ES2578521B1 - Método de identificación de cepas de levaduras vínicas a partir de muestras de mosto - Google Patents

Abstract

Método de identificación de cepas de levaduras vínicas a partir de muestras de mosto.#El método se basa en un análisis genómico mediante la técnica de AFLPs (amplifiedfragmentlengthpolymorphism) utilizando dos pares de oligonucleótidos específicos sobre muestras de ADN. El método permite la detección, identificación y diferenciación entre cepas de levaduras vínicas. El ADN de partida se puede obtener de cultivos puros de levadura o bien de muestras complejas como el mosto de uva.

Description

5

Método de identificación de cepas de levaduras vínicas a partir de muestras de

mosto

10 15

SECTOR DE LA TÉCNICA La invención que se presenta describe un método para detectar e identificar a nivel de cepa, las levaduras vínicas presentes en muestras complejas de mosto. El método se basa en un análisis genómico mediante la técnica de AFLPs (amplified fragmentlengthpolymorphism) utilizando dos pares de oligonucleótidos específicos sobre muestras de AON total purificado de muestras de mosto.

ESTADO DE LA TÉCNICA

20 2S 30

La industria vitivinícola española es una de las más importantes del mundo por la cantidad y la calidad de los vinos que se producen. El proceso de elaboración del vino sigue a grandes rasgos las directrices tradicionales, si bien durante las últimas décadas se ha tendido a estandarizar los métodos de vinificación mediante el uso de levadura comercial que permite un buen control del proceso. Esto ha llevado a producir vinos de buena calidad pero muy similares entre sí. En la actualidad, son cada vez mas las bodegas que buscan métodos y/o variedades de uva que les permitan la producción de vinos con unas características y una tipicidad que les diferencien del resto. Para conseguir este objetivo las bodegas están desarrollando nuevas técnicas agronómicas, más

S 10

respetuosas con la tierra y la vid, y también se está innovando en el proceso de vinificación, utilizando las levaduras indígenas propias de cada zona y nuevas tecnologías que permiten realizar la fermentación en las condiciones deseadas. Durante la fermentación alcohólica, además de alcohol y anhídrido carbónico, las levaduras aportan al mosto gran cantidad de metabolitos que están directamente implicados en las características organolépticas del vino. Las levaduras del género Saccharomyces son las responsables de la fermentación de la mayor parte de los azúcares del mosto, pero diversos estudios han demostrado que la presencia de levaduras de tipo no Saccharomyces en las etapas iniciales de la fermentación, aportan características sensoriales diferenciales al vino y le confieren mayor complejidad.

• Aislamiento e identificación de levaduras indígenas

15

Para poder utilizar las levaduras indígenas, es necesario un trabajo prevío de aislamiento e identificación. El aislamiento se realiza mediante procedimientos microbíológicos clásicos utilizando medios de cultivo que permiten el crecimiento de levaduras. La identificación se hace utilizando técnicas

20 25

moleculares que en base a su secuencia de DNA y/o al uso de la reacción en cadena de la polimerasa, permite realizar análisis de cariotipo, análisis de polimorfismos de fragmenlos de restricción (RFLPs, AFLPs) de DNA cromosómico o DNA mitocondrial, análisis de regiones específicas de los genes de los RNA ribosómicos, de regiones microsatélites, elementos delta del transposón Tyy los sitios de procesamiento de intrones (ISS). Estas técnicas han sido muy útiles para la diferenciación entre especies de levaduras y algunas en concreto han permitido la diferenciación entre cepas de S. cerevisiae, levadura con el genoma secuenciado desde hace años.

