ES2546648T3

ES2546648T3 - Moléculas de ADN y métodos

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Publication number: ES2546648T3
Application number: ES07733307.8T
Authority: ES
Inventors: Nigel Peter Minton; John Timothy Heap
Original assignee: Morvus Technology Ltd
Current assignee: Morvus Technology Ltd
Priority date: 2006-06-21
Filing date: 2007-06-21
Publication date: 2015-09-25
Anticipated expiration: 2027-06-21
Also published as: ZA200900494B; JP2014014366A; WO2007148091A3; WO2007148091B1; US10544422B2; WO2007148091A2; JP5513884B2; US20110124109A1; US20160160222A1; CN101506367A; EP2038418A2; CA2691767C; EP2038418B1; CN101506367B; JP2009540817A; GB0612301D0; CA2691767A1; JP5732496B2

Abstract

Una molécula de ADN que comprende: un intrón de Grupo II modificado que no expresa la transcriptasa inversa codificada por el intrón, pero que contiene un gen de marcador seleccionable modificado en la orientación inversa respecto del intrón de Grupo II modificado, donde el gen de marcador seleccionable comprende una región codificadora de marcador seleccionable y un promotor ligado operativamente a dicha región, siendo dicho promotor capaz de generar la expresión del marcador seleccionable codificado por una única copia del gen de marcador seleccionable en una cantidad suficiente para que el marcador seleccionable altere el fenotipo de una célula bacteriana de la clase Clostridia, de manera tal que pueda ser distinguida de la célula bacteriana de la clase Clostridia carente del gen de marcador seleccionable; y un promotor para la transcripción del intrón de Grupo II modificado, estando dicho promotor ligado operativamente a dicho intrón de Grupo II modificado; donde el gen de marcador seleccionable modificado contiene un intrón de Grupo I situado en orientación hacia adelante respecto del intrón de Grupo II modificado, a fin de alterar la expresión del marcador seleccionable; donde la molécula de ADN permite la remoción del intrón de Grupo I del transcripto de ARN del intrón de Grupo II modificado, a fin de dejar una región codificadora del marcador seleccionable, y permite la inserción de dicho transcripto de ARN o una de sus copias de ADN en un sitio de una molécula de ADN en una célula bacteriana de la clase Clostridia; y donde el marcador seleccionable confiere resistencia a eritromicina a la célula bacteriana de la clase Clostridia.

Description

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Clostridium. Por ejemplo, la molécula de ADN puede contener la región oriT (origen de transferencia), incluso el gen traJ.

Se proveen métodos de transformación y conjugación en Clostridia en Davis, I, Carter, G, Young, M y Minton, NP (2005) "Gene Cloning in Clostridia". En: Handbook on Clostridia (Durre P, ed.) páginas 37-52, CRC Press, Boca Raton, EE.UU.

El marcador seleccionable puede ser cualquier marcador seleccionable adecuado que se pueda expresar en una célula de la clase Clostridia que contenga el marcador seleccionable, y que se pueda usar para seleccionar dicha célula. Los marcadores seleccionables adecuados incluyen las enzimas que detoxifican una toxina, tales como las enzimas convertidoras de profármacos. Los marcadores seleccionables también incluyen un gen prototrófico (para el uso en un mutante auxotrófico correspondiente). De preferencia, el marcador seleccionable es un marcador que proporciona una ventaja de crecimiento a la célula bacteriana de la clase Clostridia en la cual se expresa. Por lo tanto, normalmente, bajo determinada condición de crecimiento, la célula bacteriana que expresa el marcador seleccionable es capaz de crecer (o de crecer con mayor rapidez), comparado con una célula equivalente que no expresa el marcador seleccionable.

Los marcadores seleccionables convenientes incluyen factores de resistencia a antibióticos. En consecuencia, de manera adecuada, el gen de marcador seleccionable es un gen que confiere resistencia a antibióticos en una célula bacteriana de la clase Clostridia.

No todos los genes de genes de resistencia a antibióticos se pueden usar en todas las células de la clase Clostridia. Por ejemplo, Clostridium sp. es naturalmente resistente a kanamicina y con frecuencia es resistente a trimetoprima. En consecuencia, se prefiere que el gen de marcador seleccionable no sea un gen de resistencia a kanamicina o un gen de resistencia a trimetoprima, en particular cuando la célula bacteriana es del género Clostridium. Los genes de resistencia a antibióticos adecuados para el uso en células de Clostridia, tales como Clostridium sp., incluyen genes de resistencia a eritromicina (tales como Erm) y genes de resistencia a cloranfenicol (tales como catP). Otro gen de resistencia a antibióticos adecuado en tetM, por ejemplo tetM proveniente del transposón conjugativo Tn916 de Enterococcus faecalis (Roberts et al. (2001) Microbiol. 147: 1243-1251). Otro gen de resistencia a antibióticos adecuado de amplio uso en bacterias de la clase Clostridia, es la espectinomicinaadeniltransferasa, aad (Charpentier et al. (2004) Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085).

Los métodos y las moléculas de ADN de la invención también se pueden usar para investigar genes cuya función se desconoce. Por ejemplo, se puede adaptar la molécula de ADN de la invención para contener una secuencia de oligonucleótido singular denominada rótulo (“tag”) que es introducida al ADN de la célula de la clase Clostridia. De manera conveniente, se produce una pluralidad de moléculas de ADN de la invención, donde cada una contiene una secuencia con marca diferente. Cuando el ADN se inserta en el cromosoma bacteriano, el rótulo está presente en el ADN genómico y puede ser detectado, por ejemplo, mediante amplificación por hibridación a una sonda de oligonucleótido marcada, donde una porción tiene una secuencia complementaria a una porción del rotulo. Los rótulos, las sondas y los métodos de amplificación y de hibridación se describen en Hensel et al. (1995) Science 269: 400-403. Se puede generar una pluralidad de mutantes por el método de la invención, donde cada uno tiene el ADN insertado en un gen diferente, y puede ser identificado mediante su rótulo exclusivo. Normalmente, cada ácido nucleico redirector diferente contiene porciones directoras que lo dirigen a un gen distinto del ADN de la célula de la clase Clostridia. Se puede introducir una pluralidad de mutantes en un ambiente durante cierto periodo. Luego se pueden recuperar los mutantes del ambiente. La capacidad para detectar los rótulos individuales en el pool de mutantes recuperado da una indicación de si un mutante particular ha podido crecer o sobrevivir, además de otros mutantes. De esta manera, pueden identificarse los genes requeridos para el crecimiento o la supervivencia en el ambiente. Hensel et al. (1995; supra) usaron un enfoque similar para identificar los genes de virulencia en Salmonella.

