KR101711860B1 - 발암성, 종양 진행 및 치료 효능을 평가하는 분석 시스템 - Google Patents

발암성, 종양 진행 및 치료 효능을 평가하는 분석 시스템 Download PDF

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Abstract

암의 발암성, 종양 진행 및 암 치료의 효과를 측정할 수 있는 시스템 및 키트가 제공된다. 이러한 시스템 및 키트는 아폽토시스 마커, 혈관형성 마커, 면역조절 마커 및 세포 주기 마커의 수준을 조사하는 분석을 이용하고 여러 시점에서 취한 환자 유래의 시료를 비교하여 암의 발암성, 종양 진행 및 암 치료의 효과를 측정할 수 있다. 상기 시스템 및 키트로 암의 발암성, 종양 진행 및 암 치료의 효과를 측정하는 방법도 제공된다.

Description

발암성, 종양 진행 및 치료 효능을 평가하는 분석 시스템{Assay system for the assessment of oncogenicity, tumor progression, and treatment efficacy}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2008년 1월 25일에 출원된 미국 임시출원 일련번호 61/023,570에 대해 우선권을 주장하는 출원으로, 이 출원의 전체 명세서는 본 발명에 참고 인용된다.
암은 현재 선진국에서 사망의 주요 원인 중 하나이다. 최근 연구는 종양형성에 관한 많은 분자 기전의 이해를 상당히 증가시켰고, 암 치료의 수많은 새로운 수단을 제공했다. 암의 단계뿐만 아니라 발암성 및 종양 진행의 정도를 평가하기 위한 시스템 및 방법은 적당한 치료를 결정하기 위한 시도에 임상적으로 이용된다. 이러한 시스템 및 방법은 또한 이용된 임의의 치료의 효능을 평가하는 데에도 이용될 수 있다.
발암성, 종양 진행 및 치료 효능을 평가할 수 있는, 암을 비롯한 질환을 치료하기 위한 개선된 방법은 여전히 요구된다.
본 발명은 암을 치료하는데 사용하기에 적합한 분석 키트(kit) 및 시스템을 제공한다. 본 발명의 시스템 및 키트는 암의 단계, 뿐만 아니라 발암성 및 종양 진행의 정도를 평가하는 등에 의해 조직 시료의 암 성질을 측정할 수 있게 한다. 또한, 본 발명의 키트 및 시스템은 적당한 치료의 결정뿐만 아니라 이용된 임의의 치료의 효능을 측정하는 데에도 이용될 수 있다. 양태들에서, 본 발명의 시스템 및 키트는 아폽토시스 마커, 혈관형성 마커, 면역조절 마커 및/또는 세포 주기 마커의 수준을 조사하는 분석법, 양태들에서 ELISA를 이용할 수 있고, 여러 시점에서 채취한 환자의 시료를 비교하여 암의 발암성, 종양 진행 및 암 치료의 효과를 측정할 수 있다.
양태들에서, 본 발명의 키트 또는 시스템은 본 발명의 분석법으로 수득한 데이터를 분석하는 소프트웨어 프로그램을 이용할 수 있다. 양태들에서, 본 발명의 키트 또는 시스템은 아폽토시스, 혈관형성, 면역조절, 세포주기 발달 및 이들의 조합과 같은 세포 과정들에 연관된 조직 시료에서 단백질의 수준을 측정하는 분석법; 및 명령어가 상기 조직 시료 내의 단백질 수준을 기준 값과 비교하여 조직 시료가 암인지 아닌지를 결정하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 프로세서에 의해 실행 가능한 일련의 명령어를 저장하도록 구성된 컴퓨터 판독가능 매체에 연결된 하나 이상의 상기 프로세서를 포함할 수 있다.
이러한 키트 및 시스템을 이용하는 방법도 제공한다. 양태들에서, 본 발명의 방법은 암의 발암성 평가, 종양의 진행 결정, 암 치료의 효능 결정, 이들의 조합 등에 의해 조직 시료의 암성을 결정하기 위한 방법을 포함할 수 있다.
본 발명은 암을 치료하는데 사용하기에 적합한 분석 방법, 키트 및 시스템을 제공한다. 또한, 본 발명은 적당한 치료의 결정뿐만 아니라 이용된 임의의 치료의 효능을 측정하는 데에도 이용될 수 있다.
