RU2816897C2 - Генетическая конструкция, содержащая последовательности химерных направляющих РНК для делеции гена SMN1 человека в культурах клеток человека - Google Patents
Генетическая конструкция, содержащая последовательности химерных направляющих РНК для делеции гена SMN1 человека в культурах клеток человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2816897C2 RU2816897C2 RU2022116800A RU2022116800A RU2816897C2 RU 2816897 C2 RU2816897 C2 RU 2816897C2 RU 2022116800 A RU2022116800 A RU 2022116800A RU 2022116800 A RU2022116800 A RU 2022116800A RU 2816897 C2 RU2816897 C2 RU 2816897C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- human
- nucleotide pairs
- smn1 gene
- guide rna
- exon
- Prior art date
Links
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 5
- 101150081851 SMN1 gene Proteins 0.000 title description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 title description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 title description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 101000617738 Homo sapiens Survival motor neuron protein Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 claims 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 claims 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- ASKZRYGFUPSJPN-UHFFFAOYSA-N 7-(4,7-diazaspiro[2.5]octan-7-yl)-2-(2,8-dimethylimidazo[1,2-b]pyridazin-6-yl)pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CN2N=C(C=C(C)C2=N1)C1=CC(=O)N2C=C(C=CC2=N1)N1CCNC2(CC2)C1 ASKZRYGFUPSJPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 2
- 102100021947 Survival motor neuron protein Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 2
- 229950009805 onasemnogene abeparvovec Drugs 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 229940126228 Evrysdi Drugs 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000035752 Live birth Diseases 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101150015954 SMN2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700013125 Zolgensma Proteins 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 208000025341 autosomal recessive disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229950001015 nusinersen Drugs 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229940121322 risdiplam Drugs 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к областям молекулярных биотехнологии и медицины и касается генетической конструкции, несущей гены направляющих РНК, комплементарных фланкирующим областям экзона 7 гена SMN1 человека. Наличие промоторов U6 обеспечивает экспрессию в клетках человека, а наличие конститутивной части (scaffold) обеспечивает узнавание синтезированных в клетке направляющих РНК нуклеазами системы CRISPR, узнающими РАМ NGG. Изобретение позволяет создать клеточные линии, моделирующие спинальную мышечную атрофию человека, которые могут быть использованы для исследования средств терапии данного заболевания. 1 ил.
Description
Область техники
Изобретение относится к областям молекулярных биотехнологии и медицины и касается генетической конструкции, несущей гены направляющих РНК с последовательностями, специфичными к фланкирующим областям экзона 7 гена SMN1 человека, под управлением промоторов U6. Изобретение может служить для нокаута гена SMN1 человека в культурах клеток для получения клеточных моделей для испытания препаратов для борьбы со спинальными мышечными атрофиями.
Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального государственного бюджетного учреждения «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» (Фонд содействия инновациям) в рамках Договора (Соглашения) №№4174ГС1/68618 от 23.07.2021.
Уровень техники
Спинальная мышечная атрофия (СМА) является тяжелым аутосомно-рецессивным нейродегенеративным заболеванием, характеризующимся прогрессирующей слабостью и атрофией проксимальных мышц, возникающих в результате дегенерации альфа-нейронов в передних рогах спинного мозга. Несмотря на то, что глобальная оценочная заболеваемость СМА не превышает 1 случая на 10000 живорождений (Verhaart, I. E. С. Prevalence, incidence and carrier frequency of 5q-linked spinal muscular atrophy a literature review / I. E. C. Verhaart, A. Robertson, I. J. Wilson, A. Aartsma-Rus, S. Cameron, С.C. Jones et al. // Orphanet J Rare Dis. - 2017. - v. 12. - P. 15.), данное заболевание является вторым по распространенности аутосомно-рецессивным наследственным заболеванием в мире и, более того, является наиболее распространенным моногенным заболеванием, приводящим к младенческой смертности. Частота встречаемости мутантного аллеля СМА варьирует от 1 на 38 до 1 на 72 случая, что в среднем в популяции составляет 1 на 54 (Chen, Т. New and Developing Therapies in Spinal Muscular Atrophy: From Genotype to Phenotype to Treatment and Where Do We Stand? / T. Chen // Int J Mol Sci. - 2020. v. 21. P. 3297.).
