ES2585929B1 - Cepa bacteriana de pseudonocardia carboxydivorans productora de branimicinas y branimicinas producidas por la misma - Google Patents

Abstract

Cepa bacteriana de Pseudonocardia carboxydivorans productora de branimicinas y branimicinas producidas por la misma.#La invención proporciona una nueva cepa bacteriana de Pseudonocardia carboxydivorans que ha sido aislada de su medio natural y depositada en la colección española de cultivos tipo bajo el número de acceso 9108, la cual es capaz de producir eficientemente por fermentación compuestos antibióticos de la familia de las branimicinas. Concretamente, esta cepa es productora de dos nuevas branimicinas, designadas en la presente invención como branimicinas B y C, que presentan actividad antibiótica o antibacteriana in vitro e in vivo frente a bacterias patógenas, preferiblemente humanas, tanto Gram positivas como Gram negativas, preferiblemente resistentes a los antibióticos de uso habitual.

Description

DESCRIPCIÓN

Cepa bacteriana de Pseudonocardia carboxydivorans productora de branimicinas y branimicinas producidas por la misma.

5

La presente invención se encuadra dentro del campo de la microbiología clínica, específicamente dentro de las cepas bacterianas productoras de antibióticos macrólidos de la familia de las branimicinas. La invención también se refiere a las branimicinas producidas y a composiciones farmacéuticas que las comprenden, las cuales son útiles para el tratamiento y/o prevención de infecciones bacterianas provocadas por bacterias 10 patógenas, preferiblemente por bacterias patógenas humanas, más preferiblemente resistentes a antibióticos.

Estado de la técnica

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Las branimicinas son nuevos antibióticos que estructuralmente pertenecen a la familia de antibióticos macrólidos conocidos como nargenicinas, con actividad antimicrobiana principalmente contra Staphylococcus aureus. Las nargenicinas, y branimicinas, tienen una estructura tricíclica con un anillo lactona de 9 o 10 miembros y contienen un único puente éter. En 1977, la familia de antibióticos nargenicina fue aislada por Pfizer y Upjohn 20 tras la fermentación aeróbica de Nocardia argentinensis ATCC 31306. Uno de estos compuestos, nargenicina A1, fue posteriormente patentado y su estructura fue elucidada (W. D. Celmer, et al., 1980, J. Am. Chem. Soc. 102: 4203-4209). Aunque se demostró su actividad antibacteriana in vitro, esta se restringía a bacterias Gram-positivas de la especie Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) También se demostró 25 que la nargenicina A1 induce diferenciación celular y puede ser usada, por tanto, como posible tratamiento en enfermedades neoplásicas.

La primera branimicina fue aislada del Actinomycete GW 60/1571, según ha sido descrito en Org Lett. 2016 Feb 19; 18(4):780-3. doi: 10.1021/acs.orglett.6b00044.. Desde 30 entonces, ha habido un gran interés en esta nueva molécula y han sido desarrolladas varias síntesis orgánicas de la misma (Marchat et al., 2010, Angew Chemie lnt Ed Engl. 49: 2050-2053; Enev et al., 2012, Che m Eur J 18: 9651-9668). Recientemente, ha sido descrita la síntesis química de miembros adicionales de la familia (WO2015028095A1), demostrando distintas actividades antibióticas contra Bacillus subtilis, Staphylococcus 35 aureus, Escherichia coli y Streptomyces viridochromogenes. Dicho trabajo también describe la actividad antibiótica que presentan las branimicinas in vivo en modelos de infección animal, lo que demuestra su eficacia en el tratamiento de infecciones in vivo particularmente por vía oral.

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Los ambientes marinos están emergiendo como una fuente de nuevos productos naturales de importancia farmacológica. Los océanos constituyen más del 70% de la superficie de nuestro planeta, de los cuales el 92-93% son profundidades marinas, mientras que la región costera representa solamente un 7-8%. En las profundidades marinas, se estima que el 60% es agua de más de 2000 m de profundidad. Se trata de un 45 ambiente extremo con alta presión, baja temperatura, oscuridad, alta salinidad y baja concentración de oxígeno. A pesar de ello, las profundidades marinas se han revelado como una fuente que merece ser investigada para el descubrimiento de nuevos antibióticos (Bull et al., 2000, Microbiology and Molecular Biology Reviews 64: 573-606). Los hábitats de aguas profundas son, por tanto, fuentes de descubrimiento de productos 50 naturales esencialmente inexploradas.

Trabajos anteriores en el mar Cantábrico (Bahía de Vizcaya), Atlántico Noreste, han revelado que actinobacterias bioactivas, principalmente especies de Streptomyces, están asociadas a corales y otros invertebrados que viven hasta a 4700 m de profundidad en el cañón submarino de Avilés (Braña et al., 2015, Microb Ecol 69: 512-524; Sarmiento-Vizcaíno et al., 2015, lnt J Syst Evol Microbiol 65: 1328-1334). Una nueva actinobacteria, 5 Myceligenerans cantabricum, se ha aislado de un coral solitario (escleractinia) en aguas de 1500 m de profundidad (Sarmiento-Vizcaíno et al., 2015, lnt J Syst Evol Microbiol 65: 1328-1334).

En resumen, debido a la creciente aparición en el ámbito clínico de bacterias patógenas 10 resistentes a los antibióticos de uso actual, se hace necesaria la obtención de nuevos antibióticos con potencial biomédico en el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas provocadas por bacterias patógenas tanto Gram positivas como Gram negativas. Asimismo, es necesario disponer de procedimientos simples, cortos y económicos para la obtención de dichos compuestos con actividad antibacteriana. 15

Descripción de la invención

La presente invención proporciona una nueva cepa bacteriana de Pseudonocardia carboxydivorans que ha sido aislada de su medio natural y depositada en la Colección 20 Española de Cultivos Tipo bajo el número de acceso 9108, la cual es capaz de producir eficientemente por fermentación compuestos antibióticos de la familia de las branimicinas. Concretamente, esta cepa es productora de dos nuevas branimicinas, designadas en la presente invención como branimicinas B y C, que presentan actividad antibiótica o antibacteriana in vitro e in vivo frente a bacterias patógenas, preferiblemente 25 humanas, tanto Gram positivas como Gram negativas.