본 발명의 다양한 양태는 도면을 참고로 하여 이하에 설명될 것이다:
도 1은 본 발명의 시스템 및 키트에 의해 수득될 수 있는 분석 리포트로부터의 시료의 아폽토시스 분석을 포함한다;
도 2는 본 발명의 시스템 및 키트에 의해 수득될 수 있는 분석 리포트로부터의 시료의 혈관형성 분석을 포함한다;
도 3은 본 발명의 시스템 및 키트에 의해 수득될 수 있는 분석 리포트로부터의 시료의 면역조절 분석을 포함한다;
도 4는 본 발명의 시스템 및 키트에 의해 수득될 수 있는 분석 리포트로부터의 시료의 세포 주기 분석을 포함한다.
본 발명은 아폽토시스(프로그램된 세포사멸), 혈관형성(새로운 혈관 성장), 면역조절 및 세포주기 인자에 중요한 역할을 하여 발암성의 총 수준에 기여하는 세포 단백질을 조사하는 분석 시스템을 제공한다. 암 세포는 전술한 과정들에 관련된 인자들의 유전자/단백질 발현의 시그널링 장애를 나타낸다. 그 결과 항상성 불균형; 면역 감시 및 아폽토시스 조절의 상실; 종양-유도성 자가조절 유래의 돌연변이; 및 혈관구조 증가가 초래된다. 이들은 조합하여 발암 개시를 유도하는 촉발요인(precipitating factor)이 된다. 예를 들어, Bax 발현의 억제조절과 조합된 아폽토시스를 차단하는 Bcl-2 발현의 증가는 아폽토시스 저항을 시사할 수 있다. 따라서, 암 치료 전과 후에 Bax 및 Bcl-2와 같은 단백질의 발현을 측정하면, 치료 요법이 악성 조직에 대한 아폽토시스 잠재성을 효과적으로 복원하는지를 통찰할 수 있게 해준다.
본 발명에 따르면, 발암성, 종양 진행 및 치료 효과를 비롯한 암의 악성을 평가하는데 이용할 수 있는 다수의 분석법을 포함하는 시스템 및 키트가 제공된다. 시스템의 아폽토시스 분석 성분은 세포가 정상적인 속도로 프로그램된 세포사멸을 겪고 있는지 또는 세포의 악성 성질을 나타낼 수 있는 세포가 사멸되어야 할 때 사멸되지 않는지를 나타내는데 이용될 수 있다. 시스템의 혈관형성 분석 부분은 암 세포의 분비 및 세포 수용체를 측정하여, 종양 성장을 촉진하는 영양소를 제공할 수 있는 신생 혈관의 형성을 자극하는 암 세포의 능력을 측정할 수 있다.
이러한 값들은 종양의 진행 및 혈관형성억제 치료의 효능을 정량분석하는데 이용될 수 있다. 면역조절 측정은 무절제한 세포 성장에 대한 면역 반응 및 종양 미세환경 내로 침윤 수준을 나타내는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 세포주기 인자는 종양이 얼마나 공격적으로 성장할 수 있는지를 나타내는 세포 전환율(turn over rate)을 평가하는데 이용될 수 있다.
4가지 카테고리(아폽토시스, 혈관형성, 면역조절 및 세포 주기 인자)는 개별적으로 수치 척도로 등급화될 수 있으나, 임상의는 주어진 4가지 값을 통합해서 평가하여 악성종양에 대한 치료 요법을 모니터하고 선택하여 수행할 수 있다.
본 발명의 분석 시스템 또는 키트의 기술적 장점은 단백질을 분석하여 종양 진행 및 치료 효능을 간단한 수치 기록으로 등급화하는 시스템 또는 키트를 수반하는 소프트웨어를 포함한다. 양태에서, 25가지 정도의 많은 단백질의 수준이 분석되어 종양 진행 및 치료 효능을 단순한 수치 기록으로 등급화할 수 있다.
ELISA 키트의 제작:
양태들에서, 본 발명의 분석 시스템은 효소-연결된 면역흡착 분석법(ELISA) 키트를 포함할 수 있다. 당업자의 이해 범위 내에 있는 모든 ELISA 시스템이 이용될 수 있다. 양태들에서, ELISA 키트는 직접 경로를 이용하여 제조할 수 있다. 다른 양태들에서, ELISA 키트는 간접 경로를 이용하여 제조할 수도 있다.
