ES2573498T3 - Opciones de tratamiento para la enfermedad de Fabry - Google Patents

Opciones de tratamiento para la enfermedad de Fabry Download PDF

Info

Publication number
ES2573498T3
ES2573498T3 ES14168748.3T ES14168748T ES2573498T3 ES 2573498 T3 ES2573498 T3 ES 2573498T3 ES 14168748 T ES14168748 T ES 14168748T ES 2573498 T3 ES2573498 T3 ES 2573498T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
gal
activity
cells
fabry
disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14168748.3T
Other languages
English (en)
Inventor
David Lockhart
Jeff Castelli
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amicus Therapeutics Inc
Original Assignee
Amicus Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38723987&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2573498(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amicus Therapeutics Inc filed Critical Amicus Therapeutics Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2573498T3 publication Critical patent/ES2573498T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/45—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cycloheximide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D211/06—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D211/36—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D211/40—Oxygen atoms
    • C07D211/44—Oxygen atoms attached in position 4
    • C07D211/46—Oxygen atoms attached in position 4 having a hydrogen atom as the second substituent in position 4
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • G01N2333/94—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Una formulación para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry, donde la formulación es una forma de dosificación oral que comprende un vehículo y 1-desoxigalactonojirimicina o una de sus sales, que se caracteriza por que la 1-desoxigalactonojirimicina o una de sus sales se administra a un paciente con la enfermedad de Fabry en una cantidad de 150 mg cada dos días.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Opciones de tratamiento para la enfermedad de Fabry CAMPO DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona una formulacion para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry que comprende 1-desoxigalactonojirimicina.
ANTECEDENTES
La enfermedad de Fabry es un trastorno del almacenamiento lisosomico de glucoesfingoUpidos (GSL) que resulta de una deficiencia heredada relacionada con el cromosoma X de a-galactosidasa A (a-GAL) lisosomica, una enzima responsable de la hidrolisis de restos a-galactosflicos terminales de glucoesfingoKpidos (Brady et al. N Engl J Med. 1967; 276: 1163-7). Una deficiencia en la actividad enzimatica da como resultado una deposicion progresiva de glucoesfingolfpidos neutros, predominantemente globotriaosilceramida (trihexosido de ceramida, CTH, GL-3), en la celula de pacientes con Fabry. Los smtomas pueden ser graves y debilitantes, incluyendo insuficiencia renal y mayor riesgo de ataque cardfaco y apoplejfa. Algunas de las mutaciones provocan cambios en la secuencia de aminoacidos de a-GAL que pueden dar como resultado la produccion de a-GAL con estabilidad reducida que no se pliega en su conformacion tridimensional correcta. Aunque a-GAL producida en celulas de pacientes retiene a menudo el potencial para cierto nivel de actividad biologica, los mecanismos de control de calidad de las celulas reconocen y retienen a-GAL no plegada en el retmulo endoplasmico, o ER, hasta que finalmente se mueve a otra parte de la celula para degradacion y eliminacion. Consecuentemente, se mueve poca o ninguna a-GAL al lisosoma, donde normalmente hidroliza GL-3. Esto conduce a la acumulacion de GL-3 en las celulas, lo que se cree que es la causa de los smtomas de la enfermedad de Fabry. Ademas, la acumulacion de la enzima a-GAL no plegada en el ER puede conducir a estres en las celulas y a respuestas de tipo inflamatorio, lo que puede contribuir a la disfuncion celular y a la enfermedad.
La enfermedad de Fabry se clasifica por manifestaciones clmicas en tres grupos: una forma clasica con vasculopatfa generalizada, una forma variante atfpica con manifestaciones clmicas limitadas al tejido cardfaco, y enfermedad de comienzo tardm, que incluye portadoras femeninas con formas leves a graves de la enfermedad.
La frecuencia de la forma clasica de la enfermedad se estima que es alrededor de 1:40.000 a 1:60.000 en hombres, y se da por todo el mundo en diferentes grupos etnicos. Los hombres afectados clasicamente tienen pocos o ningun nivel de a-GAL detectable, y son los afectados mas gravemente. Las manifestaciones clmicas incluyen angioqueratoma (manchas rojizas-violetas sobresalientes pequenas en la piel), acroparestesias (quemadura en las manos y en los pies), hipohidrosis (capacidad reducida para sudar), y opacidades corneas y lenticulares caractensticas (The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 8a Edicion 2001, Scriver et al., ed., p. 37333774, McGraw-Hill, Nueva York). El almacenamiento de lfpidos puede conducir a una circulacion arterial alterada y a un mayor riesgo de ataque cardfaco o apoplejfa. El corazon se puede agrandar tambien, y los rinones se ven implicados progresivamente. Otros smtomas incluyen fiebre y dificultades gastrointestinales, particularmente despues de comer. La expectativa de vida de los hombres afectados se reduce, y la muerte se produce habitualmente en la cuarta o quinta decada como resultado de enfermedad vascular del corazon, cerebro, y/o rinones.
Los individuos con la enfermedad de Fabry de comienzo tardm pueden ser hombres o mujeres. La enfermedad de Fabry de comienzo tardm se presenta como la forma variante atfpica, y cada vez mas pruebas indican que puede haber un numero significativo de “variantes atipicas” que no tienen explicacion en el mundo. Las mujeres, que heredan un cromosoma X que contiene una mutacion de a-GAL, pueden mostrar smtomas mas tarde en la vida, aumentando significativamente la prevalencia de esta enfermedad. Estos pacientes experimentan tfpicamente primero smtomas de la enfermedad en la etapa adulta, y a menudo tienen smtomas de la enfermedad enfocados en un solo organo. Por ejemplo, muchos hombres y mujeres con enfermedad de Fabry de comienzo tardm tienen un agrandamiento del ventrmulo izquierdo del corazon. La enfermedad de Fabry de comienzo tardm tambien se puede presentar en forma de apoplejfas de causa desconocida. A medida que los pacientes avanzan en edad, progresan las complicaciones cardfacas de la enfermedad, y pueden conducir a la muerte.
Por el contrario, los pacientes con la “variante cardfaca” mas leve de la enfermedad de Fabry tienen normalmente 515% de actividad de a-GAL normal, y presentan hipertrofia ventricular izquierda o una cardiomiopatfa. Estos pacientes con variante cardfaca permanecen esencialmente asintomaticos cuando sus contrapartes clasicamente afectadas se ven gravemente comprometidas. Las variantes cardfacas se encontraron en 11% de los pacientes masculinos adultos con cardiomiopatfa hipertrofica ventricular izquierda sin explicacion, sugiriendo que la enfermedad de Fabry puede ser mas frecuente que lo previamente estimado (Nakao et al., N. Engl. J. Med. 1995; 333; 288-293).
El gen de a-GAL se ha cartografiado para Xq22 (Bishop et al., Am. J. Hum. Genet. 1985; 37: A144), y se han dado a conocer el ADNc de longitud completa y las secuencias genomicas de 12 kb completas que codifican a-GAL (Calhoun et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA. 1985; 82: 7364-7368; Bishop et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986; 83:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
4859-4863; Tsuji et al., Eur. J. Biochem. 1987; 165: 275-280; Y Kornreich et al., Nucleic Acids Res. 1989; 17: 33013302). Hay una marcada heterogeneidad genetica de las mutaciones que provocan la enfermedad de Fabry (The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 8a Edicion 2001, Scriver et al., ed., p. 3733-3774, McGraw-Hill, Nueva York; Eng et al., Am. J. Hum. Genet. 1993; 53: 1186-1197; Eng et al., Mol. Med. 1997; 3: 174-182; y Davies et al., Eur. J. Hum. Gene. 1996; 4: 219-224). Hasta la fecha, se han dado a conocer una variedad de mutaciones de perdida de sentido, sin sentido, y de ayuste, ademas de pequenas supresiones e inserciones, y reordenamientos genicos mas grandes, aunque la mayona de las mutaciones son mutaciones con falta de sentido.
La enfermedad de Fabry es heterogenea, y a menudo es diffcil de correlacionar genotipo con fenotipo. Las personas con el mismo genotipo muestran a menudo diferentes smtomas clmicos y patologfa de la enfermedad. Sin embargo, parece que hay una correlacion entre la actividad enzimatica residual y la gravedad de la enfermedad, dando la menor actividad de a-GAL como resultado la mayor gravedad de la enfermedad. Aunque la inmensa mayona de mutaciones de a-GAL son mutaciones de perdida de sentido, estando la mayona fuera del sitio catafftico, es diffcil predecir que mutaciones dan como resultado una enzima inestable que se podna “rescatar” por una chaperona farmacologica espedfica (SPC) que estabiliza la enzima, y cuales no se podnan estabilizar usando una SPC.
Diagnostico de la enfermedad de Fabry
Debido a que la enfermedad de Fabry es rara, implica multiples organos, tiene un intervalo de comienzo de muchas edades, y es heterogenea, el diagnostico apropiado es un reto. El conocimiento es escaso entre los profesionales sanitarios, y a menudo son frecuentes los diagnosticos erroneos. Algunos ejemplos de diagnosticos seriamente considerados en pacientes a los que se les diagnostico eventualmente con la enfermedad de Fabry incluyen: prolapso de la valvula mitral, glomerulonefritis, proteinuria idiopatica, lupus eritematoso sistemico, enfermedad de Whipple, abdomen agudo, colitis ulcerosa, porfirias intermitentes agudas, y neoplasias ocultas. De este modo, incluso para hombres afectados de forma clasica, el diagnostico tarda ffpicamente de alrededor de 5-7 anos o incluso mas. Esto es un problema debido a que cuanto mas tiempo tiene la persona la enfermedad de Fabry, mas probable es que se produzca mayor dano en los organos y tejidos afectados, y mas grave se hace el estado de la persona. El diagnostico de la enfermedad de Fabry se conforma muy a menudo en base a la actividad reducida de a-GAL en leucocitos plasmaticos o perifericos (WBCs) una vez que el paciente esta sintomatico, acoplado con analisis mutacional. En las mujeres, el diagnostico es incluso mas desafiante, puesto que la identificacion enzimatica de mujeres portadoras es menos fiable debido a la inactivacion del cromosoma X al azar en algunas celulas de las portadoras. Por ejemplo, algunos portadores estrictos (hijas de hombres afectados clasicamente) tienen actividades de la enzima a-GAL que oscilan desde actividades normales hasta actividades muy bajas. Puesto que los portadores pueden tener actividad normal de la enzima a-GAL en leucocitos, solo la identificacion de una mutacion de a-GAL mediante ensayo genetico proporciona la identificacion y/o diagnostico precisos del portador.
Tratamiento de la enfermedad de Fabry
La unica terapia aprobada para tratar la enfermedad de Fabry es la terapia de sustitucion enzimatica, que implica ffpicamente la infusion intravenosa de una forma purificada de la protema de tipo salvaje correspondiente (Fabrazyme®, Genzyme Corp.). Una de las complicaciones principales con la terapia de sustitucion proteica es el logro y el mantenimiento de cantidades terapeuticamente eficaces de protemas in vivo debido a la rapida degradacion de la protema infundida. El enfoque actual para superar este problema es llevar a cabo numerosas infusiones costosas de dosis elevadas.
La terapia de sustitucion proteica tiene varias advertencias adicionales, tales como dificultades con la generacion a gran escala, purificacion y almacenamiento de protema apropiadamente plegada; la obtencion de protema nativa glucosilada; la generacion de una respuesta inmunitaria anti-protemica; y la incapacidad de la protema para atravesar la barrera hematoencefalica para mitigar patologfas del sistema nervioso central (es dear, baja biodisponibilidad). Ademas, la enzima de sustitucion no puede penetrar el corazon o el rinon en cantidades suficientes para reducir la acumulacion de sustrato en podocitos renales o miocitos cardfacos, que aparecen predominantemente en la patologfa de Fabry.
La terapia genica que usa vectores recombinantes que contienen secuencias de acido nucleico que codifican una protema funcional, o que usa celulas humanas geneticamente modificadas que expresan una protema funcional, tambien esta siendo evaluada para tratar deficiencias de protemas y otros trastornos que se benefician de la sustitucion de protemas. Aunque prometedor, este enfoque tambien esta limitado por dificultades tecnicas tales como la incapacidad de los vectores para infectar o transducir celulas en division, la baja expresion del gen diana, y la regulacion de la expresion una vez que se suministra el gen.
Un tercer enfoque relativamente reciente para tratar algunas deficiencias enzimaticas implica el uso de inhibidores de tipo pequenas moleculas para reducir la produccion del sustrato natural de protemas enzimaticas deficientes, mejorando de ese modo la patologfa. Este enfoque de “reduccion del sustrato” se ha descrito espedficamente para una clase de alrededor de 40 trastornos enzimaticos relacionados denominados trastornos de almacenamiento lisosomico, que incluyen trastornos de almacenamiento de glucoesfingolfpidos. Los inhibidores de tipo pequenas moleculas propuestos para uso como terapia son espedficos para inhibir las enzimas implicadas en la smtesis de glucolfpidos, reduciendo la cantidad de glucolfpido celular que es necesario romper por la enzima deficiente. Este
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
enfoque tambien esta limitado por cuanto los glucoftpidos son necesarios para la funcion biologica, especialmente la funcion neurologica, y la falta excesiva puede provocar efectos adversos.
