ES2574236T3 - Anticuerpos específicos para cadherina-17 - Google Patents

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ES2574236T3 ES10714548.4T ES10714548T ES2574236T3 ES 2574236 T3 ES2574236 T3 ES 2574236T3 ES 10714548 T ES10714548 T ES 10714548T ES 2574236 T3 ES2574236 T3 ES 2574236T3
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Abstract

Un anticuerpo anti-Cadherina-17 aislado que comprende: una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 4; una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 8; una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 17; una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 24; una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 30; y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 34, opcionalmente en donde cualquiera de las SEQ ID NOs: 4, 8, 17, 24, 30 o 34 comprende independientemente una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones conservadoras de los aminoácidos, en donde el anticuerpo es capaz de ser internalizado en una célula que expresa Cadherina-17.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos espedficos para cadherina-17 Campo de la invencion
La presente invencion se relaciona generalmente con los campos de la inmunologfa y la biolog^a molecular. De manera mas espedfica, se proporcionan en la presente anticuerpos, y otras protemas terapeuticas dirigidas contra la molecula de adhesion celular Cadherina-17, acidos nucleicos que codifican tales anticuerpos y protemas terapeuticas, metodos para preparar los anticuerpos monoclonales inventivos y otras protemas terapeuticas, y metodos para el tratamiento de enfermedades, tales como canceres mediados por la expresion/actividad de Cadherina-17 y/o asociados con la expresion/actividad anormal de los ligandos de la misma.
Antecedentes de la invencion
Las cadherinas son moleculas de adhesion celular dependientes de calcio. De preferencia interaction con sf mismas de una manera homofflica para conectar celulas; las cadherinas por lo tanto pueden contribuir a la clasificacion de los tipos heterogeneos de celulas. La molecula de cadherina Cadherina-17 tambien es conocida como cadherina de tngado-intestino o transportador HPT-1 asociado a peptido. La Cadherina-17 puede tener una funcion en la organizacion morfologica del tngado e intestino. La estructura de la Cadherina-17 se caracteriza por tener un dominio extracelular con 7 dominios de cadherina, un solo dominio de transmembrana hidrofobico y un extremo corto citoplasmico en el C terminal. Solo se conoce una isoforma de Cadherina-17, No de Acceso de Genebank NM_004063. La Cadherina-17 tiene el numero de acceso Q12864 en las bases de datos Swiss-PROT y trEMBL (mantenidas por el Instituto Sueco de Bioinformatica (SIB) y el Instituto de Bioinformatica Europeo (EBI) disponibles en
www.expasy.com). El ortologo de Cadherina-17 de raton (Q9R100) muestra 76% de identidad con la Cadherina- 17 humana.
De acuerdo con SWISS-PROT, la Cadherina-17 se expresa en el tracto gastrointestinal y el ducto pancreatico. No se detecta en el rinon, pulmon, tngado, cerebro, glandula adrenal o la piel. La expresion de la Cadherina-17 ha sido reportada en el cancer gastrico (vease, por ejemplo, Ito et al., Virchows Arch. 2005 Oct; 447(4):717-22; Su et al., Mod Pathol. 2008 Nov;21(11):1379-86; Ko et al., Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jun 25;319(2):562-8; y Dong et al., Dig Dis Sci. 2007 Feb;52(2):536-42), cancer pancreatico y cancer colorrectal (Su et al., Mod Pathol. 2008 Nov;21(11):1379-86) y carcinoma hepatocelular (Wong et al., Biochem Biophys Res Commun. 2003 Nov 21;311(3):618-24). La Solicitud de Patente Internacional W02008/026008 describe a la Cadherina-17 como un marcador para el cancer colorrectal y como una diana biologica para anticuerpos terapeuticos y otros agentes farmaceuticos.
Takamura et al, (2003) Cancer Sci., Vol. 94, p. 425-430, describe la expresion de cadherina tngado-intestino y su posible interaccion con galectina-3 en adenocarcinoma ductal del pancreas. Los anticuerpos monoclonales contra cadherina-17 se han descrito previamente (vease el catalogo de R&D Systems 22 de Septiembre de 2004 [XP002591715]).
Resumen de la invencion
La presente invencion proporciona anticuerpos dirigidos contra la Cadherina-17, acidos nucleicos que codifican tales anticuerpos y protemas terapeuticas, metodos para preparar anticuerpos monoclonales anti- Cadherina-17 y otras protemas terapeuticas, y metodos para el tratamiento de enfermedades, tales como trastornos mediados por Cadherina-17, por ejemplo, canceres humanos, incluyendo cancer colorrectal.
Asf, la presente invencion proporciona anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales murinos, quimericos, humanizados y completamente humanos, que se unen a la Cadherina-17 y que exhiben una o mas propiedades funcionales deseables. Tales propiedades incluyen, por ejemplo, union espedfica con alta afinidad a la Cadherina-17 humana. Tambien se proporcionan metodos para tratar una variedad de enfermedades mediadas por la Cadherina-17 utilizando los anticuerpos, protemas y composiciones de la presente invencion.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invencion, se proporciona un anticuerpo anti-cadherina-17 aislado
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que comprende:

una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 4;

una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 8;

una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 17;

una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 24;

una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 30; y

una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 34,
opcionalmente en donde cualquiera de las SEQ ID NOs: 4, 8, 17, 24, 30 o 34 comprende independientemente de
uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones conservadoras de los aminoacidos, en donde el anticuerpo es capaz de ser internalizado en una celula que expresa Cadherina-17.
La presente divulgacion describe un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion que se une al antigeno del mismo, un fragmento de anticuerpo, o un mimetico de anticuerpo que se une a un epttopo de la Cadherina-17 humana, reconocido por un anticuerpo, que comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en las SEQ ID NO: seleccionada del grupo que consiste de 38, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 y 46 y una region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos expuesta en las SEQ ID NO: seleccionada del grupo que consiste de 49, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 y 58. En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado es un anticuerpo de longitud completa de un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de la presente invencion se selecciona del grupo que consiste de: un anticuerpo completo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de una sola cadena, un inmunoconjugado, un anticuerpo defucosilado, y un anticuerpo biespedfico. El fragmento de anticuerpo puede seleccionarse del grupo que consiste de: un UniCuerpo (UniBody), un anticuerpo de dominio y un Nanocuerpo (Nanobody). En algunas realizaciones, los inmunoconjugados de la invencion comprenden un agente terapeutico. En otro aspecto de la invencion, el agente terapeutico es una citotoxina o un isotopo radioactivo.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de la presente invencion se selecciona del grupo que consiste de: un Afficuerpo (Affybody), una DARPin, una Anticalina, un Avfmero, un Versacuerpo (Versabody) y una Duocalina.
En las realizaciones alternas, las composiciones de la presente invencion comprenden un anticuerpo aislado o una porcion que se une al antfgeno y un portador farmaceuticamente aceptable.
En otros aspectos, el anticuerpo de la presente invencion es una composicion que comprende el anticuerpo aislado o una porcion que se une al antfgeno del mismo, de acuerdo con la invencion y un portador farmaceuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la invencion comprende una molecula de acido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o ligera del anticuerpo aislado o la porcion que se une al antfgeno, que se une a un epttopo de la Cadherina- 17 humana. Otros aspectos de la invencion comprenden vectores de expresion que comprenden tales moleculas de acido nucleico, y celulas hospederas que comprenden tales vectores de expresion.
En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un metodo para preparar un anticuerpo anti-Cadherina- 17, el metodo comprende los pasos de: obtener una celula hospedera que contiene una o mas moleculas de acido nucleico que codifican el anticuerpo de la invencion; cultivar la celula hospedera en un cultivo de la celula hospedera; proporcionar las condiciones de cultivo de la celula hospedera, en donde se expresan una o mas moleculas de acido nucleico; y recuperar el anticuerpo de la celula hospedera o del cultivo de la celula hospedera.
Se describen aqm metodos para tratar o prevenir una enfermedad asociada con las celulas objetivo que expresan la
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Cadherina-17, el metodo comprende el paso de administrar a un sujeto un anticuerpo anti-Cadherina-17, o una porcion que se une al antfgeno del mismo, en una cantidad efectiva para tratar o prevenir la enfermedad. En algunos ejemplos, la enfermedad tratada o prevenida por los anticuerpos o la porcion que se une al antfgeno de los mismos es cancer humano. En algunos ejemplos, la enfermedad tratada o prevenida por los anticuerpos es cancer colorrectal.
En otras realizaciones, la invencion esta dirigida a un anticuerpo anti-Cadherina-17, o una porcion que se une al antigeno del mismo, para utilizarse en el tratamiento o prevencion de un cancer asociado con las celulas objetivo que expresan a Cadherina-17. En algunos ejemplos, la enfermedad tratada o prevenida por el anticuerpo o porcion que se une al antigeno del mismo, es un cancer humano. En algunos ejemplos, la enfermedad tratada o prevenida por los anticuerpos de la presente invencion es cancer colorrectal.
En otras realizaciones, la invencion esta dirigida al uso de un anticuerpo anti-cadherina-17, o porcion que se une al antigeno del mismo, para la fabricacion de un medicamento para utilizarse en el tratamiento o prevencion de un cancer asociado con celulas objetivo que expresan a Cadherina-17. En algunos aspectos, la enfermedad tratada o prevenida por el medicamento de la invencion, es un cancer humano. En algunas realizaciones, la enfermedad tratada o prevenida por el medicamento de la invencion es cancer colorrectal.
Tambien se describe un anticuerpo monoclonal aislado o una porcion que se une al antfgeno del mismo, un fragmento de anticuerpo, o un mimetico de anticuerpo que se une a un epttopo en la Cadherina-17 humana, reconocido por un anticuerpo que comprende una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera, seleccionadas del grupo que consiste de la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 35 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 47; la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 36 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 48; la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 37 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 48; la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 38 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 49; la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 39 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 50; la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 40 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 51; la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 40 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 54; la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 40 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 55; la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 41 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 52; la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 42 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 53; la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 43 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 56; la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 44 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 55; la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 45 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 57; la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 46 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 58. En ejemplos adicionales, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de: un anticuerpo completo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de una sola cadena, un inmunoconjugado, un anticuerpo defucosilado, y un anticuerpo biespedfico. En ejemplos adicionales, el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de: un UniCuerpo (UniBody), un anticuerpo de dominio, y un Nanocuerpo (Nanobody). En algunos ejemplos, el mimetico de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de: un Afficuerpo (Affybody), una DARPin, una Anticalina, un Avfmero, un Versacuerpo (Versabody) y una Duocalina. En ejemplos adicionales, la composicion comprende el anticuerpo aislado o porcion que se une al antfgeno del mismo y un portador farmaceuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la presente invencion es una molecula de acido nucleico aislada, que codifica la cadena
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pesada o ligera del anticuerpo aislado o la porcion que se une al antigeno del mismo del anticuerpo de la invencion, y en los aspectos adicionales, puede incluir un vector de expresion que comprende tales acidos nucleicos, y celulas hospederas que comprenden tales vectores de expresion.
Otra realizacion de la presente invencion es un hibridoma que expresa el anticuerpo o porcion que se une al antigeno del mismo de cualquiera de los anticuerpos de la invencion.
Otros aspectos de la invencion estan dirigidos a metodos para hacer los anticuerpos de la invencion, que comprenden los pasos de:
inmunizar a un animal transgenico con un peptido de Cadherina-17; recuperar el ARNm de los linfocitos B de dicho animal; convertir dicho ARNm a ADNc;
expresar dicho ADNc en fagos de manera que los anticuerpos anti-Cadherina-17 codificados por dicho ADNc se presenten en la superficie de dichos fagos;
seleccionar fagos que presenten anticuerpos anti-Cadherina-17;
recuperar las moleculas de acido nucleico de dichos fagos seleccionados que codifican dichas inmunoglobulinas de Cadherina-17;
expresar dichas moleculas de acido nucleico recuperado en una celula hospedera; y recuperar anticuerpos de dicha celula hospedera que se une a la Cadherina-17.
Tambien se describe aqm un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion que se une al antfgeno del mismo, se une a un epttopo en el polipeptido de Cadherina-17, que tiene una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NOs: 136 o 137 reconocidas por un anticuerpo que comprende una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en las SEQ ID NO: seleccionada del grupo que consiste de 38, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, o 46, y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en las SEQ ID NO: seleccionada del grupo que consiste de 49, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, o 58.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 59) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 35) de la region variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal PTA001_A1. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 5) y CDR3 (SEQ ID NO: 14), estan delineadas.
La Figura 2 muestra la secuencia nucleotfdica (SEQ ID NO: 60) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 36) de la region variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal PTA001_A2. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 2), CDR2 (SEQ ID NO: 6) y CDR3 (SEQ ID NO: 15) estan delineadas.
La Figura 3 muestra la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 61) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 37) de la region variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal PTA001_A3. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 7) y CDR3 (SEQ ID NO: 16) estan delineadas.
La Figura 4 muestra la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 62) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 38) de la region variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal PTA001_A4. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 4), CDR2 (SEQ ID NO: 8) y CDR3 (SEQ ID NO: 17) estan delineadas.
La Figura 5 muestra la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 63) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 39) de la region variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal PTA001_A5. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 7) y CDR3 (SEQ ID NO: 18) estan delineadas.
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La Figura 6 muestra la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 64) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 40) de la region variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal PTA001_A6, PTA001_A9 y PTA001_A10. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 7) y CDR3 (SEQ ID NO: 16) estan delineadas.
La Figura 7 muestra la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 65) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 41) de la region variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal PTA001_A7. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 9) y CDR3 (SEQ ID NO: 19) estan delineadas.
La Figura 8 muestra la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 66) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 42) de la region variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal PTA001_A8. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 7) y CDR3 (SEQ ID NO: 16) estan delineadas.
La Figura 9 muestra la secuencia nucleotfdica (SEQ ID NO: 67) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 43) de la region variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal PTA001_A11. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 10) y CDR3 (SEQ ID NO: 20) estan delineadas.
La Figura 10 muestra la secuencia nucleotfdica (SEQ ID NO: 68) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 44) de la region variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal PTA001_A12. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 11) y CDR3 (SEQ ID NO: 21) estan delineadas.
La Figura 11 muestra la secuencia nucleotfdica (SEQ ID NO: 69) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 45) de la region variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal PTA001_A13. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 12) y CDR3 (SEQ ID NO: 18) estan delineadas.
La Figura 12 muestra la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 70) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 46) de la region variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal PTA001_A14. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 2), CDR2 (SEQ ID NO: 13) y CDR3 (SEQ ID NO: 15) estan delineadas.
La Figura 13 muestra la secuencia nucleotfdica (SEQ ID NO: 71) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 47) de la region variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal PTA001_A1. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 22), CDR2 (SEQ ID NO: 28) y CDR3 (SEQ ID NO: 32) estan delineadas.
La Figura 14 muestra la secuencia nucleotfdica (SEQ ID NO: 72) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 48) de la region variable de cadena ligera de los anticuerpos monoclonales PTA001_A2 y PTA001_A3. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 23), CDR2 (SEQ ID NO: 29) y CDR3 (SEQ ID NO: 33) estan delineadas.
La Figura 15 muestra la secuencia nucleotfdica (SEQ ID NO: 73) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 49) de la region variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal PTA001_A4. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 24), CDR2 (SEQ ID NO: 30) y CDR3 (SEQ ID NO: 34) estan delineadas.
La Figura 16 muestra la secuencia nucleotfdica (SEQ ID NO: 74) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 50) de la region variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal PTA001_A5. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 25), CDR2 (SEQ ID NO: 31) y CDR3 (SEQ ID NO: 33) estan delineadas.
La Figura 17 muestra la secuencia nucleotfdica (SEQ ID NO: 75) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 51) de la region variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal PTA001_A6. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 23), CDR2 (SEQ ID NO: 29) y CDR3 (SEQ ID NO: 33) estan delineadas.
La Figura 18 muestra la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 76) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 52) de la region variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal PTA001_A7. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 26), CDR2 (SEQ ID NO: 29) y CDR3 (SEQ ID NO: 33) estan delineadas.
La Figura 19 muestra la secuencia nucleotfdica (SEQ ID NO: 77) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 53) de la region variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal PTA001_A8. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 25), CDR2 (SEQ ID NO: 31) y CDR3 (SEQ ID NO: 33) estan delineadas.
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La Figura 20 muestra la secuencia nucleotfdica (SEQ ID NO: 78) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 54) de la region variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal PTA001_A9. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 23), CDR2 (SEQ ID NO: 29) y CDR3 (SEQ ID NO: 33) estan delineadas.
La Figura 21 muestra la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 79 y 81) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 55) de la region variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal PTA001_A10 y PTA001_A12. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 25), CDR2 (SEQ ID NO: 29) y CDR3 (SEQ ID NO: 33) estan delineadas.
La Figura 22 muestra la secuencia nucleotfdica (SEQ ID NO: 80) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 56) de la region variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal PTA001_A11. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 27), CDR2 (SEQ ID NO: 29) y CDR3 (SEQ ID NO: 33) estan delineadas.
La Figura 23 muestra la secuencia nucleotfdica (SEQ ID NO: 82) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 57) de la region variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal PTA001_A13. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 25), CDR2 (SEQ ID NO: 31) y CDR3 (SEQ ID NO: 33) estan delineadas.
La Figura 24 muestra la secuencia nucleotfdica (SEQ ID NO: 83) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 58) de la region variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal PTA001_A14. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 23), CDR2 (SEQ ID NO: 29) y CDR3 (SEQ ID NO: 33) estan delineadas.
La Figura 25 muestra la alineacion de las secuencias de nucleotidos de la region CDR1 de cadena pesada de PTA001_A1 (SEQ ID NO:84) con los nucleotidos 240-269 de la secuencia de nucleotidos Vh 7-39 de la lmea germinal de raton (SEQ ID NO: 125) y las alineaciones de las secuencias de nucleotidos de las regiones CDR1 de cadena pesada de PTA001_A2 y PTA001_A14 (SEQ ID NO: 85); PTA001_A3, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13, (SEQ ID NO:86); y PTA001_A4 (SEQ ID NO:87) con los nucleotidos 67-96 de la secuencia de nucleotidos H17 del gen II de la lmea germinal Vh de raton (SEQ ID NO: 126).
La Figura 26 muestra las alineaciones de las secuencias de nucleotidos de las regiones CDR2 de cadena pesada de PTA001_A2 (SEQ ID NO:89); PTA001_A3, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A8, PTA001_A9 y PTA001_A10 (SEQ ID NO:90); PTA001_A4 (SEQ ID NO:91); PTA001_A7 (SEQ ID NO:92); PTA001_A11 (SEQ ID NO:93); PTA001_A12 (SEQ ID NO:94); PTA001_A13 (SEQ ID NO:95) y PTA001_A14 (SEQ ID NO:96) con los nucleotidos 1096-1146 de la secuencia de nucleotidos VH105 de la region II de la lmea germinal Vh de raton (SEQ ID NO: 127).
La Figura 27 muestra la alineacion de la secuencia de nucleotidos de la region CDR1 de cadena ligera de PTA001_A1 (SEQ ID NO:105); con los nucleotidos 1738-1785 de la secuencia de nucleotidos 1-110 de la lmea germinal Vk de raton (SEQ ID NO:128), la alineacion de la secuencia de nucleotidos de la region CDR1 de cadena ligera de PTA001_A4 (SEQ ID NO:107) con los nucleotidos 510-560 de la secuencia de nucleotidos 8-30 de la lmea germinal Vk de raton (SEQ ID NO:130), y las alineaciones de las secuencias de nucleotidos de las regiones CDR1 de cadena ligera de PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A6, PTA001_A9 y PTA001_A14 (SEQ ID NO:106); PTA001_A5 y PTA001_A13 (SEQ ID NO:108); PTA001_A7 (SEQ ID NO:109); PTA001_A8 (SEQ ID NO:110); PTA001_A10 (SEQ ID NO:111); PTA001_A11 (SEQ ID NO:112); y PTA001_A12 (SEQ ID NO:113) con los nucleotidos 1807-1854 de la secuencia de nucleotidos 24-140 de la lmea germinal Vk de raton (SEQ ID NO: 133).
La Figura 28 muestra la alineacion de la secuencia de nucleotidos de la region CDR2 de cadena ligera de PTA001_A4 (SEQ ID NO:116); con los nucleotidos 606-626 de la secuencia de nucleotidos 8-30 de la lmea germinal Vk de raton (SEQ ID NO:131), y las alineaciones de las secuencias de nucleotidos de las regiones CDR2 de cadena ligera de PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A6, PTA001_A9 y PTA001_A14 (SEQ ID NO:115); PTA001_A5 y PTA001_A13 (SEQ ID NO:117); PTA001_A7, PTA001_A10, PTA001_A11 y PTA001_A12 (SEQ ID NO:118); y PTA001_A8 (SEQ ID NO:119) con los nucleotidos 1900-1920 de la secuencia de nucleotidos 24-140 de la lmea germinal Vk de raton (SEQ ID NO: 134).
La Figura 29 muestra la alineacion de la secuencia de nucleotidos de la region CDR3 de cadena ligera de PTA001_A1 (SEQ ID NO:120); con los nucleotidos 1948-1971 de la secuencia de nucleotidos 1-110 de la lmea germinal Vk de raton (SEQ ID NO:129), la alineacion de la secuencia de nucleotidos de la region CDR3 de cadena ligera de PTA001_A4 (SEQ ID NO:122) con los nucleotidos 723-749 de la secuencia de nucleotidos 8-30 de la lmea
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germinal Vk de raton (SEQ ID NO:132), y las alineaciones de las secuencias de nucleotidos de las regiones CDR3 de cadena ligera de PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A6, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12 y PTA001_A14 (SEQ ID NO:121); PTA001_A5, PTA001_A8 y PTA001_A13 (SEQ ID NO:123); y PTA001_A7 (SEQ ID NO:124); con los nucleotidos 2017-2043 de la secuencia de nucleotidos 24-140 de la lmea germinal Vk de raton (SEQ ID NO: 135).
La Figura 30 muestra el analisis de transferencia Western de la Cadherina-17 usando el anticuerpo monoclonal PTA001_A4.
La Figura 31 muestra los resultados del analisis FACS en PTA001_A4 y celulas LoVo.
La Figura 32 muestra los resultados del analisis FACS en PTA001_A4 en LoVo y celulas LS174T.
La Figura 33A muestra la union superficial del complejo PTA001_A4/conjugado de FITC de anticuerpo secundario a celulas LoVo despues de 60 minutos de incubacion.
La Figura 33B muestra la internalizacion del complejo PTA001_A4/conjugado de FITC de anticuerpo secundario despues de 120 minutos de incubacion con celulas LoVo.
La Figura 34A muestra los resultados de la internalizacion de PTA001_A4 por ensayo MabZAP en celulas LoVo de cancer de colon.
La Figura 34B muestra los resultados de la internalizacion de PTA001_A4 por ensayo MabZAP en celulas LoVo de cancer de colon.
La Figura 34C muestra los resultados de la internalizacion de PTA001_A4 por ensayo MabZAP en celulas LS174T de cancer de colon.
La Figura 34D muestra los resultados de la internalizacion de PTA001_A4 por ensayo MabZAP en celulas LS174T de cancer de colon.
La Figura 35A muestra los resultados de la internalizacion de PTA001_A4 por ensayo MabZAP en celulas LoVo de cancer de colon.
La Figura 35B muestra los resultados de la internalizacion de PTA001_A4 por ensayo MabZAP en celulas LS174T de cancer de colon.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se relaciona con anticuerpos aislados, incluyendo, pero no limitado a anticuerpos monoclonales, por ejemplo, que se unen de manera espedfica a la Cadherina-17 con alta afinidad. Los anticuerpos de la invencion comprenden las caractensticas estructurales particulares tales como regiones CDR, que comprenden secuencias de aminoacidos particulares. La invencion proporciona anticuerpos aislados, anticuerpos defucosilados, inmunoconjugados, moleculas biespedficas, afficuerpos (affybodies), anticuerpos de dominio, nanocuerpos (nanobodies) y unicuerpos (unibodies), metodos para hacer tales moleculas, y composiciones farmaceuticas que comprenden las moleculas y un portador farmaceutico. La invencion tambien se relaciona con metodos para utilizar las moleculas, tales como para detectar la Cadherina-17, asf como para tratar enfermedades asociadas con la expresion de Cadherina-17, tal como Cadherina-17 expresada en tumores, incluyendo aquellos tumores de cancer colorrectal.
Con el fin de que la presente invencion pueda entenderse mas facilmente, ciertos terminos se definen primero. Las definiciones adicionales se exponen a traves de la descripcion detallada.
Los terminos “Cadherina-17”, “cadherina de dgado-intestino”, “LI-cadherina”, “HPT-1 transportado asociado con peptido intestinal” y “CDH17” se usan de manera intercambiable. La Cadherina-17 tambien ha sido identificada como OGTA001 en la Solicitud de Patente Internacional W02008/026008. Los anticuerpos humanos de esta divulgacion
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pueden, en ciertos casos, reaccionar de manera cruzada con la Cadherina-17 de especies diferentes a la humana. En ciertas realizaciones, los anticuerpos pueden ser completamente espedficos para una o mas Cadherina-17 humana y puede no exhibir reactividad cruzada de especies o de otros tipos no humanos. La secuencia de aminoacidos completa para una Cadherina-17 humana de ejemplo tiene el numero de acceso de Genbank NM_004063.
El termino “respuesta inmune” se refiere a la accion de, por ejemplo, linfocitos, celulas que presentan el antigeno, celulas fagodticas, granulocitos y macromoleculas solubles producidas por las celulas anteriores o el Idgado (incluyendo anticuerpos, citocinas y complementos), que resultan en un dano selectivo a, destruccion de, o eliminacion del cuerpo humano de los patogenos invasores, celulas o tejidos infectados con los patogenos, celulas cancerosas, o, en casos de autoinmunidad o inflamacion patologica, celulas o tejidos humanos normales.
Una “trayectoria de transduccion de la senal”, se refiere a la relacion bioqmmica entre varias moleculas de transduccion de la senal que juegan un papel en la trasmision de una senal de una porcion de una celula a otra porcion de una celula. Como se utiliza en la presente, la expresion “receptor de la superficie celular” incluye, por ejemplo, moleculas y complejos de moleculas capaces de recibir una senal y la transmision de tal senal a traves de la membrana del plasma de una celula. Un ejemplo de un “receptor de la superficie celular” de la presente invencion, es el receptor de Cadherina-17.
El termino “anticuerpo” referido en la presente, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento que se une al antigeno (es dedr, “porcion que se une al antfgeno”) o cadenas sencillas del mismo. Un “anticuerpo” se refiere a una glucoprotema que puede comprender al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porcion que se une al antfgeno del mismo. Cada cadena pesada esta comprendida de una region variable de cadena pesada (abreviada en la presente como Vh) y una region constante de cadena pesada. La region constante de cadena pesada esta comprendida de tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera esta comprendida de una region variable de cadena ligera (abreviada en la presente como Vl o Vk) y una region constante de cadena ligera. La region constante de cadena ligera esta comprendida de un dominio, Cl. Las regiones Vh y Vl / Vk pueden subdividirse ademas en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones que determinan la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, denominadas regiones de marco (FR). Cada Vh y Vl/Vk esta compuesta de tres CDR y cuatro FR, colocados del termino amino al termino carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de union que interactua con un antfgeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la union de la inmunoglobulina a los tejidos o factores hospederos, incluyendo varias celulas del sistema inmune (por ejemplo, celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clasico.
La definicion de “anticuerpo” incluye, pero no se limita a, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos biespedficos, minocuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sinteticos (algunas veces denominados en la presente como “anticuerpos mimeticos”), anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, fusiones de anticuerpos (algunas veces denominados como “conjugados de anticuerpos”), y fragmentos de cada uno, respectivamente.
En una realizacion, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de un anticuerpo espedfico incluyen, pero no se limitan a, (i) el fragmento Fab que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo anticuerpo, (iv) el fragmento dAb que consiste de un solo dominio variable; (v) regiones de CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados (vii) moleculas Fv de cadena simple (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL estan ligados por un enlazador peptfdico que permite a los dos dominios asociarse para formar un sitio de union de antfgeno, (viii) dfmeros Fv de cadena simple bispedficos, y (ix) “diacuerpos” o “triacuerpos”, fragmentos multivalentes o multiespedficos construidos por fusion de genes. Los fragmentos de anticuerpos pueden ser modificados. Por ejemplo, las moleculas pueden ser estabilizadas mediante la incorporacion de puentes bisulfuro que enlazan los dominios VH y VL. Ejemplos de fromatos y arquitecturas de anticuerpos se describen en Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136, y Carter 2006, Nature Reviews Immunology 6:343-357 y las referencias citadas en ellos.
En una realizacion, un anticuerpo descrito en la presente puede ser un anticuerpo multiespedfico, y de manera
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notable un anticuerpo biespedfico, algunas veces denominado como “diacuerpos”. Estos son anticuerpos que se unen a dos (o mas) diferentes antfgenos. Los diacuerpos pueden fabricarse en una variedad de maneras conocidas en la tecnica, por ejemplo, prepararse qmmicamente o de hibridomas dbridos. En una realizacion, el anticuerpo es un minicuerpo. Los minicuerpos son protemas similares a anticuerpo minimizadas que comprenden un scFv unido a un dominio CH3. En algunos casos, el scFv puede unirse a la region Fc, y puede incluir algunos o todas de las regiones de sujecion. Para una descripcion de anticuerpos multiespedficos vease Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136 y las referencias citadas en las mismas.
Por “CDR” como se usa en la presente se entiende una Region Determinante de Complementariedad de un dominio variable de anticuerpo. La identificacion sistematica de los residuos incluidos en los CDR han sido desarrollados por Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda) y alternativamente por Chothia (Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883; Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol. 273: 927-948). Para los fines de la presente invencion, los CDR se definen como un conjunto de residuos ligeramente mas pequenos que los CDR definidos por Chothia. Los VL CDR estan definidos en la presente para incluir los residuos en las posiciones 27-32 (CDR1), 50-56 (CDR2), y 91-97 (CDR3), en donde la numeracion es de acuerdo con Chothia. Ya que los VL CDR como se definen por Chothia y Kabat son identicos, la numeracion de estas posiciones VL CDR tambien es de acuerdo a Kabat. Los VH CDR estan definidos en la presente para incluir residuos en las posiciones 27-33 (CDR1), 52-56 (CDR2), y 95-102 (CDR3), en donde la numeracion es de acuerdo a Chothia. Estas posiciones VH CDR corresponden a las posiciones de Kabat 27-35 (CDR1), 52-56 (CDR2), y 95-102 (CDR3).
Como sera apreciado por los expertos en la tecnica, los CDR descritos en la presente tambien incluyen variantes, por ejemplo cuando los CDR descritos en la presente se retromutan en diferentes regiones de marco. En general, la identidad del aminoacido entre CDR variantes individuales es de al menos 80% a las secuencias descritas en la presente, y mas tfpicamente con identidades que preferiblemente aumentan de al menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y casi 100%. De una manera similar, el “por ciento (%) de identidad de secuencia de acido nucleico” con respecto a la secuencia del acido nucleico de las protemas de union identificadas en la presente es definido como el porcentaje de residuos de nucleotidos en una secuencia candidata que son identicos en la secuencia codificadora de la protema de union a antfgeno. Un metodo espedfico utiliza el modulo BLASTN del conjunto WU-BLAST-2 en los parametros preestablecidos, con alcance superpuesto y fraccion superpuesta ajustados a 1 y 0.125, respectivamente.
En general, la identidad de la secuencia de acido nucleico entre las secuencias de nucleotidos que codifican CDR variantes individuales y las secuencias de nucleotidos descritas en la presente son de al menos 80%, y mas tfpicamente con identidades que preferiblemente aumentan de al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, y casi 100%.
Por lo tanto, un “CDR variante” es uno con la homologfa especificada, similitud, o identidad al CDR madre de la invencion, y comparte la funcion biologica, incluyendo, pero no limitado a, al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la especificidad y/o actividad del CDR madre.
Aunque el sitio o region para introducir una variacion de secuencia de aminoacidos esta predeterminada, la mutacion per se no requiere ser predeterminada. Por ejemplo, para optimizar el desempeno de una mutacion en un sitio dado, puede conducirse una mutagenesis aleatoria en el codon o region objetico y las variantes de CDR de protema que se une al antfgeno expresado examinarse para la combinacion optima de la actividad deseada. Las tecnicas para realizar mutaciones por sustitucion en sitios predeterminados en ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, la mutagenesis del cebador M13 y mutagenesis por PCR. El examen de los mutantes se realiza usando ensayos de actividades de protema que se une a antfgeno como se describe en la presente.
Las sustituciones de aminoacidos son tfpicamente para residuos simples; las inserciones usualmente estaran en el orden de aproximadamente uno (1) a aproximadamente veinte (20) residuos de aminoacidos, aunque pueden tolerarse inserciones considerablemente mayores. Las deleciones vanan de aproximadamente uno (1) a aproximadamente veinte (20) residuos de aminoacidos, aunque en algunos casos las deleciones pueden ser mucho mayores.
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Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinacion de estos pueden usarse para llegar a un derivado o variante final. En general estos cambios se realizan en unos pocos aminoacidos para minimizar la alteracion de la molecula, particularmente la inmunogenicidad y especificidad de la protema que se une al antfgeno. Sin embargo, pueden ser tolerados mayores cambios en ciertas circunstancias.
Por “Fab” o “region Fab” como se usa en la presente se entiende el polipeptido que comprende los dominios VH, CH1, VL, y CL inmunoglobulina. El Fab puede referirse a esta region en aislamiento, o esta region en el contexto de un anticuerpo de longitud completa, fragmento de anticuerpo o protema de fusion a Fab, o cualquier otra realizacion de anticuerpos como se define en la presente.
Por “Fv” o “fragmento Fv” o “region Fv” como se usa en la presente se entiende un polipeptido que comprende los dominios VL y VH de un solo anticuerpo.
Por “marco” como se usa en la presente se entiende la region de un dominio variable de anticuerpo exclusivo de esas regiones definidas como CDR. Cada marco de dominio variable de anticuerpo puede ser subdividido ademas en regiones contiguas separadas por los CDR (FR1, FR2, FR3 y FR4).
El termino “porcion que se une a un antigeno” de un anticuerpo (o simplemente “porcion de anticuerpo”), como se usa en la presente, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad de unirse espedficamente a un antfgeno (por ejemplo, Cadherina-17). Ha sido demostrado que la funcion de union un antfgeno de un anticuerpo puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de union comprendidos dentro del temrino “porcion que se une a un antigeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios Vl / Vk, Vh, Cl y Ch1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puento bisulfuro a la region de sujecion; (iii) un fragmento Fab', que es en esencia un Fab con parte de la region de sujecion (vease, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) un fragmento Fd que consiste de los dominios Vh y Ch1; (v) un fragmento Fv que consiste de los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo; (vi) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste de un dominio Vh; (vii) una region determinante complementaria aislada (CDR); y (viii) un nanocuerpo, una region variable de cadena pesada que contiene un dominio de una variable y dos dominios constantes. Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl / Vk y Vh, son codificados por genes separados, pueden unirse, usando metodos recombinantes, por un enlazador sintetico que les permita formar una cadena de una sola protema en la cual las regiones Vl / Vk y Vh se apareen para formar moleculas monovalentes (conocido como una cadena simple Fv (scFv); vease por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Se pretende que dichos anticuerpos de una sola cadena tambien esten comprendidos dentro del termino “porcion que se une a un antfgeno” de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo son obtenidos usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica, y los fragmentos son examinados por su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.
Un “anticuerpo aislado,” como se utiliza en la presente, pretende referirse a un anticuerpo que esta sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigenicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une de manera espedfica a Cadherina-17 esta sustancialmente libre de anticuerpos que se unen de manera espedfica a antfgenos diferentes a Cadherina-17). Un anticuerpo aislado que se une de manera espedfica a Cadherina-17 puede, sin embargo, tener reactividad cruzada para otros antfgenos, tales como moleculas de Cadherina-17 de otras especies. Ademas, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o compuestos qdmicos en una forma no encontrada naturalmente.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invencion son protemas recombinantes, protemas aisladas o protemas sustancialmente puras. Una protema “aislada” no esta acompanada por al menos parte del material con el cual normalmente esta asociada en su estado natural, por ejemplo constituida al menos de aproximadamente 5%, o al menos aproximadamente 50% por peso de la protema total en una muestra dada. Se entiende que la protema asilada puede constituir de 5 a 99.9% por peso del contenido total de la protema dependiendo de las circunstancias. Por ejemplo, la protema puede estar a una concentracion significativamente mayor a traves del uso de un promotor inducible o un promotor de alta expresion, de manera que la protema se forma a niveles aumentados de concentracion. En el caso de protemas recombinantes, la definicion incluye la produccion de un anticuerpo en una amplia variedad de organismos y/o celulas hospederas que son conocidas en la tecnica en la cual no se producen
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de manera natural.
Los terminos “anticuerpo monoclonal” o “composicion de anticuerpo monoclonal” como se utilizan en la presente, se refieren a una preparacion de moleculas de anticuerpo de una composicion molecular unica. Una composicion de anticuerpo monoclonal muestra una sola especificidad y afinidad de union por un epftopo particular.
Como se utiliza en la presente, “isotipo”, se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgGl) que es codificada por los genes de la region constante de cadena pesada.
Las expresiones “un anticuerpo que reconoce un antfgeno” y “un anticuerpo espedfico para un antigeno”, se utilizan de manera indistinta en la presente con el termino “un anticuerpo que se une de manera espedfica a un antigeno”.