Técnica de AFLP

30

La técnica de AFLP (del inglés AmplifiedFragmenlLengthPolymorphism, Vos el al. , 1995) está basada en la amplificación selectiva de los fragmentos de restricción mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Es una

técnica muy sensible para caracterizar el ácido desoxirribonucleico (ADN) cualquiera sea su origen y su complejidad, puede ser aplicado con ADN genómico total o con ADN complementario (perfiles de transcripción). Los AFLP permiten una exploración rápida de los polimorfismos del genoma

5 entero al generar un gran número de marcadores y cada uno de ellos da una huella identificadora de AON sumamente informativa. Estos marcadores son altamente reproducibles, no se necesita información previa de las secuencias ni hay que generar sondas de hibridación. La base molecular de los polimorfismos de AFLP generalmente se origina en los nucleótidos, se detectan

10 cambios de un solo nucleótido cuando: (1) se afectan los propios sitios de restricción; y (2) se afectan los nucleótidos adyacentes a los sitios de restricción, lo que hará que los cebadores hibriden erróneamente en el extremo 3'impidiendo la amplificación. La mayoría de los marcadores de AFLP son de tipo mono-alélico, lo que significa que sólo se podrá registrar un alelo porque el

15 complementario no se detecta. Todos los métodos de mejoramiento genético y propagación masiva, que de una forma u otra pueden introducir variaciones en el genoma de las plantas, así como los estudios de diversidad genética, requieren de herramientas moleculares capaces de detectar cambios genómicos.

20 • Construcción del mapa genético Una vez caracterizados los marcadores moleculares, la construcción del mapa genético implica las siguientes etapas: (i) detección de ligamento entre marcadores; (ii) ordenación de 105 marcadores ligados; y (iii) estimación de las distancias entre los mismos. En un mapa de moderada densidad, el volumen

25 de datos que debe manejarse en estos cálculos hace prohibitiva la

identificación de ligamento a partir del cómputo de recombiantes, por lo que

existe un gran número de programas para el análisis computacional de la

asociación entre marcadores y su posterior ordenación dentro de los grupos de ligamiento. 30 La mayoría de los programas que se utilizan en la construcción de mapas

genéticos usan los mismos datos estadísticos básicos, llamados análisis de dos puntos para estimar tasas de recombinación y testar ligamiento entre pares de marcadores. Sin embargo, los programas difieren en varios conceptos, como el tipo de población de muestreo que puede analizar (retrocruzamiento, F2, pedigríes clásicos, etc.); los algoritmos utilizados para estimar las frecuencias de recombinación multipunto, el método empleado para ordenar marcadores; y en algunas características informáticas (formato de datos, interface, características gráficas, etc.). A continuación se citan algunos de los programas de mapeo genético:

!!'~~~U".il'" :¡¡J&'-'~)ir..

-

~~¡;'j'

v,,, .:~;~ ,éj "

r" • •

~

'w •

¡¡p¿!")

Herramienta de análisis de dos puntos.

OU, 1986· cálculo de puntuación LOO, Programa disponible para computar numéricamente verosimilitudes en pedigríes grandes.

I I

CRI-f\íA.P

Desarrollado inicialmente para analizar

Golgar sistemas de marcadores co-dominantes en

1989· familias pequeñas se ha extendido pedigríes más generales y a sistemas de dominancia simple,

UNKAGE Paquete de herramientas que incluye análisis

Dausset multipunto. Cálculo de puntuación LOO

1990·

CFNEHlWTE

Herramienta que incluye análisis de ligamento

Kruglyak R

1999· unificado paramétrico y no paramétricos en un modo

Mp.PM/,KEH

Herramienta de análisis multipunto. Calculo

Lander de puntuación LOO. Puede analizar datos con

2000·

!

,

muchos loei pero en pedigríes pequeños y en cruces entre líneas controladas.

'" )

•

JGINMAP

Programa utilizado en mapeos de especies vegetales principalmente. Puede trabajar con todo tipo de poblaciones. La ordenación de marcadores se obtiene calculando frecuencias de recombinación por pares y las distancias de mapas se estiman por un procedimiento de mínimos cuadrados . Van Ooijen 2001'

.. Fuente: Desarrollo de un mapa genético con marcadores AFLP. Gloria Gonzalez Fortes, Universidad Santiago de Compostela, 2013

Sin embargo no existe un programa óptimo para todas las prestaciones.

EXPLICACiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención consiste en el desarrollo de un método rápido de

10 identificación de levaduras vínicas a partir de muestras de mosto, sin necesidad de aislamiento y cultivo previo de las levaduras. El método se basa en el uso de la técnica de AFLP y el desarrollo de una aplicación informatica que analiza de manera eficiente los datos obtenidos, de modo que permite identificar las especies de levadura presentes en la muestra y

15 diferenciar entre cepas. El proceso de purificación de DNA a partir de muestras de mosto es fundamental ya que se requiere DNA de alta pureza y libre de contaminantes que puedan interferir en las reacciones posteriores. Para ello, se toman muestras de mosto y mediante centrifugación se sedimentan todas las

20 levaduras presentes. A continuación se realizan una serie de lavados con solventes organicos yagua estéril para finalizar con un tratamiento con proteinasa K. De este modo se elimina n los taninos y otros compuestos que pueden interferir en la purificación posterior de los ácidos nucleicos. La purificación del AON total de la muestra se realiza con el kit "Master PureYeast DNA Purification"de Eppicentre, siguiendo las recomendaciones del fabricante. La concentración de ADN en la muestra se determina utilizando un

espectrofotómetro Nanodrop®.

Para el ensayo de AFLP, se parte de 50ng de ADN total purificado de la

muestra de mosto. El ADN se digiere con las enzimas de restricción EcoRI y Msel y a continuación se ligan unos oligonucleótidos adaptadores específicos a los fragmentos de ADN generados tras la digestión. La mezcla de ligación se utiliza a continuación como molde en una primera reacción de PCR para amplificar los fragmentos de AON con extremos EcoRI -Msel. En esta reacción se utilizan como cebadores oligonucleótidos de secuencia com plementaria a los adaptadores anteriormente ligados a los fragmentos de ADN (Msel-A 1, Msel-A2, EcoRIL-1p, EcoRIL-2p). El ADN obtenido de esta reacción se utiliza en una segunda reacción de PCR, la amplificación selectiva en la que se utilizan como cebadores oligonucleótidos de secuencia igual a los de la primera PCR pero a los que se han adicionado dos nucleótidos en su extremo 3', de manera que en esta segunda reacción solamente se van a amplificar subpoblaciones del conjunto del ADN de la mezcla. En nuestro caso, para la diferenciación entre especies y cepas de levaduras vínicas, hemos seleccionado dos pares de oligonucleótidos, denominados S (EcoRI-AC-FAM + Msel-T) y J (EcoRI-TA-HEX + Msel-CT), que conjuntamente tienen un alto poder de discriminación. Con estos pares de cebadores los fragmentos de AON que se amplifican tienen un tamaño de 50 a 250 pb Y además quedan marcados con los fluoróforos FAM y HEX. Estos fragmentos así generados se resuelven mediante electrofóresis capilar obteniendo de este modo un electroferograma que permite discriminar entre fragmentos que difieran únicamente en dos o tres pares de bases. Los electroferogramas que se obtienen de las muestras de mosto son complejos y su análisis se hace utilizando una aplicación informática que se ha desarrollado con este fin. Para ello, previamente se ha creado una base de datos con los perfiles AFLP de más de 500 aislados diferentes de levaduras vínicas de las especies Hanseniasporauvarum, Kluyveromycesthermotholerans, Torulasporadelbrueckü, Metchnikowiapulcherrima, Pichiaanomala, Saccharomycescerevisiae y Saccharomycesuvarum. El programa lo que hace es comparar los alelos del electroferograma con la información presente en la base de datos que se ha generado previamente y que incluye los perfiles de alelos específicos de especie y/o cepa de levadura.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Descripción del Programa diseñado para el análisis de resultados AFLP y búsqueda de similitudes entre muestras problema desconocidas y los conjuntos de alelos AFLP especie-específicos o cepa-específicos.

A. Nombre grupo de alelos AFLP especie-específicos o cepa-específicos;

B. Tamaño de los alelos especie-específicos cepa-específicos;

C. Presencia o ausencia del alelo;

D. Nombre de la muestra problema;

E. Conjunto alelas de la muestra problema;

F. Abundancia del alelo;

G. Porcentaje similitud;

H. Tabla de control: Hoja del libro en la que se lleva a cabo la comparación de los fragmentos y se determina la similitud;

l.

Perfiles: Hoja del libro en la que aparecen todos los perfiles que se van a comparar hasta un lolal de 50;

J.

