ES2556731T3

ES2556731T3 - Derivados 5beta,14beta-androstano útiles para el tratamiento de enfermedades debidas a la fibrosis de órganos

Info

Publication number: ES2556731T3
Application number: ES08760508.5T
Authority: ES
Inventors: Liberato Berrino; Antonio Cascino; Marilena Cipollaro; Amalia Forte; Francesco Rossi; Giuseppe Bianchi; Patrizia Ferrari
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 2007-06-07
Filing date: 2008-06-04
Publication date: 2016-01-19
Anticipated expiration: 2028-06-04
Also published as: CA2688079C; WO2008148812A1; HK1140698A1; RS54459B1; KR20100022021A; BRPI0812775A2; CA2688079A1; AU2008258521A1; JP2010529082A; EP2160190A1; KR101530019B1; BRPI0812775B1; CN101720224B; PL2160190T3; JP5579058B2; DK2160190T3; CN101720224A; PT2160190E; MX2009012917A; AU2008258521B2

Abstract

Un compuesto de fórmula (I):**Fórmula** donde: el símbolo representa un enlace sencillo o un enlace doble; Y es oxígeno o guanidinoimino, donde en la posición 3 es un doble enlace; Y es hidroxi, OR4 ó SR4, donde en la posición 3 es un enlace sencillo y puede presentar una configuración alfa o beta; R es un grupo 3-furilo o 4-piridazinilo sustituido o no sustituido; R1 es hidrógeno; metilo; etilo o n-propilo sustituido con OH ó NR5R6; R2 es hidrógeno o junto con R3 es un enlace de un anillo de oxirano; R3 es hidrógeno o junto con R2 es un enlace de un anillo de oxirano; R4 es hidrógeno; metilo; alquilo C2-C6 ó alquenilo C3-C6 ó acilo C2-C6, estando dichos grupos alquilo, alquenilo o acilo no sustituidos o sustituidos con un grupo de amonio cuaternario o uno o más OR7, NR8R9, formilo, amidino, guanidinoimino ó NR8R9 e hidroxi; R5, R6 son de forma independiente hidrógeno; metilo; alquilo C2-C6 no sustituido o sustituido con NR10R11, ó NR10R11 e hidroxi, ó R5 y R6 tomados junto al átomo de nitrógeno forman un anillo penta- o hexa-monoheterocíclico saturado o insaturado, sustituido o no sustituido, que opcionalmente contiene otro heteroátomo seleccionado entre oxígeno o azufre o nitrógeno; R7 es hidrógeno, metilo o alquilo C2-C4, estando dicho alquilo no sustituido o sustituido con uno o más NR10R11 ó con NR10R11 e hidroxi; R8, R9 son de forma independiente hidrógeno; metilo; alquilo C2-C6 ó alquenilo C3-C6, estando dichos grupos alquilo y alquenilo no sustituidos o sustituidos con uno o más NR10R11, ó NR10R11 e hidroxi, o R8 y R9 tomados junto con el átomo de nitrógeno forman un anillo penta- o hexa-monoheterocíclico saturado o insaturado, sustituido o no sustituido, que contiene opcionalmente otro heteroátomo seleccionado entre oxígeno o azufre o nitrógeno, o R8 es hidrógeno y R9 es amidino; o NR8R9 representa propargilamino, R10, R11 son de forma independiente hidrógeno, alquilo C1-C6, o R10 y R11, tomados junto con el átomo de nitrógeno forman un anillo penta- o hexa-monoheterocíclico saturado o insaturado; para la prevención o tratamiento de una enfermedad debida a la fibrosis de un órgano seleccionado del grupo que consiste en: fibrosis de riñón; fibrosis de corazón; fibrosis de páncreas; fibrosis de pulmón; fibrosis vascular de los vasos; fibrosis de médula espinal, fibrosis de hígado; o fibrosis de órganos debido a la esclerosis sistémica.