El termino “derivados de anticuerpo”, se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo u otro agente o anticuerpo. Por ejemplo, anticuerpos de la presente invencion pueden ser conjugados con una toxina, una marca, etc. Los anticuerpos de la presente invencion pueden ser no humanos, quimerico, humanizados, o completamente humanos. Para una descripcion de los conceptos de anticuerpos quimericos y humanizados vease Clark et al., 2000 y las referencias citadas en ella (Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402). Los anticuerpos quimericos comprenden la region variable de un anticuerpo no humano, por ejemplo los dominios VH y VL de origen de raton o rata, ligados operativamente a la region constante de un anticuerpo humano (vease por ejemplo la Patente de E.U.A No. 4,816,567). En una realizacion preferida, los anticuerpos de la presente invencion son humanizados. Por anticuerpos “humanizados” como se usa en la presente se entiende un anticuerpo que comprende una region humana de marco (FR) y una o mas regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo no humano (usualmente de rato o rata). El anticuerpo no humano que proporciona los CDR es llamado el “donador” y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco es llamada el “aceptor”. La humanizacion se basa principalmente en el injerto de los CDR del donador sobre el aceptor (humano) marco VL y VH (Patente de E.U.A. No, 5,225,539). Esta estrategia es referida como “injerto de CDR”. A menudo se requiere “la retromutacion” de los residuos del marco del aceptor seleccionado a los residuos correspondientes del donador correspondiente para ganar de Nuevo afinidad que es perdida en la construccion injertada injicial (US 5,530,101; US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; US 6,180,370; US 5,859,205; US 5,821,337; US 6,054,297; US 6,407,213). El anticuerpo humanizado optimamente tambien comprendera al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina, tfpicamente esa de una inmunoglobulina humana, y entonces tfpicamente comprendera una region Fc humana. Los metodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la tecnica, y pueden ser esencialmente realizados siguiendo el metodo de Winter y colaboradores (Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al.,1988, Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:15341536). Ejemplos adicionales de anticuerpos monoclonales de murino humanizados son tambien conocidos en la tecnica, por ejemplo los anticuerpos que se unen a la protema C humana (O'Connor et al., 1998, Protena Eng 11:321-8), receptor de interleucina 2 (Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33), y receptor 2 del factor de crecimiento epidermico humano (Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9). En una realizacion alterna, los anticuerpos de la presente invencion pueden ser completamente humanos, es decir que las secuencias de los anticuerpos son completamente o sustancialmente humanas. Un numero de metodos son conocidos en la tecnica para generar anticuerpos completamente humanos, incluyendo el uso de ratones transgenicos (Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455-458) o bibliotecas de anticuerpos humanos acoplados con metodos de seleccion (Griffiths et al., 1998, Curr Opin Biotechnol 9:102-108).
El termino “anticuerpo humanizado” pretende referirse a anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas de la lmea germinal de otras especies de mairnfero, tales como raton, se han injertado en las secuencias de marco humanas. Las modificaciones adicionales de la region de marco pueden hacerse dentro de las secuencias de marco humanas.
El termino “anticuerpo quimerico” pretende referirse a anticuerpos en los cuales las secuencias de la region variable se derivan de una especie, y las secuencias de la region constante se derivan de otra especie, tales como un anticuerpo en el cual las secuencias de la region variable se derivan de un anticuerpo de raton y las secuencias de la region constante se derivan de un anticuerpo humano.
El termino “se une de manera espedfica o (se une inmunoespedficamente” no pretende indicar que un anticuerpo se une exclusivamente a su objetivo pretendido. Mas bien, un anticuerpo “se une espedficamente” si su afinidad por
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su objetivo pretendido es aproximadamente 5 veces mayor cuando se compara con su afinidad por una molecula no objetivo. Convenientemente no existe una reaccion cruzada o union cruzada son sustancias indeseadas, especialmente protemas o tejidos que existen naturalmente de una persona o animal saludable. La afinidad del anticuerpo sera, por ejemplo, al menos aproximadamente 5 veces, tal como 10 veces, tal como 25 veces, especialmente 50 veces, y particularmente 100 veces o mas, mayor para una molecula objetivo que su afinidad para una molecula no objetivo. En algunas realizaciones, la union espedfica entre un anticuerpo u otro agente de union y un antigeno significa una afinidad de union de al menos 106 M-1. Los anticuerpos pueden, por ejemplo, unirse con afinidades de al menos aproximadamente 107 M-1, tal como entre aproximadamente 108 M-1 a aproximadamente 109 M-1, aproximadamente 109 M-1 a aproximadamente 1010 M-1, o aproximadamente 1010 M-1 a aproximadamente 1011 M-1. Los anticuerpos pueden, por ejemplo, unirse con un EC50 de 50 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos, 100 pM o menos, o mas preferiblemente 10 pM o menos.
El termino “no se une sustancialmente” a una protema o celulas, como se utiliza en la presente, significa que no se une o no se une con una alta afinidad a la protema o celulas, es decir, se une a la protema o celulas con una Kd de 1 x 10-6 M o mas, de manera mas preferida 1 x 10-5 M o mas, de manera mas preferida 1 x 10-4 M o mas, de manera mas preferida 1 x 10-3 M o mas, aun de manera mas preferida 1 x 10-2 M o mas.
El termino “EC50” como se utiliza en la presente, pretende referirse a la potencia de un compuesto cuantificando la concentracion que conduce a una respuesta/efecto maximo al 50%. El EC50 puede ser determinado por Scratchard o FACS.
El termino “Kasoc” o “Ka”, como se utiliza en la presente, pretende referirse a la velocidad de asociacion de una interaccion particular anticuerpo-antigeno, mientras que el termino “Kdis” o “Kd”, como se utiliza en la presente, pretende referirse a la velocidad de disociacion de una interaccion particular de anticuerpo-antfgeno. El termino “Kd”, como se utiliza en la presente, pretende referirse a la constante de disociacion, que se obtiene de la relacion de Kd a Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como una concentracion molar (M). Los valores de Kd para los anticuerpos pueden determinarse utilizando metodos bien establecidos en la tecnica. Un metodo preferido para determinar la Kd de un anticuerpo, es utilizando resonancia con plasmon superficial, de manera preferida, utilizando un sistema biosensor, tal como el sistema Biacore®.
Como se utiliza en la presente, el termino “alta afinidad” para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 1 x 10-7 M o menos, de manera mas preferida 5 x 10-8 M o menos, aun de manera mas preferida 1x10-8 M o menos, aun de manera mas preferida 5 x 10-9 M o menos y aun de manera mas preferida 1 x 10-9 M o menos para un antfgeno objetivo. Sin embargo, la union con “alta afinidad” pueden variar para otros isotipos del anticuerpo. Por ejemplo, la union con “alta afinidad” para un isotipo de IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10-6 M o menos, de manera mas preferida 10-7 M o menos, aun de manera mas preferida 10-8 M o menos.
El termino “epftopo” o “determinante antigenica” se refiere al sitio de un antigeno al cual una inmunoglobulina o un anticuerpo se unen de manera espedfica. Los epftopos pueden formarse tanto de aminoacidos contiguos como de aminoacidos no contiguos yuxtapuestos por el plegado terciario de una protema. Los epftopos formados de los aminoacidos contiguos se retienen tfpicamente tras la exposicion a solventes desnaturalizantes, mientras que los epftopos formados por el pliegue terciario se pierden tfpicamente con el tratamiento con solventes desnaturalizantes. Un epftopo incluye tfpicamente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoacidos en una conformacion espacial unica. Los metodos para determinar la conformacion espacial de los epftopos incluyen tecnicas en el campo y aquellas descritas en la presente, por ejemplo, cristalograffa con rayos x y resonancia magnetica nuclear en 2 dimensiones (vease, por ejemplo, Epftopo Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
En consecuencia, tambien se divulgan los anticuerpos que se unen a (es decir, reconocen) al mismo epftopo que los anticuerpos descritos en la presente (es decir, PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 y PTA001_A14). Los anticuerpos que se unen al mismo epftopo, pueden identificarse por su capacidad para competir con (es decir, inhiben de manera competitiva la union de) un anticuerpo de referencia a un antfgeno objetivo, de una manera estadfsticamente significativa. La inhibicion competitiva puede ocurrir, por ejemplo, si los anticuerpos se unen a epftopos identicos o estructuralmente similares (por ejemplo, epftopos que se superponen), o epftopos espacialmente proximales que, cuando se unen, causan impedimento esterico entre los anticuerpos.
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La inhibicion competitiva puede determinarse utilizando ensayos de rutina en los cuales la inmunoglobulina bajo prueba, inhibe la union espedfica de un anticuerpo de referencia a un antfgeno comun. Numerosos tipos de ensayos de union competitiva son conocidos, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto en fase solida (RIA), inmunoensayo con enzimas directo o indirecto en fase solida (EIA), ensayo de competencia intercalado (vease, Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); EIA con biotina-avidina directo en fase solida (vease, Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); ensayo marcado directo en fase solida, ensayo intercalado marcado directo en fase solida (vease, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA marcado directo en fase solida utilizando marcas con I-125 (vease, Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); EIA con biotina-avidina directo en fase solida (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); y RIA marcado directo (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Tfpicamente, tal ensayo involucra el uso de un antfgeno purificado unido a una superficie solida o celulas que portan cualquiera de estos, una inmunoglobulina de prueba no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibicion competitiva se mide determinando la cantidad de marca unida a la superficie solida o celulas en la presencia de la inmunoglobulina de prueba. Usualmente, la inmunoglobulina de prueba esta presente en exceso. Usualmente, cuando un anticuerpo competidor esta presente en exceso, inhibira la union espedfica de un anticuerpo de referencia a un antigeno comun por al menos 50-55%, 55-60%, 60-65%, 6570% 70-75% o mas.
Otras tecnicas incluyen, por ejemplo, metodos para representar el epttopo, tales como analisis con rayos x de los cristales de los complejos de antfgeno:anticuerpo, que proporciona la resolucion atomica del epftopo. Otros metodos para verificar la union del anticuerpo a los fragmentos de antfgeno o las variaciones mutadas del antfgeno, en donde la perdida de union debida a una modificacion de un residuo de aminoacido dentro de la secuencia del antfgeno, se considera con frecuencia una indicacion de un componente del epftopo. Ademas, tambien pueden utilizarse metodos combinatorios computacionales para la correlacion del epftopo. Estos metodos se basan en la capacidad del anticuerpo de interes para aislar con afinidad los peptidos cortos espedficos de las bibliotecas combinatorias del peptido de representacion del fago. Los peptidos se consideran a continuacion como lfderes para la definicion del epftopo que corresponden al anticuerpo utilizado para seleccionar la biblioteca peptfdica. Para la correlacion del epftopo, tambien se han desarrollado algoritmos computacionales que han mostrado representar los epftopos conformacionales discontinuos.
Como se utiliza en la presente, el termino “sujeto” incluye cualquier humano o animal no humano. El termino “animal no humano”, incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mairnferos y no mairnferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.
Diversos aspectos de la invencion se describen con detalle adicional en las siguientes subsecciones.
Anticuerpos anti-Cadherina-17
Los anticuerpos de la invencion estan caracterizados por rasgos o propiedades funcionales particulares de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se unen de manera espedfica a la Cadherina-17 humana. De manera preferida, un anticuerpo de la invencion se une a Cadherina-17 con alta afinidad, por ejemplo, con una Kd de 8 x 10'7 M o menos, aun de manera mas tfpica, 1 x 10'8 M o menos. Los anticuerpos anti-Cadherina-17 de la invencion, exhiben de manera preferida, una o mas de las siguientes caractensticas:
se unen a la Cadherina-17 humana con una EC50 de 50 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos, 100 pM o menos, o de manera mas preferida 10 pM o menos;
se unen a las celulas humanas que expresan a Cadherina-17.
En una realizacion, los anticuerpos se unen de manera preferida a un epftopo antigenico presente en la Cadherina- 17, epftopo el cual no esta presente en otras protemas. Los anticuerpos de unen tfpicamente a la Cadherina-17, pero no se unen a otras protemas, o se unen a protemas con una baja afinidad, tal como una Kd de 1 x 10'6 M o mas, de manera mas preferida 1 x 10'5 M o mas, de manera mas preferida 1 x 10'4 M o mas, de manera mas preferida 1 x 10'3 M o mas, aun de manera mas preferida 1 x 10'2 M o mas. De manera preferida, los anticuerpos no se unen a las protemas relacionadas, por ejemplo, los anticuerpos no se unen sustancialmente a otras moleculas de adhesion celular. Los anticuerpos de la invencion son internalizados en una celula que expresa a Cadherina-17. Los ensayos estandar para evaluar la internalizacion del anticuerpo son conocidos en la tecnica, incluyendo, por
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ejemplo, un ensayo de internalizacion HumZap.
Los ensayos estandar para evaluar la capacidad de union de los anticuerpos a Cadherina-17 son conocidos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, ELISA, transferencias Western, RIA y analisis con citometna de flujo. Los ensayos adecuados se describen con detalle en los Ejemplos. La cinetica de union (por ejemplo, afinidad de union) de los anticuerpos, tambien puede valorarse mediante ensayos estandar conocidos en la tecnica, tales como el analisis del sistema Biacore®. Para valorar la union a las celulas del tumor de los linfocitos B Raji o Daudi, las celulas Raji (No. de Deposito de la ATCC CCL-86) o Daudi (No. de Deposito de la ATCC CCL-213), pueden obtenerse de fuentes disponibles al publico, tales como la coleccion Americana de Cultivos Tipo, y utilizarse en ensayos estandar, tales como analisis con citometna de flujo.
Anticuerpos monoclonales de la Invencion
Los anticuerpos de la divulgacion son los anticuerpos monoclonales humanos PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 y PTA001_A14, aislados y estructuralmente caracterizados como se describe en los Ejemplos 1-6. Las secuencias de aminoacidos de Vh PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 y PTA001_A14 se muestran en SEQ ID NOs:35-46. Las secuencias de aminiacidos de Vk de PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 y PTA001_A14 se muestran en SEQ ID NOs:47-58.
Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a Cadherina-17, las secuencias Vh y Vk pueden “mezclarse y aparearse” para crear otras que se unen a anti-Cadherina-17. La union a Cadherina-17 de tales anticuerpos “mezclados y apareados”, puede probarse utilizando los ensayos de union descritos anteriormente y en los Ejemplos (por ejemplo, ELISA). De manera preferida, cuando las cadenas Vh y Vk se mezclan y aparean, una secuencia Vh de un apareamiento Vh/Vk particular, se reemplaza con una secuencia Vh estructuralmente similar. De igual manera, de manera preferida, una secuencia Vk de un apareamiento Vh/Vk particular se reemplaza con una secuencia Vk estructuralmente similar.
En consecuencia, en un aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo, que comprende:
una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos asentada en una SEQ ID NO: seleccionada del grupo que consiste de 38, y una region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos asentada en una SEQ ID NO: seleccionada del grupo que consiste de 49, en donde el anticuerpo se une de manera espedfica a Cadherina-17, de manera preferida, Cadherina-17 humana.
Tambien se divulgan aqu combinaciones de cadena pesada y ligera preferidas que incluyen:
una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 35 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 47; o
una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 36; y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 48, o
una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 37; y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 48; o
una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 39; y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 50; o
una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 40; y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 51; o
una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 41; y una
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region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 52; o
una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 42; y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 53; o
una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 40; y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 54; o
una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 40; y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 55; o
una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 43; y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 56; o
una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 44; y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 55; o
una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 45; y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 57; o
una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 46; y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 58.
En otro aspecto, la invencion proporciona anticuerpos que comprenden los CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y cadena ligera de PTA001_A4. Tambien se describen los anticuerpos que comprenden los CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y cadena ligera de PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 y PTA001_A14, o combinaciones de las mismas. Las secuencias de aminoacidos de los Vh CDR1 de PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 y PTA001_A14 se muestran en SEQ ID NOs: 1-4. Las secuencias de aminoacidos de los Vh CDR2 de PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 y PTA001_A14 se muestran en SEQ ID NOs: 5-13. Las secuencias de aminoacidos de los Vh CDR3 de PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 y PTA001_A14 se muestran en SEQ ID NOs:14-21. Las secuencias de aminoacidos de los Vk CDR1 de PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 y PTA001_A14 se muestran en SEQ ID NOs:22-27. Las secuencias de aminoacidos de los Vk CDR2 de PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 y PTA001_A14 se muestran en SEQ ID NOs:28-31. Las secuencias de aminoacidos de los Vk CDR3 de PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 y PTA001_A14 se muestran en SEQ ID NOs:32-34. Las regiones CDR son delineadas usando el sistema Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Protemas of Immunological Interest, Fifth Edicion, U.S. Department of Health y Human Services, NIH Publication No. 91-3242).
Dado que cada uno de estos anticuerpos se puede unir a la Cadherina-17 y que la especificidad de union al antfgeno se proporciona principalmente por las regiones CDR1, CDR2 y CDR3, las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 Vh y las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 Vk pueden “mezclarse y aparearse” (es decir, las CDR de diferentes anticuerpos pueden mezclarse y aparearse, aunque cada anticuerpo debe contener una CDR1, CDR2 y CDR3 Vh y una CDR1, CDR2 y CDR3 Vk), para crear otras moleculas de union a anti-Cadherina-17. En consecuencia, la divulgacion incluye espedficamente cada posible combinacion de CDR de las cadenas pesada y ligera.
La union de Cadherina-17 de tales anticuerpos “mezclados y apareados”, puede probarse utilizando los ensayos de union descritos anteriormente y en los Ejemplos (por ejemplo, analisis ELISA, Biacore®). De manera preferida,
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cuando las secuencias CDR Vh se mezclan y aparean, las secuencias CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia Vh particular, se reemplazan con una secuencia CDR estructuralmente similar. De igual manera, cuando las secuencias CDR Vk se mezclan y aparean, las secuencias CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia Vk particular, de manera preferida, se reemplaza con una secuencia CDR estructuralmente similar. Sera facilmente evidente para el experto con experiencia ordinaria, que las secuencias Vh y Vk novedosas, pueden crearse sustituyendo una o mas de las secuencias de la region CDR Vh y/o Vl / Vk con secuencias estructuralmente similares de las secuencias CDR descritas en la presente para los anticuerpos monoclonales PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 y PTA001_A14.
En consecuencia, se describe aqu un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion que se une al antigeno del mismo, que comprende:
una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1-4;
una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 5-13;
una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 14-21;
una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 22-27;
una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 28-31; y
una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 32-34;
siendo posibles todas las combinaciones posibles, en donde el anticuerpo se une de manera espedfica a Cadherina-17, de manera preferida, Cadherina-17 humana.
En un ejemplo, el anticuerpo comprende:
una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 1; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 5; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 14; una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 22; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 28; y una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 32.
En otro ejemplo, el anticuerpo comprende:
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una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 23; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 29; y una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 33. En otro ejemplo, el anticuerpo comprende:
una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 3; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 7; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 16; una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 23; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 29; y una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 33. En una realizacion preferida, el anticuerpo comprende:
una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 4; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 8; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 17; una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 24; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 30; y una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 34. En oro ejemplo, el anticuerpo comprende:
una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 3; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 7; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 18; una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 25; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 31; y una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 33. En otro ejemplo, el anticuerpo comprende:
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una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 26; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 29; y una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 33. En otro ejemplo, el anticuerpo comprende:
una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 3; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 7; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 16; una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 25; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 31; y una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 33. En otro ejemplo, el anticuerpo comprende:
una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 3; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 7; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 16; una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 25; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 29; y una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 33. En otro ejemplo, el anticuerpo comprende:
una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 3; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 10; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 20; una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 27; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 29; y una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 33. En otro ejemplo, el anticuerpo comprende:
una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 25;
una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 29; y
una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 33.
En otro ejemplo, el anticuerpo comprende:
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una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 12;
una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 18;
una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 25;
una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 31; y
10 una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 33.
En otro ejemplo, el anticuerpo comprende:
una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 2;
una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 13;
una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 15;
15 una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 23;
una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 29; y
una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 33.
Es bien conocido en la tecnica que el dominio CDR3, de manera independiente de los dominios CDR1 y/o CDR2, puede determinar solo la especificidad de union de un anticuerpo a un antigeno analogo y que multiples anticuerpos 20 pueden generarse de manera predecible, que tienen la misma especificidad de union basandose en una secuencia CDR3 comun. Vease, por ejemplo, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000) (que describe la produccion de un anticuerpo anti-CD30 humanizado utilizando unicamente el dominio variable de cadena pesada CDR3 del anticuerpo anti-CD30 murino Ki-4); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000) (que describen los anticuerpos de la glucoprotema-2 epitelial recombinante (EGP-2), utilizando solo la secuencia CDR3 de cadena 25 pesada del anticuerpo anti-EGP-2 MOC-31 murino original); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998) (que describe un panel de anticuerpos avP3 de antiintegrina humanizados utilizando el dominio CDR variable de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo avP3 de antiintegrina murina LM609, en donde cada miembro de anticuerpo comprende una secuencia distinta fuera del dominio CDR3 y capaz de unirse al mismo epftopo que el anticuerpo murino original con afinidades tan altas o mas altas que el anticuerpo murino original); Barbas et al., J. 30 Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (que describe que el dominio CDR3 proporciona la contribucion mas significativa a la union al antfgeno); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (que describe el injerto de las secuencias CDR3 de cadena pesada de tres Fab (SI-1, SI-40 y SI-32) contra el ADN de placenta humana en la cadena pesada de un Fab de toxoide antitetanico, reemplazando por lo tanto la CDR3 de cadena pesada existente, y demostrando que el dominio CDR3 solo, confiere especificidad de union); y Ditzel et al., J. 35 Immunol. 157:739-749 (1996) (que describe estudios de injerto, en donde la transferencia de unicamente la CDR3 de cadena pesada de un Fab poliespedfico original LNA3 a una cadena pesada de un anticuerpo Fab p313 que se une al toxoide tetanico de IgG monoespedfico, fue suficiente para retener la especificidad de union del Fab original).
En consecuencia, la presente invencion proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o mas
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dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo derivado de un humano o un animal no humano, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse de manera espedfica a la Cadherina-17. Dentro de ciertos aspectos, la presente invencion proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o mas dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo de raton o rata, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse de manera espedfica a Cadherina-17. Dentro de algunas realizaciones, los anticuerpos inventivos que comprenden uno o mas dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo no humano (a) son capaces de competir para unirse con; (b) retienen las caractensticas funcionales; (c) se unen al mismo epftopo; y/o (d) tienen una afinidad de union similar que el anticuerpo no humano original correspondiente.
Dentro de otros aspectos, la presente invencion proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o mas dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido de un animal no humano, en donde el anticuerpo humano es capaz de unirse de manera espedfica a la Cadherina-17. Dentro de otros aspectos, la presente invencion proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o mas dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un primer anticuerpo humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido de un animal no humano, en donde el primer anticuerpo humano es capaz de unirse de manera espedfica a Cadherina-17, y en donde el dominio CDR3 del primer anticuerpo humano, reemplaza un dominio CDR3 en un anticuerpo humano que carece de especificidad de union para Cadherina-17, para generar un segundo anticuerpo humano que es capaz de unirse de manera espedfica a Cadherina-17. Dentro de algunas realizaciones, tales anticuerpos inventivos que comprenden uno o mas dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera del primer anticuerpo humano (a) son capaces de competir para unirse con; (b) retienen las caractensticas funcionales; (c) se unen al mismo epftopo; y/o (d) tienen una afinidad de union similar que el primer anticuerpo humano original correspondiente.
Anticuerpos que tienen secuencias de la lrnea germinal particulares
En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la invencion comprende una region variable de cadena pesada de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada de la lrnea germinal particular y/o una region variable de cadena ligera de un gen de inmunoglobulina de cadena ligera de la lrnea germinal particular.
Por ejemplo, en una realizacion preferida, la invencion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion que se une al antfgeno del mismo, que comprende una region variable de cadena pesada que es el producto de, o se deriva de un gen Vh 7-39 murino, gen VH105 de la region II de Vh de murino, o un gen H17 de Vh de murino, en donde el anticuerpo se une de manera espedfica a Cadherina-17. En aun otra realizacion preferida, la invencion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion que se une al antfgeno del mismo, que comprende una region variable de cadena ligera que es el producto de, o se deriva de un gen Vk 1-110 de murino, un gen Vk8-30 de murino o un gen 24-140 Vk de murino, en donde el anticuerpo se une de manera espedfica a Cadherina-17.
En aun otra realizacion preferida, la invencion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion que se une al antfgeno del mismo, en donde el anticuerpo:
comprende una region variable de cadena pesada que es el producto de, o que se deriva de un gen Vh 7-39 de murino (gen el cual incluye la secuencia de nucleotidos expuesta en la SEQ ID NO: 125); comprende una region variable de cadena ligera que es el producto de, o que se deriva de un gen Vk 1-110 de murino (gen el cual incluye las secuencias de nucleotidos expuestas en la SEQ ID NO: 128 y 129); se une de manera espedfica a Cadherina- 17, de manera preferida Cadherina-17 humana. Los ejemplos de un anticuerpo que tiene Vh y Vk de Vh 7-39 y Vk 1110, respectivamente, es PTA001_A1.
En aun otra realizacion preferida, la invencion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion que se une a un antfgeno del mismo, en donde el anticuerpo:
comprende una region variable de cadena pesada que es el producto de o que se deriva de un gen H17 Vh II de murino o un gen VH105 de la region Vh II (los genes incluyen las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO: 126 y 127 respectivamente); comprende una region variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen Vk 8-30 de murino (el gen incluye las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NOs: 130, 131 y 132); y se une de manera espedfica a Cadherina-17, preferiblemente Cadherina-17 humana.
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Ejemplos de un anticuerpo que tiene Vh del gen Vh II H17 o VH105 de la region Vh II y Vk de Vk 8-30 es PTA001_A4.
En aun otra realizacion preferida, la invencion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion que se une a un antfgeno del mismo, en donde el anticuerpo:
comprende una region variable de cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen H17 Vh II de murino o un gen VH105 de la region Vh II de murino (los genes incluyen las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO: 126 y 127 respectivamente); comprende una region variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen Vk 24-140 de murino (el gen incluye las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NOs: 133, 134 y 135); y se une de manera espedfica a Cadherina-17, preferiblemente a Cadherina-17 humana. Ejemplos de anticuerpos que tienen Vh del gen H17 Vh II o VH105 de la region Vh II y Vk de Vk 24-140 son PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 y PTA001_A14.
Como se utiliza en la presente, un anticuerpo comprende las regiones variables de cadena pesada o ligera, que es “el producto de” o “derivado de” una secuencia de la lmea germinal particular si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que utiliza genes de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino. Tales sistemas incluyen seleccionar una biblioteca de genes de inmunoglobulina de murino representada en el fago con el antfgeno de interes. Un anticuerpo que es “el producto de” o “derivado de” una secuencia de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino puede identificarse como tal, comparando la secuencia de aminoacidos o nucleotidos del anticuerpo con las secuencias de aminoacidos o nucleotidos de las inmunoglobulinas de la lmea germinal de murino, y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino que esta mas cercana en secuencia (es decir, mayor % de identidad) a la secuencia del anticuerpo. Un anticuerpo que es “el producto de” o “derivado de” una secuencia de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino particular, puede contener diferencias de aminoacidos en comparacion con la secuencia de la lmea germinal, debido a, por ejemplo, mutaciones somaticas naturales o la introduccion intencional de una mutacion dirigida al sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado tfpicamente es al menos 90% identico en la secuencia de aminoacidos con una secuencia de aminoacidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino, y contienen residuos de aminoacidos que identifican al anticuerpo como que es de murino cuando se compara con la secuencias de aminoacidos de la inmunoglobulina de la lmea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de la lmea germinal humanas). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos 95%, o incluso al menos 96%, 97%, 98% o 99% identico en la secuencia de aminoacidos con la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de la inmunoglobulina de la lmea germinal. Tfpicamente, un anticuerpo derivado de una secuencia de la lmea germinal de murino particular, representara no mas de 10 diferencias de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de la inmunoglobulina de la lmea germinal de murino. En ciertos casos, el anticuerpo puede representar no mas de 5, o incluso no mas de 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de la inmunoglobulina de la lmea germinal.
Anticuerpos homologos
Tambien se divulgan aqrn anticuerpos que comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera, que comprenden secuencias de aminoacidos que son homologas a las secuencias de aminoacidos de los anticuerpos preferidos descritos en la presente, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-Cadherina-17 de la invencion.
Por ejemplo, la divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion que se une al antfgeno del mismo, que comprende una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera, en donde:
la region variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos 80% homologa con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 35-46;
la region variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos 80% homologa a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 47-58; y
el anticuerpo se une a la Cadherina-17 humana. Dichos anticuerpos pueden unirse a la Cadherina-17 humana con
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un EC50 de 50 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos, 100 pM o menos, o mas preferiblemente 10 pM o menos.
El anticuerpo tambien puede unirse a celulas CHO transfectadas con Cadherina-17 humana.
En diversas realizaciones, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimerico.
En otros ejemplos, las secuencias de aminoacidos Vh y/o Vk pueden ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homologas a las secuencias expuestas anteriormente. Un anticuerpo que tiene regiones Vh y Vk que tienen alta homologfa (es decir, 80% o mas) con las regiones Vh y Vk de las secuencias expuestas anteriormente, puede obtenerse mediante mutagenesis (por ejemplo, dirigida al sitio o mutagenesis mediada por PCR) de las moleculas de acidos nucleicos que codifican las SEQ ID NOs: 59-83, seguido por la prueba del anticuerpo alterado codificado para la funcion retenida, utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente.
El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, % de homologfa = # de posiciones identicas/total del # de posiciones x 100), tomando en cuenta el numero de huecos, y la longitud de cada hueco, que necesitan introducirse para la alineacion optima de las dos secuencias. La comparacion de las secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre las dos secuencias puede lograrse utilizando un algoritmo matematico, como se describe en los ejemplos no limitantes siguientes.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos puede determinarse utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), que se ha incorporado en el programa ALIGN (version 2.0), utilizando una tabla de residuos ponderados PAM120, una penalizacion por la longitud del hueco de 12 y una penalizacion por hueco de 4. Ademas, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos puede determinarse utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)), que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de programas GCG (disponible en
http://www.gcg.com), utilizando una matriz de Blossum 62 o una matriz PAM250, y una ponderacion del hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderacion de la longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
De manera adicional o alterna, las secuencias de protemas de la presente invencion pueden utilizarse ademas, como una “secuencia de interrogacion”, para realizar una busqueda contra las bases de datos publicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Tales busquedas pueden realizarse utilizando el programa XBLAST (version 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las busquedas de protemas con BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, calificacion = 50, longitud de la palabra = 3 para obtener secuencias de aminoacidos homologas a las moleculas del anticuerpo de la invencion. Para obtener alineaciones con huecos para propositos de comparacion, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, los parametros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) pueden utilizarse. Vease
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Anticuerpos con modificaciones conservadoras
El anticuerpo de la invencion comprende una region variable de cadena pesada que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, y una region variable de cadena ligera que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, en donde estas secuencias CDR comprende secuencias de aminoacidos especificadas, basandose en los PTA001_A4, o modificaciones conservadoras de los mismos, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-Cadherina-17 de la invencion. En consecuencia, la invencion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion que se une al antfgeno del mismo, que comprende una region variable de cadena pesada que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una region variable de cadena ligera que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, en donde:
la secuencia CDR3 de la region variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 17, y modificaciones conservadoras de las mismas;
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la secuencia CDR3 de la region variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 34, y modificaciones conservadoras de las mismas; y
el anticuerpo se une a la Cadherina-17 humana. Tales anticuerpos pueden unirse a la Cadherina-17 humana con un EC50 de 50 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos, 100 pM o menos, o mas preferiblemente 10 pM o menos.
El anticuerpo tambien puede unirse a celulas CHO transfectadas con Cadherina-17 humana.
En una realizacion preferida, la secuencia CDR2 de la region variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 8, y modificaciones conservadoras de las mismas; y la secuencia CDR2 de la region variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 30, y modificaciones conservadoras de las mismas. En otra realizacion preferida, la secuencia CDR1 de la region variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, y modificaciones conservadoras de las mismas; y la secuencia CDR1 de la region variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 24, y modificaciones conservadoras de las mismas.
En diversas realizaciones, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quimericos.
Como se utiliza en la presente, el termino “modificaciones conservadoras de la secuencia”, pretende referirse a modificaciones de los aminoacidos que no afectan o alteran de manera significativa las caractensticas de union del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoacidos. Tales modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y supresiones de aminoacidos. Las modificaciones pueden introducirse en un anticuerpo de la invencion mediante tecnicas estandar conocidas en el campo, tales como mutagenesis dirigida al sitio y mutagenesis mediada por PCR. Las sustituciones conservadoras de los aminoacidos son unas en las cuales el residuo de aminoacidos se reemplaza con un residuo de aminoacidos que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la tecnica. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistema, triptofano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Asf, uno o mas residuos de aminoacidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invencion, pueden reemplazarse con otros residuos de aminoacidos de la misma familia de cadena lateral y el anticuerpo alterado puede probarse para la funcion retenida utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente.
La secuencia CDR1 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 1-4 puede comprender una o mas modificaciones conservadoras de la secuencia, tales como una, dos, tres, cuatro, cinco o mas sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacidos; la secuencia CDR1 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22-27 puede comprender una o mas modificaciones conservadoras de la secuencia, tales como una, dos, tres, cuatro, cinco o mas sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacidos; la secuencia CDR2 de cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 5-13 puede comprender una o mas modificaciones conservadoras de la secuencia, tales como una, dos, tres, cuatro, cinco o mas sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacidos; la secuencia CDR2 de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 28-38, puede comprender una o mas modificaciones conservadoras de la secuencia, tales como una, dos, tres, cuatro, cinco o mas sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacidos; la secuencia CDR3 de cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 14-21, puede comprender una o mas modificaciones conservadoras de la secuencia, tales como una, dos, tres, cuatro, cinco o mas sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacidos; y/o la secuencia CDR3 de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 32-34 puede comprender una o mas modificaciones conservadoras de la secuencia, tales como una, dos, tres, cuatro, cinco o mas sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacidos.
Anticuerpos que se unen al mismo epftopo como anticuerpos anti-Cadherina-17 de la invencion
En otro ejemplo, la divulgacion proporciona anticuerpos que se unen al mismo epftopo en la Cadherina-17 humana, como cualquiera de los anticuerpos monoclonales de Cadherina-17 de la invencion (es decir, anticuerpos que tienen la capacidad de competir de manera cruzada para unirse a la Cadherina-17 con cualquiera de los anticuerpos
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monoclonales de la invencion). En ejemplos preferidos, el anticuerpo de referencia para los estudios sobre la competencia cruzada para la union, puede ser el anticuerpo monoclonal PTA001_A1 (que tiene secuencias Vh y Vk como se muestra en as SEQ ID NOs: 35 y 47, respectivamente), el anticuerpo monoclonal PTA001_A2 (que tiene secuencias Vh y Vk como se muestra en las SEQ ID NOs: 36 y 48, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal PTA001_A3 (que tiene secuencias Vh y Vk como se muestra en las SEQ ID NOs: 37 y 38, respectivamente), el anticuerpo monoclonal PTA001_A4 (que tiene secuencias Vh y Vk como se muestra en las SEQ ID NOs: 38 y 49, respectivamente), el anticuerpo monoclonal PTA001_A5 (que tiene secuencias Vh y Vk como se muestra en las SEQ ID NOs: 39 y 50, respectivamente), el anticuerpo monoclonal PTA001_A6 (que tiene secuencias Vh y Vk como se muestra en las SEQ ID NOs: 40 y 51, respectivamente), el anticuerpo monoclonal PTA001_A7 (que tiene secuencias Vh y Vk como se muestra en las SEQ ID NOs: 41 y 52, respectivamente), el anticuerpo monoclonal PTA001_A8 (que tiene secuencias Vh y Vk como se muestra en las SEQ ID NOs: 42 y 53, respectivamente), el anticuerpo monoclonal PTA001_A9 (que tiene secuencias Vh y Vk como se muestra en las SEQ ID NOs: 40 y 54, respectivamente), el anticuerpo monoclonal PTA001_A10 (que tiene secuencias Vh y Vk como se muestra en las SEQ ID NOs: 40 y 55, respectivamente), el anticuerpo monoclonal PTA001_A11 (que tiene secuencias Vh y Vk como se muestra en las SEQ ID NOs: 43 y 56, respectivamente), el anticuerpo monoclonal PTA001_A12 (que tiene secuencias Vh y Vk como se muestra en las SEQ ID NOs: 44 y 55, respectivamente), el anticuerpo monoclonal PTA001_A13 (que tiene secuencias Vh y Vk como se muestra en las SEQ ID NOs: 45 y 57, respectivamente) o el anticuerpo monoclonal PTA001_A14 (que tiene secuencias Vh y Vk como se muestra en las SEQ ID NOs: 46 y 58, respectivamente). Tales anticuerpos con competencia cruzada pueden identificarse basandose en su capacidad para competir de manera cruzada con PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7,
PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 o PTA001_A14 en los ensayos de union a Cadherina-17 estandar. Por ejemplo, el analisis BIAcore, los ensayos de ELISA o la citometna de flujo pueden utilizarse para demostrar la competencia cruzada para la union con los anticuerpos de la presente invencion. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la union de, por ejemplo, PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 o PTA001_A14, a Cadherina-17 humana, demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 o PTA001_A14 para unirse a la Cadherina-17 humana y, por lo tanto, se une al mismo epftopo en la Cadherina-17 humana que PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8,
PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 o PTA001_A14.
Anticuerpos disenados y modificados
Un anticuerpo de la invencion puede prepararse ademas, utilizando un anticuerpo que tiene una o mas de las secuencias Vh y/o Vl divulgadas en la presente, puede utilizarse como una materia prima para disenar un anticuerpo modificado, anticuerpo modificado el cual puede tener propiedades alteradas en comparacion con el anticuerpo inicial. Un anticuerpo puede disenarse modificando uno o mas aminoacidos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, Vh y/o Vl), por ejemplo, dentro de una o mas regiones CDR y/o dentro de una o mas regiones de marco. De manera adicional o alterna, un anticuerpo puede disenarse modificando los residuos dentro de las regiones constantes, por ejemplo, para alterar las funciones efectoras del anticuerpo.
En ciertas realizaciones, el injerto de la CDR puede utilizarse para disenar las regiones variables de los anticuerpos. Los anticuerpos interaction con antfgenos objetivo de manera predominante a traves de los residuos de aminoacidos que estan localizados en las seis regiones que determinan la complementariedad de la cadena pesada y ligera (CDR). Por esta razon, las secuencias de aminoacidos dentro de las CDR son mas diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias CDR son responsables de la mayona de las interacciones anticuerpo-antfgeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de los anticuerpos naturales espedficos, construyendo vectores de expresion que incluyen las secuencias CDR del anticuerpo natural espedfico injertado en las secuencias del marco de un anticuerpo diferente, con diferentes propiedades (vease, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327: Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525: Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Vease. U.S.A. 86:10029-10033; Patente de E.U.A. No. 5,225,539 de Winter, y las Patentes de E.U.A. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370, de Queen et al.).
En consecuencia, otra realizacion de la invencion pertenece a un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion que se
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une al antigeno del mismo, que comprende una region variable de cadena pesada que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, que comprenden las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 17, respectivamente, y una region variable de cadena ligera que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, y SEQ ID NO: 34, respectivamente. Asf, tales anticuerpos contienen las secuencias CDR Vh y Vk de los anticuerpos monoclonales PTA001_A4, aun pueden contener diferentes secuencias de marco de estos anticuerpos.
