ES2543839T3 - Nuevas cepas del virus Chikungunya aisladas y purificadas y polinucleótidos y secuencias polipeptídicas, usos diagnósticos e inmunogénicos de las mismas - Google Patents
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Abstract
Una cepa natural aislada y purificada 05.115 de virus chikungunya (CHIKV) capaz de infectar in vitro células humanas, y donde su genoma consiste en la secuencia mostrada en la Figura 4.
Description
Nuevas cepas del virus Chikungunya aisladas y purificadas y polinucleótidos y secuencias polipeptídicas, usos diagnósticos e inmunogénicos de las mismas
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a cepas naturales del virus Chikungunya aislado de pacientes que exhiben formas graves de infección y que derivan de una epidemia de arbovirosis humana. La presente invención también se refiere a secuencias de polipéptido y a fragmentos de las mismas derivados de su genoma, al polinucleótido que las codifica y a su uso en productos de diagnóstico, tales como vacunas y/o composiciones inmunogénicas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El virus Chikungunya (CHIKV) es un Alfavirus transmitido por mosquitos que pertenece a la familia de los Togaviridae [1,2]. Se aisló por vez primera en un brote en Tanzania en 1952 [3]. Es responsable de una infección aguda de inicio brusco, que se caracteriza por fiebre elevada, artralgia, mialgia, dolor de cabeza y sarpullido [4,5]. La poliartralgia, el síntoma patognomónico de la enfermedad, es muy dolorosa. Generalmente los síntomas son autolimitantes y duran de 1 a 10 días. Sin embargo, la artralgia o los síntomas artríticos pueden persistir durante meses o años. En algunos pacientes, también se han descrito síntomas hemorrágicos menores tales como epistaxis
o gingivorragia.
El CHIKV se distribuye geográficamente en África, India y Sudeste Asiático. En África, el virus se mantiene a través del ciclo de transmisión selvático entre primates salvajes y mosquitos tales como Aedes luteocephalus, Ae. furcifer o Ae. taylori [4]. En Asia, el CHIKV se transmite principalmente de humano a humano mediante Ae. aegypti y en menor extensión mediante Ae. albopictus a través de un ciclo de transmisión urbana. Desde el brote de 1952 en Tanzania, el CHIKV ha causado brotes en el África Oriental (Tanzania, Uganda), en el África Austral (Zimbabue, Sudáfrica), en el África Occidental (Senegal, Nigeria) y en el África Central (República Centroafricana, República Democrática del Congo) [4]. La re-emergencia epidémica más reciente se documentó en 1999-2000 en Kinshasa, donde se estima que se infectaron unas 50.000 personas [6]. Desde el primer brote documentado de Asia en 1958 en Bangkok, Tailandia, se han documentado brotes en Tailandia, Camboya, Vietnam, Laos, Myanmar, Malasia, Filipinas e Indonesia [4,5]. La re-emergencia epidémica más reciente se documentó en 2001-2003 en Java después de 20 años [7]. Tanto en África como en Asia, la re-emergencia fue impredecible, con intervalos de entre 7-8 años y 20 años entre epidemias consecutivas.
Desde el final de 2004, el virus Chikungunya (CHIKV) ha emergido en las islas del Océano Índico suroccidental. Entre enero y marzo de 2005, han sido referidos más de 5.000 casos en Comoros. A finales de 2.005, el virus ha circulado por otras islas, esto es, Mayotte, Seychelles, Reunión y Mauricio. Al comienzo de diciembre de 2005, la estación de lluvias dio lugar a una circulación epidémica renovada del virus. Entre el 1 de enero y el 1 de marzo de 2006 se contabilizaron 2.553, 3.471 y 4.650 casos en Mauricio, Mayotte y Seychelles (12 de marzo de 2006). La isla más afectada fue Reunión, con una estimación de 212.000 casos hasta el 12 de marzo de 2006 (población total: 770.000). Más recientemente, se ha documentado la circulación del virus en Madagascar.
En Isla Reunión los primeros casos documentados fueron pacientes que procedían de Comoros en Marzo de 2005. Entre marzo y junio se documentaron más de 3.000 casos. La transmisión se vio limitada durante la temporada de invierno del hemisferio sur y desde mediados de diciembre se observó una resurgencia importante, estimándose
210.000 casos entre enero y marzo de 2006 [8]. Desde marzo de 2005, 85 pacientes con infección de CHIKV confirmada han desarrollado síntomas clínicos graves (meningoencefalitis o hepatitis fulminante) que justificaron la hospitalización en una unidad de cuidados intensivos. Varios casos de meningo-encefalitis y síndrome álgico grave han sido asociados a una transmisión vertical del virus 9.
Hasta la fecha, se han determinado dos secuencias de nucleótidos del CHIKV completas, para las cepas Ross (nº de acceso: AF490259) y S27 [9], ambas aisladas de pacientes durante el brote de 1952 en Tanzania. Se ha determinado otra secuencia de nucleótidos completa para una cepa aislada en Ae. furcifer durante el brote de 1983 en Senegal (nº de acceso AY726732). Khan y colaboradores [9] demostraron que el genoma de S27 era similar en estructura al de otros alfavirus, y que el virus O’nyong-nyong (ONN) era el pariente más próximo al CHIKV. Adicionalmente, análisis filogenéticos basados en secuencias parciales E1 procedentes de elementos aislados de África y Asia revelaron la existencia de tres filogrupos de CHIKV distintos, uno que contenía todos los elementos aislados de África Occidental, uno que contenía los elementos aislados de Asia, y uno correspondiente a los elementos aislados de África Oriental, Central y del Sur [10]. Las cepas aisladas en 1999-2000 en la República Democrática del Congo pertenecían al último filogrupo [6].
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Un aspecto de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 es proporcionar nuevas herramientas diagnósticas e inmunológicas contra enfermedades asociadas al virus CHIK, tal como la arbovirosis.
Dicho aspecto se alcanza de manera concreta proporcionando una cepa natural aislada y purificada del virus Chikungunya (CHIK) capa de infectar células humanas in vitro; y su uso para la detección de un CHIKV asociado a un arbovirus, o para la preparación de una composición que evite y/o trate un arbovirus.
Otro aspecto de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a una cepa aislada y purificada de CHIKV que comprende al menos una mutación en la proteína estructural E1 y/o en la proteína estructural E2; y su uso para la detección de un CHIKV asociado a un arbovirus, o para la preparación de una composición que evite y/o trate un arbovirus.
Otro aspecto de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a un polinucleótido aislado y purificado de la secuencia de SEQ ID NO: 1; y su uso para la detección de un CHIKV asociado a un arbovirus, o para la preparación de una composición que evite y/o trate un arbovirus.
Otro aspecto de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a un fragmento del polinucleótido de la invención donde codifica para el ectodominio de la glicoproteína E2 ó E1; y su uso para la detección de un CHIKV asociado a un arbovirus, o para la preparación de una composición que evite y/o trate un arbovirus.
Otros aspectos de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a un vector que comprende un fragmento contemplado por la presente invención, y una célula hospedante que comprende dicho vector; y su uso para la detección de un CHIKV asociado a un arbovirus, o para la preparación de una composición que evite y/o trate un arbovirus.
Otro aspecto adicional de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a un polipéptido purificado codificado por un fragmento de la invención; y su uso para la detección de un CHIKV asociado a un arbovirus, o para la preparación de una composición que evite y/o trate un arbovirus.
Un aspecto adicional de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere al uso de un anticuerpo monoclonal o policlonal, o un fragmento del mismo que se une específicamente a un polipéptido de la invención para la detección de un CHIKV asociado a un arbovirus.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Localización de los cambios de E1 sobre la estructura 3D modelizada a partir de la estructura cristalina de SFV E1 [43] [19].
A) Diagrama de cinta de la E1, con el dominio I de color rojo, el dominio II amarillo y el dominio III, azul. Los tubos verdes marcan enlaces de disulfuro. El péptido de fusión, en la punta de la molécula (en el dominio II) está en color naranja y marcado. El extremo N y el extremo C observados en el cristal (que están 30 aa por encima de la región trans-membrana) también están marcados. Los 2 únicos cambios observados en el Océano Índico están indicados por estrellas y están marcados: posiciones 226 (blanco) y 284 (magenta).
B) Representación parcial (un octante, ligeramente extendido) de la estructura icosahédrica de la E1 en la superficie del virión, vista bajo un eje de simetría de 5 aumentos. Un promotor de E1 está resaltado en colores, como en A); los demás están representados en gris. La localización de algunos de los ejes de simetría icosahédrica está dibujada con símbolos negros sólidos: pentágonos para el eje de 5 aumentos, triángulos para los ejes de 3 aumentos, elipses para los ejes de 2 aumentos (que en la capa T=4 de los alfavirus son coincidentes con los ejes de cuasi 6 aumentos). Los triángulos abiertos indican la localización aproximada de los trímeros de E2 que interaccionan estrechamente con E1, cubriendo el dominio II y el péptido de fusión, y presentando los principales sitios antigénicos. Los triángulos abiertos también marcan ejes de simetría de cuasi 3 aumentos de la capa icosahédrica de superficie T=4. Una esfera magenta marca la localización de Glu 284, en el sitio de contacto de promotor interE1. Dicho contacto se propaga 240 veces en la capa de superficie (nótense las esferas rosas dibujadas sobre los promotores grises). Cabe destacar que el péptido de fusión, en naranja, está apuntando hacia arriba, lejos de los contactos con otros promotores E1. Esto se observa más fácilmente en la periferia del virión, donde uno de ellos está marcado (FP). En el virión, esta región de E1 no es accesible, estando cubierta bajo la molécula de E2 [19].
Figura 2: Relaciones filogenéticas entre los elementos aislados de Chikungunya en base a las secuencias parciales de nucleótido E1. Los elementos aislados del brote del Océano Índico (Reunión, Seychelles, Mayotte, Mauricio, Madagascar) representan un grupo dentro del filogrupo grande de África Oriental, Central y del Sur (ECSA, del inglés “East, Central and South Africa”). Los valores de remuestreo de cincha están indicados en los nodos principales. La rama que conduce al filogrupo de África Occidental (de una longitud aproximada de 15%) fue acordada por comodidad.
Figura 3: Escenario de evolución propuesto de los elementos aislados de virus Chikungunya procedentes del brote 1 del Océano Índico. El escenario se basa en seis secuencias genómicas determinadas por el secuenciamiento directo de productos RT-PCR obtenidos usando extractos de ARN como plantilla; por tanto las secuencias se corresponden a secuencias de consenso (Seq. Cons.) de la posible mezcla de genomas coexistentes (cuasiespecies). Interior: número de casos de E1-226A y E1-226V a diferentes intervalos de tiempo en la Isla de Reunión,
en base a secuencias parciales de la E1. El E1-226V se observó en las secuencias de consenso 2, 3 y 4, y por lo tanto la mayoría de los elementos aislados de E1-226V genotipados en base a secuencias parciales de E1 probablemente están relacionados con estos genotipos. Sin embargo, la apariencia independiente del E1-226V en otros genotipos no se puede excluir. Interior: secuencia intermedia. La localización, tamaño y posición relativa de las Islas y de la frontera africana son indicativos. La secuencia de consenso 1 se obtuvo a partir de un paciente de Reunión que viajó desde Comoros en marzo de 2005, y a partir de un paciente de la Isla de Reunión. Las secuencias 2 a 4 corresponden a muestras de Isla Reunión; la secuencia 5 a una muestra de las Seychelles.
Figura 4: muestra la secuencia de nucleótidos del genoma de una cepa de virus CHIK según una realización preferida de la invención, y más específicamente de la cepa preferida denominada 05.115 (SEQ ID NO: 1).
Figura 5: muestra la secuencia de nucleótidos del genoma de una cepa de virus CHIK según la presente descripción, y más específicamente de la cepa preferida denominada 05.209 (SEQ ID NO: 2).
Figura 6: muestra la secuencia de nucleótidos del genoma de una cepa de virus CHIK según la presente descripción, y más específicamente de la cepa preferida denominada 06.21 (SEQ ID NO: 3).
Figura 7: muestra la secuencia de nucleótidos del genoma de una cepa de virus CHIK según la presente descripción, y más específicamente de la cepa preferida denominada 06.27 (SEQ ID NO: 4).
Figura 8: muestra la secuencia de nucleótidos del genoma de una cepa de virus CHIK según la presente descripción, y más específicamente de la cepa preferida denominada 06.49 (SEQ ID NO: 5).
Figura 9: muestra la secuencia de nucleótidos del genoma de una cepa de virus CHIK según la presente descripción, y más específicamente de la cepa preferida denominada 05.61 (SEQ ID NO: 6).
Figura 10: muestra una secuencia de nucleótidos de un fragmento de un virus CHIK según la presente descripción, y más específicamente un fragmento que codifica para el ectodominio de la glicoproteína E2 de la cepa preferida denominada 06.21 (SEQ ID NO: 7).
Figura 11: muestra una secuencia de nucleótidos de un fragmento de un virus CHIK según la presente descripción, y más específicamente un fragmento que codifica para el ectodominio de la glicoproteína E2 de la cepa preferida denominada 06.27 (SEQ ID NO: 8).
Figura 12: muestra una secuencia de nucleótidos de un fragmento de un virus CHIK según la presente descripción, y más específicamente un fragmento que codifica para el ectodominio de la glicoproteína E2 de la cepa preferida denominada 06.49 (SEQ ID NO: 9).
Figura 13: muestra una secuencia de nucleótidos de un fragmento de un virus CHIK según una realización preferida de la invención, y más específicamente un fragmento que codifica para el ectodominio de la glicoproteína E2 de la cepa preferida denominada 05.115 (SEQ ID NO: 10).