Los inventores de la presente invención han aislado dicha cepa de actinobacterias, Pseudonocardia carboxydivorans M-227, de los ecosistemas de arrecifes de coral desde el cañón submarino de Avilés. Dicha cepa fue aislada a 3.000 m de profundidad en la 30 columna de agua y fue estudiada e identificada posteriormente. Se describe por tanto en la presente invención dicha cepa, un procedimiento para obtener branimicinas por fermentación a partir de la misma y dos nuevos antibióticos de la familia de las branimicinas con actividad antibacteriana contra bacterias patógenas clínicas, tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Estos nuevos compuestos presentan actividad 35 antibiótica in vivo frente a bacterias Gram-negativas, como por ejemplo aunque sin limitarnos, los patógenos Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Bacteroides fragilis y Escherichia coli; y bacterias Gram-positivas, por ejemplo pero sin limitarnos, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Corynebacterium urealyticum, Clostridium perfringens y Enterococcus faecalis. 40

Los inventores determinaron las condiciones de cultivo de la cepa para la producción de dichas nuevas branimicinas, posteriormente purificaron las mismas, procedieron a su elucidación estructural y testaron su actividad antibiótica frente a una variedad de patógenos clínicos tanto Gram-negativos como Gram-positivos, algunos de tos cuales 45 presentaban multiresistencias frente a antibióticos de uso habitual.

La presente invención representa así una solución a la necesidad de disponer de nuevos compuestos antibióticos con potencial biomédico en el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas provocadas por bacterias patógenas tanto Gram positivas 50 como Gram negativas resistentes a los antibióticos de uso actual. Asimismo, representa

una solución a la necesidad de disponer de procedimientos simples, cortos y económicos para la obtención de dichos compuestos con actividad antibacteriana, ya que el procedimiento descrito en la presente invención permite producir los citados antibióticos por fermentación con una actinobacteria en lugar de por síntesis química, proceso más complejo, largo y costoso. En este sentido, en procesos biotecnológicos que implican la 5 obtención de productos naturales estructuralmente complejos, como es el caso de las branimicinas, la producción por fermentación mediante el microorganismo productor es el procedimiento preferido, ya que es mas sencillo, más corto y más económico que el procedimiento de síntesis orgánica.

10

Así, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una cepa bacteriana de Pseudonocardia carboxydivorans M-227 depositada el 8 de marzo de 2016 en la Colección Española de Cultivo Tipo bajo el número de acceso 9108. De ahora en adelante se hará referencia a esta cepa bacteriana como "cepa de la invención" o "cepa bacteriana de la invención". 15

Otro aspecto de la invención se refiere a un sobrenadante o extracto de un cultivo de la cepa bacteriana de la invención. A este sobrenadante se hará referencia como "sobrenadante de la invención", y comprende al menos un compuesto de fórmula general (I): 20

25

o cualquiera de sus sales,

donde: R1 es un grupo -CH2Ra y Ra se puede seleccionar entre H o el grupo -OCH3.

El sobrenadante de la invención que comprende al menos un compuesto de fórmula (I) 30 puede obtenerse mediante el cultivo de la cepa de la invención en presencia de un medio de cultivo adecuado y en condiciones de fermentación. Dichas condiciones de fermentación y dicho medio de cultivo son, preferiblemente, los que se describen más adelante en el procedimiento de la invención. Posteriormente, se puede proceder a la

centrifugación de dicho cultivo bacteriano, mediante cualquier método conocido por los expertos en la materia para tal fin, y a la eliminación de los sedimentos depositados como consecuencia de este paso de centrifugación, obteniéndose así el sobrenadante de la invención que comprende al menos un compuesto de fórmula (I) y otros metabolitos producidos y secretados por la cepa de la invención en cultivo. 5

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la cepa bacteriana de la invención para la producción de compuestos de fórmula general (I):

10

o cualquiera de sus sales,

15

donde R1 es un grupo -CH2Ra y Ra se puede seleccionar entre H o el grupo -OCH3.

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la obtención de un compuesto de fórmula general (I) descrito anteriormente, de ahora en adelante "procedimiento de la invención", que comprende: 20

a. Cultivar la cepa bacteriana de la invención en un medio de cultivo en condiciones de fermentación, y

b. Purificar el compuesto de fórmula general (I) producido por la cepa en cultivo de la 25 etapa (a).

El cultivo de la etapa (a) del procedimiento de la invención se puede llevar a cabo, por ejemplo, aunque sin limitarnos, inoculando la cepa o esporas de la cepa en un medio de cultivo apropiado. Los expertos en la materia reconocerán los medios de cultivo 30 bacterianos que pueden ser empleados en esta etapa del procedimiento de la invención. El "medio de cultivo" es un medio nutritivo adecuado, es decir, que comprende los nutrientes necesarios para el mantenimiento y crecimiento in vitro de la cepa de la invención, para el desarrollo de su actividad fermentadora y, por tanto, para la producción de los compuestos de fórmula (I) descritos anteriormente. Dicho medio de cultivo puede 35 ser líquido, sólido o semisólido. Para que la cepa de la invención crezca adecuadamente

en el medio de cultivo, éste debe reunir una serie de condiciones como son temperatura, agitación, grado de humedad, luz/oscuridad y presión de oxigeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad (pH). Asimismo, el medio de cultivo debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

5

Así, el cultivo de la etapa (a) tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende, por ejemplo aunque sin limitarnos, agar o gelatina o albúmina, fuentes de carbono (por ejemplo, glucosa, sacarosa o manitol), fuentes de nitrógeno (por ejemplo, peptonas), azufre, fósforo, fuentes de vitaminas, aminoácidos y hormonas y/o factores de crecimiento (por ejemplo, extracto de carne o extracto de levadura), MOPS, sales 10 inorgánicas (por ejemplo, calcio en forma de CaCI2, magnesio, manganeso, sodio o potasio), iones de hidrógeno, etc. En una realización preferida, el medio de cultivo empleado en el procedimiento de la invención es un medio de cultivo que comprende nutrientes y propiedades físico-químicas similares a las del medio marino, más preferiblemente el medio es RSA marino. 15

La cepa de la invención se puede cultivar, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante cultivo en matraz con agitación, y fermentación a pequeña o a gran escala (que incluye las fermentaciones continua, discontinua o batch, de alimentación discontinua o feed-batch, o en estado sólido) llevada a cabo en un biorreactor de laboratorio o industrial en 20 un medio adecuado y en condiciones que permitan expresar y/o aislar los compuestos de fórmula (I) descritos anteriormente. Los compuestos de la invención se secretan, junto con otros metabolitos o compuestos, en el medio nutritivo, y éstos se pueden recuperar directamente del medio.