ELISA 키트를 직접 경로를 이용해 제조한 경우, ELISA 키트를 생산하는데 적합한 방법은 플라스틱 96웰 플레이트의 기저에 대한 당해 항체의 부착을 포함한다. 그 후, 시료가 웰에 분주되고, 표적 단백질은 항체에 결합할 것이다. 미반응 단백질을 세척한 후, 리코더(recorder) 효소에 결합된 제2 모노클로날 항체를 플레이트의 웰에 첨가할 수 있다. 이 항체는 웰 바닥에 있는 단백질 복합체에 부착한다. 복합체에 결합하지 않는 단백질은 웰을 세척하여 제거한다. 이어서, 효소 기질을 웰에 첨가하여 리코더 효소와 반응을 개시한다. 색 변화의 강도는 표적 단백질의 농도와 상관성이 있는 결합된 리코더 효소의 농도에 좌우된다.
ELISA 키트를 간접 경로를 이용해 제조한 경우, 간접 방법은 환자 시료(예, 혈청)에 존재하는 항체를 측정한다. 항원은 96웰 플레이트의 벽에 흡착된다. 환자 유래의 시료를 웰에 첨가하고, 당해 항체(환자 혈청 중의)가 존재한다면 항원에 결합할 것이다. 미반응 단백질을 세척한 후, 리코더 효소를 보유한 제2 항체를 첨가하여 환자의 시료에 존재하는 항체와 결합시킨다. 효소 기질의 첨가는 비색 변화를 일으키고 색 변화의 강도는 UV-Vis 분광계를 이용해 측정한다.
일부 양태에서, 본 발명의 분석 시스템은 직접 ELISA 방법을 기반으로 할 수 있다. 플레이트의 웰은 당해 항체로 코팅될 수 있고, 균질화된 시료를 플레이트에 첨가하여 아폽토시스성 단백질, 혈관형성성 단백질, 면역조절성 단백질 및 세포 주기 단백질의 단백질 발현을 정량분석할 수 있다.
본 발명의 분석 시스템으로 이용될 수 있는 다른 기술들은 당업자의 이해 범위내에 있는 것으로, 면역조직화학, 염색, 웨스턴 블롯 키트, 해당 단백질의 유전자 발현(단백질 발현을 위한 유전자 작제물 포함) 및 프로테오노믹스 연구를 포함하지만, 이에 국한되지 않고, 이들은 양태에 따르면 질량-분광학을 포함할 수 있다.
상기 기술들은 아폽토시스성 단백질, 혈관형성성 단백질, 면역조절성 단백질 및 세포 주기 단백질의 발현을 정량분석하는데 유사하게 이용될 수 있고, 이에 따라 암의 단계, 뿐만 아니라 발암성 및 종양 진행 정도의 평가 등을 통해 조직 시료의 암성을 결정할 수 있게 해준다.
분석 시스템에 의해 조사된 세포 마커
아폽토시스 마커
모든 아폽토시스 마커는 본 발명의 분석 시스템을 이용하여 조사할 수 있다. 이러한 마커로는 다음과 같은 것이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다:
1) Bcl-2 : B-세포 림프종 2는 항-아폽토시스성 단백질로서, 발암 세포에서 상향조절된다.
2) Bax: Bcl-2 단백질 계열의 아폽토시스 촉진성 구성원, 활성이 모든 암의 >65%에서 증가된 Bcl-2 수준에 의해 저해된다.
3) Bid: 촉진/항 및 항 Bcl-2 구성원과 이량체를 형성하여 DNA 손상을 개시하는 인자를 방출하도록 미토콘드리아를 유발하는 BH3 하위계열 단백질.
4) 사이토크롬 c: 아폽토시스 촉진성 시그널의 존재 하에 방출되고 Apaf-1(아폽토시스성 프로테아제 활성화 인자 1: 아폽토시스에 참여하는 단백질)과 복합체를 형성하여 CARD 계열의 활성을 개시시킨다(CARD는 아폽토시스 등을 비롯한 과정에 관여하고 더 큰 복합체의 형성을 매개하는 단백질에서 발견되는 도메인인 카스파제 동원 도메인(Caspase Recruitment Domain)이다). (예, Casp-9, Casp-6 및 Casp-3).
5) 카스파제-3: 핵에서 DNA 단편화의 개시에 우선하는 종점 세포질 매개인자인 CARD 계열의 주요 구성원.
6) p53: p53은 세포 주기를 조절하여 종양 억제인자로 기능을 하는 전사 인자이다. 이것은 암 억제를 돕기 때문에 다세포 유기체에 중요하다.
혈관형성 마커
모든 혈관형성 마커 및/또는 유전자 작제물은 본 발명의 분석 시스템을 이용하여 조사할 수 있다. 이러한 마커로는 다음과 같은 것이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다:
1) VEGF: 혈관 내피 성장 인자. 종양 영양분을 공급하고 전이의 기초를 제공하는 혈관층 발생을 일으키는 주요 단백질. 신생 혈관 형성을 촉진하는 세포에 의해 방출됨.