Figura 14: muestra una secuencia de nucleótidos de un fragmento de un virus CHIK según la presente descripción, y más específicamente un fragmento que codifica para una forma soluble de la glicoproteína E2 de la cepa preferida denominada 06.21 (SEQ ID NO: 11).
Figura 15: muestra una secuencia de nucleótidos de un fragmento de un virus CHIK según la presente descripción, y más específicamente un fragmento que codifica para una forma soluble de la glicoproteína E2 de la cepa preferida denominada 06.27 (SEQ ID NO: 12).
Figura 16: muestra una secuencia de nucleótidos de un fragmento de un virus CHIK según la presente descripción, y más específicamente un fragmento que codifica para una forma soluble de la glicoproteína E2 de la cepa preferida denominada 06.49 (SEQ ID NO: 13).
Figura 17: muestra una secuencia de nucleótidos de un fragmento de un virus CHIK según una realización preferida de la invención, y más específicamente un fragmento que codifica para una forma soluble de la glicoproteína E2 de la cepa preferida denominada 05.115 (SEQ ID NO: 14).
Figura 18: muestra una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de virus CHIK preferido según la presente descripción, y más específicamente relacionado con el ectodominio de la glicoproteína E2 de la cepa preferida denominada 06.21 (SEQ ID NO: 15).
Figura 19: muestra una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de virus CHIK preferido según la presente descripción, y más específicamente relacionado con el ectodominio de la glicoproteína E2 de la cepa preferida denominada 06.27 (SEQ ID NO: 16).
Figura 20: muestra una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de virus CHIK preferido según la presente descripción, y más específicamente relacionado con el ectodominio de la glicoproteína E2 de la cepa preferida denominada 06.49 (SEQ ID NO: 17).
Figura 21: muestra una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de virus CHIK preferido según una realización preferida de la invención, y más específicamente relacionado con el ectodominio de la glicoproteína E2 de la cepa preferida denominada 05.115 (SEQ ID NO: 18).
Figura 22: muestra una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de virus CHIK preferido según la presente descripción, y más específicamente relacionado con una forma soluble de la glicoproteína E2 de la cepa preferida denominada 06.21 (SEQ ID NO: 19).
Figura 23: muestra una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de virus CHIK preferido según la presente descripción, y más específicamente relacionado con una forma soluble de la glicoproteína E2 de la cepa preferida denominada 06.27 (SEQ ID NO: 20).
Figura 24: muestra una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de virus CHIK preferido según la presente descripción, y más específicamente relacionado con una forma soluble de la glicoproteína E2 de la cepa preferida denominada 06.49 (SEQ ID NO: 21).
Figura 25: muestra una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de virus CHIK preferido según una realización preferida de la invención, y más específicamente relacionado con una forma soluble de la glicoproteína E2 de la cepa preferida denominada 05.115 (SEQ ID NO: 22).
Figura 26: Elementos de Secuencia de Repetición encontrados en la región 3’NTR
A. Alineamiento de los Elementos de Secuencia de Repetición (RSE, del inglés “Repeat Sequence Elements”) encontrados en la región 3’NTR del genoma del virus Chikungunya. Todas las secuencias forman estructuras de tallo-lazo conservadas y estables en las que el lazo está constituido por los nucleótidos menos conservados en torno a la posición 20. En los genomas de Chikungunya se observan tres RSE. El primero (RSE1) está insertado antes de la secuencia poli-A interna del genoma S27 [9], mientras que los otros dos se encuentran por debajo de esta estructura.
B. Estructura secundaria predicha para el RSE1 del elemento aislado 05-115.
Figura 27: Fenotipo de foco de virus Chikungunya sobre células AP61 mediante inmunoensayo de foco.
Se infectaron células AP61 de mosquito en placas de 24 pocillos con reservas de virus CHIK cultivadas en células de mosquito (títulos de virus de 2-5 x 10^8 FFU·mL-1) a una multiplicidad de infección de 0,0001 (pocillo superior) o 0,00001 (pocillo inferior). Las células infectadas fueron superpuestas con CMC en medio de cultivo Leibovitz L15 con un 2% de FBS durante 2 días para permitir el desarrollo del foco a 28ºC. Las células fueron fijadas con un 3% de PFA en PBS, permeabilizadas con Triton X-100 en PBS, y los focos de replicación de virus CHIK fueron inmunoteñidos con HMAF anti-CHIK de ratón (dilución 1 : 2.000) e Ig anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa (dilución 1 : 100).
Figura 28: Preparación vírica que contiene pE2. Las proteínas pE2 fueron detectadas mediante anticuerpos anti-CHIK.
Figura 29: Alineamiento de secuencias de nucleótido que codifican la forma soluble de la glicoproteína E2 (E2-1 a E2-361) de las cepas de virus CHIK del Océano Índico -21, -27, -49 y -115.
Figura 30: Secuencias de cebador (SEQ ID NO: 79 y 80) usadas para la amplificación y la clonación de la forma soluble del E2 (E2-1 a E2-364) (fragmento de ácido nucleico N-terminal y C-terminal: SEQ ID NO: 81 y 82; fragmento de proteína N-terminal y C-terminal: SEQ ID NO: 83 y 84) del virus CHIK en el vector lanzadera pMT2/BiP/V5-HisA.
Figura 31: SDS-PAGE que muestra la tinción de CHIK-sE2 con azul de Coomassie.
Figura 32: Análisis de inmunotinción de proteína sE2 de CHIK altamente purificada.
Figura 33: Construcción del vector TRIP que expresa la forma soluble secretada de la glicoproteína E2 (sE2) procedente de cepas 05 de virus Chikungunya de Reunión.
Figura 34: muestra la secuencia de nucleótidos que codifica la forma soluble secretada de la glicoproteína E2 (sE2) en el vector TRIP (SEQ ID NO: 85).
Figura 35: Ensayo inmunofluorescente (IF) con anticuerpos anti-CHIK sobre células 293 transducidas con TRIP/CHIK.sE2.
Figura 36: muestra un ELISA directo con 10-4 mL de proteína pE2 enriquecida por pocillo. Los antígenos fueron evaluados respectivamente con un anti-DEN1 de ratón (dilución 1 : 1.000), anti-WN (dilución 1 : 1.000) y anti-CHIK (dilución 1: 10.000).
Figura 37: muestra una secuencia de aminoácidos del ORF 2 (proteínas estructurales) de la cepa CHIK S27 (GenBank AF339485; SEQ ID NO: 23).
Figura 38: muestra una secuencia de aminoácidos del ORF 2 (proteínas estructurales) de un virus CHIK preferido según la presente descripción, es decir la cepa 05.61 (SEQ ID NO: 24).
Figura 39: muestra una secuencia de aminoácidos del ORF 2 (proteínas estructurales) de un virus CHIK preferido según la presente descripción, es decir la cepa 05.209 (SEQ ID NO: 25).
Figura 40: muestra una secuencia de aminoácidos del ORF 2 (proteínas estructurales) de un virus CHIK preferido según una realización preferida de la presente invención, es decir la cepa 05.115 (SEQ ID NO: 26).
Figura 41: muestra una secuencia de aminoácidos del ORF 2 (proteínas estructurales) de un virus CHIK preferido según la presente descripción, es decir la cepa 06.49 (SEQ ID NO: 27).
Figura 42: muestra una secuencia de aminoácidos del ORF 2 (proteínas estructurales) de un virus CHIK preferido según la presente descripción, es decir la cepa 06.27 (SEQ ID NO: 28).
Figura 43: muestra una secuencia de aminoácidos del ORF 2 (proteínas estructurales) de un virus CHIK preferido según la presente descripción, es decir la cepa 06.21 (SEQ ID NO: 29).
Figura 44: muestra una secuencia de aminoácidos del ORF 1 (proteínas no estructurales) de un virus CHIK preferido según la presente descripción, es decir la cepa 05.61 (SEQ ID NO: 30).
Figura 45: muestra una secuencia de aminoácidos del ORF 1 (proteínas no estructurales) de un virus CHIK preferido según la presente descripción, es decir la cepa 05.209 (SEQ ID NO: 31).
Figura 46: muestra una secuencia de aminoácidos del ORF 1 (proteínas no estructurales) de un virus CHIK preferido según una realización preferida de la presente invención, es decir la cepa 05.115 (SEQ ID NO: 32).
Figura 47: muestra una secuencia de aminoácidos del ORF 1 (proteínas no estructurales) de un virus CHIK preferido según la presente descripción, es decir la cepa 06.49 (SEQ ID NO: 33).
Figura 48: muestra una secuencia de aminoácidos del ORF 1 (proteínas no estructurales) de un virus CHIK preferido según la presente descripción, es decir la cepa 05.27 (SEQ ID NO: 34).
Figura 49: muestra una secuencia de aminoácidos del ORF 1 (proteínas no estructurales) de un virus CHIK preferido según la presente descripción, es decir la cepa 06.21 (SEQ ID NO: 78).
Figura 50: Evaluación de reactividad de Mab de E2 anti-CHIK mediante ELISA.
Figura 51: Evaluación de reactividad de Mab de E2 anti-CHIK sobre viriones de CHIK mediante ELISA.
Figura 52: Análisis de inmunofluorescencia (IF) de la reactividad de Mab de E2 anti-CHIK sobre células Vero infectadas con CHIKV.
Figura 53: Análisis de inmunofluorescencia (IF) de la reactividad de Mab de E2 anti-CHIK sobre células 293A transducidas con TRIP/CHIK.sE2.
Figura 54: Unión de Mab de E2 anti-CHIK sobre la superficie celular de células Vero infectadas con virus CHIK mediante análisis FACS.
Figura 55: Análisis de transferencia “Western blot” de la expresión de CHIKsE2 en células 293A transducidas con TRIP/CHIK.sE2.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En el presente estudio, los inventores determinaron las secuencias de nucleótidos casi completas de los virus aislados de seis pacientes procedentes de las Islas de Reunión y Seychelles. La presente descripción permite determinar la estructura genómica, así como las características moleculares únicas de elementos aislados del brotedel Océano Índico, que se distinguen de otras secuencias de CHIKV y alfavirus.
Como puede apreciar el especialista en la técnica, la originalidad de la presente descripción es la identificación de nuevas cepas del virus Chikungunya (CHIK) que se distinguen del virus CHIK de la técnica previa, y el uso de dichas cepas de CHIK y de los polipéptidos y los polinucleótidos que las codifican derivados de su genoma en el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de la arbovirosis.
Según un primer aspecto, la presente invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a una cepa natural aislada y purificada del virus Chikungunya (CHIKV) capaz de infectar células humanas in vitro. Preferiblemente, la presente invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a una cepa natural
del virus CHIK que exhibe las características del elemento aislado 05.115. Según un método preferido, la cepa que se encuentra dentro del alcance de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se caracteriza por que su genoma comprende al menos una mutación cuando se compara con la secuencia del genoma de la cepa S-27 de virus CHIK (GenBank AF339485). También dentro del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13, se encuentra cualquier cepa cultivada u obtenida mediante cultivo celular a partir de una muestra de una cepa de CHIK preferida. El genoma de la cepa preferida según la presente invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 consiste en la secuencia mostrada en la Figura 4 (SEQ ID NO: 1). El genoma de las cepas preferidas según la presente descripción comprende una secuencia como la mostrada en la Figura 5, 6, 7, 8 ó 9 (SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 ó 6).
Según otro aspecto, la presente invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 proporciona una cepa aislada y purificada del virus Chikungunya (CHIKV) que comprende al menos una mutación en la proteína estructural E1 y/o en la proteína estructural E2, y más particularmente en su región de ectodominio. Según una realización preferida, la cepa de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se caracteriza por el hecho de que su genoma comprende al menos una mutación en la proteína E2 en una posición homóloga a la posición de aminoácido 382, 399, 404, 485, 489, 506, 536, 624, 637, 669, 700 ó 711 de la SEQ ID NO: 23 (Fig. 37). Más particularmente, la mutación se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en G382K, I399M, G404E, N485T, A489T, L506M, I536T, S624N, T637M, A669T, S700T y V711A, tal como se muestra en la Tabla 6. Según otra realización preferida, la cepa de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se caracteriza por el hecho de que su genoma comprende al menos una mutación en la proteína E1 en una posición homóloga a la posición de aminoácido 1035, 1078, 1093 ó 1131 de la SEQ ID NO: 23. Más particularmente, la mutación se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en A1035V, M1078V, D1093E y V1131A tal como se muestra en la Tabla 6.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “en una posición homóloga a una posición de aminoácido” de una proteína, se refiere a posiciones de aminoácido que se determinan para corresponder una con otra en base a alineamientos de secuencia y/o estructurales con una proteína de referencia específica. Por ejemplo, en una posición que corresponde a una posición de aminoácido de una proteína estructural de virus CHIK fijada en la SEQ ID NO: 1 se puede determinar empíricamente alineando las secuencias de aminoácidos fijadas en la SEQ ID NO: 1 con una proteína estructural de virus CHIK particular. Las posiciones homólogas o correspondientes se pueden determinar a través de dicho alineamiento por parte de un especialista en la técnica usando alineamientos manuales
- o usando los numerosos programas de alineamiento disponibles (por ejemplo, BLASTP). Las posiciones homólogas
- o correspondientes también se pueden basar en el alineamiento estructural, por ejemplo usando alineamientos simulados por ordenador de la estructura de la proteína. Cuando se dice que los aminoácidos de un polipéptido corresponden a aminoácidos de una secuencia descrita se refiere a aminoácidos identificados por alineamiento del polipéptido con la secuencia descrita para maximizar la identidad o la homología (cuando los aminoácidos conservados están alineados) usando un algoritmo estándar, tal como el algoritmo GAP. Tal como se usa en la presente memoria, “en una posición homóloga” se refiere a una posición de interés (es decir, un número de base o un número de residuo) de una molécula de ácido nucleico o proteína respecto a la posición en otra molécula de ácido nucleico o proteína de referencia. La posición de interés respecto a la posición en otra proteína de referencia puede estar, por ejemplo, en una secuencia de aminoácidos de la misma proteína de otra cepa de CHIK. Las posiciones homólogas se pueden determinar comparando y alineando secuencias para maximizar el número de nucleótidos o residuos coincidentes, por ejemplo, de tal modo que la identidad entre las secuencias sea superior al 95%, preferiblemente superior al 96%, más preferiblemente superior al 97%, incluso más preferiblemente superior al 98% y lo más preferiblemente superior al 99%. A continuación se asigna un número a la posición de interés dentro de la molécula de ácido nucleico de referencia.