En una modificación del método anterior, se pueden generar, reunir y usar las moléculas de ADN de la invención que tienen el mismo rótulo, pero distintas porciones directoras aleatorizadas del intrón de Grupo II para preparar mutantes bacterianos. Los intrones de Grupo II con porciones directoras aleatorizadas se describen en WO 01/29059. Muchas de las moléculas de ADN pueden ser incapaces de insertarse en cualquier parte del genoma bacteriano. Sin embargo, algunas pueden ser capaces de insertarse en una localización desconocida del genoma bacteriano regido por la secuencia de las porciones directoras. Se puede usar un pool suficientemente grande de moléculas de ADN de la invención en el método, de manera tal que se obtienen una o más colonias en las cuales se ha insertado el ADN en el cromosoma. Se selecciona un único clon. Se puede repetir el proceso para un pool de moléculas de ADN de la invención que tienen un rótulo singular diferente, a fin de obtener otro clon bacteriano mutante único con un rótulo singular. De esta manera, se genera una pluralidad de mutantes bacterianos, cada uno con un rótulo singular. La pluralidad de mutantes se puede exponer a un ambiente tal como se describió antes, a fin de identificar los mutantes particulares comprometidos para el crecimiento o la supervivencia en dicho ambiente. Luego se puede caracterizar un mutante identificado de dicha disposición para determinar el gen en el cual se ha insertado el ADN.

Más adelante se proveen más detalles sobre genes que codifican marcadores seleccionables modificados que contienen un intrón de Grupo I que altera la expresión del marcador seleccionable.

El gen de marcador seleccionable o su región codificadora se pueden asociar con regiones de ADN, por ejemplo flanqueadas por regiones de ADN que permiten la remoción del gen de marcador seleccionable o su región codificadora, después de su incorporación al cromosoma. En consecuencia, se selecciona y manipula un clon de una célula de Clostridia mutante que expresa el marcador seleccionable, a fin de permitir la remoción del gen de marcador seleccionable. Se pueden usar recombinasas para remover la región de ADN. Normalmente, las recombinasas reconocen secuencias de ADN particulares que flanquean la región removida. Se prefieren la recombinasa Cre o la recombinasa FLP. Como alternativa, se puede usar una enzima de restricción de corte extremadamente infrecuente para cortar la molécula de ADN en sitios de restricción introducidos en los flancos del gen de marcador seleccionable o su región codificadora. Una enzima de restricción preferida es I-SceI.

Una célula bacteriana mutante de la cual se ha removido el gen de marcador seleccionable retiene la inserción del intrón de Grupo II. En consecuencia, posee el mismo fenotipo debido a la inserción con el gen de marcador seleccionable o sin él. Dicha célula bacteriana mutante puede ser sometida a ulterior mutación por el método de la invención, dado que carece del gen de marcador seleccionable presente en RAM.

Aunque el intrón de Grupo II modificado en la molécula de ADN de la invención no expresa la IERT, de manera conveniente la molécula de ADN contiene en otra localización un gen capaz de expresar la IERT.

Cuando la célula de Clostridia en la cual se insertará el intrón de Grupo II utiliza un código genético distinto del intrón de Grupo II y su transcriptasa inversa de Grupo II asociada codificada por el intrón, se prefiere modificar la secuencia de la transcriptasa inversa de Grupo II codificada por el intrón, a fin de comprender codones que correspondan al código genético de la célula huésped.

Una forma de realización de particular interés de la invención es donde el intrón de Grupo II modificado comprende porciones directoras. Normalmente, las porciones directoras permiten la inserción del transcripto de ARN del intrón de Grupo II modificado en un sitio dentro de una molécula de ADN en la célula de Clostridia. Normalmente, el sitio es un sitio seleccionado y las porciones directoras del intrón de Grupo II modificado se eligen para estar dirigidas al sitio seleccionado. En una forma de realización de preferencia, el sitio seleccionado está en el ADN cromosómico de la célula de Clostridia. Normalmente, el sitio seleccionado se encuentra dentro de un gen particular o dentro de una porción de ADN que afecta la expresión de un gen particular. Normalmente, la inserción del intrón de Grupo II modificado en dicho sitio altera la expresión del gen y produce un cambio en el fenotipo.

Se pueden seleccionar los genes para la mutación con fines de ingeniería metabólica. Por ejemplo, en organismos tales como Thermoanaerobacterium saccharolyticum u otros miembros de la clase Clostridia que tienen un metabolismo similar se puede usar la eliminación de lactatodeshidrogenasa y fosfotransacetilasa para prevenir la formación de lactato y acetato, respectivamente, para elevar las concentraciones de etanol (Desai et al., (2004) Appl Microbiol Biotechnol. 65: 600-5). En clostridias solventogénicas tales como Clostridium acetobutylicum y Clostridium beijerinckii, se pueden realizar eliminaciones específicas en los genes que codifican las enzimas responsables de la producción de solvente y ácidos, como medios para maximizar la acetona y el butanol (véase Jones y Woods (1986) Microbiol. Rev. 50: 484-524). En consecuencia, se pueden generar cepas que solo producen acetona o butanol, por eliminación de las enzimas responsables de la producción de acetato (fosfotransacetilasa y/o acetatocinasa), butirato (fosfotransbutirilasa y/o butiratocinasa), butanol (butanoldeshidrogenasa A y/o butanoldeshidrogenasa B) y/o acetona (acetoacetatodescarboxilasa y/o acetoacetil-CoA-transferasa). Además, se puede ampliar la capacidad fermentativa de tales cepas por adición del gen al cromosoma, a fin de degradar nuevos sustratos (azúcares, lignocelulosa, hemicelulosa, etc.) y/o fabricar nuevos productos finales (isopropanol, 1,3-propanodiol, etc.).

