JP2009540817A - Dna分子及び方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
それ自体の可動性を調整する要素である。更に、それは、イントロンRNA組み換えを介してほとんどのいかなる所望のDNA配列をも標的としうる(Guo等(2000)Science289:452−457;Mohr等(2000)Genes Dev.14:559−573)。このように、標的に含まれる15bp領域のイントロンの個々の塩基を適切に変異させることにより、Karberg等(Nature Biotech(2001)19:1162−1167)は、0.1〜22%の間の頻度で、いくつかの異なるE.coli遺伝子において区別可能な、決められた位置への要素の挿入を導くことができた。これらの遺伝子のうちの1つ、thyAが分裂すると、生来トリメトプリム耐性のクローンになる。したがって、成分は、トリメトプリムの存在における培養により選択することが可能である。他の遺伝子の成分は、L1.LtrBイントロンの存在について、個々のコロニーをスクリーニングすることにより識別された。E.coliのthyA遺伝子を分裂させるのに用いるプラスミドは、S.フレックスネリ及びS.タイフィムリュウムにおけるthyA遺伝子の分裂にも用いられた。タイフィムリュウム耐性コロニーは、それぞれ1%及び0.3%の頻度で得られた。
これらの細菌種の1つのゲノムにおける遺伝子に含むことが好ましい。
(i)クロストリジウム鋼の細菌性細胞に、本発明のDNA分子及びグループIIイントロンコード逆転写酵素を発現することができるDNA分子を提供する工程と、
(ii)細菌性細胞を、グループIイントロンの変性されたグループIIイントロンのRNA転写体からの除去及び選択可能なマーカー遺伝子を含むRNA転写体の挿入が可能な条件下で培養する工程と、
を含む方法である。
(a)tdイントロン及びそのエクソスを含むリンカーは、ermBORF及びそのプロモーター(配列番号10)の間に挿入されて、エリスロマイシン耐性を妨害する。tdイントロンの逆ストランドからのスプライシングは、N末端(配列番号12)において12の追加的なアミノ酸と共に機能的タンパク質をコードする、変質されたermB遺伝子(配列番号11)を産出する。ErmBtdRAM1のermBプロモーターは、ErmBtdRAM2のthlプロモーターに置き換えられる。
(b)種々のテンプレートを用いるPCR及びプライマーErrmB‐Pro‐F3及びErmB‐R1であって、ErmBtdRAM1のtdイントロンの傍らに位置する。レーン1:ErmBtdRAM1 DNA;レーン2:IPTG誘導の後にpMTL201acZTTErmBtdRAM1を含む細胞から単離されたRNAから合成されたErmBtdRAM1 SE DNA;レーン3:cDNA。
(c)種々のテンプレートを用いるPCR及びプライマーThio‐F1及びErmB−R1であって、ErmBtdRAM2のtdイントロンの傍らに位置する。レーン1:クロストリジウム・スポロジェンヌspo0A突然変異体ゲノムのDNA;レーン2:pMTL007::Csp‐spo0A‐249sプラスミドDNA;レーン3:クロストリジウム・スポロジェンヌ野生型ゲノムのDNA;レーン4:水。
固体培地においてそれぞれ14日、4日又は3日培養したクロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・アセトブチリカム及びクロストリジウム・スポロジェンヌの母株の位相差顕微鏡写真。異なる3つの実験の平均胞子形成頻度がパーセンテージで示されている。