Otro aspecto de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a un polinucleótido aislado y purificado que consiste en la secuencia mostrada en la Figura 4 (SEQ ID NO: 1).
Otro aspecto de la descripción se refiere a un polinucleótido aislado y purificado que comprende la totalidad o parte de las secuencias mostradas en las Figuras 5, 6, 7, 8 ó 9 (SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 ó 6).
Otro aspecto de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a un fragmento del polinucleótido de la invención que se caracteriza por el hecho de que codifica para la región de ectodominio de la glicoproteína E1 o E2. De forma ventajosa, el fragmento de la invención tal como se define en las reivindicaciones 113, cuando codifica para el ectodominio de E2, comprende, o más preferiblemente, consiste en una secuencia de nucleótidos como la mostrada en la Figura 13 (SEQ ID NO: 10).
Otro aspecto de la descripción se refiere a un fragmento del polinucleótido que se caracteriza por el hecho de que codifica para la glicoproteína E1 o E2, y más preferiblemente para su región de ectodominio. De forma ventajosa, el fragmento de la descripción cuando codifica para el ectodominio E2 comprende, o más preferiblemente, consiste en una secuencia de nucleótidos como las mostradas en las Figuras 10, 11 ó 12 (SEQ ID NO: 7, 8 ó 9).
Otro aspecto adicional de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a un fragmento del polinucleótido de la invención que se caracteriza por el hecho de que codifica para una forma soluble de la glicoproteína E2. Según una realización preferida, dicho fragmento del polinucleótido de la invención que codifica
para un fragmento soluble de la glicoproteína E2 tal como se define en las reivindicaciones 1-13, consiste en una secuencia de nucleótidos como la mostrada en la Figura 17 (SEQ ID NO: 14).
Otro aspecto adicional de la descripción se refiere a un fragmento del polinucleótido que se caracteriza por el hecho de que codifica para una forma soluble de la glicoproteína E2. Según una realización preferida, el fragmento del polinucleótido que codifica para un fragmento soluble de la glicoproteína E2 comprende o más preferiblemente consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en las Figuras 14, 15 ó 16 (SEQ ID NO: 11, 12 ó 13).
Como apreciará el especialista en la técnica, un fragmento como el contemplado por la presente invención puede obtenerse mediante:
- -
- el uso de enzimas de restricción, donde sus sitios de ruptura están presentes en el polinucleótido que comprende dicho fragmento;
- -
- amplificación con cebadores específicos para dicho fragmento;
- -
- transcripción in vitro; o
- -
- síntesis química.
Según otro aspecto, la presente invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a un polipéptido aislado y purificado codificado por un fragmento de la invención. Tal como se usan en la presente memoria, los términos “polipéptido” y “proteína” se usan de forma indistinta para denotar un polímero de aminoácido o un conjunto de dos o más polímeros de aminoácido que interaccionan o están ligados.
Por “aislado” se entiende, en relación a un polipéptido, que la molécula indicada está separada y discreta respecto al organismo completo en el cual se encuentra de forma natural, o que está presente en una ausencia sustancial de otras macro-moléculas del mismo tipo. El término “aislado” en relación a un polinucleótido es una molécula de ácido nucleico desprovista, en su totalidad o en parte, de las secuencias asociadas normalmente a él en la naturaleza; o una secuencia, tal como se da en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas asociadas a la misma; o una molécula desasociada del cromosoma.
Definidos de forma amplia, los términos “polipéptido purificado” o “polinucleótido purificado” se refieren a polipéptidos
o polinucleótidos que están sustancialmente libres de otras proteínas o polinucleótidos, o carbohidratos, y lípidos con los que asocian de forma natural. El polipéptido o polinucleótido puede purificarse mediante cualquier proceso mediante el cual la proteína o el polipéptido se separen de otros elementos o compuestos en base, por ejemplo, a la carga, el tamaño molecular o la afinidad de unión.
Los péptidos preferidos de la invención tal como se definen en las reivindicaciones 1-13 comprenden al menos una sustitución de aminoácido con respecto a la secuencia de aminoácidos de la cepa S-27 (GenBank AF339485) y se derivan de la secuencia de una proteína codificada por un fragmento de la invención tal como el definido en las reivindicaciones 1-13. Preferiblemente, un polipéptido purificado de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 consiste en la secuencia definida en la Figura 40 (secuencia de aminoácidos del ORF2 (SEQ ID NO: 26) de la cepa de virus CHIK 05.115).
Un polipéptido purificado de la descripción comprende la totalidad o parte de la secuencia de aminoácidos de un ORF 1 ó 2 de virus CHIK contemplado por la presente descripción, tal como el definido por una cualquiera de las SEQ ID NOs: 24 a 25 y 27 a 29 (ORF 2) o las SEQ ID NOs: 30 a 34 y 78 (ORF 1). Más preferiblemente, un polipéptido purificado de la descripción comprende la totalidad o parte de la secuencia de aminoácidos de una glicoproteína E2 contemplada por la presente descripción tal como una definida en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 15 a 18 (Figuras 18 a 21). Incluso más preferiblemente, un polipéptido purificado de la descripción comprende la totalidad o parte de la secuencia de aminoácidos de una forma soluble de la glicoproteína E2 contemplada por la presente descripción tal como la definida en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 19 a 22 (Figuras 22 a 25).
La presente invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 también se refiere a un vector que comprende un fragmento de un polinucleótido de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13. Tal como se usa en la presente memoria, el término “vector” se refiere a una construcción de polinucleótido diseñada para la transducción/transfección de uno o más tipos celulares. Los vectores pueden ser, por ejemplo, “vectores de clonación” que están diseñados para el aislamiento, la propagación y la replicación de nucleótidos insertados, “vectores de expresión” que están diseñados para la expresión de una secuencia de nucleótidos en una célula hospedante, o un “vector vírico” que está diseñado para dar como resultado la producción de un virus recombinante
o de una partícula de tipo virus, o “vectores lanzadera”, que comprenden los atributos de más de un tipo de vector. Los vectores preferidos son aquellos depositados en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), 28 Rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15, Francia, el 15 de marzo de 2006 bajo los números de acceso I-3587, I-3588, I-3589 e I-3590. Otro vector preferido contemplado por la presente descripción es el plásmido denominado TRIP-CHIK.sE2 que ha sido depositado en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), 28 Rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15, Francia, el 14 de marzo de 2007 bajo el número de acceso I-3733. Dicho vector comprende un fragmento que codifica para una forma soluble de la
glicoproteína E2 de la invención. Este vector preferido ha sido optimizado para la producción eficiente de la proteína E2 recombinante en células de mamífero. Tal como se usa en la presente memoria, el término “optimizado” significa que el vector incorpora secuencias de regulación, tales como una secuencia de péptido señal, a fin de proporcionar una expresión adecuada de la proteína codificada deseada.
En un aspecto relacionado, la presente invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 proporciona una célula hospedante que comprende un vector como el definido anteriormente. El término “célula hospedante” se refiere a una célula que presenta una nueva combinación de segmentos de ácido nucleico que no están unidos covalentemente unos a otros en la naturaleza. Una nueva combinación de segmentos de ácido nucleico se puede introducir en un organismo usando una amplia variedad de técnicas de manipulación de ácidos nucleicos disponibles para los especialistas en la técnica. Una célula hospedante puede ser una única célula eucariótica, o una única célula procariótica, o una célula de mamífero. La célula hospedante puede albergar un vector que se extragenómico. Un vector de ácido nucleico extragenómico no se inserta en el genoma de la célula. Una célula hospedante puede albergar además un vector o una porción del mismo que sea intragenómica. El término intragenómico define una construcción de ácido nucleico incorporada dentro del genoma de la célula hospedante. Una célula hospedante E. coli preferida tal como una que contenga un vector como el definido en las reivindicaciones 1-13 está depositada en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), 28 Rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15, Francia, el 15 de marzo de 2006 bajo los números de acceso I-3587, I-3588, I-3589 e I-3590, y el 14 de marzo de 2007 bajo el número de acceso I-3733.
La presente invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere además al uso de un anticuerpo monoclonal o de anticuerpos policlonales, o fragmentos de los mismos, que se unen específicamente a un polipéptido de la invención para la detección in vitro de un CHIKV asociado a una arbovirosis tal como se define en las reivindicaciones 1-13. Tal como se usa en la presente memoria, el término “se une específicamente a” se refiere a anticuerpos que se unen con una afinidad relativamente elevada a uno o más epítopos de una proteína de la invención, pero que no reconocen sustancialmente ni se unen a moléculas diferentes a la(s) de interés. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “relativamente alta afinidad” significa una afinidad de unión entre el anticuerpo y la proteína de interés de al menos 10-6 M, y preferiblemente de al menos aproximadamente 10-7 M e incluso más preferiblemente 10-8 M a 10-10 M. La determinación de dicha afinidad se lleva a cabo preferiblemente bajo condiciones estándares de inmunoensayo de unión competitiva, que son de conocimiento común para el especialista en la técnica.
Tal como se usa en la presente memoria, el término “anticuerpo” se refiere a una glicoproteína producida por células linfoideas en respuesta a una estimulación con un inmunógeno. Los anticuerpos poseen la capacidad de reaccionar in vitro e in vivo específica y selectivamente con un determinante antigénico o epítopo que provoca su producción o con un determinante antigénico estrechamente relacionado con el antígeno homólogo. El término “anticuerpo” pretende abarcar construcciones que usan la región de unión (variable) de dicho anticuerpo, y otras modificaciones de anticuerpo. Por tanto, un anticuerpo útil en el uso de la invención puede comprender un anticuerpo completo, un fragmento de anticuerpo, un agregado de anticuerpo polifuncional, o en general una sustancia que comprenda uno o más sitios de unión más específicos de un anticuerpo. El fragmento de anticuerpo puede ser un fragmento tal como un fragmento Fv, Fab o F(ab’)2 o un derivado del mismo, tal como un fragmento Fv de cadena sencilla. El anticuerpo
o fragmento de anticuerpo puede ser no recombinante, recombinante o humanizado. El anticuerpo puede ser de un isotipo de inmunoglobulina, p.ej., IgG, IgM y similares. Adicionalmente, se puede usar un agregado, un polímero, un derivado y un conjugado de una inmunoglobulina, o un fragmento de los mismos, cuando sea apropiado.
Otro aspecto de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 es el uso de un elemento seleccionado del grupo que consiste en una cepa, un polinucleótido, un fragmento, un vector, una célula hospedante, un polipéptido de la invención para la detección de un CHIKV asociado a una arbovirosis, o para la preparación de una composición que evite y/o trate una arbovirosis.
Otro aspecto de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 es un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento del mismo que se une específicamente a un polipéptido de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 para la detección de un CHIKV asociado a arbovirosis.
Otro aspecto de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a una composición para tratar y/o prevenir una arbovirosis. La composición de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 comprende de forma ventajosa al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en una cepa, un polinucleótido, un fragmento, un vector, una célula hospedante, y un polipéptido de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13. La composición de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 puede comprender además un vehículo aceptable. En un aspecto relacionado, la descripción proporcionar un método para tratar y/o prevenir una arbovirosis. El método comprende la etapa de administrar a un sujeto que lo necesite una composición de la invención.
Tal como se usa en la presente memoria, el término “tratar” se refiere a un proceso mediante el cual el desarrollo de una infección de un CHIKV se ve afectado o es eliminado completamente. Tal como se usa en la presente memoria, el término “prevenir” se refiere a un proceso mediante el cual la infección de CHIKV se ve obstruida o retrasada.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “un vehículo aceptable” significa un vehículo para contener los componentes (o elementos) de la composición de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 que puede administrarse a un hospedante animal sin efectos adversos. Los vehículos adecuados conocidos en la técnica incluyen, aunque sin limitación, partículas de oro, agua esterilizada, disolución salina, glucosa, dextrosa o disoluciones tamponadas. Los vehículos pueden incluir agentes auxiliares que incluyen, aunque sin limitación, diluyentes, estabilizantes (es decir, azúcares y aminoácidos), conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes tamponantes de pH, aditivos potenciadores de la viscosidad, colorantes y otros similares.
La cantidad de componentes de la composición de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 preferiblemente es una cantidad terapéuticamente efectiva. Una cantidad terapéuticamente efectiva de componentes de la composición es la cantidad necesaria para permitir a la misma que desempeñe su función de prevención y/o tratamiento contra una infección de CHIKV sin provocar efectos negativos excesivos en el hospedante al que se administre la composición. La cantidad exacta de componentes a usar y la composición a administrar variarán de acuerdo a factores tales como el modo de administración, así como de los demás ingredientes de la composición.