2) HIF-1α: 저산소증-유도성 인자 1 알파. 해당과정 흐름을 통한 ATP의 대체 근원에 도움이 되는, 산소 수준을 감소시키는(저산소증) 종양의 내피 벽에 의해 방출됨. 또한 VEGF 및 이에 따른 혈관형성을 상향조절한다.
3) bFGF: 염기성 섬유아세포 성장 인자. 내피세포 복제, 이동 및 세포외 단백질분해를 유도한다.
4) 안지오스타틴: 신생 혈관의 형성을 저해하는 항-혈관형성 인자.
면역조절
면역조절을 나타내는 모든 마커는 본 발명의 분석 시스템을 이용하여 조사할 수 있다. 이러한 마커로는 다음과 같은 것이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다:
1) TNF-α: 종양 괴사 인자-알파. 일부 형태의 종양 세포에서 괴사를 유발하고 다른 세포에서 성장을 촉진하는 다면발현성 사이토킨.
2) IL-6: 인터루킨-6. T-세포에 의해 분비되는 염증촉진성 반응. IL-6은 종양 성장을 촉진하는 것으로 밝혀져 있고, 아마도 혈관형성 효과를 증대시켜 면역 병발을 약화시키기 때문에 많은 암의 예후적 지표이다.
세포 주기
세포 주기 발달에서 세포 위치를 나타내는 모든 마커는 본 발명의 분석 시스템을 이용하여 조사할 수 있다. 이러한 마커로는 다음과 같은 것이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
1) p21: 사이클린-의존적 키나제(cdk) 억제제, DNA 손상 후 p53-의존적 세포 주기 정지의 주요 매개인자.
2) p27: G1기에 세포 주기 진행을 조절하는 사이클린-의존적 키나제 억제제. (G1기는 유사분열, 세포질분열 및 S기 전, 간기 동안의 세포 주기 중의 기간이다. 많은 세포들에서, 이 기는 수명 동안 세포 성장의 주요 기간이다.)
환자 생검
본 발명에 따르면, 양태들에서 조직 시료는 환자로부터 채취된 후, 전술한 분석법으로 처리될 수 있다. 당업자의 이해 범위 내의 모든 방법은 조직 시료를 수득하는데 이용될 수 있다. 양태들에서, 조직 시료를 수득하기 위해 생검을 이용할 수 있다.
생검을 위해 환자로부터 2종의 시료를 추출할 수 있다. 첫 번째 시료는 비정상적 성장이 의심되는 병변으로부터 취할 수 있다. 두 번째 시료는 정상 조직 영역에서 취할 수 있다. 이 시료들은 전술한 발암성 마커의 차이에 대해 분석하여 세포 차이 및 발암성 정도를 측정할 수 있다. 시료는 균질화한 뒤, 단백질의 절단 및 분해를 방지하기 위해 프로테아제 억제제와 포스파타제 억제제를 함유하는 저온 용해 완충액에 넣는다. 양태들에서, 시료는 시험 전에 동결될 수도 있다. 이것은 시료 수득과 검사 사이에 시간이 연장된 경우에 바람직할 수 있다. 이용된 모든 동결 과정은 세포의 용해에 도움을 줄 수 있다.
시료가 검사를 위해 준비되면, 시료는 해동하여 균질화할 수 있다. 시료는 약 4℃에서 원심분리하여 균질화되지 않은 임의의 세포 파편을 제거할 수 있다. 그 다음, 분석 키트에 첨부된 단백질 분석 방법을 사용하여 단백질을 정량분석할 수 있다.
키트 설계
분석 키트는 전술한 바와 같은 ELISA 분석을 비롯하여 임의의 적당한 분석법을 이용할 수 있다. 양태들에서, 키트는 전술한 직접 ELISA법에 의해 준비된 분석법을 이용할 수 있다. 각 단백질에 대한 항체는 아폽토시스성 단백질, 혈관형성 단백질, 면역조절 단백질 및 세포 주기 단백질을 위해 96웰 플레이트에 부착시킬 수 있다.