Se pueden seleccionar genes para la mutación a fin de determinar el papel de sus productos codificados en la virulencia, un prerrequisito para el desarrollo de vacunas y otras contramedidas. Por ejemplo, en C. difficile aún falta establecer los papeles relativos de la toxina A y la toxina B (CdtA y CdtB) (Bongaerts y Lyerly (1994) Microbial Pathogenesis 17: 1-12) debido a una incapacidad previa para generar mutantes isogénicos. Ciertas cepas (Perelle et al. (1994) Infect Immun. 65: 1402-1407) también producen una ADP-ribosiltransferasa CDT específica de actina (CdtA y CdtB). Otros factores contribuyen sin duda a la virulencia, en particular el proceso inicial de colonización. Se ha propuesto la participación de cierto número de productos génicos (Tasteyre et al. (2001) Infect Immun 69: 7937-7940; Calabi et al. (2002) Infect Immun 70: 5770-5778; Waligora et al. (2001) Infect Immun 69: 2144-2153), incluso los involucrados en la adhesión, las proteínas de la capa S (SplA) y la motilidad (FliC y FliD). Hasta ahora no ha sido posible obtener pruebas definitivas sobre la intervención de estos factores en las enfermedades, mediante la generación de mutantes.

Se conocen las secuencias de ADN de los genomas de muchas bacterias de la clase Clostridia. Por ejemplo, se conocen las secuencias de ADN de los genomas de C. acetobutylicum (ATCC 824 (N.° de acceso a GenBank AE001437), C. difficile (N.° de acceso a GenBank AM180355), C. tetani E88 (N.° de acceso a GenBank AE015927) y C. perfringens cepa 13 (N.° de acceso a GenBank BA000016) y C. botulinum. En particular se conoce la secuencia de un genoma de C. sporogenes y es muy similar a la secuencia del genoma de C. botulinum. A partir de esta información, se identifican rápidamente los sitios de inserción, por ejemplo dentro de marcos de lectura abiertos. Se prefiere que la molécula de ADN de la invención contenga un intrón de Grupo II modificado que contiene porciones directoras dirigidas al transcripto de ARN del intrón de Grupo II modificado (o una copia de su ADN) en un gen del genoma de una de estas especies bacterianas.

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flanqueadores en el ARN precursor no ensamblado están indicadas con líneas interrumpidas. En el intrón L1.LtrB no modificado, el marco de lectura abierto que codifica la proteína LtrA está presente en el bucle no estructural indicado como dominio IV. B: Mecanismo de reconocimiento del sitio objetivo de ADN del intrón de Grupo II L1.LtrB. La proteína LtrA se fija al ARN del intrón de Grupo II L1.LtrB para formar un complejo de ribonucleoproteína. El intrón se extrae por ensamblado del pre-mARN y libera la ribonucleoproteína como una partícula. La particula de ribonucleoproteína sitúa secuencias de ADN objetivo dentro de la célula. La secuencia de AND objetivo de la ribonucleoproteína no modificada es una copia sin intrón del gen ltrB, cuya secuencia se presenta (SEQ ID N.° 9). El ARN del intrón se inserta dentro del sitio de inserción en la cadena superior (IS). Luego se escinde la cadena inferior en el sitio de escisión (CS) y LtrA se ceba en el ADN cortado y transcribe en reversa el ARN del intrón. Las actividades de reparación del huésped completan el proceso de integración. El reconocimiento del objetivo es mediado por una combinación de interacciones entre LtrA y nucleótidos de la secuencia objetivo, y entre EBS2 y EBS1 en el ARN del intrón y las secuencias complementarias IBS2 e IBS1 en la secuencia objetivo. Los nucleótidos más importantes reconocidos por la proteína LtrA se indican con sombreado gris.

Figura 2. Selección positiva de mutantes redirectores derivados de ácidos nucleicos. A. La transcripción del gen de marcador seleccionable proveniente del ácido nucleico redirector situado en un plásmido no da por resultado una resistencia, dado que el mARN producido retiene la inserción del intrón de Grupo I td y por lo tanto se altera la expresión del gen de marcador seleccionable. El elemento td no se extrae por empalme del mARN, dado que ha sido transcript en la orientación equivocada. B. La producción de ARN del intrón de Grupo II L1.LtrA es inducida por la adición de IPTG, que causa la transcripción del promotor fac de Clostridia. El intrón de Grupo I td dentro del gen de marcador seleccionable se transcribe en la orientación correcta y el ARN td se extrae por empalme del ARN producido. C. El ARN L1.LtrA y el gen de marcador seleccionable se insertan en el sitio objetivo del cromosoma. El gen de marcador seleccionable no contiene el intrón de Grupo I td y en consecuencia no se altera la expresión del gen de marcador seleccionable. En consecuencia, las células exhiben el fenotipo asociado con la expresión del marcador seleccionable, y puede ser seleccionado en consecuencia.

Figura 3. Expresión inducible de pMTL5401Fcat en C. sporogenes y C. acetobutylicum. (a) El plásmido de lanzadera de E. coli/Clostridium pMTL5401Fcat. (b) Se cultivó un clon de C. sporogenes o (c) C. acetobutylicum que contiene pMTL5401Fcat hasta la fase de crecimiento exponencial temprana y la actividad de CAT en lisados celulares monitoreados después de la inducción con IPTG 1 mM (■) o sin inducción (▲).

Figura 4. Secuencias adecuadas para un gen de marcador seleccionable por empalme exitoso del intrón de Grupo I td. Las secuencias de aminoácidos requeridas (SEQ ID N.° 6-8, en cualquiera de los tres marcos de lectura de traducción se muestran por encima de las secuencias de nucleótidos (SEQ ID N.° 132-134). Los aminoácidos en la posición ’X’, podrían ser G, E, A, V, L, S, W, P, Q, R, M, T o K. En la posición ’Z’, podrían ser K, S, R, I, M, T o N.

Figura 5. Funcionalidad de RAM agregada al gen ermB mediante el uso de un ligador. (a) Se inserta un ligador que contiene el intrón td y sus exones entre el ORF ermB y su promotor (SEQ ID N.° 10), que impide la expresión de resistencia a eritromicina. La extracción por empalme del intrón td de la cadena inversa produce un gen ermB modificado (SEQ ID N.° 11) que codifica una proteína funcional con 12 aminoácidos adicionales en su terminal N (SEQ ID N.° 12). El promotor ermB de ErmBtdRAM1 es reemplazado por el promotor thl en ErmBtdRAM2. (b) PCR utilizando diversas moldes y cebadores ErmB-Pro-F3 y ErmB-R1, que flanquean el intrón td en ErmBtdRAM1. Carril 1: ADN de ErmBtdRAM1; Carril 2: ADN de ErmBtdRAM1 SE; Carril 3: cDNA sintetizado de ARN aislado de células que contienen pMTL20lacZTTErmBtdRAM1 después de la inducción de IPTG; Carril 4: la misma preparación de ARN antes de la síntesis de cADN. (c) PCR utilizando diversas moldes y cebadores Thio-F1 y ErmB-R1, que flanquean el intrón td en ErmBtdRAM2. Carril 1: ADN genómico mutante spo0A de C. sporogenes; Carril 2: AND de plásmido pMTL007::Cspspo0A-249s; Carril 3: ADN genómico de C. sporogenes de tipo silvestre; Carril 4: agua.