La composición de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 puede administrarse a un hospedante (tal como un humano) a través de varias rutas de administración. Por ejemplo, la composición se puede administrar en la forma de preparaciones esterilizadas inyectables, tales como suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables esterilizadas. Dichas suspensiones pueden formularse de acuerdo a técnicas conocidas en la técnica usando agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión adecuados. Las preparaciones inyectables esterilizadas también pueden ser disoluciones o suspensiones inyectables esterilizadas en diluyentes o disolventes no tóxicos y parenteralmente aceptables. Pueden administrarse parenteralmente, por ejemplo intravenosamente, intramuscularmente o subcutáneamente mediante inyección, por infusión o per os. Las dosis adecuadas variarán dependiendo de factores tales como la cantidad de cada uno de los componentes de la composición, el efecto deseado (a corto o largo plazo), la ruta de administración, la edad y el peso del hospedante a tratar. Se puede usar cualquier otro método bien conocido en la técnica para la administración de la composición de la invención.
Otro aspecto adicional de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 es el uso de una composición como la definida por las reivindicaciones 1-13 para la preparación de un medicamento para tratar y/o prevenir una arbovirosis en un sujeto que lo necesite.
Otro aspecto adicional de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 es proporcionar un kit para la detección de un CHIKV asociado a una arbovirosis, que comprende al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en una cepa, un polinucleótido, un fragmento, un vector, una célula hospedante, un polipéptido de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 y anticuerpos monoclonales o policlonales, o un fragmento del mismo, que se una específicamente a un polipéptido de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1
13. Los kits de acuerdo con esta realización de la invención pueden comprender paquetes, que comprenden cada uno o más de los elementos mencionados (típicamente en forma concentrada) que son requeridos para llevar a cabo los ensayos respectivos diagnósticos.
EJEMPLOS
Los ejemplos mostrados a continuación destacarán otras características y ventajas de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13, y servirán para ilustrar el alcance del uso de la presente invención y no para limitar su alcance. Es posible usar otros métodos o productos equivalentes a los presentados a continuación para evaluar o para llevar a cabo la presente invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13, se describen los materiales y métodos preferidos.
EJEMPLO 1: Identificación y caracterización de virus CHIK que causan el brote del Océano Índico
Los inventores (alguna vez referidos en la presente memoria como “nosotros”) presentan la secuencia genómica casi completa de seis elementos aislados clínicos seleccionados, junto con las secuencias parciales de la glicoproteína E1 de un total de 60 pacientes de las Islas Reunión, Seychelles, Mauricio, Madagascar y Mayotte. Los presentes resultados indican que el brote se inició con una cepa relacionada con elementos aislados de África Oriental, a partir de la cual han evolucionado variantes víricas siguiendo una historia de microevolución trazable. Se han identificado las características moleculares únicas de los elementos aislados del brote. De manera destacada, en la región que codifica para las proteínas no estructurales, se encontraron diez cambios de aminoácido, tres de los cuales están localizados en posiciones conservadas del alfavirus de nsP2 (que contiene actividades de helicasa, proteasa y ARN trifosfatasa) y de la polimerasa nsP4. El único elemento aislado obtenido de fluido cerebroespinal de un paciente presentó cambios únicos en nsP1 (T301I), nsP2 (Y642N) y nsP3 (eliminación de E460). En la región de la proteína estructural, se observaron dos cambios destacables (A226V y D284E) en la glicoproteína E1 de fusión de membrana. Una modelización 3D de homología permitió el mapeo de estos dos cambios en regiones que son importantes para el ensamblaje de virión y para la fusión de membrana. El cambio E1-A226V estaba ausente en las cepas iniciales pero se observó en >85% de las secuencias víricas subsiguientes de Reunión, lo que denota el éxito evolucionario debido posiblemente a una adaptación del vector mosquito.
MATERIALES Y MÉTODOS
Pacientes. Los 60 pacientes para los que se determinó la secuencia de nucleótidos de CHIKV parcial o completa procedían de Reunión (N=43), Seychelles (N=3), Madagascar (N=7), Mayotte (N=4) y Mauricio (N=3). Las características de los pacientes y las muestras biológicas se incluyen en la Tabla 1.
Aislamiento de virus y extracción de ARN. Los virus fueron aislados a partir de suero o de fluido cerebroespinal (CSF) (Tabla 1). Resumidamente, se inocularon células C6-36 de Aedes albopictus con 1 mL de suero o CSF diluido
1:10 en medio L15 (Gibco). Las células fueron cultivadas a 28ºC en L15 suplementado con un 5% de suero fetal bovino y un 10% de triptosa-fosfato. Las células y los sobrenadantes fueron recolectados tras el primer pasaje (5 días) y el segundo pasaje (7 días). Los elementos víricos aislados fueron identificados como CHIKV mediante inmunofluorescencia indirecta, usando fluido ascítico de CHIKV hiper-inmune. En el caso de los elementos aislados 05.115, 06.21, 06.27 y 06.49, cuyos genomas fueron secuenciados, la ausencia de fiebre amarilla, dengue y virus de Nilo Occidental se confirmó mediante inmunofluorescencia indirecta usando sueros específicos. El ARN fue extraído usando el Minikit Vírico QIAAmp (Qiagen, Francia).
Secuenciamiento de nucleótidos. Se diseñaron cebadores (Tabla 4) en base a la secuencia de nucleótidos 20 de la cepa S27. Se llevó a cabo una RT-PCR usando el kit de RT-PCR Titan One Tube (Roche, Francia). Los fragmentos de RT-PCR fueron purificados mediante ultrafiltración antes del secuenciamiento (Millipore, Francia). Las reacciones de secuenciamiento se llevaron a cabo usando el kit de secuenciamiento en ciclos BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystems, EE.UU.) y se purificó mediante precipitación con etanol. Los cromatogramas de secuencia se obtuvieron en analizadores de secuencia automáticos ABI3100 ó ABI3700 (Applied Biosystems). Todos los amplicones fueron secuenciados en ambas cadenas.
Ensamblaje de secuencias genómicas y análisis de secuencias. El ensamblaje de contig se llevó a cabo independientemente por distintos operadores y software, usando BioNumerics versión 4.5 (Applied-Maths, SintMartens-Latem, Bélgica) o PhredPhrap / Consed [11]. Ambos análisis dieron lugar exactamente a la misma secuencia de consenso para todas las cepas. Se obtuvo un contig individual de 11.601 nt para cinco elementos aislados, mientras que para la cepa 05.61 faltaba una porción de la secuencia, entre las posiciones S27 5.246 y
5.649 (posiciones 390 a 524 de nsP3). Los alineamientos de secuencia y el cálculo de tablas de sustitución se llevaron a cabo usando los programas BioNumerics, DNASP versión 4.10 [12] y DAMBE versión 4.2.13 [13]. Los alineamientos de secuencias de nucleótidos y aminoácidos frente a secuencias de alfavirus seleccionadas se llevaron a cabo con el software ClustalW1.7 [14]. Las identidades de secuencia se calcularon con el paquete Phylip [15]. La estructura secundaria de ARN fue predicha con el servidor de estructura secundaria de ARN Vienna [16]. Se construyeron árboles de unión vecina usando MEGA versión 3.1 [17] con las correcciones de parámetros de múltiples sustituciones Kimura-2. La fiabilidad de los nodos se determinó mediante remuestreo de cincha con 1.000 réplicas. Las cantidades de sustituciones sinónimas por sitio sinónimo (Ks) y de sustituciones no sinónimas por sitio no sinónimo (Ka) fueron estimadas usando DNASP. Se usó RDP2 [18] para detectar secuencias mosaico putativas.
Modelización de estructura 3D. La estructura cristalográfica del ectodominio de la glicoproteína E1 de Virus Semliki Forest (SFV) a pH neutro [19]; Protein Data Bank código 2ALA) se usó como plantilla para modelizar y analizar las dos mutaciones de aminoácido de los elementos aislados del Océano Índico. La Figura 2 se preparó usando el programa RIBBONS [20].
Detección de focos víricos mediante tinción inmunológica. Se cultivaron células AP61 de Aedes pseudoscutellaris en una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos en medio de crecimiento Leibovitz L-15 con un 10% de suero fetal de ternero (FCS) inactivado térmicamente durante 24 h. Las monocapas de células de mosquito se lavaron una vez con Leibovitz L-15 y se añadieron 0,2 mL de Leibovitz L-15/FCS al 2%. Las células fueron infectadas con virus CHIK en 0,2 mL de Leibovitz L-15/FCS al 2% y se incubaron a 28ºC durante 1 h. A continuación se añadió por encima un medio que consistía en 0,4 mL de Leibovitz L-15/FBS al 2% y carboximetilcelulosa (CMC) (1,6%), y las placas de cultivo de tejido se incubaron a 28ºC durante 2 días. Los focos de células infectadas fueron visualizados mediante inmunoensayo de foco (FIA). Las células fueron lavadas con PBS, fijadas con un 3% de paraformaldehído (PFA) en PBS durante 20 minutos y permeabilizadas con un 0,5% de Triton X-100 en PBS durante 4 minutos a temperatura ambiente. Las células fijadas se incubaron durante 20 minutos a 37ºC con una dilución
1:2.000 de fluido ascítico de ratón hiper-inmune (HMAF) dirigido contra CHIKV. Se usó IgG anti-ratón de cabra, conjugada a peroxidasa de rábano como segundo anticuerpo (dilución 1:100) a 37ºC durante 20 minutos. Los focos fueron visualizados con Sustrato de Peroxidasa DAB (Sigma).
1. Estructura genómica y firmas moleculares de los virus de chikungunya del brote del Océano Índico
Organización de genoma. Determinamos las secuencias genómicas casi completas de seis elementos aislados de CHIKV (05.115, 05.61, 05.209, 06.21, 06.27 y 06.49) que representan distintos orígenes geográficos, puntos temporales y formas clínicas (Tabla 1) del brote del Océano Índico de virus de chikungunya. Se determinaron 11.601 nucleótidos, correspondientes a las posiciones 52 (5’NTR) a 11.667 (3’NTR, extremo del tercer Elemento de Secuencia de Repetición) en la secuencia de nucleótidos del elemento aislado de Tanzania de 1952 S27 (longitud total de 11.826 nt). Había tres eventos de inserción/eliminación entre el S27 y los elementos aislados de Reunión, dos de los cuales fueron observados en el 3’NTR. En primer lugar, la tira interna de poli-A de 14 nucleótidos
observada en S27 (11.440-11.443) y correspondiente a un sitio poli-A interno probable [9] estaba sustituida por una tira de solo 5 A en los elementos aislados del Océano Índico, algo similar a lo observado en otros virus de Chikungunya, p.ej. la cepa Ross (nº de acceso: AF490259). En segundo lugar, faltaba una A en los elementos aislados del Océano Índico en una tira de 5-A en la posición 11.625 de S27. Finalmente, faltaba un codón en el elemento aislado 06.27, correspondiente a al codón 460 de nsP3, en el cual todos las demás secuencias de alfavirusde elementos aislados del Océano Índico analizadas y disponibles son GAA, que codifica para Glu.
Las secuencias genómicas de los seis elementos aislados presentados en la presente memoria fueron similares a las publicadas previamente para alfavirus [9, 21, 22]. Las secuencias codificadoras consistían en dos marcos de lectura abierta (ORF) grandes de 7.422 nt y 3.744 nt que codifican la poliproteína no estructural (2.474 aminoácidos) y la poliproteína estructural (1.248 aminoácidos), respectivamente. La poliproteína no estructural es el precursor de las proteínas nsP1 (535 aa), nsP2 (798 aa), nsP3 (530 aa) y nsP4 (611 aa) y la poliproteína estructural es el precursor de las proteínas C (261 aa), p62 (487 aa, precursor de E3 – 64 aa – y E2 – 423 aa), 6K (61 aa) y E1 (439 aa). Los sitios de ruptura característicos de la familia de alfavirus en las poliproteínas no estructurales y estructurales se conservaban. Los sitios de glicosilación en E3, E2 y E1 también se conservaban. Se identificó una secuencia de intersección de 65 nt entre el codón de parada (TAG, 7499-7501) del ORF no estructural y el codón de inicio (75677569) del ORF estructural. La región no traducida 5’ (5’NTR) acababa en la posición 76. La región 3’NTR comenzaba en la posición 11.314 y contenía tres elementos de secuencia de repetición (RSE) con estructuras secundarias predichas (Figura 26) que eran consistentes con el trabajo previo [9].
Diferencias entre los elementos aislados del brote del Océano Índico y la cepa S27. En comparación con la cepa S27, el elemento aislado 05.115 de Reunión presentó 28 cambios de aa (1,13%) en las proteínas no estructurales (Tabla 5, con la mayor proporción en nsP3 (2,26%) y la menor en nsP2 (0,6%). Diez de cada 12 cambios de aminoácido en nsP3 estaban concentrados entre las posiciones 326 y 524 (5,0% de variación), similar a lo observado en los virus ONN [23]. Una diferencia importante con la S27 fue que los elementos aislados del Océano Índico exhibieron un codón de parada opal (UGA) en el codón 524 de nsP3, en lugar de Arg (CGA) en la S27. Este codón opal ha sido observado en alfavirus relacionados [9, 22, 23], y se cree que regula la expresión de nsP4, la ARN polimerasa putativa, a través de un mecanismo de lectura directa [21, 24].
En comparación con la S27, las proteínas estructurales mostraron de 21 (1,68%, para 05.115) a 22 (1,76%, para otros elementos aislados) sustituciones de aminoácidos en los elementos aislados del Océano Índico (Tabla 6). Cabe destacar que la proteína de envoltura E2 mostró la mayor variación, con 14 cambios de aa (3,3%), mayor que la proteína de envoltura E1 (0,68%) y que la proteína de cápsida (0,38%). La ratio de tasas de evolución de sitios sinónimos y no sinónimos (Ks/Ka) entre los elementos aislados S27 y 05.115 fue de 11,0 para la poliproteína completa, mientras que fue de tan solo 6,12 para la proteína E2, indicativo probablemente de una selección positiva en favor de cambios de aminoácido en esta proteína inmunogénica. Por comparación, la ratio Ks/Ka fue de 18,75 para la poliproteína no estructural.
