CN104640986B - 用于改变活细胞中存在的目标rna分子的序列的寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因治疗领域，更具体地，涉及用于改变活细胞中存在的目标RNA分子的序列的寡核苷酸。

Description

用于改变活细胞中存在的目标RNA分子的序列的寡核苷酸
发明领域
本发明涉及基因治疗领域，更具体地，涉及用于改变活细胞中存在的目标RNA分子的序列的寡核苷酸。
背景技术
许多种遗传病是由基因组中的突变引起的。若干类型的修饰已经发现在基因组中发生突变：一个或若干个碱基对的缺失、基因序列中的一个或若干个错配、一个或若干个核苷酸的插入、或重复三联体的反复以及整个或一部分基因的缺失或重复。
由一个或若干个碱基对的错配、缺失或插入导致的遗传病包括囊性纤维化、肌肉萎缩症、镰状细胞性贫血、血友病、β-地中海贫血、脆性X综合征。
可以利用RNA修复在RNA水平上修复遗传缺陷。
寡核苷酸及其复合物已经被用作修复DNA修饰的治疗分子(I Papaioannou,JPSimons,JS Owen,Oligonucleotide-directed gene-editing technology:mechanismsand future prospects(寡核苷酸引导的基因编辑技术：机制和未来展望),ExpertOpin.Biol.Ther.(2012)12(3):329-342)。这些寡聚物可以包含RNA和/或DNA核苷酸、或修饰的RNA或DNA核苷酸。采用它们获得缺陷DNA的位点特异性修复。预期修复在识别出引入的错配之后通过内源性DNA修复机制的激活进行。
形成三联体的寡核苷酸也已经被用作基因靶向的序列特异性工具。形成三联体的寡核苷酸在双链体DNA的大沟中以高亲和力结合。由于该特性，已经提出将形成三联体的寡核苷酸作为位点特异性修正靶向基因的工具(Knauert等人,Hum Mol Genet.(2001)10,2243-2251；Richardson等人,Drug Target(2002)10,133-134；Thoung等人,(1993)Angewandte Chemie.Intl.Ed.Eng.,32,666-690.)。目前的靶向基因修复方法不是非常有效，而且/或者尚未证实在活细胞中原位发挥作用，为修复基因缺陷的其他机制留下空间。
RNA水平上缺陷基因的修复已见诸报道。例如，采用通过双链寡核苷酸复合物的mRNA特定修复在体外在ΔF508CFTR mRNA中插入核苷酸。介导该过程的机制假定是RNA酶H介导的降解，然后是RNA修复(PC Zamecnik,MK Raychowdhury,DR Tabatadze,HFCantiello Reversal of cystic fibrosis phenotype in a culturedΔF508cysticfibrosis transmembrane conductance regulator cell line by oligonucleotideinsertion (通过寡核苷酸插入在培养的ΔF508囊性纤维化跨膜传导调节因子细胞系中逆转囊性纤维化表型),Proc Natl Acad Sci 2004101(21)8150-8155；WO2005094370,oligonucleotide complex compositions and methods of use as gene alterationtools(寡核苷酸复合物组合物及其用作基因变更工具的方法))。
发明内容
本发明涉及用于活细胞中的靶向基因修复的方法，更优选地，在多细胞有机体中(在体内)在活细胞中的靶向基因修复的方法。更具体地，本发明涉及在多细胞有机体中、更具体地在动物中、更具体地在哺乳动物中、再更具体地在人中在体内改变活细胞中的目标RNA。尽管有更早的活细胞中基因修复的报道，但据信本发明首次公开了使用寡核苷酸、优选单链寡核苷酸、更优选单链寡核糖核苷酸、再更具体地为化学修饰的单链寡核糖核苷酸在体内改变活细胞中的目标RNA分子、从而改变该有机体的表型的可能性。出人意料地，根据本发明的寡核苷酸可以以基本上恢复受试者有机体患病表型的量在体内不丧失活性地进行给药。本发明通过如下示例：将能够恢复编码CFTR的RNA序列、从而恢复CFTR蛋白质功能并恢复CF表型或者至少减轻有机体病情的经化学修饰的寡核糖核苷酸给予患有囊性纤维化的有机体的肺中。因此，本发明涉及寡核苷酸，优选为单链反义寡核苷酸；包括该寡核苷酸的组合物；包括该寡核苷酸和药学可接受载体的药物组合物；该寡核苷酸或组合物用于在体内或体外进行RNA修复和/或改变目标RNA分子的序列的用途和方法；该寡核苷酸或组合物用于与(遗传)病有关或与基因突变有关的疾病的治疗或预防，包括将该寡核苷酸或组合物给予受试者、优选人受试者；以及包括将该寡核苷酸或组合物给予受试者、优选人受试者的用于治疗或预防与(遗传)病有关或与基因突变有关的疾病的方法。在将该优选为单链反义的寡核苷酸引入到细胞、优选哺乳动物细胞、更优选人细胞中时，将其在RNA需要被修复、并有可能起到RNA修复的指导链作用的位置处引向RNA或其前体或其模板。具体的修复机制尚未知晓，但根据本发明的优选为单链修复分子的寡核苷酸优选在修复过程中不允许RNA酶H发挥作用。在目标RNA中介导的变化可以直接体现在RNA水平上或者经由随后转录成RNA分子的DNA或其前体间接体现。在此所述的寡核苷酸通常称作本发明的寡核苷酸，并可以用于本发明的所有实施方式中。
本发明的所有实施方式均可以在体外、在体内或离体进行(在方法或用途的情况下)或使用(在化合物或组合物的情况下)。
本发明可以方便地用于治疗囊性纤维化，优选地通过修复CFTR(囊性纤维化跨膜转导调节因子)外显子10中的ΔF508突变。根据本发明的一示例性寡核苷酸——SEQ IDNO:1所示分子的作用方式描绘于图1-3和7A中。根据本发明的一示例性寡核苷酸——SEQID NO:1所示分子相比较于之前所述的双链体(Zamecnik等人，同上)的活性描绘于图4中。附图表明，与之前所述的双链体分子相比较，当前所述的单链反义寡核苷酸(AON)在修复CFTR方面至少具有相同的活性，并且似乎活性更强(PC Zamecnik,MK Raychowdhury,DRTabatadze,HF Cantiello Reversal of cystic fibrosis phenotype in a culturedΔF508cystic fibrosis transmembrane conductance regulator cell line byoligonucleotide insertion(通过寡核苷酸插入在培养的ΔF508囊性纤维化跨膜传导调节因子细胞系中逆转囊性纤维化表型),Proc Natl Acad Sci 2004 101(21)8150-8155；WO2005094370,oligonucleotide complex compositions and methods of use as genealteration tools(寡核苷酸复合物组合物及其用作基因变更工具的方法))。SEQ ID NO:1的活性使用Zamecnik等人在同上文献中所述的比较试验测定，尤其是参见第8153页图4。
本发明还可以方便地用于改变其他目标RNA分子和/或治疗与(遗传)病相关的其他疾病，例如但不限于，白化病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、阿尔茨海默氏症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、Cadasil综合征(Cadasil syndrome)、腓骨肌萎缩症、慢性阻塞性肺病(COPD)、远端型脊肌萎缩症(DSMA)、杜氏/贝氏肌营养不良(Duchenne/Beckermuscular dystrophy)、营养不良型大疱性表皮松懈(Dystrophic Epidermolysisbullosa)、大疱性表皮松懈、法布里病(Fabry disease)、家族性腺瘤(FamilialAdenomatous)、息肉病、半乳糖血症、戈谢病(Gaucher's Disease)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色病、亨特氏综合征、亨廷顿氏舞蹈病、贺勒氏症(Hurler Syndrome)、炎症性肠病(IBD)、遗传性多凝聚反应综合征、莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan syndrome)、Lynch综合征、马凡综合征(Marfan syndrome)、黏多糖病、肌肉萎缩症、I型和II型肌强直性营养不良、A、B和C型尼曼-匹克病、NY-esol相关癌症、帕金森氏病、黑斑息肉综合征(Peutz-Jegher syndrome)、苯丙酮尿症、庞帕病(Pompe's disease)、原发性纤毛疾病(PrimaryCiliary Disease)、肺性高血压、色素性视网膜炎、山霍夫氏病(Sandhoff Disease)、重症联合免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞性贫血、脊髓型肌萎缩症、斯特格氏病(Stargardt'sDisease)、泰-萨氏病(Tay-Sachs disease)、X连锁免疫缺陷病、各种形式的癌症(例如BRCA1和BRCA2相关的乳腺癌和卵巢癌)等。
