodulacion y del ciclo celular.
Seccion de ensayo de apoptosis
El diseno del kit incluye pocillos recubiertos con el anticuerpo de interes para una protema dada. En algunas realizaciones, puede medirse Bcl-2. Pueden diluirse patrones que acompanan al kit y anadirse por duplicado a los pocillos recubiertos con anticuerpos frente a Bcl-2. Entonces puede anadirse cada muestra diana del paciente de una lesion sospechosa de crecimiento anomalo a cuatro pocillos junto con la muestra de tejido normal tal como piel obtenida por biopsia del paciente. Las protemas Bcl-2 presentes en la muestra se uniran al anticuerpo recubierto sobre la base de la placa. Los pocillos pueden lavarse con reactivos y puede anadirse a los pocillos un anticuerpo secundario con una enzima de registro. El segundo anticuerpo anadido se unira al complejo unido a la placa. Los pocillos pueden lavarse y puede anadirse un sustrato enzimatico y la intensidad del ensayo colorimetrico puede medirse usando espectroscopfa. Los otros niveles de protemas se miden usando el mismo concepto.
Una vez se cuantifican los niveles de protemas individuales, las 6 protemas pueden compararse. Puede cuantificarse cualquier protema apoptotica utilizando estos metodos. En realizaciones, las protemas apoptoticas que pueden cuantificarse utilizando estos metodos incluyen:

1) Bcl-2
2) Bax

3) p53

4) Bid
5) Caspasa-3
6) Citocromo c
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Para los marcadores anteriores, un aumento en Bcl-2, o una disminucion en Bax, Bid, caspasa-3, citocromo C, sena indicativo de una disminucion en la apoptosis, que a su vez es indicativo de un cancer agresivo. A la inversa, una disminucion en Bcl2, o un aumento en Bax, Bid, caspasa-3 o citocromo c, sena indicativo de un aumento en la apoptosis, que a su vez es indicativo de que un tratamiento dado es eficaz en el tratamiento del cancer.
Analisis de datos mediante software
Tal como se indico anteriormente, puede incluirse un programa de software con kits de la presente descripcion. Tal como se indico anteriormente, pueden medirse los niveles de protema basandose en la concentracion de protemas cargadas en cada pocillo. El software de analisis de datos que acompana a los kits puede medir el nivel de la protema de interes. Por ejemplo, en realizaciones, el software puede medir el nivel de Bcl-2 en comparacion con los niveles de Bax. Estos valores se compararan con los valores de biopsias normales para determinar una diferencia significativa en Bcl-2 en relacion con los niveles de Bax. Una razon de expresion de Bcl-2 que es significativamente superior a Bax, en realizaciones de aproximadamente 3:2, en otras realizaciones de desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 10:1, indicana un bajo nivel de apoptosis, es decir, esta razon debe ir acompanada por una desregulacion global de la familia de protemas Bcl-2 que conduce a un control apoptotico alterado. Puede utilizarse cualquier varianza estadfstica suficientemente baja para demostrar significacion clmica.
Ademas, tambien pueden compararse los niveles de p53, Bid, caspasa-3 y citocromo c con muestras de tejido normal. Si hay una disminucion en p53, caspasa-3, Bid y citocromo c, entonces puede concluirse que la muestra contiene celulas que son resistentes a la apoptosis, una de las caractensticas distintivas de la oncogenicidad.
A traves de pruebas de validacion extensas, pueden establecerse los niveles para cada lmea de celulas cancerosas, asf como un nivel para relacionar el valor obtenido mediante el software de analisis de datos con la gravedad del cancer. La escala numerica puede ser de desde 1 - 15, en cuyo caso 15 se correlaciona con una alta resistencia de apoptosis y el diagnostico de una lmea celular oncogenica.
Los registros iniciales basados en los ensayos anteriores pueden almacenarse, con una visita de seguimiento para obtener una segunda biopsia para cuantificar cualquier cambio en el potencial apoptotico. Esto puede utilizarse para indicar la eficacia del tratamiento y ayudar al medico encargado a decidir si continuar con el tratamiento o cambiar el regimen de tratamiento antes del avance del estado de cancer.