Firmas moleculares del brote del Océano Índico en proteínas no estructurales y variación fenotípica. Diez posiciones (que excluyen posiciones polimórficas) presentaron aa que eran únicos para las proteínas no estructurales de los elementos aislados del brote, en comparación con otras secuencias de CHIKV (Tabla 2). En primer lugar, la nsP2-54 fue Asn en los elementos aislados del Océano Índico y en el SFV, pero fue Ser en todas las demás secuencias. En segundo lugar, la nsP2-374 fue Tyr en los elementos aislados del Océano Índico, pero fue His o Asn en otras secuencias de alfavirus (Tabla 2). En tercer lugar, la posición 500 en la nsP4 fue Leu en las secuencias del Océano Índico en lugar de Gln en las otras cuatro secuencias de CHIKV publicadas. De forma interesante, esta posición, que tiene aproximadamente 30 aa desde la estructura catalítica “GDD”, es una Glu estrictamente conservada en todos los demás alfavirus. Los otros siete cambios restantes tuvieron lugar en regiones relativamente variables.
Se observaron cambios específicos adicionales en los elementos aislados 05.209 (S358P) y 06.27 (nsP1-T301I, nsP2-Y642N y nsP3-460del). Cabe destacar que nuestros ensayos fenotípicos llevados a cabo en paralelo mostraron diferencias para la cepa 06.27. El inmunoensayo de foco mostró que las reservas de CHIKV 05.115, 06.21, 06.27 y 06.49 formaban mezclas de focos con diferentes tamaños en células C6/36 de Ae. Albopictus (datos no mostrados) y células AP61 de Ae. pseudoscuterallis (Figura 27). De forma interesante, solo el elemento aislado 06-27 formó focos medios, mientras que otros formaron minutas y focos pequeños. El fenotipo particular del 06.27 podría estar ligado a las diferencias de aa observadas en las proteínas no estructurales, que están implicadas en la replicación vírica [21].
Firmas moleculares de Océano Índico en proteínas estructurales y modelización 3D. Al analizar las secuencias de aa de las proteínas estructurales, se observaron siete posiciones (cuatro en la E2, una en la 6K y dos en la E1) queeran únicas para los elementos aislados procedentes del brote del Océano Índico (Tabla 2). Dos de éstas estaban localizadas en el ectodominio de E2, identificándose Thr 164 y Met 312 en nuestros elementos aislados en lugar de Ala y Thr, respectivamente, en todas las demás secuencias de CHIKV disponibles (Tabla 2). La primera de estas dos posiciones es variable en los alfavirus; se encuentra en una región definida previamente como que contiene epítopos neutralizantes [5, 25]. En la posición 312, la Thr está presente en otros CHIKV, en ONNV y en SFV, pero varía en otros alfavirus; se encuentra en una región identificada como importante para la oligomerización E1-E2 [5, 25].
En la E1 se observaron dos sustituciones cruciales, una en el residuo 284, específica de los elementos aislados del Océano Índico, y una en el residuo 284, presente en 3 de los 6 elementos aislados del Índico (06.21, 06.27 y 06.49). Ambas mutaciones fueron mapeadas en la estructura 3D (modelada a partir de la estructura cristalina de la E1 de SFV) de la Figura 1. De forma interesante, el residuo 226 es Ala en todas las secuencias de CHIKV publicadas (Tabla 2), y también fue Ala en el primero de nuestros elementos aislados del Océano Índico secuenciado aquí
(05.61 y 05.115, obtenidos al principio del brote). Todos los elementos subsiguientes (obtenidos de pacientes recopilados en noviembre y diciembre de 2005) presentaron un residuo Val en esta posición. Aunque la posición 226 es relativamente variable entre los alfavirus, se observó que una única mutación en esta posición (Pro a Ser) permitía al SFV adaptarse para crecer en células de insecto agotadas en colesterol [26, 27].
El otro aa único observado en la E1 procedente de elementos aislados del Océano Índico fue la Glu 284. Ésta es una posición altamente conservada en la E1, que presenta una Asp en la mayoría de los alfavirus o una Asn en SIN (Tabla 2). Este aminoácido está localizado en la interfaz entre los protómeros de E1 de la superficie del virión, participando en los contactos que constituyen la estructura icosahédrica de la E1 (Figura 1).
2. Análisis filogenético
Trabajos previos basados en secuencias de proteína E1 mostraron una fuerte estructura filogeográfica de las especies de virus Chikungunya [6, 10]. A fin de determinar el filogrupo progenitor del cual emergieron los elementos aislados del brote del Océano Índico, comparamos una región de 1.044 nt dentro de la secuencia codificadora de la E1 (posiciones 271 a 1314, es decir, los codones 91 a 438) de 63 especímenes biológicos procedentes de 60 pacientes de Reunión, Seychelles, Madagascar, Mayotte y Comoros (Tabla 1) con otras 29 secuencias de Chikungunya disponibles (Tabla 7). El análisis filogenético (Figura 2) demostró claramente que los presentes elementos aislados del Océano Índico representan un subgrupo homogéneo dentro de un amplio grupo (grupo ECSA) que comprende los elementos aislados de África Oriental, Central y del Sur (ECSA, Figura 2). Los elementos aislados procedentes de un brote de la República Democrática del Congo [6] también formaron un subgrupo homogéneo dentro del grupo ECSA. No había ningún miembro del grupo ECSA que mostrase una relación significativamente más estrecha con los elementos aislados del Océano Índico. Los elementos aislados asiáticos estaban menos relacionados con los elementos del Océano Índico y constituían el grupo hermano del grupo ECSA, mientras que los elementos aislados de África Occidental eran incluso más divergentes. La inclusión de otros alfavirus, que incluyen el pariente ONN más próximo, colocó la raíz de los elementos aislados de Chikungunya en larama que conduce al filogrupo de África Occidental (datos no mostrados).
La comparación de las secuencias de los elementos aislados del brote del Océano Índico con la secuencia S27 reveló 316 sustituciones de nucleótidos (2,7%) en el elemento 05.115 (Tabla 8). La cepa Nagpur del subgrupo asiático mostró un 5,1% de divergencia de nucleótidos media respecto al 05.115, mientras que la cepa 37997 de Senegal del subgrupo de África Occidental mostró un 15% de diferencia (Tabla 8). De forma interesante, la última cepa mostró una conservación completa de una porción de 87 nucleótidos (9.958 – 10.045 en la intersección entre las proteínas estructurales 6K y E1) con los elementos aislados del brote de África Oriental y del Océano Índico. La identidad de secuencia en esta porción puede reflejar un evento pasado de recombinación genética entre las cepas de África Occidental y de África Oriental/Central. De manera diferente, no observamos ninguna evidencia estadística (P > 7E-2) para el mosaicismo o recombinación de secuencias desde la separación entre los elementos S27 y de Reunión, aunque algunas regiones genómicas difirieron en su densidad de polimorfismos de nucleótido.
3. Variación genotípica y fenotípica entre los elementos aislados del brote del Océano Índico y el escenario de microevolución
Se observaron cambios específicos de aa en las proteínas no estructurales en los elementos 05.209 (S358P) y
06.27 (nsP1-T301I, nsP2-Y642N y nsP3-460del). En las proteínas estructurales, se observó el cambio E1-A226V en los elementos aislados 06.21, 06.27 y 06.49, y el cambio E2-Q146R en el elemento aislado de Seychelles 05.209. Además de estos cambios no sinónimos, había 8 sustituciones silenciosas, observadas en 05.209, 06.27 y 06.49 (Tabla 3).
Se dedujo una historia de evolución de secuencia probable producida durante el brote (Figura 3) a partir de las 14 variaciones de aminoácido observadas en los seis genomas completos (Tabla 3). El elemento aislado 05.61 se seleccionó inicialmente para análisis de genoma debido a que se aisló en marzo de 2005, al inicio del brote, a partir de un paciente de Reunión que volvía de la Isla de Comoros, donde el brote había estado en desarrollo desde enero de 2005. De forma destacable, los elementos aislados 05.61 y 05.115 (que fue el segundo elemento analizado), el elemento aislado africano S27 y otros elementos aislados previos de Chikungunya no relacionados procedentes de África y Asia fueron idénticos en los 14 sitios polimórficos. Por tanto, la secuencia de consenso de los elementos aislados 05.61 y 05.115 (secuencia de consenso 1) probablemente representan el genotipo ancestral del brote de Reunión. La distribución de los 14 polimórficos sugirió que este fundador dio lugar a tres secuencias de consenso que probablemente evolucionaron en cuatro etapas. En primer lugar, la sustitución en la posición de genoma 10.670 (que provoca el cambio A226V en la E1) dio lugar a la secuencia de consenso 2, representada por el elemento aislado de finales de noviembre de 2005 06.21. En segundo lugar, una sustitución sinónima de G a A en la posición
6.547 (nsP4) condujo a una secuencia intermedia, que a su vez dio lugar a dos secuencias posteriores: la secuencia de consenso 3 (elemento 06.27), seguida de cuatro sustituciones adicionales y una eliminación de codón (Tabla 3), y
la secuencia de consenso 4 (06.49), que surgió tras tres sustituciones sinónimas distintas (Tabla 3). Se representó una quinta secuencia de consenso solo a través del elemento aislado de Seychelles 05.209, que exhibió cuatro sustituciones (dos de ellas produciendo cambios de aa en nsP3-S358P y en E2-Q146R) en comparación con la secuencia de consenso 1 (Figura 3).
Puesto que los elementos aislados de Reunión tenían E1-226A en el comienzo del brote y E1-266V A en el comienzo del brote y E1-266V más tarde durante la epidemia, comparamos el residuo 226 en 57 secuencias adicionales (57 secuencias procedentes de 54 sueros y 3 CSF) de la epidemia del Océano Índico. De forma destacable, la naturaleza de E1-226 difirió totalmente en la Isla Reunión antes y después de la temporada de invierno. Cincos secuencias tomadas de pacientes entre marzo y junio de 2005 (que incluyen la secuencia procedente de un viajero que volvía de Comoros) tenían E1-226A. Entre septiembre y finales de diciembre de 2005, 21 secuencias mostraron E1-226V. Entre las 17 secuencias de Reunión de 2006, se observó E1-226V 12 veces y E1-226A 5 veces (Tabla 1). En las secuencias de Madagascar y Seychelles, para las cuales las muestras fueron tomadas cuando se sospecharon los primeros casos clínicos (es decir, probablemente al comienzo de los brotes), solo se observó el E1-226 Ala. En las secuencias de Mayotte de 2006, solo se observó el E1-226 V. En las secuencias de Mauricio de 2006, se observaron ambos, E1-226 Ala y Val.
Hasta la fecha, solo las cepas de CHIKV de laboratorio, pasadas muchas veces sobre células de mosquito o mamífero, habían sido secuenciadas completamente [9]. Nosotros proporcionamos por vez primera secuencias de nucleótidos casi completas de seis elementos aislados clínicos pasados in vitro solo una o dos veces (véase la sección de Materiales y Métodos). La presencia de pacientes infectados de una población vírica mixta, denominada cuasi-especie [31-33], con genotipos que coexisten en un equilibrio gobernado por el compromiso entre la mutación y la selección natural. La presencia en S27 de un codón de Arg en lugar del codón de parada opal de los elementos aislados del Océano Índico se explica probablemente por numerosos pasajes in vitro del S27, ya que la evolución de opal a Arg fue observada experimentalmente en virus ONN [23]. Aunque puede ser ventajoso para las cuasiespecies víricas mantener el codón opal in vivo, un codón Arg probablemente confiera una ventaja selectiva in vitro, como se ha observado para el virus Semliki Forest estrechamente relacionado [34]. La situación in vivo de la cuasiespecie de virus Chikungunya también podría explicar el polimorfismo nsP1-T301I observado para el elemento aislado LCR 06.27. De hecho, es probable que la selección de un subconjunto de genotipos que albergan este cambio pueda asociarse con la invasión del LCR [33]. Estos resultados subrayan que la secuencia genómica de cepas “de referencia” de laboratorio pueda no reflejar de manera precisa la situación natural, ya que la complejidad genotípicas de la cuasi-especie in vivo está sujeta a erosión en la selección in vitro. Puesto que los elementos de aislamiento del Océano Índico secuenciados aquí fueron sometidos a selección in vitro solo durante unas pocas generaciones, probablemente se corresponden más estrechamente a los genotipos in vivo que las cepas de Chikungunya secuenciadas previamente.
Las diferencias de aminoácidos (aa) detectadas entre los elementos aislados del brote 1 pueden estar relacionadas con características biológicas y patogénicas del virus. Aunque nuestros resultados de cultivo vírico son preliminares, demuestran claramente diferencias fenotípicas entre el elemento aislado único procedente de CSF (06.27), aislado de un caso de encefalopatía neonatal, y los otros tres elementos aislados, asociados a la forma clásica de la enfermedad o encefalopatía. Los mayores focos observados en el cultivo con 06.27 podrían reflejar una mayor tasa de replicación del virus y estar ligados a los cambios de aminoácidos específicos identificados en nsP1, nsP2 y nsP3. Se ha demostrado previamente que los cambios individuales de aminoácido en la nsP1, que incluyen un cambio Thr/Ile (residuo 538 del virus Sindbis) [35,36] y una eliminación de 18 nt en la nsP3 afectan a la neurovirulencia en otros alfavirus [35-37]. Sin embargo, en ausencia de datos estructurales de nsP1, es difícil de predecir el impacto estructural o funcional del cambio I301T observado en el elemento aislado 06.27. También podría destacarse que todas las secuencias víricas determinadas a partir de suero o los elementos aislados procedentes de tres casos de encefalopatía neonatal y un caso de meningo-encefalitis adulto presentaron E1-226 Val. Sin embargo, puesto que este genotipo también se observa en las formas clásicas de la enfermedad, una potencial relación entre E1-226 Val y la neuropatogénesis necesita más estudios. Los factores de hospedante deben ser considerados en la aparición de formas neurológicas de la enfermedad. Por ejemplo, el paso hematoencefálico puede verse favorecido a edad joven o hipertensión.
