ES2584856T3 - Oligonucleótidos para realizar un cambio en la secuencia de una molécula de arn diana presente en una célula viva - Google Patents

Oligonucleótidos para realizar un cambio en la secuencia de una molécula de arn diana presente en una célula viva Download PDF

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Abstract

Un oligonucleótido monocatenario, en el que todos los nucleósidos del oligonucleótido son 2'-O-alquil ribosa ribonucleósidos, para su uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal; el mencionado oligonucleótido puede realizar un cambio en la secuencia de una molécula de ARN diana presente en una célula viva del mencionado cuerpo humano o animal suministrando el oligonucleótido a la célula viva en condiciones que permiten que la célula viva absorba el mencionado oligonucleótido; el mencionado oligonucleótido comprende una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a la molécula de ARN diana, de manera que la hibridación del oligonucleótido con el ARN diana, o un precursor de este o una plantilla para este, tiene lugar en la mencionada célula viva, permitiendo que los mecanismos bioquímicos presentes en la mencionada célula viva copien una diferencia en la secuencia del oligonucleótido -en relación con la molécula de ARN diana- en la molécula de ARN, ya sea directamente o mediante un precursor o plantilla, a efectos de provocar el cambio en el mencionado ARN diana.

Description

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Oligonucleótidos para realizar un cambio en la secuencia de una molécula de ARN diana presente en una célula viva
Descripción
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CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención está relacionada con el campo de la terapia génica y, más específicamente, con los oligonucleótidos utilizados para realizar un cambio en la secuencia de una molécula de ARN diana presente en una célula viva.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] Numerosas enfermedades genéticas están causadas por mutaciones en el genoma. Se han encontrado
15 diversos tipos de modificaciones que causan mutaciones en el genoma: la supresión de uno o varios pares de bases, uno o más desajustes en la secuencia del gen, la inserción de uno o varios nucleótidos, o la repetición reiterativa de tripletes y la ausencia o la duplicación de un gen completo o de una parte de él.
[0003] Las enfermedades genéticas provocadas por el desajuste (o incompatibilidad), la supresión o la inserción de uno o varios pares de bases incluyen fibrosis quística, distrofia muscular, anemia de células falciformes, hemofilia, beta-talasemia y síndrome del X frágil (SXF).
[0004] La reparación de ARN puede usarse para reparar defectos genéticos a nivel del ARN.
25 [0005] Los oligonucleótidos y sus compuestos se han utilizado como moléculas terapéuticas para reparar modificaciones de ADN (I Papaioannou, JP Simons, JS Owen 'Oligonucleotide-directed gene-editing technology: mechanisms and future prospects' Expert Opin. Biol. Ther. (2012) 12(3):329-342). Estos oligómeros pueden contener nucleótidos de ARN y/o ADN, o nucleótidos modificados de ARN o ADN. Se emplean para conseguir una reparación específica del sitio de ADN defectuoso. Se predijo que la reparación tendría lugar mediante la activación de mecanismos de reparación de ADN endógenos después del reconocimiento del desajuste introducido.
[0006] Los oligonucleótidos que forman ADN tricatenario (o de triple hélice) también se han utilizado como herramientas de secuencia específica para la técnica 'gene targeting'. Los oligonucleótidos que forman ADN tricatenario se unen con una afinidad elevada en el surco mayor de ADN bicatenario. Debido a esta característica, se
35 ha sugerido que los oligonucleótidos que forman ADN tricatenario pueden ser herramientas útiles para las correcciones específicas del sitio de genes diana (Knauert et al., Hum Mol Genet. (2001) 10, 2243-2251; Richardson et al, 'Drug Target' (2002) 10, 133-134; Thoung et al., (1993) Angewandte Chemie. Intl. Ed. Eng., 32, 666-690.). Los métodos actuales para la reparación de genes diana no son muy eficaces, y/o no se ha demostrado que funcionen 'in situ' en células vivas, lo que deja lugar para otros mecanismos para la reparación de defectos de genes.