25

El experto en la materia reconocerá las condiciones de fermentación adecuadas para ser aplicadas en el paso (a) del procedimiento de la invención Preferiblemente, dichas condiciones comprenden la incubación en agitación, mas preferiblemente en agitador orbital, del cultivo de la invención durante entre 2 y 10 días, preferiblemente entre 3 y 7 días, más preferiblemente durante 4 días: a una temperatura esencialmente constante de 30 entre 25 y 30ºC, preferiblemente entre 27 y 29ºC, más preferiblemente a 28ºC; a entre 200 y 300 rpm, preferiblemente entre 250 y 270 rpm, más preferiblemente a 250 rpm y a un pH constante de entre 6 y 7.5, preferiblemente de entre 6 y 7, más preferiblemente a 6.7.

35

Tras el cultivo de la etapa (a) del procedimiento de la invención, puede tener lugar un paso adicional de centrifugación tras el cual se descartan los sedimentos y se seleccionan los sobrenadantes, obteniendo así el sobrenadante de la invención. Dichos sobrenadantes pueden ser posteriormente filtrados en el paso (b) del procedimiento de la invención y se pueden someter a continuación a un procedimiento de extracción, como 40 por ejemplo aunque sin limitarnos, a extracción en fase sólida, con el fin de eluir los compuestos de la invención presentes en los mismos.

Los compuestos de la invención secretados al medio de cultivo por la cepa de la invención pueden recuperarse del medio empleando procedimientos conocidos en la 45 técnica. Por ejemplo, mediante procedimientos convencionales incluyendo, pero sin limitación, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación y/o precipitación.

Los compuestos de la invención producidos por la cepa en cultivo pueden purificarse 50 mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin

limitación, cromatografía (por ejemplo, HPLC, intercambio iónico, afinidad, hidrofóbica cromatoenfoque, y exclusión molecular), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato amónico). SDS-PAGE, precipitación o extracción, con el fin de obtener uno o varios compuestos de la invención sustancialmente puros. 5

Los compuestos de la invención producidos por la cepa en cultivo pueden detectarse usando procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos de detección pueden incluir, por ejemplo aunque sin limitarnos, UPLC, UV, RMN, espectrometría de masas, o similares. 10

Otro aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I) o a cualquiera de sus sales (a partir de ahora "compuesto de fórmula (I) de la invención"):

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donde R1 es un grupo -CH2Ra y Ra se puede seleccionar entre H o el grupo -OCH3.

20

Cuando R1 es -CH3 el compuesto es la branimicina B y cuando R1 es -CH2OCH3 el compuesto es la branimicina C.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante "composición de la invención", que comprende la cepa de la invención, el sobrenadante 25 de la invención o el compuesto de fórmula (I) de la invención. Dicha composición puede ser una composición farmacéutica o cosmética, que comprende la cepa de la invención, el sobrenadante de la invención o el compuesto de fórmula (I) de la invención, y un excipiente o vehículo farmacéutica o cosméticamente aceptable. Preferiblemente, la composición de la invención comprende la cepa de la invención, el sobrenadante de la 30

invención o el compuesto de fórmula (I) de la invención en una cantidad terapéuticamente efectiva.

Se entiende por "cantidad terapéuticamente efectiva" la cantidad de cepa de la invención, sobrenadante de la invención o compuesto de la invención, que cuando se administra al 5 sujeto para tratar y/o prevenir una infección bacteriana produce el efecto deseado. Dicho efecto deseado puede ser, por ejemplo aunque sin limitarnos, eliminar o reducir el número de bacterias causantes de la infección La cantidad terapéuticamente efectiva puede variar dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo pero sin limitarnos, del tipo de infección y su severidad, así como de la edad, peso, sexo, condición física, 10 capacidad de respuesta o tolerancia, etc., del individuo al que le va a ser administrada la composición de la invención.

Los excipientes y vehículos farmacéutica o cosméticamente aceptables que pueden ser utilizados en la composición de la invención son los conocidos por los expertos en la 15 materia.

El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la composición de la invención, estabiliza dichos elementos, activa o ayuda a la preparación de la composición en el sentido de darle consistencia. Así pues, los 20 excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones, azúcares o celulosas, la función de endulzar, la función de colorante, la función de protección de la composición, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, como por ejemplo, es el caso del fosfato de calcio bibásico, la 25 función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

El "vehículo farmacéuticamente aceptable", al igual que el excipiente, es una sustancia o combinación de sustancias que se emplea en la composición para diluir cualquiera de los 30 componentes comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente o portador con el que se debe administrar la composición de la invención; obviamente, dicho vehículo debe ser compatible con dicha composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser, aunque sin limitarnos, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. Ejemplos de 35 vehículos son, aunque sin limitarnos, agua, aceites o surfactantes, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como por ejemplo, y sin sentido limitativo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, aceites de ricino, polisorbatos, ésteres de sorbitano, éter sulfatos, sulfatos, betaínas, glucósidos, maltósidos, alcoholes grasos, nonoxinoles, poloxámeros, polioxietilenos, 40 polietilenglicoles, dextrosa, glicerol, digitonina y similares. El vehículo farmacológicamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los elementos comprendidos en la composición de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición Cuando la 45 forma de presentación es líquida, el vehículo farmacológicamente aceptable es el diluyente.