Tales secuencias de marco pueden obtenerse de las bases de datos publicas del ADN o las referencias publicadas, que incluyen las secuencias del gen del anticuerpo de la lmea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la lmea germinal para los genes murinos de la region variable de cadena pesada y ligera, pueden encontrarse en la base de datos de datos de la secuencia de la lmea germinal de murino “IMGT” (International ImMunoGeneTics), (disponible en la Internet en imgt.cines.fr/) asf como en Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, Departamento de Salud y Servicios Humanos de E.U.A., Publicacion NIH No. 91-3242. Como otro ejemplo, las secuencias del ADN de la lmea germinal para los genes murinos de la region variable de cadena pesada y ligera pueden encontrarse en la base de datos Genbank.
Las secuencias de protemas del anticuerpo se comparan contra una base de datos de las secuencias de protema recopilada, utilizando uno de los metodos de busqueda de similitud de la secuencia llamados Gapped BLAST (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402), que es bien conocido por aquellos con experiencia en la tecnica. BLAST es un algoritmo heunstico en que una alineacion estadfsticamente significativa entre la secuencia del anticuerpo y la secuencia de la base de datos, probablemente contiene pares de segmentos con alta calificacion (HSP) de palabras alineadas. Los pares de segmentos cuyas calificaciones no pueden mejorarse por extension o corte, son llamados un blanco (hit). Brevemente, las secuencias nucleotfdicas en la base de datos se traducen, y la region entre y que incluye la region del marco FR1 hasta FR3 se retiene. Las secuencias de la base de datos tienen una longitud promedio de 98 residuos. Las secuencias duplicadas que son correspondencias exactas en toda la longitud de la protema se eliminan. Una busqueda BLAST para las protemas utilizando el programa blastp con parametros por defecto, estandar, excepto por el filtro de baja complejidad, que se apaga, y la matriz de sustitucion de BLOSUM62, filtra los 5 mejores blancos que proporcionan las correspondencias de la secuencia. Las secuencias nucleotidicas se traducen en todos los seis marcos y el marco sin codones de paro en el segmento correspondiente de la secuencia de la base de datos, se considera el blanco potencial. Esto a su vez, se confirma utilizando el programa BLAST tblastx, que traduce la secuencia del anticuerpo en todos los seis marcos, y compara aquellas traducciones con las secuencias nucleotidicas en la base de datos traducidas de manera dinamica en los seis marcos.
Las identidades son las correspondencias exactas de aminoacidos entre la secuencia del anticuerpo y la base de datos de la protema en toda la longitud de la secuencia. Los positivos (identidades + correspondencia de la sustitucion), no son identicos, sino sustituciones de aminoacidos guiadas por la matriz de sustitucion BLOSUM62. Si la secuencia del anticuerpo corresponde con dos de las secuencias de la base de datos con la misma identidad, se decidina que el blanco con mas positivos, es el blanco de la secuencia correspondiente.
Las secuencias de marco preferidas para utilizarse en los anticuerpos de la invencion, son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias de marco utilizadas por los anticuerpos seleccionados de la invencion, por ejemplo, similares a las secuencias de marco Vh 7-39, la secuencia de marco del gen H17 Vh II, la secuencia de marco de VH105 de la region Vh II, la secuencia de marco Vk 1-110, la secuencia de marco Vk 8-30 y/o las secuencias de marco Vk 24-140 utilizadas por los anticuerpos monoclonales preferidos de la invencion. Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 Vh, y las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 Vk, pueden injertarse en regiones del marco que tiene la secuencia identica a la encontrada en el gen de la inmunoglobulina de la lmea germinal, de la cual se deriva la secuencia del marco, o las secuencias CDR pueden injertarse en las regiones de marco que contienen una o mas mutaciones en comparacion con las secuencias de la lmea germinal. Por ejemplo, se ha encontrado que en ciertos casos, es benefico mutar residuos dentro de las regiones de marco para mantener o mejorar la capacidad de union del antfgeno del anticuerpo (veanse, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370, de Queen et al.).
Otro tipo de modificacion de region variable es mutar los residuos de aminoacidos dentro de las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 Vh y/o Vk, para mejorar, por lo tanto, una o mas propiedades de union (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interes. La mutagenesis dirigida al sitio o la mutagenesis mediada por PCR puede realizarse para
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introducir las mutaciones y el efecto en la union al anticuerpo, u otra propiedad funcional de interes, pueden evaluarse en ensayos in vitro o in vivo como se describe en la presente y se proporciona en los Ejemplos. De manera preferida, se introducen modificaciones conservadoras (como se discutio anteriormente). Alternativamente, em algunos ejemplos pueden realizarse modificaciones no conservadoras. Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o supresiones de los aminoacidos, pero son de manera preferida sustituciones. Ademas, tipicamente no mas de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una region CDR son alterados, aunque como sera apreciado por los expertos en la tecnica, pueden ser mayores las variantes en otras areas (por ejemplo las regiones de marco).
En consecuencia, en otra realizacion, la presente divulgacion proporciona anticuerpos monoclonales anti-Cadherina- 17 aislados, o porciones que se unen al antigeno de los mismos, que comprenden una region variable de cadena pesada, que comprende: (a) una region CDR1 Vh que comprende la SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacidos en comparacion con la SEQ ID NO: 4; (b) una region CDR2 Vh que comprende la SEQ ID NO: 8, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacidos en comparacion con la SEQ ID NO: 8; (c) una region CDR3 Vh que comprende la SEQ ID NO: 17, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacidos en comparacion con la SEQ ID NO: 17; (d) una region CDR1 Vk que comprende la SEQ ID NO: 24, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacidos en comparacion con la SEQ ID NO: 24; (e) una region CDR2 Vk que comprende la SEQ ID NOs: 30, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacidos en comparacion con la SEQ ID NO: 30; y (f) una region CDR3 Vk que comprende la SEQ ID NO: 34, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacidos en comparacion con la SEQ ID NO: 34.
Los anticuerpos disenados de la invencion incluyen aquellos en los cuales se han hecho modificaciones a los residuos del marco dentro de Vh y/o Vk, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Tfpicamente, tales medicaciones del marco se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque es “retromutar” uno o mas residuos del marco en la secuencia de la lmea germinal correspondiente. De manera mas espedfica, un anticuerpo que se ha sometido a mutacion somatica, puede contener residuos del marco que difieren de la secuencia de la lmea germinal de la cual se deriva el anticuerpo. Tales residuos pueden identificarse comparando las secuencias de marco del anticuerpo con las secuencias de la lmea germinal de las cuales se deriva el anticuerpo.
Otro tipo de modificacion del marco involucra mutar uno o mas residuos dentro de la region del marco, o incluso dentro de una o mas regiones CDR, para eliminar los epftopos de los linfocitos T para reducir por lo tanto la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este enfoque tambien es referido como “desinmunizacion”, y se describe con mayor detalle en la Publicacion de la Patente de E.U.A. No. 20030153043, de Carr et al.
Ademas o de manera alterna a las modificaciones hechas dentro de las regiones del marco o CDR, los anticuerpos de la invencion pueden disenarse para incluir modificaciones dentro de la region Fc, tfpicamente para alterar una o mas propiedades funcionales del anticuerpo, tales como vida media en suero, fijacion al complemento, union al receptor Fc y/o citotoxicidad celular dependiente del antfgeno. Ademas, un anticuerpo de la invencion puede modificarse qmmicamente (por ejemplo, una o mas porciones qrnmicas pueden unirse al anticuerpo), o modificarse para alterar su glucosilacion, nuevamente para alterar una o mas propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con mayor detalle a continuacion. La numeracion de los residuos en la region Fc es aquella del mdice de Kabat EU.
En una realizacion, la region de articulacion de CH1 se modifica de manera que el numero de residuos de cistema en la region de articulacion se altera, por ejemplo, se incrementa o se disminuye. Este enfoque se describe ademas en la Patente de E.U.A. No. 5,677,425, de Bodmer et al. El numero de residuos de cistema en la region de articulacion de CH1 se altera, por ejemplo, para facilitar el montaje de las cadenas ligera y pesada, o para incrementar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.
En otra realizacion, la region de articulacion Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la vida media biologica del anticuerpo. De manera mas espedfica, una o mas mutaciones de aminoacidos se introducen en la region de la
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interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento de articulacion Fc, de manera que el anticuerpo tiene una union danada a la protema A de Estafilococo (SpA) con relacion a la union a SpA del dominio de articulacion Fc nativo. Este enfoque se describe con mayor detalle en la Patente de E.U.A. No. 6,165,745, de Ward et al.
En otra realizacion, el anticuerpo se modifica para incrementar su vida media biologica. Varios enfoques son posibles. Por ejemplo, una o mas de las siguientes mutaciones pueden introducirse: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente de E.U.A. No. 6,277,375, de Ward. De manera alterna, para incrementar la vida media biologica, el anticuerpo puede alterarse dentro de la region CH1 o Cl para contener un epttopo de union al receptor silvestre, tomado de dos espiras de un dominio CH2 de una region Fc de una IgG, como se describe en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,869,046 y 6,121,022, por Presta et al.
En otra realizacion, el anticuerpo se produce como un UniCuerpo (UniBody), como se describe en la WO/2007/059782.
En aun otras realizaciones, la region Fc se altera reemplazando al menos un residuo de aminoacidos con un residuo de aminoacidos diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o mas aminoacidos seleccionados de los residuos de aminoacidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322, pueden reemplazarse con uno residuo de aminoacidos diferente, de manera que el anticuerpo tiene una afinidad alterada por un ligando efector, pero retiene la capacidad de union al antfgeno del anticuerpo original. El ligando efector al cual se altera la afinidad, puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con mayor detalle en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,624,821 y 5,648,260, ambas de Winter et al.
En otro ejemplo, uno o mas aminoacidos seleccionados de los residuos de aminoacidos 329, 331 y 322, pueden reemplazarse con un residuo de aminoacidos diferente, de manera que el anticuerpo tiene una union a C1q alterada y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o anulada. Este enfoque se describe con mayor detalle en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,194,551, por Idusogie et al.
En otro ejemplo, uno o mas residuos de aminoacidos dentro de las posiciones de aminoacidos 231 y 239 se alteran para alterar por lo tanto, la capacidad del anticuerpo para fijarse al complemento. Este enfoque se describe adicionalmente en la Publicacion del PCT WO 94/29351, por Bodmer et al.
En aun otro ejemplo, la region Fc se modifica para incrementar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y/o para incrementar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy modificando uno o mas aminoacidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301,
303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376,
378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Este enfoque se describe adicionalmente en
la Publicacion del PCT WO 00/42072, de Presta. Ademas, se han descrito los sitios de union en la IgG1 humana
para FcyR1, FcyRII, FcyRIII y FcRn, se han representado y las variantes con union mejorada (vease Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Las mutaciones espedficas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339, mostraron mejorar la union a FcyRIII. Ademas, los siguientes mutantes de combinacion mostraron mejorar la union a FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A. Variantes adicionales de ADCC se describen por ejemplo en WO2006/019447.
En aun otro ejemplo, la region Fc es modificada para aumentar la vida media del anticuerpo, en general para amentar la union al receptor FcRn, como se describe por ejemplo en la PCT/US2008/088053, US 7,371,826, US 7,670,600 y WO 97/34631.
En aun otra realizacion, la glucosilacion de un anticuerpo se modifica. Por ejemplo, puede hacerse un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilacion). La glucosilacion puede alterarse para, por ejemplo, incrementar la afinidad del anticuerpo por el antfgeno. Tales modificaciones del carbohidrato pueden lograrse, por ejemplo, alterando uno o mas sitios de glucosilacion dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, una o mas sustituciones de aminoacidos pueden hacerse, que resultan en la eliminacion de uno o mas sitios de glucosilacion de la region del marco variable para eliminar, por lo tanto, la glucosilacion en ese sitio. Tal aglucosilacion puede incrementar la afinidad del anticuerpo por el antfgeno. Tal enfoque se describe con mayor detalle en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,714,350 y 6,350,861, por Co et al. y puede efectuarse al remover la asparagina en la posicion 297.
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De manera adicional o alterna, puede hacerse un anticuerpo que tiene un tipo alterado de glucosilacion, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene estructuras GlcNac que se bisecan, incrementadas. Esto es denominado algunas veces en la tecnica como una “glucoforma de ingeniena”. Tales patrones de glucosilacion alterados han demostrado incrementar la capacidad ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones del carbohidrato pueden lograrse mediante, por ejemplo, la expresion del anticuerpo en una celula hospedera con una maquinaria de glucosilacion alterada. Las celulas con maquinana de glucosilacion alterada, se han descrito en la tecnica, y pueden utilizarse como celulas hospederas en las cuales se expresan los anticuerpos recombinantes de la invencion, para producir por lo tanto, un anticuerpo con glucosilacion alterada. Se hace referencia a la tecnologfa POTELLIGENT®. Por ejemplo, las lmeas celulares Ms704, Ms705 y Ms709, carecen del gen de fucosiltransferasa, FUT8 (alfa (1,6) fucosiltransferasa), de manera que los anticuerpos expresados en las lmeas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen de fucosa en sus carbohidratos. Las lmeas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 FUT8-/- se crearon por la ruptura seleccionada del gen FUT8 en las celulas CHO/DG44, utilizando dos vectores de reemplazo (vease la Publicacion de la Patente de E.U.A. No. 20040110704, por Yamane et al. y Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Como otro ejemplo, la EP 1,176,195, de Hanai et al., describe una lmea celular con un gen FUT8 roto funcionalmente, que codifica una fucosil transferasa, de manera que los anticuerpos expresados en tal lmea celular exhiben hipofucosilacion reduciendo o eliminando la enzima relacionada con el enlace alfa 1,6. Hanai et al., tambien describen lmeas celulares que tienen una actividad enzimatica baja para agregar la fucosa a la N-acetilglucosamina que se une a la region Fc del anticuerpo, o no tiene la actividad enzimatica, por ejemplo, la lmea celular de mieloma de rata, YB2/0 (ATCC CRL 1662). La Publicacion del PCT WO 03/035835, de Presta, describe una lmea celular CHO variante, celulas Lec13, con capacidad reducida para unir la fucosa a los carbohidratos enlazados a Asn(297), que resulta tambien en la hipofucosilacion de anticuerpos expresados en esa celula hospedera (vease tambien, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La Publicacion del PCT WO 99/54342, de Umana et al., describe lmeas celulares disenadas para expresar las glucosil transferasas que modifican la glucoprotema (por ejemplo, beta(1,4)-N- acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), de manera que los anticuerpos expresados en las lmeas celulares disenadas exhiben estructuras GlcNac que se bisecan incrementadas, lo que resulta en una actividad ADCC incrementada de los anticuerpos (vease tambien Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). De manera alterna, los residuos de fucosa del anticuerpo pueden escindirse utilizando una enzima fucosidasa. Por ejemplo, la fucosidasa alfa-L-fucosidasa elimina los residuos de fucosilo de los anticuerpos (Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).
Como alternativa, las glucoformas disenadas, particularmente la afucosilacion, puede realizarse usando inhibidores de molecula pequena de las enzimas de trayectoria de glucosilacion. Vease por ejemplo Rothman et al., Mol. Immunol. 26(12):113-1123 (1989); Elbein, FASEB J. 5:3055 (1991); PCT/US2009/042610 y la Patente de E.U.A. No. 7,700,321.
Otra modificacion de los anticuerpos de la presente que esta contemplada por la invencion es la pegilacion. Un anticuerpo puede pegilarse para, por ejemplo, incrementar la vida media biologica (por ejemplo, suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, tfpicamente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un ester o derivado de aldehfdo de PEG reactivo, bajo condiciones en las cuales uno o mas grupos PEG se unen al anticuerpo o al fragmento de anticuerpo. De manera preferida, la pegilacion se lleva a cabo a traves de una reaccion de acilacion, o una reaccion de alquilacion con una molecula de PEG reactiva (o un polfmero soluble en agua reactivo analogo). Como se utiliza en la presente, el termino “polietilenglicol”, pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivar otras protemas, tales como monoalcoxi o ariloxi-polietilenglicol de (C1-C10) o polietilenglicol-maleimida. En ciertas realizaciones, el anticuerpo a ser pegilado es un anticuerpo aglucosilado. Los metodos para la pegilacion de las protemas son conocidos en la tecnica, y pueden aplicarse a los anticuerpos de la invencion. Vease, por ejemplo, la EP 0 154 316, de Nishimura et al. y la EP 0 401 384, de Ishikawa et al.
En realizaciones adicionales, por ejemplo en el uso de los anticuerpos de la invencion para fines de diagnostico o deteccion, los anticuerpos pueden comprender una marca. Por “marcado” en la presente se entiende que un compuesto tiene al menos un elemento, isotopo o compuesto qmmico unido para permitir la deteccion del compuesto. En general, las marcas caen en tres clases: a) marcas isotopicas, que pueden ser radioactivas o isotopos pesados; b) magneticos, electricos, termicos; y c) tintes con color o luminiscentes; aunque las marcas incluyen enzimas y partmulas tales como partmulas magneticas tambien. Las marcas preferidas incluyen, pero no se limitan a, complejos de lantanido fluorescentes (incluyendo esos de Europio y Terbio), y marcas fluorescentes que
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incluyen, pero no se limitan a, puntos de cuantum, fluorescema, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, Malaquita verde, stilbeno, Amarillo Lucifer, Azul Cascada, Rojo Texas, los tintes Alexa, los tintes Cy, y otros descritos en la 6a Edicion del Molecular Probes Handbook por Richard P. Haugland.
Propiedades ffsicas del anticuerpo
Los anticuerpos de la presente invencion pueden caracterizarse ademas, por varias propiedades ffsicas de los anticuerpos anti-Cadherina-17. Pueden utilizarse varios ensayos para detectar y/o diferenciar las varias clases de anticuerpos, basandose en estas propiedades ffsicas.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invencion pueden contener uno o mas sitios de glucosilacion en la region variable de la cadena libera y pesada. La presencia de uno o mas sitios de glucosilacion en la region variable puede resultar en una inmunogenicidad incrementada del anticuerpo, o una alteracion del pK del anticuerpo, debido a una union al antigeno alterada (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA and Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). Se sabe que la glucosilacion ocurre en motivos que contienen una secuencia N-X-S/T. La glucosilacion de la region variable puede probarse utilizando un ensayo Glycoblot, que escinde el anticuerpo para producir un Fab, y a continuacion probar la glucosilacion utilizando un ensayo que mide la oxidacion del peryodato y la formacion de la base de Schiff. De manera alterna, la glucosilacion de la region variable puede probarse utilizando cromatograffa con luz Dionex (Dionex-LC), que escinde los sacaridos de un Fab a monosacaridos y analiza el contenido de sacaridos individual. En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo anti-Cadherina-17 que no contenga la glucosilacion de la region variable. Esto puede lograrse seleccionando los anticuerpos que no contienen el motivo de glucosilacion en la region variable o mutando los residuos dentro del motivo de glucosilacion utilizando tecnicas estandar bien conocidas en el campo.
En una realizacion preferida, los anticuerpos de la presente invencion no contienen sitios de isomerismo de asparagina. Puede ocurrir un efecto de desamidacion o del acido isoaspartico en las secuencias N-G o D-G, respectivamente. El efecto de desamidacion o del acido isoaspartico resulta en la creacion de acido isoaspartico que disminuye la estabilidad de un anticuerpo, creando una estructura burda de cadena lateral del termino carboxi, mas que en la cadena principal. La creacion de un acido isoaspartico puede medirse utilizando un ensayo iso-quant, que utiliza HPLC en fase inversa para probar el acido isoaspartico.
Cada anticuerpo tendra un punto isoelectrico (pi) unico, pero generalmente los anticuerpos caeran en el intervalo de pH de entre 6 y 9.5. El pi para un anticuerpo de IgG1 tipicamente cae dentro del intervalo de pH de 7-9.5 y el pi para un anticuerpo de IgG4 tipicamente cae dentro del intervalo de pH de 6-8. Los anticuerpos pueden tener un pi que esta fuera de este intervalo. Aunque los efectos son generalmente desconocidos, existe la especulacion de que los anticuerpos con un pi fuera del intervalo normal pueden tener algo de desplegado e inestabilidad bajo condiciones in vivo. El punto isoelectrico puede probarse utilizando un ensayo de enfoque isoelectrico capilar, que crea un gradiente de pH y puede utilizar enfoque laser para la exactitud incrementada (Janini et al (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67). En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo anti-Cadherina-17 que contenga un valor de pi que caiga en el intervalo normal. Esto puede lograrse ya sea seleccionando los anticuerpos con un pi en el intervalo normal, o mutando los residuos de la superficie cargada utilizando tecnicas estandar bien conocidas en el campo.
Cada anticuerpo tendra una temperatura de fusion que es indicativa de la estabilidad termica (Krishnamurthy R y Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Una estabilidad termica mas alta, indica mayor estabilidad general del anticuerpo in vivo. El punto de fusion de un anticuerpo puede medirse utilizando tecnicas tales como calorimetna con exploracion diferencial (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52). Tm1 indica la temperatura del desplegado inicial del anticuerpo. Tm2 indica la temperatura del desplegado completo del anticuerpo. Generalmente, se prefiere que la Tm1 de un anticuerpo de la presente invencion sea mayor que 60°C, de manera preferida, mayor que 65°C, aun de manera mas preferida, mayor que 70°C. De manera alterna, la estabilidad termica de un anticuerpo puede medirse utilizando dicrofsmo circular (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).
En una realizacion preferida, los anticuerpos se seleccionan para que no se degraden rapidamente. La
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fragmentacion de un anticuerpo anti-Cadherina-17 puede medirse utilizando electroforesis capilar (CE) y MALDI-MS, como es bien entendido en la tecnica (Alexander AJ y Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
En otra realizacion preferida, se seleccionan anticuerpos que tengan efectos de agregacion mmimos. La agregacion puede conducir al desencadenamiento de una respuesta inmune indeseada y/o a propiedades farmacocineticas alteradas o desfavorables. Generalmente, los anticuerpos son aceptables con una agregacion de 25% o menos, de manera preferida 20% o menos, aun de manera mas preferida 15% o menos, aun de manera mas preferida 10% o menos y aun de manera mas preferida 5% o menos. La agregacion puede medirse mediante varias tecnicas bien conocidas en el campo, incluyendo cromatograffa lfquida de alto desempeno (HPLC) en columna con exclusion de tamano (SEC), y dispersion de la luz para identificar los monomeros, dfmeros, tnmeros o multimeros.
Metodos para disenar los anticuerpos
Como se discutio anteriormente, los anticuerpos anti-Cadherina-17 tienen secuencias Vh y Vk descritas en la presente, que pueden utilizarse para crear nuevos anticuerpos anti-Cadherina-17, modificando las secuencias Vh y/o Vk, o las regiones constantes unidas a las mismas. Asf, en otro aspecto de la invencion, las caractensticas estructurales de un anticuerpo anti-Cadherina-17 de la invencion, por ejemplo, PTA001_A4, se utilizan para crear anticuerpos anti-Cadherina-17 relacionados estructuralmente, que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invencion, tal como la union a Cadherina-17 humana. Por ejemplo, una o mas regiones CDR de PTA001_A4, o mutaciones de las mismas, pueden combinarse de manera recombinante con las regiones de marco y/u otras CDR para crear anticuerpos anti-Cadherina-17 disenados de manera recombinante, adicionales, de la invencion, como se discutio anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen aquellas descritas en la seccion previa. La materia prima para el metodo de diseno es una o mas de las secuencias Vh y/o Vk proporcionadas en la presente, o una o mas regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo disenado, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una protema), un anticuerpo que tenga una o mas secuencias Vh y/o Vk proporcionadas en la presente, o una o mas regiones CDR de las mismas. En su lugar, la informacion contenida en las secuencias, se utiliza como la materia prima para crear una secuencia de “segunda generacion” derivada de la secuencia original, y a continuacion la secuencia de la “segunda generacion” se prepara y expresa como una protema.
Tambien se divulga un metodo para preparar un anticuerpo anti-Cadherina-17 que comprende:
proporcionar: (i) una secuencia del anticuerpo de la region variable de cadena pesada que comprende una secuencia CDR1 seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1-4, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 5-13, y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 14-21; y/o (ii) una secuencia del anticuerpo de la region variable de cadena ligera que comprende una secuencia CDR1 seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 22-27, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 28-31, y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 32-34;
alterar al menos un residuo de aminoacidos dentro de la secuencia del anticuerpo de la region variable de cadena pesada y/o la secuencia del anticuerpo de la region variable de cadena ligera, para crear al menos una secuencia del anticuerpo alterado; y
expresar la secuencia del anticuerpo alterada como una protema.
Pueden utilizarse tecnicas de biologfa molecular estandar para preparar y expresar la secuencia del anticuerpo alterada.
De manera preferida, el anticuerpo codificado por la secuencia del anticuerpo alterada, es uno que retiene una, algunas o todas de las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-Cadherina-17 descritos en la presente, propiedades funcionales las cuales incluyen, de manera no exclusiva:
unirse a Cadherina-17 humana con una Kd de 1x10'7 M o menos;
unirse a las celulas CHO humanas transfectadas con Cadherina-17.
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Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden valorarse utilizando ensayos estandar disponibles en la tecnica y/o descritos en la presente, tales como aquellos expuestos en los Ejemplos (por ejemplo, citometna de flujo, ensayos de union).
En ciertas realizaciones de los metodos para disenar los anticuerpos de la invencion, pueden introducirse mutaciones de manera aleatoria o selectiva en toda o parte de una secuencia que codifica un anticuerpo anti- Cadherina-17 y los anticuerpos anti-Cadherina-17 modificados resultantes, pueden seleccionarse para la actividad de union y/u otras propiedades funcionales como se describe en la presente. Los metodos mutacionales se han descrito en la tecnica. Por ejemplo, la Publicacion del PCT WO 02/092780, de Short, describe metodos para crear y seleccionar mutaciones del anticuerpo utilizando mutagenesis con saturacion, montaje de ligadura sintetica o una combinacion de los mismos. De manera alterna, la Publicacion del PCT WO 03/074679, de Lazar et al., describe metodos para utilizar metodos de seleccion computacionales para optimizar las propiedades fisicoqmmicas de los anticuerpos.
Moleculas de acido nucleico que codifican los anticuerpos de la invencion
Otro aspecto de la invencion pertenece a las moleculas de acido nucleico que codifican los anticuerpos de la invencion. Los acidos nucleicos pueden estar presentes en las celulas completas, en un lisado celular, o en una forma modificada parcialmente o sustancialmente pura. Un acido nucleico esta “aislado” o “se vuelve sustancialmente puro” cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros acidos nucleicos o protemas celulares, mediante tecnicas estandar, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, formacion de bandas con CsCl, cromatograffa en columna, electroforesis sobre gel de agarosa y otras bien conocidas en la tecnica. Vease, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Un acido nucleico de la invencion puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y puede o no contener secuencias intronicas. En una realizacion preferida, el acido nucleico es una molecula de ADNc.
Los acidos nucleicos de la invencion pueden obtenerse utilizando tecnicas de biologfa molecular estandar. Para los anticuerpos expresados por los hibridomas, los ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo, hechas por el hibridoma, pueden obtenerse mediante tecnicas estandar de amplificacion con PCR o clonacion del ADNc. Para los anticuerpos obtenidos de una biblioteca de genes de inmunoglobulina (por ejemplo, utilizando tecnicas de representacion del fago), los acidos nucleicos que codifican el anticuerpo, pueden recuperarse de la biblioteca.
Las moleculas de acidos nucleicos de la invencion, son aquellas que codifican las secuencias Vh y Vl del anticuerpo monoclonal PTA001_A4. Tambien se divulgan moleculas de acidos de acidos nucleicos que codifican las secuencias Vh y Vl de los anticuerpos monoclonales PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 o PTA001_A14. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias Vh de PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 o PTA001_A14, se muestran en las SEQ ID NOs: 59-70. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias Vk de PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 o PTA001_A14, se muestran en las SEQ ID NOs: 71-83.
Otros acidos nucleicos de la divulgacion, son acidos nucleicos que tienen al menos 80% de identidad de la secuencia, tal como al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de la secuencia, con una de las secuencias mostradas en las SEQ ID NOs: 59-83, acidos nucleicos los cuales codifican un anticuerpo de la divulgacion, o una porcion que se une al antfgeno del mismo.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de acidos nucleicos es el numero de posiciones en la secuencia en las cuales el nucleotido es identico, tomando en cuenta el numero de huecos y la longitud de cada hueco, que necesitan introducirse para la alineacion optima de las dos secuencias. La comparacion de las secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse utilizando un algoritmo matematico, tal como el algoritmo de Meyers y Miller o el programa XBLAST de Altschul descrito anteriormente.
Todaa traves de mas, los acidos nucleicos preferidos de la divulgacion comprenden una o mas porciones que
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codifican a CDR de las secuencias de acidos nucleicos mostradas en las SEQ ID NOs: 59-83. En este ejemplo, el acido nucleico puede codificar la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de cadena pesada de PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 o PTA001_A14, o la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera de PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 o PTA001_A14.
Los acidos nucleicos que tienen al menos 80%, tal como al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de la secuencia, con tal porcion que codifica a CDR de las SEQ ID NO: 59-83 (secuencias Vh y Vk), tambien son los acidos nucleicos preferidos de la divulgacion. Tales acidos nucleicos pueden diferir de la porcion correspondiente de las SEQ ID NO: 59-83 en una region que codifica una porcion que no es CDR y/o en una porcion que codifica CDR. En donde la diferencia esta en una region que codifica CDR, la region CDR del acido nucleico codificada por el acido nucleico, tfpicamente comprende una o mas modificaciones conservadoras de la secuencia como se definio en la presente, en comparacion con la secuencia CDR correspondiente de PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 o PTA001_A14.
Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican los segmentos Vh y Vk, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente mediante tecnicas de ADN recombinante estandar, por ejemplo, para convertir los genes de la region variable a los de la cadena del anticuerpo de longitud completa, a genes del fragmento Fab o a un gen scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica Vk- o Vh- esta enlazado de manera operable a otro fragmento de ADN que codifica otra protefna, tal como una region constante del anticuerpo o un enlazante flexible. El termino “enlazado de manera operable”, como se utiliza en este contexto, pretende significar que dos fragmentos de ADN se unen de manera que las secuencias de aminoacidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en el marco.
El ADN aislado que codifica la region Vh puede convertirse a un gen de cadena pesada de longitud completa enlazado de manera operable al ADN que codifica VH a otra molecula de ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de los genes de la region constante de cadena pesada de murino, se conocen en la tecnica (vease, por ejemplo, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, Departamento de Salud y Servicios Humanos de E.U.A., Publicacion NIH No. 91-3242), y los fragmentos de ADN que codifican estas regiones, pueden obtenerse mediante amplificacion con PCR estandar. La region constante de cadena pesada puede ser una region constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero de manera mas preferida, es una region constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de la cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica Vh puede enlazarse de manera operable a otra molecula de ADN que codifica solo la region constante CH1 de cadena pesada.
El ADN aislado que codifica la region Vl /Vk puede convertirse a un gen de cadena ligera de longitud completa (asf como un gen de cadena ligera Fab) enlazando de manera operable el ADN que codifica Vl a otra molecula de ADN que codifica la region constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de la region constante de cadena ligera de murino se conocen en la tecnica (vease, por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, Departamento de Salud y Servicios Humanos de E.U.A., Publicacion NIH No. 91-3242), y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificacion con PCR estandar. En las realizaciones preferidas, la region constante de cadena ligera puede ser una region constante kappa o lambda.
Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican a Vh- y Vl / Vk se enlazan de manera operable a otro fragmento que codifica un enlazante flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoacidos (Gly4 -Ser)3, de manera que las secuencias Vh y Vl / Vk pueden expresarse como una protefna de una sola cadena contigua, con las regiones Vl / Vk y Vh unidas por el enlazante flexible (vease, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426: Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).
Produccion de los anticuerpos monoclonales
De acuerdo con la invencion la Cadherina-17 o un fragmento o derivado del mismo puede ser usado como un immunogen para generar anticuerpos que se unen inmuno-especfficamente a tal immunogen. Tales inmunogenes
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pueden ser aislados por cualquier medio conveniente. Un experto en la tecnica reconocera que estan disponibles muchos procedimientos para la produccion de anticuerpos, por ejemplo, como se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Cold Spring Harbor, N.Y. Un experto en la tecnica tambien apreciara que los fragmentos de union o fragmentos Fab que imitan los anticuerpos tambien pueden ser preparados de informacion genetica por diversos procedimientos (Antibody Engineering: A Practical Approach (Borrebaeck, C., ed.), 1995, Oxford University Press, Oxford; J. Immunol. 149, 3914-3920 (1992)).
En una realizacion de la invencion, se producen anticuerpos para un dominio espedfico de Cadherina-17. En una realizacion espedfica, los fragmentos hidrofflicos de Cadherina-17 son usados como inmunogenes para la produccion de anticuerpos.
En la produccion de anticuerpos, la seleccion del anticuerpo deseado puede efectuarse por tecnicas conocidas en el campo, por ejemplo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima). Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen un dominio espedfico de Cadherina-17, se pueden ensayar hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento de Cadherina-17 que contiene dicho dominio. Para la seleccion de un anticuerpo que espedficamente se une a un primer homologo de Cadherina-17 pero que no se une espedficamente a (o se une menos avidamente a) un segundo homologo de Cadherina-17, se puede seleccionar con base en la union positiva al primer homologo de Cadherina-17 y una carencia de union a (o union reducida al) segundo homologo de Cadherina- 17. De igual manera, para la seleccion de un anticuerpo que espedficamente se une a Cadherina-17 pero que no se une espedficamente a (o se une menos avidamente a) un isoformo diferente de la misma protema (tal como una glucoforma diferente que tiene el mismo peptido de nucleo que la Cadherina-17), se puede seleccionar con base en la union positiva a la Cadherina-17 y una carencia de union a (o union reducida a) el diferente isoformo (por ejemplo una glucoforma diferente). Entonces, la presente invencion proporciona un anticuerpo (tal como un anticuerpo monoclonal) que se une con mayor afinidad (por ejemplo al menos 2 veces, tal como al menos 5 veces, particularmente al menos 10 veces mayor afinidad) a la Cadherina-17 que a un diferente isoformo o isoformos (por ejemplo glucoformas) de la Cadherina-17.
Los anticuerpos policlonales que pueden ser usados en los metodos descritos son poblaciones heterogeneas de moleculas de anticuerpo derivadas de suero de animales inmunizados. Tambien puede usarse suero inmune no fraccionado. Diversos procedimientos conocidos en la tecnica pueden ser usados para la produccion de anticuerpos policlonales a la Cadherina-17, un fragmento de la Cadherina-17, un polipeptido relacionado a Cadherina-17, o un fragmento de un polipeptido relacionado a la Cadherina-17. Por ejemplo, una manera es purificar polipeptidos de interes o sintentizar los polipeptidos de interes usando, por ejemplo metodos de smtesis en la fase solida bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol. Vol 182 (1990); Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields ed., Meth. Enzymol. Vol 289 (1997); Kiso et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 38: 1192-99, 1990; Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 1: 255-60, 1995; Fujiwara et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 44: 1326-31, 1996. Los polipeptidos seleccionados pueden entonces ser usados para inmunizar por inyeccion varios animales hospederos, incluyendo pero no limitado a conejos, ratones, ratas, etc., para generar anticuerpos policlonales o monoclonales. Diversos adyuvantes (es decir, inmunoestimulantes) pueden ser usados para mejorar la respuesta inmunologica, dependiendo de las especies hospederas, incluyendo, pero no limitado a, adyuvante de Freund completo o incompleto, un gel mineral tal como hidroxido de aluminio, sustancias de superficie activa tales como lisolecitina, poliol pluronico, un polianion, un peptido, una emulsion de aceite, hemocianida de linfo de cerradura, dinitrofenol, y un adyuvante tal como BCG (bacilo Calmette-Guerin) o corynebacterium parvum. Adyuvantes adicionales tambien son bien conocidos en la tecnica.
Para la preparacion de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos hacia Cadherina-17, puede usarse cualquier tecnica que proporcione la produccion de moleculas de anticuerpo por lmeas celulares contmuas en cultivo. Por ejemplo, la tecnica del hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495, asf como la tecnica del trioma, la tecnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), y la tecnica del EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de los mismos. El hibridoma que produce los anticuerpos monoclonales puede ser cultivado in vitro o in vivo. En una realizacion adicional de la invencion, los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos en animales libres de germenes utilizando tecnologfa conocida
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(PCT/US90/02545).
El sistema animal preferido para preparar los hibridomas es el sistema murino. La produccion del hibridoma en el raton es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y tecnicas de inmunizacion para el aislamiento de los esplenocitos inmunizados para la fusion son conocidos en la tecnica. Los companeros de fusion (por ejemplo, celulas de mieloma murino) y los procedimientos de fusion tambien son conocidos.
Los anticuerpos monoclonales incluyen pero no se limitan a anticuerpos monoclonales humanos y anticuerpos monoclonales quimericos (por ejemplo quimeras de humano-raton).
Los anticuerpos quimericos o humanizados de la presente invencion pueden prepararse basandose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal no humano preparado como se describio anteriormente. La codificacion del ADN de las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera puede obtenerse del hibridoma no humano de interes y disenarse para contener secuencias de inmunoglobulina no murina (por ejemplo, humana), utilizando tecnicas de biologfa molecular estandar. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimerico, las regiones variables murinas pueden enlazarse a las regiones constantes humanas utilizando metodos conocidos en la tecnica (vease por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 4,816,567, de Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR murinas pueden insertarse en un marco humano utilizando metodos conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,225,539, de Winter, y las Patentes de E.U.A. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370, de Queen et al.).
Los anticuerpos completamente humanos pueden generarse utilizando ratones transgenicos o transcromosomicos que pueden expresar los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina endogena, pero que pueden expresar genes de cadena pesada y ligera humanos. Los ratones trangenicos son imunizados de la manera normal con un antfgeno seleccionado, por ejemplo toda o una porcion de Cadherina-17. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antfgeno pueden ser obtenidos usando tecnologfa de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana portados por el raton transgenico se rearreglan durante la diferenciacion de los linfocitos B, y posteriormente se someten a conmutacion de clase y mutacion somatica. Entonces, usando dicha tencica, es posible producir anticuerpos terapeuticamente utiles IgG, IgA, IgM y IgE. Estos ratones transgenicos y transcromosomicos incluyen ratones referidos en la presente como ratones de las razas HuMAb Mouse® (Medarex® Inc) y KM Mouse®. La raza HuMAb Mouse® (Medarex®, Inc.), se describe en Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para una discusion detallada de esta tecnologfa para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y los protocolos para producir tales anticuerpos, vease por ejemplo la Patente de E.U.A 5,625,126; la Patente de E.U.A 5,633,425; la Patente de E.U.A 5,569,825; la Patente de E.U.A 5,661,016; y la Patente de E.U.A 5,545,806. La raza KM mouse® strain se refiere a un raton que porta un transgen de cadena pesada humano y un transcromosoma de cadena ligera humano y se describe a detalle en la Publicacion PCT WO 02/43478 de Ishida et al.