Figura 6. Características y secuencia de ErmBtdRAM1 Secuencia ErmBtdRAM1 (SEQ ID N.° 13)

Figura 7. Evidencia directa del empalme de ErmBtd RAM1 en E. coli. Para analizar si el intrón de Grupo II td había sido empalmado de ErmBtdRAM1 tras la inducción de la expresión del ARN del intrón de Grupo II, se preparó ARN a partir de células que expresan pMTL20lacZTTErmBtdRAM1. Se realizó RT-PCR usando cebadores que flanquean el sitio de inserción de Itd. En reacciones de control, se usaron los mismos cebadores para amplificar ErmBtdRAM1 y los equivalentes ensamblados SE ADN por PCR. Carril 1: marcadores de ADN; Carril 2, PCR de ErmBtd RAM1; Carril 3, PCR de ErmBtd RAM1 SE; Carril 4, RT-PCR sobre el ARN total proveniente de células que contienen pMTL201acZTTErmBtdRAM1, y; Carril 5 control negativo de RT-PCR.

Figura 8. Construcción de un sitio de multiclonación en pBRR3

Secuencias de los sitios de clonación de pBRR3-LtrB (SEQ ID N.° 14) y plásmidos pCR2.1-TOPO (SEQ ID N.° 15). El fragmento de sitio de multiclonación presentado (SEQ ID N.° 16) se insertó dentro de un pBRR3-LtrB escindido para preparar el pBRR3-MCS1 mostrado (SEQ ID N.° 17), que contiene los sitios de restricción hallados en el plásmido pCR2.1-TOPO.

Figura 9. Secuencias de los promotores thl y thl2

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codificadas por el sitio de empalme. El análisis de las secuencias de proteína de todas las proteínas conocidas por conferir resistencia en Clostridia no pudieron identificar una proteína candidata que contiene cualquiera de las secuencias de aminoácidos de interés.

5 En consecuencia, se obtuvo por ingeniería un gen que codifica un marcador seleccionable, de manera tal que contenía un sitio de inserción para el intrón de grupo I td. Esto se hizo para formar la base de un RAM de Clostridia. Se eligió el gen nativo ermB del plásmido pAMβ1 de Enterococcus faecalis, que confiere resistencia a eritromicina, como el gen de marcador seleccionable, dado que este gen ha tenido amplio uso en la construcción de vectores de lanzadera de E. coli/Clostridium (Dürre, P. Handbook on Clostridia. 2005. Taylor y Francis, CRC Press.)

10 Se diseñó una secuencia ligadora que contenía el sitio de empalme requerido, y se fusionó con el extremo 5’ de la región codificadora del gen ermB, lo que prolongó efectivamente el terminal N de la proteína en 12 aminoácidos (Figura 5). En el diseño de esta secuencia, se eligió el marco de lectura que tenía aminoácidos codificados tan inertes como fuera posible y solubles, a fin de minimizar el riesgo de afectar la función de la proteína ErmB. El marco 1 (DPRD; SEQ

15 ID N.° 6) fue la mejor opción, dado que incluye tres residuos cargados (Asp -ve, Arg +ve) que debería favorecer la solubilidad. Se esperaba que la mezcla de cargas podría contribuir a prevenir una fuerte interacción con el resto de la proteína. El resto del ligador se componía de los pequeños residuos inertes Gly y Ala, con un único Ser para evitar una larga porción de residuos hidrofóbicos que podrían reducir la solubilidad de la proteína. Además, la secuencia de nucleótidos elegida incorpora el uso de codón de Clostridia, a fin de minimizar cualquier posible problema de expresión.

20 Se ensamblaron dos constructos mediante el uso de SOEing PCR tal como se describe más adelante, mediante el uso de los cebadores de oligonucleótido indicados en la Tabla 1 siguiente. El ErmBtd RAM1 (el gen ermB modificado que contiene el intrón td insertado en el sitio indicado en la Fig. 6 (SEQ ID N.° 13), y el equivalente empalmado (SE), donde el intrón td está ausente. Se clonaron ErmBtdRAM1 y ErmBtdRAM1 SE en el plásmido de alto nivel de copias

25 pMTL5402F en la orientación opuesta al promotor fac (por lo que cualquier resistencia conferida se debe al promotor RAM o al propio promotor de SE).

Tabla 1: Cebadores de oligonucleótidos

Cebador: Secuencia (5’ -3’) SEQ ID N.°

ErmB-Pro-F3: 24

ErmB-Pro-RA: 25

linker1-ErmB-F1: 26

ErmB-R1: 27

ErmB-Pro-RB: 28

tdGpI-F1: 29

tdCrpI-R1: 30

Thio-F1: imagen11 31

Thio-R-RAM: 32

30 Se preparó ErmBtdRAM1 SE como sigue. El promotor ermB se amplificó por PCR a partir de pMTL5402F mediante el uso de los cebadores ErmB-Pro-F3 y ErmB-Pro-RA. Se amplificó ORF ermB por PCR a partir de pMTL5402F mediante el uso de los cebadores linker1-ErmB- F1 y ErmB-R1. Los productos de PCR fueron purificados mediante gel y usados como moldes en un SOEing PCR mediante el uso de los cebadores externos ErmB-Pro-F3 y ErmB-R1. El producto de PCR que codifica ErmBtdRAM1 SE se clonó en pCR2.1-TOPO. Se removió ErmBtdRAM1 SE de

35 pCR2.1::ErmBtdRAM1SE como un fragmento HindIII/XhoI y se ligó en pMTL5402F linearizado con las mismas enzimas. Esto colocó ErmBtdRAM1 SE en la orientación opuesta al promotor fac sobre el plásmido resultante pMTL5402F::ErmBtdRAM1SE.