Se ha mostrado previamente que la union de inhibidores de tipo pequenas moleculas de enzimas asociadas con LSDs puede incrementar la estabilidad tanto de la enzima mutante como de la enzima de tipo salvaje correspondiente (veanse las patentes U.S. nos 6.274.597; 6.583.158; 6.589.964; 6.599.919; 6.916.829, y 7.141.582). En particular, se descubrio que la administracion de derivados de tipo pequenas moleculas de glucosa y galactosa, que son inhibidores competitivos espedficos y selectivos para varias enzimas lisosomicas diana, incremento eficazmente la estabilidad de las enzimas en celulas in vitro, y, de este modo, incremento el trafico de las enzimas al lisosoma. De este modo, al aumentar la cantidad de enzima en el lisosoma, se espera que aumente la hidrolisis de los sustratos enzimaticos. La teona original detras de esta estrategia fue la siguiente: puesto que la protema enzimatica mutante es inestable en el ER (Ishii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996; 220: 812-815), la protema enzimatica se retrasa en la ruta de transporte normal (ER ^ aparato de Golgi ^ endosomas ^ lisosoma) y se degrada prematuramente. Por lo tanto, un compuesto que se una a e incremente la estabilidad de una enzima mutante puede servir como una “chaperona” para la enzima, y puede incrementar la cantidad que puede salir del ER y que se puede mover a los lisosomas. Ademas, debido a que el plegamiento y el trafico de algunas protemas de tipo salvaje es incompleto, degradandose hasta 70% de algunas protemas de tipo salvaje en algunos casos antes de alcanzar su localizacion celular final, las chaperonas se pueden usar para estabilizar enzimas de tipo salvaje e incrementar la cantidad de enzima que puede salir del ER y se puede mover a los lisosomas. Se ha mostrado que esta estrategia incrementa varias enzimas lisosomicas in vitro e in vivo, incluyendo p-glucocerebrosidasa y a- glucosidasa, cuyas deficiencias estan asociadas, respectivamente, con la enfermedad de Gaucher y de Pompe.
Sin embargo, como se indica anteriormente, los candidatos con exito para la terapia SPC deben tener una mutacion que de como resultado la produccion de una enzima que tiene el potencial para ser estabilizada y plegada en una conformacion que permita su trafico fuera del ER. Las mutaciones que truncan gravemente la enzima, tales como mutaciones sin sentido, o mutaciones en el dominio catalftico que evitan la union de la chaperona, probablemente no seran “rescatables” o “potenciables” usando la terapia SPC. Aunque es mas probable que las mutaciones con falta de sentido fuera del sitio catalftico sean rescatables usando SPCs, no hay ninguna garanffa, necesitando el cribado para mutaciones receptivas. Esto significa que, incluso cuando se diagnostica la enfermedad de Fabry detectando actividad deficiente de a-GAL en WBCs, es muy diffcil, si no imposible, predecir si un paciente con Fabry particular respondera al tratamiento con una SPC. Ademas, puesto que los WBCs solo sobreviven durante un corto penodo de tiempo en cultivo (in vitro), el cribado para la potenciacion de a-GAL mediante SPC es diffcil.
A fin de aplicar eficazmente la terapia SPC, es necesario adoptar antes del inicio del tratamiento un metodo ampliamente aplicable, rapido y eficiente para cribar pacientes para determinar la sensibilidad a la terapia SPC. De este modo, existe en la tecnica la necesidad de metodos relativamente no invasivos para evaluar rapidamente la potenciacion enzimatica con terapias potenciales antes de tomar decisiones de tratamiento, tanto para beneficios de coste como emocionales para el paciente.
SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona una formulacion para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry, donde la formulacion es una forma de dosificacion oral que comprende un vehffculo y 1-desoxigalactonojirimicina o una de sus sales, que se caracteriza por que la 1-desoxigalactonojirimicina o una de sus sales se administra a un paciente con la enfermedad de Fabry en una cantidad de 150 mg cada dos dfas.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Figura 1. Curso de tiempo para potenciacion para A97V. Celulas T que poseen la mutacion A97V en a-Gal A se cultivaron en ausencia (drculos en blanco) o en presencia (drculos oscuros) de 20 |iM de DGJ durante uno a cuatro dfas, y despues se ensayaron en busca de la actividad de a-GAL. El cambio de medio despues de 2 dfas y la sustitucion por medio reciente con (triangulo blanco) o sin DGJ (triangulo oscuro) no tuvo ningun efecto sobre la actividad enzimatica observada.
Figura 2A-C. Dependencia de DGJ con la concentracion en celulas T de pacientes de control normales y pacientes con Fabry. Celulas T procedentes de individuos normales (2A) se incubaron durante 3 dfas con DGJ de 2 nM a 200 |iM, y despues se ensayaron para determinar la actividad de a-GAL. Se muestran los resultados de tres experimentos en diferentes dfas. Celulas T procedentes de pacientes con Fabry con las mutaciones A97V (2B), R112H (2C), o R301Q (2C), respectivamente, se cultivaron con DGJ de 2 nM a 200 |iM, y despues se ensayaron para determinar la actividad de a-GAL. Se muestran tres conjuntos independientes de experimentos de dosificacion de DGJ, cada uno de los cuales se realizo con conjuntos triplicados.
Figura 3. Celulas T procedentes de diversos pacientes con Fabry se cultivaron en ausencia o en presencia de 20 |iM de DGJ durante tres dfas, y despues se ensayaron para determinar la actividad de a-GAL. Se represento graficamente el porcentaje del promedio normal de actividad espedfica de la a-GAL para mostrar el efecto del rescate con DGJ en los diferentes genotipos de pacientes con Fabry. El panel inferior muestra los resultados de la transferencia Western para cada mutacion, sondada con anticuerpo de conejo policlonal espedfico para a-GAL.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Esto demuestra una mayor estabilidad proteica para las mutaciones potenciables A97V y R301Q, y ningun incremento en la cantidad de protema para las mutaciones R356W, G132R y A143P.
Figura 4. Representacion grafica de la potenciacion in vivo de la actividad de a-GAL en WBC de pacientes con Fabry tras el tratamiento con DGJ.
Figura 5. Representacion grafica que compara la potenciacion in vitro e in vivo de la actividad de a-GAL para 10 genotipos.
DESCRIPCION DETALLADA
La presente invencion proporciona una formulacion para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry, donde la formulacion es una forma de dosificacion oral que comprende un vehmulo y 1-desoxigalactonojirimicina o una de sus sales, que se caracteriza por que la 1-desoxigalactonojirimicina o una de sus sales se administra a un paciente con la enfermedad de Fabry en una cantidad de 150 mg cada dos dfas.
Convenientemente, la 1-desoxigalactonojirimicina o una de sus sales se administra durante al menos 12 semanas. Definiciones
Los terminos usados en esta memoria descriptiva tienen generalmente sus significados normales en la tecnica, dentro del contexto de esta invencion y en el contexto espedfico en el que se usa cada termino. Ciertos terminos se discuten mas abajo o en cualquier otra parte en la memoria descriptiva, para proporcionar una gma adicional al especialista a la hora de describir las composiciones y metodos de la invencion y como obtenerlas y usarlas.
La expresion “enfermedad de Fabry” se refiere a un error innato ligado al cromosoma X del catabolismo de glucoesfingolfpidos debido a una deficiente actividad de a-galactosidasa A lisosomica. Este defecto provoca acumulacion de globotriaosilceramida (trihexosido de ceramida) y glucoesfingolfpidos relacionadas en lisosomas endoteliales vasculares del corazon, rinones, piel, y otros tejidos.
La expresion “enfermedad de Fabry atfpica” se refiere a pacientes con manifestaciones cardfacas principalmente de la deficiencia de a-GAL, a saber, acumulacion progresiva de globotriaosilceramida (GL-3) en celulas miocardicas que conduce a un agrandamiento significativo del corazon, particularmente el ventnculo izquierdo.
Una “portadora” es una mujer que tiene un cromosoma X con un gen de a-GAL defectuoso y un cromosoma X con el gen normal, y en la que la inactivacion del alelo normal en el cromosoma X esta presente en uno o mas tipos celulares. Una portadora sufre a menudo la enfermedad de Fabry.
Un “paciente” se refiere a un sujeto que ha sido diagnosticado con una enfermedad particular. El paciente puede ser humano o animal. Un “paciente con enfermedad de Fabry” se refiere a un individuo que ha sido diagnosticado con la enfermedad de Fabry y tiene una a-GAL mutada como se define posteriormente mas abajo. Los marcadores caractensticos de la enfermedad de Fabry pueden aparecer en hemicigotos masculinos y portadoras femeninas con la misma prevalencia, aunque las mujeres tfpicamente se ven afectadas de forma menos grave.
a-Galactosidasa A (a-GAL) humana se refiere a una enzima codificada por el gen Gla humano. La enzima a- GAL humana consiste en 429 aminoacidos, y esta en el numero de acceso GenBank U78027.
Como se usa aqm en una realizacion, la expresion “a-GAL mutada” incluye un a-GAL que tiene una mutacion en el gen que codifica a-GAL, que da como resultado la incapacidad de la enzima para lograr una conformacion estable en las condiciones normalmente presentes en el ER. El fracaso a la hora de lograr una conformacion estable da como resultado que se degrada una cantidad sustancial de la enzima, en lugar de ser transportada al lisosoma. Tal mutacion se denomina algunas veces un “mutante conformacional”.
Las mutaciones de a-GAL ejemplares no limitantes, asociadas con la enfermedad de Fabry, que dan como resultado a-GAL inestable, incluyen L32P; N34S; T41I; M51K; E59K; E66Q; I91T; A97V; R100K; R112C; R112H; F113L; T141L; A143T; G144V; S148N; A156V; L166V; D170V; C172Y; G183D; P205T; Y207C; Y207S; N215S; A228P; S235C; D244N; P259R; N263S; N264A; G272S; S276G; Q279E; Q279K; Q279H; M284T; W287C; I289F; M296I; M296V; L300P; R301Q; V316E; N320Y; G325D; G328A; R342Q; E358A; E358K; R363C; R363H; G3705; y P409A.
Como se usa aqm, la expresion “chaperona farmacologica espedfica” (“SPC”) o “chaperona farmacologica” se refiere a cualquier molecula, incluyendo una pequena molecula, protema, peptido, acido nucleico, hidrato de carbono, etc., que se une espedficamente a una protema y tiene uno o mas de los siguientes efectos: (i) potenciar la formacion de una conformacion molecular estable de la protema; (ii) incluye el trafico de la protema desde el ER hacia otra localizacion celular, preferiblemente una localizacion celular nativa, es dear, evita la degradacion de la protema asociada al ER; (iii) evita la agregacion de protemas plegadas erroneamente; y/o (iv) restaura o potencia al menos parcialmente la funcion de tipo salvaje y/o actividad de la protema. Un compuesto que se une espedficamente a, por ejemplo, a-GAL, significa que se une a y ejerce un efecto de chaperona sobre a-GAL y no un grupo generico de enzimas relacionadas o no relacionadas. Mas espedficamente, esta expresion no se refiere a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
chaperonas endogenas, tales como BiP, o a agentes no espedficos que tienen actividad de chaperona no espedfica demostrada frente a diversas protemas, tales como glicerol, DMSO o agua deuterada, es dear, chaperonas qmmicas (veanse Welch et al., Cell Stress and Chaperones 1996; 1(2):109-115; Welch et al., Journal of Bioenergetics and Biomembranes 1997; 29(5):491-502; patente U.S. n° 5.900.360; patente U.S. n° 6.270.954; y patente U.S. n° 6.541.195). En la presente invencion, la SpC puede ser un inhibidor competitivo reversible.
Un “inhibidor competitivo” de una enzima se puede referir a un compuesto que se asemeja estructuralmente a la estructura qmmica y geometna molecular del sustrato enzimatico para unirse a la enzima en aproximadamente la misma localizacion que el sustrato. De este modo, el inhibidor compite por el mismo sitio activo que la molecula sustrato, incrementando asf la Km. La inhibicion competitiva es habitualmente reversible si hay disponibles suficientes moleculas sustrato para desplazar el inhibidor, es dear, los inhibidores competitivos se pueden unir de forma reversible. Por lo tanto, la cantidad de inhibicion enzimatica depende de la concentracion de inhibidor, de la concentracion de sustrato, y de las afinidades relativas del inhibidor y del sustrato por el sitio activo.
A continuacion se da una descripcion de algunas chaperonas farmacologicas espedficas contempladas por esta invencion:
1-desoxigalactonojirimicina se refiere a un compuesto que tiene las siguientes estructuras:
imagen1
imagen2
Este termino incluye tanto la base libre como cualesquiera formas salinas. La sal de hidrocloruro de DGJ es conocida como hidrocloruro de migalastat (Migalastat).
Todavfa otras SPCs para a-GAL se describen en las patentes U.S. 6.274.597, 6.774.135, y 6.599.919 de Fan et al., e incluyen a-3,4-di-epi-homonojirimicina, 4-epi-fagomina, y a-alo-homonojirimicina, N-metil-desoxigalactonojirimicina, P-1-C-butil-desoxigalactonojirimicina, y a-galacto-homonojirimicina, calistegina A3, calistegina B2, calistegina B3, N- metil-calistegina A3, N-metil-calistegina B2 y N-metil-calistegina B3.