根据本发明一优选实施方式，目标RNA序列的变化包括将一个或多个核苷酸插入到目标RNA中。在更优选的实施方式中，插入一个或多个核苷酸导致在由目标RNA序列编码的多肽序列中插入至少一个氨基酸序列。根据最优选的实施方式，插入氨基酸序列导致编码的多肽在多细胞有机体中恢复成正常发挥功能的多肽。因此，在本发明最优选的实施方式中，多细胞有机体中的目标RNA序列与目标RNA序列功能失常导致的疾病有关，并且遗传病选自因目标RNA序列与正常发挥功能的目标RNA序列相比缺少一个或多个核苷酸而导致的疾病。优选地，根据本发明，目标RNA序列缺少密码子的至少一部分，其通过使用根据本发明的寡核苷酸改变RNA序列得以恢复。
本发明表明，RNA修复可以通过根据本发明的寡核苷酸的全身给药在体内完成。取决于与疾病有关的组织或器官，或者更一般地为要实现目标RNA改变的对象，给药方式可以加以修改，以优化根据本发明的寡核苷酸的递送。对于肺病和其他呼吸疾病，根据本发明的寡核苷酸可以方便地直接给予肺，例如，通过吸入。另外可选地，取决于疾病和/或目标组织，给药可以局部(例如，在皮肤上)或全身进行，例如，皮内、皮下、肌内、静脉内、口服、直肠、颅内给药等。
根据本发明的寡核苷酸可以含有DNA-或RNA-核苷酸；可以存在有修饰的DNA-或RNA-核苷酸，以提高稳定性，如本文别处所述。根据本发明的寡核苷酸可以包括，例如肌苷，并且/或者包括修饰的核苷酸，优选选自2’-O-烷基核糖、2’-O-甲基核糖、2’氟核糖、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、PMO、5-甲基-dC、2-氨基-dA、C5-嘧啶。稳定化核苷酸的一种这样的优选例子是2’-O-甲基修饰的核苷酸，另一例子是锁核酸(LNA)核苷酸和/或肽核酸(PNA)。其他提高稳定性的措施可以是，例如，核苷酸之间的硫代磷酸酯连接。根据本发明的寡核苷酸可以根据本领域已知的任何方法制备。本领域技术人员知晓如何合成根据本发明的寡核苷酸。
因此，根据本发明的寡核苷酸优选加以化学修饰，以耐受核酸内切酶、核酸外切酶和RNA酶H，并促进(RNA)结合和双链体稳定性。所选择化学性的具体特性至少部分地影响根据本发明的寡核苷酸向目标的递送：给药途径、生物稳定性、生物分布、组织内分布以及细胞摄取和运输。此外，可以应用寡核苷酸化学性质的进一步优化，以提高结合亲和力和稳定性，提高活性，提高安全性，并/或通过减少长度或改进合成和/或提纯方法而降低商品成本。多种化学修饰是本领域技术人员常用的和/或市售的(例如，2’-O-甲基RNA和5-取代的嘧啶和2,6-二氨基嘌呤)。
根据本发明的寡核苷酸可以具有至少一个骨架，和/或糖修饰和/或至少一个碱基修饰。
碱基修饰包括天然嘌呤和嘧啶碱基(例如腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)的修饰形式，例如，次黄嘌呤、乳清酸、agmatidine、赖胞苷、2-硫代嘧啶(例如，2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶)、G形钳(G-clamp)及其衍生物、5-取代的嘧啶(例如，5-卤代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氨基甲基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-氨基甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、Super T)、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、8-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、Super G、Super A和N4-乙基胞嘧啶或其衍生物；N2-环戊基鸟嘌呤(cPent-G)、N2-环戊基-2-氨基嘌呤(cPent-AP)和N2-丙基-2-氨基嘌呤(Pr-AP)或其衍生物；和简并或通用的碱基，如2,6-二氟甲苯，或缺碱基，如脱碱基位点(abasic site)(例如，1-脱氧核糖、1,2-二脱氧核糖、1-脱氧-2-O-甲基核糖；或其中环氧已被氮取代的吡咯烷衍生物(脱氮核糖))。Super A、Super G和Super T衍生物的例子可见于US专利6,683,173(Epoch Biosciences)，在此将其全文并入作为参考。cPent-G、cPent-AP和Pr-AP显示在结合到siRNA中时降低免疫刺激效果(Peacock H.等人,J.Am.Chem.Soc.2011,133,9200)。
糖修饰包括核糖基部分的修饰形式，例如，2’-O-修饰的RNA，例如2’-O-烷基或2’-O-(取代的)烷基如2’-O-甲基、2’-O-(2-氰基乙基)、2’-O-(2-甲氧基)乙基(2’-MOE)、2’-O-(2-硫代甲基)乙基、2’-O-丁酰基、2’-O-炔丙基、2’-O-烯丙基、2’-O-(2-氨基)丙基、2’-O-(2-(二甲基氨基)丙基)、2’-O-(2-氨基)乙基、2’-O-(2-(二甲基氨基)乙基)；2’-脱氧(DNA)；2’-O-(卤代烷氧基)甲基(Arai K.等人,Bioorg.Med.Chem.2011,21,6285)例如2’-O-(2-氯代乙氧基)甲基(MCEM)、2’-O-(2,2-二氯代乙氧基)甲基(DCEM)；2’-O-烷氧基羰基例如2’-O-[2-(甲氧基羰基)乙基](MOCE)、2’-O-[2-(N-甲基氨甲酰基)乙基](MCE)、2’-O-[2-(N,N-二甲基氨甲酰基)乙基](DCME)；2’-卤素如2’-F、FANA(2’-F阿拉伯糖基核酸)；卡巴糖(carbasugar)和氮杂糖修饰；3’-O-烷基例如3’-O-甲基、3’-O-丁酰基、3’-O-炔丙基；及其衍生物。其他修饰包括“桥连”或“双环”核酸(BNA)，例如锁核酸(LNA)、xylo-LNA、α-L-LNA、β-D-LNA、cEt(2’-O,4’-C受限乙基)LNA、cMOEt(2’-O,4’-C受限甲氧基乙基)LNA、乙撑-桥连核酸(ENA)、三环DNA；解锁核酸(UNA)；环己烯基核酸(CeNA)、altriol核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)、氟化HNA(F-HNA)、吡喃糖基-RNA(p-RNA)、3’-脱氧吡喃糖基-DNA(p-DNA)；吗啉代(PMO)、阳离子型吗啉代(PMOPlus)、PMO-X；及其衍生物。本发明中还包括在根据本发明的寡核苷酸中引入多于一个的不同的糖修饰。BNA衍生物描述于例如WO 2011/097641中，在此将其全文引入作为参考。PMO-X的例子描述于WO2011150408中，在此将其全文引入作为参考。
骨架修饰包括磷酸二酯的修饰形式，例如，硫代磷酸酯(PS)、手性纯的硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯(PS2)、膦酰基乙酸酯(PACE)、膦酰基乙酰胺(PACA)、硫代膦酰基乙酸酯、硫代膦酰基乙酰胺、硫代磷酸酯前药、H-膦酸酯、膦酸甲酯、硫代膦酸甲酯、磷酸甲酯、硫代磷酸甲酯、磷酸乙酯、硫代磷酸乙酯、硼烷基磷酸酯(boranophosphate)、硼烷基硫代磷酸酯、硼烷基磷酸甲酯、硼烷基硫代磷酸甲酯、硼烷基膦酸甲酯、硼烷基硫代膦酸甲酯及其衍生物。其他的修饰包括亚磷酰胺(phosphoramidite)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、N3’→P5’氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯(phosphordiamidate)、硫代二氨基磷酸酯、氨基磺酸酯、二亚甲基亚砜(dimethylenesulfoxide)、磺酸酯、三唑、草酰基、氨基甲酸酯、亚甲基亚氨基(methyleneimino，MMI)和硫代乙酰氨基核酸(TANA)；及其衍生物。本发明还包括在根据本发明的寡核苷酸中引入多于一个的不同的骨架修饰。
根据本发明的寡核苷酸的其他化学修饰包括肽-碱基核酸(PNA)、硼簇修饰的PNA、基于吡咯烷的氧-肽核酸(POPNA)、基于乙二醇-或丙三醇的核酸(GNA)、基于苏糖的核酸(TNA)、基于无环苏氨醇的核酸(aTNA)、基于吗啉代的寡核苷酸(PMO、PMO-X)、阳离子型基于吗啉代的寡聚体(PMOPlus)、具有整合的碱基和骨架的寡核苷酸(ONIBs)、吡咯烷-酰胺寡核苷酸(POMs)及其衍生物。
根据本发明的寡核苷酸含有与要修复的目标RNA互补的序列，其优选地编码野生型多肽序列。因此，由于密码子的简并性，寡核苷酸可以包括一个或多个简并的互补密码子。互补的核苷酸可以存在于要修复的位点的任一侧上，即，要改变的序列侧翼的序列优选地在要改变的序列的3’侧、5’侧或3’和5’侧二者上。这些互补序列碱基配对时，RNA修复便被激活。
目标RNA的序列优选地与修复的或野生型序列不同。未修复的目标RNA优选是突变的序列。优选地，突变是正常野生型序列的替换、缺失或插入。经修复的目标RNA优选地是基因或其他所需参考序列的野生型序列。
根据本发明的寡核苷酸的长度优选为15-100个核苷酸，优选地长度为至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或至少40个核苷酸，其中至少10个与目标RNA序列互补。可使用一些其他的核苷酸作为修复模板(或诱导物)。与目标mRNA序列的碱基配对优先在细胞中发生。细胞可以是哺乳动物细胞，其可以存在于细胞培养物中(体外)或身体内(体内)。