[0007] Se ha informado sobre la reparación de genes defectuosos a nivel del ARN. Por ejemplo, la reparación específica de ARNm mediante un complejo de oligonucleótidos duplicados ('duplexed oligonucleotides', en inglés) se utilizó para insertar nucléotidos 'in vitro' en el ARNm de CFTR con ∆F508. Se ha postulado que el mecanismo que actúa es la degradación mediante la ARNasa H, seguida de la reparación del ARN (PC Zamecnik, MK
45 Raychowdhury, DR Tabatadze, HF Cantiello 'Reversal of cystic fibrosis phenotype in a cultured ∆F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator cell line by oligonucleotide insertion' Proc Natl Acad Sci 2004 101(21) 81508155; WO2005094370, 'oligonucleotide complex compositions and methods of use as gene alteration tools').
[0008] 'Mutation Research' (2011), 717(1-2): 91-98, de Ying Shen et al., describe el uso de un oligonucleótido de ARN monocatenario, flanqueado por regiones de ADN, como una herramienta para la alteración de genes en células humanas y bacterianas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
55 [0009] La presente invención se define en las reivindicaciones y atañe a métodos para la reparación dirigida de genes en células vivas y, más preferiblemente, en células vivas de un organismo pluricelular ('in vivo'). Más específicamente, la invención está relacionada con la realización 'in vivo' de cambios en un ARN diana en células vivas de organismos pluricelulares, más particularmente en animales, más particularmente en mamíferos, e incluso más específicamente en humanos. A pesar de los informes previos sobre la reparación de genes en células vivas, se cree que la presente invención desvela por primera vez la posibilidad de realizar cambios 'in vivo' en una molécula de ARN diana en una célula viva, cambiando así el fenotipo de ese organismo, mediante el uso de oligonucleótidos, preferiblemente oligonucleótidos monocatenarios o de una sola hélice, más preferiblemente oligorribonucleótidos monocatenarios, e incluso más específicamente oligorribonucleótidos monocatenarios químicamente modificados. De manera sorprendente, los oligonucleótidos conformes a la presente invención
65 pueden administrarse 'in vivo' sin pérdida de actividad y en unas cantidades que permiten recuperar sustancialmente el fenotipo enfermo del organismo tratado. La invención se ilustra mediante la administración -en el pulmón de un
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CFTR se restablece tras el tratamiento con QR-010.
[0098] En general, el presente experimento demuestra claramente que un oligonucleótido conforme a la invención, como QR-010, es eficaz para reparar defectos genéticos. 5 Ejemplo 2
Actividad para restablecer la secuencia de ARN que codifica el CFTR de tipo natural de los oligonucleótidos representados en las SEQ ID NO’s: 51, 56, 61 y 66.
[0099] Los oligonucleótidos representados en las SEQ ID NO’s: 51, 56, 61 y 66 se analizan para conocer su actividad al restablecer la secuencia de ARN que codifica el CFTR de tipo natural en células epiteliales del pulmón primarias obtenidas de pacientes que portan la mutación diana en al menos un alelo. Las células se cultivan en un medio adecuado de acuerdo con los métodos conocidos para las personas versadas en la materia. Los
15 oligonucleótidos conformes a la invención se introducen en las células mediante transfección. La transfección se realiza de acuerdo con los métodos conocidos para las personas versadas en la materia con la ayuda de lipofectamina, un reactivo de transfección, en concentraciones que van de 1 a 500 nM. El oligocomplejo reactivo de transfección se añade a las células en el medio adecuado y se elimina de las células tras una incubación de 24 h.