Como se usa aqrn, la expresion “se une espedficamente” se refiere a la interaccion de una chaperona farmacologica con una protema tal como a-GAL, espedficamente una interaccion con restos de aminoacidos de la protema que participa directamente en la puesta en contacto con la chaperona farmacologica. Una chaperona farmacologica se une espedficamente a una protema diana, por ejemplo, a-GTAL, para ejercer un efecto de chaperona sobre a-GAL y no un grupo generico de protemas relacionadas o no relacionadas. Los restos de aminoacidos de una protema que interaccionan con una chaperona farmacologica dada pueden estar o no dentro del “sitio activo” de la protema. La union espedfica se puede evaluar mediante ensayos de union habituales o mediante estudios estructurales, por ejemplo, co-cristalizacion, RMN, y similares. El sitio activo para a-GAL es el sitio de union del sustrato.
“Actividad deficiente de a-GAL” se refiere a la actividad de a-GAL en celulas de un paciente que esta por debajo del intervalo normal en comparacion (usando los mismos metodos) con la actividad en individuos normales que no tienen o que no se sospecha que tienen enfermedad de Fabry o cualquier otra enfermedad (especialmente una enfermedad de la sangre).
Como se usa aqrn, las expresiones “potenciar la actividad de a-GAL” o “incrementar la actividad de a-GAL” se refieren a incrementar la cantidad de a-GAL que adopta una conformacion estable en una celula que se pone en contacto con una chaperona farmacologica espedfica para la a-GAL, con respecto a la cantidad en una celula (preferiblemente del mismo tipo celular o la misma celula, por ejemplo, en una etapa mas temprana) que no se pone en contacto con la chaperona farmacologica espedfica para la a-GAL. Esta expresion tambien se refiere a incrementar el trafico de a-GAL hacia el lisosoma en una celula que se pone en contacto con una chaperona farmacologica espedfica para la a-GAL, con respecto al trafico de a-GAL que no se pone en contacto con la chaperona farmacologica espedfica para la protema. Estas expresiones se refieren tanto a a-GAL de tipo salvaje como mutante. En una realizacion, el incremento en la cantidad de a-GAL en la celula se mide midiendo la hidrolisis de un sustrato artificial en lisados procedentes de celulas que han sido tratadas con la SPC. Un incremento en la hidrolisis es indicativo de una mayor actividad de a-GAL.
La expresion “actividad de a-GAL” se refiere a la funcion fisiologica normal de una a-GAL de tipo salvaje en una celula. Por ejemplo, la actividad de a-GAL incluye la hidrolisis de GL-3.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Un “respondedor” es un individuo (diagnosticado con o que se sospecha que tiene la enfermedad de Fabry) cuyas celulas muestran una actividad de a-GAL suficientemente incrementada, y/o mejona de los smtomas o mejora en marcadores sustitutos, en respuesta al contacto con una SPC. Los ejemplos no limitantes de mejoras en marcadores sustitutos para la enfermedad de Fabry incluyen incrementos en los niveles o actividad de a-GAL en celulas (por ejemplo, fibroblastos) y tejido; reducciones en la acumulacion de GL-3; menores concentraciones plasmaticas de homocistema y molecula 1 de adhesion de celulas vasculares (VCAM-1); menor acumulacion de GL-3 en las celulas del miocardio y fibrocitos valvulares; reduccion en la hipertrofia cardfaca (especialmente del ventnculo izquierdo), mejora de la insuficiencia valvular y arritmias; mejora de la proteinuria; menores concentraciones urinarias de lfpidos tales como CTH, lactosilceramida, ceramida, y mayores concentraciones urinarias de glucosilceramida y esfingomielina (Fuller et al., Clinical Chemistry, 2005; 51: 688-694); la ausencia de cuerpos de inclusion laminados (cuerpos de Zebra) en celulas epiteliales glomerulares; mejoras en la funcion renal; mitigacion de la hipohidrosis; ausencia de angioqueratomas; y mejoras de anormalidades de la audicion tales como perdida de audicion sensorineural de alta frecuencia, perdida de audicion progresiva, sordera repentina, o acufenos. Las mejoras en smtomas neurologicos incluyen prevencion de ataque isquemico transitorio (TIA) o apoplejfa; y mejora de dolor neuropatico que se manifiesta por sf mismo como acroparestesia (escozor u hormigueo en las extremidades).
La dosis que logra una o mas de las respuestas mencionadas anteriormente es una “dosis terapeuticamente eficaz”.
La frase “farmaceuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiologicamente tolerables y no producen tfpicamente reacciones inapropiadas cuando se administran a un ser humano. Preferiblemente, como se usa aqrn, la expresion “farmaceuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia normativa del gobierno federal o del gobierno estatal, o enunciado en la Farmacopea de los Estados Unidos de America u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y mas particularmente en seres humanos. El termino “vehmulo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehmulo con el que se administra el compuesto. Tales vehmulos farmaceuticos pueden ser lfquidos esteriles, tales como agua y aceites. El agua o la disolucion acuosa, disoluciones salinas o disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol se emplean preferiblemente como vehmulos, particularmente para disoluciones inyectables. Los vehmulos farmaceuticos adecuados se describen en “Remington's Pharmaceutical Sciences” por E.W. Martin, 18a Edicion, u otras ediciones.
Como se usa aqrn, el termino “aislado” significa que el material citado se elimina del entorno en el que se encuentra normalmente. De este modo, un material biologico aislado puede estar libre de componentes celulares, es dear, componentes de las celulas en las cuales se encuentra o se produce el material. En el caso de moleculas de acido nucleico, un acido nucleico aislado incluye un producto de PCR, una banda de ARNm en un gel, un ADNc, o un fragmento de restriccion. En otra realizacion, un acido nucleico aislado se escinde preferiblemente del cromosoma en el que se puede encontrar, y mas preferiblemente ya no esta unido a regiones no reguladoras, no codificantes, o a otros genes, situados en direccion 5' o en direccion 3' del gen contenido por la molecula de acido nucleico aislada cuando se encuentra en el cromosoma. En todavfa otra realizacion, el acido nucleico aislado carece de uno o mas intrones. Los acidos nucleicos aislados incluyen secuencias insertadas en plasmidos, cosmidos, cromosomas artificiales, y similares. De este modo, en una realizacion espedfica, un acido nucleico recombinante es un acido nucleico aislado. Una protema aislada se puede asociar con otras protemas o acidos nucleicos, o con ambos, con los que se asocia la celula, o con membranas celulares si es una protema asociada a la membrana. Un organulo, celula o tejido aislado se retira del sitio anatomico en el que se encuentra en un organismo. Un material aislado puede estar, aunque no es necesario, purificado.
Las expresiones “alrededor de” y “aproximadamente” significaran generalmente un grado aceptable de error para la cantidad medida, dada la naturaleza o precision de las mediciones. Los grados ejemplares tfpicos de error estan dentro del 20 por ciento (%), preferiblemente dentro del 10%, y mas preferiblemente dentro del 5% de un valor o intervalo de valores dado. Como alternativa, y particularmente en sistemas biologicos, las expresiones “alrededor de” y “aproximadamente” pueden significar valores que estan dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro de 10 o 5 veces, y mas preferiblemente dentro de 2 veces de un valor dado. Las cantidades numericas dadas aqrn son aproximadas excepto que se establezca de otro modo, queriendo decir que la expresion “alrededor de” o “aproximadamente” se puede inferir cuando no se senale expresamente.
Metodo
Para determinar facilmente si la terapia con SPC sera un tratamiento viable para pacientes con Fabry, incluyendo portadoras femeninas, se desarrollo un ensayo de rescate con DGJ simple, no invasivo, de la actividad de a en WBCs, o subconjuntos de WBCs, procedentes de pacientes con Fabry.
I. Ensayo in vitro
El metodo de diagnostico implica purificar celulas T y establecer cultivos de celulas T a partir de espedmenes de sangre procedentes de pacientes con Fabry (o pacientes que se sospecha que tienen la enfermedad de Fabry). Los cultivos de celulas T se tratan entonces con o sin una SPC, por ejemplo DGJ, durante un penodo de tiempo suficiente para demostrar la potenciacion (es decir, incremento) de la actividad de a-GAL. Las celulas T se lisan entonces, y el lisado se usa en un ensayo para determinar la actividad enzimatica. Un incremento suficiente en la actividad de a-GAL en los lisados procedentes de celulas tratadas con la SPC con respecto a la actividad en los
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
lisados procedentes de celulas no tratadas indica que el paciente probablemente respondera a la terapia con SPC (es dedr, el paciente sera un “respondedor”).
Este metodo se puede llevar a cabo segun lo siguiente.
Separacion de globulos blancos
Los WBCs se preparan usando tecnicas estandar, por ejemplo recoleccion, centrifugacion, separacion, y lavado. Mas espedficamente, se pueden preparar segun las siguientes etapas:
1. Se extrae una muestra de sangre de un paciente con Fabry. En realizaciones espedficas, se extraen aproximadamente 8 a 10 ml en un recipiente apropiado, tal como un tubo CPT de Becton-Dickenson (que contiene un anticoagulante y un medio de separacion).
2. La muestra de sangre se centrifuga para separar globulos rojos de globulos blancos y plasma. Tfpicamente, esta etapa se puede realizar a temperatura ambiente (18-25°C) a alrededor de 1800 x g con una centrifugadora de mesa durante alrededor de 20-30 minutos, o hasta que los globulos rojos se separan del plasma y de los globulos blancos (WBCs). Sin embargo, tambien se pueden usar otras tecnicas conocidas de separacion de globulos blancos, por ejemplo Ficoll-Hypaque, Percoll u otros gradientes de densidad similares. En una realizacion alternativa, las celulas T se enriquecen de WBCs usando separacion magnetica o mediada por anticuerpos usando seleccion negativa para eliminar otros tipos celulares a fin de obtener celulas T no unidas. Se puede usar cualquier tecnica conocida para enriquecer celulas T, aunque se prefieren los metodos menos caros y mas oportunos.
3. Se descarta la mitad de la capa plasmatica (sin perturbar la capa de globulos blancos), y el fluido que queda, que contiene los globulos blancos, se transfiere a un tubo de centrifugadora.
4. Los WBCs se peletizan entonces y se lavan dos o mas veces resuspendiendo las celulas peletizadas en un tampon isotonico apropiado, por ejemplo PBS, seguido de la centrifugacion durante alrededor de 15-20 minutos a alrededor de 320 x g.
5. El pelete se resuspende entonces con un pequeno volumen de tampon isotonico apropiado, por ejemplo PBS. La mitad del pelete se transfiere a un criovial etiquetado para la congelacion. La otra mitad se usa para establecer cultivos de celulas T como se describe mas abajo. La muestra que se va a congelar se centrifuga y despues se resuspende en un pequeno volumen de tampon isotonico apropiado, por ejemplo RPMI 1640 mas DMSO, antes de la congelacion.
Cultivos de celulas T
Los cultivos de celulas T se establecen estimulando las celulas T presentes en la preparacion de WBC, por ejemplo, segun el siguiente procedimiento.
1. Las celulas lavadas procedentes de lo anterior se resuspenden en un medio de cultivo celular apropiado, tal como RPMI suplementado con citocinas y/o mitogenos estimulantes de celulas T. Las citocinas estimulantes sugeridas incluyen IL-2, IL-12, IL-15, fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A (con A), y mitogeno de fitolaca. En una realizacion particular, los WBCs se resuspenden en un volumen apropiado de medio RPMI 1640 suplementado con FBS, IL-2 y una concentracion estimulante de PHA. Entonces se pueden transferir a una vasija de cultivo apropiada, y se incuban durante un tiempo suficiente para la expansion, por ejemplo alrededor de 2-3 dfas.
2. Despues de que las celulas T se expanden, se pueden congelar, por ejemplo a alrededor de 3 x 106 celulas/vial usando medio RPMI 1640 suplementado para crioconservacion, por ejemplo que contiene FCS y DMSO. Esto es suficiente para congelar 5 ml de cultivo a 5 x 105 celulas viables/ml.
Se ha de senalar que un experto normal en la tecnica sera capaz de averiguar las cantidades apropiadas de citocinas o mitogenos estimulantes de celulas T, aunque tfpicamente tales agentes se anaden en cantidades de entre alrededor de 1 ng/ml y alrededor de 25 ng/ml (o alrededor de 100 U/ml) para citocinas. Para los mitogenos, las concentraciones oscilan de alrededor de 10 ng/ml a alrededor de 10 |ig/ml, estando las mas eficaces para mitogenos en el intervalo bajo de |ig/ml.
Ensayo de actividad/potenciacion enzimatica
Tfpicamente, las celulas T aisladas anteriormente (por ejemplo, aproximadamente 2,5 x 106) se hacen crecer en medio de cultivo (precedido de la descongelacion, si estan congeladas) en una vasija de cultivo apropiada en ausencia o presencia de la SPC, por ejemplo DGJ, durante un tiempo suficiente para evaluar el cambio en la actividad de a-GAL, por ejemplo 2 o 3 dfas. Las dosis de DGJ que se espera que potencien a-GAL estan en el intervalo de alrededor de 2 nM a alrededor de 150 |iM, preferiblemente alrededor de 1 |iM a 100 |iM, y mas preferiblemente alrededor de 5 |iM a 50 |iM. En una realizacion espedfica, DGJ se anade a alrededor de 20 |iM. Las celulas se pueden cosechar mediante centrifugacion, y se lavan dos veces con PBS. Los peletes se pueden almacenar congelados a -80°C hasta que se evaluan para determinar la actividad enzimatica.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Las celulas se lisan entonces mediante adicion de tampon de lisis (o agua desionizada) y la disgregacion ffsica (pipeteo, sometiendo a vortice y/o agitacion, y/o sometiendo a ultrasonidos) a temperatura ambiente o en hielo, seguido de la reunion de los lisados en hielo, y separando despues el lisado reunido en pequenas almuotas y congelando.