本发明优选地涉及用于治疗囊性纤维化的方法，其中遗传病优选为ΔF508突变，要改变的序列优选为携带ΔF508突变的CFTR的(前-)mRNA。本发明优选地用于修复具有囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)突变ΔF508的患者的RNA。引入5’-UUU-3’或5’-CUU-3’替代三个缺失的核苷酸将会得到修复的RNA，其在蛋白质序列中恢复丢失的苯丙氨酸氨基酸(F或Phe)，并由此引起野生型蛋白质形成。
例如，CFTRΔF508 RNA可以通过将细胞、优选哺乳动物细胞、更优选人细胞在体外或体内与根据本发明的寡核苷酸接触和/或用其转染来修复。
根据本发明优选的寡核苷酸与这样的序列互补：其与SEQ ID NO:6的核苷酸16-30和34-48的序列同一性为至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％，并且改变的序列优选选自5’-UUU-3’和5’-CUU-3’，优选为5’-CUU-3’。根据本发明更优选的寡核苷酸是包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3(优选SEQ ID NO:1)的寡核苷酸，或由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3(优选SEQ ID NO:1)组成的寡核苷酸；或者包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3(优选SEQID NO:1)的较短变体的寡核苷酸，或由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3(优选SEQ ID NO:1)的较短变体组成的寡核苷酸。这类较短变体从SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的3’和/或5’端去除了一些核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个核苷酸。根据本发明优选的变体寡核苷酸包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3(优选SEQ ID NO:1)的核苷酸7-29。
SEQ ID NO:1：5’-AUCAUAGGAAACACCAAAGAUGAUAUUUUCUUUU-3’(CAPS核苷酸优选是2’-O-Me修饰的RNA)。
SEQ ID NO:3：5’-AUCAUAGGAAACACCAAAAAUGAUAUUUUCUUU-3’(CAPS核苷酸优选是2’-O-Me修饰的RNA)。
根据本发明进一步优选的寡核苷酸包括：包括序列选自SEQ ID NO:16至SEQ IDNO:24的寡核苷酸或由其组成的寡核苷酸；或者包括序列选自SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:24的寡核苷酸的较短变体或由其组成的寡核苷酸。这类较短变体从SEQ ID NO:16至SEQ IDNO:24的3’和/或5’端去除了一些核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个核苷酸。这些寡核苷酸可以方便地用于改变目标RNA分子的序列，例如，通过在缺失的苯丙氨酸密码子(出于例示目的)处移码插入1或2个碱基对、在CFTR蛋白质的氨基酸508位处框内插入产生苯丙氨酸密码子的核苷三联体、在CFTR蛋白质的氨基酸508位或其他氨基酸位置处框内插入产生亮氨酸密码子的核苷三联体、或在CFTR编码序列中插入终止密码子。根据本发明的这些示例性寡核苷酸——SEQ ID NO:16-24中所示分子的作用方式描绘于图7B-8F中。
优选地，在根据本发明的寡核苷酸中，一些，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸包括如本文之前所述的修饰或其组合，优选经2’-O-Me修饰的核苷酸。可以将如本文之前所述的提高稳定性的特性加在序列上，例如，在一些或全部核苷酸之间使用LNA或PNA核苷酸或硫代磷酸酯键。另外可选地，可以使用DNA核苷酸代替RNA核苷酸。所描述修饰的全部或一些可以在一个反义分子中组合。
上述的修饰可以提高在上皮细胞中的摄取。另外可选地，可以通过从3’和/或5’端除去一些，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个核苷酸，使分子缩短，以提高在细胞中的摄取。
对于体内应用来说，根据本发明的寡核苷酸可以包装在脂质体、多核糖体或纳米颗粒或其他合适的颗粒例如病毒颗粒中用于递送(给药)。另外可选地，或者与递送载体结合，修复分子可以与聚乙烯-亚胺(PEI)和/或聚乙二醇(PEG)复合。根据本发明的寡核苷酸可以在细胞内部、甚至在体内合成，例如，通过将细胞用编码寡核苷酸的病毒或病毒样颗粒感染。另外可选地，可以在体外或体内用(病毒)DNA或质粒等转染活细胞。在感染或转染活细胞后，根据本发明的寡核苷酸便在活细胞内通过正常的转录和/或复制进行合成。
因此，根据本发明的寡核苷酸可以照此直接地递送至多细胞有机体的细胞、组织或器官。根据本发明的寡核苷酸也可以使用任何本领域已知的适当方式间接给药。例如，根据本发明的寡核苷酸可以载体或表达载体的形式提供给多细胞有机体的细胞、组织或器官，其中载体或表达载体包括编码寡核苷酸的核酸分子。优选地，将表达载体经由基因传递载体引入到多细胞有机体的细胞、组织、器官中。在一实施方式中，提供有包括驱动本发明寡核苷酸的表达或转录的表达盒或转录盒的病毒载体。优选的递送载体是病毒载体，例如腺相关病毒载体(AAV)，或者逆转录病毒载体，例如慢病毒等。
本发明一实施方式涉及包括如上所述的核酸分子的载体的用途，其中载体是适合于基因治疗的载体。适合于基因治疗的载体描述于以下文献中：Anderson 1998,Nature392:25-30；Walther和Stein,2000,Drugs 60:249-71；Kay等人,2001,Nat.Med.7:33-40；Russell,2000,J.Gen.Virol.81:2573-604；Amado和Chen,1999,Science 285:674-6；Federico,1999,Curr.Opin.Biotechnol.10:448-53；Vigna和Naldini,2000,J.GeneMed.2:308-16；Marin等人,1997,Mol.Med.Today 3:396-403；Peng和Russell,1999,Curr.Opin.Biotechnol.10:454-7；Sommerfelt,1999,J.Gen.Virol.80:3049-64；Reiser,2000,Gene Ther.7:910-3；以及其中引用的参考文献。
特别合适的基因治疗载体包括腺病毒和腺相关病毒(AAV)载体。这些载体感染许多种分裂和非分裂的细胞类型。此外，腺病毒载体能够进行高水平的转基因表达。但是，由于腺病毒和AVV载体在进入细胞之后的附加型(episomal)性质，这些病毒载体最适合于如上所述的仅要求转基因瞬时表达的治疗应用(Russell,2000,J.Gen.Virol.81:2573-2604；Goncalves,2005,Virol J.2(1):43)。优选的腺病毒载体经修饰以减少宿主反应，如Russell综述(2000,同上)。
应用于本发明的优选的逆转录病毒载体是基于慢病毒的表达构建物。慢病毒载体具有独特的感染非分裂细胞的能力(Amado和Chen,1999Science 285:674-6)。构建和应用基于慢病毒的表达载体的方法描述于以下文献中：U.S.专利第6,165,782、6,207,455、6,218,181、6,277,633和6,323,031号；Federico(1999,Curr Opin Biotechnol 10:448-53)和Vigna等人(2000,J Gene Med 2000；2:308-16)。
通常，基因治疗载体将会视作以下意义上的上述表达载体：其包括编码要表达的根据本发明的寡核苷酸的核酸分子，其中所述核酸分子与适当的调节序列可操作地连接。这些调节序列将会至少包括启动子序列。用于由基因治疗载体表达编码多肽的核苷酸序列的适当的启动子包括，例如，巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子，病毒长末端重复序列启动子(LTRs)，例如来自莫洛尼氏鼠白血病病毒(murine moloney leukaemia virus，MMLV)劳斯肉瘤病毒或HTLV-1的启动子，猿猴病毒40(SV 40)早期启动子和单纯性疱疹病毒胸苷激酶启动子。
许多意在用于肺的药物可以经由气道应用。一种这样的药物可以由RNA修复分子即根据本发明的寡核苷酸组成。优选地使用喷雾器用于将根据本发明的寡核苷酸在气溶胶中递送至气道上皮细胞。另外可选地，可以使用干燥粉末吸入制剂。在气道递送系统中使用根据本发明的单链寡核苷酸降低了给药过程中分子被剪切力崩解的机会。