Se preparó el constructo ErmBtdRAM1 como sigue. Se amplificó el promotor ermB por PCR a partir de pMTL5402F 40 mediante el uso de los cebadores ErmB-Pro-F3 y ErmB-Pro-RB. Se amplificó el ORF ermB por PCR a partir de pMTL5402F mediante el uso de los cebadores linker1-ErmB-F1 y ErmB-R1. Se amplificaron por PCR el intrón de Grupo I td atenuado y sus exones a partir de pACD4K-C, mediante el uso de los cebadores tdGpI-F1 y tdGpI-Rl. Los productos de PCR fueron purificados por gel y usados como moldes en un SOEing PCR de tres vías que utiliza los cebadores externos ErmB-Pro-F3 y ErmB-R1. El producto de PCR que codifica ErmBtdRAM1 fue incorporado por clonación en pCR2.1-TOPO. Se removió ErmBtdRAM1 de pCR2.1::ErmBtdRAM1 como un fragmento HindIII/XhoI y se ligó en pMTL5402F linearizado con las mismas enzimas.

E. coli portador de pMTL5402F::ErmBtdRAM1 era sensible a eritromicina de 500 y 125 mg/ml (sin crecimiento durante la noche a 37°C). E. coli portador de pMTL5402F::ErmBtdRAM1SE era resistente a eritromicina de 500 y 125 mg/ml (creció durante la noche a 37°C). Estos experimentos demostraron que el gen ermB modificado confirió resistencia a eritromicina en E. coli, e igualmente importante, que la inserción de td inactiva el gen.

Ejemplo 3: Validación del marcador seleccionable ErmBtd en E. coli

El componente de ácido nucleico redirector de pACD4K-C fue subclonado como un fragmento NaeI (recortado) en pMTL20 (Chambers et al. (1988) Gene 68: 139-149) entre los sitios HindIII y SmaI, y la región redirectora lacZ nuevamente mostró capacidad para knock-out el gen lacZ en el huésped E. coli HMS174(DE3). A continuación, se reemplazó KanRAM en pMTL20lacZTT por ErmBtd RAM1 como fragmento MluI. Para analizar si el intrón de Grupo I td era empalmado de ErmBtd RAM1 después de inducir la expresión del ARN del intrón de Grupo II, se recolectaron las células de E. coli portadoras de pMTL20lacZTTErmBtdRAM1 y se preparó el ARN. Luego se realizaron reacciones RT-PCR mediante el uso de cebadores que flanquean el sitio de inserción de td. Como control, se realizó PCR estándar en ErmBtd RAM1 y ErmBtd RAM1 SE (el equivalente empalmado de ErmBtd RAM1). Tal como se observa en la Figura 7, el producto predominante obtenido de las muestras de ARN inducidas por IPTG era del menor tamaño correspondiente al gen SE. Esto demuestra con claridad que td se empalma a partir del ARN del gen de ermB modificado en ErmBtd RAM1.

A pesar del hecho de que se demostró que ocurría empalme de ErmBtd RAM1, no se obtuvieron colonias resistentes a eritromicina después de sembrar las células inducidas por IPTG en medio de agar suplementado con 500, 250 o 125 mg/mL de eritromicina. No fue posible reducir aún más la concentración de antibiótico, dado que E. coli es naturalmente resistente a concentraciones inferiores del antibiótico.

La imposibilidad de obtener colonias resistentes a eritromicina puede haberse debido a un efecto de cantidad de copias. En consecuencia, una única copia insertada en el genoma puede haber sido insuficiente para generar resistencia al antibiótico por encima del bajo nivel habitual de resistencia inherente a E. coli de tipo silvestre. Para analizar esta posibilidad, se ligó un fragmento de AND portador de ErmBtdRAM1 SE al pACYC184 escindido, y la mezcla de ligadura fue transformada en E. coli y se sembró en 2YT que contiene tetraciclina o eritromicina en tres concentraciones diferentes, 500, 250 y 125 mg/mL. Crecieron cantidades de colonias similares en Erm125 y Tet, pero crecieron varias veces menos en Erm250, y solo unas pocas crecieron en Erm500. Este experimento de control fijó los límites prácticos para el análisis de la herencia de ErmBtdRAM1 SE cuando está presente en pACYC184 como 125 mg/mL.

Una vez establecida la concentración de eritromicina necesaria para analizar ErmBtdRAM1 SE en E. coli, se amplificó por PCR una región de lacZ que abarca la región directora con los cebadores lacZ dirigido a F (ACGAATTCCGGATAATGCGAACAGC-GCACGG; SEQ ID N.° 33) y lacZ dirigido a R (TGCGATCGCACCGCCGA-CGGCACGCTGATTG; SEQ ID N.° 34), clonado en pCR2.1TOPO, y luego se subclonó en pACYC184, que está presente en varias copias de la célula de E. coli. Luego se repitió el experimento de redireccionamiento mediante la introducción de pMTL20lacZTTErmBtdRAM1 en células de E. coli portadoras de pACYC184::lacZ. Después de la inducción con IPTG, se sembraron las células en medio que contenía eritromicina. En contraste con el experimento previo, se obtuvieron cantidades apreciables de colonias resistentes. El uso de cebadores apropiados en un PCR diagnóstico confirmó que había tenido lugar el redireccionamiento del intrón de Grupo II hacia el gen lacZ en pACYC184. Por lo tanto, cuando ErmBtdRAM1 SE está presente como única copia, la expresión de ErmB es insuficiente para conferir resistencia a eritromicina, pero cuando está presente en múltiples copias, se expresa ErmB en cantidad suficiente para conferir el fenotipo resistente.

Ejemplo 4: Construcción de un sistema de redireccionamiento a Clostridia mediante el uso del marcador seleccionable ErmBtd

Una vez establecido que ErmBtdRAM1 podría sustituir el KanRAM en el intrón de Grupo II de Sigma-Aldrich, se subclonó todo el elemento, junto con la región redirigida para lacZ, a partir de pMTL20lacZTTErmBtdRAM1 (como fragmentos HindIII/SacI y SacI/NheI) en el vector de expresión de Clostridia pMTL5402F (escindido con HindIII-NheI) para obtener pMTL5402FlacZTTErmBtdRAM1. En consecuencia, la expresión del intrón de Grupo II estaba bajo el control del promotor fac. La expresión del intrón de Grupo II será regulada por IPTG.

Se estudió la capacidad de este vector para redirigir el gen lacZ en pACYC184::lacZ en E. coli. Después de la inducción por IPTG y el sembrado sobre eritromicina, se demostró el éxito del redireccionamiento.

Ejemplo 5: Determinación de la eficacia de ErmBtdRAM1 en redireccionamiento de intrón de Grupo II

imagen12

aObjetivo indicado como microrganismo, ORF y punto de inserción. Se seleccionaron los sitios de inserción de objetivo de manera tal que los intrones fueran insertados después de la cantidad de bases indicadas a partir del inicio del ORF, ya fuera la orientación con sentido (s) o antisentido (a).