Los lisados se pueden descongelar inmediatamente antes del ensayo, y se debenan suspender mediante uso de una mezcladora de vortice, y se debenan de someter a ultrasonidos antes de la adicion a los pocillos apropiados, por ejemplo en una microplaca. Entonces se anade N-acetilgalactosamina (GalNAc) a cada pocillo (para inhibir a- galactosidasa B), seguido de una incubacion corta. Entonces se anade 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranosido (4- MU Gal), u otro sustrato de DGJ marcado apropiado, y la placa se mezcla suavemente durante un penodo breve de tiempo, se cubre, y se incuba a 37°C durante un tiempo suficiente para la hidrolisis del sustrato, habitualmente alrededor de 1 hora. Para detener la reaccion, se anade a cada pocillo tampon de NaOH-glicina, pH 10,7, y la placa se lee en un lector de placas fluorescente (por ejemplo Wallac 1420 Victor3 ™ o instrumento similar). Las longitudes de onda de excitacion y de emision se ajustaron habitualmente a 355 nm y 460 nm, respectivamente. Una unidad de actividad enzimatica se define como la cantidad de enzima que cataliza la hidrolisis de 1 nmol de 4- metilumbeliferona por hora. Para cada muestra de paciente, se debenan ensayar concurrentemente al menos tres muestras normales.
Diversas modificaciones de este ensayo seran facilmente averiguables para aquel de pericia normal en la tecnica. Los ejemplos de sustratos artificiales que se pueden usar para detectar la actividad de a-GAL incluyen, pero no se limitan a, p-nitrofenil-a-D-galactopiranosido y 4-MU GAL. Obviamente, solo son adecuados para uso los sustratos que se pueden escindir mediante a-GAL humana. Se observa que aunque se prefiere el uso de un sustrato fluorogeno, se contemplan otros metodos de determinacion de la actividad de a-GAL para uso en el metodo, incluyendo sustratos cromogenos y tecnicas de inmunocuantificacion.
Diagnostico y pronostico. El ensayo de celulas T se puede modificar facilmente para uso como un ensayo de diagnostico para diagnosticar la enfermedad de Fabry eliminando simplemente la etapa de cultivo de las celulas T en presencia de DGJ antes de llevar a cabo los ensayos de potenciacion. La actividad de a-GAL en celulas T establecidas a partir de un individuo que se sospecha que tiene la enfermedad de Fabry se puede cuantificar en su lugar usando celulas T procedentes de un individuo normal como control. Ademas, tanto la actividad de a-GAL como los ensayos de potenciacion mediante SPC se pueden llevar a cabo casi simultaneamente usando las mismas celulas T derivadas de una muestra del paciente. Puesto que las celulas T pueden expresar mas a-GAL (la a-GAL en celulas T normales en comparacion con WBCs es mucho mayor), sera mas facil de confirmar con mas certeza si un paciente tiene actividad de a-GAL por debajo del intervalo normal, debido a que el margen de error sera mas pequeno. En consecuencia, el uso del ensayo de celulas T podna evitar potencialmente diagnosticos erroneos.
Ademas, el ensayo modificado tambien se puede usar para monitorizar periodicamente el progreso de los pacientes en los que se inicio la terapia con SPC para confirmar que la actividad de a-GAL sigue aumentando con respecto a antes del inicio del tratamiento.
II. Ensayo in vivo
Se evaluaron WBCs para la potenciacion de a-GAL mediante una SPC in vivo. La actividad de a-GAL en WBCs derivados de pacientes se evalua antes de la administracion de SPC, a fin de obtener un valor de lmea base. A los pacientes se les administra entonces DGJ diariamente (por ejemplo, 150 mg/dfa) durante un penodo de tiempo suficiente, por ejemplo alrededor de 10 dfas a alrededor de 2 semanas, seguido de la extraccion de sangre y determinacion de cambios en la actividad de a-GAL desde el valor de lmea base. No es necesario el cultivo de las celulas antes o tras la administracion.
La dosis y el regimen de dosificacion de la administracion de DGJ durante el penodo de evaluacion in vivo puede variar dependiendo del paciente, puesto que hay tanta heterogeneidad entre las mutaciones, y dependiendo de la actividad residual de a-GAL del paciente. Como ejemplos no limitantes, se espera que las siguientes dosis y regfmenes sean suficientes para incrementar a-GAL en individuos mayoritariamente “rescatables”: 25 mg b.i.d; 50 mg una vez al dfa; 50 mg b.i.d.; 50 mg una vez cada dos dfas, 75 mg una vez al dfa; 75 mg b.i.d.; 100 mg una vez al dfa; 100 mg b.i.d.; 150 mg una vez al dfa; 150 mg b.i.d., 150 mg una vez cada dos dfas; 250 mg una vez al dfa; 250 mg b.i.d. y 250 mg una vez cada dos dfas. En realizaciones espedficas, las dosis son 50 mg una vez al dfa; 50 mg una vez cada dos dfas; 150 mg una vez al dfa; 150 mg una vez cada dos dfas.
La administracion de DGJ de acuerdo con la presente invencion se realiza en una formulacion adecuada para la administracion por boca en una forma de dosificacion oral tal como un comprimido, capsula o disolucion. Como ejemplo, al paciente se le administran oralmente capsulas que contienen cada una 25 mg, 50 mg, 75 mg o 100 mg, o sus combinaciones. Para este ensayo, en el caso de la administracion oral, se prefiere que al paciente se le administre la DGJ sin alimentos (por ejemplo, sin alimentos 2 horas antes y durante 2 horas despues de la dosificacion), puesto que la biodisponibilidad puede ser menor si se toma con alimento, con riesgo de ese modo de resultados inexactos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Los pacientes que han estado en otras terapias, tales como ERT, debenan cesar el tratamiento durante al menos alrededor de 28 d^as antes del ensayo in vivo, para asegurar los resultados mas exactos.
Separacion de los globulos rojos
Los WBCs se aislaron y separaron como se describe anteriormente para el ensayo in vitro de celulas T. Sin embargo, no se ha de anadir medio RPMI o DMSO a los peletes antes de la congelacion (como ocurrio en la etapa 5 anterior).
Ensayo de actividad/potenciacion enzimatica
Los peletes se descongelaron en hielo, y las celulas se lisaron entonces mediante adicion de tampon de lisis y disgregacion ffsica (tal como mediante el uso de una mezcladora de vortice y agitacion, y/o ultrasonidos a temperatura ambiente) durante un tiempo suficiente, seguido de la reunion de los lisados en un tubo de polipropileno en hielo, separando despues el lisado reunido en almuotas para la congelacion.
Los lisados de WBC se descongelaron entonces en hielo y se mezclaron (nuevamente mediante ultrasonidos y/o sometiendo a vortice). Entonces se anadieron muestras de cada lisado, asf como patrones y controles negativos, a los pocillos apropiados en, por ejemplo, una microplaca de 24 o 96 pocillos. Se anaden cantidades iguales de GalNAc a cada pocillo en por ejemplo tampon de citrato/fosfato, pH 4,6, seguido de la adicion de un sustrato marcado, tal como 4-MU Gal (tambien en tampon de citrato/fosfato, pH 4,6) a todos los pocillos, y la incubacion durante un tiempo corto a temperatura ambiente. La placa se mezcla entonces brevemente y se incuba a 37°C durante un penodo de tiempo suficiente para permitir la hidrolisis del sustrato, por ejemplo alrededor de 1 hora. Despues del penodo de tiempo suficiente, la reaccion se detiene mediante adicion de tampon de parada, y la placa se lee en un lector de placas fluorescente (por ejemplo, Wallac 1420 Victor3 ™) para determinar la actividad enzimatica por pocillo.
Diversas modificaciones de este ensayo seran facilmente averiguables por aquel de pericia normal en la tecnica. Los ejemplos de sustratos artificiales que se pueden usar para detectar la actividad de a-GAL incluyen, pero no se limitan a, p-nitrofenil-a-D-galactopiranosido y 4-MU Gal. Obviamente, solo son adecuados para uso los sustratos que se pueden escindir mediante a-GAL humana. Se senala que aunque se prefiere el uso de un sustrato fluorogeno, se contemplan otros metodos de determinacion de la actividad de a-GAL para uso en el metodo, incluyendo sustratos cromogenos o tecnicas de inmunocuantificacion.
Criterios de determinacion de idoneidad
Los criterios para determinar la idoneidad de la terapia con SPC dependen de la actividad enzimatica residual del paciente en la lmea base, es dear, la actividad determinada en las celulas T no tratadas en el ensayo in vitro, o la actividad en los WBCs antes de la administracion de SPC en el ensayo in vivo. Cuanto menor es la actividad residual, mayor necesidad de potenciacion a fin de que el paciente sea considerado un respondedor probable al tratamiento.
Los criterios para determinar la idoneidad para el ensayo in vitro son los siguientes:
• Si la actividad residual de a-Gal A en linfocitos es menor que 1% del normal, entonces la actividad de a-GAL tras la incubacion con DGJ debe ser al menos 2% del normal;
• si la actividad residual de a-GAL en linfocitos esta entre 1% del normal y <3% del normal, entonces la actividad de a-GAL tras la incubacion con DGJ debe ser al menos 2x el nivel de la lmea base;
• si la actividad residual de a-GAL en linfocitos esta entre 3% del normal y <10% del normal, entonces la actividad de a-GAL tras la incubacion con DGJ debe ser al menos 3% del normal mayor que el nivel de la lmea base; y
• si la actividad residual de a-GAL en linfocitos es 10% del normal o mas, entonces la actividad de a-GAL tras la incubacion con DGJ debe ser al menos 1,3x el nivel de la lmea base.
Como alternativa, los pacientes con enfermedad de Fabry se podnan categorizar como idoneos para la terapia con SPC si su actividad de a-GAL en celulas T en presencia de una SPC tal como DGJ es al menos alrededor de 35-40 nmoles/h/mg de protema, lo que es alrededor de 58% del normal. De acuerdo con la presente invencion, el promedio espedfico fue demasiado variable para darlo como una media global. En consecuencia, las muestras de celulas T de los pacientes se compararon en actividad con al menos tres controles normales recogidos en las 48 h de la fecha de recogida para la muestra de paciente, y se hicieron crecer en condiciones identicas (vease el Ejemplo 1). Como comparacion, la actividad de a-GAL en celulas T procedentes de pacientes con Fabry con A97V, R301Q, y R111H en la lmea base fue 8 nmoles/h/mg de protema, 4 nmoles/h/mg y 1,8 nmoles/h/mg. Las celulas T expresan mayores niveles de a-GAL en comparacion con otros WBCs, de manera que se espera que la actividad de a-GAL en un cultivo enriquecido para celulas T sera significativamente mayor que cuando se considera normal en WBCs totales (21 nmoles/h/mg de protema a alrededor de 50 nmoles/h/mg de protema; Desnick et al., The Metabolic and
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Molecular Bases of Inherited Disease. 8a Edicion 2001, Scriver et al., ed., p. 3733-3774, McGraw-Hill, Nueva York). Para comparacion, tres pacientes con Fabry que tienen las mutaciones R220X, R356W, y G132R tuvieron una actividad de a-GAL en WBC de 0,22, 0,18, y 0,26 nmoles/br/mg de protema, respectivamente.
Para el ensayo in vivo, se usaron los siguientes criterios para determinar los criterios de idoneidad:
• Si a-GAL de la lmea base es menor que 1% del normal, entonces la actividad de a-GAL en el Dfa 15 tras el tratamiento con DGJ debe ser al menos 2% del normal;
• si a-GAL de la lmea base esta entre 1% del normal y <5% del normal, entonces la actividad de a-GAL debe ser al menos 2x el nivel de lmea base despues del penodo de tratamiento;
• si a-GAL de la lmea base esta entre 5% del normal y <10% del normal, entonces la actividad de a-GAL debe ser al menos 5% del normal mayor que el nivel de la lmea base despues del penodo de tratamiento; y
• si a-GAL de la lmea base esta es 10% del normal o mas, entonces la actividad de a-GAL debe ser al menos 1,5x el nivel de lmea base despues del penodo de tratamiento.
Como alternativa, un incremento en la actividad de al menos alrededor de 20% en las celulas cultivadas con SPC con respecto a la actividad en las celulas no cultivadas con SPC, ya sea en el ensayo in vitro o in vivo, puede ser indicativo de que el paciente tendra una respuesta clmicamente relevante (terapeuticamente eficaz) a la terapia con SPC.