Todavfa ademas, los sistemas de animales transgenicos alternos que expresan los genes de la inmunoglobulina humana, estan disponibles en la tecnica, y pueden utilizarse para crear anticuerpos anti-Cadherina-17 de la invencion. Por ejemplo, un sistema transgenico alterno referido el Xenomouse (Amgen, Inc.) puede utilizarse; tal raton se describe en, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 y 6,162,963, de Kucherlapati et al.
Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epttopo seleccionado pueden generarse usando una tecnica denominada como “seleccion guiada”. En este enfoque se usa un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo un anticuerpo de raton, para guiar la seleccion de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epftopo. (Jespers et al. (1994) Bio/technology 12:899-903).
Ademas, los sistemas de animales transcromosomicos alternos que expresan los genes de la inmunoglobulina humana, estan disponibles en la tecnica, y pueden utilizarse para crear anticuerpos anti-Cadherina-17. Por ejemplo, pueden utilizarse los ratones que portan el transcromosoma de la cadena pesada humana y un transcromosoma de la cadena ligera humana, referidos como “raton TC”; tales ratones se describen en Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Ademas, se han descrito en la tecnica, vacas que portan los transcromosomas de la cadena pesada y ligera (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) y la solicitud del PCT No. WO/2002/092812, y pueden utilizarse para crear anticuerpos anti-Cadherina-17 de la invencion.
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Los anticuerpos monoclonales humanos de la invencion tambien pueden prepararse utilizando ratones SCID en los cuales las celulas inmunes humanas se han reconstituido, de manera que puede generarse una respuesta al anticuerpo humano tras la inmunizacion. Tales ratones se describen, por ejemplo, en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,476,996 y 5,698,767, de Wilson et al.
Los anticuerpos de la presente invencion pueden ser generados por el uso de tecnologfa de despliegue de fagos para producir y seleccionar bibliotecas de polipeptidos para unirse a un objetivo seleccionado. Vease por ejemplo Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-82, 1990; Devlin et al., Science 249, 404-6, 1990, Scott and Smith, Science 249, 386-88, 1990; y Ladner et al., Patente de E.U.A. No. 5,571,698. Un concepto basico de los metodos de despliegue de fagos es el establecimiento de una asociacion ffsica entre el ADN que codifica un polipeptido a ser seleccionado y el polipeptido. Esta asociacion ffsica es proporcionada por la partpfcula del fago, que despliega un polipeptido como parte de un capsido que encierra al genoma del fago que codifica al polipeptido. El establecimiento de una asociacion ffsica entre polipeptidos y su material genetico permite una seleccion simultanea de masa de grandes numeros de fagos que portan diferentes polipeptidos. Un fago que despliega un polipeptido con afinidad a un objetivo se une al objetivo y este fago es enriquecido por seleccion de afinidad al objetivo. La identidad de los polipeptidos desplegados de estos fagos puede ser determinada de sus respetivos genomas. Usando estos metodos un polipeptido identificado como teniendo una afinidad de union por un objetivo deseado puede entonces ser sintetizado a granel en medios convencionales. Vease por ejemplo la Patente de E.U.A No. 6,057,098. En particular, tal fago puede ser utilizado para desplegar un dominio de union a antfgeno expresado de un repertorio o biblioteca de anticuerpo combinatorial (por ejemplo humano o murino). Un fago que expresa un domino de union a antfgeno que se une al antfgeno de interes puede ser seleccionado o identificado con el antfgeno, por ejemplo usando un antfgeno marcado o antfgeno unido o capturado en una superficie solida o perla. El fago usado en estos metodos es tfpicamente un fago filamentoso incluyendo dominios de union fd y M13 expresados de fagos con Fab, Fv o dominios de anticuerpo Fv estabilizados con bisulfuro recombinantemente fusionados a la protema del gen III o gen VIII del fago. Los metodos de despliegue de fago que pueden ser usados para formar los anticuerpos de la presente invencion incluyen esos descritos en Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); Solicitud PCT No. PCT/GB91/01134; Publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y Patentes de E.U.A. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108.
Como se describe en las referencias anteriores, despues de la seleccion del fago, las regiones codificadoras del anticuerpo del fago pueden ser aisladas y usadas para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de union a antfgeno deseado, y expresado en cualquier hospedera deseado, incluyendo celulas de mamffero, celulas de insectos, celulas de plantas, levadura, y bacterias, por ejemplo como se describe a detalle a continuacion. Por ejemplo, las tecnicas para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 tambien pueden ser empleadas usando metodos conocidos en la tecnica tales como esos descritos en la publicacion PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); y Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); y Better et al., Science 240:1041-1043 (1988).
Ejemplos de tecnicas que pueden ser usadas para producir Fvs de una sola cadena y anticuerpos incluyen esos descritos en las Patentes de E.U.A. 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al., Metodos in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).
La invencion proporciona fragmentos funcionalmente activos, derivados o analogos de las moleculas de inmunoglobulina de anti-Cadherina-17. Funcionalmente active significa que el fragmento, derivado o analogo es capaz de producir anticuerpos anti-anti-idiotipo (es decir, anticuerpos terciarios) que reconocen el mismo antfgeno que es reconocido por el anticuerpo del cual se deriva el fragmento, derivado o analogo. Espedficamente, en una realizacion particular la antigenocidad del idiotipo de la molecula de inmunoglobulina puede ser mejorado por delecion del marco y las secuencias CDR que son C-terminales a la secuencia de CDR que espedficamente reconoce el antfgeno. Para determinar cuales secuencias de CDR se unen al antfgeno, peptidos sinteticos que contienen las secuencias de CDR pueden ser usados en ensayos de union con el antfgeno por cualquier metodo de ensayo de union conocido en la tecnica.
La presente invencion proporciona fragmentos de anticuerpo tales como, pero no limitados a, fragmentos F(ab')2 y
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fragmentos Fab. Los fragmentos de anticuerpo que reconocen epttopos espedficos pueden ser generados por tecnicas conocidas. Los fragmentos F(ab')2 consisten de la region variable, la region constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada y son generados por digestion de pepsina de la molecula de anticuerpo. Los fragmentos Fab son generados al reducir los puentes bisulfuroi de los fragmentos F(ab')2. La invencion tambien proporciona dfmeros de cadena pesada y cadena ligera de los anticuerpos de la invencion, o cualquier fragmento mmimo del mismo tal como Fvs o anticuerpos de una sola cadena (SCAs) (por ejemplo como se describe en la Patente de E.U.A. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:544-54), o cualquiera otra molecula con la misma especificidad que el anticuerpo de la invencion. Los anticuerpos de una sola cadena son formados por el enlace de los fragmentos de cadena pesada y ligera de la region Fv a traves de un puente aminoacido, que resulta en un polipeptido de cadena simple. Las tecnicas para el ensamble de fragmentos Fv funcionales en E. coli pueden ser usados (Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
En otras realizaciones, la invencion proporciona protemas de fusion de las inmunoglobulinas de la invencion (o fragmentos funcionalmente activos de las mismas), por ejemplo en donde la inmunoglobulina es fusionada a traves de un enlace covalente (por ejemplo un enlace de peptido), en cualquiera del extremo N o el extremo C a una secuencia de aminoacidos de otra protema (o porcion de la misma, preferiblemente una porcion de al menos 10, 20 o 50 aminoacidos de la protema) que no es la inmunoglobulina. Preferiblemente la inmunoglobulina, o fragmento de la misma, esta enlazada covalentemente a otra protema en el extremo N del dominio constante. Como se establecio anteriormente, tales protemas de fusion pueden facilitar la purificacion, aumentar la vida media in vivo, y mejorar el suministro de un antfgeno a traves de una barrera epitelial al sistema inmune.
Las inmunoglobulinas de la invencion incluyen analogos y derivados que estan modificados, es decir, por la union covalente de cualquier tipo de molecula en tanto que esa union covalente no deteriore la union inmunoespedfica. Por ejemplo, pero no a manera de limitacion, los derivados y analogos de las inmunoglobulinas incluyen esos que han sido modificados adicionalmente, por ejemplo por glucosilacion, acetilacion, pegilacion, fosfilacion, amidacion, derivatizacion por grupos conocidos protectores/bloqueadores, disociacion proteolttica, enlace a un ligando celular u otra protema, etc. Cualquiera de numerosas modificaciones qmmicas puede ser realizada por tecnicas conocidas, incluyendo, pero no limitadas a disociacion qmmica espedfica, acetilacion, formilacion, etc. Adicionalmente, el analogo o derivado puede contener uno o mas aminoacidos no clasicos.
Inmunizacion de ratones
Los ratones pueden inmunizarse con una preparacion purificada o enriquecida de antfgeno de Cadherina-17 y/o Cadherina-17 recombinante, o celulas que expresan a Cadherina-17. De manera preferida, los ratones seran de 616 semanas de edad tras la primera infusion. Por ejemplo, una preparacion purificada o recombinante (100 |jg) del antfgeno Cadherina-17 puede utilizarse para inmunizar al raton con Ig humana intraperitonealmente.
La experiencia acumulativa con diversos antfgenos ha mostrado que los ratones responden cuando se inmunizan intraperitonealmente (IP) con el antfgeno en adyuvante completo de Freund. Sin embargo, los adyuvantes diferentes a Freund tambien se encuentran que son efectivos. Ademas, se encuentra que las celulas completas, en la ausencia del adyuvante son altamente inmunogenicas. La respuesta inmune puede verificarse durante el curso del protocolo de inmunizacion con muestras de plasma que se obtienen mediante sangrados retroorbitales. El plasma puede seleccionarse mediante ELISA (como se describe a continuacion), para probar valoraciones satisfactorias. Los ratones pueden reforzarse intravenosamente con el antfgeno por 3 dfas consecutivos antes del sacrificio y el retiro del bazo realizandose 5 dfas despues. En una realizacion, pueden utilizarse las razas de raton a/J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Me).
Generacion de transfectomas que producen los anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos de la invencion tambien pueden producirse en un transfectoma de una celula hospedera utilizando, por ejemplo, una combinacion de tecnicas de ADN recombinante y metodos de transfeccion del gen como es bien conocido en la tecnica (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o los fragmentos del anticuerpo de los mismos, los ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa, pueden obtenerse mediante tecnicas de biologfa
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molecular estandar (por ejemplo, amplificacion con PCR o clonacion de ADNc utilizando un hibridoma que exprese el anticuerpo de interes), y los ADN pueden insertarse en los vectores de expresion, de manera que los genes estan enlazados de manera operable a las secuencias de control transcripcional y traduccional. En este contexto, el termino “enlazado de manera operable”, pretende significar que un gen del anticuerpo se liga a un vector de manera que las secuencias de control transcripcional y traduccional dentro del vector, sirven para su fusion pretendida de regular la transcripcion y traduccion del gen del anticuerpo. El vector de expresion y las secuencias de control de la expresion se eligen para ser compatibles con la expresion de la celula hospedera utilizada.
La celula hospedera puede ser cotransfectada con dos vectores de expresion de la invencion, el primer vector codificando un polipeptido derivado de cadena pesada y el segundo vector codificando un polipeptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables identicos que permiten la misma expresion de los polipeptidos de cadena pesada y ligera. Como alternativa, puede usarse un solo vector que codifica ambos polipeptidos de cadena pesada y ligera. En dichas situaciones, la cadena ligera debe colocarse antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre toxica (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197). Las secuencias codificadoras para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genomico.
Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresion mediante metodos estandar (por ejemplo, ligadura de los sitios de restriccion complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y el vector, o ligadura con extremo romo si no hay presentes sitios de restriccion). Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente, pueden utilizarse para crear genes del anticuerpo de longitud completa de cualquier isotipo del anticuerpo, insertandolos en los vectores de expresion que ya codifican las regiones contantes de cadena pesada y constante de cadena ligera del isotipo deseado, de manera que el segmento Vh esta enlazado de manera operable al segmento Ch dentro del vector, y el segmento Vk esta enlazado de manera operable al segmento Cl dentro del vector. De manera adicional o alterna, el vector de expresion recombinante puede codificar un peptido de senal que facilita la secrecion de la cadena del anticuerpo de una celula hospedera. El gen de la cadena del anticuerpo puede clonarse en el vector, de manera que el peptido de senal esta enlazado en el marco al termino amino del gen de la cadena del anticuerpo. El peptido de senal puede ser un peptido de senal de inmunoglobulina o un peptido de senal heterologo (es decir, un peptido de senal de una protema que no es inmunoglobulina).
Ademas de los genes de la cadena del anticuerpo, los vectores de expresion recombinante de la invencion portan secuencias reguladoras que controlan la expresion de los genes de la cadena del anticuerpo en una celula hospedera. El termino “secuencia reguladora” pretende incluir promotores, mejoradores y otros elementos de control de la expresion (por ejemplo, senales de poliadenilacion) que controlan la transcripcion o traduccion de los genes de la cadena del anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Se apreciara por aquellos con experiencia en la tecnica, que el diseno del vector de expresion, incluyendo la seleccion de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la eleccion de la celula hospedera a ser transformada, el nivel de expresion de la protema deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresion de las celulas hospederas de mairnfero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresion de la protema en las celulas de mamffero, tales como promotores y/o mejoradores derivados del citomegalovirus (CMV), Virus Simiano 40 (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotortardm mayor del adenovirus (AdMLP) y el polioma. De manera alterna, pueden utilizarse secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina y el promotor de p-globina. Todaa traves de mas, los elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRa, que contiene secuencias del promotor temprano SV40 y la repeticion de terminal larga del tipo 1 del virus de la leucemia de los linfocitos T humana (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
Ademas de los genes de la cadena del anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresion recombinantes de la invencion pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicacion del vector en las celulas hospederas (por ejemplo, ongenes de replicacion) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la seleccion de las celulas hospederas en las cuales se ha introducido el vector (veanse, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, tfpicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a los farmacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una celula hospedera en la cual se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para utilizarse en celulas hospederas de dhfr con seleccion/amplificacion con metotrexato), y el neo gen (para la seleccion con G418).
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Para la expresion de las cadenas ligera y pesada, los vectores de expresion que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan en una celula hospedera mediante tecnicas estandar. Las diversas formas del termino “transfeccion” pretenden abarcar una amplia variedad de tecnicas utilizadas comunmente para la introduccion del ADN exogeno en una celula hospedera procariotica o eucariotica, por ejemplo, electroporacion, precipitacion con fosfato de calcio, transfeccion con DEAE-dextrano y lo similar. Aunque es teoricamente posible expresar los anticuerpos de la invencion en celulas hospederas procarioticas o eucarioticas, la expresion de los anticuerpos en celulas eucarioticas, y de manera mas preferida en celulas hospederas de mairnfero, es mas preferida, debido a que tales celulas eucarioticas, y en particular las celulas de marnffero, tienen mas probabilidad que las celulas procarioticas de montarse y secretar un anticuerpo doblado de manera apropiada e inmunologicamente activo. La expresion procariotica de los genes del anticuerpo se ha reportado como inefectiva para la produccion de altos rendimientos de un anticuerpo activo (Boss, M. A. y Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
Las celulas hospederas de marnffero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invencion incluyen celulas de Ovario de Hamster Chino (celulas CHO) conjuntamente con un vector tal como el elemento promotr de genes temprano intermedio principal del citomegalovirus humano (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2), celulas dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador DHFR seleccionable, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), celulas de myeloma NSO, celulas COS y celulas SP2. En particular, para uso con celulas de mieloma NSO, otro sistema preferido de expresion es el sistema de expresion de genes GS descrito en WO 87/04462 (de Wilson), WO 89/01036 (de Bebbington) y EP 338,841 (de Bebbington).
Puede usarse una variedad de sistemas de vector de expresion de hospedera para expresar una molecula de anticuerpo de la invencion. Dichos sistemas de expresion de hospederos representan vehmulos mediante los cuales las secuencias codificadoras de interes pueden ser producidos y posteriormente purificados, pero tambien representan celulas que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificadoras de nucleotidos adecuadas, expresar la molecula de anticuerpo de la invencion in situ. Estos incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresion de ADN de un bacteriofago recombinante, ADN de plasmido o ADN de cosmido que contienen secuencias que codifican a anticuerpo; levadura (por ejemplo Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresion de levadura recombinante que contienen secuencias que codifican a anticuerpo; sistemas de celulas de insectos infectadas con vectores de expresion de virus recombinante (por ejemplo baculovirus) que contienen las secuencias que codifican al anticuerpo; sistemas de celulas de plantas infectadas con vectores de expresion de virus recombinantes (por ejemplo virus mosaico de coliflor, CaMV; virus mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresion de plasmido recombinante (por ejemplo plasmido Ti) que contiene secuencias que codifican el anticuerpo; o sistemas de celulas de marnffero (por ejemplo celulas COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que portan construcciones de expresion recombinante que contienen promoteres derivados del genoma de celulas de mamffero (por ejemplo el promotor de metallotioneina) o de virus de mamfferos (por ejemplo el promotor tardfo de adenovirus; el promotor del virus de vacuna 7.5K).
En sistemas bacterianos, un numero de vectores de expresion puede ser ventajosamente seleccionado dependiendo del uso pretendido para la molecula de anticuerpo que es expresada. Por ejemplo, cuando una gran cantidad de tal protema sera producida, para la generacion de composiciones farmaceuticas que comprenden una molecula de anticuerpo, los vectores que dirigen la expresion de altos niveles de productos de protema de fusion que son facilmente purificados puede ser deseable. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresion de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), en el cual la secuencia codificadora a anticuerpo puede ser ligada individualmente dentro del vector en el marco con la region codificadora lac Z de manera que se produce la protema de fusion; los vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX pueden tambien ser usados para expresar polipeptidos extranos como protemas de fusion con glutationa S-transferasa (GST). En general, tales protemas de fusion son solubles y pueden ser facilmente purificadas de celulas lisadas por adsorcion y union a una matriz de perlas de glutationa-agarosa seguido por elucion en presencia de glutationa libre. Los vectores pGEX son disenados para incluir trombina o sitios de disociaicon de proteasa de factor Xa de manera que el producto del gen objetivo clonado puede ser liberado de la unidad estructural GST.
En un sistema de insecto, el virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) es usado como un vector para expresar genes extranos. El virus crece en celulas de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificadora a
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anticuerpo puede ser clonada individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y colocada bajo control de un promotor AcNPV (por ejemplo el promotor de polihedrina). En celulas hospederas de mairnfero, puede ser utilizado un numero de sistemas de expresion a base de virus (por ejemplo un sistema de expresion de adenovirus).
Como se discutio anteriormente, una cepa de celula hospedera puede ser elegida para modular la expresion de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto del gen de la manera espedfica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo glucosilacion) y procesamiento (por ejemplo disociacion) de los productos de protema puede ser importante para la funcion de la protema.
Para una produccion a largo plazo de alto rendimiento de anticuerpos recombinantes, se prefiere una expresion estable. Por ejemplo, las lmeas de celulas que expresan de manera estable un anticuerpo de interes pueden ser producidas por transfeccion de las celulas con un vector de expresion que comprende la secuencia de nucleotidos del anticuerpo y la secuencia de nucleotidos de un elegible (por ejemplo neomicina o higromicina), y seleccionar la expresion del marcador elegible. Tales lmeas de celulas disenadas pueden ser particularmente utiles en la seleccion y evaluacion de compuestos que interactuan directamente o indirectamente con la molecula de anticuerpo.
Los niveles de expresion de la molecula de anticuerpo pueden ser aumentados por amplificacion de vector (para una revision, vease Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa el anticuerpo es amplificable, aumenta en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la celula hospedera aumentara el numero de copias del gen marcador. Ya que la region amplificada esta asociada con el gen del anticuerpo, la produccion del anticuerpo tambien aumentara (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
Cuando los vectores de expresion recombinantes que codifican genes de anticuerpos son introducidos en celulas hospederas de marnfferos, los anticuerpos son producidos por cultivo de las celulas hospederas por un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresion del anticuerpo en las celulas hospederas o, mas preferiblemente, la secrecion del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual las celulas hospederas crecen. Una vez que la molecula de anticuerpo de la invencion ha sido recombinantemente expresada, puede ser purificada por cualquier metodo conocido en la tecnica para la purificacion de una molecula de anticuerpo, por ejemplo, por cromatograffa (por ejemplo cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de afinidad tal como con protema A o anffgeno espedfico, y cromatograffa de columna de dimensionamiento), centrifugacion, solubilidad diferencial, o por cualquiera otra tecnica estandar para la purificacion de protemas.
Como alternativa, cualquier protema de fusion puede ser facilmente purificada al utilizar un anticuerpo espedfico para la protema de fusion que es expresada. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht et al. permite la facil purificacion de protemas de fusion no desnaturalizadas expresadas en lmeas de celulas humanas (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897). En este sistema, el gen de interes es subclonado en un plasmido de recombinacion de vacuna de manera que el marco de lectura abierto del gen es translacionalmente fusionado a una etiqueta de extremo amino que consiste de seis residuos de histidinea. La etiqueta sirve como un dominio de union de matriz para la protema de fusion. Extractos de celulas infectadas con virus de vacuna recombinante son cargados en columnas de Ni2+ acido nitriloacetico-agarosa y las protemas marcadas con histidina son selectivamente eluidas con regulador que contiene imidazol.
Caracterizacion del anticuerpo que se une a un anffgeno
Los anticuerpos que son generados por estos metodos pueden ser seleccionados por primera seleccion de afinidad y especificidad con el polipeptido purificado de interes y, si se requiere, comparando los resultados con la afinidad y especificidad de los anticuerpos con los polipeptidos que se desean excluir de la union. Los anticuerpos pueden probarse para la union a Cadherina-17 mediante, por ejemplo, ELISA estandar. El procedimiento de seleccion puede implicar la inmovilizacion de los polipeptidos purificados en pozos separados de placas de microvaloracion. La solucion que contiene un anticuerpo potencial o grupos de anticuerpos se coloca entonces en los pozos de microvaloracion respectivos y se incuban por aproximadamente 30 min a 2h. Los pozos de microvaloracion son lavados y un anticuerpo secundario marcado (por ejemplo, un anticuerpo anti-raton conjugado a fosfatasa alcalina si los anticuerpos cultivados son anticuerpos de raton) se anaden a los pozos y se incuban por aproximadamente 30
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min y luego se lavan. El sustrato se anade a los pozos y aparecera una reaccion de color donde esta presente el anticuerpo al polipeptido(s) inmovilizado.
Los anticuerpos asf identificados pueden ser entonces analizados adicionalmente para afinidad y especificidad en el diseno de ensayo seleccionado. En el desarrollo de inmunoensayos para una protema objetivo, la protema objetivo purificada actua como un estandar con la cual juzgar la sensibilidad y especificidad de los inmunoensayos usando los anticuerpos que han sido seleccionados. Debido a que la afinidad de union de los diversos anticuerpos puede diferir; ciertos pares de anticuerpos (por ejemplo en ensayos intercalados) pueden interferir uno con el otro estericamente, etc., el desempeno del ensayo de un anticuerpo puede ser una medida mas importante que la afinidad y especificidad absolutas de un anticuerpo.
Los expertos en la tecnica reconoceran que pueden realizarse muchos acercamientos para producir anticuerpos o fragmentos de union y examinar y seleccionar para afinidad y especificidad para los diversos polipeptidos, pero estos acercamientos no cambian el alcance invencion.
Para determinar si los anticuerpos monoclonales seleccionados de anti-Cadherina-17 se unen a epftopos unicos, cada anticuerpo puede ser biotinilado usando reactivos commerciamente disponibles (Pierce, Rockford, IL). Los estudios de competicion usando anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados pueden ser realizados usando placas ELISA revestidas de Cadherina-17. La union mAb biotinilada puede ser detectada con una sonda de un paso de avidina-fosfatasa alcalina.
Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados, el isotipo de ELISA puede ser realizado usando reactivos espedficos para anticuerpos de un isotipo particular.
Los anticuerpos anti-Cadherina-17 pueden ser probados ademas para reactividad con antigeno de Cadherina-17 por transferencia Western. Brevemente, la Cadherina-17 puede ser preparada y sometida a electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio. Despues de la electroforesis, los antfgenos separados son transferidos a membranas de nitrocelulosa, bloqueados con 10% de suero bovino fetal, y probados con los anticuerpos monoclonales a ser probados.
La especificidad de union de un anticuerpo de la invencion puede tambien ser determinada por monitorizacion de la union del anticuerpo a celulas que expresan a Cadherina-17, por ejemplo por citometna de flujo. Tfpicamente, una lmea celular, tal como una lmea celular CHO, puede ser transfectada con un vector de expresion que codifica a Cadherina -17. La protema transfectada puede comprender una etiqueta, tal como una etiqueta myc, preferiblemente en el extremo N, para deteccion usando un anticuerpo en la etiqueta. La union de un anticuerpo de la invencion a Cadherina-17 puede ser determinada por incubacion de las celulas transfectadas con el anticuerpo, y detectando el anticuerpo unido. La union de un anticuerpo a la etiqueta en la protema transfectada puede ser usada como un control positivo.
La especificidad de un anticuerpo de la invencion para Cadherina-17 puede ser ademas estudiado por determinacion de sf o no el anticuerpo se une a otras protemas, tal como otro miembro de la familia de Cadherina usando los mismos metodos por los cuales se determina la union a Cadherina-17.
Inmunoconjugados
En otro aspecto, la presente invencion incorpora un anticuerpo anti-Cadherina-17, o un fragmento del mismo, conjugado a una unidad estructural terapeutica, tal como una citotoxina, un farmaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Tales conjugados son denominados en la presente como “inmunoconjugados”. Los inmunoconjugados que incluyen una o mas citotoxinas son denominados como “inmunotoxinas.” Una citotoxina o agente citotoxico incluye cualquier agente que es danino para (por ejemplo, mata) celulas. Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- dehidrotestosterona, glucocorticoides, procama, tetracama, lidocama, propranolol, y puromicina y analogos u homologos de los mismos. Los agentes terapeuticos tambien incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida,
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busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina), antibioticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).
Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapeuticas que pueden ser conjugadas a un anticuerpo de la invencion incluyen duocarmicinas, caliceamicinas, maytansinas y auriestatinas, y derivados de los mismos. Un ejemplo de un conjugado de anticuerpo de caliceamicina esta comerciamente disponible (Mylotarg®; American Home Products).
Las citotoxinas pueden ser conjugadas a anticuerpos de la invencion usando tecnologfa enlazante disponible en la tecnica. Ejemplos de tipos de enlazantes que han sido usados para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioeteres, esteres, disulfuros y enlazantes que contienen peptidos. Un enlazante puede ser elegido porque es, por ejemplo, susceptible a disociacion por bajo pH dentro del compartimiento lisosomal o susceptible a disociacion por proteasas, tal como proteasas preferencialmente expresadas en tejido de tumor tal como catepsinas (por ejemplo, catepsinas B, C, D).
Ejemplos of citotoxinas son descritos, por ejemplo, en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,989,452, 7,087,600, y 7,129,261, y en las Solicitudes PCT Nos. PCT/US2002/17210, PCT/US2005/017804, PCT/US2006/37793, PCT/US2006/060050, PCT/US2006/060711, WO2006/110476, y en la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 60/891,028. Para discusion adicional de los tipos de citotoxinas, enlazantes y metodos para conjugar agentes terapeuticos a anticuerpos, vease tambien Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. y Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.
Los anticuerpos de la presente invencion tambien pueden ser conjugados a un isotopo radioactivo para generar radiofarmaceuticos citotoxicos, tambien denominados como radioinmunoconjugados. Ejemplos de isotopos radioactivos que pueden ser conjugados a anticuerpos para uso en diagnostico o terapeuticamente incluyen, pero no se limitan, yodo131, indio111, itrio90 y lutetio177. Los metodos para preparar radioinmunoconjugados son establecidos en la tecnica. Ejemplos de radioinmunoconjugados comercialmente disponibles, incluyen Zevalin® (IDEC Pharmaceuticals) y Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals), y metodos similares pueden ser usados para preparar radioinmunoconjugados usando los anticuerpos de la invencion.
Los conjugados de anticuerpos de la invencion pueden ser usados para modificar una respuesta biologica dada, y la unidad estructural de farmaco no debera ser considerada como limitada a agentes terapeuticos qmmicos clasicos. Por ejemplo, la unidad estructural de farmaco puede ser una protema o polipeptido que posee una actividad biologica deseada. Tales protemas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa, o fragmento activo del mismo, tal como abrin, ricin A, exotoxinas de pseudomonas, o toxina de difteria; una protema tal como factor de necrosis de tumor o interferon-Y; o, modificadores de respuesta biologica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulante de colonia de macrofago de granulocitos ("GM-CSF"), factor estimulante de colonia de granulocitos ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento.
Las tecnicas para conjugar tal unidad estructural terapeutica a anticuerpos son bien conocidas, vease por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs in Cancer Therapy,” en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies for Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review,” en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy,” en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
Moleculas Biespedficas
En otro aspecto, la presente invencion incorpora moleculas biespedficas que comprenden un anticuerpo anti-
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Cadherina-17, o un fragmento del mismo, de la invencion. Un anticuerpo de la invencion, o porciones que se unen a un antigeno del mismo, puede ser derivado o enlazado a otra molecula funcional, por ejemplo, otro peptido o protema (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molecula biespedfica que se une al menos a dos diferentes sitios de union o moleculas objetivo. El anticuerpo de la invencion puede de hecho ser derivado o enlazado a mas de una otra molecula funcional para generar moleculas multiespedficas que se unen a mas de dos diferentes sitios de union y/o moleculas objetivo; tales moleculas multiespedficas tambien pretenden estar comprendidas por el termino “molecula biespedfica” como se usa en la presente. Para crear una molecula biespedfica de la invencion, un anticuerpo de la invencion puede ser funcionalmente enlazado (por ejemplo, por acoplamiento qmmico, fusion genetica, asociacion no covalente o de otra manera) a una o mas de otras moleculas de union, tal como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, peptido o mimetico de union, de manera que resulta una molecula biespedfica.
En consecuencia, la presente invencion incluye moleculas biespedficas que comprenden al menos una primera especificidad de union para Cadherina-17 y una segunda especificidad de union para un segundo epttopo objetivo. En una realizacion particular de la invencion, el segundo epttopo objetivo es un receptor Fc, por ejemplo, FcyRI humano (CD64) o un receptor Fca humano (CD89). Por lo tanto, la invencion incluye moleculas biespedficas capaces de union tanto a FcyR o FcaR que expresan celulas efectoras (por ejemplo, monocitos, macrofagos o celulas polimorfonucleares (PMNs)), y a celulas objetivo que expresan a Cadherina-17. Estas moleculas biespedficas dirigen las celulas que expresan Cadherina-17 a celulas efectoras y activan las actividades de las celulas efectoras mediadas por el receptor Fc, tal como fagocitosis de celulas que expresan Cadherina-17, citotoxicidad mediada por celulas dependientes de anticuerpos (ADCC), liberacion de citocina, o generacion de anion superoxido.
En una realizacion de la invencion en la cual una molecula biespedfica es multiespedfica, la molecula puede incluir ademas una tercera especificidad de union, ademas de una especificidad de union anti-Fc y una especificidad de union anti-Cadherina-17. En una realizacion, la tercera especificidad de union es una porcion de factor anti- mejorador (EF), por ejemplo, una molecula que se une a una protema de superficie involucrada en actividad citotoxica y de esta manera aumenta la respuesta inmune contra la celula objetivo. La “porcion de factor anti- mejorador” puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que se une a una molecula dada, por ejemplo, un antfgeno o un receptor, y de esta manera resulta en una mejora del efecto de los determinantes de union para el receptor Fc o el antfgeno de la celula objetivo. La “porcion de factor anti-mejorador” puede unirse a un receptor Fc o a un antfgeno de celula objetivo. Como alternativa, la porcion de factor anti- mejorador puede unirse a una entidad que es diferente de la entidad a la cual se unen la primera y segunda especificidades de union. Por ejemplo, la porcion de factor anti-mejorador puede unirse a celulas T citotoxicas (por ejemplo a traves de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra celula inmune que resulta en un aumento en la respuesta inmune contra la celula objetivo).
En una realizacion, las moleculas biespedficas de la invencion comprenden como una especificidad de union al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, incluyendo, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb o Fv de cadena simple. El anticuerpo puede tambien ser un dfmero de cadena ligera o cadena pesada, o cualquier fragmento mmimo del mismo tal como un Fv o una construccion de cadena simple como se describe en la Patente de E.U.A. No. 4,946,778 de Ladner et al.
En una realizacion, la especificidad de union para un receptor Fcy es proporcionada por un anticuerpo monoclonal, la union del cual no es bloqueada por inmunoglobulina G humana (IgG). Como se usa en la presente, el termino "receptor IgG" se refiere a cualquiera de los ocho genes de cadena y- ubicados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de doce isoformas de receptor soluble o de transmembrana que son agrupados en tres clases de receptor Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32), y FcyRIII (CD16). En una realizacion preferida, el receptor Fcy es FcyRI humano de alta afinidad. El FcyRI humano es una molecula de 72 kDa, que muestra alta afinidad para el IgG monomerico (108 - 109 M'1).
La produccion y caracterizacion de ciertos anticuerpos monoclonales preferidos anti-FcY son descritas en la Publicacion PCT WO 88/00052 y en la Patente de E.U.A. No. 4,954,617 de Fanger et al. Estos anticuerpos se unen a un epftopo de FcyRI, FcyRII o FcyRIII en un sitio que es distinto del sitio de union del Fcy del receptor y, entonces, sur union no es bloqueada sustancialmente por niveles fisiologicos de IgG. Los anticuerpos espedficos anti-FcyRI utiles en esta invencion son mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. El hibridoma que produce mAb 32 esta
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disponible de la American Type Culture Collection, No. de Acceso ATCC HB9469. En otras realizaciones, el anticuerpo receptor anti-Fcy es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal 22 (H22). La produccion y caracterizacion del anticuerpo H22 se describe en Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 y la Publicacion PCT WO 94/10332 de Tempest et al.. La lmea celular que produce el anticuerpo H22 fue depositada en el American Type Culture Collection bajo la designacion HA022CL1 y tiene el no. de acceso CRL 11177.
En aun otras realizaciones preferidas, la especificidad de union para un receptor Fc es proporcionada por un anticuerpo que se une a un receptor IgA humano, por ejemplo, un receptor Fc-alfa (FcaRI (CD89)), la union del cual es preferiblemente no bloqueada por inmunoglobulina A humana (IgA). El termino “receptor IgA” pretende incluir el producto del gen de un gen a (FcaRI) ubicado en el cromosoma 19. Estes gen es conocido por codificar numerosas isoformas de transmembrana alternativamente divididas de 55 a 110 kDa. El FcaRI (CD89) es constitutivamente expresado en monocitos/macrofagos, eosinofflicos y granulocitos neutrofflicos, pero no en poblaciones de celulas no efectoras. El FcaRI tiene afinidad por el medio (« 5 x 107 M-1) para ambos IgA1 y IgA2, lo que aumenta con la exposicion a citocinas tales como G-CSF o GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). Cuatro anticuerpos monoclonales espedficos de FcaRI, identificados como A3, A59, A62 y A77, que se unen a FcaRI fuera del dominio de union del ligando IgA, han sido descritos (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764).
FcaRI y FcyRI son receptores de activacion preferidos para uso en las moleculas biespedficas de la invencion porque son (1) expresados principalmente en celulas efectoras inmunes, por ejemplo, monocitos, PMNs, macrofagos y celulas dendnticas; (2) expresados a altos niveles (por ejemplo, 5,000-100,000 por celula); (3) mediadores de actividades citotoxicas (por ejemplo, ADCC, fagocitosis); y (4) median la presentacion mejorada de antfgeno de antfgenos, incluyendo auto-antfgenos, dirigidos a ellos.
Los anticuerpos que pueden ser empleados en las moleculas biespedficas de la invencion son anticuerpos monoclonales de murino, humano, quimericos y humanizados.
Las moleculas biespedficas de la presente invencion pueden ser preparadas por conjugacion de las especificidades de union del constituyente, por ejemplo, las especificidades de union anti-FcR y anti-Cadherina-17, usando metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, cada las especificidad de union de la molecula biespedfica puede ser generada por separado y luego conjugada a la otra. Cuando las especificidades de union son protemas o peptidos, una variedad de agentes de acoplamiento o entrelazamiento pueden ser usados para la conjugacion covalente. Ejemplos agentes de entrelazamiento incluyen protema A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(acido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), y sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (vease por ejemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros metodos incluyen esos descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83, y Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugacion preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Cuando las especificidades de union son anticuerpos, pueden ser conjugados a traves de union de sulfhidrilo a las regiones articuladas del extremo C de las dos cadenas pesadas. En una realizacion particularmente preferida, la region articulada es modificada para contener un numero par de residuos silfhidrilo, preferiblemente uno, antes de la conjugacion.
Como alternativa, ambas especificidades de union pueden ser codificadas en el mismo vector y expresadas y ensambladas en la misma celula hospedera. Este metodo es particularmente util cuando la molecula biespedfica es un mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x protema Fab de fusion. Una molecula biespedfica de la invencion puede ser una molecula de una sola cadena que comprende un anticuerpo de una sola cadena y un determinante de union, o una molecula biespedfica de una sola cadena que comprende dos determinantes de union. Las moleculas biespedficas pueden comprender al menos dos moleculas de una sola cadena. Los metodos para preparar moleculas biespedficas son descritos por ejemplo en las Patentes de E.U.A. Numeros 5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498; y 5,482,858.
La union de las moleculas biespedficas a sus objetivos espedficos puede ser confirmada mediante, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), analisis FACS, bioensayo (por
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ejemplo, inhibicion de crecimiento), ensayo de transferencia Western. Cada uno de estos ensayos en general detecta la presencia de complejos de protema-anticuerpo de particular interes al emplear un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) espedfico para el complejo de interes. Por ejemplo, los complejos FcR-anticuerpo pueden ser detectados usando por ejemplo, un anticuerpo enlazado a enzima o fragmento de anticuerpo que reconoce y espedficamente se une a los complejos de anticuerpo-FcR. Como alternativa, los complejos pueden ser detectados usando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser radioactivamente marcado y usado en un radioinmunoensayo (RIA) (vease por ejemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986.). El isotopo radiaoctivo puede ser detectado por tales medios como el uso de un contador y o un contador de centelleo o por autoradiograffa.