在许多疾病中，粘液层显现出厚度增加，导致药物经由肺的吸收降低。一种这样的疾病是慢性支气管炎，另一例子是囊性纤维化。可得到各种形式的粘液正常化剂(mucusnormalizer)，例如，DNA酶、高渗盐水或甘露醇，其以Bronchitol名称市售。当粘液正常化剂与RNA修复化合物例如根据本发明的寡核苷酸组合使用时，它们可以增加这些药物的有效性。因此，将根据本发明的寡核苷酸给予受试者、优选人受试者优选地与粘液正常化剂、优选本文所述的粘液正常化剂组合施用。此外，根据本发明的寡核苷酸的给药可以与用于治疗CF的小分子例如增效剂化合物如Kalydeco(ivacaftor；VX-770)或校正剂(corrector)化合物如VX-809(Lumacaftor)和/或VX-661的给药结合。
另外可选地，或者与粘液正常化剂相结合，可以将粘液渗透颗粒或纳米颗粒中的递送应用于将RNA修复分子有效递送至例如肺和肠的上皮细胞。因此，将根据本发明的寡核苷酸给予受试者、优选人受试者的过程优选地使用粘液渗透颗粒或纳米颗粒中的递送。
慢性和急性肺感染常常出现于患有例如囊性纤维化的疾病的患者中。抗生素治疗降低了细菌感染及其症状，例如粘液增稠和/或生物膜形成。抗生素与RNA修复分子的结合使用可以因使得修复分子更容易接近目标细胞而增加RNA修复的有效性。因此，将根据本发明的寡核苷酸给予受试者、优选人受试者的过程优选地与抗生素治疗结合，以减少细菌感染及其症状，例如粘液增稠和/或生物膜形成。抗生素可以全身给药，或局部给药，或者全身和局部地给药。
对于在例如囊性纤维化患者中的应用，根据本发明的寡核苷酸或者根据本发明的包装或复合的寡核苷酸可以与任何粘液正常化剂例如DNA酶、甘露糖、高渗盐水和/或抗生素和/或用于治疗CF的小分子例如增效剂化合物如Kalydeco(ivacaftor；VX-770)或校正剂化合物如VX-809(Lumacaftor)和/或VX-661结合。
为了提高目标分子的可及性(access)，可以在给予根据本发明的寡核苷酸之前应用支气管-肺泡灌洗(BAL)，以清洁肺部。
延时释放(time-release)胶囊可以用于将根据本发明的寡核苷酸递送至肠上皮细胞。这些细胞中的CFTR修复可以增加营养素的摄取。这可以与生物或合成来源的胰酶制剂例如胰脂肪酶或市售Creon的使用相结合，通常由CF患者使用，以帮助消化。
在本发明的所有实施方式中，根据本发明的寡核苷酸可以存在于高渗盐水组合物中，即，包括根据本发明的寡核苷酸、并进一步包括2％-9％盐水、优选3％-8％盐水、更优选4％-8％盐水、更优选5％-8％盐水、更优选6％-8％盐水(例如6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7.0％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％或8.0％)、更优选6％-7％盐水、再更优选大约7％盐水、最优选7％盐水的组合物。在此盐水百分含量定义为盐水重量/组合物总体积，即，7％盐水对应于70克盐水/升组合物。高渗盐水溶液优选地基本上是NaCl溶液。
在本发明的任意实施方式中，根据本发明的寡核苷酸和/或组合物可以根据本领域技术人员已知的任何方式给药，其包括但不限于，给予肺(优选经由气道)以及全身给药，优选静脉内、肌内、皮内或皮下给药。
本领域技术人员将会认识到，本文上述的递送方法、载体和给药方式的组合可以进一步在根据本发明的方法和用途中结合，例如，根据本发明的寡核苷酸和/或包括该寡核苷酸的组合物可以与如本文所述的递送化合物复合，可以包装在本文所述的递送载体中，并/或可以包装在延时释放胶囊中。
一种优选的递送方法是编码根据本发明的寡核苷酸的病毒颗粒或病毒核酸序列的形式，上述寡核苷酸在用病毒颗粒感染活细胞或者用病毒核酸序列转染活细胞时得以表达；优选地如本文之前所述。
根据本发明的寡核苷酸的递送可以是递送至肺(优选通过气道)和/或递送至肠。给药可以与优选如本文所述的粘液正常化剂和/或与优选如本文所述的抗生素治疗结合，和/或可以与优选如本文所述的胰酶制剂的给药结合，和/或可以与支气管-肺泡灌洗结合，以提高目标分子的可及性。
本领域技术人员将会理解到，两种或更多种根据本发明的寡核苷酸可以组合。本领域技术人员将会认识到，当在本文中提到根据本发明的寡核苷酸时，在根据本发明的方法和用途中，根据本发明的组合物或药物组合物优选可以可互换地使用。
一方面，本发明提供一种寡核苷酸用于改变活细胞中存在的目标RNA分子的序列的用途，其包括以下步骤：在使得活细胞能够摄取所述寡核苷酸的条件下对活细胞提供寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括与目标RNA分子至少部分互补的序列，使得在所述活细胞中发生寡核苷酸与目标RNA或其前体或其模板的杂交，使所述活细胞中存在的生化机制将寡核苷酸序列中相对于目标RNA分子序列的差异直接地或经由其前体或其模板拷贝到RNA分子上，以引起所述目标RNA的序列变化。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸是如本文之前所述的寡核苷酸。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸是寡核糖核苷酸。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸以单链形式提供给活细胞。
优选地，在该方面的实施方式中，活细胞是多细胞有机体的一部分。
优选地，在该方面的实施方式中，活细胞是动物细胞，更优选人细胞。
优选地，在该方面的实施方式中，所述目标RNA的序列变化导致细胞改变其表型。
优选地，在该方面的实施方式中，所述目标RNA的变化通过测定所述目标RNA或其前体或其模板的序列证实。
优选地，在该方面的实施方式中，所述目标RNA的变化通过测定多肽产物的序列或由所述目标RNA编码的多肽的核酸编码序列的序列证实。
优选地，在该方面的实施方式中，所述目标RNA的变化通过测定所述活细胞或包括所述细胞的有机体中的表型变化证实。
优选地，在该方面的实施方式中，变化是与变化之前目标RNA的序列有因果关系的疾病的减轻。
优选地，在该方面的实施方式中，疾病是遗传病。
优选地，在该方面的实施方式中，该方面的寡核苷酸长度为15-100个核苷酸。更优选地，寡核苷酸的长度为20-50个、更优选25-45个核苷酸，更优选27-35个核苷酸。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸包括肌苷，并且/或者包括修饰的核苷酸，优选选自2’-O烷基核糖、2’氟核糖、PMO、5-甲基-dC、2-氨基-dA、C5-嘧啶，和/或选自硫代磷酸酯连接、甲基膦酸酯连接的修饰的核苷间连接。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸包括RNA、DNA、PNA和/或LNA。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸的全部核苷均为2’-O烷基核糖核苷，更优选为2’-O甲基核糖核苷。
优选地，在该方面的实施方式中，全部核苷均为核糖核苷。
优选地，在该方面的实施方式中，目标RNA分子的序列变化包括一个或多个核苷的插入或替换。
优选地，在该方面的实施方式中，目标RNA编码人CFTR，并且上述变化导致编码CFTR蛋白质508位氨基酸的苯丙氨酸的核苷三联体的产生或恢复。
优选地，在该方面的实施方式中，上述变化包括插入选自5’-UUU-3’和5’-CUU-3’的核苷三联体。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸与这样的序列互补：其与SEQ ID NO:6的核苷酸16-30和34-48的序列同一性为至少75％、80％、85％、90％、95％或99％，并且上述变化包括插入选自5’-UUU-3’和5’-CUU-3’的核苷三联体。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3(优选SEQ ID NO:1)的核苷酸7-29，优选核苷酸1-33，或者由其组成。其他优选的寡核苷酸包括：包括序列选自SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:24的寡核苷酸或由其组成的寡核苷酸，或者包括序列选自SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:24的寡核苷酸的较短变体或由其组成的寡核苷酸。这些较短变体已从SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:24的3’和/或5’端去除了一些，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个核苷酸。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸在优选为脂质体、多核糖体或纳米颗粒的载体中提供，并且/或者其中寡核苷酸与优选为聚乙烯-亚胺(PEI)、聚乙二醇(PEG)的递送化合物复合，并/或与优选为胆固醇的甾醇连接。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸以干燥制剂或以气溶胶的形式优选使用喷雾器优选经由气道提供给肺，并且优选地寡核苷酸与本领域技术人员已知的转染介质和/或囊性纤维化药物一起提供，优选DNA酶、甘露醇(优选Bronchitol)和/或用于治疗CF的小分子，优选Kalydeco(ivacaftor；VX-770)、VX-809(Lumacaftor)和/或VX-661。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸在优选盐水浓度2％-9％、优选3％-8％、更优选4％-8％、更优选5％-8％、更优选6％-8％、更优选6％-7％、再更优选盐水浓度大约7％的高渗盐水溶液中提供，其中高渗盐水溶液优选是生理学和药学可接受的溶液。