La composición de la presente invención puede formularse para su administración a un animal, preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas 50 conocidas en el estado de la técnica. Como ejemplos de preparaciones se incluye

cualquier composición sólida (comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, gránulos, barras, lápices, vaporizadores, aerosoles, etc.), semisólida (ungüento, crema, pomada, gel, hidrogel, espuma, loción, jabón, jalea, gelatina, etc.) o líquida (soluciones acuosas o no acuosas, soluciones hidroalcohólicas o hidroglicólicas, suspensiones, emulsiones, jarabes, composiciones anhidras, dispersiones acuosas, aceites, leches, bálsamos, 5 linimentos, sueros, etc.) para administración oral, tópica o parenteral. La composición de la presente invención también puede estar en forma de formulaciones de liberación sostenida o de cualquier otro sistema convencional de liberación. El término "liberación sostenida" se utiliza en sentido convencional refiriéndose a un sistema de vehiculización de un compuesto que proporciona la liberación gradual de dicho compuesto durante un 10 periodo de tiempo y preferiblemente, aunque no necesariamente, con niveles de liberación del compuesto relativamente constantes a lo largo de un periodo de tiempo. Ejemplos ilustrativos de vehículos o sistemas de liberación sostenida incluyen, aunque no se limitan a, liposomas, liposomas mixtos, oleosomas, niosomas, etosomas, milicápsulas, microcápsulas, nanocápsulas, esponjas, ciclodextrinas, vesículas, micelas, micelas 15 mixtas de tensioactivos, micelas mixtas fosfolípidotensioactivo, miliesferas, microesferas, nanoesferas, lipoesferas, microemulsiones, nanoemulsiones, minipartículas, milipartículas, micropartículas, nanopartículas, nanopartículas sólidas lipídicas, soportes lipídicos nanoestructurados, materiales poliméricos, parches o implantes biodegradables o no biodegradables, o micropartículas biodegradables, como por ejemplo, microesferas 20 biodegradables.

Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, intraestromal, intraarticular, intrasinovial, intratecal, 25 intralesional, intraarterial, intracardíaca, intramuscular, intranasal, intracraneal, cutánea o subcutánea, intraorbital, intracapsular, tópica, oftalmológica u ocular, mediante parches transdérmicos o vía rectal o vaginal, mediante la administración de un supositorio o encapsulado, percutánea, espray nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna, bomba de infusión o vía catéter. 30

Las composiciones de la presente invención son aptas para su aplicación mediante dispositivos médicos que permitan la liberación del principio activo en concentraciones adecuadas para el tratamiento y/o prevención de infecciones bacterianas. Estos dispositivos deben ser, preferiblemente, adecuados para la administración del principio 35 activo de forma local, permitiendo que el tratamiento actúe en la zona afectada y no se disperse. Los dispositivos pueden, por ejemplo, pero sin limitarse, llevar el principio activo en su interior o ir recubiertos con el mismo.

En una realización preferida, la composición de la invención, preferiblemente 40 farmacéutica o cosmética, además comprende otro agente antibacteriano y/o antifúngico, más preferiblemente dicho agente antibacteriano es otro antibiótico.

Se entiende por "agente antibacteriano" una sustancia química, producida de forma sintética o natural (sintetizada por ejemplo por hongos o bacterias), que inhibe el 45 crecimiento (bacteriostático) o mata (bactericida) a las bacterias. El agente antibacteriano puede ser, por ejemplo aunque sin limitarnos, un antibiótico, un inhibidor de la bomba de eflujo o un agente permeabilizante de la membrana bacteriana.

Los antibióticos a los que se refiere la presente invención son compuestos que, 50 preferiblemente, no comprometen la viabilidad y supervivencia de la cepa de la invención.

Ejemplos de antibióticos que pueden incluirse en la composición de la invención son, aunque sin limitarnos, amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina, paromomicina, geldanamicina, herbimicina, loracarbef, ertapenem, doripenem, imipenem/cilastatin, meropenem, cefadroxilo, cefazolina, cefalotina, cefalexina, cefaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozil, cefuroxima, cefixima, 5 cefdinir, cefditoren, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriaxona, cefepime, ceftobiprole, teicoplanin, vancomicina, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, telitromicina, espectinomicina, aztreonam, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penicilina, 10 piperacilina, ticarcilina, bacitracina, colistina, ciprofloxacino, enoxacino, gatifloxacino, levofloxacino, lomefloxacino, moxifloxacino, norfloxacino, ofloxacin, trovafloxacino, grepafloxacino, sparfloxacino, temafloxacino, mafenide, sulfonamidocrisoidina, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfametizol, sulfanilimidae, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprim, trimetoprim-sulfametoxazol (co-trimoxazol), demeclociclina, doxiciclina, 15 minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina, arsfenamina, cloranfenicol, clindamicina, lincomicina, etambutol, fosfomicina, ácidofusídico, furazolidona, isoniacida, linezolida, metronidazol, mupirocina, nitrofurantoina, platensimicina, pirazinamida, quinupristin/ dalfopristin, rifampicina, tiamfenicol, tinidazol, dapsona y clofazimina, así como otras nargenicinas, incluyendo branimicinas distintas a las descritas en la presente invención. 20

La composición de la presente invención puede incluir alternativa o adicionalmente un agente antifúngico o antimicótico, dicho agente antifúngico puede ser un fungicida o un fungistático.

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El uso de la cepa de la invención, del sobrenadante de la invención, del compuesto de fórmula (I) de la invención o de la composición de la invención en combinación con otros agentes antibacterianos es una estrategia interesante en la prevención y/o tratamiento de infecciones bacterianas, preferiblemente de enfermedades de origen infeccioso provocadas por bacterias patógenas resistentes o multi-resistentes, y en la inhibición de 30 la formación de biopelículas bacterianas sobre cualquier superficie.

Por ello, otro aspecto de la invención se refiere al uso del sobrenadante de la invención, del compuesto de fórmula (I) de la invención o de la composición, preferiblemente farmacéutica, de la invención para la elaboración de un medicamento. Alternativamente, 35 este aspecto de la invención se refiere al sobrenadante de la invención, el compuesto de fórmula (I) de la invención o la composición de la invención para su uso como medicamento.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del sobrenadante de la invención, del 40 compuesto de fórmula (I) de la invención o de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de infecciones bacterianas Alternativamente, este aspecto de la invención se refiere al sobrenadante de la invención, el compuesto de fórmula (I) de la invención o la composición de la invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de infecciones bacterianas. 45

Las infecciones bacterianas a las que se refiere la presente invención son provocadas por una o más bacterias Gram negativas o Gram positivas, o por ambas conjuntamente. En una realización más preferida, las infecciones bacterianas a las que se refiere la presente invención son provocadas por una o más bacterias de los géneros seleccionados de 50 Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Micrococcus, Staphylococcus, Bacteroides,

Escherichia, Haemophilus o Neisseria. En una realización aún más preferida, las infecciones bacterianas a las que se refiere la presente invención son provocadas por una o más bacterias seleccionadas de la lista que consiste en: Clostridium perfringens, Corynebacterium urealyticum, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae o Neisseria 5 meningitidis. En una realización aún más preferida, la bacteria es Micrococcus luteus.

En otra realización preferida, las bacterias a las que se refiere la presente invención son bacterias resistentes, más preferiblemente multiresistentes, a uno o más antibióticos.