Muestra: Hoja del libro en la que aparecen todos las muestras que se van a comparar hasta un total de 50;

K.

Porcentajes de similitud.

MODO DE REALIZACiÓN DE LA INVENCiÓN

1. Oligos Oligos Adapladores: O 5 ~Msel : Msel-A1: GACGATGAGTCCTGAG Msel-A2: TACTCAGGACTCAT

~EcoRI: EcoRIL-1p: CTCGTAGACTGCGTACC EcoRIL-2p: AATTGGTACGCAGTCTAC

Par de Oligos Preselectivos:

10 ~ MselO: GATGAGTCCTGAGTAA ~ EcoRIL-1p: CTCGTAGACTGCGTACC

Pares de Oligos Selectivos:

Fluoróforo

Par de Oligos EcoRI Msel

M

GACTGCGTACCAATTCTA GATGAGTCCTGAGTAACG

Marcado con

N GACTGCGTACCAATTCTA GATGAGTCCTGAGTAACT

HEX

J GACTGCGTACCAATTCTA GATGAGTCCTGAGTAACA

Q

GACTGCGTACCAATTCTA GATGAGTCCTGAGTAACC

H

GACTGCGTACCAATTCAC GATGAGTCCTGAGTAACC

Marcado con FAM

G GACTGCGTACCAATTCAC GATGAGTCCTGAGTAACA

S

GACTGCGTACCAATTCAC GATGAGTCCTGAGTAAT

11. Tratamiento del mosto para la posterior extracción de DNA

genómico total:

1.

Homogeneizar la muestra de mosto, coger 15-25 mi y ponerlos en un tubo de 50 mI.

2.

Añadir un volumen de fenol: cloroformo: alcohol isoamilico (25:24:1) al tubo con el mosto y mezclar bien utilizando el vortex. Dejar reposar 1 minuto.

3.

Recoger la fase acuosa y pasa rla a otro tubo de 50 mI.

4.

Centrifugar a 3500 rpm durante 8 minutos.

5.

Descartar el sobrenadan te y añadir 2 mi de agua destilada para lavar el precipitado.

6.

Centrifugar a 3500 rpm durante 8 minutos.

7.

Descartar el sobrenadante y re-suspender en 5 mi de agua destilada. Repartir en volúmenes de 1 mi en tubos eppendorf de 1.5 mI.

8.

Centrifugar a 13.000 rpm durante 2 minutos y descartar el sobrenadante por completo.

9.

Re-suspender en 200 ~L de buffer Tris-CI 50mM, pH 7.4, EDTA 20nM, SOS 2%, 4,5 mg/ml Proteinasa K. Incubar 12 horas a 37 oC.

10.

Realizar el proceso de extracción del ADN genómico utilizando un kit

o cualquier protocolo.

111. Tratamiento informático de los electroferogramas de AFLPs. GeneMapper®: En el software de ApplyBiosystem® (GeneMapper®) se cargan

los archivos (de extensión ".fsa") que se obtienen de cada una de las muestras

a través de la electroforesis capilar. Se analizan las muestras clasificándolas primero por especies (previamente identificadas utilizando diferentes técnicas de biologia molecular) y comprobando similitudes y diferencias entre los electroferogramas de cada muestra. Después se descarga el archivo del

GeneMapper® en el que te viene la información de cada muestra (fragmentos,

abundancia y tamaño) y se chequean y comparan uno a uno. De esta forma , se consiguen identificar los fragmentos, o picos, que se repiten y entre que

muestras, pudiendo determinarse cuáles son comunes de la especie y cuáles

de cepa. Todos estos datos se distribuyen en tablas y una vez se tiene toda la información de cada una de las especies se comparan los fragmentos entre diferentes especies pudiendo determinarse que fragmentos son o no únicos de especies. Determinamos así perfiles tanto únicos de especie como únicos de

cepa, pudiendo determinar a qué especie y/o cepa pertenece una muestra

desconocida. Para ello, lo que hacemos, es introducir, utilizando las propias

herramientas del GenMapper®, esos perfiles específicos de especies y cepas y

lanzar contra ellos las muestras desconocidas.