Las firmas moleculares únicas de los genomas del brote del Océano Índico fueron identificadas cuando se compararon con las demás secuencias de alfavirus publicadas. Estas características representan dianas interesantes para futuros estudios funcionales, así como para seguimiento epidemiológico. Una característica particularmente interesante fue el residuo E1-226 Val (ver arriba). Otra firma molecular interesante de los genomas del brote del Océano Índico fue E1-284 Asp. Aunque el modelo seudo-atómico de estructura usado tiene una resolución modesta (la resolución de la estructura cristalina es limitada – aproximadamente 3Å – y el modelo es el resultado de ajustar esta estructura en una reconstrucción de microscopía crio-electrónica de 9Å de resolución), parecer ser que la cadena lateral de la Asp 284 interacciona con la cadena principal de un polipéptido E1 adyacente del virión. De hecho, se encuentra en una posición compatible con la aceptación de un enlace de hidrógeno de la amida 379 de la cadena principal del promotor E1 vecino. Puesto que el empaquetamiento es muy apretado (véase la Figura 1B), es posible que la cadena lateral de mayor longitud del ácido glutámico (que tiene un grupo CH2 extra en comparación con Asp o Asn) pueda introducir una ligera distorsión en los sitios de contacto, un efecto que se propaga por la simetría icosahédrica T=4 del virión. Por tanto, un efecto cooperativo debido a este cambio en la
posición Asp 284 puede desempeñar una función a la hora de permitir un ensamblaje menos eficiente de nuevas partículas en células infectadas, o un proceso de desensamblaje de partícula más eficiente durante la invasión de una nueva célula, o una combinación de ambos. Esta información puede guiar nuevos estudios de mutagénesis sito-dirigida, usando genética inversa, para evaluar el efecto de la sustitución Asp/Glu en el ciclo del virus.
Ejemplo 2: Identificación y caracterización de una forma soluble de E2 (sE2) del virus CHIK.
El plásmido TOPO/CHIK-21.pE2 (CNCM I-3587) que contiene el ADNc que codifica para la glicoproteína pE2 (E3+E2) procedente de la cepa de virus CHIK 21 (Schuffenecker et al., Plos Med., 3: 1058, 2006) se usó como plantilla para la amplificación mediante PCR de la secuencia de ectodominio de la glicoproteína de envoltura E2 (Figura 29). El ectodominio de gp-E2 (E2-1 a E2-364; 85% de E2) está conservado estrictamente entre las líneas celulares CHIK-21, 27, 49 y 115 aisladas del Océano Índico durante el brote epidémico de 2005-06 (véase la Figura 29). La forma soluble de la sE2 se corresponde con el ectodominio de gp-E2 que está eliminado en el extremo carboxílico de su región de anclaje de transmembrana. Es interesante destacar que la forma soluble porta los epítopos principales que activan los anticuerpos neutralizadores del virus. Los cebadores de PCR se describen en la Figura 30 (SEQ ID NO: 79 y 80): permiten la clonación de la secuencia sE2 entre los sitios únicos Bg/II y NotI del vector pMT/BiP/V5-HisA (Invitrogen), por un lado en una fase dependiente del péptido señal BiP del extremo N-terminal, y por otro lado en la unión sucesiva de etiquetas V5 (His)6 en su extremo carboxílico.
Se transfectaron células S2 de Drosophila con el plásmido recombinante pMT/BiP/CHIK-sE2 en presencia del plásmido que codifica para el gen de resistencia a blasticidina. La línea celular estable S2/CHIK-sE2 se obtuvo mediante pasajes sucesivos en presencia de blasticidina. La línea celular se seleccionó por su capacidad para promover la secreción eficiente del virus CHIK-sE2 tras la activación del promotor de metalotioneína.
Las células S2/CHIK-sE2 en suspensión fueron inducidas para la secreción de sE2 durante 21 días en presencia de Cu2+. El sobrenadante celular se filtra a 0,22 μM y se concentra durante 16 horas en una columna de afinidad de 5 mL HiTrap Chelating HP (Amersham Biosciences) con la ayuda de una bomba peristáltica. La proteína CHIK sE2 es eluída de la columna de afinidad en presencia de concentraciones crecientes de imidazol (50, 100 y 500 mM, pH 8). La proteína CHIK sE2 es eluída específicamente a una concentración de imidazol de 500 mM (elución E3) de la fracción E37 (Figura 31). La proteína sE2 se detecta como altamente purificada en PAGE SDS tras coloración con Azul de Coomassie. La proteína sE2 eluída en la fracción E39 es inmunodetectada específicamente a través de un ascite (HMAF) de un ratón hiper-inmunizado contra el virus CHIK que fue producido en la unidad IMFH (Figura 32). No se observó reactividad cruzada con el HMAHF anti-dengue (DEN) o anti-Nilo Occidental (WN) y el anticuerpo monoclonal 9D12 anti-DEN E. Las proteínas solubles DEN sE (DEN-3 y DEN-4) y WN sE purificadas a partir de los sobrenadantes de clones celulares S2 inducidos según el protocolo descrito antes en la presente memoria se usan como antígenos víricos de control para la especificidad de los anticuerpos murinos anti-CHIK.
Ejemplo 3: Construcción del vector TRIP que expresa la forma soluble de E2 (sE2) del virus CHIK según la presente invención.
El gen que codifica la proteína CHIK sE2 ha sido optimizada por la firma Genecust de tal modo que proporcione un ADN sintético con un contenido de G+C enriquecido en comparación con el ADNc obtenido del ARN genómico vírico. Los codones ricos en G+C (aminoácidos E2-1 a E2-364, ectodominio gp-E2 soluble, sE2) fueron fusionados a la secuencia de péptido señal de calreticulina humana (ssCRT) MLLSVPLLLLGLLGLAA (SEQ ID NO: 77) para la traslocalización de la proteína vírica en el mecanismo de secreción. Los sitios de la enzima de restricción BamHi en 5’ y XhoI en 3’ han sido añadidos en sus respectivos extremos de las secuencias que codifican para la proteína de fusión ssCRT+sE2.
El gen sintético se clonó en el vector TRIP entre los sitios BamHI y XhoI bajo la transcripción del promotor ieCMV. El plásmido no replicativo e integrativo TRIP/CHIK.sE2 producido de este modo fue validado para la expresión de la proteína sE2 tras la transducción de células 293.
Tal como se muestra en la Figura 33, los inventores han construido un vector que expresa la CHIK sE2. Tal como se ha mencionado anteriormente, la secuencia CHIK sE2 original clonada en el vector TRIP ha sido modificada para mejorar la expresión en células de mamífero (Figura 34).
La Figura 35 muestra células de mamífero, tales como las células 293, transducidas con el vector TRIP-CHIK.sE2. La proteína sE2 expresada ha sido revelada mediante IF con anticuerpos anti-CHIK.
Ejemplo 4: Producción de proteína recombinante sE2 y anticuerpos monoclonales específicos.
Los inventores han generado la línea celular S2/CHIK.sE2 inducible estable que libera la forma soluble de la glicoproteína E2 de envoltura (sE2) procedente de cepas de virus CHIK de Reunión. Los inventores también han generado una línea celular estable 293A/CHIK.sE2 que fue transducida mediante vector lentiviral recombinante TRIP/CHIK.sE2. Debía usarse un gen sE2 sintético que fue modificado para uso óptimo de codón en células de mamífero con el objetivo de obtener una expresión eficiente de sE2 de virus CHIK en células 293A fibroblásticas humanas. El vector TRIP/CHIK.sE2 se caracteriza actualmente por su capacidad para inducir inmunidad protectora
en un modelo murino de infección experimental. La suspensión vírica enriquecida principalmente en CHIK pE2 (precursor de E2 o E3E2) se obtuvo solubilizando viriones de CHIK cultivados en células de mosquito con Triton X
100. Se hiper-inmunizó ratones adultos con CHIK pE2 en presencia de un adyuvante a fin de generar un hibridoma dirigido contra proteínas estructurales de CHIK. Los anticuerpos monoclonales anti-CHIK E2 producidos mediante 5 hibridoma de ratón fueron caracterizados mediante un ensayo ELISA sobre virión de CHIK altamente purificado y análisis de transferencia “Western blot” sobre sE2 secretada de la línea celular estable S2/CHIK.sE2 (Figuras 50, 51 y Tabla 9). Los ensayos de inmunodetección fluorescente de antígenos víricos intracelulares o superficiales también fueron establecidos en células VERO infectadas por virus CHIK y la línea celular transducida 293A/CHIK.sE2 estable (Figuras 52-55). Los Mabs anti-CHIK.sE2 de los inventores tienen uso potencial en el desarrollo de diagnosis vírica
10 temprana de la enfermedad de CHIK en base a la inmunocaptura de viriones de CHIK en sangre virémica de pacientes, y como herramientas para estudios inmunológicos y virológicos.
Tabla 1. Características de los pacientes.
- Paciente nº
- Isla Región o Isla Ciudad o Localidad Muestra (b) Fecha de muestreo Síntomas clínicos (c) Elemento vírico aislado nº (d) E1-226 (e)
- 15
- Reunión Sur La Riviève St Louis S 23-Nov-05 Clásicos 06.45 V (**)
- 16
- Reunión Sur La Riviève St Louis (parents) S 28-Nov-05 ME neonatal 06.21 (G) V (***)
- 17
- Reunión Sur St Joseph S 23-Nov-05 Clásicos 06.47 V (**)
- 18
- Reunión Sur La Riviève St Louis P 24-Nov-05 Clásicos n.i. V (**)
- 19
- Reunión Sur Le Tampon P 26-Nov-05 Clásicos n.i. V (**)
- 20
- Reunión Sur Ravine des Cabris P 25-Nov-05 Clásicos n.i. V (**)
- 21
- Reunión Sur St Joseph (parents) S 29-Nov-05 ME neonatal 06.25 V (**)
- 21
- Reunión Sur St Joseph (parents) CSF 29-Nov-05 ME neonatal 06.27 (G) V (***)
- 22
- Reunión Sur St Louis S 2-Dic-05 Clásicos 06.49 (G) V (***)
- 23
- Reunión Sur St Louis P 8-Dic-05 Clásicos n.i. V (**)
- 24
- Reunión Sur Ravine des Cabris S 9-Dic-05 ME 06.17 V (**)
- 25
- Reunión Sur St Louis P 13-Dic-05 Clásicos n.i. V (**)
- 26
- Reunión Sur St Pierre P 2-Ene-06 Clásicos n.i. A (**)
- 27
- Reunión Sur St Pierre P 4-Ene-06 Síndrome álgico n.i. A (**)
- 28
- Reunión Este St André S 4-Ene-06 Clásicos n.i. A (**)
- 29
- Reunión Sur St Louis P 29-Dic-05 Síndrome álgico n.i. V (**)
- Paciente nº
- Isla Región o Isla Ciudad o Localidad Muestra (b) Fecha de muestreo Síntomas clínicos (c) Elemento vírico aislado nº (d) E1-226 (e)
- 29
- Reunión Sur St Louis CSF 29-Dic-05 Síndrome álgico n.i. V (**)
- 30
- Reunión Sur La Riviève St Louis P 29-Dic-05 Clásicos n.i. V (**)
- 31
- Reunión Sur La Riviève St Louis P 27-Dic-05 Clásicos n.i. V (**)
- 32
- Reunión Sur St Pierre P 27-Dic-05 Sarpullido vesicular severo miembros inferiores n.i. V (**)
- 32
- Reunión Sur St Pierre L 28-Dic-05 Sarpullido vesicular severo miembros inferiores n.i. V (**)
- 33
- Reunión Sur Ravine des Cabris P 4-Ene-06 n.d. n.i. A (**)
- 34
- Reunión Sur St Joseph P 3-Ene-06 Síndrome álgico n.i. V (**)
- 35
- Reunión Sur St Louis P 2-Ene-06 Síndrome álgico n.i. V (**)
- 36
- Reunión Sur St Joseph P 5-Ene-06 Síndrome álgico n.i. Por determinar
- 37
- Reunión Sur Ravine des Cabris P 6-Ene-06 Clásicos n.i. V (**)
- 38
- Reunión Sur St Louis P 6-Ene-06 Síndrome álgico n.i. V (**)
- 39
- Reunión Oeste Saint-Paul hospital S 5-Ene-06 n.d. n.i. A (**)
- 40
- Reunión Oeste St Leu S 19-Ene-06 Clásicos n.i. V (**)
- 41
- Reunión Sur Les Avirons S 30-Ene-06 Clásicos 06.97 V (**)
- Paciente nº
- Isla Región o Isla Ciudad o Localidad Muestra (b) Fecha de muestreo Síntomas clínicos (c) Elemento vírico aislado nº (d) E1-226 (e)
- 42
- Reunión Este St Benoît S 3-Feb-06 Hepatitis n.i. V (**)
- 43
- Reunión n.d. n.d. S 22-Feb-06 Clásicos n.i. V (**)
- 44
- Seychelles Isla Mahe Anse aux Pins S 9-Ago-05 Clásicos 05.209 (G) A (*)
- 45
- Seychelles Isla Mahe Anse aux Pins S 10-Ago-05 Clásicos negativo A (**)
- 46
- Seychelles Isla Mahe Anse aux Pins S 10-Ago-05 Clásicos negativo A (**)
- 47
- Madagascar Este Toamasina S 1-Feb-06 Clásicos 06.103 A (**)
- 48
- Madagascar Este Toamasina S 8-Feb-06 Clásicos 06.99 A (**)
- 49
- Madagascar Este Toamasina S 9-Feb-06 Clásicos 06.101 A (**)
- 50
- Madagascar Este Toamasina S 15-Feb-06 Clásicos n.i. A (**)
- 51
- Madagascar Norte Ampany S 14-Feb-06 Clásicos n.i. A (**)
- 52
- Madagascar Norte Djamandjary S 14-Feb-06 Clásicos n.i. A (**)
- 53
- Madagascar Norte Djamandjary S 15-Feb-06 Clásicos n.i. A (**)
- 54
- Mayotte n.d. n.d. S 7-Feb-06 Clásicos 06.111 Por determinar
- 55
- Mayotte n.d. n.d. S 11-Feb-06 Clásicos n.i. V (**)
- 56
- Mayotte n.d. n.d. S 13-Feb-06 Clásicos n.i: V (**)
- 57
- Mayotte n.d. n.d. S 13-Feb-06 Clásicos n.i. V (**)
- Paciente nº
- Isla Región o Isla Ciudad o Localidad Muestra (b) Fecha de muestreo Síntomas clínicos (c) Elemento vírico aislado nº (d) E1-226 (e)
- 58
- Mauricio n.d. n.d. S 12-Feb-06 Clásicos 06.93 V (*)
- 59
- Mauricio n.d. n.d. S 27-Feb-06 Clásicos n.i. A (**)
- 60
- Mauricio n.d. n.d. S 1-Mar-06 Clásicos n.i. A (**)
- (a) Este paciente viajó de vuelta desde Comoros y se cree que se infectó allí. (b) S: suero; P: plasma; CSF: fluido cerebroespinal (c) ME: meningo-encefalitis (d) Los elementos aislados marcados con (G) se corresponden con aquellos para los que se establecido la secuencia genómica casi completa (e) A: Alanina; V: Valina; (*): Secuencia determinada a partir de los elementos víricos aislados; (**): Secuencia determinada a partir de muestras biológicas; (***): Secuencia determinada a partir tanto de elementos víricos aislados como de muestras biológicas n.i.: aislamiento de virus no realizado; n.d.: no determinado
Tabla 2. Cambios de aminoácidos relevantes identificados entre los elementos aislados del Océano Índico y una selección de secuencias de Alfavirus.