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Como ejemplos de bacterias resistentes a antibióticos, se encuentran aquellas cepas resistentes a aminoglicósidos, carbapenemas, cefalosporinas, glicopéptidos, lincosamidas, lipopéptido, macrólidos, monobactámico, nitrofuranos, oxazolidononas, penicilinas, quinolonas, sulfonamidas, ácido fusídico, ácido pseudomónico, rifamicinas, lipoglicopéptidos, novobiocina y/o tetraciclinas, entre otros. Más preferiblemente, las 15 bacterias a las que se refiere la presente invención son bacterias resistentes a al menos un antibiótico seleccionado de la lista que consiste en: amikacina, amoxicilina, ampicilina, capreomicina, ciprofloxacina, ácido clavulánico, clindamicina, cotrimoxazol, etambutol, eritromicina, fosfomicina, isoniazida, kanamicina, nitrofurantoina, quinolonas, rifampicina, estreptomicina y/o tetraciclina. 20

En una realización aún más preferida, el compuesto de fórmula (I) es la branimicina B y la bacteria es Micrococcus luteus.

En otra realización preferida, el compuesto de fórmula (I) es la branimicina B o C y la 25 bacteria es Corynebacterium urealyticum, Clostridium perfringens, Neisseria meningitidis y/o Micrococcus luteus.

En otra realización preferida, el compuesto de fórmula (I) es la branimicina 8 y la bacteria es Haemophilus influenzae, Escherichia coli y/o Bacteroides fragilis. 30

En otra realización preferida, el compuesto de fórmula (I) es la branimicina e y la bacteria es Enterococcus faecalis y/o Staphylococcus aureus.

En otra realización preferida, el medicamento al que se refiere la presente invención es 35 para el tratamiento y/o prevención de enfermedades infecciosas bacterianas o enfermedades provocadas por infecciones bacterianas. Más preferiblemente, dichas enfermedades se seleccionan de la lista que consiste en: enteritis necrótica, gangrena gaseosa, infecciones del tracto genitourinario (tales como cistitis, uretritis, prostatitis, pielonefritis, epididimitis), infecciones cutáneas (tales como impétigo, foliculitis, celulitis, 40 abscesos, infección de heridas), osteomielitis, mastitis, faringoamigdalitis, conjuntivitis, epiglotitis, otitis, meningitis, meningococemia, bacteriemia, sepsis, endocarditis, infecciones del tracto respiratorio (tales como neumonía o sinusitis), infecciones intraabdominales (colecistitis, peritonitis, abscesos viscerales), así como infecciones nosocomiales. 45

El termino "medicamento", tal y como se usa en esta invención, hace referencia a cualquier sustancia usada para la prevención, alivio, tratamiento o curación de infecciones en el hombre, o cualquier otro animal, y plantas. En el contexto de la presente invención, este término se refiere a una preparación que comprenda el sobrenadante de 50 la invención, el compuesto de fórmula (I) de la invención o la composición de la invención.

El medicamento al que se refiere la presente invención puede ser de uso humano o veterinario. El "medicamento de uso humano" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedades en seres humanos o que pueda usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones 5 fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico médico. El "medicamento de uso veterinario" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo 10 una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico veterinario, incluyendo, pero sin limitarse, a las premezclas medicamentosas. Se entiende por "premezcla medicamentosa" o "premezcla para alimentos medicamentosos", todo medicamento veterinario preparado de antemano con vistas a la fabricación ulterior de alimentos medicamentosos. Se entiende por "alimento medicamentoso" toda mezcla de 15 medicamento(s) veterinario(s) y de alimento(s) preparada previamente a su comercialización y destinada a ser administrada a los animales sin transformación, en razón de las propiedades curativas o preventivas o de otras propiedades del medicamento.

20

Los medicamentos de la invención pueden utilizarse tanto solos como en combinación con otros medicamentos o composiciones para el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas. Así, los medicamentos de la presente invención pueden ser empleados junto a otros principios activos o terapias a modo de terapia combinada. Los otros principios activos pueden formar parte de la misma composición o bien pueden ser proporcionados 25 mediante una composición distinta, siendo administrados al mismo tiempo o en tiempos diferentes.

El término "tratamiento", tal como se entiende en la presente invención, se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de la infección, enfermedad o 30 condición patológica de interés en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano) que incluye:

(i) inhibir la infección, enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;

35

(ii) aliviar la infección, enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la infección, enfermedad o la condición patológica o su sintomatología;

(iii) estabilizar la infección, enfermedad o la condición patológica.

40

El término "prevención", tal como se entiende en la presente invención, consiste en evitar la aparición de la infección o enfermedad infecciosa o biopelícula bacteriana, es decir, evitar la aparición de una biopelícula en una superficie o evitar que se produzca la infección o la enfermedad infecciosa en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano), en particular cuando dicho sujeto tiene predisposición para 45 sufrir una infección pero aún no se ha diagnosticado que la tenga, como es el caso, por ejemplo, de neonatos, ancianos o pacientes inmunodeprimidos o sometidos recientemente a intervención quirúrgica.

El término "infección" es el término clínico empleado para describir la colonización de un 50 organismo huésped por microorganismos de otras especies. En clínica, el organismo

colonizador es perjudicial para el funcionamiento normal y supervivencia del huésped. Como se usa aquí, el término "enfermedades infecciosas bacterianas" o "enfermedades de origen infeccioso provocadas por bacterias" se refiere a enfermedades precedidas por una infección bacteriana, incluyendo infecciones sistémicas (bacteriemia y sepsis) e infecciones en cualquier órgano o tejido del organismo huésped. Los órganos o tejidos 5 incluyen, pero sin limitación, músculo esquelético, piel, tejidos blandos o mucosas, torrente sanguíneo, riñones o cualquier otro tejido del tracto urinario, tracto respiratorio, tracto gastrointestinal, órganos sexuales, oído, ojo, corazón, pulmones o hueso. Estas infecciones pueden estar causadas por bacterias Gram positivas y/o Gram negativas.

10

En la presente invención, dichas infecciones ocurren en un sujeto que puede ser, pero sin limitarnos, un animal, en particular un mamífero y más particularmente un humano, o un animal doméstico, por ejemplo cerdo, ratón, rata, gato, jerbo conejo, perro, mono, chimpancé, etc., o un ave.