아폽토시스 분석 섹션
키트 설계는 주어진 단백질에 대한 당해의 항체로 코팅된 웰을 포함한다. 일부 양태에서, Bcl-2가 측정될 수 있다. 키트 동반의 표준물은 희석하고 Bcl-2에 대한 항체가 코팅된 웰에 이반복으로 첨가할 수 있다. 그 다음, 이상 성장의 의심 병변으로부터 취한 환자의 각 표적 시료를, 환자로부터 생검에 의해 수득한 피부와 같은 정상 조직 시료와 함께 4개의 웰에 첨가할 수 있다. 시료에 존재하는 Bcl-2 단백질은 플레이트의 기저에 코팅된 항체에 결합할 것이다. 웰을 시약으로 세척한 뒤, 리코더 효소를 보유한 2차 항체를 웰에 첨가할 수 있다. 첨가된 2차 항체는 플레이트에 부착된 복합체에 결합할 것이다. 웰을 세척할 수 있고, 효소 기질을 첨가하여 비색 분석의 강도를 분광학을 이용해 측정할 수 있다. 이와 같은 개념으로 다른 단백질의 수준도 측정한다.
개개의 단백질 수준이 정량분석된 후, 6개의 단백질을 비교할 수 있다. 이러한 방법을 이용하여 모든 아폽토시스성 단백질을 정량분석할 수 있다. 양태들에서, 이러한 방법을 이용해 정량분석할 수 있는 아폽토시스성 단백질로는 다음을 포함한다:
1) Bcl-2
2) Bax
3) p53
4) Bid
5) 카스파제-3
6) 사이토크롬 c
상기 마커들에서, Bcl-2의 증가, 또는 Bax, Bid, 카스파제-3, 사이토크롬 C의 감소는 아폽토시스의 감소를 나타낼 것이며, 결과적으로 침습성 암을 시사한다. 이와 반대로, Bcl-2의 감소, 또는 Bax, Bid, 카스파제-3 또는 사이토크롬 c의 증가는 아폽토시스의 증가를 나타낼 것이고, 결과적으로 주어진 치료가 암 치료에 효과적이라는 것을 나타낸다.
소프트웨어 데이터 분석
상기 언급한 바와 같이, 소프트웨어 프로그램은 본 발명의 키트와 함께 포함될 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 단백질 수준은 각 웰에 로딩된 단백질의 농도에 기초하여 측정할 수 있다. 키트에 동반된 데이터 분석 소프트웨어는 당해 단백질의 수준을 측정할 수 있다. 예를 들어, 양태들에서, 소프트웨어는 Bax 수준 대비로 Bcl-2 수준을 측정할 수 있다. 이 값들은 정상 생검 값과 비교해서, Bax 수준과 관련된 Bcl-2의 유의적 차이를 측정할 수 있을 것이다. Bax보다 유의적으로 높은 Bcl-2 발현의 비, 양태들에서 약 3:2, 다른 양태들에서 약 1:1 내지 약 10:1은 낮은 아폽토시스 수준을 나타낼 것이고, 즉 이 비는 아폽토시스 조절 장애를 초래하는 Bcl-2 단백질 계열의 전반적인 조절곤란에 의해 동반될 것이다. 임상적 유의성을 증명하기에 충분히 낮은 임의의 통계 분산이 이용될 수 있다.
또한, p53, Bid, 카스파제-3 및 사이토크롬 c 수준도 정상 조직 시료와 비교할 수 있다. p53, 카스파제-3, Bid 및 사이토크롬 c가 감소한다면, 시료가 발암성의 인증 특징 중 하나인 아폽토시스 저항성인 세포를 함유하는 것으로 결론지을 수 있다.
광범한 입증 검사를 통해 각 암세포주의 수준은 물론 데이터 분석 소프트웨어에 의해 수득된 값이 암의 중증도와 관련지어지는 수준도 확립될 수 있다. 수의 스케일은 1에서 15까지일 수 있고, 여기서 15는 아폽토시스에 대한 높은 저항성 및 발암성 세포주의 진단과 상관성이 있다.
상기 분석법을 기반으로 한 1차 기록들은 보관할 수 있고, 후속 방문에서 2차 생검을 수득하여 아폽토시스 가능성의 임의의 변화를 정량분석할 수 있다. 이는 치료 효능을 나타내고 치료 의사가 암 상태의 진행 전에 치료 요법을 변화시키거나 치료를 지속할지 여부를 결정하는데 도움을 주기 위해 이용할 수 있다.