Description

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3 beta -(2-hidroxietoxi)-17 beta -(4-piridazinil)5 beta-androstano-14 beta, 17 alfa -diol; 3 beta -(3-Aminopropoxi)-17 beta -(4-piridazinil)-5 beta-androstano-14 beta, 17 alfa -diol; 3 beta -(2-(1-Pirrolidinil)etoxi)-17 beta -(4-piridazinil)-5 beta -androstano-14 beta, 17 alfa -diol; 3 beta -(3-(1-Pirrolidinil)propoxi)-17 beta -(4-piridazinil)-5 beta -androstano-14 beta, 17 alfa -diol; 17 beta -(4-Pridazinil)-17 alfa -(3-aminopropoxi)-5 beta-androstano-3 beta, 14 beta -diol; 3 beta -(2-(1-Pirrolidinil)etoxi)-17 beta -(4-piridazinil)-17 alfa -metoxi-5 beta -androstan-14 beta -ol; 3 beta -(2-(1-Pirrolidinil)etoxi)-17 beta -(4-piridazinil)-17 alfa -(3-amino-propoxi)-5 beta -androstan-14 beta -ol; 14 beta, 17 alfa -Dihidroxi-17 beta -(4-piridazinil)-5 beta-androstan-3-ona; 3-Guanidinoimino-17 beta -(4-piridazinil)-5 beta -androstano-14 beta, 17 alfa -diol; 14 beta, 15 beta -Epoxi-17 beta -(3-furil)-5 beta -androstano-3 beta, 17 alfa -diol; 3 beta -(2-Hidroxietoxi)-14 beta, 15 beta -epoxi-17 beta -(3-furil)-5 beta -androstan-17 alfa -ol; 3 beta -(3-Aminopropoxi)-14 beta, 15 beta -epoxi-17 beta -(3-furil)-5 beta -androstan-17 alfa -ol; 3 beta -(2-(1-Pirrolidinil)etoxi)-14 beta, 15 beta -epoxi-17 beta -(3-furil)-5 beta -androstan-17 alfa -ol; 3 beta -(3-(1-Pirrolidinil)propoxi)-14 beta, 15 beta -epoxi-17 beta -(3-furil)-5 beta -androstan-17 alfa -ol; 3 beta -(2-(1-Pirrolidanil)etoxi)-17 beta -(3-furil)-17 alfa-metoxi-14 beta, 15 beta -epoxi-5 beta -androstano; 17 alfa -hidroxi-17 beta -(3-furil)-14 beta, 15 beta -epoxi-5 beta -androstan-3-ona; 3-Guanidinoimino-17 beta -(3-furil)-14 beta, 15 beta -epoxi-5 beta -androstan-17 alfa -ol; 14 beta, 15 beta -Epoxi-17 beta -(4-piridazinil)-5 beta -androstano-3 beta, 17 alfa -diol; o los derivados 3 alfa de los

derivados anteriores identificados como 3 beta derivados y también los correspondientes tioderivados 3 alfa y 3 beta

donde Y = S. El ejemplo más preferido del compuesto específico según la presente invención es 17 beta -(3-furil)-5 beta androstano-3 beta, 14 beta, 17 alfa -triol, de ahora en adelante denominado como "rostafuroxin".

Otro objetivo de la presente invención es el uso de un compuesto de fórmula (I) donde el significado de los sustituyentes se ha mencionado anteriormente para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad debida a la fibrosis de órganos seleccionada entre el grupo que consiste en: fibrosis de riñón debido a nefropatía diabética, glomerulonefritis, o nefroesclerosis; fibrosis de corazón debida a insuficiencia coronaria crónica o la edad; fibrosis de páncreas debido a las enfermedades del páncreas; fibrosis de pulmón debido a las enfermedades del pulmón; fibrosis vascular de los vasos debido a las enfermedades degenerativas vasculares como la arterioesclerosis o reestenosis después de una desobstrucción vascular seguida de una operación de puente (by-pass en inglés) coronario y angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA por sus siglas en inglés) o inserción de una derivación (shunt en inglés); fibrosis de la médula espinal; fibrosis de hígado debido a virus y hepatitis crónica alcohólica, esteatohepatitis no alcohólica (NASH por sus siglas en inglés), cirrosis y cáncer de hígado; y otras fibrosis de órganos debido a la esclerosis sistémica.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" tal como se usa en la presente memoria se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, aliviar una enfermedad o afección objetivo, o para exhibir un efecto terapéutico detectable.