Причиной развития СМА более чем в 95% случаев является снижение уровня экспрессии белка выживания моторных нейронов SMN (Survival of Motor Neuron), возникающее в результате гомозиготной делеции или конверсии гена SMN1. В геноме находится практически идентичный аналог этого гена - SMN2, однако он обеспечивает только 10-15% синтеза функционального белка (Blasco-Perez, L. Beyond copy number: A new, rapid, and versatile method for sequencing the entire SMN2 gene in SMA patients / L. Blasco-Perez, I. Paramonov, J. Leno, S. Bernal, L. Alias, P. Fuentes-Prior et al. // Hum Mutat. -2021.-v. 42. - P. 787-795.).
Именно гены SMN1 и SMN2 являются главными мишенями для разработки современных методов терапии спинальной мышечной атрофии. В настоящее время три препарата - Нусинерсен ("Спинраза"; Biogen), Рисдиплам ("Эврисди"; Roche) и Онасемноген абепарвовек ("Золгенсма"; Novartis) - одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) и Европейским агентством по лекарственным средствам (ЕМА). Все одобренные препараты имеют крайне высокую стоимость, достигающую несколько миллионов долларов, в связи с этим они недоступны для большинства населения. В России и других странах идет разработка терапевтических и генотерапевтических подходов для борьбы с этими заболеваниями и для их испытания требуется биологическая модель. В качестве такой модели может выступать клеточная линия с делецией гена SMN1. Создание генно-инженерной конструкции для быстрого нокаута гена SMN1 в любой клеточной линии человека позволит в короткие сроки получать удобные модели для исследования эффективности терапии спинальных мышечных атрофий.
Раскрытие сущности изобретения
В данном изобретении гены направляющих РНК кодируют хнРНК комплементарные фланкирующим областям 7 экзона гена SMN1 человека. В кассете располагаются два гена направляющих РНК под управлением промотора U6, после каждого гена находится конститутивная часть (scaffold) (фигура). Генетическая кассета пригодна для клонирования в любую генетическую конструкцию и обеспечивает нокаут целевого гена SMN1 человека при работе в комплексе с эндонуклеазами типа Cas, узнающими РАМ-мотив NGG. Наличие промотора U6 будет обеспечивать синтез хнРНК, комплементарных фланкирующим областям экзона 7 гена SMN1, в культуре клеток, для направления нуклеазы и вырезания экзона 7 указанного гена.
Задачей заявляемого изобретения является применение для создания модельных клеточных линий с нокаутом гена SMN1, моделирующих спинальную мышечную атрофию человека для исследования терапевтических подходов.
Задача решается тем, что получена новая генетическая конструкция pDUAL_GUIDE_SMN1, для чего:
1. Попарно одноцепочечные олигонуклеотиды SMN1_G1-Up (SEQ ID NO:1) и SMN1_G1-Down (SEQ ID NO:2), а также SMN1_G2-Up (SEQ ID NO:3) и SMN1_G2-Down (SEQ ID NO:4) гибридизуются друг с другом с образованием двуцепочечных молекул G1 и G2 соответственно длиной 24 пары нуклеотидов каждая с липкими концами САСС и АААС, каждая из которых кодирует ген направляющей РНК.
2. Генетическая конструкция для клонирования двух направляющих РНК G1 и G2 под управлением промоторов U6 для каждой из них гидролизуется с помощью эндонуклеазы рестрикции BbsI с образованием липких концов. Далее гидролизованная конструкция смешивается с двуцепочечной молекулой G2 и происходит лигирование с помощью ДНК-лигазы фага Т4 и последующее клонирование в бактериальных клетках Escherichia coli штамма NEB Stable.
3. После выделения готовых конструкций, несущих ген направляющей РНК G2, производится их гидролиз эндонуклеазой рестрикции BsaI с образованием липких концов. Далее гидролизованная конструкция смешивается с двуцепочечной молекулой G1 и происходит лигирование с помощью ДНК-лигазы фага Т4 и последующее клонирование в бактериальных клетках Escherichia coli штамма NEB Stable.
4. Подтверждение правильности сборки конструкции pDUAL_GUIDE_SMN1 осуществляется с помощью секвенирования по методу Сенгера.
Технический результат изобретения: получена генетическая конструкция, несущая гены направляющих РНК G1 и G2 под управлением промоторов U6, обеспечивающая направление нуклеаз системы CRISPR, узнающих РАМ NGG и конститутивную часть (scaffold) к фланкирующим областям экзона 7 гена SMN1 человека.
Изобретение иллюстрируется фигурой и перечнем использованных последовательностей.