[0100] La actividad de los oligonucleótidos para restablecer la secuencia de ARN que codifica el CFTR de tipo natural se determina tras 1 a 4 días de cultivo celular después de la transfección. Se cosechan las células y se evalúa la actividad de los oligonucleótidos a nivel molecular usando la reparación de ARN como información principal. La reparación de ARN se determina mediante secuenciación y/o métodos de Q-PCR. El ARN se depura de las células usando un método conocido para las personas versadas en la materia. Posteriormente, la parte del ARN
25 de CFTR en la que está presente la mutación diana se amplifica mediante RT-PCR. Los productos del RT-PCR se secuencian para determinar que la mutación se ha reparado como se representa en las figuras 9A-D.
LEYENDA DE LAS FIGURAS
[0101]
Figura 1. Secuencias parciales de ARN de CFTR de tipo natural (WT) y con ∆F508 (Mut), en los alrededores del sitio de deleción. Los tres nucleótidos suprimidos o eliminados en el mutante se representan en negrita en la secuencia WT.
35 Figura 2. Representación esquemática de la edición de ARN del ARN mutante de CFTR con ∆F508 usando un oligonucleótido con la SEQ ID NO: 1. La molécula de ARN reparada (RS) tiene 3 nucleótidos insertados, lo que hace que la secuencia de ARN sea idéntica al CFTR de tipo natural (CFTR WT).
Figura 3. ARN parcial y secuencias proteicas de las moléculas reparadas, mutantes y de tipo natural. La mutante no tiene fenilalanina en la posición 508. El ARN reparado da lugar a la inserción de una fenilalanina, dando lugar a una secuencia proteica de tipo natural.
Figura 4. Actividad del oligonucleótido monocatenario en el CFTR mutante con ∆F508 endógena que
45 expresa cultivos celulares. Se comparan el oligonucleótido monocatenario y el oligonucleótido dúplex previamente descrito. La actividad se mide mediante la detección de la actividad del transportador de cloruro del CFTR.
Figura 5. La actividad del ENaC representada como el potencial (mV) para ratones de tipo natural (WT), ratones con CF (CF) y ratones con CF tratados con QR-010 (CF-treated). ** P<0,01; ns=no significativo. Las barras muestran el error estándar de la media (SEM); los valores de p se obtuvieron con una prueba t para datos independientes.
Figura 6. La respuesta de CFTR inducida con forskolina se representa como el porcentaje relativo para
55 ratones de tipo natural (Wild type), ratones con CF sin tratar (CF), ratones con CF tratados con 3 dosis de QR-010 (CF 3D) y ratones con CF tratados con 6 dosis de QR-010 (Cf 6D). Los ratones de tipo natural se representan con un porcentaje de 100%.
Figura 7A. Se representa la reparación de la mutación delta F508 de CFTR en un ARN diana junto al oligonucleótido 010g (SEQ ID NO: 1); se muestra parte del ARN en las cercanías del sitio de deleción. El trinucleósido insertado CUU, que provoca la aparición de una fenilalanina (F) en la posición 508 (UUU), se resalta en negrita.
Figura 7B. Se representa la inserción de dos nucleósidos en la posición 508 del ARN diana de CFTR con
65 delta F508 mediante un oligonucleótido con la secuencia de SEQ ID NO: 16; se muestra parte del ARN en las cercanías del sitio de deleción. Se representa la inserción de dos nucleósidos CU en la posición 508, lo que
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provoca un desplazamiento del marco en la secuencia de codificación.
Figura 7C. Se representa la inserción de un nucleósido en la posición 508 del ARN diana de CFTR con delta F508 mediante un oligonucleótido con la secuencia de SEQ ID NO: 17; se muestra parte del ARN en las cercanías del sitio de deleción. Se representa la inserción del nucleósido C en la posición 508, lo que provoca un desplazamiento del marco en la secuencia de codificación y finalmente crea un codón de parada en la posición 512.
Figura 7D. Se representa la inserción de un nucleósido en la posición 508 del ARN diana de CFTR con delta F508 mediante un oligonucleótido con la secuencia de SEQ ID NO: 18; se muestra parte del ARN en las cercanías del sitio de deleción. Se representa la inserción del nucleósido C en la posición 508, lo que provoca un desplazamiento del marco en la secuencia de codificación y finalmente crea un codón de parada en la posición 512.