优选地，在该方面的实施方式中，高渗盐水溶液基本上是NaCl溶液。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸在粘液渗透颗粒、优选在粘液渗透纳米颗粒中给药。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸的给药与抗生素治疗结合，以减少细菌感染及其症状，例如粘液增稠和/或生物膜形成。
优选地，在该方面的实施方式中，在给予根据本发明的寡核苷酸之前应用支气管-肺泡灌洗(BAL)。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸在延时释放胶囊中给药，以促进递送至肠细胞。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸的给药与生物或合成胰酶组合物例如胰脂肪酶或Creon的给药结合。
在另一方面，本发明提供一种用于人体或动物体治疗的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够改变所述人体或动物体的活细胞中存在的目标RNA分子的序列，其通过以下进行：在使得活细胞能够摄取所述寡核苷酸的条件下对活细胞提供寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括与目标RNA分子至少部分互补的序列，使得在所述活细胞中发生寡核苷酸与目标RNA或其前体或其模板的杂交，使所述活细胞中存在的生化机制将寡核苷酸序列中相对于目标RNA分子的差异直接地或经由其前体或其模板拷贝到RNA分子上，以引起所述目标RNA的变化。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸是如本文之前所述的寡核苷酸。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸是寡核糖核苷酸。
优选地，在该方面的实施方式中，所述目标RNA的序列变化导致细胞改变其表型。
优选地，在该方面的实施方式中，所述目标RNA的序列变化通过测定所述目标RNA或其前体或其模板的序列证实。
优选地，在该方面的实施方式中，所述目标RNA的序列变化通过测定由所述目标RNA编码的多肽产物的序列证实。
优选地，在该方面的实施方式中，所述目标RNA的序列变化通过测定所述活细胞或包括所述细胞的有机体中的表型变化证实。
优选地，在该方面的实施方式中，表型变化是与变化之前目标RNA的序列有因果关系的疾病的减轻。
优选地，在该方面的实施方式中，疾病是遗传病。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸的长度为15-100个核苷酸。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸的长度为20-50个、更优选25-45个核苷酸，更优选27-35个核苷酸。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核糖核苷酸包括肌苷，并且/或者包括修饰的核苷酸，优选选自2’-O烷基核糖、2’氟核糖、PMO、5-甲基-dC、2-氨基-dA、C5-嘧啶，和/或选自硫代磷酸酯连接、甲基膦酸酯连接的修饰的核苷间连接。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸的全部核苷均为2’-O烷基核糖核苷，更优选为2’-O甲基核糖核苷。
优选地，在该方面的实施方式中，全部核苷均为核糖核苷。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸包括RNA、DNA、PNA和/或LNA。
在根据本发明的所有实施方式中，根据本发明的寡核苷酸典型地以范围在1μg至1000mg、更优选10μg至100mg、再更优选100μg至10mg、最优选500μg至5mg的剂量给药，其取决于要处理的细胞(组织)、有机体重量、给药方式和/或部位(局部vs全身，给药部位(腹膜内、肌内、肺等))、要治疗的疾病、要应用的方案(单次或重复的大丸剂或连续给药)等。本领域普通技术人员将能够通过一些反复试验和错误来确定最优剂量。
优选地，在该方面的实施方式中，目标RNA分子的序列变化包括一个或多个核苷的插入或替换。
优选地，在该方面的实施方式中，目标RNA编码人CFTR，并且上述变化导致编码CFTR蛋白质508位氨基酸的苯丙氨酸的核苷三联体的产生或恢复。
优选地，在该方面的实施方式中，上述变化包括插入选自5’-UUU-3’和5’-CUU-3’的核苷三联体。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸与这样的序列互补：其与SEQ ID NO:6的核苷酸16-30和34-48的序列同一性为至少75％、80％、85％、90％、95％或99％，并且上述变化包括插入选自5’-UUU-3’和5’-CUU-3’的核苷三联体。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3(优选SEQ ID NO:1)的核苷酸7-29，优选核苷酸1-33，或者由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3(优选SEQ ID NO:1)的核苷酸7-29，优选由核苷酸1-33组成。其他优选的寡核苷酸包括：包括序列选自SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:24的寡核苷酸或由其组成的寡核苷酸，或者包括序列选自SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:24的寡核苷酸的较短变体或由其组成的寡核苷酸。这些较短变体已从SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:24的3’和/或5’端去除了一些，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个核苷酸。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸在优选为脂质体、多核糖体或纳米颗粒的载体中提供，并且/或者其中寡核苷酸与优选为聚乙烯-亚胺(PEI)、聚乙二醇(PEG)的递送化合物复合，并/或与优选为胆固醇的甾醇连接。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸以干燥制剂或以气溶胶的形式优选使用喷雾器优选经由气道提供给呼吸道或肺，并且优选地寡核苷酸与本领域技术人员已知的转染介质和/或囊性纤维化药物一起提供，优选DNA酶、甘露醇(优选Bronchitol)和/或用于治疗CF的小分子，优选Kalydeco(ivacaftor；VX-770)、VX-809(Lumacaftor)和/或VX-661。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸在优选盐水浓度2％-9％、优选3％-8％、更优选4％-8％、更优选5％-8％、更优选6％-8％、更优选6％-7％、再更优选盐水浓度大约7％的高渗盐水组合物中提供，其中高渗盐水溶液优选是生理学和药学可接受的溶液。
优选地，在该方面的实施方式中，高渗盐水溶液基本上是NaCl溶液。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸在粘液渗透颗粒、优选在粘液渗透纳米颗粒中提供。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸的给药与抗生素治疗结合，以减少细菌感染及其症状，例如粘液增稠和/或生物膜形成。
优选地，在该方面的实施方式中，在给予根据本发明的寡核苷酸之前应用支气管-肺泡灌洗(BAL)。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸在延时释放胶囊中给药，以促进递送至肠细胞。
优选地，在该方面的实施方式中，寡核苷酸的给药与生物或合成胰酶组合物例如胰脂肪酶或Creon的给药结合。
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括如本发明之前的方面所定义的寡核苷酸、药学可接受载体和/或高渗的生理学和药学可接受的盐水溶液，优选盐水浓度2％-9％、优选3％-8％、更优选4％-8％、更优选5％-8％、更优选6％-8％、更优选6％-7％、再更优选盐水浓度大约7％。
优选地，在该方面的实施方式中，高渗盐水溶液基本上是NaCl溶液。
优选地，在该方面的实施方式中，药物组合物进一步包括转染介质。
优选地，在该方面的实施方式中，药物组合物进一步包括本领域技术人员已知的囊性纤维化药物，优选DNA酶、甘露醇和/或用于治疗CF的小分子，优选Kalydeco(ivacaftor；VXVX-770)、VX-809(Lumacaftor)和/或VX-661。