人工プロモーター‘fac’を担持するE.coli/クロストリジウムシャトルベクター(pMTL540F)の使用は既に記載した。それは、E.coli lacZオペロンのオペレータを、クロストリジウム・パスツリアヌム・フェレドキシン遺伝子(Fox等(1996)Gene Ther.3:173〜178)のプロモーターのすぐ下流に挿入することにより生成された。このプロモーター要素はクロストリジウムの異種遺伝子の高レベル発現に直接用いられたが、安定化した転写は実証されていない。そこで、新たなE.coli/クロストリジウムシャトルベクター5401Fが、クロストリジウム・アセトブチリカム・ホスホトランスブチリラーゼ(ptb)遺伝子のプロモーター、及びクロストリジウム・スポロジェンヌ、ボツリヌス菌及びクロストリジウム・ディフィシレへの接合伝達を促進するプラスミドRK2のoriT領域の転写制御の下で、facプロモーター及びlacIリプレッサー遺伝子を用いて構成される。pMTL5401Fをテストするため、我々はプロモーターを有しないpC194 cat 遺伝子を挿入して、その転写が得られたプラスミド、pMTL5401Fcatのfacプロモーターの制御下となるようにした(図3)。我々はその後、外来栄養のIPTGの存在下又は不存在下で培養された、pMTL5401Fcatを担持するクロストリジウム・スポロジェンヌ又はクロストリジウム・アセトブチリカム細胞の溶解物におけるcat遺伝子生成物のエンザイム活性を測定した。誘導は双方の有機的組織体において観察されたが、IPTGの不存在下のクロストリジウム・スポロジェンヌにおいて転写の強い抑制が明らかな間(図3)、クロストリジウム・アセトブチリカムにおいて発現の顕著な基礎レベルが観察された(図3)。pMTL5401Fはクロストリジウム・ディフィシレに誘導されることができるが、pCB102レプリコンはこのクロストリジウム宿主において比較的有効でなく機能し、抗生物質添加液体培養においてその接合体の成長を支持することができない。したがって、同等の誘導実験を行うことはできなかった。
tdグループIイントロンのスプライシングは、挿入ポイントの傍らに配置されるエクソン配列に依存する。ファージT4tdグループIイントロンに認識される標的部位は5’‐GACCCAAGAA‐3’(配列番号23)であり、イントロンは初めの‘G’の後に挿入する。しかしながら、tdグループIイントロンは5’‐GACCCAAGAGA‐3’(配列番号5)部位にも挿入する(Sigma Aldrich TargeTronTM Gene Knockout System)。クロストリジウムにおいて現在使用される抗生物質遺伝子の配列は、これらの配列の存在と判断されたが、これらの配列のいずれも組み込んだ遺伝子は識別されていない。スプライス部位5’‐GACCCAAGAGA‐3’(配列番号5)がタンパク質コード領域に存在する場合は、それがコードされるアミノ酸配列はそのリーディングフレームに依存する。スプライス部位にコードされうるアミノ酸配列(3つの可能なフレームに対応する)が図4に示されている。クロストリジウムに耐性を与えると知られているすべてのタンパク質のタンパク質配列のスクリーニングは、所望のアミノ酸配列のいずれかを含む候補タンパク質を識別することができなかった。
pACD4K‐Cの再標的化核酸構成要素は、NaeI(blunt)フラグメントとして、HindIII及びSmaI部位の間でpMTL20にサブクローニングされ(Chambers等(1988)Gene 68:139〜149)、E.coli宿主(DE3)においてlacZ遺伝子をノックアウトできるように、lacZ再標的領域が再び示された。次に、pMTL201acZTTのkanRAMが、ErmBtdRAM1と共にMluIフラグメントとして配置された。tdグループIイントロンが、グループIIイントロンRNA発現の誘導に続いて、ErmBtdRAM1からスプライスされていることをテストするため、pMTL201acZTTErmBtdRAM1を担持するE.coli細胞が採取され、RNAが作成された。その後、td挿入部位の傍らにあるプライマーを用いてRT‐PCR反応が開始された。制御として、ErmBtd RAM1及びErmBtd RAM1 SE(ErmBtd RAM1のスプライスされた等価物)に標準的PCRが実行された。図7にみられるように、IPTG導入RNAサンプルから得られた主な生成物は、SE遺伝子に対応するより小さいものだった。これは、tdが、ErmBtd RAM1における変性されたermB遺伝子のRNAからスプライスされたことを明確に立証している。