Figura 8. Se representan diversas inserciones en la posición 508 en el ARN diana de CFTR de tipo natural.
Figura 8A. Se representa la inserción de un codón de parada en la posición 508 ((ATCATCTGATTTGGTGTT); SEQ ID NO: 33) en el ARN diana de CFTR de tipo natural por medio de un oligonucleótido con la secuencia de SEQ ID NO: 19; se muestra parte del ARN en las cercanías de la posición 508. La inserción del codón de parada provoca una parada de la traducción tras I 507.
Figura 8B. Se representa la inserción de dos nucleósidos en la posición 508 del ARN diana de CFTR de tipo natural por medio de un oligonucleótido con la secuencia de SEQ ID NO: 20; se muestra parte del ARN en las cercanías de la posición 508. Se representa la inserción de dos nucleósidos GA en la posición 508, lo que provoca un desplazamiento del marco en la secuencia de codificación.
Figura 8C. Se representa la inserción de un nucleósido en la posición 508 del ARN diana de CFTR de tipo natural por medio de un oligonucleótido con la secuencia de SEQ ID NO: 21; se muestra parte del ARN en las cercanías de la posición 508. Se representa la inserción de un nucleósido A en la posición 508, lo que provoca un desplazamiento del marco en la secuencia de codificación y finalmente crea un codón de parada en la posición 513.
Figura 8D. Se representa la inserción de un codón de leucina (ATCATCCTCTTTGGTGTT; SEQ ID NO: 40) en la posición 508 del ARN diana de CFTR de tipo natural por medio de un oligonucleótido con la secuencia de SEQ ID NO: 22; se muestra parte del ARN en las cercanías de la posición 508. Se muestran la inserción del codón de leucina y el polipéptido resultante.
Figura 8E. Se representa la inserción de un codón de parada a medio camino del exón 10 del ARN diana de CFTR de tipo natural por medio de un oligonucleótido con la secuencia de SEQ ID NO: 23; se muestra parte del ARN en las cercanías de la posición 508. La inserción del codón de parada provoca una parada de la traducción tras la posición de aminoácido F 494.
Figura 8F. Se representa la introducción de un codón de leucina (CUU) en el exón 10 del ARN diana de CFTR de tipo natural por medio de un oligonucleótido con la secuencia de SEQ ID NO: 24. Se muestran la introducción del codón de leucina y el polipéptido resultante.
Figura 9A. Se representa la reparación de la mutación R117H del CFTR en un ARN diana por medio del oligonucleótido CFTR-R117 (SEQ ID NO: 51); se muestra parte del ARN en las cercanías del sitio de mutación. La sustitución de “A” por “G” transforma el codón CAC (His) en un codón CGC (Arg) y está resaltada en negrita.
Figura 9B. Se representa la reparación de la mutación G542X del CFTR en un ARN diana por medio del oligonucleótido CFTR-G542 (SEQ ID NO: 56); se muestra parte del ARN en las cercanías del sitio de mutación. La sustitución de “U” por “G” transforma el codón UGA (Parada) en un codón GGA (Gly) y está resaltada en negrita.
Figura 9C. Se representa la reparación de la mutación W1282X del CFTR en un ARN diana por medio del oligonucleótido CFTR-W1282 (SEQ ID NO: 61); se muestra parte del ARN en las cercanías del sitio de mutación. La sustitución de “A” por “G” transforma el codón UGA (Parada) en un codón UGG (Tryp) y está resaltada en negrita.
Figura 9D. Se representa la reparación de la mutación N1303K del CFTR en un ARN diana por medio del oligonucleótido CFTR-N1303 (SEQ ID NO: 66); se muestra parte del ARN en las cercanías del sitio de mutación. La sustitución de “G” por “C” transforma el codón AAG (Lys) en un codón AAC (Asn) y está resaltada en negrita.
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