Este descubrimiento proporciona un metodo para mejorar el diagnostico de y facilitar decisiones de tratamiento clmico para la enfermedad de Fabry en particular, y la enfermedad de almacenamiento lisosomico en general. Ademas, este metodo se puede extender a un amplio intervalo de enfermedades geneticamente definidas en tipos celulares apropiados. Esta clase de enfermedad incluye los otros trastornos de almacenamiento lisosomico, fibrosis cfstica (CFTr) (celulas epiteliales de las glandulas sudonparas o respiratorias), hipercolesterolemia familiar (receptor de LDL; adipocitos de LpL o celulas endoteliales vasculares), cancer (p53; celulas tumorales PTEN), y amiloidosis (transtirretina), entre otros.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1: Metodo in vitro para evaluar los efectos de una SPC sobre la actividad de a-GAL
El presente Ejemplo proporciona el ensayo de diagnostico in vitro para determinar una capacidad de respuesta del paciente con Fabry a chaperona farmacologica espedfica.
A. Preparacion de peletes de WBC humanos para el crecimiento de linfocitos T
1. Materiales:
Tubo CPT: Becton-Dickenson (tubo de preparacion de celulas BD Vacutainer® CPT™ con citrato de sodio, n° de cat. 362761). IL-2 humana (recombinante), PreProTECH, n° de cat. 200-02
Fitohemaglutinina (Forma M) (PHA), lfquida, Invitrogen, n° de cat. 10576-015
Medio RPMI-1640, Mediatech Inc., n° de cat. 10-040-CV
Suero fetal bovino, Mediatech Inc., n° de cat. 35-010-CV Acido cftrico, monohidrato, ACS, Mallinckrodt, n° de cat. 0627
Fosfato sodico dibasico (Na2HPO4), ACS, Mallinckrodt n° de cat. 7917 Hidroxido de sodio, disolucion volumetrica I0N, Mallinckrodt n° de cat. H385 Acido fosforico, ACS, Mallinckrodt n° de cat. PX0995-3
4-MU a-D-galactopiranosido (4-MU-Gal), Sigma n° de cat. M-7633 N-Acetil-D-galactosamina (GalNAc), Sigma n° de cat. A-2795
4-metilumbeliferona (4-MU), Sigma n° de cat. M-1381 Glicina, grado de cultivo tisular, Fisher n° de cat. BP381 Agua doblemente desionizada
Disolucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco, PBS, (sin Ca, sin Mg), Mediatech Inc. n° de cat. 21- 031-CV
5
10
15
20
25
30
35
40
Kit de ensayo de protemas Micro BCA, Pierce n° de cat. 23235
Placas de microtitulacion de 96 pocillos, Costar fondo redondo de 96 pocillos de poliestireno negro, n° de cat. 3792 Microplacas tratadas de cultivo tisular de 24 pocillos Costar, Corning Life Sciences, n° de cat. 3526
Tubos Falcon de polipropileno de 15 ml, Becton Dickinson, n° de cat. 352097
Crioviales esteriles
Incubadora humidificada de CO2 al 5%, 37°C Bano de agua a 37°C Lector de placas mediante fluorescencia Separacion de WBC:
Se extrajo sangre del paciente en un tubo de CPT de 8 ml, que se ha almacenado a 18-25°C.
Inmediatamente despues de recoger sangre, se mezclo invirtiendo el tubo 8-10 veces.
El tubo se centrifugo a temperatura ambiente (18-25°C) durante 30 minutos a 1800 x g usando una centrifugadora de mesa equipada con cubetas oscilantes. Se llevaron a cabo normas de seguridad para la manipulacion de muestras de sangre, incluyendo el uso de una cubeta de tipo canasto cerrada para la centrifugacion.
• Tras la centrifugacion, varias capas de la composicion sangumea se hicieron distinguibles, lo que represento la separacion de los globulos rojos del plasma y globulos blancos. Si esto no se produce, calientese en las manos durante 5 minutos y centrifuguese de nuevo.
3. Lavado de los WBCs
• La mitad de la capa plasmatica se aspiro mediante vado y se desecho sin perturbar la capa de globulos blancos. Todo el fluido que queda, incluyendo la capa celular, se transfirio con una pipeta Pasteur a un tubo de centrifugadora Falcon de tapa de rosca conico de 15 ml.
• Se anadio PBS para llevar el volumen hasta 14 ml, y el tubo se mezclo mediante inversion.
• El tubo se centrifugo a temperatura ambiente durante 20-30 minutos a 1300 rpm (aproximadamente 320 x g).
• Inmediatamente despues de la centrifugacion, se aspiro tanto sobrenadante como fue posible mediante vado y se desecho sin perturbar el pelete celular.
4. Lavado opcional
• El pelete celular se resuspendio en el lfquido que queda golpeando contra la parte inferior del tubo.
• Se anadieron 10 ml de PBS a las celulas resuspendidas, y se centrifugo a temperatura ambiente durante 20
minutos a 1300 rpm.
• Inmediatamente despues de la centrifugacion, se aspiro tanto sobrenadante como fue posible mediante vado y se desecho sin perturbar el pelete celular.
5. Opcional: Congelacion del pelete de WBC
• El pelete celular se mezclo en el lfquido que queda golpeando con un dedo contra la parte inferior del tubo.
• Se anadieron 0,5 a 1 ml de PBS a las celulas resuspendidas, y se transfirio la mitad del pelete (usando una punta esteril en una micropipeta) a un criovial de 1,8 ml marcado.
• El criovial se centrifugo a temperatura ambiente durante 5 minutos a 5000 rpm (aproximadamente 2250 g) en una microcentrifugadora.
• Todo el lfquido del sobrenadante se desecho usando una pipeta Pasteur sin perturbar el pelete celular.
• Entonces se anadieron al tubo 0,5 a 1 ml de RPMI 1640 que contiene 10% de FBS y 5% de DMSO y se
mezclo con una pipeta y se congelo toda la noche a -80C antes de transferir a un congelador de almacenamiento de celulas en nitrogeno lfquido.
B. Establecimiento de cultivos de celulas T a partir de muestras de sangre
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
1. Las celulas lavadas se resuspendieron en 3,0 ml de medio RPMI 1640 con 10% de suero Cosmic Calf Serum (CCS, Hyclone Laboratories, Logan, UT), alrededor de 25 ng/ml de IL-2 (PreProTECH, Rocky Hill, NJ) y la concentracion de PHA (Life Technology, Gaithersburg, MD) recomendada por el fabricante. Las celulas se transfirieron entonces a un matraz de cultivo de 25 cm3 vertical, y se incubaron durante 3-4 dfas a 37°C, 5% de CO2.
2. El cultivo celular se diluyo hasta 5 ml con medio de crecimiento (RPMI-1640, 10% de FBS, 25 ng/ml de IL-2). La concentracion celular se ajusto entonces a alrededor de 5 x 105 celulas/ml en el matraz.
3. El crecimiento de las celulas se monitorizo diariamente. Las celulas se mantuvieron entre 5 x 105 y 1,5 x 106 celulas en un matraz vertical. La profundidad del medio en el matraz no supero 1 cm (alrededor de 7 ml en un T25 y 20 ml en un T75). Los cultivos se pueden mantener durante aproximadamente 21 dfas con un tiempo de duplicado de alrededor de 24 h. La senescencia del cultivo sera manifiesta mediante una reduccion drastica en la tasa de crecimiento. El tiempo de cultivo se puede extender posiblemente mediante reestimulacion con PHA.
4. Congelacion opcional de linfocitos T: los linfocitos T se pueden congelar a 3 x 106 celulas/vial usando medio RPMI 1640 que contiene 20% de FCS y 7,5% de DMSO. En el dfa 5, 6 o 7, crioconservense tantos viales como sea posible a 3 x 106 celulas/vial. Esto es suficiente para descongelar 5 ml de cultivo a 5 x 105 celulas viables/ml.
Cuando se establezcan cultivos de celulas T, se debena observa lo siguiente.
• Las muestras de sangre reciente se debenan recoger en tubos heparinizados (o tubos que contengan un anticoagulante apropiado), y se debenan usar el mismo dfa. Se debenan tubos ACD si las muestras no se pueden procesar en las 24 horas. (Clin Chem. enero de 1988; 34(1): 110-3; Clin Diagn Lab Immunol. noviembre de 1998; 5(6): 804-7.).
• Habitualmente es suficiente ocho-10 ml de sangre para establecer 20 millones de celulas hacia el dfa 5.
• Los linfocitos T son las dianas espedficas del virus del VIH. Extremese la precaucion si se desconoce el estado de VIH del paciente.
• Cada nuevo lote de IL-2 se debena ensayar para determinar la concentracion optima. Se ha encontrado que el lote procedente de PreProTECH usado para estos experimentos es optimo a 25 ng/ml, con solo una ligera reduccion en el crecimiento celular a concentraciones hasta 50 ng/ml.
• Cada lote de mitogeno, por ejemplo fitohemaglutinina A (PHA), se evalua por el proveedor (Invitrogen), y se debena usar a la dilucion recomendada.
• Todos los cultivos se mantuvieron en una atmosfera saturada con agua a 37C, 5% de CO2.
• Las celulas mononucleares y los linfocitos tambien se pueden recoger usando medio de separacion de linfocitos (Ficoll-Hypaque) o tubos Lymphoprep, siguiendo el procedimiento estandar del fabricante.
Cuando se analiza mediante clasificacion celular activada por fluorescencia, el regimen de estimulacion de IL-2 y PHA da como resultado 99% celulas CD3-positivas (que tinen todos los subconjuntos de celulas T), con numeros iguales de celulas CD4-positivas y CD4-negativas (datos no mostrados).
C. Tratamiento con chaperonas
La densidad de las celulas T se ajusto a 1 x 106 por 3 ml de medio de cultivo (RPMI-1640, 10% de FBS, 25 ng/ml de IL-2). Entonces se pipetean 3 ml (~1 x 106 celulas) en cada uno de 6 pocillos de una placa de cultivo marcada de 6 pocillos, y se incubo toda la noche a 37°C, 5% de CO2. Entonces se anadieron 3 ml de medio adicional a 3 pocillos para dar un volumen final de 6 ml/pocillo. A los tres pocillos que quedan, 3 ml de medio que contiene DGJ (Cambridge Major Laboratories, Inc., Germantown, WI) a una concentracion de alrededor de 40 |iM (2x; la concentracion final es 20 |iM), durante 4-5 dfas. Las celulas se cosecharon mediante centrifugacion (400 x g durante alrededor de 10 minutos) y se lavaron 1x en 10 ml de PBS. Los peletes resultantes se resuspendieron en 1 ml de PBS y se transfirieron a un tubo de microcentrifugadora de 1,7 ml, y se centrifugaron en una microcentrifugadora refrigerada a 3000 rpm durante 5 minutos. Se aspiro el sobrenadante, y los peletes se almacenaron congelados a - 80°C hasta que se ensayaron para determinar la actividad enzimatica.
Observese que antes de llevar a cabo el ensayo de potenciacion, se determino la concentracion optima de DGJ usando un intervalo de 2 nM-200 |iM. Se determino que 20 |iM fue el optimo.
D. Preparacion de fibroblastos
Para una comparacion, se prepararon cultivos de fibroblastos como se describio previamente (por ejemplo, documento U.S. 6.274.597). De forma breve, los cultivos de fibroblastos derivaron de biopsias de piel de pacientes y se hicieron crecer en DMEM con 10% de FBS hasta que se establecieron (3-4 semanas).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
E. Ensayo de actividad
Antes del ensayo, las celulas T se descongelaron en hielo y se sometieron a ultrasonidos durante 2 minutos, y todos los otros reactivos del ensayo se descongelaron a temperatura ambiente. El ensayo fluorometrico de la actividad de a-GAL se llevo a cabo esencialmente como se describio previamente (Kusiak et al., J Biol Chem. 1978; 253(1), 184190). Las celulas se lisaron en 0,2 ml de agua desionizada, combinado con un pipeteado y un vortice vigorosos. El sobrenadante obtenido tras la centrifugacion a 13000 rpm durante 2 min. a 4°C se coloco en un tubo reciente y se uso como la fuente de a-GAL. La actividad de a-GAL se determino incubando almuotas de 50 |il del sobrenadante (que contiene cantidades comparables de protema segun se determina usando 20 |il en un ensayo de cuantificacion de protema estandar) en una placa de 24 pocillos a 37°C con 3,75 mM de 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranosido (4-MU Gal) (Research Products International, Mount Prospect IL) en tampon de acido dtrico/fosfato (tampon de 27 mM de citrato/46 mM de fosfato, pH 4,6) sin taurocolato y con BSA (3 mg/ml). El porcentaje de a-GAL se determino comparando la actividad total con la actividad observada en presencia de 117 mM de N-acetilgalactosamina (GalNAc) Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), un inhibidor espedfico de N-acetilgalactosaminidasa. Se uso un lector de deteccion de fluorescencia Wallac 1420 Victor3™ (Perkin Elmer, CA) para medir la 4-MU liberada, a longitudes de excitacion y de emision de 355 nm y 460 nm, respectivamente. Tambien se emplearon pocillos apropiados para patrones fluorescentes y negativo (sin sustrato o sin lisado). Para cada muestra de paciente, se ensayaron concurrentemente al menos tres muestras normales.
Las incubaciones duraron tfpicamente 30 minutos, pero se pueden emplear penodos mas prolongados o mas cortos con resultados similares.
La actividad enzimatica (nmol/h/mg de protema) se calculo segun lo siguiente:
Fluorescenciadelamuestra * 60min. * 1000 |il * 1
Fluorescenciadelpatron Tiempodeincubacion(min.) Volumenevaluado(^l) Valordeprotema(mg/ml)
Una unidad de actividad enzimatica se define como la cantidad de enzima que cataliza la hidrolisis de 1 nmol de 4- metilumbeliferona por hora. El “ruido” de la lmea base en el resultado de fluorescencia se obtuvo evaluando seis veces el promedio del blanco. Si la actividad tras el tratamiento con SPC fue al menos 2 desviaciones estandar por encima de la lmea base, se considero sensible y sin ruido.