ErmBtdRAM1がSigma‐AldrichグループIIイントロンにおいてKanRAMの代わりになりうることを確立して、全体の要素は、lacZの再標的化領域と共に、(HindIII/SacI及びSacI/Nhelフラグメントとしての)pMTL201acZTTErmBtdRAM1から(HindIII‐NheIで切断された)クロストリジウム発現ベクターpMTL5402Fにサブクローニングされて、pMTL5402FlacZTTErmBtdRAM1を与えた。その結果、グループIIイントロンの発現はfacプロモーターの制御下にあった。グループIIイントロンの発現はIPTGによって調節される。
ErmBtdRAM1が、KanRAMと比較して、グループIIイントロンが標的化できる頻度に影響するか否かを評価するために、我々は、Karberg等(2001,上記と同様)が開発した2プラスミドシステムを用いて、いくつかのモビリティアッセイに着手した。IPTG誘導に続くpACD2からのグループIIイントロンの(本来的な標的であるLtrBを担持する)pBRR3‐LtrBへの再標的化は、後者のプラスミド上のTet遺伝子の活性化をもたらした。このように個々の再標的化事象はテトラサイクリンへの耐性の取得に基づいて検知することができる。
ErmBtdRAM1の再標的化を評価するために、3つの異なるクロストリジウム種から8つの異なるテスト遺伝子が選択された。これらは、クロストリジウム・スポロジェンヌpyrF,spo0A,codY及びSONO,クロストリジウム・ディフィシレpyrF(ゲノム注釈番号CD3592)及びspo0A(ゲノム注釈番号CD1214)、クロストリジウム・アセトブチリカムpyrF(ゲノム注釈番号CAC2652)及びspo0Aだった。
初めの4つの新たな再標的化核酸(各々がクロストリジウム・スポロジェンヌ遺伝子pyrF,spo0A,codY及びSONOのいずれか1つにおける挿入を対象としている)がプロトタイプベクターpMTL5402FTTErmBtdRAM1及びE.coliドナーCA434に導入された結果として生じる組み換えプラスミドにサブクローニングされ、それ故、受容体としてクロストリジウム・スポロジェンヌ又はクロストリジウム・ディフィシレのいずれかとの接合に用いられた。後者の場合、接合体は得られなかった。クロストリジウム・スポロジェンヌの場合は、双方のプラスミドにより接合体が得られた。単一の接合体が、250μg/mlのサイクロセリン及び7.5μg/mlのチアンフェニコール(後者はプラスミドメンテナンスを保証する)が補充された1.5mlの適当な成長媒体に植菌され、培養地は37℃で、一晩、抗生物質培養により静止期まで成長させられた。この培養地の150μlが、同じタイプで、同じサプルメントを含む1.5mlの未使用の培養液の植菌に使用され、その後37℃で嫌気的に培養された。培養地の中において成長が見られるとすぐに、典型的には1時間後に、培養地は1mMのIPTGで誘導され、1時間培養された。
実施例7に記載したように、再標的化核酸が再標的化を検出できないことの1つの説明は、ermBプロモーターが、細胞の染色体における遺伝子の1つのコピーがエリソマイシン耐性を与えることを可能とするのに弱すぎることである。大腸連鎖球菌プラスミドpAMβ1のermBプロモーター配列の解析は、プロモーターの−35及び−10領域の間隔は21bpであることを示した。グラム陽性プロモーターの最適条件は17±1bpである。
クロストリジウム・アセトブチリカムのthl遺伝子のプロモーターは、強く構成的なプロモーターとして認識されている。プライマーは、ErmBtdRAM1プロモーターをthlプロモーターに置き換えるように設計された。これらは、転写開始部位及びリボソーム結合部位の間における不要な配列を削除し、開始コドンにNdeI部位を挿入して、プロモーターが必要に応じて再度変更されることを容易にしている。thlプロモーターが強くなりすぎるのを防ぐために、−35及び−10〜16ntの間隔を変更し、−35及び−10要素にマイナーチェンジを行うことにより、突然変異体thlプロモーター‘thl2’も設計された。−35及び−10要素にわたるthl及びthl2プロモーターが、コンセンサスグラム陽性増殖期プロモーターとの比較において、図9に示されている。完全なthlプロモーターの配列は、図10のErmBtdRAM2配列における15〜84ポジションに示されている。