- Proteínas no estructurales Proteínas estructurales
- Proteína
- nsP 1 nsP 1 nsP 2 nsP 2 nsP 2 nsP 2 nsP 3 nsP 3 nsP 3 nsP 3 nsP 3 nsP 4 nsP 4 nsP 4 E2 E2 E2 E2 E2 6K E1 E1 E1
- Polipéptido
- 301 488 589 909 117 132 155 167 169 179 180 193 211 236 47 48 63 70 71 75 103 107 109
- posición (a)
- 7 8 0 0 1 3 4 8 7 3 1 9 7 0 1 6 5 8 3
- Proteína
- 301 488 54 374 642 793 217 337 358 460 471 75 254 500 14 16 31 37 38 8 226 269 284
- posición (a)
- 6 4 2 5 6
- 05.115
- T R N Y Y V H I S E S A A L Q T M T A I A V E
- (Genotipo 1)
- 06.21
- T R N Y Y V H I S Nd nd A A L Q T M T A I V V E
- (Genotipo 2)
- 06.27
- I R N Y N V H I S Del S A A L Q T M T A I V V E
- (Genotipo 3)
- 06.49
- T R N Y Y V H I S E S A A L Q T M T A I V V E
- (Genotipo 4)
- 05.209
- T R N Y Y V H I P E S A A L R T M T A I A V E
- (Genotipo 5)
Numeración de referencia S27
(a)
Posición variable.
* ** Posición hipervariable.
ONV: Virus o'nyong-nyong; SFV: virus Semliki Forest; RRV: virus Ross River; SINV: virus Sindbis; EEV: virus de Encefalitis Equina Oriental.
nd: no determinado. Nótese que el codón de parada opal observado en nsP3-524 de elementos aislados del brote del Océano Índico, pero no en S27, no está
representado en la Tabla.
Tabla 3. Polimorfismos observados entre los elementos aislados del Océano Índico. Tabla 4. Cebadores usados para RT-PCR y secuenciamiento.
- Fragmento
- Gen Cebador (a) Sequence (5' to 3') SEQ ID NO:
- FG1
- 5'NC 18F CACGTAGCCTACCAGTTTCTTA 35
- nsP1
- 871R ATGGAACACCGATGGTAGGTG 36
- FG2
- nsP1 616F AACCCCGTTCATGTACAATGC 37
- nsP1
- 1435R CGGTACCACAAAGCTGTCAAAC 38
- FG3
- nsP1 1317F CACTGACCTGCTGCTGTCTATG 39
- nsP2
- 2130R AGTCCTGCAGCTTCTTCCTTC 40
- FG4
- nsP1 1412F CGAGTTTGACAGCTTTGTGGTA 41
- nsP2
- 2227R ATGACTGCAATTTTGTATGGGC 42
- FG5
- nsP2 1908F CAATCTCGCCTGAAGACTTCC 43
- nsP2
- 2709R TCCACTACAATCGGCTTGTTG 44
- FG6
- nsP2 2530F GTGCGGCTTCTTCAATATGATG 45
- nsP2
- 3343R TCCAGGCCTATTATCCCAGTG 46
- FG7
- nsP2 2577F AACATCTGCACCCAAGTGTACC 47
- nsP2
- 3504R GTCTCCTGTTGGCCGGTATAAT 48
- FG8
- nsP2 3332F TAATAGGCCTGGAGGGAAGATG 49
- Fragmento
- Gen Cebador (a) Sequence (5' to 3') SEQ ID NO:
- nsP3
- 4134R CTACGCACTCTTCATCGTTCTT 50
- FG9
- nsP2 3885F GAACGAGTCATCTGCGTATTGG 51
- nsP3
- 4725R ATATCTCTGCCATATCCACTGC 52
- FG10
- nsP3 4458F TCTTTACAGCCATGGACTCGAC 53
- nsP3
- 5273R CGACAGGTACGGTGCTCATTAC 54
- FG11
- nsP3 5065F TGTACAGGAAGCGAGTACGACC 55
- nsP4
- 5874R TCTACTTTGCGCGACTGATACC 56
- FG12
- nsP4 5630F ACGGACGACGAGTTACGACTAG 57
- nsP4
- 6380R CCCAGTATTCTTGGTTGCATG 58
- FG13
- nsP4 6184F AAAACAGCACGCTTACCACG 59
- nsP4
- 6936R AACTTGAAGCGCGTACCTGTC 60
- FG14
- nsP4 6732F TCATAGCCGCACACTTTAAGC 61
- nsP4
- 7495R AGGACCGCCGTACAAAGTTAC 62
- FG15
- nsP4 7278F GCAGGTGACGAACAAGATGAG 63
- C
- 8034R CCGCTTAAAGGCCAATTTG 64
- FG16
- C 7910F TCGAAGTCAAGCACGAAGG 65
- E2
- 8670R GTCTGTCGCTTCATTTCTGATG 66
- Fragmento
- Gen Cebador (a) Sequence (5' to 3') SEQ ID NO:
- FG17
- E3 8459F TGCTTGAGGACAACGTCATGAG 67
- E2
- 9240R TTTGTGATTGGTGACCGCG 68
- FG18
- E2 9093F AGTCCGGCAACGTAAAGATCAC 69
- 6K
- 9861R AAAGGTTGCTGCTCGTTCCAC 70
- FG19
- E2 9648F AGTTGTGTCAGTGGCCTCGTTC 71
- E1
- 10403R TAAAGGACGCGGAGCTTAGCTG 72
- FG20
- E1 10145F ACAAAACCGTCATCCCGTCTC 73
- E1
- 11158R TGACTATGTGGTCCTTCGGAGG 74
- FG21
- E1 10959F CAGCAAGAAAGGCAAGTGTGC 75
- 3'NC
- 11770R TTTGCCAATTATGGTATTCA 76
(a) El nombre del cebador indica su posición y dirección sobre la secuencia de nucleótidos del genoma de S27.
Tabla 5. Cambios de aminoácidos observados entre la cepa S27 y las cepas del brote del Océano Índico en las proteínas no estructurales.
nsP1 y nsP2
- Proteína
- nsP1 nsP1 nsP1 nsP1 nsP1 nsP1 nsP1 nsP1 nsP2 nsP2 nsP2 nsP2 nsP2
- Posición de proteína
- 172 234 301 383 384 481 488 507 54 374 642 643 793
- Posición de polipéptido
- 172 234 301 383 384 481 488 507 589 909 1177 1178 1328
- S27
- L E T M I T Q L S H C S A
- 05.115
- V K T L L I R R N Y Y N V
- 05.61
- V K T L L I R R N Y Y N V
- 06.21
- V K T L L I R R N Y Y N V
- 06.27
- V K I L L I R R N Y N N V
- 06.49
- V K T L L I R R N Y Y N V
- 05.209
- V K T L L I R R N Y Y N V
nsP3 y nsP4 Las celdas en gris corresponden a aminoácidos que eran variables entre los elementos aislados del brote del Océano Índico.
- Proteína
- nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP4 nsP4 nsP4 nsP4 nsP4 nsP4
- Posición de proteína
- 175 217 326 331 337 352 358 376 382 460 461 462 471 524 75 254 500 514 555 604
- Posición de polipéptido
- 1508 1550 1659 1664 1670 1685 1691 1709 1715 1793 1794 1795 1804 1857 1938 2117 2363 2377 2418 2467
- S27
- V Y P V T K S I A L L S P R T T Q I V V
- 05.115
- I H S A I E S T T E P N S STOP A A L T I I
- Proteína
- nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP3 nsP4 nsP4 nsP4 nsP4 nsP4 nsP4
- 05.61
- I H S A I E S T T nd nd nd nd nd A A L T I I
- 06.21
- I H S A I E S T T E P N S STOP A A L T I I
- 06.27
- I H S A I E S T T elimin. P N S STOP A A L T I I
- 06.49
- I H S A I E S T T E P N S STOP A A L T I I
- 05.209
- I H S A I E P T T E P N S STOP A A L T I I
Tabla 6. Cambios de aminoácidos observados en los genes estructurales entre las cepas S27, Ross y el brote del Océano Índico.
- Proteína
- C E3 E2 E2 E2 E2 E2 E2 E2 E2 E2 E2 E2 E2 E2 E2 E2 E2 E2 6K 6K E1 E1 E1 E1
- Proteína escindida
- 63 23 57 74 79 144 160 164 181 194 195 211 251 267 299 312 344 375 386 8 54 226 269 284 322
- Posición de AA
- 6
- Poliproteína
- 63 284 382 399 404 471 485 489 506 519 520 536 576 592 624 637 669 700 711 756 802 103 107 109 113
- Posición de AA
- 5 8 3 1
- Genoma
- 775 841 871 876 877 897 902 903 908 912 912 917 929 934 943 947 957 966 969 983 997 106 107 108 109
- Posición de nt (a)
- 4 7 0 3 7 8 0 1 2 1 5 3 3 1 7 6 1 4 8 2 0 70 98 45 58
- S27
- K I G I G Q N A L S Q I R M S T A S V V I A M D V
- Ross
- R I G I G Q N A L G R I P R S T A S V V I A M D V
- 05.115
- R T K M E Q T T V G Q T R R N M T T A I V A V E A
- 05.61
- R T K M E Q T T V G Q T R R N M T T A I V A V E A
- 06.21
- R T K M E Q T T V G Q T R R N M T T A I V V V E A
- 06.27
- R T K M E Q T T V G Q T R R N M T T A I V V V E A
- 06.49
- R T K M E Q T T V G Q T R R N M T T A I V V V E A
- 05.209
- R T K M E R T T V G Q T R R N M T T A I V A V E A
(a) Cuando dos posiciones de nt están disponibles en el mismo codón, solo se muestra la posición del nt que está por encima. Las celdas en gris corresponden a cambios de aminoácidos entre los elementos aislados del brote del Océano Índico.
Tabla 7. Secuencia usada para el análisis filogenético de las secuencias parciales de E1.
- Nº de acceso
- Cepa Dominio genómico Origen de la cepa Fecha de aislamiento Filogrupo Referencia
- AF192906
- CAR 256 E1 parcial Región de África Central Desconocida África Central 1
- AF192907
- Aq41855 E1 parcial Uganda 1982 África Central 1
- AY549583
- ChikRCA E1 parcial DRC (b) 1996 África Central 2
- AF192903
- AR 18211 E1 parcial República de Sudáfrica 1976 África Central-Oriental/Sur 1
- AF192904
- SA H2123 E1 parcial República de Sudáfrica 1976 África Central-Oriental/Sur 1
- AF192905
- Ross E1 parcial Tanzania 1953 África Central-Oriental/Sur 1
- AF490259
- Ross Genoma completo Tanzania 1953 África Central-Oriental/Sur na
- AF369024
- S27 Genoma completo Tanzania 1952 África Central-Oriental/Sur 3
- AY549576
- DRC010 E1 parcial DRC (b) 2000 África Central 2
- AY549577
- DRC027 E1 parcial DRC (b) 2000 África Central 2
- AY549579
- DRC1719 E1 parcial DRC (b) 2000 África Central 2
- AY549575
- DRC007 E1 parcial DRC (b) 2000 África Central 2
- AY549578
- DRC1718 E1 parcial DRC (b) 2000 África Central 2
- AY549581
- DRC1725 E1 parcial DRC (b) 2000 África Central 2
- AY549582
- DRC1728 E1 parcial DRC (b) 2000 África Central 2
- Nº de acceso
- Cepa Dominio genómico Origen de la cepa Fecha de aislamiento Filogrupo Referencia
- AY549580
- DRC1720 E1 parcial DRC (b) 2000 África Central 2
- AY549584
- DRC1730 E1 parcial DRC (b) 2000 África Central 2
- AF192896
- 644188 E1 parcial Tailandia 1988 Asia 1
- AF192899
- 3412/78 E1 parcial Tailandia 1978 Asia 1
- AF192894
- RSU1 E1 parcial Indonesia 1985 Asia 1
- AF192895
- H15483 E1 parcial Filipinas 1985 Asia 1
- AF192898
- 1455/75 E1 parcial Tailandia 1975 Asia 1
- AF192901
- Gibbs 63-263 E1 parcial India 1963 Asia 1
- AF192902
- PO731460 E1 parcial India 1973 Asia 1
- AF192897
- C-03295 E1 parcial Tailandia 1995 Asia 1
- AF192900
- SV045196 E1 parcial Tailandia 1996 Asia 1
- L37661
- Cepa de vacuna Gen de poliproteína Na na Asia na
- AF192892
- 37997 E1 parcial Na na África Occidental 1
- AY726732
- 37997 Genoma completo Senegal 1983 África Occidental 4
- AF192891
- PM2951 E1 parcial Senegal 1966 África Occidental 1
- AF192893
- IbH35 E1 E1 parcial Nigeria 1964 África Occidental 1
Referencias: (1) Powers et al., Pastorino et al., 2004; (3) Khan et al., 2002; (4) Vanlandingham et al., 2005.