15

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la cepa de la invención, del sobrenadante de la invención, del compuesto de fórmula (I) de la invención o de la composición de la invención para la eliminación y/o prevención y/o inhibición de la formación de biopelículas bacterianas, preferiblemente sobre superficies inertes, es decir ex vivo. 20

En una realización preferida de este aspecto de la invención, las biopelículas bacterianas son provocadas por una o más bacterias de los géneros seleccionados de Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Micrococcus, Staphylococcus, Bacteroides, Escherichia, Haemophilus o Neisseria. En una realización más preferida, las biopelículas bacterianas 25 son provocadas por bacterias seleccionadas de la lista que consiste en: Clostridium perfringens, Corynebacterium urealyticum, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae o Neisseria meningitidis. En una realización aún más preferida, la bacteria es Micrococcus luteus. 30

En una realización aún más preferida, el compuesto de fórmula (I) es la branimicina B y la bacteria es Micrococcus luteus.

En otra realización preferida, el compuesto de fórmula (I) es la branimicina B o C y la 35 bacteria es Corynebacterium urealyticum, Clostridium perfringens, Neisseria meningitidis y/o Micrococcus luteus.

En otra realización preferida, el compuesto de fórmula (I) es la branimicina B y la bacteria es Haemophilus influenzae, Escherichia coli y/o Bacteroides fragilis. 40

En otra realización preferida, el compuesto de fórmula (I) es la branimicina e y la bacteria es Enterococcus faecalis y/o Staphylococcus aureus.

Se entiende por "biopelículas" o "biofilms" las comunidades de microorganismos que 45 crecen embebidos en una matriz de exopolisacáridos y adheridos a una superficie inerte o a un tejido in vivo o ex vivo (en cultivo). Es una comunidad de bacterias (de una única especie o varias) que se adhiere a una superficie sólida. Las biopelículas son una causa común de infecciones bacterianas, tanto en humanos como en otros animales y plantas. Ejemplos de biopelículas son aquellas que se forman en la cavidad oral, tales como las 50 caries (placa dental) o enfermedad periodontal.

Los mecanismos por los que el biofilm produce los síntomas de la enfermedad todavía no están completamente establecidos, pero se ha sugerido que las bacterias del biofilm pueden producir exotoxinas, se pueden liberar grupos de bacterias al torrente sanguíneo, se vuelven resistentes a la acción fagocitaría de las células del sistema inmune y, por otro lado, constituyen un nicho para la aparición de bacterias resistentes a los tratamientos 5 antibióticos. Este último aspecto puede ser especialmente relevante dado que las bacterias resistentes originadas en un biofilm podrían extenderse de paciente a paciente a través de las manos del personal sanitario.

Por otro lado, la contaminación biológica de superficies por formación de biofilms es 10 común, pudiendo desarrollarse el biofilm sobre superficies hidratabas, hidrófilas, bióticas o abióticas, y conduce a la degradación del material, productos de contaminación, bloqueo mecánico e impedancia de la transferencia de calor en procesos acuáticos. Los biofilms son también la primera causa de contaminación biológica en alimentos, catéteres, drenajes o implantes, así como en los sistemas de distribución de agua 15 potable, y otras conducciones, siendo especialmente importante el control de biofilms en los sistemas antiincendios.

El término "Gram negativa" se refiere a las bacterias que no retienen la coloración violeta en el protocolo de tinción Gram e incluyen, pero sin limitarse, Enterobacteriaceae, 20 incluyendo E. coli, Klebsiella spp., Haemophilus, Bacteroides, Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Proteus spp., Providencia spp., Salmonella spp., Shigella spp., Pseudomonas (incluyendo P. aeruginosa) y especies tales como Moraxella spp. (incluyendo, M catarrhalis) y Neisseria spp.

25

El término "Gram positiva" se refiere a las bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta en el protocolo de tinción Gram e incluyen, pero sin limitarse, Staphylococcus (incluyendo Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophytics), Streptococcus (incluyendo Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, S. agalactiae, S. avium, S. bovis, S. lactis, S. sanguis y Streptococcus del grupo C, Streptococcus del 30 grupo G y Streptococcus viridans), Enterococcus (incluyendo Enterococcus faecalis y E. faecium), Clostridium, Corynebacterium, Listeria monocytogenes, Corynebacterium jeikeium, Chlamydia spp. (incluyendo C. pneumoniae), Micrococcus y Mycobacterium tuberculosis. Las cepas habituales de S. aureus son resistentes a la penicilina. La aparición de cepas de esta especie resistentes a la meticilina y vancomicina representa 35 un serio problema sanitario.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se 40 desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Descripción de las figuras 45

FIG. 1. Árbol filogenético obtenido por el método " neighbour-joining" obtenido por análisis matriciales de distancias de las secuencias del gen 16S rRNA, mostrando la posición de Pseudonocardia carboxydivorans M-227 y sus parientes filogenéticos más próximos. Los números de los nodos son valores bootstrap (1000 50 muestreos; solo se presentan valores >70%). Los asteriscos indican que los

correspondientes nodos también se obtuvieron en el árbol obtenido por el método de la máxima verosimilitud (maximum-likelihood). La barra indica un 1% de divergencia de secuencias.

Ejemplos 5

A continuación se ilustrara la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de la cepa de la invención en la producción de dos nuevos antibióticos macrólidos de la familia de las branimicinas (designados en la presente invención como branimicinas B y C), así como la actividad 10 antimicrobiana de estos nuevos antibióticos frente a bacterias patógenas tanto Gram negativas como Gram positivas.

Ejemplo 1. Sección experimental

15

Procedimientos experimentales generales

Los análisis y separaciones mediante HPLC semipreparativo se llevaron a cabo utilizando un sistema cromatográfico de Alliance con una columna SunFire C18 (10 μm, 10 x 250 mm, Waters). Para los análisis de UPLC se usó un UPLC Acquity equipado con una 20 columna BEH C18 (1,7 μm, 2.1 x 100 mm, Waters), la rotación óptica fue determinada con un polarímetro JASCO P-2000. Los espectros de IR fueron medidos con un espectrómetro JASCO FT/IR-4100 equipado con un accesorio ATR de PIKE MIRacle™ (reflexión simple). Los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Bruker Avance III (500 y 125 MHz para 1H y 13C RMN, respectivamente) equipado con una sonda 25 TCI MicroCryoProbe™ de 1,7 mm, usando la señal del solvente residual como referencia interna (δH 7,27 y δC 77,0 ppm para CDCI3). Los espectros de HRESIMS fueron adquiridos usando un espectrómetro de masas Bruker maXis QTOF.