Краткое описание чертежей
На фигуре представлена схема конструкции pDUAL_GUIDE_SMN1. Два гена направляющих РНК расположены между собственными промоторами U6 и конститутивными частями (scaffold).
Осуществление изобретения
Способ осуществляется следующим образом:
Получение генов направляющих РНК. Олигонуклеотиды SMN1_G1-Up (SEQ ID NO:1) и SMN1_G1-Down (SEQ ID NO:2), а также SMN1_G2-Up (SEQ ID NO:3) и SMN1_G2-Down (SEQ ID NO:4) гибридизовали попарно в буфере, содержащем: 65 mM Tris-HCl (рН 8,9), 16 mM (NH4)2SO4, 1,5 mM MgCl2, 0,05% Tween-20, по температурной схеме 96°С - 10 мин, 85°С - 5 мин, 80°С - 5 мин, 75°С - 5 мин, 70°С - 5 мин, 65°С - 5 мин, 60°С - 5 мин, 55°С - 5 мин, 50°С - 5 мин, 45°С - 5 мин, 40°С - 5 мин, 35°С - 5 мин.
Генетическую конструкцию pDUAL_GUIDE, несущую сайты клонирования двух генов направляющих РНК гидролизовали с помощью эндонуклеазы рестрикции BbsI (SibEnzyme) и очищали с помощью экстракции из агарозного геля с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
Лигирование гена направляющей РНК G2 и выделенного из геля фрагмента проводили с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (Thermo Fisher Scientific). Расчет необходимого количества фрагментов для проведения реакции лигирования производился с помощью онлайн калькулятора NEBioCalculator (NEB). Для успешного прохождения реакции было выбрано соотношение копий ДНК вставок относительно копий ДНК вектора 7 к 1, при этом на реакцию было взято 100 нг фрагмента. Лигазную смесь трансформировали в компетентные клетки NEB Stable (NEB), колонии скринировали, наращивали в ночной культуре, плазмидную ДНК из них выделяли и проводили второй этап клонирования.
Плазмиду гидролизовали с помощью эндонуклеазы рестрикции BsaI (SibEnzyme) и очищали с помощью экстракции из агарозного геля с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
Лигирование гена направляющей РНК G1 и выделенного из геля фрагмента проводили с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (Thermo Fisher Scientific). Расчет необходимого количества фрагментов для проведения реакции лигирования производился с помощью онлайн калькулятора NEBioCalculator (NEB). Для успешного прохождения реакции было выбрано соотношение копий ДНК вставок относительно копий ДНК вектора 7 к 1, при этом на реакцию было взято 100 нг фрагмента. Лигазную смесь трансформировали в компетентные клетки NEB Stable (NEB), колонии скринировали, наращивали в ночной культуре, плазмидную ДНК из них выделяли и проводили секвенирование по методу Сенгера для подтверждения структуры.
--->
Перечень последовательностей
<110> ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ ТРАНСГЕН
(OBSCHESTVO S OGRANICHENNOI OTVETSTVENNOSTYU TRANSGEN)
<120> Генетическая конструкция, содержащая последовательности химерных
направляющих РНК для делеции гена SMN1 человека в культурах клеток человека
<160> 4
<210> 1
<211> 24
<212> ДНК
<213> artifficial sequence
<220> олигонуклеотид
<223> SMN1_G1-Up
<400> 1 tgc tgt gta cag tgc agt atg cct 24 н.
<210> 2
<211> 24
<212> ДНК
<213> artifficial sequence
<220> олигонуклеотид
<223> SMN1_G1-Down
<400> 1 aaa cag gca tac tgc act gta cac 24 н.
<210> 3
<211> 24
<212> ДНК
<213> artifficial sequence
<220> олигонуклеотид
<223> SMN1_G2-Up
<400> 1 cac cgg gtc tca tta tgt tgc cca 24 н.
<210> 4
<211> 24
<212> ДНК
<213> artifficial sequence
<220> олигонуклеотид
<223> SMN1_G2-Down
<400> 1 aaa ctg ggc aac ata atg aga ccc 24 н.