Tabla 4: Cebadores de oligonucleótidos usados para generar productos de PCR para el redireccionamiento

Cebador: Secuencia 5’-3’ de cebador SEQ ID N.°

EBS Universal: CGAAATTAGAAACTTGCGTTCAGTAAAC 43

Csp-codY-417s-IBS: imagen13 44

Csp-codY-417s-EBS1d: 45

Csp-codY-417s-EBS2: 46

Cdi-pyrF-97a-IBS: 47

Cdi-pyrF-97a-EBS1d: 48

Cdi-pyrF-97a-EBS2: imagen14 49

Cdi-spo0A-178a-IBS: 50

Cdi-spo0A-178a-EBS1d: 51

Cdi-spo0A-178a-EBS2: imagen15 52

Csp-spo0A-249s-IBS: 53

Csp-spo0A-249s-EBS1d: 54

Csp-spo0A-249s-EBS2: 55

Csp-pyrF-595s-IBS: 56

Csp-pyrF-595s-EBS1d: 57

Csp-pyrF-595s-EBS2: imagen16 58

Cac-pyrF-345s-IBS: 59

Cac-pyrF-345s-EBSld: 60

Cac-pyrF-345s-EBS2: imagen17 61

Cac-spo0A-242a-IBS: 62

Cac-spo0A-242a-EBS1d: 63

Cac-spo0A-242a-EBS2: 64

Csp-SONO-492s-IBS: 65

Csp-SONO-492s-EBS1d: 66

Csp-SONO-492s-EBS2: imagen18 67

Para asegurar que los intrones de Grupo II modificados eran capaces de redirigir hacia los genes de Clostridia seleccionados, primero se realizaron experimentos en E. coli usando sistemas de plásmidos conocidos por su efectiva función. El sistema utilizado es un sistema de dos plásmidos desarrollado por Karberg et al. (2001) tal como se describe 5 en el Ejemplo 5. Usando este sistema, se coloca el intrón de Grupo II obtenido por ingeniería en un plásmido (pACD2) y su objetivo (en este caso, el gen de Clostridia clonado) en un segundo plásmido (pBRR3). El redireccionamiento del intrón de Grupo II proveniente de pACD2 hacia pBRR3 da por resultado la activación del gen Tet en el último plásmido. En consecuencia, se pueden detectar eventos de redireccionamiento sobre la base de la adquisición de resistencia a tetraciclinas. Una porción de las bacterias se siembra sobre placas de agar no selectivo para dar una indicación del total

10 de bacterias viables, y una porción se siembra sobre placas de agar que contiene tetraciclinas (placas Tet). La eficacia de la redirección se estima sobre la base de la proporción del total de bacterias viables que son resistentes a tetraciclinas.

Para facilitar la subclonación de los genes objetivo provenientes de los plásmidos pCR2.1/pCRII TOPO en pBRR3, se

15 introdujo un sitio de clonación múltiple en pBRR3-LtrB para obtener pBRR3-MCS1. Esto se efectuó por inserción de un fragmento de sitio de multiclonación entre los sitios AatII y EcoRI de pBRR3-LtrB, que contiene sitios de restricción hallados en el plásmido pCR2.1-TOPO. Las secuencias de los sitios de clonación se muestran en la Figura 8. Se preparó el fragmento de sitio de multiclonación mostrado en la Figura 8 a partir del oligonucleótido de MCS1a CTCGAGGTACCATGCATAGGCCTGAGCTCA-CTAGTGCGGCCGCG (SEQ ID N.° 68) y el oligonucleótido de MCSlb

20 AATTC-GCGGCCGCACTAGTGAGCTCAGGCCTATGCATGGTACCTCGAGACGT (SEQ ID N.° 69).

Se evaluaron cuatro ácido nucleicos redirigidos (cada uno pretendido para la inserción en uno de los genes de C. sporogenes pyrF, spo0A, codY y SONO) mediante el uso del ensayo de movilidad de intrón de dos plásmidos. Los cuatro permitieron un redireccionamiento mucho más eficaz que el previsto. En consecuencia, las diluciones elegidas 25 para la siembra en placas Tet no era el ideal y solo estaba justo en el rango del recuento de colonias, y en consecuencia las efectividades dadas pueden ser menos exactas que si se hubieran sembrado menos bacterias. Se evaluaron los siguientes cuatro ácido nucleicos redirigidos (cada uno pretendido para la inserción en uno de los genes de C. difficile pyrF y spo0A o los genes de C. aceotbutylicum pyrF y spo0A) para el redireccionamiento. Se estimaron los eventos de redirección mediante la siembra de las bacteria en placas Tet. En este experimento inicial, SONO no produjo colonias

30 EmR. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5: Resultados del ensayo de movilidad del intrón

Plásmido donante: Plásmido receptor Eficacia de movilidad del intrón*

pACD2::Cs-spoOA-249s TR: Fragmento pBRR3::Cs-spo0A AS2 ~15 %

pACD2::Cs-codY-417s TR: Fragmento pBRR3::Cs-codY AS2 ~20 %

pACD2::Cd-pyrF-97a TR: Objetivo pBRR3::Cd-pyrF-97 ~100 %

pACD2::Cd-spo0A-178a TR: Objetivo pBRR3::Cd-spo0A-178 ~20 %

pACD2::Cs-pyrF-595s TR: pBRR3::Cs-pyrF ~2 %

pACD2::Ca-pyrF-345s TR: pBRR3::Ca-pyrF ~0.2 %

pACD2::Ca-spo0A-242a TR: pBRR3::Cs-spo0A ~20 %

pACD2::Cs-SONO-492s TR: pBRR3::Cs-SONO" ND

*Eficacia e movilidad del intrón = colonias TetR/colonias AmpR CmR, Cs -C. sporogenes, Ca -C. acetobutylicum, Cd -C. difficile. Los números se refieren al sitio de inserción del intrón respecto del inicio del gen, en orientación con sentido (s) o antisentido (a). TR= ácido nucleico redirigido

Ejemplo 7: Evaluación de ácido nucleicos redirigidos en clostridias

35 Se subclonaron los primeros cuatro ácido nucleicos redirigidos nuevos (cada uno pretendido para la inserción en uno de los genes de C. sporogenes pyrF, spo0A, codY y SONO) en el vector prototipo pMTL5402FTTErmBtdRAM1 y los plásmidos resultantes se introdujeron el donante de E. coli CA434, y luego se usaron en experimentos de conjugación con C. sporogenes o C. difficile como receptor. En el caso de este último, no se obtuvieron transconjugantes. Se

40 obtuvieron transconjugantes con ambos plásmidos en el caso de C. sporogenes. Se inocularon transconjugantes únicos en 1,5 mL de un medio de crecimiento apropiado suplementados con 250 mg/mL de cicloserina y 7,5 mg/mL de tianfenicol (el último de los cuales asegura el mantenimiento del plásmido) y se permitió que el cultivo creciera hasta la fase estacionaria por incubación anaerobia a 37°C durante la noche. Se usaron 150 mL de este cultivo para inocular 1,5 mL de caldo nuevo del mismo tipo que contiene los mismos suplementos, y luego se incubó en anaerobiosis a 37°C. En

45 cuanto fue visible el crecimiento en el cultivo, normalmente después de 1 h, se indujo el cultivo con IPTG 1 mM y se incubó durante 1 h.