(b) República Democrática del Congo.
Tabla 8. Porcentaje de similitud de secuencia basado en aminoácidos y nucleótidos (en paréntesis) para las proteínas estructurales (SP) y no estructurales (NSP) de
Alfavirus seleccionados.
CHIKV: virus chikungunya; ONNV: virus o'nyong-nyong; SFV: virus Semliki Forest; RRV: virus Ross River; SINV: virus Sindbis. NA: no disponible.
Tabla 9: Lista de ensayos biológicos llevados a cabo para validar la reactividad de MAbs anti-CHIK E2.
Referencias
- 1.
- Strauss EG, Strauss JH (1986) Structure and replication of the alphavirus genome. En: Schlesinger S, Schlesinger MJ, editores. The Togaviridae and Flaviviridae. Nueva York: Plenum Press. pág. 35-90.
- 2.
- Porterfield JH (1980) Antigenic characteristics and classification of the Togaviridae. En: Schlesinger R, editor. The Togaviruses. Nueva York: Academic Press. pág. 13-46.
- 3.
- Ross RW (1956) The Newala epidemic. III. The virus: isolation, pathogenic properties and relationship to the epidemic. J Hyg 54: 177-191.
- 4.
- Jupp PG, McIntosh BM (1988) Chikungunya disease. En: editores MTP, editor. The Arboviruses: epidemiology and ecology. Boca Raton, Florida: CRC Press. pág. 137-13 157.
- 5.
- Johnston RE, Peters CJ (1996) Alphaviruses associated primarily with fever and polyarthritis. En: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, editores. Fields Virology. pág. 16 843-898.
- 6.
- Pastorino B, Muyembe-Tamfum JJ, Bessaud M, Tock F, Tolou H, et al. (2004) Epidemic resurgence of Chikungunya virus in democratic Republic of the Congo: identification of a new central African strain. J Med Virol 74: 277-282.
- 7.
- Laras K, Sukri NC, Larasati RP, Bangs MJ, Kosim R, et al. (2005) Tracking the re-emergence of epidemic chikungunya virus in Indonesia. Trans R Soc Trop Med Hyg 99: 128-141.
- 8.
- Paquet C, Quatresous I, Solet JL, Sissoko D, Renault P (2006) Chikungunya outbreak in Reunion: epidemiology and surveillance, 2005 to early January 2006. Eurosurveillance weekly 11: 2.
- 9.
- Khan AH, Morita K, Parquet Md Mdel C, Hasebe F, Mathenge EG, et al. (2002) Complete nucleotide sequence of chikungunya virus and evidence for an internal polyadenylation site. J Gen Virol 83: 3075-3084.
- 10.
- Powers AM, Brault AC, Tesh RB, Weaver SC (2000) Re-emergence of Chikungunya and O'nyong-nyong viruses: evidence for distinct geographical lineages and distant evolutionary relationships. J Gen Virol 81: 471-479.
- 11.
- Gordon D AC, Green P. (1998) Consed: a graphical tool for sequence finishing. Genome Res 8: 195-202.
- 12.
- Rozas J, Sanchez-DelBarrio JC, Messeguer X, Rozas R (2003) DnaSP, DNA 2 polymorphism analyses by the coalescent and other methods. Bioinformatics 19: 2496-2497.
- 13.
- Xia X, Xie Z (2001) DAMBE: software package for data analysis in molecular biology and evolution. J Hered 92: 371-373.
- 14.
- Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22: 4673-4680.
- 15.
- Felsenstein J (1989) PHYLIP -Phylogeny Interfeme Package (version 3.2). Cladistics 5: 164-166.
- 16.
- Hofacker IL (2003) Vienna RNA secondary structure server. Nucleic Acids Res 31: 3429-3431.
- 17.
- Kumar S, Tamura K, Nei M (2004) MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Brief Bioinform 5: 150-163.
- 18.
- Martin DP, Williamson C, Posada D (2005) RDP2: recombination detection and analysis from sequence alignments. Bioinformatics 21: 260-262.
- 19.
- Roussel A, Lescar J, Vaney MC, Wengler G, Wengler G, et al. (2006) Structure and interactions at the viral surface of the envelope protein E1 of semliki forest virus. Structure 14: 75-86.
- 20.
- Carson M (1987) Ribbon models of macromolecules. J Mol Graph 5: 103-106.
- 21.
- Strauss JH, Strauss EG (1994) The alphaviruses: gene expression, replication, and evolution. Microbiol Rev 58: 491-562.
- 22.
- Lavergne A, Thoisy BD, Lacoste V, Pascalis H, Pouliquen JF, et al. (2005) Mayaro virus: Complete nucleotide sequence and phylogenetic relationships with other alphaviruses. Virus Res in press.
- 23.
- Lanciotti RS, Ludwig ML, Rwaguma EB, Lutwama JJ, Kram TM, et al. (1998) Emergence of epidemic O'nyongnyong fever in Uganda after a 35-year absence: genetic characterization of the virus. Virology 252: 258-268.
24. Strauss EG, Levinson R, Rice CM, Dalrymple J, Strauss JH (1988) Nonstructural proteins nsP3 and nsP4 of Ross River and O'Nyong-nyong viruses: sequence and comparison with those of other alphaviruses. Virology 164: 265
274.
- 25.
- Griffin DE (2001) Alphaviruses. En: Knipe DM, Howley PM, editores. Fields Virology. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. pág. 917-962.
- 26.
- Vashishtha M, Phalen T, Marquardt MT, Ryu JS, Ng AC, et al. (1998) A single point mutation controls the cholesterol dependence of Semliki Forest virus entry and exit. J Cell Biol 140: 91-99.
- 27.
- Ahn A, Schoepp RJ, Sternberg D, Kielian M (1999) Growth and stability of a cholesterol-ndependent Semliki Forest virus mutant in mosquitoes. Virology 262: 452-456.
- 28.
- Williams MC, Woodall JP, Corbet PS, Gillett JD (1965) O'nyong-Nyong Fever: An Epidemic Virus Disease In East Africa. 8. Virus Isolations From Anopheles Mosquitoes. Trans R Soc Trop Med Hyg 59: 300-306.
- 29.
- Weaver SC, Barrett AD (2004) Transmission cycles, host range, evolution and emergence of arboviral disease. Nat Rev Microbiol 2: 789-801.
- 30.
- Lu YE, Cassese T, Kielian M (1999) The cholesterol requirement for sindbis virus entry and exit and characterization of a spike protein region involved in cholesterol dependence. J Virol 73: 4272-4278.
- 31.
- Holland J, Spindler K, Horodyski F, Grabau E, Nichol S, et al. (1982) Rapid evolution of RNA genomes. Science
215: 1577-1585.
- 32.
- Domingo E, Holland JJ (1997) RNA virus mutations and fitness for survival. Annu Rev Microbiol 51: 151-178.
- 33.
- Vignuzzi M, Stone JK, Arnold JJ, Cameron CE, Andino R (2006) Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population. Nature 439: 344-348.
- 34.
- Kim KH, Rumenapf T, Strauss EG, Strauss JH (2004) Regulation of Semliki Forest virus RNA replication: a model for the control of alphavirus pathogenesis in invertebrate hosts. Virology 323: 153-163.
- 35.
- Heise C, Kirn DH (2000) Replication-selective adenoviruses as oncolytic agents. J Clin Invest 105: 847-851.
- 36.
- Heise MT, White LJ, Simpson DA, Leonard C, Bernard KA, et al. (2003) An attenuating mutation in nsP1 of the Sindbis-group virus S.A.AR86 accelerates non-structural protein processing and up-regulates viral 26S RNA synthesis. J Virol 77: 1149-1156.
- 37.
- Suthar MS, Shabman R, Madric K, Lambeth C, Heise MT (2005) Identification of adult mouse neurovirulence determinants of the Sindbis virus strain AR86. J Virol 79: 4219-4228.
- 38.
- Condon RJ, Rouse IL (1995) Acute symptoms and sequelae of Ross River virus infection in South-Western Australia: a follow-up study. Clin Diagn Virol 3: 273-284.
- 39.
- Selden SM, Cameron 1 ron AS (1996) Changing epidemiology of Ross River virus disease in South Australia. Med J Aust 165: 313-317.
- 40.
- Mazaud R, Salaün JJ, Montabone H, Goube P, Bazillio R (1971) Troubles neurologiques et sensoriels aigus dans la dengue et la fièvre a Chikungunya. Bull Soc Pathol Exot 64: 22-30.
- 41.
- Nimmannitya S, Halstead SB, Cohen SN, Margiotta MR (1969) Dengue and chikungunya virus infection in man in Thailand, 1962-1964. I. Observations on hospitalized patients with hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg 18: 954
971.
- 42.
- Gratz NG (2004) Critical review of the vector status of Aedes albopictus. Med Vet Entomol 18: 215-227.
- 43.
- Lescar J, Roussel A, Wien MW, Navaza J, Fuller SD, et al. (2001) The Fusion glycoprotein shell of Semliki Forest virus: an icosahedral assembly primed for fusogenic activation at endosomal pH. Cell 105: 137-148.
Claims (13)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Una cepa natural aislada y purificada 05.115 de virus chikungunya (CHIKV) capaz de infectar in vitro células humanas, y donde su genoma consiste en la secuencia mostrada en la Figura 4.
-
- 2.
- Un polinucleótido aislado y purificado que consiste en la secuencia mostrada en la Figura 4.
-
- 3.
- Un fragmento del polinucleótido según la reivindicación 2, que codifica para el ectodominio de la glicoproteína E2.
-
- 4.
- Un fragmento del polinucleótido según la reivindicación 2, que codifica para una forma soluble de la glicoproteína E2.
-
- 5.
- Un fragmento del polinucleótido según la reivindicación 2, que codifica para el ectodominio de la glicoproteína E1.
-
- 6.
- Un vector que comprende un fragmento como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.
-
- 7.
- Una célula hospedante que comprende un vector como el definido en la reivindicación 6.
-
- 8.
- Un polipéptido purificado codificado por un fragmento de polinucleótido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.
-
- 9.
- Un polipéptido purificado que consiste en la secuencia definida en la Figura 40.
-
- 10.
- El uso de un elemento seleccionado del grupo que consiste en: -una cepa de virus chikungunya 05.115 que consiste en el genoma definido en la Figura 4; -un polinucleótido que consiste en la secuencia mostrada en la Figura 4; -un fragmento como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; -un vector como el definido en la reivindicación 6; -una célula hospedante como la definida en la reivindicación 7; -un polipéptido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9; y -anticuerpos monoclonales o policlonales, o fragmentos de los mismos, que se unan específicamente a un
polipéptido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9; para la detección in vitro de un CHIKV asociado a una arbovirosis. -
- 11.
- El uso de un elemento seleccionado del grupo que consiste en: -una cepa de virus chikungunya 05.115 que comprende un genoma como el definido en la Figura 4; -un polinucleótido que consiste en la secuencia mostrada en la Figura 4; -un fragmento como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; -un vector como el definido en la reivindicación 6; -una célula hospedante como la definida en la reivindicación 7; y -un polipéptido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9;
para la preparación de una composición que prevenga y/o trate una arbovirosis. -
- 12.
- Una composición que comprende al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en: -una cepa de virus chikungunya 05.115 que comprende un genoma como el definido en la Figura 4; -un polinucleótido que consiste en la secuencia mostrada en la Figura 4; -un fragmento como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; -un vector como el definido en la reivindicación 6; -una célula hospedante como la definida en la reivindicación 7; y -un polipéptido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, y que además comprende un
vehículo aceptable. - 13. Un kit para la detección de un CHIKV asociado a una arbovirosis, que comprende al menos un paquete que comprende al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en: -una cepa de virus chikungunya 05.115 que consiste en el genoma definido en la Figura 4; -un polinucleótido que consiste en la secuencia mostrada en la Figura 4; -un fragmento como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; -un vector como el definido en la reivindicación 6;-una célula hospedante como la definida en la reivindicación 7; -un polipéptido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9; y anticuerpos monoclonales o policlonales, o fragmentos de los mismos, que se unan específicamente a un polipéptido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9.FIGURA 14FIGURA 15 FIGURA 16FIGURA 17 FIGURA 18FIGURA 19FIGURA 20 FIGURA 22FIGURA 23 FIGURA 25FIGURA 39 FIGURA 41 FIGURA 43
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