Seccion de ensayo de angiogenesis
Puede analizarse cualquier componente indicativo de angiogenesis como parte de la porcion de angiogenesis del sistema de ensayo de la presente descripcion. En realizaciones, los componentes adecuados que pueden examinarse como parte de la porcion de angiogenesis del sistema de ensayo de la presente descripcion incluyen:
1) VEGF
2) HIF-1a
3) bFGF
4) Angiostatina
Pueden utilizarse metodos similares a los descritos anteriormente para cuantificar los factores apoptoticos para la comparacion de factores angiogenicos a partir de muestras diana obtenidas de una lesion sospechosa de crecimiento anomalo con tejido normal. Una comparacion de este tipo puede indicar si celulas en una lesion estan estimulando la formacion de nuevos vasos sangumeos. Si hay un aumento de VEGF, HIF-1a, bFGF y una disminucion de angiostatina, esto puede ser indicativo de angiogenesis y un entorno tumoral en organizacion rapida y muy agresivo. A la inversa, una disminucion en VEGF, HIF-1a, bFGF y un aumento en angiostatina puede ser indicativo de una disminucion en la angiogenesis y que un tratamiento dado es eficaz en el tratamiento del cancer. El software de datos descrito anteriormente puede clasificar el aumento en la angiogenesis en una escala de desde 1 hasta 15.
Aunque el ensayo anterior se describe como uno que examina la expresion proteica, tambien puede construirse para incluir un ensayo para cada uno de los receptores para cada uno de los factores angiogenicos.
Los resultados obtenidos pueden utilizarse para sugerir un modo de tratamiento y, tras una visita de seguimiento y una toma de muestras adicional de una lesion sospechosa de crecimiento anomalo, el analisis puede utilizarse para confirmar la eficacia del tratamiento.
Seccion de ensayo de inmunomodulacion
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Puede someterse a ensayo cualquier inmunomodulador como porcion de inmunomodulacion del sistema de ensayo de la presente descripcion. En realizaciones, los componentes adecuados que pueden examinarse como parte de la porcion de inmunomodulacion del sistema de ensayo de la presente descripcion incluyen:
1) TNF-a
2) IL-6
Pueden obtenerse muestras tal como se describio anteriormente de una lesion sospechosa de crecimiento anomalo y tejido normal. Los niveles para muestras de una lesion sospechosa de crecimiento anomalo pueden compararse con los niveles basales de las muestras de tejido normal. Estos calculos pueden evaluar el papel de la respuesta inmunitaria en la promocion del crecimiento tumoral. IL-6 aumenta con la edad y el estres y puede tener un papel en la oncogenesis; tiene un papel bien establecido en la progresion del cancer y su relacion con la angiogenesis. Un aumento (regulacion por incremento) de IL-6 puede promover la progresion tumoral. TNF-a puede promover o inhibir el crecimiento tumoral dependiendo del tipo de tumor maligno.
Los datos procesados mediante el software que acompana al kit pueden utilizarse para evaluar el papel de la inflamacion en el tipo de cancer y, de manera mas importante, en un paciente espedfico. Ademas de TNF-a e IL-6, tambien pueden cuantificarse las secreciones para los receptores de estas protemas en las celulas. El valor final, en una escala de 1-15, en la que 1 significa la implicacion mas baja en la respuesta inmunomoduladora y 15 es la mas alta, puede basarse en la expresion proteica asf como en la actividad de receptores celulares.
Seccion de ensayo del ciclo celular
La tasa de recambio de celulas cancerosas es extremadamente alta. Por tanto, con esta porcion del sistema de ensayo, esta tasa de recambio puede cuantificarse midiendo marcadores del ciclo celular. Puede someterse a ensayo cualquier marcador del ciclo celular utilizando el sistema de la presente descripcion. En realizaciones, los componentes adecuados que pueden examinarse como parte de la porcion del ciclo celular del sistema de ensayo de la presente descripcion incluyen, pero no se limitan a:
1) p21
2) p27
De nuevo, muestras obtenidas mediante biopsia tal como se describio anteriormente se someteran a un ensayo ELISA tal como se describio anteriormente. Niveles disminuidos de cualquiera de los marcadores anteriores pueden indicar un aumento en el recambio celular que, a su vez, puede significar un tumor que crece agresivamente. En comparacion con las biopsias de tejidos normales, la clasificacion del recambio del ciclo celular puede clasificarse basandose en una escala de 1-15, en la que 1 es una tasa baja y 15 es la tasa de recambio mas rapida. Los valores de esta porcion del ensayo pueden proporcionar una indicacion de la tasa de crecimiento de un tumor. Pueden examinarse muestras obtenidas en una visita de seguimiento para determinar la tasa de recambio celular, que entonces puede utilizarse para evaluar si un tumor esta avanzando a una tasa rapida o si un tratamiento esta deteniendo el crecimiento.
Sistema
Se expone un ejemplo de un informe de ensayo (para un paciente hipotetico) que puede generarse con el software del sistema y kit de la presente descripcion en las figuras 1-4 adjuntas y a continuacion en las tablas 1-5. El informe de ensayo puede incluir informacion tal como el nombre del paciente, la fecha de nacimiento, un numero de identificacion, la fecha del informe, un breve sumario del historial del paciente, el diagnostico que se sospecha, combinaciones de los mismos, y similares, asf como cualquier otro factor considerado relevante para el profesional sanitario.