ErmBtdRAM2及び3の再標的化効率は、実施例5に記載した再標的化アッセイを用いて評価した。結果を下記の表7に示す。
上述のように、いずれのRAMも、RAM3ではなく多数のEryRコロニーを与えるEry500又はEry125のいずれかを用いて、グループIIイントロンのE.coli HMS174(DE3)染色体のlacZへの再標的化を検出するのに用いることはできない。恐らくこれらのコロニーは、プラスミドが与える弱い耐性により生じる。
図11は、pMTL5402FlacZTTEemBtdRAM2とも呼ばれるベクターpMTL007の主要な構成要素を図示している。このグループIIイントロンは、lacZ遺伝子を再標的とするように変性される。それはクロストリジウム鋼の細菌性細胞の遺伝子を再標的とするように変性される。
クロストリジウムにエリスロマイシン耐性を与えることができる新たなRAMを生成して、イントロンがcodYに対するクロストリジウム・スポロジェンヌを再標的化するように構成された標的部分を有する変性されたグループIIイントロンを有するクロストリジウム再標的化核酸が作られた。2つのプラスミドがRAM2又はRAM3のいずれかを生成して作られ、それぞれpMTL5402FCs‐codY‐417sTT::RAM2及びRAM3と命名された。RAM2バージョンは、グループIIイントロンの再標的化部分及びIBS配列がクロストリジウム・スポロジェンヌのE.coli lacZではなくcodYに対する再標的化を可能とするように作られている以外は、図10に示されたものと同様である。いずれもプラスミドも、クロストリジウム・スポロジェンヌに接合された。接合体はPCRにより実証され、Ery1.25に対して完全に敏感であることが示された。各RAMの選択された接合体は、その後IPTGにより誘導され、遠心分離及び洗浄により誘導物質を除去した後、エリスロマイシンの濃度の範囲を含む寒天プレート上に塗抹される前に、3時間の回復を与えられた。
我々は、その不活性化が容易に検出できる表現型に導く2つの遺伝子を標的とすることにした。これらはpyrF及びspo0Aである。後者の分裂が胞子非形成を引き起こすのに対し、前者の不活性化はウラシル要求性を引き起こすと考えられる。
標準プロトコルは、クロストリジウムにおいて再標的化のために以下のように作成された。
1. 対象の遺伝子に対するイントロン再標的化配列は、基本的にTargetron TM キットでSigmaにより提供された方法に従って生成される:
Sigmaのウェブサイト[http://www.sigma-genosys.com/targetron]で提供されたコンピュータアルゴリズムが、対象の遺伝子の配列内で可能なイントロンターゲットを識別し、PCRプライマーを設計するのに用いられる。これらのプライマーは、その後、Sigma TargetronTM プロトコルに従って使用され、Sigma TargetronTMキットで提供されるPCR試薬を使用して、イントロンの部分に対応し変性されたIBS,EBS1d及びEBS2配列を含む353bp PCR生成物を生成し、これによりイントロンは対象の遺伝子を再標的化することができる。このPCR生成物はpCR2.1等の適当なクローニングベクターに複製され、その配列が検証される。あるいは、それはpMTL007に直接サブクローンされてもよい。
工程1のPCR生成物がクローニングベクターに複製されたとすると、所望の再標的化配列が、制限エンザイムHindIII及びBsrGIの消化により、そのプラスミドから切除され、同じエンザイムにより消化されるpMTL5402FlacZTTR2に複製される。いずれの場合でも、結果として得られる構成体は限定解析及び/又はシーケニングにより検証される。