在另一方面，本发明提供如本文中各个方面和实施方式中定义的根据本发明的寡核苷酸和/或包括该寡核苷酸的药物组合物。优选地，根据本发明的该寡核苷酸或组合物是单链寡核糖核苷酸或包括单链寡核糖核苷酸的药物组合物，上述单链寡核糖核苷酸互补于与SEQ ID NO:6的核苷酸16-30和34-48的序列同一性为至少75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列。更优选地，根据本发明的该寡核苷酸或组合物是单链寡核糖核苷酸或包括单链寡核糖核苷酸的药物组合物，上述单链寡核糖核苷酸包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3(优选SEQ ID NO:1)的核苷酸7-29，优选核苷酸1-33。其他优选的寡核苷酸包括：包括序列选自SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:24的寡核苷酸或由其组成的寡核苷酸，或者包括序列选自SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:24的寡核苷酸的较短变体或由其组成的寡核苷酸。这些较短变体已从SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:24的3’和/或5’端去除了一些，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个核苷酸。
在本发明的所有实施方式中，可以使用赋形剂，其将(进一步)有助于提高根据本发明的寡核苷酸的稳定性、溶解性、吸收、生物有效性、活性、药代动力学、药效学和向细胞和细胞内的递送，特别是能够形成复合物、囊泡、纳米颗粒、微颗粒、纳米管、纳米凝胶、水凝胶、泊咯沙姆(poloxamer)或普朗尼克(pluronics)、聚合物囊泡、胶体、微泡、囊泡、胶束、lipoplexes和/或脂质体的赋形剂，其将复合或捕获于囊泡或脂质体中的化合物、物质和/或寡核苷酸通过细胞膜递送。纳米颗粒的例子包括金纳米颗粒、磁性纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、脂类纳米颗粒、糖颗粒、蛋白质纳米颗粒和肽纳米颗粒。另一类纳米颗粒是聚合纳米颗粒。许多种这些聚合物质是本领域已知的。合适的物质包括，例如，聚乙烯亚胺(PEI)、ExGen 500、聚丙烯亚胺(PPI)、聚(2-羟基丙烯亚胺)(pHP)、葡聚糖衍生物(例如聚阳离子，如二乙基氨基乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖，已知其是DNA转染试剂，它们可以与氰基丙烯酸丁酯(PBCA)和氰基丙烯酸己酯(PHCA)组合，以配制可以将所述化合物跨细胞膜递送至细胞内的阳离子型纳米颗粒)、氰基丙烯酸丁酯(PBCA)、氰基丙烯酸己酯(PHCA)、聚(乳酸-co-乙醇酸)(PLGA)、聚胺类(例如，精胺、亚精胺、腐胺、尸胺)、壳聚糖、聚(酰氨基胺)(PAMAM)、聚(酯胺)、聚乙烯基醚、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、环糊精、透明质酸、多聚乙酰神经氨酸及其衍生物、树枝状聚合物(例如，聚(酰氨基胺)、脂类{例如，1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、二油酰基二甲基氯化铵(DODAC)、卵磷脂衍生物[例如，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)]、lyso-卵磷脂衍生物[例如，l-硬脂酰基-2-lyso-sn-甘油-3-磷酸胆碱(S-Ly soPC)]、鞘磷脂、2-{3-[双-(3-氨基-丙基)-氨基]-丙基氨基}-N-二-十四烷基(ditetracedyl)氨基甲酰基甲基乙酰胺(RPR209120)、磷酸甘油衍生物[例如，1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油钠盐(DPPG-Na)、磷脂酸衍生物[1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酸钠盐(DSPA)、磷脂酰乙醇胺衍生物[例如，二油酰基-J-R-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)]、JV-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTAP)、1,3-二-油酰氧基-2-(6-羧基-spermyl)-丙酰胺(DOSPER)、(1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-二甲基羟基乙基铵(DMRIE)、(N1-胆甾醇氧基羰基-3,7-二氮杂壬烷-1,9-二胺(CD AN)、二甲基二-十八烷基溴化铵(DDAB)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、(b-L-精氨酰基-2,3-L-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油基-酰胺三盐酸化物(AtuFECTOl)、N,N-二甲基-3-氨基丙烷衍生物[例如，1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DoDMA)、l,2-二亚油基氧基-N,N-3-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、磷脂酰丝氨酸衍生物[l,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸钠盐(DOPS)]、胆固醇}、合成的两亲化合物(SAINT-18)、lipofectin、蛋白质(例如，白蛋白、明胶、端胶原(atellocollagen))、肽(例如，PepFects、NickFects、聚精氨酸、聚赖氨酸、CADY、MPG)及其组合和/或病毒衣壳蛋白质，其能够自组装到可以将所述化合物或寡核苷酸递送至细胞的颗粒中。Lipofectin代表脂质体转染试剂的例子。它由至少两个脂类组分组成：阳离子型脂类N-[l-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)(cp.DOTAP，其为硫酸甲酯盐)和中性脂类二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)。中性组分介导细胞内释放。除这些纳米颗粒材料以外，阳离子肽鱼精蛋白也提供了将寡核苷酸配制成胶体的另外可选的方法。该胶体纳米颗粒系统可以形成所谓的proticle，其可以通过简单的自组装过程制备，以包装本文所定义的化合物并介导其细胞内释放。本领域技术人员可以选择和调整任意上述的或其他市售的或非市售的另外可选的赋形剂和递送系统。
本发明还提供一种预防或治疗受试者中与(遗传)病有关或与(遗传)突变有关的疾病的方法，其包括将根据本发明的寡核苷酸或根据本发明的组合物给予受试者、优选人受试者。
(遗传)病、(遗传)突变、寡核苷酸、组合物和给药优选如本文之前所述。
在本发明的说明书中，术语“遗传”置于括弧之间，以表明目标RNA分子中的突变并不必然得以遗传编码。它们可以是因为(不正确)RNA编辑、异常的前RNA剪接或加工或任何其他(未知)的机制引起。
在本文件及其权利要求中，动词“包括”及其连词以其非限定性意义使用，意味着包括了该词语后的项目，但是并不排除未提到的项目。此外，除非上下文明确要求有且只有一个元素，通过不定冠词“一”或“一个”提到的元素并不排除存在有一个以上的元素的可能性。不定冠词“一”或“一个”由此通常是指“至少一个”。词语“大约”或“约”在与数值结合使用时(例如，大约10)优选地是指数值可以是给定的数值(例如，10)加上或减去该数值的0.1％。
本文提供的序列信息不应当狭义地理解成要求包含误识别的核苷酸。技术人员能够识别出这些误识别的核苷酸，并知晓如何更正这些错误。在序列错误的情况下，应以囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)的基因组DNA、mRNA和多核苷酸序列为准。
在此将本所说明书中引用的所有专利和参考文献均全文并入作为参考。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步进行说明，这些实施例不应理解成对本发明的范围构成限定。
除非另外指出，本发明的实施将会采用分子生物学、微生物学和/或生物化学的传统标准方法。这些技术描述于以下文献中：Sambrook等人,(1989)Molecular Cloning,ALaboratory Manual(第2版)，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Volumes 1和2,Ausubel等人,(1994)Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols,USA；和VolumesI和II,Brown(1998)Molecular Biology LabFax,第2版,Academic Press(UK)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait编)；Nucleic Acid Hybridization(Hames和Higgins编著)。
实施例1
QR-010的体内评价