<---
Claims (4)
- Рекомбинантная кассета DUAL_GUIDE_SMN1, предназначенная для синтеза в клеточных линиях человека направляющих РНК, комплементарных фланкирующим последовательностям экзона 7 гена SMN1 человека для его нокаута и создания модельных клеточных линий для исследования методов терапии спинальной мышечной атрофии, имеет размер 743 пары нуклеотидов и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 1, два гена направляющих РНК (G1 и G2), имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3 длиной 24 нуклеотида каждая, включая сайты рестрикции, комплементарные фланкирующим последовательностям 7 экзона гена SMN1 человека, и состоит из следующих элементов:
- a) промотор U6, имеющий координаты с 11 по 251 пару нуклеотидов и с 378 по 618 пару нуклеотидов, для обеспечения транскрипции генов направляющих РНК с помощью клеточной ДНК-зависимой РНК полимеразы III;
- b) вариабельные фрагменты химерных направляющих РНК, имеющие координаты с 260 по 279 пару нуклеотидов для G2 варианта и с 627 по 646 пару нуклеотидов для G1 варианта, комплементарные целевым фланкирующим последовательностям экзона 7 гена SMN1 человека;
- c) конститутивная часть химерных направляющих РНК, имеющая координаты с 280 по 355 пару нуклеотидов для G2 варианта и с 647 по 722 пару нуклеотидов для G1 варианта, для обеспечения узнавания хнРНК эндонуклеазами системы CRISPR.
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2022116800A RU2022116800A (ru) | 2023-12-22 |
| RU2816897C2 true RU2816897C2 (ru) | 2024-04-08 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LI J.J. et al. Disruption of splicing-regulatory elements using CRISPR/Cas9 to rescue spinal muscular atrophy in human iPSCs and mice, Natl Sci Rev, 2019, vol. 7, N. 1, pp. 92-101. ПЯТИИЗБЯНЦЕВ Т.А. Использование технологии CRISPR/Cas9 для создания клеточных моделей генетических заболеваний, Молодая фармация - потенциал будущего: Сборник материалов XII всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием, Санкт-Петербург, 14 марта - 18 апреля 2022 года, сс. 554-558. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108690844B (zh) | HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对、质粒及HD细胞模型 | |
| US20230139474A1 (en) | RNA TARGETING OF MUTATIONS VIA SUPPRESSOR tRNAs AND DEAMINASES | |
| CN107130000B (zh) | 一种同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统及其应用 | |
| JP2023166400A5 (ru) | ||
| EP3752611A1 (en) | Antisense oligonucleotides for rna editing | |
| US20050256072A1 (en) | Dual functional oligonucleotides for use in repressing mutant gene expression | |
| JP2008526213A (ja) | 自己保護オリゴヌクレオチドを使用する、遺伝子発現を調節するための組成物および方法 | |
| CN107267516B (zh) | 双sgRNA介导的基因精确修饰方法及应用 | |
| US20230407333A1 (en) | Aav capsids and compositions containing same | |
| US20230002788A1 (en) | Aav3b variants with improved production yield and liver tropism | |
| Karagyaur et al. | Practical recommendations for improving efficiency and accuracy of the CRISPR/Cas9 genome editing system | |
| CN115768487A (zh) | 用于面肩肱型肌营养不良症的crispr抑制 | |
| EP3814510A1 (en) | Microhomology mediated repair of microduplication gene mutations | |
| RU2816897C2 (ru) | Генетическая конструкция, содержащая последовательности химерных направляющих РНК для делеции гена SMN1 человека в культурах клеток человека | |
| Jo et al. | In vivo application of base and prime editing to treat inherited retinal diseases | |
| CN114875033A (zh) | sgRNA、CRISPR/Cas试剂及其应用 | |
| US20220290132A1 (en) | Engineered CRISPR/Cas9 Systems for Simultaneous Long-term Regulation of Multiple Targets | |
| CN114426960A (zh) | 一种PDA@CRISPR/Cas9/sgHMGA2 NPs复合体、制备方法及应用 | |
| CN114144202A (zh) | 用于载体的多重shRNA | |
| CN110714008A (zh) | 核苷酸序列构建的crispr重组质粒靶向编辑iss序列的方法 | |
| McCullers | CRISPR-Cas9 Utility in Genome Engineering | |
| RU2660715C2 (ru) | Способ репликации человеческого митохондриального генома в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica | |
| WO2024015966A2 (en) | Recombinant aav having aav clade d and clade e capsids and compositions containing same | |
| TW202309066A (zh) | 衍生自豬的腺相關病毒衣殼及其用途 | |
| Wang et al. | Chromosome level genome assembly and transcriptome analysis of E11 cells infected by tilapia lake virus |