La figura 1 incluye un grafico que representa el analisis de apoptosis de una muestra; la figura 2 incluye un grafico que representa el analisis de angiogenesis de una muestra; la figura 3 incluye un grafico que representa el analisis de inmunomodulacion de una muestra; y la figura 4 incluye un grafico que representa el analisis del ciclo celular de una muestra. Ademas de los graficos representados en las figuras, el informe del ensayo (de nuevo, en este caso para un paciente hipotetico) puede incluir la siguiente informacion incluida en las tablas 1-4 a continuacion para cada ensayo (tabla 1 para el analisis de apoptosis, tabla 2 para el de angiogenesis, tabla 3 para el de inmunomodulacion y tabla 4 para el del ciclo celular), con un resumen de muestras de los resultados del ensayo tal como se expone en la tabla 5 a continuacion:
TABLA 1
Resultados de apoptosis:
Protemas apoptoticas
Niveles en comparacion con tejido normal
Bcl-2
Aumentados
Bax
Disminuidos
p53
Disminuidos
Bid
Disminuidos
Caspasa-3
Disminuidos
Citocromo C
Disminuidos
TABLA 2
5
10
Resultados de angiogenesis:
Protemas de angiogenesis
Niveles en comparacion con tejido normal
VEGF
Aumentados
Hif-1a
Aumentados
bFGF
Aumentados
Angiostatina-1
Disminuidos
TABLA 3
Resultados de inmunomodulacion:
Protemas de inmunomodulacion
Niveles en comparacion con tejido normal
TNF-a
Aumentados
IL-6
Aumentados
TABLA 4
15
Resultados del ciclo celular:
Protemas del ciclo celular
Niveles en comparacion con tejido normal
p21
Disminuidos
J27____________________
Disminuidos
TABLA 5
20
Resumen de resultados del ensayo
Seccion de ensayo
Clasificacion
Apoptosis
13
Angiogenesis
11
Inmunomodulacion
Ciclo celular
11
Impresion clinica:
Los datos de los principales factores contribuyentes a la progresion y el estado de cancer indican todos que el paciente tiene un tumor maligno agresivo que:
1) Presenta resistencia apoptotica significativa que puede presentar problemas hacia la intervencion quimioterapica.
2) Aumento de la angiogenesis que esta facilitando el suministro activo de nutrientes al microentorno tumoral y que forma armaduras vasculares dentro de y alrededor del tumor maligno para reforzar complejos extracelulares que se acoplan a sitios tumorales y posiblemente permiten la invasion metastasica a otros sitios de tejidos/organos.
3) El tumor esta creciendo a una tasa extremadamente alta. La tasa de recambio celular y multiplicacion concuerda con un tumor que aumentara de tamano rapidamente y/o invadira tejido circundante, conduciendo posiblemente a metastasis basada en heterogeneidad.
4) Los factores inflamatorios estan aumentados, lo que sugiere que el tumor
9
5
10
15
20
25
30
esta en estado proliferativo y sano. El tumor esta desarrollando “su propio sistema inmunitario”, lo que anade otra capa de resistencia hacia una serie de modalidades de tratamiento y media en la comunicacion dentro del microentorno tumoral.
Debe entenderse que el componente de software de la presente descripcion puede implementarse en diversas formas de hardware, software, firmware, redes, procesadores de proposito especial o una combinacion de los mismos. En realizaciones, la presente descripcion puede implementarse en software como un programa de aplicacion realizado de manera tangible en un dispositivo de almacenamiento de programas. El programa de aplicacion puede subirse a, y ejecutarse por, un sistema informatico que comprende cualquier arquitectura adecuada tal como un ordenador personal, una estacion de trabajo o un servidor. En realizaciones, el sistema puede implementarse en una plataforma informatica que tiene hardware tal como una o mas unidades centrales de procesamiento (CPU) (por ejemplo, procesador), una memoria de acceso aleatorio (RAM), una memoria de solo lectura (ROM) e interfaz/interfaces de entrada/salida (I/O) tal(es) como un teclado, un dispositivo de control de cursor (por ejemplo, un raton o joystick) y un dispositivo de presentacion visual. Puede utilizarse cualquier aparato de procesamiento de datos similar que pueda hacer funcionar el software descrito en el presente documento, generando de ese modo los datos descritos en el presente documento.