-

7 Excel®: Una vez determinados los perfiles únicos de especies y

cepas, puede utilizarse una tabla dinámica de Excel que hemos diseñado. En ella tienes una columna fija con el perfil especifico y otras columnas en las que vas introduciendo los valores de cada muestra volcados desde el

GeneMapper® (altura y tamaño). La hoja lo que hace es buscar el perfil

específico en las muestras introducidas, dándonos un porcentaje de similitud en base a los criterios que le introducimos nosotros. A partir de hojas dinámicas de Excel se ha desarrollado un programa basado en macros para el análisis de los datos que se obtienen de los AFLP resueltos por electroforesis capilar. En bloques de tres columnas se podrán incluir en la hoja "Perfiles" (Fig. 11 ) hasta un total de 50 grupos de alelos AFLP especie-especifico o cepaespecifico en función de los que se necesiten parar llevar a cabo un análisis. En una de las columnas se anota el nombre de la especie y el par de oligonucleótidos con el que se generó el conjunto de alelas AFLP, en otra queda registrado el tamaño de cada uno de los alelas AFLP de cada conjunto y en una tercera columna se indicará la presencia o ausencia de cada alelo con un 1 o un O, lo que nos permitirá calcular el porcentaje de similitud entre la muestra problema y el conjunto de alelos (Fig. 1A, 1 By 1C). Por otro lado, de forma similar, las muestras problema también se incluyen en bloques de tres

columnas en la hoja "Muestra" (Fig. 1J), siendo también el máximo de muestras

a

analizar 50. En este caso en una columna aparecerá el nombre de la

muestra , en la siguiente columna el conjunto de alelas que componen el perfil

AFLP

obtenido y una tercera columna en la que aparece reflejada las

S

abundancias de cada alelo y que nos permite determinar la validez de los

mismos (Figura 10, 1 E Y 1 F).

El programa compara la columna de alelas AFLP especie-específicos o cepa

específicos con la columna de alelas AFLP de la muestra problema de forma

automática, llevando a cabo la comparación de todos los conjuntos de alelos

10

de la hoja "Perfiles" frente a todos los grupos de alelas de la hoja "Muestra". El

resultado que devuelve el programa es un porcentaje de similitud (Fig. 1 G), que

se almacena en la hoja "Porcentaje de similitud" (Fig. 1 K) Y que muestra que

porcentaje del conjunto de alelas especie-específicos o cepa-específicos

son

comunes

a los alelas de una muestra problema (Fig. 1 L). De este modo se

15

puede determinar la presencia o ausencia de una especie o cepa concreta en

la muestra problema analizada. Todo el proceso comparativo se lleva a cabo

en

la hoja "Tabla de control" (Fig. 1 H), que es en la que el programa lleva a

cabo el proceso comparativo.

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Método para la detección e identificación de especies y cepas de levaduras vinicas presentes en muestras de mosto de uva, antes o durante la fermentación alcohólica, sin necesidad de cultivo microbiológico.

   2,-Método basado en la reivindicación 1 basado en la identificación de ADN

   total purificado de las muestras de mosto, que permite detectar las diferentes levaduras presentes en la muestra de un modo rápido.
2. 3.-Método basado en la reivindicación 1 estableciendo un procedimiento de

   recogida de las levaduras totales del mosto que permite la posterior purificación de los ácidos nucleicos con un nivel de pureza que no intelfiere en las posteriores reacciones dirigidas a la obtención de los AFLP.
3. 4.-Procedimiento de obtención de AFLPs basado en dos pares de oligonucleótidos específicos que permiten discriminar entre las diferentes especies de levaduras vinicas de tipo Saccharomycesy no Saccharomyces.
4. 5.-Procedimiento basado en la reivindicación 4 para especies de levaduras

   vínicas no Saccharomyces.
5. 6.-Procedimiento de tratamiento de datos obtenidos tras la resolución mediante electroforesis capilar de los fragmentos AFLP amplificados, utilizando una aplicación informática que detecta perfiles específicos de especie o cepa de levadura en el conjunto de alelas AFLP que se obtienen de las muestras complejas de mosto.