La cantidad eficaz precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, la dieta, el momento y la frecuencia de la administración, la combinación de fármacos, las sensibilidades de reacción, y la tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede determinarse mediante experimentación rutinaria y está dentro del criterio del médico. En general, una dosis eficaz por día será de 0,05 mg a 20 mg, preferiblemente 0,5 mg a 15 mg, más preferiblemente 5 mg a 10 mg de un compuesto de fórmula (1), preferido es rostafuroxin.

La dosis de tratamiento puede ser un calendario de dosis única o un calendario de dosis múltiple, según el juicio del

médico. Las composiciones se pueden administrar individualmente a un paciente, o pueden administrarse en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas.

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El medicamento puede contener también un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la administración de un agente terapéutico. Dichos vehículos incluyen anticuerpos y otros polipéptidos, genes y otros agentes terapéuticos tales como liposomas, siempre que el vehículo no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición, y que puedan administrarse sin ninguna toxicidad indebida.

Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes de metabolismo lento tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas.

Se puede encontrar una extensa discusión sobre vehículos farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J. 1991).

Los vehículos farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, disolución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, en dichas composiciones pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes de pH, y otras similares. Dichos vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas sean formuladas como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones, y similares, para la ingestión por parte del paciente.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos a tratar pueden ser animales; en particular, se pueden tratar sujetos humanos.

El medicamento de esta invención puede administrarse a través de una serie de rutas que incluyen, aunque sin limitación, oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, aplicaciones transdérmicas o transcutáneas, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, medios rectales, o localmente sobre el tejido enfermo tras una operación quirúrgica. El compuesto de la invención también se puede aplicar (recubriendo) sobre la endoprótesis vascular, incluso incorporado en una matriz de liberación controlada.

Discusión de las Figuras

Los dibujos muestran el efecto de rostafuroxin (1) en la prevención de la reestenosis después de una endarterectomía en ratas MHS y MNS (tinción hematoxilina-orceína, aumento 10x); y (2) en la prevención de fibrosis de hígado en ratas (tinción Trichrome, aumento 200X).

Figura 1(A) sección transversal de carótida de MHS no dañada de una rata no tratada.

Figura 1 (B) sección transversal de carótida de MHS dañada, tomada 30 días después de la operación, de una rata tratada oralmente con Methocel 0,5%.

Figura 1 (C) sección transversal de carótida de MHS dañada, tomada 30 días después de la operación, de una rata tratada oralmente con Rostafuroxin 100 µg/kg.

Figura 2(A) sección transversal de carótida de MNS no dañada de una rata no tratada.

Figura 2 (B) sección transversal de carótida de MNS dañada, tomada 30 días después de la operación, de una rata tratada oralmente con Methocel 0,5%.

Figura 2 (C) sección transversal de carótida de MNS dañada, tomada 30 días después de la operación, de una rata tratada oralmente con Rostafuroxin 100 µg/kg.

Figura 3 muestra modelos de tinción normales del hígado de rata control (grupo Ctr.).

Figura 4 muestra que la lesión del hígado por CCl4 induce un significativo daño hepatocelular que a su vez estimula la aparición de un proceso de curación de la herida complejo, que conduce a la fibrosis hepática (grupo Ctr. LF).

Figura 5 muestra que en animales tratados con Rostafuroxin (grupo RLF), se asocia menos daño del tejido extendido a un menor grado de fibrosis de hígado.