Fragmentos de anticuerpos y mimeticos de anticuerpos
La presente invencion no esta limitada a los anticuerpos tradicionales, y puede practicarse a traves del uso de fragmentos de anticuerpos y mimeticos de anticuerpos. Como se detalla a continuacion, una amplia variedad de tecnologfas de fragmentos de anticuerpos y mimeticos de anticuerpos se ha desarrollado ahora, y se conoce ampliamente en la tecnica. Aunque varias de estas tecnologfas, tales como los anticuerpos de dominio, Nanocuerpos (Nanobodies) y UniCuerpos (UniBodies) hacen uso de fragmentos de, u otras modificaciones de las estructuras de los anticuerpos tradicionales, tambien hay tecnologfas alternas, tales como los Afficuerpos (Affybodies), DARPin, Anticalinas, Avfmeros y Versacuerpos (Versabodies) que emplean las estructuras de union que, mientras que imitan la union al anticuerpo tradicional, se generan de, y funcionan a traves de mecanismos distintos.
Los Anticuerpos de Dominio (dAb) son las unidades de union funcionales mas pequenas de los anticuerpos, que corresponden a las regiones variables de las cadenas pesada (VH) o ligera (VL) de los anticuerpos humanos. Los Anticuerpos de Dominio tienen un peso molecular de aproximadamente 13 kDa. Domantis ha desarrollado una serie de bibliotecas grandes y altamente funcionales de dAbs de VH y VL completamente humanos (mas de diez miles de millones de secuencias diferentes en cada biblioteca), y utiliza estas bibliotecas para seleccionar los dAbs que son espedficos para los objetivos terapeuticos. En contraste con muchos anticuerpos convencionales, los Anticuerpos de Dominio son bien expresados en los sistemas de celulas bacterianas, de levadura y de mairrifero. Los detalles adicionales de los anticuerpos de dominio y los metodos de produccion de los mismos, pueden obtenerse con referencia a Patentes de E.U.A. 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; E.U.A. No. de Serie 2004/0110941; solicitud de patente Europea No. 1433846 y Patentes Europeas 0368684 y 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 y WO03/002609.
Los Nanocuerpos (Nanobodies) son protemas terapeuticas derivadas de anticuerpos que contienen las propiedades estructurales y funcionales unicas de los anticuerpos de cadena pesada naturales. Estos anticuerpos de cadena pesada contienen un solo dominio variable (VHH) y dos dominios constantes (CH2 y CH3). De manera importante, el dominio VHH clonado y aislado es un polipeptido perfectamente estable que aloja la capacidad de union al antfgeno completa del anticuerpo de cadena pesada original. Los Nanocuerpos (Nanobodies) tienen una alta homologfa con los dominios VH de los anticuerpos humanos, y pueden humanizarse ademas sin ninguna perdida de la actividad. De manera importante, los Nanocuerpos (Nanobodies) tienen un bajo potencial inmunogenico, que se ha confirmado en estudios con primates con compuestos que conducen a los Nanocuerpos (Nanobodies).
Los Nanocuerpos (Nanobodies) combinan las ventajas de los anticuerpos convencionales con las caractensticas importantes de los farmacos de molecula pequena. Como los anticuerpos convencionales, los Nanocuerpos (Nanobodies) muestran una alta especificidad objetivo, alta afinidad por su objetivo y baja toxicidad inherente. Sin embargo, como los farmacos de molecula pequena, pueden inhibir las enzimas y acceder facilmente a las hendiduras del receptor. Ademas, los Nanocuerpos (Nanobodies) son extremadamente estables, pueden administrarse por medios diferentes a la inyeccion (vease, por ejemplo, la WO 04/041867), y son faciles de fabricar. Otras ventajas de los Nanocuerpos (Nanobodies) incluyen reconocer los eprtopos no comunes u ocultos como resultado de su tamano pequeno, unirse a las cavidades o sitios activos de las protemas objetivo, con afinidad y selectividad, debido a su flexibilidad tridimensional unica, de formato del farmaco, diseno de la vida media y facilidad y velocidad de descubrimiento del farmaco.
Los Nanocuerpos (Nanobodies) son codificados por genes unicos, y se producen de manera eficiente en casi todos
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los hospederos procarioticos y eucarioticos, por ejemplo, E. coli (vease, por ejemplo, la US 6,765,087), mohos (por ejemplo, Aspergillus o Trichoderma) y levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula o Pichia) (vease, por ejemplo, la US 6,838,254). El proceso de produccion es escalable y se han producido cantidades de multiples kilogramos de Nanocuerpos (Nanobodies). Debido a que los Nanocuerpos (Nanobodies) exhiben una estabilidad superior en comparacion con los anticuerpos convencionales, pueden formularse como una solucion lista para utilizarse con larga vida util.
El metodo de la Nanoclona (vease, por ejemplo, la WO 06/079372), es un metodo patentado para generar Nanocuerpos (Nanobodies), contra un objetivo deseado, basado en la seleccion de alto rendimiento automatizada de los linfocitos B, y podna utilizarse en el contexto de la presente invencion.
Los Unicuerpos (UniBodies) son otra tecnologfa de fragmentos de anticuerpo; sin embargo, esta es una basada en el retiro de la region de articulacion de los anticuerpos de IgG4. La supresion de la region de articulacion resulta en una molecula que es esencialmente la mitad del tamano de los anticuerpos de IgG4 tradicionales, y tiene una region de union univalente mas que la region de union bivalente de los anticuerpos de IgG4. Tambien es bien conocido que los anticuerpos de IgG4 son inertes, y por lo tanto no interactuan con el sistema inmune, lo que puede ser ventajoso para el tratamiento de enfermedades en donde no se desea la respuesta inmune, y esta ventaja se pasa a los UniCuerpos (UniBodies). Por ejemplo, los UniCuerpos (UniBodies) pueden funcionar para inhibir o silenciar, pero no destruir, las celulas a las cuales estan unidos. Ademas, la union del UniCuerpo (UniBody) a las celulas cancerosas no las estimula a proliferar. Ademas, debido a que los UniCuerpos (UniBodies) son de aproximadamente la mitad del tamano de los anticuerpos de IgG4 tradicionales, pueden mostrar una mejor distribucion sobre tumores solidos mas grandes, con una eficacia potencialmente ventajosa. Los UniCuerpos (UniBodies) son eliminados del cuerpo a una velocidad similar a los anticuerpos de IgG4 completos, y son capaces de unirse con una afinidad similar a sus antfgenos como los anticuerpos completos. Los detalles adicionales de los UniCuerpos (UniBodies) pueden obtenerse con referencia a la patente WO2007/059782.
Las moleculas de Afficuerpos (Affybodies) representan una nueva clase de protemas de afinidad basadas en un dominio de protemas de 58 residuos de aminoacidos, derivados de uno de los dominios de union de la IgG de la protema A de estafilococo. Este dominio de haz de tres helices se ha utilizado como una estructura para la construccion de bibliotecas de fagemidos combinatorios, de los cuales las variantes del Afficuerpo (Affybody) que seleccionan las moleculas deseadas, pueden seleccionarse utilizando la tecnologfa de representacion del fago (Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an a-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997; 15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002; 269:2647-55). La estructura simple, robusta de las moleculas del Afficuerpo (Affybody) en combinacion con su bajo peso molecular (6 kDa), las hace adecuadas para una amplia variedad de aplicaciones, por ejemplo, como reactivos de deteccion (Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, et al, Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261:199-211), y para inhibir las interacciones de los receptores (Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affybody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003;16:691-7). Los detalles adicionales de los Afficuerpos (Affybodies) y los metodos de produccion de los mismos, pueden obtenerse con referencia a la Patente de E.U.A. No. 5831012.
Los Afficuerpos (Affybodies) marcados tambien pueden ser utiles en aplicaciones de formacion de imagenes para determinar la abundancia de las Isoformas.
Las DARPin (Protemas de Repeticion de Ankirina Disenadas) son un ejemplo de una tecnologfa de DRP (Protema de Repeticion Disenada) de un mimetico de anticuerpo, que se ha desarrollado para explotar las capacidades de union de los polipeptidos que no son anticuerpos. Las protemas de repeticion tales como la ankirina o las protemas de repeticion ricas en leucina, son moleculas de union ubicuas, que aparecen, a diferencia de los anticuerpos, intra y extracelularmente. Su arquitectura modular unica tiene como caractenstica unidades estructurales que se repiten (repeticiones), que se apilan juntas para formar dominios de repeticion alargados que representan superficies de union al objetivo variables y modulares. Basandose en esta modularidad, pueden generarse bibliotecas combinatorias de polipeptidos con especificidades de union altamente diversificadas. Esta estrategia incluye el diseno de consenso de las repeticiones autocompatibles que representan residuos superficiales variables, y su montaje aleatorio en los dominios de repeticion.
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Las DARPin pueden producirse en sistemas de expresion bacteriana, a rendimientos muy altos, y pertenecen a las protemas mas estables conocidas. Las DARPin altamente espedficas, de alta afinidad, para una amplia gama de protemas objetivo, incluyendo receptores humanos, citocinas, cinasas, proteasas humanas, virus y protemas de membrana, se han seleccionado. Puede obtenerse DARPin que tienen afinidades en el intervalo nanomolar o picomolar de un solo dfgito.
Las DARPin se han utilizado en una amplia gama de aplicaciones, incluyendo ELISA, ELISA intercalado, analisis con citometna de flujo (FACS), inmunohistoqmmica (IHC), aplicaciones de microplaquetas, purificacion por afinidad o transferencia Western. Las DARPin tambien han probado ser altamente activas en el compartimiento celular, por ejemplo, como protemas marcadoras intracelulares, fusionadas a la protema fluorescente verde (GFP). Las DARPin se utilizaron ademas para inhibir la CI50 en el intervalo pM. Las DARPin no son solo ideales para bloquear las interacciones protema-protema, sino tambien para inhibir las enzimas. Las proteasas, cinasas y transportadores se han inhibido de manera exitosa, mas frecuentemente con un modo de inhibicion alosterico. Los enriquecimientos muy rapidos y espedficos sobre el tumor y las relaciones tumor a sangre muy favorables, hacen a las DARPin bien adecuadas para los enfoques de diagnostico in vivo o terapeuticos.
La informacion adicional con respecto a las DARPin y otras tecnologfas de DRP, pueden encontrarse en la Publicacion de la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2004/0132028, y la Publicacion de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 02/20565.
Las anticalinas son una tecnologfa adicional de mimeticos de anticuerpo, sin embargo, en este caso, la especificidad de union se deriva de las lipocalinas, una familia de protemas de bajo peso molecular que se expresan de manera natural y abundante en los tejidos humanos y en los fluidos corporales. Las lipocalinas han evolucionado para realizar una gama de funciones in vivo, asociadas con el transporte fisiologico y el almacenamiento de compuestos qmmicamente sensibles o insolubles. Las lipocalinas tienen una estructura intrmseca robusta que comprende un cilindro p conservado, que soporta cuatro espiras en un termino de la protema. Estas espiras forman la entrada a un receptaculo de union y las diferencias conformacionales en esta parte de la molecula, constituyen la variacion en la especificidad de union entre las lipocalinas individuales.
Aunque la estructura general de las espiras hipervariables soportadas por el marco de la hoja p conservada es reminiscente de las inmunoglobulinas, las lipocalinas difieren considerablemente de los anticuerpos en termino del tamano, estando compuestas de una sola cadena polipeptfdica de 160-180 aminoacidos, que es marginalmente mayor que un solo dominio de inmunoglobulina.
Las lipocalinas son clonadas y sus espiras se someten a diseno con el fin de crear Anticalinas. Las bibliotecas de Anticalinas estructuralmente diversas se han generado, y la representacion de la Anticalina permite la seleccion y clasificacion de la funcion de union, seguido por la expresion y produccion de la protema soluble para los analisis adicionales en sistemas procarioticos o eucarioticos. Los estudios han demostrado de manera exitosa que pueden desarrollarse Anticalinas que son espedficas para virtualmente cualquier protema objetivo humana, y que pueden aislarse y pueden obtenerse afinidades de union en el intervalo nanomolar o mayor.
Las Anticalinas tambien pueden formatearse como protemas de seleccion dobles, llamadas Duocalinas. Una Duocalina se une a dos objetivos terapeuticos separados en una protema monomerica producida facilmente, utilizando procesos de fabricacion estandar, mientras que retienen la especificidad y afinidad objetivo, sin importar la orientacion estructural de sus dos dominios de union.
La modulacion de multiples objetivos a traves de una sola molecula, es particularmente ventajoso en las enfermedades conocidas por involucrar mas de un solo factor causante. Ademas, los formatos de union bi o multivalentes, tales como las Duocalinas, tienen un potencial significativo para dirigir las moleculas de la superficie celular en la enfermedad, mediar los efectos agomsticos en las trayectorias de transduccion de la senal o inducir los efectos de internalizacion mejorados a traves de la union y agrupamiento de los receptores de la superficie celular. Ademas, la alta estabilidad intrmseca de las Duocalinas es comparable con las Anticalinas monomericas, ofreciendo una formulacion y potencial de suministro flexibles para las Duocalinas.
La informacion adicional con respecto a las Anticalinas puede encontrarse en la Patente de E.U.A. No. 7,250,297, y la Publicacion de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 99/16873.
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Otra tecnologfa mimetica del anticuerpo util en el contexto de la presente invencion son los Avfmeros. Los Av^eros evolucionaron de una gran familia de dominios del receptor extracelular humano mediante mezclado del exon in vitro y representacion del fago, generando protemas con multiples dominios con propiedades de union e inhibidoras. El enlazado de multiples dominios de union independientes ha mostrado crear avidez y resulta en una afinidad y especificidad mejoradas, en comparacion con las protemas de union de un solo epftopo convencionales. Otras ventajas potenciales incluyen la produccion simple y eficiente de moleculas espedficas para multiples objetivos en Escherichia coli, termoestabilidad mejorada y resistencia a las proteasas. Se han obtenido Avfmeros con afinidades subnanomolares contra una variedad de objetivos.
La informacion adicional con respecto a los Avfmeros puede encontrarse en las Publicaciones de las Solicitudes de Patentes de E.U.A. Nos. 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844,
2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756.
Los Versacuerpos (Versabodies) son otra tecnologfa mimetica de anticuerpos que podna utilizarse en el contexto de la presente invencion. Los Versacuerpos (Versabodies) son protemas pequenas de 3-5 kDa con mas de >15% de cistemas, que forman una estructura de alta densidad de disulfuro, reemplazando el nucleo hidrofobico que tienen las protemas tipicas. El reemplazo de un gran numero de aminoacidos hidrofobicos, que comprenden el nucleo hidrofobico, con un pequeno numero de disulfuros, resulta en una protema que es mas pequena, mas hidrofflica (menos agregacion y sin union espedfica), mas resistente a las proteasas y al calor, y que tiene una densidad menor de epttopos de los linfocitos T, debido a que los residuos que contribuyen principalmente a la presentacion del MHC son hidrofobicos. Las cuatro de estas propiedades son bien conocidas por afectar la inmunogenicidad, y se espera que juntas causen una mayor disminucion en la inmunogenicidad.
La inspiracion para los Versacuerpos (Versabodies) viene de los biofarmaceuticos inyectables naturales producidos por las sanguijuelas, vfboras, aranas, escorpiones, caracoles y anemonas, que se sabe que exhiben una inmunogenicidad inesperadamente baja. Empezando con las familias de protemas naturales seleccionadas, mediante el diseno y mediante seleccion, el tamano, la hidrofobicidad, el procesamiento del antfgeno proteolttico y la densidad del epftopo se reducen al mmimo a niveles bastante menores que el promedio para las protemas inyectables naturales.
Dada la estructura de los Versacuerpos (Versabodies), estos mimeticos de anticuerpo ofrecen un formato versatil que incluye valencias multiples, especificidad multiple, una diversidad de mecanismos de la vida media, modulos que seleccionan el tejido y la ausencia de la region Fc del anticuerpo. Ademas, los Versacuerpos (Versabodies) son fabricados en E. coli a altos rendimientos, y debido a su hidrofilicidad y pequeno tamano, los Versacuerpos (Versabodies) son altamente solubles y pueden formularse a altas concentraciones. Los Versacuerpos (Versabodies) son excepcionalmente estables con el calor (pueden someterse a ebullicion), y ofrecen una vida util extendida.
La informacion adicional con respecto a los Versacuerpos (Versabodies) puede encontrarse en la Publicacion de la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2007/0191272.
La descripcion detallada del fragmento de anticuerpo y las tecnologfas mimeticas del anticuerpo proporcionadas anteriormente, no pretende ser una lista extensa de todas las tecnologfas que podnan utilizarse en el contexto de la presente especificacion. Por ejemplo, y tambien no a manera de limitacion, una variedad de tecnologfas adicionales, incluyendo las tecnologfas basadas en polipeptidos alternas, tales como fusiones de las regiones que determinan la complementariedad como se expone en Qui et al., Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007), asf como las tecnologfas basadas en acidos nucleicos, tales como las tecnologfas del aptamero de ARN descritas en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,789,157, 5,864,026, 5,712,375, 5,763,566, 6,013,443, 6,376,474, 6,613,526, 6,114,120, 6,261,774 y 6,387,620, podnan utilizarse en el contexto de la presente invencion.
Composiciones farmaceuticas
En otro aspecto, la presente invencion proporciona una composicion, por ejemplo, una composicion farmaceutica, que contiene uno o una combinacion de anticuerpos monoclonales, o porciones que se unen al antfgeno del mismo, de la presente invencion, formulados juntos con un portador farmaceuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir uno o una combinacion de (por ejemplo, dos o mas diferentes) anticuerpos, o inmunoconjugados o
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moleculas biespedficas de la invencion. Por ejemplo, una composicion farmaceutica de la invencion puede comprender una combinacion de anticuerpos (o inmunoconjugados o biespedficos), que se unen a diferentes epttopos en el antigeno objetivo o que tienen actividades complementarias.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion tambien pueden administrarse en terapia de combinacion, es decir, combinados con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinacion puede incluir un anticuerpo anti- Cadherina de la presente invencion combinado con al menos otro agente anti-tumor, o un agente antiinflamatorio o inmunosupresor. Los ejemplos de agentes terapeuticos que pueden utilizarse en la terapia de combinacion se describen con mayor detalle a continuacion en la seccion sobre los usos de los anticuerpos de la invencion.
Como se utiliza en la presente, un “portador farmaceuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicoticos, agentes isotonicos y que retrasan la absorcion, y lo similar, que son fisiologicamente compatibles. De manera preferida, el portador es adecuado para la administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea, parenteral, espinal o epidermica (por ejemplo, mediante inyeccion o infusion). Dependiendo de la ruta de administracion, el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, inmunoconjugado o molecula biespedfica, puede recubrirse en un material para proteger el compuesto de la accion de los acidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.
Los compuestos farmaceuticos de la invencion pueden incluir una o mas sales farmaceuticamente aceptables. Una “sal farmaceuticamente aceptable” se refiere a una sal que retiene la actividad biologica deseada del compuesto original, y no imparte ningun efecto toxicologico indeseado (vease, por ejemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Los ejemplos de tales sales incluyen sales de adicion de acido y sales de adicion de base. Las sales de adicion de acido incluyen aquellas derivadas de los acidos inorganicos no toxicos, tales como clorddrico, mtrico, fosforico, sulfurico, bromlddrico, yodddrico, fosforoso y lo similar, asf como acidos organicos no toxicos tales como acidos alifaticos mono y dicarboxflicos, acidos alcanoicos sustituidos con fenilo, acidos hidroxialcanoicos, acidos aromaticos, acidos sulfonicos alifaticos y aromaticos y lo similar. Las sales de adicion de base incluyen aquellas derivadas de metales alcalinoterreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y lo similar, asf como de aminas organicas no toxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocama, colina, dietanolamina, etilendiamina, procama y lo similar.
Una composicion farmaceutica de la invencion tambien puede incluir un antioxidante farmaceuticamente aceptable. Los ejemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como acido ascorbico, clorhidrato de cistema, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y lo similar; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y lo similar; y (3) agentes quelantes metalicos, tales como acido dtrico, acido etilendiamin tetraacetico (EDTA), sorbitol, acido tartarico, acido fosforico y lo similar.
Los ejemplos de los portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmaceuticas de la invencion, incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y lo similar), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de agentes surfactantes.
Estas composiciones pueden contener tambien adyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes de dispersion. La prevencion de la presencia de microorganismos puede asegurarse tanto mediante procedimientos de esterilizacion, supra, como mediante la inclusion de diversos agentes antibacterianos y antimicoticos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, acido sorbico y lo similar. Puede ser deseable incluir agentes isotonicos, tales como azucares, cloruro de sodio y lo similar en las composiciones. Ademas, la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable puede provocarse por la inclusion de agentes que retrasan la absorcion, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Los portadores farmaceuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmaceuticamente activas se conoce en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, el uso de los mismos en las
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composiciones farmaceuticas de la invencion esta contemplado. Los compuestos activos suplementarios tambien pueden incorporarse en las composiciones.
Las composiciones terapeuticas tipicamente deben ser esteriles y estables bajo las condiciones de fabricacion y almacenamiento. La composicion puede formularse como una solucion, microemulsion, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentracion del farmaco. El portador puede ser un solvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido y lo similar), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de una dispersion y mediante el uso de agentes surfactantes. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse, incluyendo en la composicion un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Las soluciones inyectables esteriles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado, con uno o una combinacion de los ingredientes enumerados anteriormente, conforme se requiera, seguido por microfiltracion con esterilizacion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehnculo esteril, que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos de preparacion preferidos son secado a vado y secado por congelacion (liofilizacion), que proporciona un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una solucion filtrada esteril previamente de los mismos.
La cantidad del ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una sola forma de dosificacion, variara dependiendo del sujeto que este siendo tratado, y del modo de administracion particular. La cantidad del ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificacion unica, generalmente sera aquella cantidad de la composicion que produzca un efecto terapeutico. Generalmente, del cien por ciento, esta cantidad variara de aproximadamente 0.01 por ciento a aproximadamente noventa y nueve por ciento del ingrediente activo, de manera preferida de aproximadamente 0.1 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, de manera mas preferida de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento del ingrediente activo en combinacion con un portador farmaceuticamente aceptable.
Los regfmenes de dosificacion se ajustan para proporcionar la respuesta deseada optima (por ejemplo, una respuesta terapeutica). Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, varias dosis divididas pueden administrarse con el tiempo o la dosis puede reducirse o incrementarse proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situacion terapeutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificacion, para facilidad de administracion y uniformidad de la dosificacion. La forma unitaria de dosificacion como se utiliza en la presente, se refiere a unidades ffsicamente discretas, adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a ser tratados, cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo, calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el portador farmaceutico requerido. La especificacion de las formas unitarias de dosificacion de la invencion es dictada por, y depende directamente de (a) las caractensticas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico particular a ser logrado, y (b) la limitacion inherente en la tecnica de combinacion de tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.
Para la administracion del anticuerpo, la dosificacion vana de aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y mas usualmente de 0.01 a 5 mg/kg, del peso corporal del hospedero. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 0.3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Un regimen de tratamiento ejemplar abarca la administracion una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los regfmenes de dosificacion preferidos para un anticuerpo anti-Cadherina-17 de la invencion, incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal a traves de administracion intravenosa, con el anticuerpo que se proporciona utilizando uno de los siguientes programas de dosificacion: (i) cada cuatro semanas durante seis dosificaciones, a continuacion cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.
En algunos metodos, dos o mas anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de union se administran
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de manera simultanea, caso en el cual la dosificacion de cada anticuerpo administrado cae dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo se administra usualmente en multiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones unicas pueden, por ejemplo, ser semanales, mensuales, cada tres meses o anuales. Los intervalos tambien pueden ser irregulares, como se indica midiendo los niveles en sangre del anticuerpo al antigeno objetivo en el paciente. En algunos metodos, la dosificacion se ajusta para lograr una concentracion del anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1000 pg/ml y en algunos metodos de aproximadamente 25-300 pg/ml.
De manera alterna, el anticuerpo puede administrarse como una formulacion de liberacion sostenida, caso en el cual se requiere una administracion menos frecuente. La dosificacion y frecuencia vana dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media mas larga, seguido por los anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos y anticuerpos no humanos. La dosificacion y la frecuencia de la administracion pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profilactico y terapeutico. En las aplicaciones profilacticas, una dosificacion relativamente baja se administra a intervalos relativamente poco frecuentes durante un periodo de tiempo largo. Algunos pacientes continuan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En las aplicaciones terapeuticas, una dosificacion relativamente alta a intervalos relativamente cortos se requiere algunas veces, hasta que la progresion de la enfermedad se reduce o termina, y de manera preferida, hasta que el paciente muestra un alivio parcial o completo de los smtomas de la enfermedad. Por lo tanto, puede administrarse al paciente un regimen profilactico.
Los niveles de dosificacion reales de los ingredientes activos en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo que es efectiva para lograr la respuesta terapeutica deseada para un paciente, composicion y modo de administracion particular, sin ser toxico para el paciente. El nivel de dosificacion seleccionado dependera de una variedad de factores farmacocineticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invencion empleadas, o el ester, sal o amida del mismo, la ruta de administracion, el tiempo de administracion, la velocidad de excrecion del compuesto particular siendo empleado, la duracion del tratamiento, otros farmacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinacion con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condicion, salud general e historial medico anterior del paciente siendo tratado, y factores similares bien conocidos en el campo medico.
Una “dosificacion terapeuticamente efectiva” de un anticuerpo anti-Cadherina-17 de la invencion, resulta de manera preferida en una disminucion en la severidad de los smtomas de la enfermedad, un incremento en la frecuencia y duracion de los periodos libres de los smtomas de la enfermedad o una prevencion del dano o discapacidad debida a la afliccion de la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de los tumores Cadherina-17+, una “dosificacion terapeuticamente efectiva” inhibe de manera preferida el crecimiento celular o el crecimiento del tumor por al menos aproximadamente 20%, de manera mas preferida por al menos aproximadamente 40%, aun de manera mas preferida por al menos aproximadamente 60%, y aun de manera mas preferida por al menos aproximadamente 80% con relacion a los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento de un tumor puede evaluarse en un sistema de un modelo animal predictivo de la eficacia en los tumores humanos. De manera alterna, esta propiedad de una composicion puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento celular, tal inhibicion puede medirse in vitro mediante ensayos conocidos por el practicante con experiencia. Una cantidad terapeuticamente efectiva de un compuesto terapeutico puede disminuir el tamano del tumor, o aliviar de otra manera los smtomas en un sujeto. Alguien con experiencia ordinaria en la tecnica sera capaz de determinar tales cantidades basandose en factores tales como el tamano del sujeto, la severidad de los smtomas del sujeto y la composicion particular o ruta de administracion seleccionada.
Una composicion de la presente invencion puede administrarse a traves de una o mas rutas de administracion, utilizando uno o mas de una variedad de metodos conocidos en la tecnica. Como se apreciara por el experto, la ruta y/o el modo de administracion, variara dependiendo de los resultados deseados. Las rutas de administracion preferidas para los anticuerpos de la invencion incluyen rutas de administracion intravenosas, intramuscular, intradermica, intraperitoneal, subcutanea, espinal u otra ruta parenteral, por ejemplo, mediante inyeccion o infusion. La expresion “administracion parenteral”, como se utiliza en la presente, significa modos de administracion diferentes a la administracion enteral y topica, usualmente mediante inyeccion, e incluyen, de manera no exclusiva, inyeccion intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradermica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal e infusion.
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De manera alterna, un anticuerpo de la invencion puede administrarse a traves de una ruta no parenteral, tal como ruta de administracion topica, epidermica o mucosal, por ejemplo, de manera intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o topica.
Los compuestos activos pueden prepararse con portadores que protegeran al compuesto contra la liberacion rapida, tal como una formulacion de liberacion controlada, incluyendo implantes, parches transdermicos y sistemas de suministro microencapsulados. Los polfmeros biocompatibles, biodegradables, pueden utilizarse, tales como acetato de etilen vinilo, polianhudridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Muchos metodos para la preparacion de tales formulaciones estan patentados o se conocen generalmente por aquellos con experiencia en la tecnica. Vease, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Las composiciones terapeuticas pueden administrarse con dispositivos medicos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, en una realizacion preferida, una composicion terapeutica de la invencion puede administrarse con un dispositivo de inyeccion hipodermica sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; o 4,596,556. Los ejemplos de implantes y modulos bien conocidos utiles en la presente invencion incluyen: la Patente de E.U.A. No. 4,487,603, que describe una bomba de microinfusion implantable para distribuir la medicacion a una velocidad controlada; la Patente de E.U.A. No. 4,486,194, que describe un dispositivo terapeutico para administrar medicamentos a traves de la piel; la Patente de E.U.A. No. 4,447,233, que describe una bomba de infusion de la medicacion para suministrar la medicacion a una velocidad de infusion precisa; la Patente de E.U.A. No. 4,447,224, que describe un aparato de infusion implantable de flujo variable para el suministro continuo del farmaco; la Patente de E.U.A. No. 4,439,196, que describe un sistema de suministro del farmaco osmotico que tiene compartimientos con multiples camaras; y la Patente de E.U.A. No. 4,475,196, que describe un sistema de suministro de farmaco osmotico. Muchos otros de tales implantes, sistemas de suministro y modulos son conocidos por aquellos con experiencia en la tecnica.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos monoclonales humanos de la invencion pueden formularse para asegurar la distribucion apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera sangre-cerebro (BBB), excluye muchos compuestos altamente hidrofflicos. Para asegurarse que los compuestos terapeuticos de la invencion cruzan la BBB (si se desea), pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para los metodos para fabricar liposomas, veanse, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. 4,522,811; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o mas unidades estructurales que se transportan de manera selectiva en las celulas u organos espedficos, mejorando asf el suministro del farmaco dirigido (vease, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Las unidades estructurales de seleccion ejemplares incluyen folato o biotina (vease, por ejemplo, la Patente de E.U.A. 5,416,016 de Low et al.); manosidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); un receptor de la protema A tensoactiva (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); vease tambien K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
Usos y metodos
Los anticuerpos, las composiciones de anticuerpos y los metodos de la presente invencion, tienen numerosas utilidades de diagnostico y terapeuticas in vitro e in vivo, que involucran el diagnostico y el tratamiento de los trastornos mediados por la Cadherina-17.
En algunas realizaciones, estas moleculas pueden administrarse a celulas en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir y diagnosticar una variedad de trastornos. Como se utiliza en la presente, el termino “sujeto” pretende incluir humanos y animales no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mairnferos y no mamfferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios y reptiles. Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que tienen trastornos mediados por la actividad de la Cadherina-17. Los metodos son particularmente adecuados para tratar a pacientes humanos, que tienen un trastorno asociado con la expresion aberrante de la Cadherina-17. Cuando los anticuerpos para la Cadherina-17 se administran junto con otro agente, los dos pueden administrarse en cualquier orden o de manera simultanea.
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Dada la union espedfica de los anticuerpos de la invencion para Cadherina-17, los anticuerpos de la invencion pueden utilizarse para detectar de manera espedfica la expresion de Cadherina-17 en la superficie de las celulas, y ademas, pueden utilizarse para purificar la Cadherina-17 a traves de la purificacion con inmunoafinidad.
Adicionalmente, dada la expresion de Cadherina-17 en varias celulas tumorales, los anticuerpos humanos, las composiciones de anticuerpos y los metodos de la presente invencion, pueden utilizarse para tratar a un sujeto con trastorno tumorigenico, por ejemplo, un trastorno caracterizado por la presencia de celulas tumorales que expresan a Cadherina-17 incluyendo, por ejemplo, cancer colorrectal. Se ha demostrado que la Cadherina-17 se internaliza en la union al anticuerpo como se ilustra en el Ejemplo 10 siguiente, habilitando asf a los anticuerpos de la invencion a ser usados en cualquier mecanismo de accion de carga, por ejemplo, un enfoque ADC, radioinmuno conjugado, o enfoque ADEPT.
En una realizacion, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moleculas y composiciones multiespedficas y biespedficas) de la invencion, pueden utilizarse para detectar niveles de Cadherina-17, o niveles de celulas que contienen Cadherina-17 en su superficie membranal, niveles los cuales pueden relacionarse entonces con ciertos smtomas de la enfermedad. De manera alterna, los anticuerpos pueden utilizarse para inhibir o bloquear la funcion del Cadherina-17, que a su vez, puede relacionarse con la prevencion o alivio de ciertos smtomas de la enfermedad, implicando por lo tanto a la Cadherina-17 como un mediador de la enfermedad. Esto puede lograrse poniendo en contacto una muestra y una muestra de control con el anticuerpo anti-Cadherina-17 bajo condiciones que permiten la formacion de un complejo entre el anticuerpo y Cadherina-17. Cualesquier complejos formados entre el anticuerpo y Cadherina-17 se detectan y comparan en la muestra y el control.
En otra realizacion, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos, moleculas y composiciones multiespedficas y biespedficas) de la invencion, pueden probarse inicialmente para la actividad de union asociada con un uso terapeutico o diagnostico in vitro. Por ejemplo, las composiciones de la invencion pueden probarse utilizando los ensayos de citometna de flujo descritos en los Ejemplos siguientes.
Los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos, moleculas multiespedficas y biespedficas, inmunoconjugados y composiciones) de la invencion tienen utilidad adicional en la terapia y en el diagnostico de enfermedades relacionadas con la Cadherina-17. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos, las moleculas multiespedficas o biespedficas y los inmunoconjugados, pueden utilizarse para provocar in vivo o in vitro una o mas de las siguientes actividades biologicas: inhibir el crecimiento y/o destruir una celula que expresa la Cadherina-17; mediar la fagocitosis o ADCC de una celula que expresa la Cadherina-17 en la presencia de celulas efectoras humanas, o bloquear la union del ligando de Cadherina-17 a Cadherina-17.
En una realizacion particular, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos, moleculas y composiciones multiespedficas y biespedficas) se utilizan in vivo para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de cancer relacionado con la Cadherina-17. Ejemplos de cancer relacionado con la Cadherina-17 incluyen, entre otros, tejidos de cancer humano que representan el cancer colorrectal.
Las rutas adecuadas para administrar las composiciones de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moleculas multiespedficas y biespedficas e inmunoconjugados) de la invencion in vivo e in vitro, son bien conocidos en la tecnica, y pueden seleccionarse por aquellos con experiencia ordinaria. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpo pueden administrarse mediante inyeccion (por ejemplo, intravenosa o subcutanea). Las dosificaciones adecuadas de las moleculas utilizadas dependeran de la edad y peso del sujeto, y la concentracion y/o formulacion de la composicion del anticuerpo.
Como se describio previamente, los anticuerpos anti-Cadherina-17 de la invencion pueden coadministrarse con uno u otros agentes terapeuticos, por ejemplo, un agente citotoxico, un agente radiotoxico o un agente inmunosupresor. El anticuerpo puede enlazarse al agente (como un inmunocomplejo) o puede administrarse de manera separada del agente. En el ultimo caso (administracion separada), el anticuerpo puede administrarse antes, despues o de manera concurrente como el agente, o puede coadministrarse con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia anticancengena, por ejemplo, radiacion. Tales agentes terapeuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplasicos tales como doxorrubicina (adriamicina), cisplatino, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucilo e hidroxiurea de ciclofosfamida que, por sf mismos, son unicamente efectivos a niveles que son toxicos o subtoxicos para el paciente. El cisplatino se administra de manera intravenosa como una dosis de 100 mg/kg una vez cada cuatro semanas y la
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adriamicina se administra de manera intravenosa como una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 dfas. Otros agentes adecuados para la co-administracion con los anticuerpos de la invencion incluyen otros agentes usados para el tratamiento de canceres, por ejemplo, cancer pancreatico o colorrectal, tales como Avastin®, 5FU y gemcitabina. La co-administracion de los anticuerpos anti-Cadherina-17 humanos, o fragmentos que se unen al antigeno de los mismos, de la presente invencion con los agentes quimioterapeuticos, proporciona dos agentes anticancengenos que operan a traves de un mecanismo diferente, que proporciona un efecto citotoxico a las celulas tumorales humanas. Tal coadministracion puede solucionar problemas debido al desarrollo de resistencia a los farmacos o un cambio en la antigenicidad de las celulas tumorales, que podna volverlas no reactivas con el anticuerpo.
Las celulas efectoras espedficas del objetivo, por ejemplo, las celulas efectoras relacionadas con las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moleculas multiespedficas y biespedficas) de la invencion, tambien pueden utilizarse como agentes terapeuticos. Las celulas efectoras para la seleccion, pueden ser leucocitos humanos tales como macrofagos, neutrofilos o monocitos. Otras celulas incluyen eosinofilos, celulas citotoxicas naturales y otras celulas que portan el receptor de IgG o IgA. Si se desea, las celulas efectoras pueden obtenerse del sujeto a ser tratado. Las celulas efectoras espedficas del objetivo pueden administrarse como una suspension de celulas en una solucion fisiologicamente aceptable. El numero de celulas administradas puede ser del orden de 108-109 pero variara dependiendo del proposito terapeutico. En general, la cantidad sera suficiente para obtener la ubicacion en la celula objetivo, por ejemplo, una celula tumoral que expresa a Cadherina-17, y efectuar la destruccion de las celulas, por ejemplo, mediante fagocitosis. Las rutas de administracion tambien pueden variar.
La terapia con celulas efectoras espedficas del objetivo puede realizarse en conjunto con otras tecnicas para la eliminacion de las celulas seleccionadas. Por ejemplo, la terapia antitumoral utilizando las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moleculas multiespedficas y biespedficas) de la invencion y/o las celulas efectoras armadas con estas composiciones, puede utilizarse en conjunto con la quimioterapia. Ademas, las imnunoterapia de combinacion puede utilizarse para dirigir dos diferentes poblaciones efectoras citotoxicas hacia el rechazo de la celula tumoral. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Cadherina-17 enlazados a RI anti-Fc-gamma RI o anti-CD3 pueden utilizarse en conjunto con los agentes que se unen de manera espedfica al receptor de IgG o IgA.
Las moleculas biespedficas y multiespedficas de la invencion tambien pueden utilizarse para modular los niveles de FcyR o FcyR en las celulas efectoras, tales como mediante la coronacion y eliminacion de los receptores en la superficie celular. Las mezclas de los receptores anti-Fc pueden utilizarse tambien para este proposito.
Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moleculas multiespedficas y biespedficas e
inmunoconjugados) de la invencion, que tienen sitios de union al complemento, tales como las porciones de IgG1, 2 o 3 o IgM que se unen al complemento, tambien pueden utilizarse en la presencia del complemento. En una realizacion, el tratamiento ex vivo de una poblacion de celulas que comprende las celulas objetivo con un agente de union de la invencion, y las celulas efectoras apropiadas, pueden suplementarse mediante la adicion del complemento o suero que contiene el complemento. La fagocitosis de las celulas objetivo recubiertas con un agente de union de la invencion puede mejorarse uniendo las protemas del complemento. En otra realizacion, las celulas objetivo recubiertas con las composiciones (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moleculas multiespedficas y biespedficas) de la invencion, pueden tambien lisarse por el complemento. En aun otra realizacion, las composiciones de la invencion no activan el complemento.
Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moleculas multiespedficas y biespedficas e
inmunoconjugados) de la invencion, tambien pueden administrarse junto con el complemento. En ciertas realizaciones, la presente divulgacion proporciona composiciones que comprenden anticuerpos humanos, moleculas multiespedficas o biespedficas y suero o el complemento. Estas composiciones pueden ser ventajosas cuando el complemento se localiza en proximidad cercana a los anticuerpos humanos, moleculas multiespedficas o
biespedficas. De manera alterna, los anticuerpos humanos, moleculas multiespedficas o biespedficas de la
invencion y el complemento o el suero, pueden administrarse de manera separada.
Tambien se describen en la presente, kits que comprenden las composiciones de anticuerpos de la invencion (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moleculas biespedficas o multiespedficas, o inmunoconjugados), e instrucciones para el uso. El kit puede contener ademas, uno o mas reactivos adicionales, tales como un agente inmunosupresor, un agente citotoxico o un agente radiactivo, o uno o mas anticuerpos humanos adicionales de la
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invencion (por ejemplo, un anticuerpo que tiene actividad complementaria que se une a un epttopo en el antfgeno de Cadherina-17 diferente del primer anticuerpo).
En consecuencia, a los pacientes tratados con las composiciones de anticuerpos de la invencion se les puede administrar (antes de, de manera simultanea con, o despues de la administracion de un anticuerpo humano de la invencion) otro agente terapeutico, tal como un agente citotoxico o radiotoxico, que mejora o aumenta el efecto terapeutico de los anticuerpos.
En otras realizaciones, el sujeto puede tratarse ademas, con un agente que modula, por ejemplo, mejora o inhibe, la expresion o actividad de los receptores Fcy o Fcy, por ejemplo, tratando al sujeto con una citocina. Las citocinas preferidas para la administracion durante el tratamiento con la molecula multiespedfica incluyen el factor que estimula la colonia del granulocito (G-CSF), factor que estimula la colonia del granulocito-macrofago (GM-CSF), interferon-y (IFN-y), y factor de necrosis del tumor.
Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos, moleculas multiespedficas y biespedficas) de la invencion, tambien pueden utilizarse para celulas objetivo que expresan a FcyR o Cadherina-17, por ejemplo, para marcar tales celulas. Para cada uso, el agente de union puede enlazarse a la molecula que puede detectarse. Asf, la invencion proporciona metodos para localizar ex vivo o in vitro celulas que expresan los receptores Fc, tales como FcyR o Cadherina-17. La marca detectable puede ser, por ejemplo, un radioisotopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimatico.
En un ejemplo particular, la divulgacion proporciona metodos para detectar la presencia de un antigeno de Cadherina-17 en una muestra, o para medir la cantidad de antfgeno de Cadherina-17, que comprende poner en contacto la muestra y una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal, o una porcion que se une al antfgeno del mismo, que se une de manera espedfica a Cadherina-17, bajo condiciones que permiten la formacion de un complejo entre el anticuerpo o porcion del mismo y Cadherina-17. La formacion de un complejo se detecta entonces, en donde una diferencia en la formacion del complejo entre la muestra, comparada con la muestra de control, es indicativa de la presencia del antfgeno de Cadherina-17 en la muestra.
Tambien se describen metodos para tratar un trastorno mediado por la Cadherina-17 en un sujeto, por ejemplo, canceres humanos, incluyendo cancer colorrectal.
En aun otra realizacion, los inmunoconjugados de la invencion pueden utilizarse para dirigir compuestos (por ejemplo, agentes terapeuticos, marcas, citotoxinas, radiotoxinas, inmunosupresores, etc.), a las celulas que tienen receptores de la superficie celular de Cadherina-17, enlazando tales compuestos al anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo anti-Cadherina-17 puede conjugarse a cualquiera de los compuestos de toxinas descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,281,354 y 6,548,530, las publicaciones de patente de E.U.A. Nos. 20030050331, 20030064984, 20030073852 y 20040087497, o publicados en la WO 03/022806.
Asf, la invencion tambien proporciona metodos para localizar ex vivo o in vivo celulas que expresan a Cadherina-17 (por ejemplo, con una marca detectable, tal como un radioisotopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimatico).
De manera alterna, los inmunoconjugados pueden utilizarse para destruir las celulas que tienen receptores de la superficie celular de Cadherina-17, dirigiendo las citotoxinas o radiotoxinas a Cadherina-17.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Construccion de una biblioteca de despliegue de fago
Una protema recombinante compuesta de dominios 1-2 del dominio extracelular de Cadherina-17 (SEQ ID NO:136) fue generada en bacterias por metodos estandard recombinantes y usada como antfgeno para immunizacion (vease lo siguiente). Una protema recombinante compuesta del dominio extracelular de longitud completa de Cadherina-17 (SEQ ID NO:137) fue tambien eucarioticamente sintetizada por metodos estandard recombinantes y usada para
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seleccion.
Inmunizacion y aislamiento de ARNm
Una biblioteca de despliegue de fago para identificacion de moleculas de union a Cadherina-17 fue construida como sigue. Ratones A/J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Me.) fueron inmunizados intraperitonealmente con antigeno recombinante a Cadherina-17 (dominios 1-2 del dominio extracelular), usando 100 |jg de protema en adyuvante completo de Freund, en el dfa 0, y con 100 jg de antigeno en el dfa 28. Los sangrados de prueba de los ratones fueron obtenidos a traves de puncion del seno retro-orbital. Si, al probar las valoraciones, fueron consideradas altas por ELISA usando antigeno biotinilado de Cadherina-17 inmovilizado a traves de Placas de Poliestireno Revestidas con neutravidin (Reacti-Unirse(TM) NeutrAvidin™, Pierce, Rockford, Ill.), los ratones fueron sobrealimentados con 100 jg de protema en el dfa 70, 71 y 72, con subsiguiente sacrificio y extraccion del bazo el dfa 77. Si las valoraciones de anticuerpo fueron consideradas no satisfactorias, los ratones fueron sobrealimentados con 100 jg de antfgeno en el dfa 56 y se tomo una muestra de sangre en el dfa 63. Si se obtuvieron valoraciones satisfactorias, los animales fueron sobrealimentados con 100 jg de antfgeno en el dfa 98, 99, y 100 y los bazos recolectados en el dfa 105.
Los bazos fueron recolectados en una campana de flujo laminar y transferidos a cajas petri, cortados y desechada la grasa y tejido conectivo. Los bazos fueron macerados rapidamente con el embolo de una jeringa esteril de 5 cc en presencia de 1.0 ml de solucion D (25.0 g guanidina tiocianato (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), 29.3 ml de agua esteril, 1.76 ml 0.75 M citrato de sodio pH 7.0, 2.64 ml 10% sarkosyl (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.), 0.36 ml 2-mercaptoetanol (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.)). Esta suspension de bazo fue jalada a traves de una aguja de calibre 18 hasta que todas las celulas fueron lisadas y la solucion viscosa fue transferida a un tubo de microcentrifugacion. La caja Petri fue lavada con 100 jl de solucion D para recuperar cualquier bazo restante. Esta suspension fue jalada a traves de una aguja calibre 22 por 5-10 veces mas.
La muestra fue dividida igualmente entre dos tubos de microcentrifugacion y se anade lo siguiente, en orden, con la mezcla por inversion despues de cada adicion: 50 jl 2 M de acetato de sodio pH 4.0, 0.5 ml fenol saturado con agua (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.), 100 jl cloroformo/alcohol isoairnlico 49:1 (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.). La solucion fue sometida a vortice por 10 segundos e incubada en hielo por 15 min. Despues de la centrifugacion a 14 krpm por 20 min a 2-8 °C., la fase acuosa fue transferida a un tubo fresco. Un volumen igual de fenol saturado con agua:cloroformo:alcohol isoamnlico (50:49:1) fue anadido, y el tubo sometido a vortice por diez segundos. Despues de 15 min de incubacion en hielo, la muestra fue centrifugada por 20 min a 2-8 °C., y la fase acuosa transferida a un tubo fresco y precipitado con un volumen igual de isopropanol a -20 °C. por un mmimo de 30 min. Despues de centrifugacion a 14 krpm por 20 min a 4 °C., el sobrenandante fue aspirado, los tubos girados brevemente y se removio toda traza de lfquido de la perla de ARN.
Las perlas de ARN fueron disueltas en 300 jl de solucion D, combinadas, y precipitadas con un volumen igual de isopropanol a -20 °C. por un mmimo de 30 min. La muestra fue centrifugada 14 krpm por 20 min a 4 °C., el sobrenadante fue aspirado como antes, y la muestra enjuagada con 100 jl de 70% etanol enfriado en hielo. La muestra fue de nuevo centrifugada a 14 krpm por 20 min a 4 °C., aspirada la solucion de 70% etanol, y la perla de ARN perla secada al vacm. La perla fue resuspendida en 100 jl de agua esteril tratada con dietil pirocarbonato. La concentracion fue determinada por A260 usando una absorbancia de 1.0 para una concentracion de 40 jg/ml. Los ARN fueron almacenados a -80 °C.
Preparacion de ADN complementario (ADNc)
El ARN total purificado de bazos de raton como se describe anteriormente fue usado directamente como molde para la preparacion de ADNc. ARN (50 jg) fue diluido a 100 jL con agua esteril, y 10 jL de 130 ng/jL oligo dT12 (sintetizado en un sintetizador Applied Biosistemas Model 392 ADN) fue anadido. La muestra fue calentada por 10 min a 70 °C., luego enfrada en hielo. Cuarenta jL 5* regulador de primera hebra fue anadido (Gibco/BRL, Gaithersburg, Md.), junto con 20 jL 0.1 M ditiotreitol (Gibco/BRL, Gaithersburg, Md.), 10 jL 20 mM deoxinucleosido trifosfatos (dNTP's, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), y 10 jL de agua en hielo. La muestra fue entonces incubada a 37 °C. por 2 min. Diez jL de transcriptasa inversa (Superscript(TM) II, Gibco/BRL, Gaithersburg, Md.) fueron anadidos y continuo la incubacion a 37 °C. por 1 hr. Los productos de ADNc fueron usados directamente para reaccion en cadena de polimerasa (PCR).
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Amplificacion de genes de anticuerpo por PCR
Para amplificar substancialmente todos los genes de cadena H y L usando PCR, se eligieron cebadores que corresponden a substancialmente todas las secuencias publicadas. Ya que las secuencias de nucleotidos del extremo amino de H y L contiene diversidad considerable, 33 oligonucleotidos fueron sintetizados para servir como cebadores en la direccion 5' para las cadenas H, y 29 oligonucleotidos fueron sintetizados para servir como cebadores en la direccion 5' para las cadenas kapa L como se describe en la Patente de E.U.A. Ser. No. 08/835,159, presentada el 4 de abril de 1997. Las secuencias de nucleotidos de region constante para cada cadena requirieron solo un cebador en la direccion 3' para las cadenas H y un cebador en la direccion 3' para las cadenas kapa L.
Una reaccion en 50 pL fue realizada para cada par de cebador con 50 pmolar de cebador en la direccion 5', 50 pmolar de cebador en la direccion 3', 0.25 pL Taq ADN Polimerasa (5 unidades/pL, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), 3 pL ADNc (preparado como se describio), 5 pL 2 mM dNTP's, 5 pL 10*Taq ADN regulador de polimerasa con MgCl2 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), y H2O to 50 pL. La amplificacion fue realizada usando un ciclizador GeneAmp(R) 9600 thermal (Perkin Elmer, Foster City, Calif.) con el siguiente programa de termociclo: 94 °C. por 1 min; 30 ciclos de 94 °C. por 20 seg, 55 °C. por 30 seg, y 72 °C. por 30 seg; 72 °C. por 6 min; 4 °C.
Los productos de ADNds del procedimiento PCR fueron luego sometidos a PCR asimetrico usando solo un cebador en la direccion 3' para generar substancialmente solo la hebra anti-sentido de los genes objetivo. Una reaccion en 100 pL fue realizada para cada producto de ADNds con 200 pmolar de cebador en la direccion 3', 2 pL de producto ds-ADN, 0.5 pL Taq ADN Polimerasa, 10 pL 2 mM dNTP's, 10 pL 10*Taq ADN regulador de polimerasa con MgCl2 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), y H2O a 100 pL. Se uso el mismo programa de PCR descrito antes para amplificar el (ss)-ADN de una sola hebra.
Purificacion de ADN de una sola hebra por cromatograffa ffquida de alto rendimiento y ADN de una sola hebra cinasante
Los productos ss-PCR de cadena H y los productos de PCR de una sola hebra de cadena L fueron precipitados por etanol anadiendo 2.5 volumenes de etanol y 0.2 volumenes de 7.5 M acetato de amonio e incubando a -20 °C. por al menos 30 min. El ADN fue perlado por centrifugacion en una cenfffuga Eppendorf a 14 krpm por 10 min a 2-8 °C. El sobrenadante fue aspirado cuidadosamente y los tubos fueron brevemente girados una segunda vez. La ultima gota de sobrenadante fue removida con una pipeta. El ADN fue secado al vacfo por 10 min en medio de calentamiento. Los productos de la cadena H fueron combinados en 210 pL de agua y los productos de la cadena L fueron combinados por separado en 210 pL de agua. El ADN de una sola hebra fue purificado por cromatograffa ffquida de alto rendimiento (HPLC) usando un Hewlett Packard 1090 HPLC y una columna de intercambio de aniones Gen- Pak(TM) FAX (Millipore Corp., Milford, Mass.). El gradiente usado para purificar el AND de una sola hebra se muestra en el Cuadro 1, y la temperatura del horno fue 60 °C. La absorbancia fue monitorizada a 260 nm. El ADN de una sola hebra eluido de la HPLC fue recolectado en fracciones de 0.5 min. Las fracciones que conteman el ADN de una sola hebra fueron precipitadas en metanol, se formo una perla y se secaron como se describio antes. Las perlas de ADN fueron combinadas en 200 pL de agua esteril.
Taba 1 - Gradiente de HPLC para purificacion de ss-ADN
Tiempo (min)
%A %B %C Flujo (ml/min)
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Regulador A es 25 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0 Regulador B es 25 mM Tris, 1 mM EDTA, 1 M NaCl, pH 8.0 Regulador C es 40 mm acido fosforico
El ADN de una sola hebra fue fosforilado en la direccion 5' para mutagenesis. Veinticuatro pL 10* de regulador de cinasa (United States Biochemical, Cleveland, Ohio), 10.4 pL 10 mM adenosina-5'-trifosfato (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind ), y 2 pL polinucleotido cinasa (30 units/pL, United States Biochemical, Cleveland, Ohio) fueron anadidos a cada muestra, y los tubos fueron inculpados a 37 °C. por 1 hr. Las reacciones fueron detenidas al incubar los tubos a 70 °C. por 10 min. El ADN fue purificado con una extraccion de fenol equilibrado con Tris (pH>8.0, United States Biochemical, Cleveland, Ohio):cloroformo: alcohol isoairnlico (50:49:1) y una extraccion con cloroformo: alcohol isoamnlico (49:1). Despues de las extracciones, el ADN fue precipitado en etanol y se formo en perlas como se describio antes. Las perlas de ADN fueron secadas, luego disueltas en 50 pL de agua esteril. La concentracion fue determinada por medicion de la absorbancia de una alfcuota del ADN a 260 nm usando 33 pg/ml para una absorbancia de 1.0. Las muestras fueron almacenadas -20 °C.
Preparacion de moldes de uracilo usados en la generacion de bibliotecas de fago de anticuerpo de bazo
Se agrego un ml de cultivo durante la noche de E. coli CJ236 (BioRAD, Hercules, Calif.) a 50 ml 2*YT en un matraz agitado con deflectores de 250 ml. El cultivo fue criado a 37 °C. a OD600=0.6, inoculado con 10 pl de una dilucion 1/100 de BS45 reserva de vector de fago (descrito en la Solicitud de Patente de E.U.A. Ser. No. 08/835,159, presentado en Abr. 4, 1997) y continuo el crecimiento por 6 hr. Aproximadamente 40 ml del cultivo fue centrifugado a 12 krpm por 15 minutes a 4 °C. El sobrenadante (30 ml) fue transferido a un tubo de centrifugacion fresco y se incubo a temperatura ambiente por 15 minutos despues de la adicion de 15 pl de 10 mg/ml ARNseA (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.). Los fagos fueron precipitados por the adicion de 7.5 ml de 20% polietilen glicol 8000 (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.)/3.5M acetato de amonio (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) e incubacion en hielo por 30 min. La muestra fue centrifugada a 12 krpm por 15 min a 2-8 °C. El sobrenadante fue desechado cuidadosamente, y el tubo ligeramente girado para remover toda traza de sobrenadante. La perla fue resuspendida en 400 pl regulador alto en sales (300 mM NaCl, 100 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA), y transferida a un tubo de 1.5 ml.
La reserva de fago fue extrafda repetidamente con un volumen igual de fenol: cloroformo: alcohol isoamnlico (50:49:1) hasta que no fue visible ninguna traza de una interfaz blanca, y luego se extrajo con un volumen igual de cloroformo: alcohol isoamnlico (49:1). El ADN fue precipitado con 2.5 volumenes que etanol y 1/5 volumen de 7.5 M de acetato de amonio y cinco o por 30 min a -20 °C. El ADN fue centrifugado a 14 krpm por 10 min a 4 °C., La perla fue la paga una vez con 70% de etanol frio, y secada al vacfo. El ADN del molde de uracilo fue disuelta en 30 pl de agua esteril y se determino la concentracion por A260 usando una absorbancia de 1.0 para una concentracion de 40 pg/ml. El molde fue diluido a 250 ng/pL con agua esteril, se tomaron alfcuotas, y se almaceno a -20 °C.
Mutagenesis del molde de uracilo con ss-ADN y electroporacion en E. Coli para generar bibliotecas de fago de anticuerpos
Las bibliotecas de despliegue de fago de anticuerpos fueron generadas al introducir simultaneamente genes de cadena pesada y ligera de una sola hebra sobre un molde de uracilo de vector de despliegue de fago. Se realizo una mutagenesis tfpica a una escala de 2 pg por mezclado de lo siguiente en un tubo de reaccion de 0.2 ml de PCR: 8 pl de (250 ng/pL) del molde de uracilo, 8 pL de 10* regulador de anillado (200 mM Tris pH 7.0, 20 mM MgCl2, 500 mM NaCl), 3.33 pl de inserto de cadena pesada de una sola hebra cinasado (100 ng/pL), 3.1 pl inserto de cadena ligera de una sola hebra (100 ng/pL), y agua esteril hasta 80 pl. El ADN fue anillado en un ciclizador GeneAmp(R) 9600 thermal usando el siguiente perfil termico: 20 seg a 94 °C., 85 °C. por 60 seg, 85 °C. a 55 °C. en rampa sobre 30 min, manteniendo a 55 °C. por 15 min. El ADN fue transferido a hielo despues de que termino el programa. La extension/ligadura fue realizada al anadir 8 pl de 10* regulador de smtesis (5 mM cada dNTP, 10 mM ATP, 100 mM Tris pH 7.4, 50 mM MgCl2, 20 mM DTT), 8 pL T4 ADN ligasa (1 U/pL, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), 8 pL de T7 ADN polimerasa diluida (1 U/pL, New England BioLabs, Beverly, Mass.) e incubando a 37 °C. por 30 min.
La reaccion fue detenida con 300 pL de regulador del paro de mutagenesis (10 mM Tris pH 8.0, 10 mM EDTA). El ADN de mutagenesis fue extrafdo una vez con fenol equilibrado (pH>8):cloroformo:alcohol isoairnlico (50:49:1), una vez con cloroformo: alcohol isoairnlico (49:1), y el ADN fue precipitado en etanol a -20 °C. por al menos 30 min. El ADN fue perlado y el sobrenadante fue removido cuidadosamente como se describio antes. La mezcla fue girada 5 brevemente de nuevo y se removieron todas las razas de etanol con una pipeta. La perla fue secada al vado. El ADN fue resuspendido en 4 pL de agua esteril.
Un microlitro de ADN de mutagenesis (500 ng) fue transferido en 40 pl de E. coli DH12S electrocompetente (Gibco/BRL, Gaithersburg, Md.) usando electroporacion. Las celulas transformadas fueron mezcladas con aproximadamente 1.0 ml de de celulas XL-1 durante la noche que fueron diluidas con caldo 2*YT a 60% del volumen 10 original. Luego esta mezcla fue transferida a un tubo de cultivo esteril de 15-ml y se anadieron 9 ml de agar superior en una placa de Agar LB de 150-mm. Las placas fueron incubadas por 4 hrs a 37° C. y luego transferidas a 20° C. Durante la noche. Se formaron fagos de anticuerpos de primera ronda al eluir al fago fuera de las placas en 10 ml de 2*YT, girando los desechos y tomando el sobrenadante. Estas muestras son las bibliotecas de despliegue de fago de anticuerpos usadas para seleccionar anticuerpos contra Cadherina-17. La eficiencia de las electroporaciones fue 15 medida al colocar en placas 10 pl de una dilucion al 10-4 de celulas suspendidas en placas de agar LB, seguido por incubacion durante la noche de las placas a 37 °C. La eficiencia fue calculada al multiplicar el numero de placas en la placa de dilucion al 10-4 por 106. Las eficiencias de electroporacion de la biblioteca son tfpicamente mayores que 1*107 fagos bajo estas condiciones.
Transformacion de E. coli por electroporacion
20 Celulas electrocompetentes de E. coli celulas fueron congeladas en hielo. El ADN fue mezclado con 40 L de estas celulas al tomar suavemente con una pipeta las celulas hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces, siendo cuidadoso de no introducir una burbuja de aire. Las celulas fueron transferidas a una cubeta Gene Pulser (hueco de 0.2 cm, BioRAD, Hercules, Calif.) que ha sido enfriada en hielo, de nuevo siendo cuidadoso de no introducir una burbuja de aire en la transferencia. La cubeta fue colocada en el pulsador de E. coli (BioRAD, Hercules, Calif.) y electroporada con el 25 voltaje establecido a 1.88 kV de acuerdo con la recomendacion del fabricante. La muestra transformada fue inmediatamente resuspendida en 1 ml de caldo 2*YT o 1 ml de una mezcla de 400 pl 2*YT/600 pl durante la noche de celulas XL-1 y procesada de acuerdo los procedimientos.
Colocacion en placas del fago M13 o celulas transformadas con reaccion de mutagenesis de vector de despliegue de fago de anticuerpo
30 Se anadieron muestras de fago a 200 pL de un cultivo nocturno de E. coli XL1-Azul cuando se colocaron en placas en placas de agar LB de 100 mm o en 600 pL de celulas nocturnas cuando se colocaron en placas en placas de 150 mm en tubos de cultivo esteriles de 15 ml. Despues de anadir agar LB superior (3 ml para placas de 100 mm o 9 ml para placas de 150 mm, se almaceno el agar superior a 55 °C. (vease el Apendice A1, Sambrook et al., supra.), La mezcla fue distribuida uniformemente en una placa de agar LB que fue previamente calentada (37 °C.-55 °C.) Para 35 remover cualquier exceso de humedad en la superficie del agar. Las placas fueron enfriadas a temperatura ambiente hasta que solidifico el agar superior. Las placas fueron invertidas e incubadas a 37 °C. segun fue indicado.
Preparacion de Cadherina-17 biotinilada y anticuerpos biotinilados
Un antfgeno de Cadherina-17 recombinante concentrado (dominio extracelular de longitud completa) fue dializado extensamente en BBS (20 mM borato, 150 mM NaCl, 0.1% NaN3, pH 8.0). Despues de la dialisis, se hizo reaccionar 40 1 mg de Cadherina-17 (1 mg/ml en BBS) con un exceso molar de 15 veces de ester de biotina-XX-NHS (Molecular
Probes, Eugene, Oreg., Solucion de reserva en 40 mM en DMSO). La reaccion fue incubada a temperatura ambiente por 90 min y luego templada con taurina (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) a una concentracion final de 20 mM. La mezcla de reaccion biotinilada fue entonces dializada contra BBS a 2-8 °C. Despues de la dialisis, la Cadherina-17 biotinilada fue diluida en un regulador amplificador (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mg/ml BSA, 0.1% 45 Tween 20, pH 7.5), se tomaron alfcuotas, y se almaceno a -80 °C. hasta que fue requerido.
Los anticuerpos se hicieron reaccionar con 3-(N-maleimidilpropionil)biocitina (Molecular Probes, Eugene, Oreg.) usando una cistema libre ubicada en el extremo carboxi de la cadena pesada. Los anticuerpos fueron reducidos al anadir DTT a una concentracion final de 1 mM por 30 min a temperatura ambiente. El anticuerpo reducido fue
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pasado a traves de una columna de desalacion Sephadex G50 equilibrada en 50 mM fosfato de potasio, 10 mM acido borico, 150 mM NaCl, pH 7.0. 3-(N-maleimidilpropionil)-biocitina fue anadido a una concentracion final de 1 mM y la reaccion se dejo proceder a temperatura ambiente por 60 min. Luego las muestras fueron extensamente dializadas contra BBS y almacenadas a 2-8 °C.
Preparacion de latex magnetico de avidina
El latex magnetico (Estapor, 10% de solidos, Bangs Laboratories, Fishers, Ind.) fue resuspendido perfectamente y se tomaron alfcuotas de 2 ml en un tubo conico de 15 ml. El latex magnetico fue suspendido en 12 ml de agua destilada y separado de la solucion por 10 min usando un iman (PerSeptive Biosystems, Framingham, Mass.). Mientras se mantema la separacion del latex magnetico con el iman, el lfquido fue cuidadosamente removido usando una pipeta de 10 ml esteril. Este procedimiento de lavado fue repetido tres veces mas. Despues del lavado final, el latex fue resuspendido en 2 ml de agua destilada. En un tubo conico separado de 50 ml, se disolvieron 10 mg de avidina-HS (NeutrAvidin, Pierce, Rockford, Ill.) en 18 ml de 40 mM Tris, 0.15 M cloruro de sodio, pH 7.5 (TBS). Mientras se sometio a vortice, los 2 ml del latex magnetico fueron anadidos a la avidina-HS diluida y la mezcla se mezclo por otros 30 segundos. Esta mezcla fue incubada a 45 °C. por 2 hr, agitando cada 30 minutos. El latex magnetico de avidina fue separado de la solucion usando un iman y se lavo tres veces con 20 ml de BBS como se describio antes. Despues del lavado final, el latex fue resuspendido en 10 ml de BBS y almacenado a 4 °C.
Inmediatamente antes del uso, el latex magnetico de avidina fue equilibrado en regulador de amplificacion (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mg/ml BSA, 0.1% Tween 20, pH 7.5). El latex magnetico de avidina necesario para un experimento de amplificacion (200 pl/muestra) fue anadido a un tubo de centrifugacion esteril de 15 ml y llevado a 10 ml con regulador de amplificacion. Estuvo fue colocado sobre el iman por 10 min para separar el latex. La solucion fue cuidadosamente removida con una pipeta esteril de 10 ml como se describio antes. El latex magnetico fue re suspendido en regulador de amplificacion para iniciar el segundo lavado. El latex magnetico fue lavado un total de 3 veces con regulador de amplificacion. Despues del lavado final, el latex fue resuspendido en regulador de amplificacion al volumen inicial.
Ejemplo 2
Seleccion de anticuerpos recombinantes policlonales al antfgeno de Cadherina-17
Los reactivos de union que se unen espedficamente a Cadherina-17 fueron seleccionados de las bibliotecas de despliegue de fagos creadas a partir de ratones dperinmunizados como se describio en el Ejemplo 1.
Amplificacion
Los fagos de anticuerpo de primera ronda fueron preparados como se describio en el Ejemplo 1 usando un molde de uracilo BS45. Las electroporaciones del ADN de mutagenesis fueron realizadas produciendo muestras de fagos derivadas de diferentes ratones inmunizados. Para crear mas diversidad en la biblioteca policlonal recombinante, cada muestra de fago fue amplificada por separado.
Antes de la primera ronda de amplificacion funcional con antfgeno de Cadherina-17 biotinilado, se seleccionaron bibliotecas de fagos de anticuerpos para que los fagos desplegaran tanto cadenas pesadas como ligeras en su superficie por amplificacion con latex magnetico 7F11 (como se describe en los Ejemplos 21 y 22 de la Solicitud de Patente de E.U.A. Ser. No. 08/835,159, presentada en Abr. 4, 1997). La amplificacion funcional de estas bibliotecas enriquecidas fue realizada en principio como se describe en el Ejemplo 16 de la solicitud de Patente de E.U.A. Ser. No. 08/835,159. Espedficamente, 10 pL de 1*10-6 M de antfgeno de Cadherina-17 biotinilado antfgeno fue anadido a las muestras de fagos (aproximadamente una concentracion final de 1*10-8 M de Cadherina-17), y la mezcla se dejo llegar al equilibrio durante la noche a 2-8 °C.
Despues de alcanzar el equilibrio, las muestras fueron amplificadas con latex magnetico de avidina para capturar el fago del anticuerpo unido a la Cadherina-17. El latex magnetico de avidina equilibrado (Ejemplo 1), 200 pL latex por muestra, fue incubado con el fago por 10 min a temperatura ambiente. Despues de 10 min, aproximadamente 9 ml de regulador de amplificacion fue anadido a cada muestra de fago, y y se separo el latex magnetico de la solucion usando un iman. Despues de una separacion de diez minutos, el fago sin unir fue removido cuidadosamente usando
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una pipeta esteril de 10 ml. El latex magnetico fue entonces resuspendido en 10 ml de regulador densificacion para iniciar el segundo lavado. El latex fue lavado un total de tres veces como se describio antes. Para cada lavado, los tubos se pusieron en contacto con el iman por 10 min para separar al fago separados sin unir del latex magnetico. Despues de la tercera lavada, el latex magnetico fue resuspendido en 1 ml de regulador de amplificacion y transferido a un tubo de 1.5 mL. El volumen completo del latex magnetico de cada muestra fue entonces recolectado y resuspendido en 200 pl 2*YT y colocado en placas en placas LB de 150 mm como se describio en el Ejemplo 1 para amplificar al fago unido. Las placas fueron incubadas a 37 °C. por 4 hr, luego durante la noche a 20 °C.
Las placas de 150 mm usadas para amplificar el fago unido fueron usadas para generar la siguiente ronda de fagos de anticuerpos. Despues de incubacion durante la noche, la segunda ronda de fagos de anticuerpos fueron eluidos a partir de placas de 150 mm al pipetear 10 mL de medio 2*YT sobre el tamiz y agitando suavemente la placa a temperatura ambiente por 20 min. Las muestras de fago fueron transferidas a tu voz de centrifugacion esteriles desechables de 15 ml con un tapon de sello obturador, y los desechos de la placa LB fueron peletizados al centrifugar los tubos por 15 min a 3500 rpm. El sobrenadante que contema la segunda ronda de fagos de anticuerpos fue entonces transferido a un nuevo tubo.
Se establecio una segunda ronda de amplificacion funcional al diluir 100 pL de cada reserva de fago en 900 pL de regulador de amplificacion en tubos de centrifugacion esteriles desechables de 15 ml. El antfgeno de Cadherina-17 biotinilado fue entonces anadido a cada muestra como se describio para la primera ronda de amplificacion, y las muestras de fago fueron incubadas por 1 hr a temperatura ambiente. Las muestras de fagos fueron entonces amplificadas con latex magnetico de avidina como se describio antes. Se monitorizo el progreso de la amplificacion en este punto al colocar alfcuotas en placas de cada muestra de latex en placas de agar LB de 100 mm LB para determinar el porcentaje de positivos de kapa. La mayor parte del latex de cada amplificacion (99%) fue colocado en placas en placas de agar LB de 150 mm para amplificar el fago unido al latex. Las placas de agar LB de 100 mm fueron incubadas a 37 °C. por 6-7 hr, despues de lo cual las placas fueron transferidas a temperatura ambiente y se tendieron filtros de nitrocelulosa (tamano del poro de 0.45 mm, BA85 Protran, Schleicher y Schuell, Keene, N.H.) sobre las placas.
Las placas con filtros de nitrocelulosa fueron incubadas durante la noche a temperatura ambiente y luego se desarrollaron con un conjugado de fosfatasa alcalina kapa cabra anti-raton para determinar el porcentaje de positivos kapa como se describe a continuacion. Las muestras de fago con menores porcentajes (<70%) de positivos kapa en la poblacion fueron sometidos a una ronda de amplificacion con latex magnetico 7F11 antes de realizar una tercera ronda funcional de amplificacion durante la noche a 2-8 °C. usando antfgeno de Cadherina-17 biotinilado a aproximadamente 2*10'9 M. esta ronda de amplificacion tambien fue monitorizada para los positivos kapa. Las muestras individuales de fagos que tuvieron porcentajes positivos de kapa mayores que 80% fueron combinadas y sometidas a una ronda final de amplificacion durante la noche a 2-8 °C. a 5*10-9 M de Cadherina-17. Los genes de anticuerpo contenidos dentro del fago eluido de esta cuarta ronda de densificacion funcional fueron subclonados en el vector de expresion, pBRncoH3.
El procedimiento de subclonacion fue realizado en general como se describe en el Ejemplo 18 de la solicitud de Patente de E.U.A. Ser. No. 08/835,159. Despues de la subclonacion, el vector de expresion fue electroporado en celulas DH10B y la mezcla se dejo crecer durante la noche en 2*YT que contema 1% de glicerol y 10 pg/ml de tetraciclina. Despues de una segunda ronda de crecimiento y seleccion en tetraciclina, alfcuotas de las celulas fueron congeladas a -80° C. Como la fuente de produccion de anticuerpos policlonales para Cadherina-17. Los anticuerpos monoclonales fueron seleccionados de esas mezclas policlonales al colocar en placas una muestra de la mezcla en placas de agar LB que conteman 10 pg/ml de tetraciclina y se examino para anticuerpos que reconocieron la Cadherina-17.
Expresion y purificacion de anticuerpos recombinantes contra Cadherina-17
Se genero un inoculado en un matraz agitado durante la noche a -70 °C. De un banco de celulas en un agitador incubador Innova 4330 (New Brunswick Scientific, Edison, N.J.) ajustado a 37 °C., 300 rpm. El inoculado fue usado para sembrar un fermentador de 20 L (Applikon, Foster City, Calif.) que que contema un medio de cultivo definido (Pack et al. (1993) Bio/Technology 11: 1271-1277) suplementado con 3 g/L L-leucina, 3 g/L L-isoleucina, 12 g/L digestor de casema (Difco, Detroit, Mich.), 12.5 g/L glicerol y 10 pg/ml tetraciclina. La temperatura, pH y oxfgeno disuelto en el fermentado fueron controlados a 26 °C., 6.0-6.8 y 25% de saturacion, respectivamente. Se controlo la
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espuma por adicion de propilen glicol (Dow, Midland, Mich.). Se anadio glicerol al fermentado en un modo alimentado por lo que es. Se indujo la expresion Fab por adicion de L(+)-arabinosa (Sigma, St. Louis, Mo.) a 2 g/L durante la fase tardfa de crecimiento logafftmico. Se midio la densidad celular por la densidad optica a 600 nm en un espectrofotometro UV-1201 (Shimadzu, Columbia, Md.). Despues del termino de la corrida y ajuste del pH a 6.0, el cultivo fue pasado dos veces a traves de un Microfluidizador M-210B-EH (Microfluidics, Newton, Mass.) a 1195 kg/cm2 (17,000 psi). La homogeneizacion alta presion de las celulas libero el Fab en el sobrenadante del cultivo.
El primer paso en la purificacion fue cromatograffa de afinidad de metal inmovilizado de lecho expandido (EB-IMAC). La resina quelante Streamline(TM) (Pharmacia, Piscataway, N.J.) fue cargada con 0.1 M NiCl2 y luego fue expandida y equilibrada en 50 mM de acetato, 200 mM NaCl, 10 mM imidazol, 0.01% NaN3, regulador a pH 6.0 fluyendo en la direccion hacia arriba. Se uso una solucion de reserva para traer al homogenado del cultivo hasta 10 mM de imidazol, despues de lo cual fue diluido dos veces son mas en regulador de equilibrio para reducir el contenido de solidos humedos a menos de 5% en peso. Luego fue cargado en la columna Streamline fluyendo hacia arriba a una velocidad superficial de 300 cm/hr. Los desechos celulares pasaron a traves sin impedimento, pero el Fab fue capturado por medio de la interaccion de alta afinidad entre el mquel y la etiqueta de hexahistidina en la cadena pesada de Fab. Despues del lavado, el lecho expandido fue convertido a un lecho empacado y el Fab fue eluido con 20 mM de borato, 150 mM NaCl, 200 mM imidazol, 0.01% NaN3, regulador a pH 8.0 fluyendo en la direccion hacia abajo.
El segundo paso en la purificacion uso cromatograffa de intercambio ionico (IEC). Resina Q Sepharose FastFlow (Pharmacia, Piscataway, N.J.) fue equilibrada en 20 mM de borato, 37.5 mM NaCl, 0.01% NaN3, pH 8.0. La combinacion de elucion de Fab del paso EB-IMAC fue diluido cuatro veces en 20 mM de borato, 0.01% NaN3, pH 8.0 y cargado sobre la columna IEC. Despues del lavado, el Fab fue eluido con un gradiente de sal de 37.5-200 mM de NaCl. Las fracciones de la elucion fueron embargadas en su pureza usando un sistema Xcell II(TM) SDS-PAGE (Novex, San Diego, Calif.) Antes de la combinacion. Finalmente, el Fab combinado fue concentrado y diafiltrado en 20 mM borato, 150 mM NaCl, 0.01% NaN3, regulador a pH 8.0 para almacenamiento. Esto fue logrado en un sistema Sartocon Slice(TM) equipado con un casete 10,000 MWCO (Sartorius, Bohemia, N.Y.). Los rendimientos de la purificacion final fueron ffpicamente 50%. La concentracion del Fab purificadao fue medida por absorbancia de UV a 280 nm, suponiendo una absorbancia de 1.6 para a 1 mg/ml de solucion.