Para el ensayo de potenciacion de fibroblastos comparativo, se hicieron crecer fibroblastos (~1,5 x 106) en 12 ml de medio de cultivo en un matraz de cultivo tisular T75 en ausencia o presencia de DGJ a 20 |iM durante 3 dfas. Al final del penodo de incubacion, las celulas se eliminaron del matraz mediante tratamiento con disolucion de tripsina- EDTA, se recogieron mediante centrifugacion, y se lavaron 3 veces con disolucion salina tamponada con fosfato. Los peletes celulares se congelaron a -80C hasta que se ensayaron para determinar la actividad de a-GAL. Todas las etapas para procesar el pelete celular para el ensayo, incluyendo el tampon de extraccion, el tiempo de ultrasonidos, y los volumenes usados, son los mismos que los usados para las celulas T ensayadas anteriormente.
F. Transferencias Western
El nivel de protema a-GAL se midio mediante transferencia Western. La protema se determino usando un kit Micro BCA Protein Assay kit (Pierce, Rockford, IL), con seroalbumina bovina (BSA) como patron. La absorbancia a 562 nm se midio usando el lector de absorbancia de Molecular Devices VersaMax, en un formato de 96 pocillos. Para la electroforesis en gel antes de la transferencia Western, las protemas se separaron usando Novex Tris-glicina nativa o SDS-PAGE en geles de gradiente de 8-16% (Invitrogen). Las transferencias Western se desarrollaron usando anticuerpo policlonal de conejo frente a a-GAL como se describe previamente (Park et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100: 3450-54).
Resultados
Este metodo descrito anteriormente que usa celulas T es rapido y eficaz cuando se compara con ensayos de a-GAL a base de fibroblastos realizados sustancialmente de forma similar al ensayo de celulas T (excepto que se colocan en placas alrededor de 1,5 x 106 fibroblastos en cada pocillo en lugar de 2,5 x 106 celulas T).
Usando este metodo, se incubaron celulas T procedentes de pacientes con Fabry sin y con 20 |iM de DGJ durante 1, 2 y 4 dfas, respectivamente, y se midio la actividad de a-GAL en homogenados celulares y se comparo con valores de control normales. Cuando se repuso el medio despues de 2 dfas y las celulas se incubaron durante 2 dfas adicionales, la actividad de a-GAL de A97V fue 13% del control normal (Figura 1, drculos blancos). Sin embargo, cuando se anadio 20 |iM de DGJ al medio de las celulas T, la actividad de a-GAL aumento hasta alrededor de 40% del normal despues de solamente 1 dfa de incubacion, y continuo hasta 80% del normal tras 4 dfas de incubacion (Figura 1, drculos en negro). La adicion de DGJ reciente y de medio despues de 2 dfas, y la incubacion durante 2 dfas adicionales, no dio como resultado ningun cambio en el perfil con respecto al observado con una unica adicion de DGJ. El incremento observado en la actividad despues de 3 dfas hasta un nivel claramente distinguible de la actividad de a-GAL sin DGJ condujo a la adopcion de un tiempo estandar de medicion despues de 3 dfas de
5
10
15
20
25
incubacion con 20 |iM de DGJ en experimentos subsiguientes. El uso de un curso de tiempo de tres dfas evita la necesidad de proporcionar medio reciente y/o de dividir las celulas despues de 3 dfas en cultivo.
Para determinar el efecto de la dosificacion de DGJ en celulas T procedentes de controles normales, se midio la actividad de a-GAL en celulas de pacientes usando un intervalo de DGJ desde 2 nM hasta 200 |iM (Figura 2A), y se comparo con valores de controles normales no tratados ensayados en el mismo dfa. La actividad de a-GAL aumento entre 2 nM y 20 |iM de DGJ. A 200 |iM, DGJ inhibio la actividad normal de a-GAL hasta aproximadamente 40% del promedio de los controles normales no tratados. La potenciacion optima de la actividad mutada de a-GAL dentro de este mismo intervalo de concentraciones de DGJ se determino para la mutacion A97V y se comparo con los controles normales (Figura 2B). Se llevaron a cabo tres experimentos distintos para los efectos de la dosis sobre A97V. DGJ en concentraciones de 2 nM a 20 |iM aumento la actividad de a-GAL de A97V de una manera dependiente de la dosis. Sin embargo, a concentraciones de DGJ de 200 |iM, hubo una disminucion en la actividad de a-GAL cuando se compara con su nivel mas elevado cuando las celulas se hicieron crecer en 20 |iM de DGJ. En los tres experimentos, la potenciacion optima de la actividad de la mutacion A97V se observo a 20 |iM de DGJ, con una actividad ligeramente inferior a 2 y 200 |iM. Cuando las mutaciones R112H y R301Q se ensayaron en el mismo intervalo de concentraciones, surgio un patron similar, observandose el nivel mas elevado de actividad potenciada a 20 |iM de DGJ (Figuras 2C). Los resultados mostraron que diversas mutaciones tuvieron perfiles de respuesta a la dosificacion similares pero diferentes niveles de potenciaciones. Entre los tres genotipos mutantes de a-GAL ensayados para determinar los efectos de la dosificacion, 20 |iM de DGJ dio como resultado un incremento en a- GAL hasta al menos 50% del control normal.
El efecto de rescate de a-GAL mutante de pacientes con enfermedad de Fabry con al menos 11 genotipos distintos se ha observado usando una chaperona farmacologica usando este ensayo de a-GAL a base de celulas T. Los resultados, presentados en la Tabla 1, mas abajo, mostraron que DGJ potencio la actividad de al menos cinco formas mutantes distintas de a-GAL en celulas T (T) y fibroblastos (F). Sin embargo, la chaperona farmacologica no potencio la actividad de cuatro formas mutantes distintas de a-GAL. La actividad de a-GAL de un paciente con Fabry clasico se potencio mediante DGJ a nivel intermedio. La importancia de este ensayo se basa en el hecho de que se puede usar para cribar pacientes que se pueden beneficiar de la administracion de chaperonas farmacologicas, evitando asf el gasto y la frustracion de una terapia innecesaria y de biopsias tisulares.
Tabla 1
Numero Paciente/Normal Sexo Mutacion de
muestra
Numero de Actividad (% normal) Relacion de Grupo replicas potenciacion
1 PT
V T41I (n=) 3 (- DGJ) 48 (+ DGJ) 147 3 E
2 PT
V T41I 4 61 175 2,9 E
3 PT
V M51K 2 6 29 4,6 E
4 PT
V A97V 3 14 75 5,5 E
5 PT
V R112C 1 10 36 3,8 E
6 PT
V R112C 3 8 49 6,3 E
7 PT
V R112H 2 3 51 15,9 E
8 PT
V R112H 2 8 73 9,4 E
9 PT
V R112H 3 3 60 20 E
10 PT
V A143T 4 31 69 2,2 E
11 PT
V A143T 5 49 62 1,3 E
12 PT
V S201F 1 9 82 9,6 E
13 PT
V P205T 1 37 108 2,9 E
14 PT
V N215S 2 15 79 5,2 E
15 PT
V P259R 1 9 297 32,6 E
16 PT
V P259R 3 3 138 47,4 E
17 PT
V F295C 3 1 29 32,3 E
18 PT
V L300P 5 2 72 36,1 E
19 PT
V R301Q 1 7 91 12,3 E
20 PT
V R301Q 3 22 204 9,1 E
21 PT
V R301Q 4 7 80 12,1 E
22 PT
V G328A 4 2 54 24,6 E
23 PT
V R49C 9 3 11 4,3 I
Numero
Paciente/Normal Sexo Mutacion Numero de Actividad (% normal) Relacion de
de
replicas potenciacion
muestra
(n=) (- DGJ) (+ DGJ)
24 PT V Y207S 3 4 15 3,5
25 PT V S276G 1 0 9
26 PT V S276G 3 1 12 9,8
27 PT V C94S 2 2 2 NE
28 PT V G128E 1 2 4 NE
29 PT V G128E 5 2 2 NE
30 PT V G132R 3 1 2 NE
31 PT V A143P 2 2 1 NE
32 PT V A143P 2 1 1 NE
33 PT V R220X 3 0 1 NE
34 PT V R227Q 3 4 3 NE
35 PT V W236R 3 1 2 NE
36 PT V G261D 1 0 1 NE
37 PT V G271C 1 2 3 NE
38 PT V G271C 3 1 2 NE
39 PT V N272K 1 0 0 NE
40 PT V W287C 1 1 1 NE
41 PT V W287C 1 1 2 NE
42 PT V R356W 1 1 1 NE
43 PT V R356W 4 0 0 NE
44 PT V dE358 3 2 4 NE
45 PT V L415P 1 0 3 NE
46 PT V desconocida 1 1 2 NE
47 PT V desconocida 2 0 1 NE
48 PT V 1042insG 3 1 1 NE
49 PT V 256del1 1 0 0 NE
50 PT V 30delG 6 2 2 NE
51 PT V 82insG 2 1 0 NE
52 PT V del26bp21 1 0 1 NE
53 PT V del26bp21 1 0 0 NE
54 PT V ivs4-1g/a 2 0 0 NE
55 PT V Q119X 1 2 1 NE
56 PT V R220X 3 0 1 NE
57 PT V R301X 4 0 7 NE
Todos NL
NL V o M 162 101 128 1,3
Todos NL
Varon
NL V 115 101 124 1,2
Todos NL
Mujer
NL M 47 84 117 1,4
58 NL M 8 120 161 1,3
59 NL M 3 88 100 1,1
60 NL M 1 95 120 1,3
61 NL M 9 85 104 1,2
62 NL M 8 103 150 1,5
63 NL M 3 107 165 1,5
64 NL M 15 106 145 1,4
65 NL V 8 100 97 1
66 NL V 4 80 141 1,8
67 NL V 1 172 198 1,1
Grupo
I
I
I
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
5
10
15
20
25
30
35
Numero Paciente/Normal Sexo Mutacion Numero de Actividad (% normal) Relacion de Grupo de replicas potenciacion
muestra
(n=) (- DGJ) (+ DGJ)
68 NL
V 1 271 315 1,2
69 NL
V 1 110 140 1,3
70 NL
V 1 101 145 1,4
71 NL
V 19 106 138 1,3
72 NL
V 11 90 131 1,4
73 NL
V 4 75 99 1,3
74 NL
V 10 105 126 1,2
75 NL
V 3 97 100 1
76 NL
V 2 93 108 1,2
77 NL
V 3 85 116 1,4
78 NL
V 3 89 118 1,3
79 NL
V 1 127 107 0,8
80 NL
V 42 100 117 1,2
81 NL
V 1 102 111 1,1
Abreviaturas usadas: PT: paciente; NL: individuo normal; E: potenciable; I: potenciable (intermedio); NE: no potenciable;
Se determino que la potenciacion optima de la actividad de a-GAL mutada en el ensayo in vitro se logro usando alrededor de 20 |iM de DGJ. Entre los tres genotipos mutantes de a-GAL ensayados para determinar los efectos de la dosificacion, 20 |iM de DGJ dio como resultado un incremento en a-GAL hasta al menos 50% del control normal para cada uno (Figura 3).
En la Tabla 1, el grupo potenciable incluyo pacientes cuya actividad de a-GAL fue al menos 50% de los controles normales cuando se cultiva en presencia de DGJ (por ejemplo, R112H se potencio hasta 60% de la actividad del control normal). Se incluyen en el grupo potenciable las mutaciones A97V, R301Q, R112H y L300P. Por ejemplo, la actividad de la mutacion A97V aumento de 14 a 75% del normal en presencia de DGJ, un incremento de 6 veces. De forma similar, R301Q aumento desde 7 a 80% del normal, con 12 veces, y R112H aumento de 3 a 60%, casi un cambio de 20 veces. Ademas, la actividad en la mutacion L300P aumento de 2% a 72% de normal, un incremento de 37 veces, que fue el mayor entre las mutaciones potenciables examinadas. L300P fue poco habitual por cuanto parte de la actividad sin DGJ estaba por debajo del umbral mmimo para la deteccion. Estos resultados demuestran niveles y relaciones de potenciacion dependientes de la mutacion.
Las transferencias Western mostraron que la intensidad de las bandas aumento considerablemente mediante el tratamiento con DGJ en celulas de controles normales y aquellas con la mutacion A97V y R301Q, mientras que no se observo incremento para R356W, G132R, y A143P (Figura 3). La protema parece haberse desplazado hasta un peso molecular aparente inferior, indicando maduracion de la enzima mediante paso desde el retmulo endoplasmico, a traves del aparato de Golgi, al lisosoma. Las transferencias Western muestran que la potenciacion de la actividad de a-GAL por DGJ esta correlacionada con una mayor cantidad de protema a-GAL. Todavfa no se ha observado ningun caso en el que los niveles de protema incrementados segun se miden mediante transferencias Western no diesen como resultado mayor actividad enzimatica.