Figura 6 muestra modelos de tinción normales del hígado en rata control (grupo Ctr.). puntuación 0.

Figura 7 muestra la aparición histológica del hígado de dos ratas tratadas con CCl4 (grupo Crt. LF) con lesiones fibróticas de grado moderado: puntuación 2.

Figura 8 muestra la aparición histológica del hígado de dos ratas tratadas con CCl4 con Rostafuroxin a 1mg/kg vía oral (grupo RLF) con lesiones fibróticas de grado medio: puntuación 1.

Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran adicionalmente la invención.

imagen6

Animal n°: Relación de carótida Dañada/No dañada

imagen7: 0,5% de Methocel Rostafuroxin 100 µg/kg

5: 0,31 0,81

6: 0,23 0,66

7: 0,22 0,54

8: - 0,36

9: - 0,25

Media: 0,379 0,680

±DE: 0,057 0,081

Prueba t de Student.: imagen8 p< 0,0094

Los resultados detallados en la Tabla 1/Figura 1 (A-C) muestran que el compuesto de la invención redujo de manera significante estadísticamente (-45%) la reestenosis arterial en ratas MHS con hipertensión arterial.

Ejemplo 2 (Ejemplo de Referencia)

Los resultados detallados en el Ejemplo 1 se confirmaron usando ratas MNS sin hipertensión arterial. El método usado fue el mismo que el descrito en el Ejemplo 1.

Los resultados obtenidos se detallan en la siguiente Tabla 2 y Figura 2(A-C)

Tabla 2

Las medidas morfométricas del área del lumen de la carótida de ratas MNS sin hipertensión arterial.

imagen9: Relación de carótida Dañada/No dañada

Animal n°: 0,5% de Methocel Rostafuroxin 100 µg/kg

1: 0,94 1,00

2: 0,80 0,95

3: 0,65 0,93

4: 0,60 0,83

5: 0,58 0,80

6: 0,56 0,76

7: 0,53 0,75

8: 0,51 0,68

9: 0.49 0,59

10: 0,47 0,36

11: 0,45 -

12: 0,38 -

13: 0,36 -

14: 0,24 -

Media: 0,540 0,765

±DE: 0,047 0,060

Prueba t de Student.: imagen10 p< 0,0084

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Los resultados detallados en la Tabla 2, que son significantes estadísticamente, confirmaron los resultados obtenidos en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3

Para ensayar la actividad del compuesto de la invención para la prevención y el tratamiento de la fibrosis de órganos, ratas MHS hipertensas espontáneas con hipertensión arterial genética (Bianchi G., Barber B. R., Torielli L., Ferrari P. The Milan hypertensive strain of rats. Genetic Model of Hypertension. 1994; 22: 457-460) se usaron. Las ratas MHS están disponibles en Prassis Research Institute, Sigma-tau, Italia.

La fibrosis de hígado se indujo mediante administración oral de CCl4 oral tal como se describe en J. Hepatol. 1999;