Ejemplo 3
Seleccion de anticuerpos para el anffgeno de Cadherina-17 a partir de preparaciones de membrana de tumor
Los anticuerpos seleccionados en el Ejemplo 2 fueron posteriormente examinados contra preparaciones de membrana de tumor para aislar anticuerpos que preferencialmente se unen a la Cadherina-17 en celulas de cancer y no al epitelio intestinal normal.
Las preparaciones de membrana del plasma biotiniladas de cancer colorrectal apareado y muestras de tejido adyacente normal fueron usados para amplificar muestras de fago con un latex magnetico de avidina para capturar al fago de anticuerpo unido a Cadherina-17 como se describio en el Ejemplo 2. Los anticuerpos fueron seleccionados de esas mezclas policlonales al examinar los anticuerpos que preferencialmente se unen Cadherina- 17 en las celulas de cancer colorrectal y no al epitelio intestinal normal. Luego estos anticuerpos fueron aislados como se describe en el Ejemplo 4 y analizados para la union a Cadherina-17.
Ejemplo 4
Seleccion de anticuerpos monoclonales a Cadherina-17 a partir de mezclas de anticuerpo policlonal recombinante
Los anticuerpos monoclonales contra Cadherina-17 fueron aislados de clones que conteman las mezclas policlonales recombinantes (Ejemplo 3) al colocar en placas una muestra diluida de la mezcla en placas de agar LB que conteman 10 pg/ml de tetraciclina. Entonces, las colonias individuales fueron probadas por su capacidad de producir anticuerpos que reconocieron a Cadherina-17 recombinante usando resonancia de plasmon superficial (BIACORE) (BIACORE, Uppsala, Suecia). La produccion a pequena escala de estos anticuerpos monoclonales fue efectuada usando un metodo de union por lotes a Ni-quelato (vease lo siguiente). Los anticuerpos aislados de este metodo fueron diluidos 1:3 en HBS-EP (0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% polisorbato 20
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(v/v)), capturados en un anticuerpo kapa cabra anti-raton (Southern Biotechnology Associates, Inc, Birmingham, Ala.) Acoplados a un circuito integrado detector BIACORE CM5, y probados por su capacidad de unirse a Cadherina-17 recombinante.
Minipreparacion de anticuerpos monoclonales por el metodo de union por lotes a Ni-quelato
Las colonias individuales fueron aisladas de las mezclas policlonales recombinante es (Ejemplo 3) y se usaron para inocular 3 ml de cultivos de medio 2*YT que contema 1% de glicerol suplementado con 10 pg/ml de tetraciclina. Estos cultivos fueron criados en un agitador incubado Innova 4330 (New Brunswick Scientific, Edison, N.J.) ajustado a 37 °C., 300 rpm. La siguiente manana 0.5 ml de cada cultivo fue usado para inocular matraces agitados que conteman 50 ml de medio definido, (Pack et al. (1993) Bio/Technology 11: 1271-1277) suplementado con 3 g/L L- leucina, 3 g/L L-isoleucina, 12 g/L digestion de casema (Difco, Detroit, Mich.), 12.5 g/L glicerol y 10 pg/ml de tetraciclina. Estos cultivos fueron agitados a 300 rpm, 37 °C. hasta que se alcanzo una densidad optica de 4 a 600 nm. Entonces fue inducida la expresion Fab anadiendo L(+)-arabinosa (Sigma, St. Louis, Mo.) a 2 g/L y cambiando la temperatura a 23 °C. con agitacion durante la noche. El siguiente dfa se anadio lo siguiente a los cultivos de 50 ml: 0.55 ml de 1 M imidazol, 5 ml B-PER (Pierce, Rockford, Ill.) y 2 ml de resina de Ni-quelante (Chelating Sepharose FastFlow(TM) resin Pharmacia, Piscataway, N.J.). La mezcla fue agitada a 300 rpm, 23 °C. por 1 hora despues de cuyo tiempo se detuvo la agitacion y se dejo a la resina depositarse en el fondo de los matraces por 15 minutos.
Entonces fue vertido el sobrenadante y la resina resuspendida en 40 ml de BBS (20 mM borato, 150 mM NaCl, 0.1% NaN3, pH 8.0) que contema 10 mM de imidazol. Esta suspension fue transferida a un tubo conico de 50 ml y la resina fue lavada un total de 3 veces con BBS que contema 10 mM de imidazol. El lavado fue efectuado por centrifugacion a baja velocidad (1100 rpm por 1 minuto), remocion del sobrenadante y, resuspension de la resina en BBS que contema 10 mM de imidazol. Despues que se elimino el sobrenadante del lavado final, se anadio, 0.5 ml de 1 M imidazol a cada tubo, se sometio a vortice brevemente, y se transfirio a un tubo de microcentrifugacion esteril. Las muestras fueron entonces centrifugadas a 14 krpm por 1 minuto y el sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo de micro centrifugacion. Los anticuerpos contenidos en el sobrenadante fueron entonces analizados para su union a Cadherina-17 usando un BIACORE (BIACORE, Uppsala, Suecia).
Ejemplo 5
Especificidad de anticuerpos monoclonales a Cadherina-17 determinada por analisis de citometna de flujo
La especificidad de los anticuerpos contra Cadherina-17 seleccionada en el Ejemplo 4 fue probada por citometna de flujo. Para probar la capacidad de los anticuerpos para unirse a una protema Cadherina-17 de superficie celular, los anticuerpos fueron incubados con celulas que expresan a Cadherina-17: LoVo y LS174T, lmeas de cancer colorrectal humano. Las celulas fueron lavadas y resuspendidas en PBS. Se aplicaron cuatro microlitros de las suspensiones a pozos de un portaobjetos de microscopio de ocho pozos y se dejaron secar al aire. Los portaobjetos fueron ligeramente calentados para fijar los untados al portaobjeto y se cubrieron con 0.1 mg/ml de anticuerpo diluido en PBS que contema 1% BSA. Los untados fueron incubados con anticuerpo por 1 h a 37 °C. En una camara de humedad. Despues del lavado de los portaobjetos tres veces por remojo en PBS por 5 min cada una, los untados fueron cubiertos con conjugado de fluorescema isotiocianato de conejo anti-raton IgG (H&L) F(ab')2 (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, Calif.) diluido 1:80 en PBS, 1% BSA, 0.05% Azul de Evans (Sigma). Los portaobjetos fueron incubados por 1 h a 37 °C. en una Camara de humedad que se lavo como se describio antes. Despues de un lavado final con agua desionizada, los portaobjetos fueron secados al aire en la oscuridad. Se montaron cubre objetos usando un medio de montaje al 90% de glicerol que contema 10 mg/ml p-fenilendiamina, pH 8.0.
Los resultados del analisis de citometna de flujo demostraron que 14 anticuerpos monoclonales PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 y PTA001_A14 se unieron de manera efectiva a la Cadherina-17 humana de superficie celular.
Ejemplo 6
Caracterizacion estructural de anticuerpos monoclonales a Cadherina-17
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Las secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de los anticuerpos monoclonales PTA001_A1, PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001_A13 y PTA001_A14 fueron obtenidas usando tecnicas estandar de PCR y fueron secuenciadas usando tecnicas estandar de secuenciacion de ADN.
Las secuencias anticuerpo pueden ser mutagenizadas para revertir los residuos de la lmea germinal a uno o mas residuos.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena pesada de PTA001_A1 se muestran en la Figura 1 y en las SEQ ID NO:59 y 35, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena ligera de PTA001_A1 se muestran en la Figura 13 y en las SEQ ID NO:71 y 47, respectivamente.
La comparacion de las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada de PTA001_A1 a las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demostro que la cadena pesada de PTA001_A1 cadena pesada utiliza un segmento Vh de la lmea germinal de murino Vh 7-39. Un analisis posterior de la secuencia Vh de PTA001_A1 usando el sistema Kabat de determinacion de region de CDR llego a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 1, y en las SEQ ID NOs:1, 5 y 14, respectivamente. La alineacion de la secuencia Vh de PTA001_A1 CDR1 a la secuencia de la lmea germinal Vh 7-39 se muestra en la Figura 25.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de PTA001_A1 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena ligera de PTA001_A1 utiliza un segmento Vk de la lmea germinal de murino Vk 1-110. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A1 Vk usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 13 y en la SEQ ID NOs:22, 28 y 32, respectivamente. Las alineaciones de las secuencias Vk de CDR1 y CDR3 de PTA001_A1 a la secuencia de la lmea germinal Vk 1110 se muestran en las Figuras 27 y 29, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena pesada de PTA001_A2 se muestran en la Figura 2 y en la SEQ ID NO: 60 y 36, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena ligera de PTA001_A2 se muestran en la Figura 14 y en la SEQ ID NO: 72 y 48, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de PTA001_A2 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena pesada de PTA001_A2 utiliza un segmento Vh de la lmea germinal de murino Vh VH105 y Gen H17 Vh II. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A2 Vh usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 2 y en la SEQ ID NOs:2, 6 y 15, respectivamente. Las alineaciones de las secuencias Vh de CDR1 de PTA001_A2 a la secuencia de la lmea germinal del gen H17 Vh II se muestran en la Figura 25, y la alineacion de la secuencia de Vh de CDR2 de PTA001_A2 a la region de la lmea germinal Vh II se muestra en Figura 26.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de PTA001_A2 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena ligera de PTA001_A2 utiliza un segmento Vk de la lmea germinal de murino Vk 24-140. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A2 Vk usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 14 y en la SEQ ID NOs:23, 29 y 33, respectivamente. Las alineaciones de las secuencias Vk de CDR1 y CDR3 de PTA001_A2 a la secuencia de la lmea germinal Vk 24140 se muestran en las Figuras 27, 28 y 29, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena pesada de PTA001_A3 se muestran en la Figura 3 y en la SEQ ID NO: 61 y 37, respectivamente.
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La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de PTA001_A3 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena pesada de PTA001_A3 utiliza un segmento Vh de la lmea germinal de murino VH105 de region Vh II y gen H17 Vh II. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A3 Vh usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 3 y en la SEQ ID NOs:3, 7 y 16, respectivamente. La alineacion de la secuencia Vh de CDR1 de PTA001_A3 a la secuencia de la lmea germinal del gen H17 Vh II se muestran en la Figura 25, y la alineacion de la secuencia de Vh de CDR2 de PTA001_A3 a la region de la lmea germinal Vh II se muestra en Figura 26.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de PTA001_A3 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena ligera de PTA001_A3 utiliza un segmento Vk de la lmea germinal de murino Vk 24-140. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A3 Vk usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 14 y en la SEQ ID NOs:23, 29 y 33, respectivamente. Las alineaciones de las secuencias Vk de CDR1, CDR2 y CDR3 de PTA001_A3 a la secuencia de la lmea germinal Vk 24-140 se muestran en las Figuras 27, 28 y 29, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena pesada de PTA001_A4 se muestran en la Figura 4 y en la SEQ ID NO: 62 y 38, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena ligera de PTA001_A4 se muestran en la Figura 15 y en la SEQ ID NO: 73 y 49, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de PTA001_A4 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena pesada de PTA001_A4 utiliza un segmento Vh de la lmea germinal de murino VH105 de region Vh II y gen H17 Vh II. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A4 Vh usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 4 y en la SEQ ID NOs:4, 8 y 17, respectivamente. La alineacion de la secuencia Vh de CDR1 de PTA001_A4 a la secuencia de la lmea germinal del gen H17 Vh II se muestran en la Figura 25, y la alineacion de la secuencia de Vh de CDR2 de PTA001_A4 a la region de la lmea germinal Vh II se muestra en Figura 26.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de PTA001_A4 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena ligera de PTA001_A4 utiliza un segmento Vk de la lmea germinal de murino Vk 8-30. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A4 Vk usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 15 y en la SEQ ID NOs:24, 30 y 34, respectivamente. Las alineaciones de las secuencias Vk de CDR1, CDR2 y CDR3 de PTA001_A4 a la secuencia de la lmea germinal Vk 8-30 se muestran en las Figuras 27, 28 y 29, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena pesada de PTA001_A5 se muestran en la Figura 5 y en la SEQ ID NO: 63 y 39, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena ligera de PTA001_A5 se muestran en la Figura 16 y en la SEQ ID NO: 74 y 50, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de PTA001_A5 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena pesada de PTA001_A5 utiliza un segmento Vh de la lmea germinal de murino VH105 de region Vh II y gen H17 Vh II. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A5 Vh usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 5 y en la SEQ ID NOs:3, 7 y 18, respectivamente. La alineacion de la secuencia Vh de CDR1 de PTA001_A5 a la secuencia de la lmea germinal del gen H17 Vh II se muestran en la Figura 25, y la alineacion de la secuencia de Vh
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Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena pesada de PTA001_A6 se muestran en la Figura 6 y en la SEQ ID NO: 64 y 40, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena ligera de PTA001_A6 se muestran en la Figura 17 y en la SEQ ID NO: 75 y 51, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de PTA001_A6 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena pesada de PTA001_A6 utiliza un segmento Vh de la lmea germinal de murino VH105 de region Vh II y gen H17 Vh II. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A6 Vh usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 6 y en la SEQ ID NOs:3, 7 y 16, respectivamente. La alineacion de la secuencia Vh de CDR1 de PTA001_A6 a la secuencia de la lmea germinal del gen H17 Vh II se muestran en la Figura 25, y la alineacion de la secuencia de Vh de CDR2 de PTA001_A6 a la region VH105 de la lmea germinal Vh II se muestra en Figura 26.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de PTA001_A6 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena ligera de PTA001_A6 utiliza un segmento Vk de la lmea germinal de murino Vk 24-140. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A6 Vk usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 17 y en la SEQ ID NOs:23, 29 y 33, respectivamente. Las alineaciones de las secuencias Vk de CDR1, CDR2 y CDR3 de PTA001_A6 a la secuencia de la lmea germinal Vk 24-140 se muestran en las Figuras 27, 28 y 29, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena pesada de PTA001_A7 se muestran en la Figura 7 y en la SEQ ID NO: 65 y 41, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena ligera de PTA001_A7 se muestran en la Figura 18 y en la SEQ ID NO: 76 y 52, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de PTA001_A7 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena pesada de PTA001_A7 utiliza un segmento Vh de la lmea germinal de murino VH105 de region Vh II y gen H17 Vh II. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A7 Vh usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 7 y en la SEQ ID NOs:3, 9 y 19, respectivamente. La alineacion de la secuencia Vh de CDR1 de PTA001_A7 a la secuencia de la lmea germinal del gen H17 Vh II se muestran en la Figura 25, y la alineacion de la secuencia de Vh de CDR2 de PTA001_A7 a la region de la lmea germinal Vh II se muestra en Figura 26.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de PTA001_A7 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena ligera de PTA001_A7 utiliza un segmento Vk de la lmea germinal de murino Vk 24-140. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A7 Vk usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 18 y en la SEQ ID NOs:26, 29 y 33, respectivamente. Las alineaciones de las secuencias Vk de CDR1, CDR2 y CDR3 de PTA001_A7 a la secuencia de la lmea germinal Vk 24-140 se muestran en las Figuras 27, 28 y 29, respectivamente.
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Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena pesada de PTA001_A8 se muestran en la Figura 8 y en la SEQ ID NO: 66 y 42, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena ligera de PTA001_A8 se muestran en la Figura 19 y en la SEQ ID NO: 77 y 53, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de PTA001_A8 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena pesada de PTA001_A8 utiliza un segmento Vh de la lmea germinal de murino VH105 de region Vh II y gen H17 Vh II. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A8 Vh usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 8 y en la SEQ ID NOs:3, 7 y 16, respectivamente. La alineacion de la secuencia Vh de CDR1 de PTA001_A8 a la secuencia de la lmea germinal del gen H17 Vh II se muestran en la Figura 25, y la alineacion de la secuencia de Vh de CDR2 de PTA001_A8 a la region VH105 de la lmea germinal Vh II se muestra en Figura 26.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de PTA001_A8 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena ligera de PTA001_A8 utiliza un segmento Vk de la lmea germinal de murino Vk 24-140. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A8 Vk usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 19 y en la SEQ ID NOs:23, 29 y 33, respectivamente. Las alineaciones de las secuencias Vk de CDR1, CDR2 y CDR3 de PTA001_A8 a la secuencia de la lmea germinal Vk 24-140 se muestran en las Figuras 27, 28 y 29, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena pesada de PTA001_A9 se muestran en la Figura 6 y en la SEQ ID NO: 64 y 40, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena ligera de PTA001_A9 se muestran en la Figura 20 y en la SEQ ID NO: 78 y 54, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de PTA001_A9 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena pesada de PTA001_A9 utiliza un segmento Vh de la lmea germinal de murino VH105 de region Vh II y gen H17 Vh II. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A9 Vh usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 6 y en la SEQ ID NOs:3, 7 y 16, respectivamente. La alineacion de la secuencia Vh de CDR1 de PTA001_A9 a la secuencia de la lmea germinal del gen H17 Vh II se muestran en la Figura 25, y la alineacion de la secuencia de Vh de CDR2 de PTA001_A9 a la region VH105 de la lmea germinal Vh II se muestra en Figura 26.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de PTA001_A9 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena ligera de PTA001_A9 utiliza un segmento Vk de la lmea germinal de murino Vk 24-140. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A9 Vk usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 20 y en la SEQ ID NOs:23, 29 y 33, respectivamente. Las alineaciones de las secuencias Vk de CDR1, CDR2 y CDR3 de PTA001_A9 a la secuencia de la lmea germinal Vk 24-140 se muestran en las Figuras 27, 28 y 29, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena pesada de PTA001_A10 se muestran en la Figura 6 y en la SEQ ID NO: 64 y 40, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena ligera de PTA001_A10 se muestran en la Figura 21 y en la SEQ ID NO: 79 y 55, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de PTA001_A10 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena pesada de PTA001_A10 utiliza un segmento Vh de la lmea germinal de murino VH105 de region Vh II y gen H17 Vh II. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A10 Vh usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR
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condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 6 y en la SEQ ID NOs:3, 7 y 16, respectivamente. La alineacion de la secuencia Vh de CDR1 de PTA001_A10 a la secuencia de la lmea germinal del gen H17 Vh II se muestran en la Figura 25, y la alineacion de la secuencia de Vh de CDR2 de PTA001_A10 a la region VH105 de la lmea germinal Vh II se muestra en Figura 26.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de PTA001_A10 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena ligera de PTA001_A10 utiliza un segmento Vk de la lmea germinal de murino Vk 24-140. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A10 Vk usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 19 y en la SEQ ID NOs:25, 29 y 33, respectivamente. Las alineaciones de las secuencias Vk de CDR1, CDR2 y CDR3 de PTA001_A10 a la secuencia de la lmea germinal Vk 24-140 se muestran en las Figuras 27, 28 y 29, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena pesada de PTA001_A11 se muestran en la Figura 9 y en la SEQ ID NO: 67 y 43, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena ligera de PTA001_A11 se muestran en la Figura 22 y en la SEQ ID NO: 80 y 56, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de PTA001_A11 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena pesada de PTA001_A11 utiliza un segmento Vh de la lmea germinal de murino VH105 de region Vh II y gen H17 Vh II. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A11 Vh usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 9 y en la SEQ ID NOs:3, 10 y 20, respectivamente. La alineacion de la secuencia Vh de CDR1 de PTA001_A11 a la secuencia de la lmea germinal del gen H17 Vh II se muestran en la Figura 25, y la alineacion de la secuencia de Vh de CDR2 de PTA001_A11 a la region VH105 de la lmea germinal Vh II se muestra en Figura 26.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de PTA001_A11 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena ligera de PTA001_A11 utiliza un segmento Vk de la lmea germinal de murino Vk 24-140. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A11 Vk usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 22 y en la SEQ ID NOs:27, 29 y 33, respectivamente. Las alineaciones de las secuencias Vk de CDR1, CDR2 y CDR3 de PTA001_A11 a la secuencia de la lmea germinal Vk 24-140 se muestran en las Figuras 27, 28 y 29, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena pesada de PTA001_A12 se muestran en la Figura 10 y en la SEQ ID NO: 68 y 44, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena ligera de PTA001_A12 se muestran en la Figura 21 y en la SEQ ID NO: 81 y 55, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de PTA001_A12 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena pesada de PTA001_A12 utiliza un segmento Vh de la lmea germinal de murino VH105 de region Vh II y gen H17 Vh II. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A12 Vh usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 10 y en la SEQ ID NOs:3, 11 y 21, respectivamente. La alineacion de la secuencia Vh de CDR1 de PTA001_A12 a la secuencia de la lmea germinal del gen H17 Vh II se muestran en la Figura 25, y la alineacion de la secuencia de Vh de CDR2 de PTA001_A12 a la region VH105 de la lmea germinal Vh II se muestra en Figura 26.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de PTA001_A12 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena ligera de PTA001_A12 utiliza un segmento Vk de la lmea germinal de murino Vk 24-140. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A12 Vk usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 21 y en la SEQ ID NOs:25, 29 y 33,
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respectivamente. Las alineaciones de las secuencias Vk de CDR1, CDR2 y CDR3 de PTA001_A12 a la secuencia de la lmea germinal Vk 24-140 se muestran en las Figuras 27, 28 y 29, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena pesada de PTA001_A13 se muestran en la Figura 11 y en la SEQ ID NO: 69 y 45, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena ligera de PTA001_A13 se muestran en la Figura 23 y en la SEQ ID NO: 82 y 57, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de PTA001_A13 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena pesada de PTA001_A13 utiliza un segmento Vh de la lmea germinal de murino VH105 de region Vh II y gen H17 Vh II. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A13 Vh usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 11 y en la SEQ ID NOs:3, 12 y 18, respectivamente. La alineacion de la secuencia Vh de CDR1 de PTA001_A13 a la secuencia de la lmea germinal del gen H17 Vh II se muestran en la Figura 25, y la alineacion de la secuencia de Vh de CDR2 de PTA001_A13 a la region VH105 de la lmea germinal Vh II se muestra en Figura 26.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de PTA001_A13 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena ligera de PTA001_A13 utiliza un segmento Vk de la lmea germinal de murino Vk 24-140. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A13 Vk usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 23 y en la SEQ ID NOs:25, 31 y 33, respectivamente. Las alineaciones de las secuencias Vk de CDR1, CDR2 y CDR3 de PTA001_A13 a la secuencia de la lmea germinal Vk 24-140 se muestran en las Figuras 27, 28 y 29, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena pesada de PTA001_A14 se muestran en la Figura 12 y en la SEQ ID NO: 70 y 46, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de cadena ligera de PTA001_A14 se muestran en la Figura 24 y en la SEQ ID NO: 83 y 58, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de PTA001_A14 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena pesada de PTA001_A14 utiliza un segmento Vh de la lmea germinal de murino VH105 de region Vh II y gen H17 Vh II. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A14 Vh usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 12 y en la SEQ ID NOs:2, 13 y 15, respectivamente. La alineacion de la secuencia Vh de CDR1 de PTA001_A14 a la secuencia de la lmea germinal del gen H17 Vh II se muestran en la Figura 25, y la alineacion de la secuencia de Vh de CDR2 de PTA001_A14 a la region VH105 de la lmea germinal Vh II se muestra en Figura 26.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de PTA001_A14 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de la lmea germinal de murino conocida demuestra que la cadena ligera de PTA001_A14 utiliza un segmento Vk de la lmea germinal de murino Vk 24-140. Un analisis posterior de la secuencia PTA001_A14 Vk usando el sistema Kabat de determinacion de la region de CDR condujo a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 24 y en la SEQ ID NOs:23, 29 y 33, respectivamente. Las alineaciones de las secuencias Vk de CDR1, CDR2 y CDR3 de PTA001_A14 a la secuencia de la lmea germinal Vk 24-140 se muestran en las Figuras 27, 28 y 29, respectivamente.
Ejemplo 7
Inmunohistoqmmica en las secciones FFPE usando anticuerpos anti-Cadherina-17
La inmunohistoqmmica fue realizada en secciones FFPE de tejido de tumor colorrectal y adyacente normal usando los anticuerpos PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A6, PTA001_A8 y PTA001_A9.
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El EX-De-Wax fue de BioGenex, CA, USA. Las secciones y arreglos de tejido fueron de Biomax, MD, USA.
Los portaobjetos fueron calentados por 2 h a 60 0C en 50 ml de Falcons en un bano de agua sin regulador. Cada Falcon tuvo un portaobjetos o dos portaobjetos espalda con espalda con una punta de carga de gel larga entre ellos para prevenir que los portaobjetos se pegaran uno al otro. Los portaobjetos fueron desparafinizados en EZ-DeWax por 5 min en una mampara de deslizamiento negras, luego se encontraron bien con la misma solucion de DeWax usando una pipeta de 1 ml, luego se lavo con agua de la botella de agua. Los portaobjetos fueron colocados en una jarra coplin llena con agua hasta que estuvo lista la presion de la olla; el agua fue cambiada un par de veces.
El agua fue intercambiada por solucion de recuperacion de anrtgeno = 1 x regulador de citrato, pH 6 (DAKO). El anrtgeno fue recuperado por el metodo de olla a presion. Los porto objetos en la jarra coplin de plastico en solucion de recuperacion de anrtgeno fueron colocados en una olla a presion que luego fue calentada hasta la posicion 6 (el maximo ajuste). 15-20 min dentro de la incubacion, la temperatura fue reducida a la posicion 3 y se dejo a esa (cuando la temperatura al interior de la olla de presion fue 117 °C) por otros 20-25 minutos. Luego la pericia fue apagada y la fue colocada sobre la perilla fna y se libero la presion al mover cuidadosamente el mango a la posicion entre “abierto” y “cerrado”. El sistema completo se dejo liberar la presion y enfriar por otros 20 minutos. Se abrio la tapa y se sacaron las muestras para reposo en la mesa. Los portaobjetos fueron lavados 1x5min con PBS-3T (0.5 L PBS + 3 gotas de Tween-20) y colocados en PBS.
Despues de la recuperacion del anrtgeno, los portaobjetos fueron montados en el sistema Shandon Coverplate. Se previno que quedaron atrapadas con hojas de aire entre el portaobjetos y el cubre objetos de plastico para colocar al cubre objetos dentro de la jarra coplin llena con PBS y se deslizaron suavemente los portaobjetos con las secciones de tejido dentro del cubre objetos. Se jalo hacia afuera el portaobjetos de la jarra coplin mientras que se sujetaba fuertemente junto con el cubre objetos. El portaobjetos ensamblado fue colocado en el soporte, dejando que el PBS atrapado en el embudo y entre el portaobjetos cubre objetos se escapara. Los portaobjetos fueron lavados con 2x2 ml (or 4x1 ml) PBS-3T, 1x2 ml PBS, esperando a que se eliminara todo el PBS a traves del portaobjetos y que no quedara virtualmente nada de PBS en el embudo.
Se realizo un bloqueo de peroxido endogeno usando 1-4 gotas de solucion de peroxido por portaobjetos; el tiempo de incubacion fue de 5 minutos. Los portaobjetos fueron encuadrados con agua y luego una vez con 2 ml PBS; fue importante esperar hasta que virtualmente no quedo lfquido en el embudo antes de anadir una nueva porcion del regulador de lavado.
El anticuerpo primario diluido con un reactivo diluyente de anticuerpos (DAKO). La dilucion optima fue determinada siendo 1:400. Se aplico hasta 200 pl del anticuerpo primario diluido a cada portaobjetos y se incubo por 45 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos fueron lavados con 2x2 ml (o 4x1 ml) PBS-3T y luego 1x2 ml PBS.
Se aplico secundario cabra anti-raton kapa HRP (1 mg/ml, cat.1050-05, Southern Biotech) a 2x2 gotas por cubre objetos y se incubo por 35 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos fueron lavados como en lo anterior.
El sustrato DAB fue formado en regulador de dilucion; 2 ml que conteman 2 gotas de sustrato fue suficiente para los 10 portaobjetos. El reactivo DAB fue aplicado a los portaobjetos al aplicar unas cuantas gotas en un momento y dejando por 10 min. Los portaobjetos fueron lavados 1x2 ml (o 2x1 ml) con PBS-3T y 1x2 ml (o 2x1 ml) con PBS.
Se aplico hematoxilina (DAKO); 1 ml fue suficiente para 10 portaobjetos y los portaobjetos fueron inculpados por 1 min a temperatura ambiente. Los embudos del sistema Shandon Coverplate fueron llenados con 2 ml de agua y se dejo correr a traves de ellos. Cuando los portaobjetos estuvieron libres el exceso de hematoxilina, el sistema fue que se ensamblado, las secciones y/o arreglos de tejido fueron lavadas con agua de la botella de agua y colocadas dentro de un soporte de portaobjetos negro. Los tejidos fueron deshidratados al incubar en EZ-DeWax por 5 min y y luego en 95% de etanol por 2-5 min.
Los portaobjetos fueron dejados secar en una mesa a temperatura ambiente y luego se montaron en un medio de montaje se cubrieron con cubre objetos.
El analisis inmunohistoqmmico en los anticuerpos PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A6, PTA001_A8 y PTA001_A9 revelo una tincion espedfica de membrana de celulas de tumor en cancer colorrectal y ninguna tincion
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apreciable del tejido adyacente normal en todos los casos. El anticuerpo PTA001_A4, en particular, mostro una tincion clara espedfica de membrana de las celulas de tumor.
EJEMPLO 8
Inmunohistoqmmica en secciones congeladas usando anticuerpos anti-Cadherina-17
Se realizo inmunohistoqmmica en tejidos apareados de tumor y adyacentes normales congelados usando los anticuerpos anti-Cadherina-17 PTA001_A4, PTA001_A6, PTA001_A8 y PTA001_A9.
Las secciones de tejido fueron de BioCadena Institute Inc., CA, USA.
Las secciones congeladas fueron lavadas con PBS dos veces por 3 minutos cada vez y luego fueron colocadas en PBS.
Se realizo bloqueo de peroxido endogeno usando Bloqueador de Peroxidasa (S2001, DAKO). Se anadieron 1-4 gotas del bloqueador de peroxidasa a cada portaobjetos y se incubo por 5 minutos. Los objetos fueron encuadrados tres veces con 3 ml de PBS.
El anticuerpo primario fue diluido con un reactivo diluyente de anticuerpos (DAKO). 150 pl de anticuerpo primario diluido fue aplicado a cada portaobjetos e incubado por 45 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos fueron lavados dos veces por 3 minutos con PBS-3T (500 ml PBS + 3 gotas de Tween-20) y luego una vez por 3 minutos con PBS.
Se aplico secundario cabra anti-raton kapa HRP a 1:1000 (1 mg/ml, cat.1050-05, Southern Biotech) y se incubo por 35 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos fueron lavados como en lo anterior.
El sustrato DAB fue formado en regulador de dilucion; 2 ml que conteman 2 gotas de sustrato fue suficiente para los 10 portaobjetos. El reactivo DAB fue aplicado a los portaobjetos al aplicar unas cuantas gotas en un momento y dejando por 10 min. Los portaobjetos fueron lavados una vez por 3 minutos con PBS-3T y dos veces por 3 minutos con agua.
Se aplico hematoxilina (DAKO); 1 ml fue suficiente para 10 portaobjetos y los portaobjetos fueron inculpados por 1 min a temperatura ambiente.
Los portaobjetos fueron dejados secar en una mesa a temperatura ambiente y luego se montaron en un medio de montaje basado en agua de Vector y se cubrieron con cubre objetos.
El analisis inmunohistoqmmico en los anticuerpos PTA001_A4, PTA001_A6, PTA001_A8 y PTA001_A9 en tres muestras de cancer colorrectal junto con las muestras de tejido adyacente normal a pareadas revelaron una fuerte tincion espedfica de membrana de las celulas de tumor en el cancer colorrectal y una tincion debil del tejido adyacente normal. El anticuerpo PTA001_A4, en particular, mostro una tincion clara espedfica de membrana de las celulas de tumor.
Ejemplo 9
Transferencia Western usando anticuerpos anti-Cadherina-17
La transferencia Western fue realizada usando anticuerpos anti-Cadherina-17 PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A6, PTA001_A8 y PTA001_A9 para detectar a Cadherina-17 en un panel de lmeas celulares de cancer colorrectal geneticamente caracterizadas representando combinaciones de tres fenotipos de mutacion cntica (p53, APC y RER+/).
Perlas celulares congeladas subitamente fueron lisadas en regulador RIPA modificado (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP-40, 0.25% Na-deoxicolato, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) que conteman inhibidores de proteasa (Roche) y y se aclaro al girar a 18,000 g por 15 min a 4 C. en regulador de carga de muestra 4x LDS (Invitrogen Inc.) fue anadido al
lisado clarificado a una concentracion final de 1x; la muestra fue calentada por 10 min a 70 0C y mantenida a -80 0C posteriormente. Antes se cargar en gel las muestras fueron recalentadas.
Las protemas de 10 |jg (PC/JW) y 20 |jg (otras lmeas de celulas) de lisado por banda fueron separadas por electroforesis de mini-gel en mini-gel prefundido NuPAGE Novex (Invitrogen, UK). Los g fueron transferidos sobre 5 membrana de nitrocelulosa con un Sistema iBlot Dry Blotting (Invitrogen, UK).
La membrana fue incubada con bloqueador libre de animal (Vector) y probada con anticuerpo anti-Cadherina-17 en un bloqueador libre de animal a una dilucion de 1:500, a 4 C, por 14-18 h, con rotacion. El secundario fue el conjugado anti-raton DyLight 488 (Pierce).
Se detecto una senal clara a un tamano correspondiente a la protema Cadherina-17 (92 kDa) en 11 de las 14 lmeas 10 de celulas colorrectales elegidas para todos los 5 anticuerpos de 5 Cadherina-17 (PTA001_A3, PTA001_A4, PTA001_A6, PTA001_A8 y PTA001_A9). La Figura 25 muestra el analisis de transferencia Western de Cadherina- 17 para el anticuerpo PTA001_A4. Las lmeas de celulas fueron cuidadosamente seleccionadas para diferentes antecedentes geneticos relevantes para el inicio y progresion de CRC (RER+ = fenotipo de tumor positivo de error de replicacion; RER- = fenotipo de tumor deficiente de error de replicacion; p53 del tipo silvestre o ante y APC del 15 tipo silvestre o genotipo mutante. El Cuadro 2 siguiente muestra el fenotipo de las lmeas celulares derivadas del tumor colorrectal.
Tabla 2 - Fenotipo de lmeas celulares derivadas de tumores colorrectales
Lmea celular
Caractensticas
LS411
Carcinoma Colorrectal, etapa del Tumor: tipo B de Dukes; Tumorigenico en ratones desnudos.
LoVo
Adenocarcinoma Colorrectal, tipo C de Dukes, grado IV derivado del sitio metastasico; Tumorigenico en ratones desnudos.
Vaco 5
Carcinoma Colorrectal.
DLD-1
Adenocarcinoma Colorrectal, tipo C de Dukes; Tumorigenico en ratones desnudos.
LS 174T
Adenocarcinoma Colorrectal, tipo B de Dukes; Tumorigenico en ratones desnudos.
HCT 116
Colorrectal carcinoma, Tumorigenico en ratones desnudos.
PC/JW
Adenocarcinoma. Tumorigenico en ratones desnudos etflicos.
C99
Adenocarcinoma Colorrectal
C84
Adenocarcinoma Colorrectal
HT29
Adenocarcinoma Colorrectal Tumorigenico en ratones desnudos.
LS513
Adenocarcinoma Colorrectal, tipo C de Dukes; Tumorigenico en ratones desnudos.
NCI-H716
Adenocarcinoma Colorrectal Tumorigenico en ratones desnudos..
Caco2
Adenocarcinoma Colorrectal
Colo205
Adenocarcinoma Colorrectal
Ejemplo 10
20 Internalizacion de Anticuerpos anti-Cadherina-17
El PTA001_A4 mostro ser internalizado por celulas LoVo celulas con la union a las celulas usando un ensayo microscopico de inmunofluorescencia. El ensayo microscopico de inmunofluorescencia mostro la internalizacion de los anticuerpos monoclonales anti-Cadherina-17 a traves de la union de un conjugado de anticuerpo secundario IgG anti-humano a Fluorescema isotiocianato (GamK-FITC). Primero, los PTA001_A4 fueron unidos a la superficie de 25 celulas LoVo. Luego, el conjugado de anticuerpo secundario a Fluorescema isotiocianato fueron unidos a los anticuerpos primarios. Enseguida, el complejo de conjugado FITC PTA001_A4/anticuerpo secundario o internalizado por las celulas.
5
10
15
20
25
El ensayo de microscopia de inmunofluorescencia fue realizado como sigue: celulas LoVo fueron incubadas a 37oC por 12 horas para que las celulas se adhirieran entre sn El PTA001_A4 y el conjugado de anticuerpo secundario a Fluorescema isotiocianato fueron diluidos serialmente, lavados con regulador FACS (PBS, 2% FBS) y y luego anadidos el medio de cultivo. Luego el medio fue lavado del nuevo con regulador FACS (PBS, 2% FBS) e incubado al 37%, despues de lo cual se anadio 200 ul 2% de PFA. Los cubre objetos fueron montados usando 9 ul de un medio de montaje acuoso y luego las celulas fueron visualizadas a intervalos regulares de tiempo usando un microscopio fluorescente Leica. La Figura 32A y la Figura 32B muestran la superficie de union de PTA001_A4/complejo de conjugado FITC anticuerpo secundario a celulas LoVo despues de 60 minutos de incubacion e internalizacion de PTA001_A4/complejo de conjugado FITC anticuerpo secundario despues de 120 minutos.
El anticuerpo monoclonal PTA001_A4, demostro ser internalizado por celulas LS147T y LoVo con la union de las celulas usando un ensayo MabZap. El ensayo MabZAP mostro la internalizacion de los anticuerpos monoclonales anti-CDH17 a traves de la union de un anticuerpo secundario de IgG anti-humano conjugado a la toxina saporina. (Advanced Targeting System, San Diego, CA, IT-22-100). Primero, el PTA001_A4 fue unido a la superficie de las celulas LS147T y LoVo. Luego, los anticuerpos MabZAP fueron unidos a los anticuerpos primarios. Enseguida, el complejo MabZAP fue internalizado por las celulas. La entrada de Saporina dentro de las celulas resulto en la inhibicion de la smtesis de protemas y eventual muerte celular.