組み換え型プラスミドは、電気形質転換又は接合のいずれかに基づく標準DNA転写方法により、クロストリジウム宿主に誘導されうる。いずれの方法も、Davis I,Carter G,Young M及びMinton NP(2005)の「Gene Cloning in Clostridia」、In:Handbook on Clostridia(Durre P,ed)pp.37‐52,CRC Press,Boca Raton,USAで提供される。我々の実験では、プラスミドはE.coliドナーからの接合によりクロストリジウム・ディフィシレ及びクロストリジウム・スポロジェンヌに導入された。対照的に、プラスミドは形質転換によりクロストリジウム・アセトブチリカムに導入された。
個々の形質転換細胞コロニーは、250μg/mlのサイクロセリン及び7.5μg/mlのチアンフェニコール(後者はプラスミドメンテナンスを補強する)が補充された1.5mlの適当な成長媒体を植菌するのに用いられ、培地は嫌気的培養により37℃で一晩、静止期まで成長させられる。この培地の150μlが、同じタイプで同じサプルメントを含む1.5mlの未使用の培養液の植菌に用いられ、その後、37℃で嫌気的に培養される。培地の中で成長が見られるとすぐに、典型的には1時間後に、培地は1mMのIPTGに誘導され、3時間培養される。
1分間7000rpmの遠心分離により2mlの誘導細胞が採取され、PBSにおける再懸濁により洗浄され、もとの通り採取される。沈殿物は同量(2ml)のサプルメントなしの適当な成長媒体に再懸濁され、37℃で3時間嫌気的に培養される。その後、培地の連続希釈物が、1〜10μm/mlのエリスロマイシンが補充された適当な固体成長メディアに蒔かれ、37℃で嫌気的に培養される。再標的化核酸成分クローンに対応するエリスロマイシン耐性コロニーは、使用された有機的組織体及びエリスロマイシン濃度に応じて、18〜48時間後にこれらのプレートから集められる。
前記方法の利便性を更に確立するために、我々は3種のそれぞれからいくつかの他の遺伝子を選択して、突然変異生成手順を繰り返した。標的化された遺伝子は表12に挙げられており、pMTL007のグループIIイントロンの組み換えのための標準プロトコルに従ってPCR生成物を生成するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、表4又は表14に示されている。すべての場合において、所望の成分が得られた。各挿入はPCRスクリーニングにより確認され、挿入ポイントはヌクレオチドシーケニングにより検証された。
Claims (39)
- イントロンコード逆転写酵素を発現しないが、変性されたグループIIイントロンと逆方向の変性された選択可能マーカー遺伝子を含む前記変性されたグループIIイントロンであって、前記選択可能マーカー遺伝子は選択可能マーカー及び前記選択可能マーカー遺伝子の領域に動作可能に結合されたプロモーターをコードする前記領域を有し、前記プロモーターは、前記選択可能マーカー遺伝子の単一のコピーに、前記選択可能マーカーがクロストリジウム鋼の細菌性細胞の表現型を、前記選択可能マーカー遺伝子が欠如したクロストリジウム鋼の細菌性細胞から識別することができるように変更するのに十分な量でコードされる選択可能マーカーの発現を起こすことができる、前記変性されたグループIIイントロンと、
前記変性されたグループIIイントロンの転写のためのプロモーターであって、前記変性されたグループIIイントロンに動作可能に結合された前記プロモーターと、
を有し、
前記変性された選択可能マーカー遺伝子は、前記選択可能マーカー遺伝子の発現を妨害することができるように、前記変性されたグループIIイントロンに対して前方方向に位置するグループIイントロンを含み、
前記DNA分子は、前記グループIイントロンが前記変性されたグループIIイントロンの前記RNA転写から除去されて前記選択可能マーカーをコードする領域を残すことを可能とし、前記RNA転写(又はそのDNAコピー)をクロストリジウム鋼の細菌性細胞におけるDNA分子の部位に挿入することを可能にする、DNA分子。 - 前記変性されたグループIIイントロンの傍らにはエクソンが位置し、前記エクソンは前記グループIIイントロンの前記RNA転写のスプライシングを可能とする、請求項1に記載のDNA分子。