Discusion
El uso de celulas T en un sistema de ensayo para potenciar enzimas mediante SPCs ofrece ventajas significativas en la velocidad de ensayo y conveniencia con respecto a otros sistemas de cultivo. Una etapa cntica a la hora de determinar que pacientes se pueden beneficiar de la terapia con SPC fue el desarrollo de un metodo rapido y fiable para cribar celulas derivadas de pacientes para la potenciacion de la actividad de a-GAL mediante DGJ. Los resultados demuestran un metodo para generar rapidamente un cultivo celular de corta vida que permite el ensayo de la potenciacion, y tambien proporcionan un sistema util para estudios posteriores sobre el mecanismo de accion o para cribar moleculas de chaperonas adicionales. Los leucocitos usados tradicionalmente para el diagnostico de estado afectado y portador no sobreviven suficientemente para permitir ensayos repetidos si fuese necesario.
Aunque se han ensayado linfoblastos B transformados con el virus de Epstein-Barr (Fan et al., Nat med 1999; 5(1), 112-1l5) y cultivos de fibroblastos primarios (Fan, mas arriba; Mayes et al., Clin Chim Acta. 1981; 112(2), 247-251), estos no son convenientes para uso a gran escala para cribar pacientes para estudios clmicos. Los cultivos de fibroblastos primarios requieren una biopsia de puncion de la piel invasiva, y generalmente tardan al menos tres a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
cuatro semanas para que crezcan suficientes celulas para el ensayo. Los linfoblastos de celulas B requieren el proceso de transfeccion y seleccion viral de Epstein Barr, que consume tiempo y trabajo, ademas de tener efectos desconocidos sobre la actividad enzimatica.
La presente invencion proporciona un metodo para establecer cultivos de celulas T a partir de sangre reciente de individuos de controles normales y pacientes con la enfermedad de Fabry. Estos cultivos se pueden hacer crecer para uso en un ensayo de potenciacion para a-GAL en 7 a 10 dfas. Estos datos tambien muestran que la eficacia de la potenciacion con DGJ fue evidente despues de alrededor de 3 dfas en el medio de crecimiento de las celulas T. Los datos generados son una medida reproducible del grado de actividad enzimatica potenciada por una SPC para un genotipo espedfico.
Este metodo se puede usar para otros ensayos de potenciacion a base de SPC de otras enfermedades geneticas, incluyendo glucoesfingolipidosis, mucopolisacaridosis, y enfermedad de almacenamiento de glucogeno (Pompe), y se puede extender como un protocolo de investigacion y clmico en un amplio intervalo de enfermedades geneticamente definidas, tales como fibrosis dstica (CFTR) y cancer (p53, PTEN), y otras.
Ejemplo 2: Metodo in vivo para evaluar los efectos de una SPC sobre la actividad de a-GAL
Este ejemplo describe resultados de un estudio de Fase II abierto de DGJ en pacientes con Fabry (n = 11) con 10 mutaciones diferentes de a-GAL, y apoya el uso del ensayo in vivo. Los pacientes se seleccionaron para el estudio de Fase II basandose en el incremento en la actividad de a-GAL en el ensayo de celulas T descrito anteriormente. Los genotipos fueron los siguientes: T41L (2 pacientes); A143T; A97V; M51K; S276G; L300P; G328A; P205T; N215S; y L415P.
A algunos pacientes (8) se les administro DGJ segun el siguiente programa de dosificacion: 25 mg b.i.d. dos semanas; 100 mg b.i.d. semanas 2-4; 250 mg b.i.d. semanas 4-6; y 25 mg b.i.d. semanas 6-12. Tres pacientes recibieron 150 mg de DGJ una vez cada dos dfas durante todo el estudio. La sangre se extrajo en un tubo Vacutainer CPT de 8 ml al final de cada penodo de dosificacion, y se trato como se describe mas abajo.
A. Preparacion de peletes de WBC humanos para ensayo
Los WBCs se prepararon sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1, con la excepcion de que no se anade FBS/DMSO al pelete antes de la congelacion.
Los datos preliminares se resumen en la siguiente tabla.
B. Preparacion de lisados de WBC humanos para ensayo
A los microtubos que contienen el pelete de WBC, se anadieron 0,6 ml de tampon de lisis (26 mM de citrato/46 mM de fosfato, pH 5,5)
Los tubos se sometieron a vortice hasta que las celulas se resuspendieron
Los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante alrededor de 15 minutos, pero se agito la suspension sometiendo a vortice cada par de minutos
Los tubos se sometieron a ultrasonidos durante 2 minutos, y despues se sometieron a vortice durante alrededor de 10 segundos
Los lisados se incubaron en hielo hasta que se congelaron, y despues se reunieron en un recipiente de polipropileno previamente congelado (en hielo)
El recipiente se sometio a vortice, y los lisados reunidos se dividieron en alfcuotas de 0,100 ml en tubos de microcentrifugadora de polipropileno de tapa de rosca de 0,5 ml etiquetados previamente congelados. Los lisados reunidos se mezclaron mientras se toman alfcuotas sometiendo a vortice entre cada 10-20 alfcuotas.
Las alfcuotas se almacenaron a -80°C hasta el uso
Ensayo de WBC humanos
Cada tubo que contiene lisado se descongelo en hielo, se sometio a ultrasonidos durante 2 minutos, y despues se sometio a vortice durante 1 minuto.
Se anadieron 50 |il de cada muestra estandar, de control, o clmica en pocillos apropiados de una placa de poliestireno negra (usense 50 |il de 0,5% de BSA en tampon de lisis de WBC para un patron)
Se anadieron 50 |il de 117 mM de GalNAc a todos los pocillos, y la placa se incubo durante 5 minutos a temperatura ambiente;
5
10
15
20
25
30
• Se anadieron 50 |il de 5 mM de sustrato 4-MU Gal a todos los pocillos, y los pocillos se mezclaron en un agitador de placas durante 30 segundos
• La placa se cubrio y se incubo durante alrededor de 1 hora a 37°C
• Se anadieron 100 |il de tampon de NaOH/glicina 0,2M, pH 10,7, a cada pocillo para detener la reaccion
• La placa se leyo usando un lector de placas fluorescente como se describe en el Ejemplo 1
Resultados
Los datos disponibles procedentes de los primeros once pacientes tratados con DGJ durante al menos 12 semanas sugieren que el tratamiento con DGJ conduce a un incremento en la actividad de la deficiencia enzimatica en la enfermedad de Fabry en 10 de los 11 pacientes (Figura 4). El paciente con el genotipo L415P no mostro un incremento tras DGJ (a las 6 semanas) (Figura 5). Con el fin de calcular el porcentaje de normal en la tabla, se derivo el nivel de a-GAL que es normal usando el promedio de los niveles de a-GAL en globulos blancos de 15 voluntarios sanos procedentes del estudio de Fase I de multiples dosis. Los 11 pacientes representaron 10 mutaciones geneticas diferentes, y tuvieron niveles de lmea base de a-GAL que oscilaron de cero a 30% del normal.
Los datos muestran un incremento promedio de 2 veces en la actividad de a-GAL, y hasta 10 veces y 15 veces en algunos pacientes segun se mide en globulos blancos. La actividad permanecio elevada desde 6-24 semanas, y se segrna contando cuando la dosis se redujo nuevamente hasta 25 mg b.i.d. (datos no mostrados).
Discusion
Basandose en estos resultados, parece posible cribar pacientes candidatos para la idoneidad para chaperona usando un ensayo in vivo o un ensayo in vitro usando celulas T como se describe en el Ejemplo 1, puesto que 10 de 11 pacientes que demostraron un incremento significativo en la actividad de a-GAL en el ensayo de celulas T demostraron un incremento tras un tratamiento de 2 semanas con DGJ. La realizacion de un cribado in vivo puede permitir una evaluacion mas exacta de la respuesta in vivo a DGJ y a otro tratamiento con chaperonas, puesto que el ensayo in vitro puede no ser completamente predictivo de una respuesta in vivo debido a interacciones sistemicas, y puede ser especialmente util determinar la dosis apropiada. Este incremento drastico en la actividad aparecio despues de 2 semanas a una dosis baja de solo 50 mg/dfa (25 mg b.i.d.) (aunque se contemplan por la presente invencion diferentes regfmenes de dosificacion).
Estos metodos se pueden usar para ensayos de potenciacion a base de chaperonas para otras enfermedades geneticas, incluyendo glicoesfingolipidosis, mucopolisacaridosis y otros trastornos de almacenamiento lisosomico, ademas de otras enfermedades basadas en la genetica, tales como fibrosis cfstica, en la que la maduracion de la protema se produce en el ER.

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una formulacion para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry, donde la formulacion es una forma de dosificacion oral que comprende un vehnculo y 1-desoxigalactonojirimicina o una de sus sales, que se caracteriza por que la 1-desoxigalactonojirimicina o una de sus sales se administra a un paciente con la enfermedad de Fabry en
    5 una cantidad de 150 mg cada dos dfas.
  2. 2. La formulacion para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry de acuerdo con la reivindicacion 1, que se caracteriza por que la 1-desoxigalactonojirimicina o una de sus sales se administra durante al menos 12 semanas.
  3. 3. La formulacion para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry de acuerdo con la reivindicacion 1 o la 10 reivindicacion 2, que se caracteriza por que la 1-desoxigalactonojirimicina comprende hidrocloruro de migalastato.
  4. 4. La formulacion para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza por que la forma de dosificacion oral comprende un comprimido, una capsula o una solucion.
  5. 5. La formulacion para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry de acuerdo con cualquiera de las 15 reivindicaciones 1 a 4, que se caracteriza por que la 1-desoxigalactonojirimicina o una de sus sales potencia la
    actividad a-galactosidasa A.
  6. 6. 1-Desoxigalactonojirimicina o una de sus sales para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry, que se caracteriza por que la 1-desoxigalactonojirimicina o una de sus sales se administra por via oral a un paciente con la enfermedad de Fabry en una cantidad de 150 mg cada dos dfas durante al menos 12 semanas.
    20 7. 1-Desoxigalactonojirimicina o una de sus sales para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry de
    acuerdo con la reivindicacion 6, que se caracteriza por que la sal de 1-desoxigalactonojirimicina comprende hidrocloruro de migalastato.
ES14168748.3T 2006-05-16 2007-05-16 Opciones de tratamiento para la enfermedad de Fabry Active ES2573498T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US80108906P 2006-05-16 2006-05-16
US801089P 2006-05-16
US85363106P 2006-10-23 2006-10-23
US853631P 2006-10-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2573498T3 true ES2573498T3 (es) 2016-06-08

Family

ID=38723987

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14168748.3T Active ES2573498T3 (es) 2006-05-16 2007-05-16 Opciones de tratamiento para la enfermedad de Fabry
ES12168451.8T Active ES2464527T7 (es) 2006-05-16 2007-05-16 Opciones de tratamiento para la enfermedad de Fabry
ES15173515T Active ES2709445T3 (es) 2006-05-16 2007-05-16 Opciones de tratamiento para la enfermedad de Fabry

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12168451.8T Active ES2464527T7 (es) 2006-05-16 2007-05-16 Opciones de tratamiento para la enfermedad de Fabry
ES15173515T Active ES2709445T3 (es) 2006-05-16 2007-05-16 Opciones de tratamiento para la enfermedad de Fabry

Country Status (18)

Country Link
US (9) US7851143B2 (es)
EP (5) EP2955520B1 (es)
JP (6) JP2009537149A (es)
AU (1) AU2007253900A1 (es)
CA (1) CA2652553C (es)
CY (3) CY1115180T1 (es)
DK (2) DK2533050T6 (es)
ES (3) ES2573498T3 (es)
HK (3) HK1129458A1 (es)
HU (2) HUE027569T2 (es)
LT (1) LTC2787345I2 (es)
LU (1) LU93312I2 (es)
MX (2) MX2008014679A (es)
NL (1) NL300843I2 (es)
PL (2) PL2787345T3 (es)
PT (1) PT2533050E (es)
SI (2) SI2787345T1 (es)
WO (1) WO2007137072A2 (es)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2652553C (en) 2006-05-16 2020-08-18 Amicus Therapeutics, Inc. Use of 1-deoxygalactonojirimycin or a salt thereof in the treatment of fabry disease
MX2009011473A (es) * 2007-04-26 2010-01-18 Amicus Therapeutics Inc Regimenes de dosificacion para el tratamiento de enfermedades por almacenamiento lisosomal que utilizan chaperonas farmacologicas.