혈관형성 분석 섹션
혈관형성을 나타내는 임의의 성분은 본 발명의 분석 시스템의 혈관형성 부분의 일부로 분석될 수 있다. 양태들에서, 본 발명의 분석 시스템의 혈관형성 부분의 일부로 조사될 수 있는 적당한 성분으로는 다음을 포함한다:
1) VEGF
2) HIF-1α
3) bFGF
4) 안지오스타틴
아폽토시스 인자를 정량분석하기 위한 전술한 것과 유사한 방법은 비정상 성장의 의심 병변에서 수득된 표적 시료 유래의 혈관형성 인자를 정상 조직과 비교하는데 이용할 수 있다. 이러한 비교는 병변의 세포가 신생 혈관의 형성을 자극하는지를 나타낼 수 있다. VEGF, HIF-1α, bFGF가 증가하고 안지오스타틴이 감소한다면, 이것이 혈관형성 및 매우 공격적으로 빠르게 조직화하는 종양 환경을 나타낼 수 있다. 이에 반해, VEGF, HIF-1α, bFGF의 감소 및 안지오스타틴의 증가는 혈관형성의 감소 및 제공된 치료가 암 치료에 효과적이라는 것을 나타낼 수 있다. 전술한 데이터 소프트웨어는 1부터 15까지의 스케일로 혈관형성의 증가를 평가할 수 있다.
상기 분석법은 단백질 발현을 조사하는 것으로 설명되었지만, 각 혈관형성 인자의 각 수용체에 대한 분석법을 포함하는 것으로 제작될 수도 있다.
수득된 결과는 치료 방식을 제안하는데 이용될 수 있고, 후속 방문 및 비정상 성장의 의심 병변으로부터의 추가 시료채취 후, 분석은 치료 효능을 확인하는데 이용될 수 있다.
면역조절 분석 섹션
본 발명의 분석 시스템의 면역조절 부분으로서 임의의 면역조절제가 분석될 수 있다. 양태들에서, 본 발명의 분석 시스템의 면역조절 부분의 일부로서 조사될 수 있는 적당한 성분으로는 다음을 포함한다:
1) TNF-α
2) IL-6
시료는 비정상 성장의 의심 병변 및 정상 조직으로부터 전술한 바와 같이 수득할 수 있다. 비정상 성장의 의심 병변으로부터의 시료의 수준은 정상 조직 시료로부터의 기본 수준과 비교할 수 있다. 이러한 계산은 종양 성장의 촉진에서 면역 반응의 역할을 평가할 수 있다. IL-6은 나이와 스트레스와 더불어 증가하고, 발암에 역할을 할 수 있다; 암의 진행에서 및 혈관형성과의 관계에서 잘 확립된 역할을 나타낸다. IL-6의 증가(상향조절)는 종양 진행을 촉진할 수 있다. TNF-α는 악성종양의 종류에 따라 종양 성장을 촉진하거나 저해할 수 있다.
키트에 동반된 소프트웨어에 의해 처리된 데이터는 암 종류에서, 더욱 중요하게는 특정 환자에서 염증의 역할을 평가하는데 이용될 수 있다. TNF-α 및 IL-6 외에, 세포 상에 상기 단백질들의 수용체 분비도 정량분석할 수 있다. 1-15 스케일로, 1은 염증조절 반응에 가장 낮은 관련성을, 15는 가장 높은 관련성을 의미하는 최종 값은 단백질 발현뿐만 아니라 세포 수용체 활성을 기반으로 할 수 있다.
세포 주기 분석 섹션
암세포의 전환율은 매우 빠르다. 즉, 이 분석 시스템의 부분에서 이 전환율은 세포 주기 마커를 측정하여 정량분석할 수 있다. 모든 세포 주기 마커는 본 발명의 시스템을 이용하여 분석할 수 있다. 양태들에서, 본 발명의 분석 시스템의 세포 주기 부분의 일부로 조사될 수 있는 적당한 성분으로는 다음과 같은 것을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다:
1) p21
2) p27
다시, 전술한 바와 같이 생검으로 수득한 시료는 전술한 ELISA 분석으로 처리할 것이다. 상기 마커 중 어느 하나의 감소된 수준은 세포 전환율의 증가를 나타낼 수 있고, 즉 공격적으로 성장하는 종양을 의미할 수 있다. 정상 조직 생검과 비교했을 때, 세포 주기 전환율은 1-15 스케일에 의거해 등급화할 수 있고, 여기서 1은 낮은 속도를, 15는 전환율의 최고 빠른 속도이다. 이 분석 부분의 값은 종양 성장 속도의 지표를 제공할 수 있다. 후속 방문 시에 수득한 시료로 세포 전환율을 조사할 수 있고, 이로써 종양이 빠른 속도로 진행하고 있는지 또는 치료가 성장을 정지시켰는지를 평가하는데 이용될 수 있다.