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Tabla 7: Resultados del ensayo de movilidad del intrón

Plásmido donante: Resultados

Eficacia de movilidad del intrón*: Eficacia de ensamblado de RAM†

Mostrados previamente:

pACD2: ~100 n/d

pACD2KanRAM: ~10-3 18/20

pACD2ErmBtdRAM1: ~10-3 18/20

Este experimento:

pACD2ErmBtdRAM2: ~5 x 10-3 9/10

pACD2ErmBtdRAM3: ~7 x 10-2 9/10

*Eficacia y movilidad del intrón = colonias TetR/colonias AmpR CmR †Eficacia de ensamblado de RAM = colonias TetR resembradas para KanR o ErmR/todas las colonias TetR

El empalme de RAM2 y RAM3 fue eficaz (90 %) y equivalente al RAM original (RAM1).

5 Ejemplo 11: Evaluación de ErmBtdRAM2 y 3 en sistema pMTL20lacZTT en E. coli

Como antes, no se pudo usar ningún RAM para detectar el redireccionamiento del intrón de Grupo II en lacZ en el cromosoma HMS174(DE3) de E. coli mediante el uso de Ery500 o Ery125. A diferencia de RAM3, RAM2 dio numerosas colonias EryR, pero se demostró por PCR que no contenían un intrón de Grupo II redirigido al gen lacZ. Se supone que

10 estas colonias surgieron debido a la débil resistencia conferida por el plásmido.

Ejemplo 12:

La Figura 11 ilustra los componentes esenciales del vector pMTL007, también denominado

15 pMTL5402FlacZTTErmBtdRAM2. Este intrón de Grupo II está modificado para redirigir el gen lacZ. Puede ser modificado para redirigir un gen de una célula bacteriana de la clase Clostridia.

Los elementos esenciales del plásmido son:

20 Un promotor de Clostridia para generar la expresión del elemento de ácido nucleico redirector, que en el ejemplo ilustrado es el promotor fac inducible. De manera similar, se pueden emplear otros promotores que se han tornado inducibles mediante la provisión de un operador lac, p.ej., fac2. Para mediar la inducción, el plásmido también porta el gen lacI de E. coli bajo el control de un promotor de Clostridia, en este caso el promotor del gen ptb (que codifica fosfotransbutirilasa) de Clostridium acetobutylicum. Se puede usar un promotor constitutivo en lugar de un promotor

25 inducible. El plásmido también contiene el replicón ColE1 del plásmido pMTL20E, a fin de permitir el mantenimiento del plásmido en E. coli y la región de replicación del plásmido pCB102de Clostridium butyricum, a fin de permitir el mantenimiento en especies de Clostridium. También se provee el mantenimiento del plásmido mediante la inclusión del gen catP para permitir la selección del plásmido en E. coli (por suplementación del medio con cloranfenicol) y Clostridia (por suplementación del medio con tianfenicol). A fin de proporcionar la facilidad de conjugar el plásmido en los

30 receptores de Clostridia además de la transformación, el vector también contiene la región oriT del plásmido RP4.

Todos estos elementos son intercambiables con otros factores equivalentes provenientes de otras fuentes. En consecuencia, se puede intercambiar ColE1 con otros replicones capaces de replicarse en E. coli, tales como p15a, pVW01 u orígenes de fagos tales como M13. El gen catP puede ser sustituido por otros genes de resistencia a 35 antibióticos adecuados, tales tetM o aad. De modo similar, se puede emplear cualquier replicón capaz de replicarse en el huésped bacteriano objetivo de Clostridia o grampositivo, tal como pIM13, pIP404, pAMβ1, pCD6, pC194, pE194, pT181, pCB101, pBP1. También se pueden emplear los replicones defectuosos para la replicación, incluso replicones que pueden ser condicionales para la replicación, p.ej., sensibles a temperatura o dependientes de un factor exógeno para la replicación. También se pueden emplear plásmidos que carecen de cualquier disposición para la replicación en

40 un plásmido grampositivo, es decir, un vector suicida que solo contiene un replicón ColE1.

Se pueden emplear otras combinaciones de genes operadores y represores. Otro candidato es un promotor identificado en el transposón conjugativo Tn5397 regulado por tetraciclina (Tet) (Roberts, tesis de doctorado, UCL). Como alternativa, recientemente se demostró un promotor inducible por xilosa derivado de S. xylosus que funciona en C. 45 acetobutylicum (Girbal et al. (2003) Appl Environ Microbiol. 69: 4985-8). Otro candidato es un promotor regulado por tet, desarrollado en B. subtilis (Geissendorfer e Hillen (1990) Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 657-63). Se construyó por agregado de una secuencia de operador tet (tetO) entre -35 y -10 de un promotor xyl fuerte (Geissendorfer e Hillen, 1990, supra). En presencia de un gen tetR (que codifica el represor), el promotor derivado es inducible 100 veces por concentraciones subletales de Tet. Las concentraciones basales de expresión obtenidas podrían ser abolidas

50 completamente por la adición de un segundo operador tet, si bien esta adición causó una reducción general de los niveles de expresión. Con posterioridad, este promotor ha tenido amplia aplicación en S. aureus (Bateman et al. (2001) Infect Immun. 69: 7851-7; Ji et al. (2001) Science 293: 2266-2269), donde solo fue necesario un único operador.