30: 621-631, con modificaciones menores: 0,375 ml/kg de CCl4 disuelto en aceite de oliva se administró tres veces por semana durante tres semanas mediante sonda oral a ratas empezando a partir de la 7ª semana del destete. Las ratas control recibieron solamente el vehículo (aceite de oliva). El tratamiento con Rostafuroxin empezó 7 semanas antes de la inducción de la fibrosis del hígado mediante la administración de CCl4 (pretratamiento) y se continuó durante el tratamiento con CCl4 durante tres semanas. El Rostafuroxin se administró oralmente a 1mg/kg/día, suspendido en Methocel (0,5%). Un total de veinticuatro ratas MHS de 25 días (destete) se dividieron en tres grupos de 8 ratas cada uno: el primer grupo, considerado como control negativo para la inducción de la fibrosis de hígado (Ctr.), se trató oralmente con el vehículo de Rostafuroxin (Methocel 0,5%) durante todo el período (10 semanas) y recibió el aceite de oliva como vehículo de CCl4 en la 7ª semana después del destete durante tres semanas; el segundo grupo, considerado como control positivo para la inducción de la fibrosis de hígado (Ctr. LF), se trató oralmente con el vehículo de Rostafuroxin (Methocel 0,5%) durante todo el período (10 semanas) y recibió CCl4 en la 7ª semana después del destete durante tres semanas; el tercer grupo, tratado con Rostafuroxin con fibrosis de hígado (RLF), recibió Rostafuroxin a 1 mg/kg durante todo el período (10 semanas) y recibió CCl4 en la 7ª semana después del destete durante tres semanas. Al final del tratamiento (10ª semana), las ratas se pesaron y se anestesiaron con pentobarbital para muestrear la sangre y la retirada de órganos. La sangre se dejó coagular y el suero se separó después de centrifugación y guardó para medir la albuminemia y transaminasas en suero (ALT y AST) en un Analizador Hematológico Automático Pentra 400 (ABX). Se retiraron el bazo y el hígado y se pesaron. Las muestras del lóbulo hepático medio se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se mantuvieron a -80° para su medida bioquímica posterior del contenido de 4-Hidroxiprolina en hígado, tomado como un índice de la deposición de colágeno (Biochem. J. 1961; 80 (1): 148-154). El resto del hígado se conservó en una solución de formalina tamponada al 10% para el análisis histológico.

Medida de hidroxiprolina

El contenido de hidroxiprolina en el hígado se determinó tal como se describe en Anal. Biochem.1981; 112: 70-75, con ligeras modificaciones.

El tejido hepático (0,4 g) se homogeneizó en 3 ml de HCl 6 N y se hidrolizó a 110 °C durante 24 h. Después de centrifugación a 14000 rpm durante 10 min, se neutralizaron 100 µl de líquido sobrenadante con 50 µl de NaOH 10N y 150 µl de NaHCO3 1N. Después de centrifugación a 14000 durante 5 min, se mezclaron 100 µl de líquido sobrenadante con 200 µl de tampón acetato citrato más Cloramina T pH 6,0, después de incubación durante 10 min a TA, se añadió 1,3 ml de reactivo Ehrlich y la mezcla se incubó a 60 °C durante 25 min. Después de enfriar, se midió la absorbancia a 558 nm (Jasco V-530).

Histopatología y morfometría

Para cada caso, los lóbulos medio e izquierdo del hígado se sometieron a procedimientos de cortes y fijación estándares; los portas se tiñeron con Hematoxilina y Eosina (H&E) (Laboratory Methods in Histotechnology; Armed Forces Institute of Pathology Publicado por the American Registry of Pathology Washington, D.C. 1992). También se aplicaron técnicas especiales con el fin de permitir la detección de tejido conectivo propio (tinción Trichrome de Masson -Laboratory Methods in Histotechnology; Armed Forces Institute of Pathology Publicado por the American Registry of Pathology Washington, D.C. 1992) al igual que la detección de colágeno específico y la evaluación de la fibrosis hepática (método de tinción de sirio rojo tal como se describe en The Journal of Histochemistry and Citochemistry 1985; vol 33, No. 8, pp. 737-743).

La fibrosis del hígado se puntuó cualitativamente en portas teñidos con rojo sirio como sigue:

0 = Ausencia de fibrosis del hígado, solamente patrón de tinción normal;

1 = Grado medio, correspondiente a fibrosis centrolobulillar/periportal, con expansión septal predominantemente incompleta-fibrosis intersticial focal media;

2 = Grado moderado, correspondiente a fibrosis en puente difusa, con apariencia nodular focal-fibrosis intersticial multifocal;

3 = Grado severo, correspondiente a fibrosis confluyente,

con apariencia nodular difusa-fibrosis intersticial difusa severa.

Los hallazgos histopatológicos se detectaron mediante el microscopio óptico "ECLIPSE E800M" (Nikon Instruments S.p.A.), equipado con un vídeo de color 3CCD -cámara JVC "KY F55BE", conectado a un ordenador personal.