시스템
본 발명의 시스템 및 키트의 소프트웨어로 수득할 수 있는 분석 보고서(가상 환자의 것)의 예는 첨부되는 도면 1 내지 4와 이하 표 1 내지 5에 제시되어 있다. 이 분석 리포트는 환자의 성명, 출생일, 식별 번호, 보고서 날짜, 환자 이력의 개요, 의심 진단, 이들의 조합 등뿐만 아니라 의료제공자와 관련이 있는 것으로 추정되는 임의의 다른 인자와 같은 정보를 포함할 수 있다.
도 1은 시료의 아폽토시스 분석을 나타낸 그래프를 포함한다; 도 2는 시료의 혈관형성 분석을 나타낸 그래프를 포함한다; 도 3은 시료의 면역조절 분석을 나타낸 그래프를 포함한다; 도 4는 시료의 세포 주기 분석을 나타낸 그래프를 포함한다. 도면에 나타낸 그래프 외에, 분석 보고서(또한, 가상 환자의 보고서)는 각 분석에 대한 이하 표 1 내지 4에 포함된 다음과 같은 정보를 포함할 수 있고(표 1은 아폽토시스, 표 2는 혈관형성, 표 3은 면역조절, 표 4는 세포 주기 분석), 각 분석 결과의 표본 요약은 이하 표 5에 제시한 바와 같다:
아폽토시스 결과
아폽토시스성 단백질 정상 조직 대비 수준
Bcl-2 증가
Bax 감소
p53 감소
Bid 감소
카스파제-3 감소
사이토크롬 C 감소
혈관형성 결과
혈관형성 단백질 정상 조직 대비 수준
VEGF 증가
HIF-1α 증가
bFGF 증가
안지오스타틴-1 감소
면역조절 결과
면역조절 단백질 정상 조직 대비 수준
TNF-α 증가
IL-6 증가
세포 주기 결과
세포 주기 단백질 정상 조직 대비 수준
p21 감소
p27 감소
분석 결과 요약:
분석 섹션 등급
아폽토시스 13
혈관형성 11
면역조절 9
세포 주기 11

임상 소견:
암의 진행 및 상태에 대한 주요 기여 인자로부터의 데이터는 모두 환자가 다음과 같은 공격적인 악성종양을 갖고 있음을 나타낸다:

1) 화학요법 시술에 대해 문제를 나타낼 수 있는 유의적인 아폽토시스 저항성을 나타냄.

2) 종양 미세환경으로 활성 영양소 전달을 촉진하고 악성종양 내와 그 주위에서 혈관 갑옷을 형성하여, 종양 부위를 도킹시켜 아마도 다른 조직/기관 부위로 전이성 침윤을 허용하는 세포외 복합체를 강화시키는 혈관형성의 증가.

3) 이 종양은 매우 빠른 속도로 성장하고 있다. 세포 전환율 및 증식 속도는 빠르게 팽대하고/하거나 주위 조직에 침윤하여 아마도 불균일성에 기초한 전이를 초래하는 종양과 일치한다.

4) 염증 인자가 증가하여 종양이 증식성 및 건강한 상태임을 시사한다. 이 종양은 "자신의 면역계"를 발달시켜, 일련의 치료 방식에 대한 다른 저항성 층을 추가하고 종양 미세환경 내에서 소통을 매개한다.
본 발명의 소프트웨어 구성요소는 다양한 형태의 하드웨어, 소프트웨어, 펌웨어, 네트워크, 특수 목적의 프로세서 또는 이들의 조합에서 실행될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 양태들에서, 본 발명은 프로그램 저장 장치에서 분명하게 구현되는 애플리케이션 프로그램과 같은 소프트웨어에서 실행될 수 있다. 애플리케이션 프로그램은 퍼스널 컴퓨터, 워크스테이션 또는 서버와 같은 임의의 적당한 구조를 포함하는 컴퓨터 시스템에 업로드되어 실행될 수 있다. 양태들에서, 시스템은 하나 또는 그 이상의 중앙처리장치(CPU)(예, 프로세서), RAM(random access memory), ROM(read only memory) 및 입력/출력(I/O) 인터페이스(들), 예컨대 키보드, 커서 조절 장치(예, 마우스 또는 조이스틱) 및 디스플레이 장치와 같은 하드웨어를 보유한 컴퓨터 플랫폼에서 실행될 수 있다. 본 명세서에 기술된 소프트웨어를 작동시켜 본 명세서에 기술된 데이터를 생성할 수 있는 임의의 유사한 데이터 처리 장치를 이용할 수 있다.