Un promotor regulado por tet es una alternativa ideal para nuestros sistemas fac/lacI desarrollados. En consecuencia, podremos expresar tetR usando el mismo promotor usado para expresar lacI (el promotor ptb de C. acetobutylicum). En

B. subtilis, el grado de inducción fue dependiente de la dosis para el rango estudiado. Sin embargo, dado que B. subtilis fue sensible al antibiótico, no se pudieron agregar concentraciones elevadas de Tet. No se aplicará una restricción

5 similar a clostridias tales como C. difficile, que son resistentes a este antibiótico. A fin de analizar la factibilidad del sistema, resintetizaremos fac y reemplazaremos la región entre -35 y -10 por tetO. Si se observaran concentraciones basales elevadas en ausencia de Tet, se puede agregar un segundo operador. También se puede usar la adición de otras secuencias sintéticas lacO para mejorar la represión de promotores mediante LacI (Muller et al. (1996) J Mol Biol.

257: 21-9).

10 Construcción de pMTL007

Los cebadores de oligonucleótidos usados en la construcción se indican en la Tabla 8 siguiente.

15 Tabla 8: Cebadores de oligonucleótidos

Cebador: Secuencia (5’ -3’) SEQ ID N.°

lacI-P1: GTGGTGCATATGAAACCAGTAACG 70

lacI-P2: 71

ptb-P1: 72

ptb-P2: 73

tdGpI-F1: 29

CatPFwd: 74

CatPSOER: CGGTCATGCTGTAGGTACAAGGTAC 75

CatPRev: imagen20 76

CatPSOEF: GTACCTTGTACCTACAGCATGACCG 77

Thio-F1: 78

Thio-R-RAM: 79

Se aisló un fragmento LspI-HindIII de 1,627 kb del plásmido pCB102 de Clostridium butynicum (Minton y Morris (1981) J Gen Microbiol 127: 325-33) y recortado en el extreme por polimerasa de Klenow. El vector de clonación del replicón pMTL21E (Swinfield et al. (1990) Gene 87:79-89) fue escindido con NheI, recortado en el extremo con polimerasa de

20 Klenow y ligado con el fragmento de replicón pCB102 aislado. El plásmido resultante se denominó pMTL540E (T Davis, Tesis doctoral, The Open University, 1989), tal como se muestra en la Figura 12.

El elemento promotor inducible se derivó del promotor del gen de ferredoxina de Clostridium pasteurianum. Ahora denominado fac, fue creado por adición de un operador lac de E. coli inmediatamente después del +1 del promotor del 25 gen de ferredoxina, y alteración de la secuencia que precede inmediatamente el codón de inicio de ATG del gen estructural de ferredoxina de CAT, y así crear un sitio de restricción NdeI (CATATG) (Minton et al. (1990) Vector systems for the genetic analysis of Clostridium acetobutylicum En: Anaerobes in Human Medicine and Industry (eds. P Boriello & J Hardie), Wrightson Publishing, Petersfield, RU pp. 187-206). En este caso particular, se insertó el operador lac en la orientación opuesta respecto de la transcripción, comparado con el promotor lac. No obstante, esto no afecta la

30 funcionalidad, y la proteína LacI continuará con su capacidad de ligar y reprimir la transcripción desde el promotor.

Luego se subclonó el promotor fac como fragmento de restricción de NdeI y EcoRI entre los sitios equivalentes de plásmido pMTL1003 (Brehm et al. (1991) Appl. Biotechnol. 36, 358-363) que generan el plásmido pMTL1006. Esta etapa de subclonación removió eficazmente el promotor trp de pMTL1003 y colocó la expresión de lacZ’ bajo el control

35 del promotor fd modificado. Luego se sometió el plásmido pMTL1006 a una digestión con BglI y se aisló el mayor de los dos fragmentos obtenidos. De modo similar, se escindió el plásmido pMTL500E (Oultram et al. (1988) FEMS Microbiol Letts 56: 83-88) con BglI y el mayor de los dos fragmentos aislados y ligados con el mayor fragmento aislado de pMTL1006. El plásmido obtenido se designó pMTL500F (Fox et al., 1996, supra).

40 Si bien pMTL500F es excelente en la replicación en Clostridia, hallamos que la frecuencia de transferencia de vectores de lanzadera basados en pAMβ1 en Clostridia es relativamente ineficaz. Por lo tanto, elegimos cambiar el replicón por el de pCB102. En consecuencia, se escindieron pMTL540E y pMTL500F con BglI, y el mayor fragmento de pMTL540E se ligó al fragmento menor de pMTL500F. El plásmido obtenido fue denominado pMTL540F (Fox et al., 1996, supra). Por

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intrón-TGTCTACACT

C. acetobutylicum pyrF 345s: 8 2 25 % CTTTGAAGGTintrón-GATTTTGAAG 85

C. acetobutylicum CAC0081 141a: 6 6 100 % TTTTAATGACintrón-ATAGTTTATA 86

C. acetobutylicum CAC0080 121s: 6 6 100 % CTGAAATTATintrón-TTCGTTAATA 87

C. acetobutylicum CAC0078 385a: 3 3 100 % GTATCTCCAGintrón-GCGCATATCT 88

C. acetobutylicum CAC2208 201s: 4 3 75 % TGTGGAGTATintrón-TCGGTACACA ipt

C. difficile CD0153 784a: 5 5 100 % CCAATAAGCCintrón-CATCTCCAGA 90

C. difficile CD0552 75a: 10 9 90 % CTCTACAATAintrón-TCTATCTTTA 91

C. difficile CD3563 226s: 8 8 100 % GAGGGACAGGintrón-TTGCTGTAGC 92

C. botulinum CB00780 671a: 44 100 % TTTATTATTTintrón-TCTTTTTTAAd 93

C. botulinum CBO1120 670s: 4 4 100 % GAATTTTATGintrón-CTAATATATCd 94

C. botulinum CBO2762 1014s: 4 4 100 % TTTAACATATintrón-AGATTAGTTAd 95

C. botulinum spo0A 249s: 4 4 100 % TATGCCAAGGintrón-GTAATTGTTTd 96

aLos intrones se insertaron detrás de la cantidad de bases indicada desde el inicio del ORF, en orientación con sentido (s) o antisentido (a). bSe extrajo el ADN genómico de clones EmR tomados al azar y usados como moldes en PCR que utilizó cebadores para amplifica a través de una unión intrón-exón. Se seleccionó un clon de cada mutante deseado y se verificó el sitio de inserción del intrón por determinación de secuencia. cSe analizaron 96 clones candidatos mutantes de C. difficile pyrF EmR en pools. No se requirió análisis exhaustivo para aislar el mutante, por lo que se da un rango de frecuencias posibles. dSitio de inserción previsto, no verificado por determinación de secuencias de nucleótidos.

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Claims

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