En realizaciones, por ejemplo, un sistema adecuado puede incluir al menos un procesador acoplado a un medio legible por ordenador configurado para almacenar un conjunto de instrucciones que pueden ejecutarse por el al menos un procesador, incluyendo las instrucciones comparar un nivel de una protema en una muestra de tejido con un valor de referencia, y determinar si la muestra de tejido es o no cancerosa. En tal caso, el conjunto de instrucciones que estan ejecutandose por el al menos un procesador pueden incluir el componente de software indicado anteriormente.
En otras realizaciones, los sistemas y kits pueden no incluir un ordenador, con la expectativa de que el usuario de un sistema o kit de la presente descripcion posea una CPU o procesador/aparato similar en el que pueda ejecutarse el componente de software del sistema o kit, generando de ese modo los datos descritos en el presente documento.
Aun en otras realizaciones, un sistema y kit de la presente descripcion puede incluir una unidad independiente que presenta un procesador con el software descrito en el presente documento y un lector que puede leer placas u otros medios/componentes utilizados en el ensayo de la presente descripcion. Los ejemplos de tales sistemas incluyen, pero no se limitan a, los disponibles comercialmente como el sistema de ensayo biologico NANOCF™ de Eksigent Technologies (Dublin, CA).
Se apreciara que diversas de las caractensticas y funciones dadas a conocer anteriormente y otras, o alternativas de las mismas, pueden combinarse deseablemente en muchos otros sistemas o aplicaciones diferentes.

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    10
    15
  2. 2.
    20
    25
    30
  3. 3.
    35
    40
    45
  4. 4.
    50 5.
  5. 6.
    55
  6. 7.
    Metodo que comprende:
    medir los niveles de protemas implicadas en angiogenesis en una muestra de tejido obtenida de un animal, en el que las protemas comprenden VEGF, HIF-1a, angiostatina y bFGF ;
    comparar los niveles de las protemas en la muestra de tejido con un valor de referencia;
    en el que
    (A) un aumento en VEGF, un aumento en HIF-1a, un aumento en bFGF y una disminucion en angiostatina indica que la muestra es cancerosa; o
    (B) una disminucion en VEGF, una disminucion en HIF-1a, una disminucion en bFGF y un aumento en angiostatina indica que un tratamiento es eficaz en tratar el cancer en el animal.
    Sistema para llevar a cabo el metodo segun la reivindicacion 1, que comprende al menos un procesador acoplado a un medio legible por ordenador configurado para almacenar un conjunto de instrucciones que pueden ejecutarse por el al menos un procesador, incluyendo las instrucciones:
    comparar los niveles de protemas en una muestra de tejido de un animal con un valor de referencia, en el que las protemas comprenden VEGF, HIF-1a, angiostatina y bFGF; y en el que
    (A) un aumento en VEGF, un aumento en HIF-1a, un aumento en bFGF y una disminucion en angiostatina indica que la muestra es cancerosa; o
    (B) una disminucion en VEGF, una disminucion en HIF-1a, una disminucion en bFGF y un aumento en angiostatina indica que un tratamiento es eficaz en tratar el cancer en el animal.
    Sistema que comprende:
    ensayos para medir los niveles de protemas implicadas en angiogenesis en una muestra de tejido, en el que las protemas consisten VEGF, HIF-1a, angiostatina y bFGF; y al menos un procesador acoplado a un medio legible por ordenador configurado para almacenar un conjunto de instrucciones que pueden ejecutarse por el al menos un procesador, incluyendo las instrucciones las etapas de:
    comparar los niveles de las protemas en la muestra de tejido con un valor de referencia, en el que
    (A) un aumento en VEGF, un aumento en HIF-1a, un aumento en bFGF y una disminucion en angiostatina indica que la muestra es cancerosa; o
    (B) una disminucion en VEGF, una disminucion en HIF-1a, una disminucion en bFGF y un aumento en angiostatina indica que un tratamiento es eficaz en tratar el cancer en el animal.
    Metodo segun la reivindicacion 1, realizacion (A), en el que el valor de referencia se obtiene de una muestra anterior obtenida del animal de una region de tejido normal; o en el que el valor de referencia comprende un nivel conocido de las protemas.
    Sistema segun la reivindicacion 2 o 3, realizacion (A), en el que el valor de referencia se obtiene de una muestra anterior obtenida del animal de una region de tejido normal; o en el que el valor de referencia comprende un nivel conocido de las protemas.
    Metodo segun la reivindicacion 1, realizacion (B), en el que el valor de referencia se obtiene de una muestra anterior obtenida del animal antes o durante el tratamiento del cancer.
    Sistema segun la reivindicacion 2 o 3, realizacion (B), en el que el valor de referencia se obtiene de una muestra anterior obtenida del animal antes o durante el tratamiento del cancer.
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