- 前記変性されたグループIIイントロンは標的化部分を有する、請求項1又は2のいずれか一項に記載のDNA分子。
- 前記標的化部分は、前記変性されたグループIIイントロンの前記RNA転写の、前記クロストリジウム鋼の細菌性細胞におけるDNA分子の範囲内の部位への挿入を可能とする、請求項3に記載のDNA分子。
- 前記部位は選択された部位である、請求項4に記載のDNA分子。
- 前記DNA分子はプラスミドである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のDNA分子。
- 前記プラスミドは大腸菌クロストリジウムシャトルベクターである、請求項6に記載のDNA分子。
- 前記大腸菌から前記クロストリジウム鋼の細菌性細胞への接合伝達を可能とするタンパク質をコードする遺伝子を更に有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載のDNA分子。
- 前記選択可能マーカーをコードする前記領域に動作可能に接合された前記プロモーターは、クロストリジウム・アセトブチリカムのthl,ptb若しくはadc遺伝子又はクロストリジウム・パーフリンジェンスのfdx若しくはcpe遺伝子のプロモーターである、請求項1〜8のいずれか一項に記載のDNA分子。
- 前記選択可能マーカーは、前記選択可能マーカーが欠如した前記クロストリジウム鋼の細菌性細胞と比較して、前記選択可能マーカー遺伝子が発現する前記クロストリジウム鋼の細菌性細胞に成長効果を与える、請求項1〜9のいずれか一項に記載のDNA分子。
- 前記選択可能マーカーは、前記クロストリジウム鋼の細菌性細胞にエリスロマイシン耐性又はクロラムフェニコール耐性を与える、請求項1〜10のいずれか一項に記載のDNA分子。
- 前記グループIイントロンは、前記選択可能マーカーをコードする前記領域の範囲内又はその上流に位置する、請求項1〜11のいずれか一項に記載のDNA分子。
- 前記変性されたグループIIイントロンに動作可能に結合する前記プロモーターは誘導プロモーターである、請求項1〜11のいずれか一項に記載のDNA分子。
- 前記誘導プロモーターは、IPTG又はキシロース誘導性である、請求項13に記載のDNA分子。
- プロモーターに動作可能に接続されているが前記変性されたグループIIイントロンに含まれないグループIIイントロンコード逆転写酵素をコードする、オープンリーディングフレームを更に有する、請求項1〜14のいずれか一項に記載のDNA分子。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載のDNA分子と、
グループIIイントロンコード逆転写酵素を発現することができるDNA分子と、
を有するパーツキット。 - (i)請求項1〜14のいずれか一項に記載のDNA分子と、グループIIイントロンコード逆転写酵素を発現することができるDNA分子と、を有するクロストリジウム鋼の細菌性細胞を提供する工程と、
(ii)前記細菌性細胞を、前記変性されたグループIIイントロンの前記RNA転写からの前記グループIイントロンの除去と、前記選択可能マーカー遺伝子(又はそのDNAコピー)を含む前記RNA転写の前記部位への挿入を可能とする条件下で培養する工程と、
を有する、核酸分子をクロストリジウム鋼の細菌性細胞におけるDNA分子の部位に導入することができる方法。 - 前記選択可能マーカーを発現することができる条件下で前記クロストリジウム鋼の細菌性細胞を培養する工程を更に有する、請求項17に記載の方法。
- 前記選択可能なマーカーにより与えられた変化した表現型に基づいて前記クロストリジウム鋼の細菌性細胞を選択する工程を更に有する、請求項18に記載の方法。
- 請求項17で得られた細胞より生じた細胞の単一のクローンを単離する工程を更に有する、請求項19に記載の方法。