US9999618B2 (en) 2007-04-26 2018-06-19 Amicus Therapeutics, Inc. Dosing regimens for the treatment of lysosomal storage diseases using pharmacological chaperones
ES2541933T3 (es) * 2008-02-12 2015-07-28 Amicus Therapeutics, Inc. Método para predecir la respuesta al tratamiento farmacológico con chaperona de enfermedades
AU2009223125A1 (en) * 2008-03-12 2009-09-17 Amicus Therapeutics, Inc. Assays for diagnosing and evaluating treatment options for Pompe disease
TW201142297A (en) * 2009-11-17 2011-12-01 Baylor Res Inst Urinary triaosylceramide (Gb3) as a marker of cardiac disease
EP2542687A1 (en) * 2010-03-05 2013-01-09 Baylor Research Institute Involvement of androgen/androgen receptor pathway in fabry disease
JP2014528901A (ja) * 2011-03-11 2014-10-30 アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド ファブリー病の治療用投薬レジメン
EP2707101B1 (en) 2011-05-12 2019-02-13 Proteostasis Therapeutics, Inc. Proteostasis regulators
JP6320931B2 (ja) * 2011-12-22 2018-05-09 セントジーン アイピー ゲーエムベーハー リソソーム酵素を再構成する能力を有する化合物ならびにアンブロキソールおよび／またはアンブロキソールの誘導体の組み合わせ
EP2806875B1 (en) 2012-01-25 2017-07-19 Proteostasis Therapeutics, Inc. Proteasome activity modulating compounds
WO2014127038A1 (en) * 2013-02-12 2014-08-21 Baylor Research Institute Methods and compositions related to calcium homeostasis and fabry disease
KR102128145B1 (ko) * 2013-12-23 2020-06-30 비씨엔 펩티드즈, 에스.에이. 리소좀 축적 질환 또는 당원병의 치료에서 사용하기 위한 엑소사이토시스 활성화 화합물로서의 비칼루타미드 유사체 또는 （ｓ）-비칼루타미드
US9675627B2 (en) * 2014-04-14 2017-06-13 Amicus Therapeutics, Inc. Dosing regimens for treating and/or preventing cerebral amyloidoses
CA2955297A1 (en) * 2014-07-25 2016-01-28 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Crystal structure of human four-phosphate adaptor protein 2 glycolipid transfer protein like domain
GB201508025D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Fabry disease gene therapy
US20190183869A1 (en) * 2016-07-19 2019-06-20 Amicus Therapeutics, Inc. Treatment of fabry disease in ert-naïve and ert-experienced patients
US11335461B1 (en) 2017-03-06 2022-05-17 Cerner Innovation, Inc. Predicting glycogen storage diseases (Pompe disease) and decision support
US10251873B2 (en) 2017-05-30 2019-04-09 Amicus Therapeutics, Inc. Methods of treating fabry patients having renal impairment
CN111278438A (zh) * 2017-05-30 2020-06-12 阿米库斯治疗学公司 治疗具有肾损害的法布里患者的方法
US11923048B1 (en) 2017-10-03 2024-03-05 Cerner Innovation, Inc. Determining mucopolysaccharidoses and decision support tool
KR20200128676A (ko) 2018-02-06 2020-11-16 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 임신 환자의 파브리병 치료를 위한 미갈라스타트의 용도
HRP20240025T1 (hr) * 2018-02-06 2024-03-29 Amicus Therapeutics, Inc. Liječenje bolesnika s klasičnom fabrijevom bolešću migalastatom
BR112020026580A2 (pt) 2018-06-27 2021-03-23 Proteostasis Therapeutics, Inc. (Fem) Compostos, composição farmacêutica e métodos para tratar um paciente
EP3814336A1 (en) 2018-06-27 2021-05-05 Proteostasis Therapeutics, Inc. Proteasome activity enhancing compounds
WO2020023390A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Modernatx, Inc. Mrna based enzyme replacement therapy combined with a pharmacological chaperone for the treatment of lysosomal storage disorders
AU2020327019A1 (en) 2019-08-07 2022-03-03 Amicus Therapeutics, Inc. Methods of treating Fabry disease in patients having a mutation in the GLA gene
US11191827B1 (en) 2020-12-09 2021-12-07 Tevogen Bio Inc. COVID-19 peptide specific T-cells and methods of treating and preventing COVID-19
US11623916B2 (en) 2020-12-16 2023-04-11 Amicus Therapeutics, Inc. Highly purified batches of pharmaceutical grade migalastat and methods of producing the same

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0463109A4 (en) * 1989-03-24 1992-11-19 Research Corporation Technologies, Inc. Recombinant alpha-galactosidase, a therapy for fabry disease
WO1992000277A1 (fr) * 1990-06-29 1992-01-09 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Derive de piperidine
JP2000509971A (ja) 1996-04-10 2000-08-08 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 化学的シャペローンを用いる遺伝的欠陥の修正
US6270954B1 (en) 1996-04-10 2001-08-07 The Regents Of The University Of California Correction of genetic defects using chemical chaperones
US6274597B1 (en) * 1998-06-01 2001-08-14 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Method of enhancing lysosomal α-Galactosidase A
US7842470B2 (en) 2001-10-09 2010-11-30 Oregon Health & Science University Method for pharmacoperones correction of GnRHR mutant protein misfolding
SI2332567T1 (sl) 2003-01-31 2015-08-31 The Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Kombinirana terapija za zdravljenje motenj pomanjkanja proteina
US7446098B2 (en) * 2003-02-18 2008-11-04 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Combination therapy for treating protein deficiencies
US20070066543A1 (en) * 2003-05-22 2007-03-22 The Hospital For Sick Children Treatment of tay sachs or sandhoff diseases by enhancing hexosaminidase activity
FR2861991B1 (fr) 2003-11-07 2008-01-18 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'inhibiteurs de glucosidase pour une therapie de la mucoviscidose
CN1906162B (zh) 2003-11-12 2012-05-23 阿米库斯治疗学公司 用于治疗戈谢病的羟基哌啶衍生物
KR20080025373A (ko) 2005-05-17 2008-03-20 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 1-데옥시노지리마이신 및 유도체를 이용한 폼페병의 치료방법
EP2027137B1 (en) 2005-06-08 2015-02-18 Amicus Therapeutics, Inc. Imino and amino sugar purification
JP2009509913A (ja) 2005-06-08 2009-03-12 アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド リソソーム酵素をコードする遺伝子の変異に関連するｃｎｓ障害の治療
AU2006272497B2 (en) 2005-07-27 2012-07-19 University Of Florida Research Foundation, Inc. Small compounds that correct protein misfolding and uses thereof
US7790364B2 (en) 2006-01-27 2010-09-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for high throughput screening of pharmacological chaperones
CA2652553C (en) 2006-05-16 2020-08-18 Amicus Therapeutics, Inc. Use of 1-deoxygalactonojirimycin or a salt thereof in the treatment of fabry disease
EP2081904B1 (en) 2006-09-22 2011-03-02 Krka Tovarna Zdravil, D.D., Novo Mesto Aripiprazole hemifumarate and process for its preparation
US20100113517A1 (en) 2007-03-30 2010-05-06 Amicus Therapeutics, Inc. Method for the treatment of fabry disease using pharmacological chaperones
US9999618B2 (en) 2007-04-26 2018-06-19 Amicus Therapeutics, Inc. Dosing regimens for the treatment of lysosomal storage diseases using pharmacological chaperones
MX2009011473A (es) 2007-04-26 2010-01-18 Amicus Therapeutics Inc Regimenes de dosificacion para el tratamiento de enfermedades por almacenamiento lisosomal que utilizan chaperonas farmacologicas.
ES2541933T3 (es) 2008-02-12 2015-07-28 Amicus Therapeutics, Inc. Método para predecir la respuesta al tratamiento farmacológico con chaperona de enfermedades
US8321148B2 (en) 2008-10-24 2012-11-27 Amicus Therapeutics, Inc. Multiple compartment dosing model
ES2585584T3 (es) 2009-05-26 2016-10-06 Amicus Therapeutics, Inc. Utilización de chaperonas farmacológicas para mejorar la fabricación y la purificación de ß-glucosidasa ácida
US9206457B2 (en) 2009-05-26 2015-12-08 Amicus Therapeutics, Inc. Utilization of pharmacological chaperones to improve manufacturing and purification of biologics
TW201142297A (en) 2009-11-17 2011-12-01 Baylor Res Inst Urinary triaosylceramide (Gb3) as a marker of cardiac disease
JP2014528901A (ja) 2011-03-11 2014-10-30 アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド ファブリー病の治療用投薬レジメン
US9694056B2 (en) 2012-07-17 2017-07-04 Amicus Therapeutics, Inc. α-galactosidase A and 1-deoxygalactonojirimycin co-formulation
US10155027B2 (en) 2012-07-17 2018-12-18 Amicus Therapeutics, Inc. Alpha-galactosidase A and 1-deoxygalactonojirimycin co-formulation for the treatment of fabry disease
EP3432882B1 (en) 2016-03-22 2021-09-01 Amicus Therapeutics, Inc. Methods of treating fabry disease in patients having the g9331a mutation in the gla gene
US20190183869A1 (en) 2016-07-19 2019-06-20 Amicus Therapeutics, Inc. Treatment of fabry disease in ert-naïve and ert-experienced patients
US11357834B2 (en) 2017-01-10 2022-06-14 Amicus Therapeutics, Inc. Recombinant α-galactosidase A for treatment of Fabry disease
US10251873B2 (en) 2017-05-30 2019-04-09 Amicus Therapeutics, Inc. Methods of treating fabry patients having renal impairment
EA202090242A1 (ru) 2017-07-19 2020-05-26 Амикус Терапьютикс, Инк. Лечение болезни фабри у фзт-наивных и фзт-леченных пациентов
HUE060287T2 (hu) 2017-08-28 2023-02-28 Amicus Therapeutics Inc Eljárás szívmûködés javítására és/vagy stabilizálására Fabry betegségben szenvedõ betegnél
KR20200128676A (ko) 2018-02-06 2020-11-16 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 임신 환자의 파브리병 치료를 위한 미갈라스타트의 용도
HRP20240025T1 (hr) 2018-02-06 2024-03-29 Amicus Therapeutics, Inc. Liječenje bolesnika s klasičnom fabrijevom bolešću migalastatom
BR112021003137A2 (pt) 2018-08-20 2021-05-11 Amicus Therapeutics, Inc. métodos de tratamento de doença de fabry em pacientes com uma mutação no gene gla
CN114423427A (zh) 2019-06-11 2022-04-29 阿米库斯治疗学公司 治疗具有肾损害的患者的法布里病的方法
AU2020327019A1 (en) 2019-08-07 2022-03-03 Amicus Therapeutics, Inc. Methods of treating Fabry disease in patients having a mutation in the GLA gene

Also Published As

Publication number Publication date
EP2955520B1 (en) 2018-10-31
US20080056994A1 (en) 2008-03-06
DK2787345T3 (en) 2016-05-30
EP2787345A1 (en) 2014-10-08
ES2464527T3 (es) 2014-06-03
PL2533050T6 (pl) 2016-05-31
JP2016006088A (ja) 2016-01-14
JP2023027053A (ja) 2023-03-01
MX2008014679A (es) 2009-04-14
CY2016040I1 (el) 2017-06-28
LTPA2016033I1 (lt) 2016-12-12
CA2652553A1 (en) 2007-11-29
EP2024745A4 (en) 2010-03-17
ES2464527T9 (es) 2015-07-24
JP2020196717A (ja) 2020-12-10
EP2787345B8 (en) 2016-04-13
MX351004B (es) 2017-09-26
CA2652553C (en) 2020-08-18
LU93312I2 (fr) 2017-01-26
SI2787345T1 (sl) 2016-08-31
EP2533050B1 (en) 2014-03-12
ES2464527T7 (es) 2015-09-14
JP2018138564A (ja) 2018-09-06
EP3457135A1 (en) 2019-03-20
JP6800176B2 (ja) 2020-12-16
US7851143B2 (en) 2010-12-14
EP2533050B3 (en) 2015-06-24
JP2009537149A (ja) 2009-10-29
US20120220632A1 (en) 2012-08-30
HK1178975A1 (en) 2013-09-19
EP2955520A1 (en) 2015-12-16
EP2533050A1 (en) 2012-12-12
US9000011B2 (en) 2015-04-07
SI2533050T1 (sl) 2014-07-31
US10383864B2 (en) 2019-08-20
US20180325881A1 (en) 2018-11-15
JP2013100307A (ja) 2013-05-23
PL2787345T3 (pl) 2016-08-31
HUS1600048I1 (hu) 2017-01-30
US9480682B2 (en) 2016-11-01
US9987263B2 (en) 2018-06-05
ES2709445T3 (es) 2019-04-16
CY1115180T1 (el) 2016-12-14
JP6026268B2 (ja) 2016-11-16
LTC2787345I2 (lt) 2017-10-10
HK1129458A1 (en) 2009-11-27
US20220160690A1 (en) 2022-05-26
HUE027569T2 (en) 2016-10-28
US20110104727A1 (en) 2011-05-05
WO2007137072A2 (en) 2007-11-29
AU2007253900A1 (en) 2007-11-29
US20170042868A1 (en) 2017-02-16
US20150238474A1 (en) 2015-08-27
CY2016040I2 (el) 2017-06-28
DK2533050T6 (da) 2015-09-21
WO2007137072A3 (en) 2008-10-16
NL300843I2 (es) 2016-12-21
EP2787345B1 (en) 2016-02-24
PL2533050T3 (pl) 2014-08-29
CY1117656T1 (el) 2017-05-17
US10406143B2 (en) 2019-09-10
DK2533050T3 (da) 2014-06-02
US11241422B2 (en) 2022-02-08
HK1218955A1 (zh) 2017-03-17
US20190388409A1 (en) 2019-12-26
JP7175297B2 (ja) 2022-11-18
US20180250279A1 (en) 2018-09-06
EP2024745B1 (en) 2015-07-08
PT2533050E (pt) 2014-05-26
EP2024745A2 (en) 2009-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2573498T3 (es) Opciones de tratamiento para la enfermedad de Fabry
AU2021201208A1 (en) Assays for diagnosing and evaluating treatment options for fabry disease
AU2023202736A1 (en) Assays for diagnosing and evaluating treatment options for fabry disease