El ensayo MabZAP fue realizado como sigue. Cada una de las celulas fue sembrada a una densidad de 5x103 celulas por pozo. Los anticuerpos monoclonales anti-CDH17 o un piso tipo de control de IgG humano fueron serialmente diluidos luego anadidos a las celulas. Luego fue anadido el MabZAP a una concentracion de 50 pg/ml y las placas se dejaron incubar por 48 y 72 horas. Se detecto la viabilidad de las celulas en las placas mediante un Kit de Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CelulaTiter-Glo® (Promega, G7571) y las placas fueron lefdas a 490nM por un Luminomitor (Tuner BioSystems, Sunnyvale, CA). Los datos fueron analizados por Prism (Graphpad). La muerte celular fue proporcional a la concentracion de PTA001_A4 y anticuerpo monoclonal. Las Figuras 35A y 35B muestran que los anticuerpos monoclonales anti-CDH17 fueron eficazmente internalizados por las celulas LS174T y LoVo respectivamente en comparacion con el anticuerpo de control del isotipo IgG anti-humano.
LISTADO DE SECUENCIAS
SEQ ID NO
DESCRIPCION DE SECUENCIA SECUENCIA
1
VH CDR1 aminoacido PTA001 A1 GFTFSNYGMS
2
VH CDR1 aminoacido PTA001 A2,PTA001 A14 GYTFSDHAIH
3
VH CDR1 aminoacido PTA001_A3, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001 A12, PTA001 A13 GYTFTDHAIH
4
VH CDR1 aminoacido PTA001 A4 GYTLTDHTIH
5
VH CDR2 aminoacido PTA001 A1 AINRDGGTTYYTDNVKG
6
VH CDR2 aminoacido PTA001 A2 YIYPRHGTTNYNENFKG
7
VH CDR2 aminoacido PTA001 A3,PTA001 A5, PTA001_A6, PTA001_A8, PTA001 A9,PTA001 A10 YIYPEHGTIKYNEKFKG
8
VH CDR2 aminoacido PTA001 A4 YIYPRDGITGYNEKFKG
9
VH CDR2 aminoacido PTA001 A7 YIYPRDGFTKYNEKFKG
10
VH CDR2 aminoacido PTA001 A11 YIYPEHGSITYNEKFKG
11
VH CDR2 aminoacido PTA001 A12 YIYPRDDFAKVNEKFKG
12
VH CDR2 aminoacido PTA001 A13 YIYPEHGTITYNEKFKG
13
VH CDR2 aminoacido PTA001 A14 YIFPRDAFSLNNEKFKG
14
VH CDR3 aminoacido PTA001 A1 FLLWDGWYFDV
15
VH CDR3 aminoacido PTA001 A2,PTA001 A14 RNYFYVMDY
16
VH CDR3 aminoacido PTA001_A3, PTA001_A6, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001 A10 TNYFYVMEY
17
VH CDR3 aminoacido PTA001 A4 GYSYRNYAYYYDY
18
VH CDR3 aminoacido PTA001 A5,PTA001 A13 RNYLYIMDY
19
VH CDR3 aminoacido PTA001 A7 TNYFYTMDY
20
VH CDR3 aminoacido PTA001 A11 RNYLYVMDY
21
VH CDR3 aminoacido PTA001 A12 TNYLYIMDY
22
VK CDR1 aminoacido PTA001 A1 RSSQSLLHSNGNTYLH
23
VK CDR1 aminoacido PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A6, PTA001_A9, PTA001 A14 TSSKSLLRSNGNTYLY
24
VK CDR1 aminoacido PTA001 A4 KSSQSLLHSSNQKNYLA
25
VK CDR1 aminoacido PTA001_A5, PTA001_A8, PTA001_A10, PTA001_A12, PTA001 A13 RSSKSLLRSNGNTYLY
26
VK CDR1 aminoacido PTA001 A7 RSSKSLLRTNGNTYLH
27
VK CDR1 aminoacido PTA001 A11 RSTKSLLRSNGNTYLY
28
VK CDR2 aminoacido PTA001_A1 KVSNRFS
29
VK CDR2 aminoacido PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001 A14 RMSNLAS
30
VK CDR2 aminoacido PTA001 A4 WASTRES
31
VK CDR2 aminoacido PTA001_A5, PTA001_A8, PTA001_A13 RLSNLAS
32
VK CDR3 aminoacido PTA001_A1 SQSTHVLT
33
VK CDR3 aminoacido PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A5, PTA001_A6, PTA001_A7, PTA001_A8, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001 A13, PTA001 A14 MQHLEYPFT
34
VK CDR3 aminoacido PTA001_A4 QQYYSYPWT
35
VH aminoacido PTA001_A1 LGKPWRYPRFVHGENKVKQSTIALALLPLLFTPVAKAEVQLLETGGGWKPG GSLKLSCAASGFTFSNYGMSWVRQTPEKRLEWVAAINRDGGTTYYTDNVKG RFTISRDNAKNSLYLQMSSLRSEDTALYYCARQFLLWDGWYFDVWGAGTTV TVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSG VHTFPAVLOSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
36
VH aminoacido PTA001_A2 LGKPWRYPRFVHGENKVKQSTIALALLPLLFTPVAKAQVQLQQSDAELVKPG ASVKISCKVSGYTFSDHAIHWMSQRPGQGLKWIGYIYPRHGTTNYNENFKGK ATLTADTSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCARMRNYFYVMDYWGQGTSVTVS SAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVH TFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
37
VH aminoacido PTA001_A3 LGKPWRYPRFVHGENKVKQSTIALALLPLLFTPVAKAQVLLQQSDAELVKPG ASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQRPEQGLEWIGYIYPEHGTIKYNEKFKGKA TLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCSRLTNYFYVMEYWGQGTSVTVSSA KTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFP AVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
38
VH aminoacido PTA001_A4 LGKPWRYPRFVHGENKVKQSTIALALLPLLFTPVAKAEVQLQQSVAELVKPG ASVKMSCKVSGYTLTDHTIHWMKQRPEQGLEWIGYIYPRDGITGYNEKFKGK ATLTADTSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCARWGYSYRNYAYYYDYWGQGT TLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLS SGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPR DC
39
VH aminoacido PTA001_A5 LGKPWRYPRFVHGENKVKQSTIALALLPLLFTPVAKAQVQLQQSDADLVKPG ASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQRPEQGLEWIGYIYPEHGTIKYNEKFKGKA TLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCARLRNYLYIMDYWGQGTSVTVSSA KTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFP AVLOSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
40
VH aminoacido PTA001_A6, PTA001_A9, PTA001_A10 LGKPWRYPRFVHGENKVKQSTIALALLPLLFTPVAKAQVQLQQSDAELVKPG ASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQRPEQGLEWIGYIYPEHGTIKYNEKFKGKA TLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCSRLTNYFYVMEYWGQGTSVTVSSA KTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFP AVLOSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
41
VH aminoacido PTA001_A7 LGKPWRYPRFVHGENKVKQSTIALALLPLLFTPVAKAQVQLQQSDAELVKPG ASVKISCKVSGYTFTDHAIHWMKQRPEQGLEWIGYIYPRDGFTKYNEKFKGK ATLTADTSSSTAYMQLNSLTSEDSTVYFCARMTNYFYTMDYWGQGTSVTVS SAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVH TFPAVLOSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
42
VH aminoacido PTA001_A8 LGKPWRYPRFVHGENKVKQSTIALALLPLLFTPVAKAQVQLQQSDADLVKPG ASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQRPEQGLEWIGYIYPEHGTIKYNEKFKGKA TLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCSRLTNYFYVMEYWGQGTSVTVSSA KTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFP AVLOSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
43
VH aminoacido PTA001_A11 LGKPWRYPRFVHGENKVKQSTIALALLPLLFTPVAKAQVQLQQSDAELVKPG ASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQRPEQGLEWIGYIYPEHGSITYNEKFKGKA TLTADKSSSTVYMHLNSLTSEDSAVYFCARLRNYLYVMDYWGQGTSVTVSS AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHT FPAVLOSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
44
VH aminoacido PTA001_A12 LGKPWRYPRFVHGENKVKQSTIALALLPLLFTPVAKAQVQLQQSEAELVKPG ASVKLSCKASGYTFTDHAIHWMKQRPEQGLEWIGYIYPRDDFAKVNEKFKG KATLTADTSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCARMTNYLYIMDYWGQGTSVTV SSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGV HTFPAVLOSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
45
VH aminoacido PTA001_A13 LGKPWRYPRFVHGENKVKQSTIALALLPLLFTPVAKAQVQLQQSDAELVKPG ASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQRPEQGLEWIGYIYPEHGTITYNEKFKGKA TLTADKSSSTVYMHLNSLTSEDSAVYFCARLRNYLYIMDYWGQGTSVTVSSA KTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFP AVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
46
VH aminoacido PTA001_A14 LGKPWRYPRFVHGENKVKQSTIALALLPLLFTPVAKAQVQLQQSDAALVKPG ASVKISCKVSGYTFSDHAIHWMKQRPEQGLEWIGYIFPRDAFSLNNEKFKGK
ATLSADTSSSTAYMELTSLTFEDSAVYFCARMRNYFYVMDYWGQGTSVTVS SAKTTPPSVYTLAPGSAAQTN SMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWN SGSLSSGVEI TFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
47
VK aminoacido PTA001_A1 RILPDAFYRNSLLFLHTRFFGWSETMKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADVVLT QTPLSLPVTLGDQASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLLKPGQSPKLLIYKVSN RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKITRVEAEDLGVYFCSQSTHVLTFGAGTKLELK RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNE SYPYDVPDYAS
48
VK aminoacido PTA001_A2, PTA001_A3 RILPDAFYRNSLLFLHTRFFGWSETMKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIVMT QAAPSVPVTPGESVSISCTSSKSLLRSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNL ASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIK RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNE SYPYDVPDYAS
49
VK aminoacido PTA001_A4 RILPDAFYRNSLLFLHTRFFGWSETMKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIVMS QSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLHSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKVLIYWA STRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKSEDLAVYYCQQYYSYPWTFGGGTRL EIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNG VLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNR NESYPYDVPDYAS
50
VK aminoacido PTA001_A5 RILPDAFYRNSLLFLHTRFFGWSETMKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIVMT QAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLRSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRLSNL ASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIK RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNE SYPYDVPDYAS
51
VK aminoacido PTA001_A6 RILPDAFYRNSLLFLHTRFFGWSETIKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIVMTQ AAPSVPVTPGESVSISCTSSKSLLRSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLA SGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIKR ADAAPTVSILPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLN SWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNES YPYDVPDYAS
52
VK aminoacido PTA001_A7 RILPDAFYRNSLLFLHTRFFGWSETMKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIVMT QAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLRTNGNTYLHWFLQRPGQSPQLLIYRMSNL ASGVPDRFSGSGSGTVFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIK RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNE SYPYDVPDYAS
53
VK aminoacido PTA001_A8 RILPYAFYRNSLLFLHTRFFGWSETMKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIVMT QAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLRSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRLSNL ASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIK RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNE SYPYDVPDYAS
54
VK aminoacido PTA001_A9 RILPDAFYRNSLLFLHTRFFGWSETMKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIVMT QAAPSVPVTPGESVSISCTSSKSLLRSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNL ASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIK RADAAPTVSISPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNE SYPYDVPDYAS
55
VK aminoacido PTA001_A10, PTA001_A12 RILPDAFYRNSLLFLHTRFFGWSETMKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIVMT QAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLRSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNL ASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGGGTKLEIK RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNE SYPYDVPDYAS
56
VK aminoacido PTA001_A11 RILPDAFYRNSLLFLHTRFFGWSETMKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIVMT QAAPSVSVTPGESVSISCRSTKSLLRSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNL ASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGGGTKLEIK RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNE SYPYDVPDYAS
57
VK aminoacido PTA001_A13 RILPDAFYRNSLLFLHTRFFGWSETMKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIVMT QAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLRSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRLSNL ASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIK RADAAPTVSIFPQYSEQLTTGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNE SYPYDVPDYAS
58
VK aminoacido PTA001_A14 RILPDAFYRNSLLFLHTRFFGWSETMKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIVMT QAAPSVPVTPGESVSISCTSSKSLLRSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNL ASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTNLEIK RADAAPTVSIFTTSREQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVK
59
VH n.t. PTA001_A1 TGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCACGCTTTGTACATGGAGAAAATAA AGTGAAACAAAGCACTATTGCACTGGCACTCTTACCGCTCTTATTTACCCC
TGTGGCAAAAGCCGAAGTGCAGCTGTTGGAGACTGGGGGAGGCGTAGTG AAGCCCGGAGGGTCCCTTAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTC AGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGA GTGGGTCGCAGCCATTAATCGTGATGGTGGTACCACCTACTATACAGACA ATGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTG TACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACAGCCTTGTATTACTG TGCAAGACAGTTCCTTCTCTGGGACGGCTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGC AGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCT ATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGG GATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAAC TCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCT GACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCC AGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGT GGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGT
60
VH n.t. PTA001_A2 TGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCACGCTTTGTACATGGAGAAAATAA AGTGAAACAAAGCACTATTGCACTGGCACTCTTACCGCTCTTATTTACCCC TGTGGCAAAAGCCCAGGTTCAGCTGCAACAGTCTGACGCTGAGTTGGTGA AACCTGGAGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGTTTCTGGCTACACCTTCA GTGACCATGCTATTCACTGGATGAGTCAGAGACCTGGACAGGGCCTGAAA TGGATTGGATATATTTATCCTAGACATGGGACTACTAACTACAATGAGAA CTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCCTCCAGCACAGCCT ACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAAGATTCTGCCGTCTATTTCTGTG CAAGAATGAGAAACTACTTCTATGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACC TCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTG GCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTG GTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATC CCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTA CACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGA CCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAG AAAATTGTGCCCAGGGATTGT
61
VH n.t. PTA001_A3 TGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCACGCTTTGTACATGGAGAAAATAA AGTGAAACAAAGCACTATTGCACTGGCACTCTTACCGCTCTTATTTACCCC TGTGGCAAAAGCCCAGGTTCTGCTGCAACAGTCTGACGCTGAGTTGGTGA AACCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCA CTGACCATGCTATTCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAA TGGATTGGATATATTTATCCTGAACATGGAACTATTAAGTATAATGAGAA GTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCCAGCACTGCCT ATATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGATTCAGCAGTGTATTTCTGTT CAAGACTCACTAACTACTTCTATGTTATGGAGTATTGGGGTCAAGGAACCT CAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGG CCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGG TCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCC CTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTAC ACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGAC CGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGA AAATT GT GCCCAGGGATTGT
62
VH n.t. PTA001_A4 TGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCACGCTTTGTACATGGAGAAAATAA AGTGAAACAAAGCACTATTGCACTGGCACTCTTACCGCTCTTATTTACCCC TGTGGCAAAAGCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGTCGCTGAGTTGGTGA AACCTGGAGCTTCAGTGAAGATGTCATGCAAGGTTTCTGGCTACACCCTC ACTGACCATACTATTCACTGGATGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGA ATGGATTGGATATATTTACCCTAGAGATGGAATAACTGGGTACAATGAGA AGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACTTCTTCCAGCACAGCC TACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCAGTCTATTTCTGT GCCAGATGGGGCTATAGTTACAGGAATTACGCGTACTACTATGACTACTG GGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCAT CTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGA CCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACC TGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTG CAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACC TGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCAC CAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGT
63
VH n.t. PTA001_A5 TGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCACGCTTTGTACATGGAGAAAATAA AGTGAAACAAAGCACTATTGCACTGGCACTCTTACCGCTCTTATTTACCCC TGTGGCAAAAGCCCAGGTTCAGCTGCAACAGTCTGACGCTGACTTGGTGA AACCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCA CTGACCATGCTATTCACTGGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAA TGGATTGGATATATTTATCCTGAACATGGAACTATTAAGTATAATGAGAA GTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCCAGCACTGCCT ATATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGATTCAGCAGTGTATTTCTGTG CAAGACTCAGGAACTATTTGTATATTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACC TCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTG GCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTG GTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATC CCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTA
CACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGA CCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAG AAAATTGTGCCCAGGGATTGT
64
VH n.t. PTA001_A6, PTA001_A9, PTA001_A10 TGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCACGCTTTGTACATGGAGAAAATAA AGTGAAACAAAGCACTATTGCACTGGCACTCTTACCGCTCTTATTTACCCC TGTGGCAAAAGCCCAGGTTCAGCTGCAACAGTCTGACGCTGAGTTGGTGA AACCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCA CTGACCATGCTATTCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAA TGGATTGGATATATTTATCCTGAACATGGAACTATTAAGTATAATGAGAA GTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCCAGCACTGCCT ATATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGATTCAGCAGTGTATTTCTGTT CAAGACTCACTAACTACTTCTATGTTATGGAGTATTGGGGTCAAGGAACCT CAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGG CCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGG TCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCC CTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTAC ACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGAC CGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGA AAATT GT GCCCAGGGATTGT
65
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66
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CAAGAATGACTAACTACCTCTATATTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACC TCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTG GCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTG GTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATC CCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTA CACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGA CCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAG AAAATTGTGCCCAGGGATTGT
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CTCCATACCCGTTTTTTTGGATGGAGTGAAACGATGAAATACCTATTGCCT ACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCCATGGCCGA CATCGTTATGTCTCAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAA GGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGCCAGAGCCTTTTACATAGTAGCAATC AAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAA GTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGAGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTC ACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCACCAGTGTGAA GTCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTATCCGTG GACGTTCGGTGGCGGCACCAGGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCAC CAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTG CCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCA AGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGG ACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCAC GTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCA CTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAG TCTTATCCATATGATGTGCCAGATTATGCGAGCTAA
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GGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCTTTCACATT CGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTG TATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAG TCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGA AGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGAT CAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGAC CAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACA AGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTCTTAT CCATATGATGTGCCAGATTATGCGAGCTAA
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ACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTCT TATCCATATGATGTGCCAGATTATGCGAGCTAA
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(HV 1. OOVld '6V_ 1- OOVld '8V_l-00Vld '9V_l-00Vld 'ev_i.oovid tu eaao ha 66
118
VK CDR2 n.t. PTA001_A7, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001 A12 CGGATGTCCAACCTTGCCTCA
119
VK CDR2 n.t. PTA001_A8 CGGCTGTCTAACCTTGCCTCA
120
VK CDR3 n.t. PTA001_A1 TCTCAAAGTACACATGTGCTCACG
121
VK CDR3 n.t. PTA001_A2, PTA001_A3, PTA001_A6, PTA001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11, PTA001_A12, PTA001 A14 ATGCAACATCTAGAATATCCTTTCACG
122
VK CDR3 n.t. PTA001_A4 CAGCAATATTATAGCTATCCGTGGACG
123
VK CDR3 n.t. PTA001_A5, PTA001 A8, PTA001_A13 ATGCAACATCTAGAATATCCTTTCACA
124
VK CDR3 n.t. PTA001_A7 ATGCAACATCTAGAATATCCATTCACG
125
VH7-39 (Genbank AJ851868.3) n.t. 240-269 GGATTCACTTTCAGTAGCTATGGCATGTCT
126
VHII gen H17 (GenBank X02466.1) n.t. 67-96 GGCTACACCTTCACTGACCATACTATTCAC
127
VHII region VH105 (GenbankJ00507) n.t.1096-1146 TATATTTATCCTAGAGATGGTAGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGG C
128
VK1-110 (GenBank AY591695.1) n.t. 1738-1785 AGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACAT
129
VK1-110 (GenBank AY591695.1) n.t. 1948-1971 TCTCAAAGTACACATGTTCCTCCC
130
VK8-30 (GenBank AJ235948.1) n.t. 510-560 AAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGC C
131
VK8-30 (GenBank AJ235948.1) n.t. 606-626 TGGGCATCCACTAGGGAATCT
132
VK8-30 (GenBank AJ235948.1) n.t. 723-749 CAGCAATATTATAGCTATCCTCCCACA
133
VK24-140 (GenBank AY591710.1) n.t. 1807-1854 AGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTAT
134
VK24-140 (GenBank AY591710.1) n.t. 1900-1920 CGGATGTCCAACCTTGCCTCA
135
VK24-140 (GenBank AY591710.1)n.t. 2017-2043 ATGCAACATCTAGAATATCCTTTCACA
136
Cadherina-17 ECD dominios 1-2 QEGKFSGPLKPMTFSIYEGQEPSQIIFQFKANPPAVTFELTGETDNIFVIEREGLL YYNRALDRETRSTHNLQVAALDANGIIVEGPVPITIKVKDINDNRPTFLQSKYE GSVRQNSRPGKPFLYVNATDLDDPATPNGQLYYQIVIQLPMINNVMYFQINN KTGAISLTREGSQELNPAKNPSYNLVISVKDMGGQSENSFSDTTSVDIIVTENI WKAPKP
137
Cadherina-17 ECD QEGKFSGPLKPMTFSIYEGQEPSQIIFQFKANPPAVTFELTGETDNIFVIEREGLL YYNRALDRETRSTHNLQVAALDANGIIVEGPVPITIKVKDINDNRPTFLQSKYE GSVRQNSRPGKPFLYVNATDLDDPATPNGQLYYQIVIQLPMINNVMYFQINN KTGAISLTREGSQELNPAKNPSYNLVISVKDMGGQSENSFSDTTSVDIIVTENI WKAPKP VEMVENSTDPHPIKITQVRWNDPGAQYSLVDKEKLPRFPFSIDQEG DIYVTQPLDREEKDAYVFYAVAKDEYGKPLSYPLEIHVKVKDINDNPPTCPSP VTVFEVQENERLGNSIGTLTAHDRDEENTANSFLNYRIVEQTPKLPMDGLFLI QTYAGMLQLAKQSLKKQDTPQYNLTIEVSDKDFKTLCFVQINVIDINDQIPIFE KSDYGNLTLAEDTNIGSTILTIQATDADEPFTGSSKILYHIIKGDSEGRLGVDTD PHTNTGYVIIKKPLDFETAAVSNIVFKAENPEPLVFGVKYNASSFAKFTLIVTD VNEAPQFSQHVFQAKVSEDVAIGTKVGNVTAKDPEGLDISYSLRGDTRGWLK IDHVTGEIFSVAPLDREAGSPYRVQWATEVGGSSLSSVSEFHLILMDVNDNPP RLAKDYTGLFFCHPLSAPGSLIFEATDDDQHLFRGPHFTFSLGSGSLQNDWEV SKINGTHARLSTRHTDFEEREYVVLIRINDGGRPPLEGIVSLPVTFCSCVEGSCF RPAGHQTGIPTVGM

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    Reivindicaciones
    1. Un anticuerpo anti-Cadherina-17 aislado que comprende:
    una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 4;
    una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 8;
    una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 17;

    una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 24;

    una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 30; y

    una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 34,
    opcionalmente en donde cualquiera de las SEQ ID NOs: 4, 8, 17, 24, 30 o 34 comprende independientemente una,
    dos, tres, cuatro o cinco sustituciones conservadoras de los aminoacidos,
    en donde el anticuerpo es capaz de ser internalizado en una celula que expresa Cadherina-17.
  2. 2. Un anticuerpo anti-Cadherina-17 aislado tal como se reivindica en la reivindicacion 1, en donde cualquiera de las SEQ ID NOs: 4, 8, 17, 24, 30 o 34 comprende independientemente una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones conservadoras de los aminoacidos con cadenas laterales basicas.
  3. 3. Un anticuerpo anti-Cadherina-17 aislado tal como se reivindica en la reivindicacion 1, en donde cualquiera de las SEQ ID NOs: 4, 8, 17, 24, 30 o 34 comprende independientemente una o dos sustituciones conservadoras de aminoacidos.
  4. 4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa de un isotipo IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4.
  5. 5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de: un anticuerpo entero, un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de una sola cadena, un anticuerpo defucosilado, un mimetico de anticuerpo y un anticuerpo biespedfico preferiblemente en donde dicho fragmento es un anticuerpo de dominio.
  6. 6. Un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes conjugado con un agente terapeutico.
  7. 7. El inmunoconjugado de la reivindicacion 6 en donde el agente terapeutico es una citotoxina o un isotopo radioactivo.
  8. 8. Una composicion que comprende el anticuerpo aislado o porcion que se une al antfgeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un inmunoconjugado de la reivindicacion 6 o la reivindicacion 7, y un portador farmaceuticamente aceptable.
  9. 9. Una molecula aislada de acido nucleico que codifica la cadena pesada y ligera del anticuerpo o porcion que se une al antfgeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
  10. 10. Un vector de expresion que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 9.
  11. 11. Una celula hospedera que comprende:
    (I) el vector de expresion de la reivindicacion 10; o
    5
    10
    15
    20
    25
    (Ii) un primer vector de expresion que codifica la cadena pesada del anticuerpo o porcion que se une al antigeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un segundo vector de expresion que codifica la cadena ligera del anticuerpo o porcion que se une al antigeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
  12. 12. Un metodo para preparar un anticuerpo anti-Cadherina-17, comprendiendo dicho metodo los pasos de:
    obtener una celula hospedera que contiene una o mas moleculas de acido nucleico que codifican el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,
    cultivar la celula hospedera en un cultivo de celulas hospedera;
    proporcionar condiciones de cultivo de la celula hospedera en donde las una o mas moleculas de acido nucleico se expresan; y recuperan el anticuerpo de la celula hospedera o del cultivo de celulas hospedera.
  13. 13. Un metodo de fabricacion de anticuerpos anti-Cadherina-17-, que comprende los pasos de: recuperar ARNm de los linfocitos B de un animal que ha sido inmunizado con un peptido de Cadherina-17; convertir dicho ARNm en ADNc;
    expresar dicho ADNc en fagos de manera que los anticuerpos anti-Cadherina-17 codificados por dicho ADNc se presenten en la superficie de dichos fagos;
    seleccionar fagos que presentan anticuerpos anti-Cadherina-17;
    recuperar moleculas de acido nucleico a partir de dichos fagos seleccionados que codifican dichas inmunoglobulinas anti-cadherina-17;
    expresar dichas moleculas de acidos nucleicos recuperados en una celula hospedera; y
    recuperar anticuerpos como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 a partir de dicha celula hospedera que se une a la Cadherina-17.
  14. 14. Un anticuerpo anti-Cadherina-17, o porcion que se une al antfgeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un inmunoconjugado de la reivindicacion 6 o la reivindicacion 7, para uso en el tratamiento o prevencion de un cancer asociado con las celulas objetivo que expresan Cadherina-17 .
  15. 15. El anticuerpo, o porcion que se une al antfgeno del mismo para uso de acuerdo con la reivindicacion 14, en donde dicha enfermedad es un cancer humano.
  16. 16. El anticuerpo, o porcion que se une al antfgeno del mismo para uso de acuerdo con la reivindicacion 15, en donde dicho cancer humano es cancer colorrectal.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106188295A (zh) 2009-04-20 2016-12-07 牛津生物疗法有限公司 特异于钙粘素‑17的抗体
WO2012054084A2 (en) * 2010-10-20 2012-04-26 Oxford Biotherapeutics Ltd. Antibodies
CN105263514B (zh) * 2013-03-15 2019-04-26 本质生命科学有限公司 抗铁调素抗体及其用途
CA2961917A1 (en) 2014-09-22 2016-03-31 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
US10829560B2 (en) 2015-04-20 2020-11-10 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Agents binding specifically to human cadherin-17, human cadherin-5, human cadherin-6 and human cadherin-20 RGD motif
EP3400013A4 (en) * 2016-01-09 2019-09-11 Arbele Limited CADHERIN-17 SPECIFIC ANTIBODIES AND CYTOTOXIC CELL TREATMENT CELLS
CN106265480A (zh) * 2016-09-03 2017-01-04 山西纳安生物科技有限公司 纳米抗体阴道给药系统及制备方法和应用
EP3360898A1 (en) * 2017-02-14 2018-08-15 Boehringer Ingelheim International GmbH Bispecific anti-tnf-related apoptosis-inducing ligand receptor 2 and anti-cadherin 17 binding molecules for the treatment of cancer
US20210253728A1 (en) * 2018-04-26 2021-08-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and Methods for Retrieving Tumor-related Antibodies and Antigens
US20210115152A1 (en) * 2018-05-16 2021-04-22 Arbele Limited Composition of bispecific antibodies and method of use thereof
CN114044823B (zh) * 2021-11-05 2022-07-05 深圳市人民医院 靶向钙粘蛋白17的纳米抗体及其应用
CA3240301A1 (en) * 2021-12-07 2023-06-15 Dennis Slamon Cdh17 antibodies and methods of treating cancer
AU2022408069A1 (en) * 2021-12-07 2024-06-20 The Regents Of The University Of California Dlk1 antibodies and methods of treating cancer
CN113999308B (zh) * 2021-12-30 2022-03-11 深圳市人民医院 靶向钙粘蛋白17的纳米抗体及其应用

Family Cites Families (170)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
EP0623679B1 (en) 1987-05-21 2003-06-25 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP1892296A1 (en) 1988-09-02 2008-02-27 Dyax Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US20040049014A1 (en) 1988-12-28 2004-03-11 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5789157A (en) 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5864026A (en) 1990-06-11 1999-01-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5763566A (en) 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
US5712375A (en) 1990-06-11 1998-01-27 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US6261774B1 (en) 1990-06-11 2001-07-17 Gilead Sciences, Inc. Truncation selex method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
DE69233750D1 (de) 1991-04-10 2009-01-02 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer Rezeptoren mittels Phagemiden
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JPH07503124A (ja) 1991-06-14 1995-04-06 ゾーマ・コーポレーション 微生物によって生産される抗体断片とそれらの複合体
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
DK0616640T3 (da) 1991-12-02 2004-12-20 Medical Res Council Fremstilling af anti-selv antistoffer fra repertoirer af antistofsegmenter og fremvist på fag
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
US5798224A (en) * 1992-12-29 1998-08-25 Doheny Eye Institute Nucleic acids encoding protocadherin
IL108499A (en) 1993-02-04 2000-02-29 Lilly Co Eli Mammalian influx peptide transporter
ES2162863T3 (es) 1993-04-29 2002-01-16 Unilever Nv Produccion de anticuerpos o fragmentos (funcionalizados) de los mismos derivados de inmunoglobulinas de cadena pesada de camelidae.
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
EP0733070A1 (en) 1993-12-08 1996-09-25 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
ATE243745T1 (de) 1994-01-31 2003-07-15 Univ Boston Bibliotheken aus polyklonalen antikörpern
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
CA2219807C (en) 1995-05-03 2008-12-30 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US6013443A (en) 1995-05-03 2000-01-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
AU6155896A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Cytel Corporation Humanized antibodies to e-selectin
JPH11513391A (ja) 1995-10-03 1999-11-16 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート Ｃｃ−１０６５ 及びズオカーマイシンのｃｂｉ 類縁体
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
GB9705949D0 (en) 1997-03-21 1997-05-07 Electrophoretics International Diagnosis of tumours and other abnormalities of body cells
US6057098A (en) 1997-04-04 2000-05-02 Biosite Diagnostics, Inc. Polyvalent display libraries
US6703362B1 (en) 1997-05-15 2004-03-09 Cytogen Corporation Random peptides that bind to gastro-intestinal tract (GIT) transport receptors and related methods
US7135457B1 (en) 1997-05-15 2006-11-14 Cytogen Corporation Random peptides that bind to gastro-intestinal tract (GIT) transport receptors and related methods
US7053177B1 (en) 1997-05-15 2006-05-30 Cytogen Corporation Random peptides that bind to gastro-intestinal tract (GIT) transport receptors and related methods
JP2002512624A (ja) 1997-05-21 2002-04-23 バイオベーション リミテッド 非免疫原性タンパク質の製造方法
AU754083B2 (en) 1997-05-22 2002-11-07 Scripps Research Institute, The Analogs of duocarmycin and CC-1065
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE458007T1 (de) 1998-04-20 2010-03-15 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
US6699973B1 (en) 1998-11-19 2004-03-02 Elan Corporation, Plc Antibodies to peptides that target GIT receptors and related methods
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
US6387620B1 (en) 1999-07-28 2002-05-14 Gilead Sciences, Inc. Transcription-free selex
AU2608201A (en) 1999-12-30 2001-07-16 Corixa Corporation Compounds for immunotherapy and diagnosis of colon cancer and methods for their use
CN1313328A (zh) * 2000-03-15 2001-09-19 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人原钙粘素14和编码这种多肽的多核苷酸
WO2002020565A2 (en) 2000-09-08 2002-03-14 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
US7041870B2 (en) 2000-11-30 2006-05-09 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
DK1355919T3 (da) 2000-12-12 2011-03-14 Medimmune Llc Molekyler med længere halveringstider, sammensætninger og anvendelser deraf
WO2002074156A2 (en) 2001-02-02 2002-09-26 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
WO2002083070A2 (en) 2001-04-10 2002-10-24 Corixa Corporation Compounds for immunotherapy and diagnosis of colon cancer and methods for their use
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050089932A1 (en) 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20060223114A1 (en) 2001-04-26 2006-10-05 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20030082630A1 (en) 2001-04-26 2003-05-01 Maxygen, Inc. Combinatorial libraries of monomer domains
CN100448992C (zh) 2001-05-11 2009-01-07 麒麟医药株式会社 含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体
EP1421203A4 (en) 2001-05-17 2005-06-01 Diversa Corp NEW ANTIGEN-BINDING MOLECULES FOR THERAPEUTIC, DIAGNOSTIC, PROPHYLACTIC, ENZYMATIC, INDUSTRIAL AND AGRICULTURAL APPLICATIONS AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND SCREENING THEREOF
MXPA03011094A (es) 2001-05-31 2004-12-06 Medarex Inc Citotoxinas, profarmacos, ligadores, y estabilizadores utiles para ello.
CA2450379A1 (en) 2001-06-10 2002-12-19 Irm Llc Molecular signatures of commonly fatal carcinomas
EP1404356B1 (en) 2001-06-11 2011-04-06 Medarex, Inc. Method for designing cd10-activated prodrug compounds
DE60233509D1 (de) * 2001-06-20 2009-10-08 Fibron Ltd Fgfr3 blockierende antikörper, verfahren zum screening darauf und verwendungen davon
DK1399484T3 (da) 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
WO2003020934A1 (en) 2001-08-31 2003-03-13 Diadexus, Inc. Compositions and methods relating to colon specific genes and proteins
WO2003022806A2 (en) 2001-09-07 2003-03-20 The Scripps Research Institute Cbi analogues of cc-1065 and the duocarmycins
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
WO2003074679A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
IL149820A0 (en) 2002-05-23 2002-11-10 Curetech Ltd Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency
WO2004001072A2 (en) 2002-06-19 2003-12-31 Oncotherapy Science, Inc. Method for diagnosis of colorectal tumors
DE60305919T2 (de) 2002-06-28 2007-01-18 Domantis Limited, Cambridge Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
AU2002951346A0 (en) 2002-09-05 2002-09-26 Garvan Institute Of Medical Research Diagnosis of ovarian cancer
CN1795009B (zh) 2002-11-07 2014-07-09 伊谬诺金公司 抗-cd33抗体及其用途
AU2003286004A1 (en) 2002-11-08 2004-06-07 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against interferon- gamma and uses therefor
AU2003295824A1 (en) 2002-11-22 2004-06-18 Incyte Corporation Cell adhesion and extracellular matrix proteins
CA2511910A1 (en) 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
EP2357237A1 (en) 2003-05-14 2011-08-17 Domantis Limited A process for recovering polypeptides that unfold reversibly from a polypeptide repertoire
JP5087274B2 (ja) 2003-06-30 2012-12-05 ドマンティス リミテッド ポリペプチド
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
JP2005084955A (ja) 2003-09-09 2005-03-31 Hitachi Ltd 携帯情報端末
AU2004284090A1 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Avidia, Inc. LDL receptor class A and EGF domain monomers and multimers
DE102004023187A1 (de) 2004-05-11 2005-12-01 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
EP1786466B1 (en) 2004-06-18 2013-08-21 Genentech, Inc. Combination of a chemotherapeutic agent and an antagonist of a gene product for treating tumors
CN101987870B (zh) 2004-07-15 2013-07-03 赞科股份有限公司 优化的Fc变体
US20060234299A1 (en) 2004-11-16 2006-10-19 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
AU2005325801A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
KR20080000613A (ko) 2005-03-25 2008-01-02 제넨테크, 인크. 과안정화된 ｃ-ｍｅｔ의 조절을 위한 방법 및 조성물
US7714016B2 (en) 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
EP1899484B1 (en) 2005-06-03 2015-08-12 bioTheranostics, Inc. Identification of tumors and tissues
CA2612021A1 (en) 2005-06-13 2006-12-28 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
JP2009508493A (ja) 2005-09-19 2009-03-05 ベリデックス・エルエルシー すい臓がんを診断するための方法
CA2622441A1 (en) 2005-09-27 2007-04-05 Amunix, Inc. Proteinaceous pharmaceuticals and uses thereof
PL1945665T3 (pl) 2005-10-21 2012-02-29 Genzyme Corp Leki oparte na przeciwciałach z ulepszoną aktywnością adcc
KR20080090406A (ko) 2005-11-28 2008-10-08 젠맵 에이/에스 재조합 １가 항체 및 그의 제조 방법
WO2008026008A1 (en) 2006-08-29 2008-03-06 Oxford Genome Sciences (Uk) Ltd Protein
US8535677B2 (en) 2006-06-06 2013-09-17 Oxford Biotherapeutics, Ltd. Antibody drug conjugate treatment of colorectal cancer
GB0611116D0 (en) * 2006-06-06 2006-07-19 Oxford Genome Sciences Uk Ltd Proteins
US7968035B2 (en) 2006-10-11 2011-06-28 Xerox Corporation Forged ink stick fabrication from in-line extrusion
WO2008104803A2 (en) * 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
US9207242B2 (en) 2008-10-09 2015-12-08 The University Of Hong Kong Cadherin-17 as diagnostic marker and therapeutic target for liver cancer
CN106188295A (zh) 2009-04-20 2016-12-07 牛津生物疗法有限公司 特异于钙粘素‑17的抗体
WO2012054084A2 (en) 2010-10-20 2012-04-26 Oxford Biotherapeutics Ltd. Antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
UA108201C2 (xx) 2015-04-10
JP6141638B2 (ja) 2017-06-07
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EA030182B1 (ru) 2018-07-31
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AU2016203229A1 (en) 2016-06-09

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