Microorganismos y condiciones de fermentación 30

La cepa M-227 (CECT 91 08) fue aislada de una muestra de aguas profundas recogida en el mar Cantábrico a 3000 m de profundidad. Un cultivo de siembra fue preparado inoculando esporas de esta cepa en 50 ml de medio GCM (1,5% glucosa, 2% peptona de soja, 0,15% extracto de levadura, 1% MOPS, 0,01% CaCI2, pH 6.7) en un matraz 35 Erlenmeyer de 250 ml. Este cultivo fue incubado en un agitador orbital durante 4 días a 28ºC y 250 rpm y usado para inocular (al 2%, v/v) veinte matraces Erlenmeyer de 250 ml, conteniendo cada uno 50 ml de medio R5A, que fueron incubados durante 10 días en las condiciones arriba descritas.

40

Análisis filogenético (taxonomía) del microorganismo productor

La cepa M-227 fue sometida a análisis filogenético en base al análisis de la secuencia del 16S rRNA. El análisis filogenético fue realizado usando MEGA versión 6.0 después de un alineamiento múltiple de los datos mediante CLUSTALO. Las distancias (opciones de 45 distancia según el modelo de dos parámetros de Kimura) y alineamiento con el método neighbor-joining fueron determinadas usando valores bootstrap basadas en 1000 replicaciones.

50

Actividad antimicrobiana de las branimicinas B y C contra patógenos clínicos

Se determinó la actividad antimicrobiana de las branimicinas B y C y la concentración inhibitoria mínima (ClM) contra un grupo de patógenos humanos (Tabla 1).

5

Tabla 1. Descripción de los patógenos clínicos. a lnh, rif, emb. b lnh, rif, emb, str, amk, kan, cap c Amp, amo/clav, ery, cot, cip, fos, nitro. Amk amikacina; amo: amoxicilina; amp: ampicilina; cap: capreomicina; cip: ciprofloxacina; clav: ácido clavulánico; clin: 10 clindamicina; cot: cotrimoxazol; emb: etambutol; ery: eritromicina; fos: fosfomicina; inh: isoniazida; kan: kanamicina; nitro: nitrofurantoina; quin: quinolonas; rif: rifampicina; str: estreptomicina; tet: tetraciclina.

Algunos de ellos han sido aislados e identificados en los laboratorios de microbiología 15 clínica a partir de muestras obtenidas de pacientes con infecciones clínicas. El medio Mueller-Hinton (Biomedics) fue utilizado en los bioensayos frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Micrococcus luteus, Haemophilus influenzae, siendo suplementado de acuerdo a las condiciones CLSI (CLSI, Clinical and Laboratory Standards lnstitute, documento M100-S24 2014) para 20

Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes y Neisseria meningitidis, Tripticaseina de soja con sangre de carnero al w/5% (DIFCO) fue usada para Corynebacterium urealyticum. Brucella Broth (SIGMA) suplementado con hemina (5 μg/ml), vitamina K1 (1 μg/ml) y sangre de caballo sometida a lisis (5% v/v) fue usada para Bacteroides fragilis y Clostridium perfringens. 5

Para la mayoría de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, se realizaron los ensayos antimicrobianos según normas del protocolo CLSI. Las pruebas de sensibilidad de Mycobacterium tuberculosis se realizaron en medio agarificado Middlebrook 7H10 suplementado con OADC al 10% y glicerol al 0,5% de acuerdo al método de proporción 10 en agar para micobacterias de lento crecimiento (CLSI documento M24-A2, 2011).

Ejemplo 2. Resultados

Taxonomía de la cepa M-227 15

El 16S rDNA de la cepa productora M-227 fue amplificado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciado. El análisis de la secuencia demostró una identidad del 99,9% con Pseudonocardia carboxydivorans Y8. El árbol filogenético generado por el método "neighbor-joining", basado en la secuencia del gen 16S rRNA, 20 reveló claramente la relación evolutiva de la cepa M-227 con un grupo de especies conocidas del género Pseudonocardia (Figura 1). Por lo tanto, esta cepa fue señalada como Pseudonocardia carboxydivorans M-227.

Aislamiento y purificación de branimicinas B y C guiados por bioactividad 25

Los cultivos se centrifugaron, se descartaron los sedimentos y los sobrenadantes fueron filtrados y aplicados a un cartucho de extracción en fase sólida (Sep-Pak Vac C18, 10 g, Waters). El material retenido se eluyó con una mezcla de metanol y 0,05% de ácido trifluoroacético (TFA) en agua. Un gradiente lineal de 0 a 100% metanol en 60 min, a 10 30 ml/min, fue utilizado. Las fracciones fueron recogidas cada 5 minutos y su actividad antibiótica fue detectada por la prueba de difusión en disco, utilizando Micrococcus luteus como microorganismo indicador. La mayor parte de la actividad fue localizada en las dos fracciones recogidas entre 15 y 25 minutos, que se evaporaron en vacío y el material seco fue posteriormente redisuelto en 3 ml de DMSO y m etanol (1:1). Muestras (100 μI) 35 de las fracciones activas fueron cromatografiadas en una columna SunFire C18 (10 μm, 10 x 250 mm, Waters) con acetonitrilo y 0,05% TFA en agua como solventes. La elución se realizó con un gradiente lineal de 20 a 100% de acetonitrilo en 10 min, a 5 ml/min, y el eluyente se recogió en fracciones recolectadas cada 10 segundos. Una vez más, la actividad antibiótica de estas fracciones fue localizada por bioensayo y posteriormente 40 todo el material activo fue cromatografiado en inyecciones múltiples en las mismas condiciones. Se agruparon las fracciones activas recogidas, correspondientes a los mismos tiempos de retención, se diluyeron cuatro veces con agua y se desalaron y concentraron por extracción en fase sólida (Sep-Pak C18, Waters). El análisis por UPLC de estas fracciones indicó que la actividad antibiótica pareció correlacionarse con la 45 presencia de dos picos principales. Estos picos se purificaron aún más usando la misma columna y solventes, pero esta vez fue empleada una elución isocrática con acetonitrilo al 20%. Los compuestos purificados se diluyeron con agua y se extrajeron en fase sólida como se indica arriba. Finalmente, fueron disueltos en una mezcla de agua y tert-butanol (1:1) y liofilizados. Los rendimientos resultantes fueron de 58,6 mg de branimicina By 61,7 50 mg de branimicina C.