Las imágenes relevantes se almacenaron mediante el uso de un programa informático de análisis adecuado para el 5 procesamiento y grabación de imágenes (ARKON, A&P Software, Genos -Ark).

Un análisis cuantitativo del grado de fibrosis, seguido de un análisis cualitativo histológico, se llevó a cabo por conversión de la imagen digital de las imágenes histológicas mediante un método previamente descrito (J. Gastroenterol. 2004, Oct 1; 10(19)2894-2897).

De forma resumida, después de teñir con rojo sirio, el contenido de colágeno del hígado se midió mediante un

10 método histomorfométrico. Se tomaron una serie de imágenes en toda el área de la sección (Leica DM-IRE2). Cada imagen se analizó mediante un programa informático ImageJ versión 1.39 para análisis de imagen digital. Los límites de detección se ajustaron para el color rojo y colágeno teñido. El área fibrótica con tinción positiva se seleccionó automáticamente, se perfiló y se evaluó. El contenido relativo de colágeno se calculó como porcentaje de píxeles teñidos positivos sobre el número de píxeles totales de la imagen.

15 Resultados

Los resultados obtenidos se indican en las siguientes tablas 3-6

La Tabla 3 muestra los pesos del cuerpo y órganos, expresados como un índice de masa corporal, en los tres grupos.

Tabla 3

Rata: Ctr. Methocel 0,5% Ctr. LF Methocel 0,5% RLF 1 mg/kg vía oral

N°: PC g. Bazo/pc (%) PC g. Bazo/pc (%) PC g. Bazo/pc (%)

1: 472 0,168 360 0,295 344 0,262

2: 472 0,180 395 0,269 333 0,247

3: 445 0,175 327 0,281 381 0,302

4: 460 0,183 329 0,495 345 0,348

5: 460 0,185 344 0,351 344 0,288

6: 458 0,180 353 0,403 347 0,251

7: 425 0,189 338 0,389 364 0,316

8: muerte - muerte - 366 0,261

imagen11: imagen12 imagen13 imagen14

Media: 456 0,180 349,4 0,355 353 0,284

eem: 5,8 0,0024 8,3 0,029 5,6 0,013

p: imagen15 imagen16 <0,01 Vs. Ctr. <0,01 Vs. Ctr. <0,01 Vs. Ctr. < 0,05 vs Ctr LF

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Los resultados detallados en la Tabla 3 muestran que el compuesto de la invención redujo de manera estadísticamente significativa en un 20% el peso del bazo en ratas con fibrosis del hígado inducida por CCl4. El peso del hígado y las transaminasas no se modificaron después del tratamiento del compuesto de la invención. La Tabla 4 muestra la albuminemia en plasma en los tres grupos.

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Tabla 4

Rata: Ctr. Methocel 0,5% Ctr. LF Methocel 0,5% RLF 1 mg/kg vía oral

N°: Albúmina g/dl Albúmina g/dl Albúmina g/dl

1: 3,50 2,51 2,95

2: 3,57 2,93 3,19

3: 3,46 3,28 3,07

4: 3,52 3,09 3,82

5: 3,63 2,93 4,04

6: 3,40 3,39 3,65

7: 3,62 3,02 3,36

8: muerte muerte 4,15

Media: 3,53 3,02 3,53

eem: 0,032 0,107 0,16

p: imagen17 <0,05 Vs Ctr < 0,05 vs Ctr LF

Los resultados detallados en la Tabla 4 muestran que el compuesto de la invención aumentó de manera estadísticamente significativa un 16,8% los niveles plasmáticos de albúmina en ratas con fibrosis del hígado inducida por CCl4.

La Tabla 5 muestra el contenido de hidroxiprolina en hígado en los tres grupos.