囊性纤维化(CF)的表型是由功能性CFTR蛋白质的缺失引起的，导致氯流出(chloride efflux)降低。CFTR也是钠通道ENaC的负调节物。CFTR的缺失诱导ENaC，导致钠的超量吸收，进一步加剧了渗透平衡的不平衡，并使CF表型恶化。CFTR的修复使氯转运增加，并具有减轻钠超量吸收的额外作用。
治疗CFTR的药剂的有效性可以通过在囊性纤维小鼠模型中测定鼻电位差(NPD)来测量(Leal等人,2006,Lab animals 40:43-52)。NPD测量是测量动物和人中鼻上皮上的电流的方式。在此，在测量过程中产生的迹线(trace)中，通过计算开始时和加入ENaC阻断剂之后的电流之间的差异，测定钠转运。对于CFTR活性，测定减氯缓冲液(chloride-minusbuffer)和/或毛喉素(forskolin)应用之前和之后之间的差异。
电势的降低指示了在CF中观察到的ENaC过度活性的降低而导致的有效治疗。钠由受CFTR调节的ENaC转运。由于在CF中缺乏功能性CFTR，ENaC未下调，导致钠的超量吸收，进而使CF表型恶化。
电势通过毛喉素诱导增加也指征有效的治疗。典型地，在CF小鼠中，没有减氯CFTR反应，也没有毛喉素诱导的CFTR反应；如果治疗之后可以观察到统计学上显著的毛喉素诱导的CFTR反应的修正，这是有效治疗的指征。
简言之，将8只CF-dF508小鼠用ProQR的QR-010分子(序列如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸)处理。小鼠已数次用溶解于2μL水中的40μg QR-010鼻内给药。小鼠在第0天进行处理前NPD测量，在第2、4和7天以该分子给药，并在第9天进行处理后NPD测量。随后3只小鼠在第10、13和15天给药，在第17天进行处理后测量，NPD测量根据Leal等人,2006,Lab animals40:43-52如下进行，加以一些修改，使用数据记忆高阻抗(>1.0E+12Ω)电压计(KnickPortamesss 913,ElektronischeBerlin,Germany)。简言之，将小鼠背朝下置于加热垫上，爪和尾以绑带捆住挪开。将皮下插入于后腿中的装有稀释导电膏(Signa[Parker Labs,Fairfield,NJ,USA]膏/KCl 1mol/L 1:1vol/vol)的具翼静脉导管(0.719mm,Insyte-Wt,Becton Dickinson,UT,USA)用作连接参比Ag/AgCl电极(SLEInstruments,South Croydon,UK)的桥。将双腔导管(外径[OD]r0.3mm)置于鼻通道中，一个管腔用于灌注等渗盐水缓冲溶液，另一个用作测量电极。其阻抗为<1.0E+6Ω。将动物的舌头移到侧边，将尖的滤纸芯朝着喉咙插入嘴中大约1cm，以从口腔中吸收多余的液体。将从灌注的鼻孔流出的多余液体用置于鼻尖的滤纸吸收，这样的方式使得相对的鼻孔保持不含液体。通常，注射药物后5min，将加热垫稍倾斜大约30°，动物头部向下，使用蠕动泵(P1,Amersham Biosciences,Roosendaal,The Netherlands)以15mL/min速率开始鼻灌注。开始灌注之前，测量基线鼻PD，直至得到稳定的数值。只有在电压已稳定之后，更换溶液。基础等渗盐水溶液由以下组成(mmol/L)：Na+140、Cl-120、K+5.2、HCO3 -25,HPO4 2-2.4、H2PO4 -0.4、Ca2+1.2和Mg2+1.2。通过将NaCl和CaCl2用等摩尔的葡糖酸盐代替，MgCl2用MgSO4代替，制备用来检测来自鼻上皮的氯流出的无氯溶液。摩尔渗透压浓度(osmolarity)为275mOsm/L，pH为7.4。起始NPD值主要是由于ENaC产生的钠流。将该通道用阿米洛利(amiloride)阻断，以将电势降至零。加入无氯缓冲液，以测量CFTR转运的氯，使用毛喉素激活CFTR。实验结束时，给予固定剂量的纳洛酮(4mg)、竞争性吗啡拮抗剂和阿替美唑以及美托咪啶特异性解毒剂(美托咪啶剂量的5倍)，将动物在暗室中置于加热垫上，直至完全恢复，通常在3-4小时之后发生。
NPD测量的结果示于图5和图6中。
在图5中，明显地表明，CF小鼠中的钠转运在用QR-010处理时有变化(p＝0.0002；n＝8)，朝着野生型水平移动。这是CFTR活性在用QR-010处理时得以恢复的明确指征。
在图6中，明显地表明，毛喉素诱导的CFTR反应在3次给药QR-010之后得以提高(p＝0.019；n＝8)，在6次给药QR-010之后进一步提高(p＝0.11；n＝3)。通常，在CF小鼠中没有毛喉素诱导的CFTR反应；但在处理之后，观察到毛喉素诱导的CFTR反应的修正。这是CFTR活性在用QR-010处理时得以恢复的明确指征。
总之，本实验清楚地证明，根据本发明的寡核苷酸例如QR-010在基因缺陷的修复中是有效的。
实施例2
SEQ ID NO’s:51、56、61和66所示的寡核苷酸恢复编码野生型CFTR的RNA序列的活 性
测定SEQ ID NO’s:51、56、61和66所示的寡核苷酸用于在从在至少一个等位基因上携带目标突变的患者得到的初始肺上皮细胞中恢复编码野生型CFTR的RNA序列的活性。根据本领域技术人员已知的方法在合适的培养基中培养细胞。通过转染将根据本发明的寡核苷酸引入到细胞中。转染根据本领域技术人员已知的方法借助于浓度范围1-500nM的转染试剂lipofectamine进行。将低聚-转染试剂复合物加入到适当培养基中的细胞中，孵育24小时后从细胞上洗去。
转染后细胞培养1-4天后测定寡核苷酸修复编码野生型CFTR的RNA序列的活性。收获细胞，使用RNA修复作为主要读出在分子水平上评价寡核苷酸的活性。RNA修复通过测序和/或Q-PCR方法测定。使用本领域技术人员已知的方法从细胞中提纯RNA。随后，通过RT-PCR对CFTR RNA中存在有目标突变的部分进行扩增。对RT-PCR产物进行测序，以确定突变以得到修复，如图9A-D所示。
附图说明
图1.野生型(WT)和ΔF508(Mut)CFTR RNA在缺失部位周围的部分序列。在突变体中缺失的三个核苷酸在WT序列中以黑体表示。
图2.使用SEQ ID NO:1的寡核苷酸对突变的ΔF508CFTR RNA进行RNA编辑的示意图。修复的RNA分子(RS)已经插入了3个核苷酸，产生与野生型CFTR相同的RNA序列。
图3.野生型、突变体和修复的分子的部分RNA和蛋白质序列。突变体在508位上丢失了苯丙氨酸。修复的RNA导致插入了苯丙氨酸，产生野生型蛋白质序列。
图4.单链寡核苷酸在表达内源性ΔF508突变CFTR的细胞培养物中的活性。对单链寡核苷酸和之前描述的双链寡核苷酸进行比较。通过检测CFTR氯转运体的活性来测量活性。
图5.野生型小鼠(WT)、CF小鼠(CF)和用QR-010处理的CF小鼠(CF-处理过)的表示为电势(mV)的ENaC活性。**P<0.01；ns＝不显著。标尺表示平均值的标准误差(SEM)；p-值通过非配对T-检验得到。
图6.野生型小鼠(野生型)、未经处理的CF小鼠(CF)、3次给药QR-010处理的CF小鼠(CF 3D)和6次给药QR-010处理的CF小鼠(CF 6D)的表示为相对百分比的毛喉素诱导的CFTR反应。野生型小鼠表示为100％。
图7A.显示了010g寡核苷酸(SEQ ID NO:1)对目标RNA中CFTR ΔF508突变的修复；显示了缺失位点周围的RNA部分。导致在508位(UUU)出现苯丙氨酸(F)的插入的三核苷CUU以黑体强调。
图7B.显示出通过序列SEQ ID NO:16的寡核苷酸在ΔF508CFTR目标RNA的508位插入两个核苷；显示了缺失位点周围的RNA部分。显示了508位上两个核苷CU的插入，导致编码序列中的移码。
图7C.显示出通过序列SEQ ID NO:17的寡核苷酸在ΔF508CFTR目标RNA的508位插入一个核苷；显示了缺失位点周围的RNA部分。显示了508位上的核苷C的插入，导致编码序列中的移码，最终在512位上产生终止密码子。
图7D.显示出通过序列SEQ ID NO:18的寡核苷酸在ΔF508CFTR目标RNA的508位插入一个核苷；显示了缺失位点周围的RNA部分。显示了508位上的核苷C的插入，导致编码序列中的移码，最终在512位产生终止密码子。
图8.显示了WT CFTR目标RNA中508位上的各种插入。
图8A.显示出通过序列SEQ ID NO:19的寡核苷酸在WT CFTR目标RNA的508位(ATCATCTGATTTGGTGTT；SEQ ID NO:33)插入终止密码子；显示了508位周围的RNA部分。插入终止密码子导致I 507之后的翻译终止。
图8B.显示出通过序列SEQ ID NO:20的寡核苷酸在WT CFTR目标RNA的508位插入两个核苷；显示了508位周围的RNA部分。显示了508位上两个核苷GA的插入，导致编码序列中的移码。
图8C.显示出通过序列SEQ ID NO:21的寡核苷酸在WT CFTR目标RNA的508位插入一个核苷；显示了508位周围的RNA部分。显示了508位上的核苷A的插入，导致编码序列中的移码，最终在513位产生终止密码子。
图8D.显示出通过序列SEQ ID NO:22的寡核苷酸在WT CFTR目标RNA的508位插入亮氨酸密码子(ATCATCCTCTTTGGTGTT；SEQ ID NO:40)；显示了508位周围的RNA部分。显示了亮氨酸密码子的插入和产生的多肽。
图8E.显示了通过序列SEQ ID NO:23的寡核苷酸在WT CFTR目标RNA外显子10的中途插入终止密码子；显示了508位周围的RNA部分。插入终止密码子导致在氨基酸F 494位之后的翻译终止。
图8F.显示了通过序列SEQ ID NO:24的寡核苷酸在WT CFTR目标RNA外显子10中引入亮氨酸密码子(CUU)。显示了亮氨酸密码子的引入和产生的多肽。