- 前記グループIIイントロンコード逆転写酵素を発現することができる前記DNA分子は、請求項1〜14のいずれか一項に記載の前記DNA分子と同一である、請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロストリジウム鋼の細菌性細胞はクロストリジウム属のものである、請求項1〜15のいずれか一項に記載のDNA分子又は請求項17〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記目はクロストリジウムであり、前記細胞はクロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ディフィシレ、ボツリヌス菌、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ベイジェリンキー、クロストリジウム・テタニ、クロストリジウム・セルリチカム又はクロストリジウム・セプティカムである、請求項22に記載のDNA分子又は請求項22に記載の方法。
- 前記クロストリジウム鋼の細菌性細胞における前記DAN分子の前記部位は、遺伝子の範囲内又は遺伝子の発現に影響を及ぼすDNAの部分に位置する、請求項1〜15,22又は23のいずれか一項に記載のDNA分子又は請求項17〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記部位は、細菌ゲノムの範囲内に位置する、請求項1〜15若しくは22〜24のいずれか一項に記載のDNA分子又は請求項17〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載の前記DNA分子を有する前記クロストリジウム鋼の細菌性細胞を提供する工程は、前記DNA分子を前記クロストリジウム鋼の細菌性細胞に形質導入若しくは転移する工程、又は前記DNA分子をドナー細菌性細胞から前記細菌性細胞にトランス接合させる工程を有する、請求項17〜24のいずれか一項に記載の方法。
- (i)請求項3に記載のDNA分子と、グループIIイントロンコード逆転写酵素を発現することができるDNA分子と、を有するクロストリジウム鋼の細菌性細胞を提供する工程と、
(ii)前記細菌性細胞を、前記変性されたグループIIイントロンの前記RNA転写からの前記グループIイントロンの除去と、前記選択可能マーカー遺伝子(又はそのDNAコピー)を含む前記RNA転写の前記選択部位への挿入を可能とする条件下で培養する工程と、
を有する、核酸をクロストリジウム鋼の細菌性細胞におけるDNA分子の選択部位に標的化させる方法。 - 前記DNA分子の前記選択部位は、遺伝子又は遺伝子の発現に影響を及ぼすDNAの部分である、請求項27に記載の方法。
- 請求項17〜27のいずれか一項に記載の方法によって得られる、クロストリジウム鋼の突然変異細菌性細胞。
- エリスロマイシン耐性の発現を妨害するグループIイントロンを含む変性されたエリスロマイシン耐性遺伝子を有する、DNA分子。
- クロラムフェニコール耐性の発現を妨害するグループIイントロンを含む変性されたクロラムフェニコール耐性遺伝子を有する、DNA分子。
- テトラサイクリン耐性の発現を妨害するグループIイントロンを含む変性されたテトラサイクリン耐性遺伝子を有する、DNA分子。
- スペクチノマイシン耐性の発現を妨害するグループIイントロンを含む変性されたスペクチノマイシン耐性遺伝子を有する、DNA分子。
- プラスミドである、請求項30〜33のいずれか一項に記載のDNA分子。
- 請求項30〜34のいずれか一項に記載のDNA分子を有する宿主細胞。
- クロストリジウム鋼の突然変異体細菌性細胞の作成における、請求項1〜15又は30〜34のいずれか一項に記載のDNA分子の使用。
- ここに記載されるあらゆる新規なDNA分子。
- ここに記載されるクロストリジウム鋼の細菌性細胞におけるDNA分子への核酸分子のあらゆる新規な導入方法。
- ここに記載されるクロストリジウム鋼の細菌性細胞におけるDNA分子の選択部位に核酸分子を標的化するあらゆる新規な方法。
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