양태들에서, 예컨대 적당한 시스템은 하나 이상의 프로세서에 의해 실행 가능한 일련의 명령어를 저장하도록 구성된 컴퓨터 판독가능 매체에 연결된 하나 이상의 프로세서를 포함할 수 있고, 상기 명령어는, 조직 시료 중의 단백질 수준을 기본 값과 비교하는 단계 및 조직 시료의 암성 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 이러한 경우에, 하나 이상의 프로세서에 의해 실행되는 일련의 명령어는 앞에서 언급한 소프트웨어 구성요소를 포함할 수 있다.
다른 양태들에서, 시스템 및 키트는 컴퓨터를 포함하지 않을 수 있고, 이러한 경우 본 발명의 시스템 또는 키트의 사용자는 시스템 또는 키트의 소프트웨어 구성요소가 실행하여 본 명세서에 기술된 데이터를 생성할 수 있는 CPU 또는 유사 프로세서/장치를 보유할 것으로 생각된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 시스템 및 키트는 본 명세서에 기술된 소프트웨어를 구비한 프로세서를 보유하는 독립 장치 및 본 발명의 분석법에 이용된 플레이트 또는 다른 매체/구성요소를 판독할 수 있는 판독기를 포함할 수 있다. 이러한 시스템의 예로는 Eksigent Technologies(Dublin, CA)에서 NANOCF™ 생물학적 분석 시스템으로 시판되는 것을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
다양한 전술한 특징과 기능 및 여타 특징과 기능, 또는 이의 변형은 많은 다른 여러 시스템 또는 애플리케이션에 바람직하게 병합될 수 있다. 또한, 현재 예상하거나 예기치 못한 다양한 대안, 변형, 변화 또는 개량 예들은 당업자에 의해 계속해서 제조될 수 있고, 이 역시 이하 특허청구범위에 포함되어야 한다.

Claims (9)

  1. 조직 시료의 암성(癌性)을 판정하기 위한 방법으로서,
    조직 시료 중에서 혈관형성과 연관된 단백질의 수준을 측정하는 단계로서, 상기 단백질이 VEGF, HIF-1α, bFGF 및 안지오스타틴을 포함하는 단계 및
    상기 조직 시료 중에서 측정된 단백질 수준을 기준 값과 비교하는 단계
    를 포함하고, 이때, VEGF의 증가, HIF-1α의 증가, bFGF의 증가 및 안지오스타틴의 감소가 상기 조직 시료가 암성임을 나타냄
    을 특징으로 하는, 조직 시료의 암성을 판정하기 위한 방법.
  2. 암 치료의 효능을 판정하기 위한 방법으로서,
    조직 시료 중에서 혈관형성과 연관된 단백질의 수준을 측정하는 단계로서, 상기 단백질이 VEGF, HIF-1α, bFGF 및 안지오스타틴을 포함하는 단계 및
    상기 조직 시료 중에서 측정된 단백질 수준을 기준 값과 비교하는 단계
    를 포함하고, 이때, VEGF의 감소, HIF-1α의 감소, bFGF의 감소 및 안지오스타틴의 증가가 상기 치료가 암을 치료하는데 효과적임을 나타냄
    을 특징으로 하는, 암 치료의 효능을 판정하기 위한 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기준 값이 상기 단백질의 공지된 수준을 포함하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기준 값이 정상 조직의 시료로부터 수득되는 방법.
  5. 하나 이상의 프로세서에 의해 실행 가능한 일련의 명령어를 저장하도록 구성된 컴퓨터 판독가능 매체에 연결된 하나 이상의 상기 프로세서를 포함하고, 이때 상기 명령어가 조직 시료 중의 단백질 수준을 기준 값과 비교하고 상기 조직 시료의 암성 여부를 판정하거나 상기 치료가 암 치료에 효과적인지 여부를 판정함을 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따른 방법을 실시하기 위한 시스템.
  6. 조직 시료 중의 단백질을 측정하기 위한 ELISA (효소-연결된 면역흡착 분석) 키트, 및
    조직 시료 중의 단백질 수준을 기준 값과 비교하는 소프트웨어
    를 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따른 방법을 실시하기 위한 키트.
  7. 조직 시료 중에서 혈관형성과 연관된 단백질 수준을 측정하는 분석 키트, 및
    하나 이상의 프로세서에 의해 실행 가능한 일련의 명령어를 저장하도록 구성된 컴퓨터 판독가능 매체에 연결된 하나 이상의 상기 프로세서
    를 포함하고, 이때 상기 명령어가 조직 시료 중의 단백질 수준을 기준 값과 비교하고 상기 조직 시료의 암성 여부를 판정하거나 상기 치료가 암 치료에 효과적인지 여부를 판정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 제1항 또는 제2항에 따른 방법을 실시하기 위한 시스템.
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  9. 삭제
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