图9A.显示了CFTR-R117寡核苷酸(SEQ ID NO:51)对目标RNA中CFTR R117H突变的修复；显示了突变位点周围的RNA部分。将“A”替换成“G”使得CAC密码子(His)转化成CGC密码子(Arg)，并以黑体强调。
图9B.显示了CFTR-G542寡核苷酸(SEQ ID NO:56)对目标RNA中CFTR G542X突变的修复；显示了突变位点周围的RNA部分。将“U”替换成“G”使得UGA密码子(终止密码子)转化成GGA密码子(Gly)，并以黑体强调。
图9C.显示了CFTR-W1282寡核苷酸(SEQ ID NO:61)对目标RNA中CFTR W1282X突变的修复；显示了突变位点周围的RNA部分。将“A”替换成“G”使得UGA密码子(终止密码子)转化成UGG密码子(Tryp)，并以黑体强调。
图9D.显示了CFTR-N1303寡核苷酸(SEQ ID NO:66)对目标RNA中CFTR N1303K突变的修复；显示了突变位点周围的RNA部分。将“G”替换成“C”将AAG密码子(Lys)转化成AAC密码子(Asn)，并以黑体强调。

Claims (45)

1.一种用于治疗人体或动物体中的囊性纤维化的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所有核苷均为2’-O烷基核糖核苷，其中通过在使得活细胞能摄取所述寡核苷酸的条件下对所述活细胞提供所述寡核苷酸，所述寡核苷酸能够改变所述人体或动物体的活细胞中存在的目标RNA分子的序列，其中所述寡核苷酸包括与所述目标RNA分子至少部分互补的序列，使得在所述活细胞中发生寡核苷酸与目标RNA或其前体或其模板的杂交，使所述活细胞中存在的生化机制将寡核苷酸序列中相对于目标RNA分子的差异直接地或经由其前体或其模板拷贝到RNA分子上，以引起所述目标RNA的变化，其中：
所述寡核苷酸由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸1-33组成，并且其中所述目标RNA是CFTR RNA。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中(a)：所述目标RNA的序列变化导致细胞改变其表型；(b)其中所述目标RNA的序列的变化通过测定所述目标RNA或其前体或其模板的序列而证实；(c)其中所述目标RNA的序列的变化通过测定由所述目标RNA编码的多肽产物的序列而证实；(d)其中所述目标RNA的序列的变化通过测定所述活细胞或包括所述细胞的有机体中的表型变化而证实，理想地，其中所述表型变化是与变化之前目标RNA的序列有因果关系的疾病的减轻。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核糖核苷酸包括肌苷，并且/或者包括修饰。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其中所述修饰的核苷酸选自5-甲基-dC、2-氨基-dA、C5-嘧啶，和/或选自硫代磷酸酯键和甲基膦酸酯键的修饰的核苷间的键。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的全部核苷均为2’-O-甲基核糖核苷。
6.根据权利要求1-2中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在载体中提供，并且/或者其中所述寡核苷酸与递送化合物复合，并且/或者与甾醇连接。
7.根据权利要求6所述的寡核苷酸，其中所述载体为脂质体、多核糖体或纳米颗粒。
8.根据权利要求6所述的寡核苷酸，其中所述递送化合物为聚乙烯-亚胺(PEI)或聚乙二醇(PEG)。
9.根据权利要求6所述的寡核苷酸，其中所述甾醇为胆固醇。
10.根据权利要求1-2中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸以干燥制剂或以气溶胶的形式提供给呼吸道或肺。
11.根据权利要求10所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸经由气道提供给呼吸道或肺。
12.根据权利要求10所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸以干燥制剂或以气溶胶的形式使用喷雾器提供给呼吸道或肺。
13.根据权利要求10所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与转染介质和/或囊性纤维化药物和/或用于治疗CF的小分子一起提供。
14.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中所述囊性纤维化药物为DNA酶或甘露醇。
15.根据权利要求14所述的寡核苷酸，其中所述甘露醇是Bronchitol。
16.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中所述用于治疗CF的小分子是Kalydeco(ivacaftor；VX-770)、VX-809(Lumacaftor)和/或VX-661。
17.根据权利要求10所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在高渗盐水组合物中提供。
18.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述高渗盐水组合物的盐水浓度为2％-9％。
19.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述高渗盐水组合物的盐水浓度为3％-8％。
20.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述高渗盐水组合物的盐水浓度为4％-8％。
21.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述高渗盐水组合物的盐水浓度为5％-8％。
22.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述高渗盐水组合物的盐水浓度为6％-8％。
23.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述高渗盐水组合物的盐水浓度为6％-7％。
24.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述高渗盐水组合物的盐水浓度为7％。
25.根据权利要求17-24中任一项所述的寡核苷酸，其中高渗盐水溶液是生理学和药学可接受的溶液。
26.根据权利要求25所述的寡核苷酸，其中所述高渗盐水溶液是NaCl溶液。
27.根据权利要求10所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在粘液渗透颗粒中提供。
28.根据权利要求27所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在粘液渗透纳米颗粒中提供。
29.根据权利要求10所述的寡核苷酸，其中(i)所述寡核苷酸的给药与抗生素治疗结合，以减少细菌感染及其症状；和/或(ii)其中在寡核苷酸给药之前应用支气管-肺泡灌洗(BAL)。
30.根据权利要求29所述的寡核苷酸，其中所述症状是粘液增稠和/或生物膜形成。
31.根据权利要求1-2中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在延时释放胶囊中给药，以促进递送至肠细胞；以及任选地，其中所述寡核苷酸的给药与生物或合成的胰酶组合物的给药结合。
32.根据权利要求31所述的寡核苷酸，其中所述胰酶组合物是胰脂肪酶或Creon。
33.一种药物组合物，其包括如权利要求1-32中任一项所述的寡核苷酸、药学可接受载体和/或高渗的生理学和药学可接受的盐水溶液。
34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中高渗的盐水溶液的盐水浓度为2％-9％。
35.根据权利要求33所述的药物组合物，其中高渗的盐水溶液的盐水浓度为3％-8％。
36.根据权利要求33所述的药物组合物，其中高渗的盐水溶液的盐水浓度为4％-8％。
37.根据权利要求33所述的药物组合物，其中高渗的盐水溶液的盐水浓度为5％-8％。
38.根据权利要求33所述的药物组合物，其中高渗的盐水溶液的盐水浓度为6％-8％。
39.根据权利要求33所述的药物组合物，其中高渗的盐水溶液的盐水浓度为6％-7％。
40.根据权利要求33所述的药物组合物，其中高渗的盐水溶液的盐水浓度为7％。
41.根据权利要求33所述的药物组合物，其中高渗的盐水溶液是NaCl溶液。
42.根据权利要求33所述的药物组合物，其还包括转染介质。
43.根据权利要求33-42中任一项所述的药物组合物，其还包括囊性纤维化药物和/或用于治疗CF的小分子。
44.根据权利要求43所述的药物组合物，其中所述囊性纤维化药物为DNA酶或甘露醇。
45.根据权利要求43所述的药物组合物，其中所述用于治疗CF的小分子为Kalydeco(ivacaftor；VX-770)、VX-809(Lumacaftor)和/或VX-661。
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