Branimicina B: sólido blanco; [α]20D +106.6º (c 0.1, CHCI3) ; IR (ATR) vmax 3419, 3038, 2961,2929, 2878, 2832, 1719, 1457, 1378, 1248, 1147, 1117, 1082, 1030, 984, 944, 890 cm-1; para los datos de 1H y 13C RMN ver Tabla 2; HRESIMS m/z 456.2596 (M+NH4]+ (calcd. para C23H38NO8+, 456.2592), 439.2326 [M+H]+ (calcd. para C23H35O8+, 439.2326), 421.2222 [M-H2O+H]+ (calcd para C23H33O7+, 421.2221). 5

Branimicina C: sólido blanco; [α]20D +101.2º (c 0.1, CHCI3); IR (ATR) vmax 3422, 3038, 2961, 2931, 2879, 2833, 1722, 1457,1386, 1248, 1140. 1118, 1083, 1030, 979, 945, 889 cm-1; para los datos de 1H y 13C RMN ver Tabla 2; HRESIMS m/z 486.2709 [M+NH4]+ (calcd. para C24H40NO9+, 486.2698), 469.2432 [M+H]+ (calcd. para C24H37O9+, 469.2432), 10 451.2333 (M-H2O+H]+ (calcd. para C24H35O8+, 451.2326).

15

Tabla 2. Espectros 1H y 13C de RMN para las branimicinas B y C (500 MHz, CDCl3).

5

Actividad antimicrobiana de las branimicinas B y C

La actividad antimicrobiana de las branimicinas By e fue probada contra un grupo de patógenos humanos (Tabla 1). Algunos de ellos fueron aislados e identificados en laboratorios de microbiología clínica a partir de muestras obtenidas de pacientes con 10 infecciones clínicas.

La Tabla 3 muestra las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM). Ambos compuestos exhiben actividades moderadas contra las bacterias Gram-positivas Corynebacterium urealyticum y Clostridium perfringens. La branimicina B mostró actividades moderadas 15 contra las Gram-negativas Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae ATCC 49247, Escherichia coli ESS y Bacteroides fragilis ATCC 25285 y fuerte actividad contra la Gram-positiva Micrococcus luteus, con un valor de CIM de 1 μg ml-1. La branimicina C mostró actividades moderadas contra las Gram-positivas Enterococcus faecalis 10544, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 6538P y 20 Micrococcus luteus, y la Gram-negativa Neisseria meningitidis.

Tabla 3. Concentración inhibitoria mínima (CIM) frente a un panel de patógenos clínicos.

En conclusión, dos nuevos antibióticos, las branimicinas B y C, fueron aislados y 5 caracterizados a partir de una actinobacteria abisal, Pseudonocardia carboxydivorans M-227, aislada de la columna de agua a 3.000 m de profundidad en el mar Cantábrico. Estos compuestos exhiben importantes actividades inhibitorias contra diversas bacterias patógenas, tanto Gram-positivas como Gram-negativas, aisladas de los principales Hospitales (HUCA y Cabueñes) de la misma región geográfica. Estos resultados son un 10 ejemplo de la relevancia de los productos naturales marinos como candidatos para el tratamiento de bacterias patógenas resistentes a los antibióticos.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1. Cepa bacteriana de Pseudonocardia carboxydivorans M-227 depositada en la Colección Española de Cultivo Tipo bajo el número de acceso 9108.

   5
2. 2. Sobrenadante de un cultivo de la cepa según la reivindicación 1.
3. 3. Uso de la cepa según la reivindicación 1 para la producción de compuestos de

   fórmula general (I) o cualquiera de sus sales: OH

   10

   donde: R1 es un grupo -CH2Ra y Ra se puede seleccionar entre H o el grupo -OCH3. 15
4. 4. Procedimiento para la obtención de un compuesto de fórmula general (I), o cualquiera de sus sales, descrito en la reivindicación 3, que comprende:

   a. Cultivar la cepa según la reivindicación 1 en un medio de cultivo en condiciones de 20 fermentación, y

   b. Purificar el compuesto de fórmula (I) producido por la cepa en cultivo de la etapa (a).

   25
5. 5. Compuesto de fórmula general (I):

   o cualquiera de sus sales,

   5

   donde: R1 es un grupo -CH2Ra y Ra se puede seleccionar entre H o el grupo -OCH3.
6. 6. Composición que comprende el sobrenadante según la reivindicación 2 o el compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 5.

   10
7. 7. Composición según la reivindicación 6, que además comprende otro agente antibacteriano y/o antifúngico.
8. 8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, donde la composición es una composición farmacéutica o cosmética y además comprende un excipiente o 15 vehículo farmacéutica o cosméticamente aceptable.
9. 9. Uso del sobrenadante según la reivindicación 2, del compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 5 o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, para la elaboración de un medicamento. 20
10. 10. Uso del sobrenadante según la reivindicación 2, del compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 5 o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de infecciones bacterianas. 25
11. 11. Uso según la reivindicación 10, donde las infecciones bacterianas son provocadas por bacterias seleccionadas de la lista que consiste en: Clostridium perfringens, Corynebacterium urealyticum, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae o Neisseria 30 meningitidis.
12. 12. Uso según la reivindicación 11, donde la bacteria es Micrococcus luteus.
13. 13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde las bacterias son bacterias resistentes a antibióticos.

    5
14. 14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, donde el compuesto de fórmula (I) es un compuesto donde R1 es -CH3 y la bacteria es Micrococcus luteus.
15. 15. Uso de la cepa según la reivindicación 1, del sobrenadante según la reivindicación 2, del compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 5 o de la composición según 10 cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, para la eliminación y/o prevención de la formación de biopelículas bacterianas sobre superficies inertes.
16. 16. Uso según la reivindicación 15, donde las biopelículas bacterianas son provocadas por bacterias seleccionadas de la lista que consiste en: Clostridium perfringens, 15 Corynebacterium urealyticum, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae o Neisseria meningitidis.
17. 17. Uso según la reivindicación 16, donde la bacteria es Micrococcus luteus. 20
18. 18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, donde el compuesto de fórmula (I) es un compuesto donde R1 es -CH3 y la bacteria es Micrococcus luteus.