Tabla 5

Rata: Ctr. Methocel 0,5% Ctr. LF Methocel 0,5% RLF 1 mg/kg vía oral

N°: hidroxiprolina µg/g prot hidroxiprolina µg/g prot hidroxiprolina µg/g prot

1: 391,8 1353,3 799,8

2: 574,0 2254,6 2762,3

3: 538,5 1568,7 750,0

4: 427,2 1564,2 1460,7

5: 512,7 1195,4 886,5

6: 467,6 2393,4 791,6

7: 656,3 845,6 1217,4

8: muerte muerte 811,0

Media: 509,72 1596,45 1184,9

eem: 34,13 210,09 242,2

Los resultados detallados en la Tabla 5 muestran que el compuesto de la invención redujo de manera significativa 10 (25,8 %) el contenido en el hígado de hidroxiprolina, que es un índice de la deposición de colágeno, por lo tanto fibrosis, en ratas con fibrosis de hígado inducida por CCl4 .

Histopatología y morfometría

La principal patología en animales tratados con CCl4 (grupo Ctr.LF) fue representada por un significativo daño hepatocelular (degeneración en "balón" y apoptosis, cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos, modificación en la 15 grasa), reacción inflamatoria crónica, deposición de matriz extracelular y cambios regenerativos (proliferación e hiperplasia de células parenquimales y no-parenquimales).

En ratas tratadas con Rostafuroxin se mostró una extensión menor del daño tisular.

Las imágenes de los resultados obtenidos se indican en las Figuras 3-5

La Tabla 6 muestra la evaluación cualitativa de la fibrosis del hígado, en base al sistema de puntuación adoptado en portas teñidos con sirio rojo.

Tabla 6

Fibrosis hígado: del Puntuación Ctr. Methocel 0,5% Ctr. LF Methocel 0,5% RLF 1 mg/kg vía oral

imagen18: imagen19 N.º % N.º % N.º %

Ausencia: imagen20 0 7/7 100 0/7 0 0/8 0

Medio: imagen21 1 0/7 0 0/7 0 6/8 75

Moderado: imagen22 2 0/7 0 6/7 85,7 2/8 25

Severo: imagen23 3 0/7 0 1/7 14,3 0/8 0

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Los resultados detallados en la Tabla 6 y figuras 6-8 indican que todos los animales tratados con CCl4 solamente (grupo Ctr. LF) mostraron valores altos en la puntuación de la fibrosis de hígado, oscilando de grado moderado (85,7% de casos) a severo (un caso, correspondiente a 14,3%).

En cambio, el grado medio de la fibrosis del hígado se detectó solamente en CCl4 + Rostafuroxin, el compuesto de

10 la invención, animales tratados (grupo RLF), y se observó en la gran mayoría de los casos (75%). En el mismo grupo, se observó un grado moderado de fibrosis del hígado en dos animales solamente (25%, comparado con el 85,7% del grupo CCl4). Finalmente, ninguna rata tratada con CCl4 + Rostafuroxin mostró fibrosis del hígado.

La Tabla 7 muestra el análisis cuantitativo del grado de fibrosis del hígado observado mediante el análisis en los tres grupos.

15 Tabla 7

imagen24: % AREA FIBRÓTICA

Rata n°: Ctr. Methocel 0,5% Ctr. LF Methocel 0,5% RLF 1 mg/kg vía oral

1: 1,43 11,55 6,63

2: 0,57 10,40 6,89

3: 1,74 8,42 5,08

4: 0,61 17,18 11,80

5: 0,28 10,26 2,01

6: 0,52 6,97 4,64

7: 1,47 8,57 5,50

8: imagen25 imagen26 1,44

imagen27: imagen28 imagen29 imagen30

Media: 0,95 10,48 5,50

eem: 0,22 1,26 1,14

p: imagen31 <0,01 Vs Ctr < 0,05 vs Ctr LF

Los resultados detallados en la Tabla 7 muestran que el compuesto de la invención redujo de manera estadísticamente significativa un 47,5% el área fibrótica del hígado en ratas con fibrosis del hígado inducida por CCl4.

Claims

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