JP2013126414A - チクングンヤウイルスの新規な分離されかつ精製された株、並びにそのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列、診断及び免疫原性の使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】インビトロでヒト細胞に感染可能なチクングンヤウイルス(CHIKV)の分離されかつ精製された野生株06.49。分離されかつ精製されたポリヌクレオチド。前記ポリヌクレオチドのフラグメントを含むベクター。前記ベクターを含む宿主細胞。前記ポリヌクレオチドのフラグメントによりコードされる精製されたポリペプチド。前記ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル若しくはポリクローナル抗体。前記成分の、アルボウイルス症に関連するCHIKVのインビトロ検出のための使用。
【選択図】なし
Description
由来する患者から分離されたチクングンヤウイルスの野生株に関する。本発明は、それらのゲノムに由来するポリペプチド配列及びそのフラグメント、それをコードするポリヌクレオチド、並びに診断用製品、ワクチン及び/又は免疫原性組成物としてのそれらの使用にも関する。
た[3]。これは、高熱、関節痛、筋肉痛、頭痛及び発疹を特徴とする突然の発症の急性感
染の原因である[4,5]。この疾患の特徴的症状である多発性関節痛(Poly-arthralgia)は、非常に苦痛である。症状は、通常、限定された過程を経、1〜10日間継続する。しかし、
関節痛又は関節炎性の症状は、数ヶ月又は数年持続し得る。いくらかの患者においては、わずかな出血性の徴候、例えば鼻出血又は歯肉出血(gingivorrhagia)も記載されている。
ては、このウイルスは、野生の霊長類と、蚊、例えばAedes luteocephalus、Ae. furcifer又はAe. tayloriとの間の野生鳥獣に発生する(sylvatic)伝播サイクルを介して維持される[4]。アジアでは、CHIKVは、ヒトからヒトに、都市型伝播サイクルを介して、Ae. aegypti、及びより少ない程度であるがAe. albopictusにより主に伝播される。1952年のタンザニアでの大発生以来、CHIKVは、東部アフリカ(タンザニア、ウガンダ)、南部アフリカ(ジンバブエ、南アフリカ)、西部アフリカ(セネガル、ナイジェリア)及び中央アフリカ(中央アフリカ共和国、コンゴ民主共和国)で大発生を引き起こしている[4]。最も近年の集団再発現は、1999〜2000年にキンシャサであったことが記録され、ここでは、推定50,000人が感染した[6]。タイのバンコクでの1958年のアジアで最初に記録された大発生以来、タイ、カンボジア、ベトナム、ラオス、ミャンマー、マレーシア、フィリピン及びインドネシアでの大発生が記録されている[4,5]。最も近年の集団再発現は、2001〜2003年に、20年ぶりにジャワであったことが記録されている[7]。アフリカ又はアジアのいずれにおいても、連続する大発生の間の間隔が7〜8年から20年である再発現は、予測不可能である。
ている。2005年の1月から3月の間に、コモロでは5,000を超える件が報告された。2005年
の後半には、ウイルスは、他の島々、すなわちマヨット、セーシェル、レユニオン及びモーリシャスで流布している。2005年12月に始まって、雨季に、ウイルスの流行性の流布が新たに増加した。2006年の1月1日から3月1日の間に、モーリシャス、マヨット及びセーシェルにおいて2,553件、3,471件及び4,650件が報告されている(2006年3月12日)。最も影響を受けた島は、レユニオンであり、2006年3月12日までに推定212,000件がある(全人口:770,000)。より最近では、ウイルスの流布は、マダガスカルで記録されている。
であった。3月から6月にかけて、3,000を超える件が報告された。伝播は、南半球の冬季
に限定され、主な急増は、12月中旬から観察され始め、2006年の1月から3月までに推定210,000件が観察された[8]。2005年の3月以来、CHIKV感染が確定した85人の患者が、重篤な臨床徴候を発生し(髄膜脳炎又は劇症肝炎)、集中治療室での入院加療が必要であった。髄膜脳炎及び主要疼痛症候群(major algic syndrome)のいくつかの件は、ウイルスの垂直感染に関連している9。
決定されている[9]。別の完全ヌクレオチド配列が、1983年のセネガルでの大発生の間にAe. furciferで分離された株について決定されている(アクセッション番号AY726732)。Khanら[9]は、S27ゲノムの構造が、他のアルファウイルスの構造に類似し、オニョンニョンウイルス(ONN)が、CHIKVの最も近縁であることを示した。さらに、アフリカ及びアジアでの分離株からの部分的E1配列に基づく系統発生的分析は、1つは西部アフリカからの全ての分離株を含み、1つはアジアからの分離株を含み、1つは東部、中央及び南部アフリカの分離株に相当する3つの異なるCHIKVの系統群(phylogroups)の存在を明らかにした[10]。コンゴ民主共和国で1999〜2000年に分離された株は、後者の系統群に属する[6]。
の変異を含むCHIKVの分離されかつ精製された株、並びにアルボウイルスに関連するCHIKVの検出、又はアルボウイルスを予防及び/又は治療する組成物の製造のためのその使用に関する。
又はアルボウイルスを予防及び/又は治療する組成物の製造のためのその使用に関する。
出、又はアルボウイルスを予防及び/又は治療する組成物の製造のためのその使用に関する。
る組成物の製造のためのその使用に関する。
ルボウイルスを予防及び/又は治療する組成物の製造のためのその使用に関する。
本研究において、本発明者らは、レユニオン及びセーシェル島を起源とする6人の患者
から単離されたウイルスのほぼ完全なヌクレオチド配列を決定した。本発明は、インド洋大発生分離株のゲノム構造及び独特な分子的特徴を決定することを可能にし、これらにより、これらの分離株は、他に報告されたCHIKV及びアルファウイルス配列から区別される
。
ルス(CHIKV)の分離されかつ精製された野生株に関する。好ましくは、本発明は、分離株05.115、05.61、05.209、06.21、06.27及び06.49からなる群より選択されるものと同じ特
徴を示すCHIKウイルスの野生株に関する。好ましい実施形態によると、本発明の範囲内の株は、それらのゲノムが、CHIKウイルスS-27株のゲノム配列(GenBank AF339485)と比較したときに、少なくとも1つの変異を含むことを特徴とする。本発明の好ましいCHIK株の試
料からの細胞培養により成長するか又は得られるいずれの株も、本発明の範囲内である。本発明による好ましい株のゲノムは、図4、5、6、7、8又は9に示す配列(配列番号1、2、3、4、5又は6)を含む。
ス構造タンパク質のアミノ酸の位置に対応する位置は、配列番号1に示すアミノ酸配列を
、具体的なCHIKウイルス構造タンパク質と整列させることにより、経験的に決定できる。相同な又は対応する位置は、手動のアラインメントを用いて当業者により、又は利用可能な多数のアラインメントプラグラム(例えばBLASTP)により決定できる。相同な又は対応する位置は、例えば、タンパク質構造のアラインメントをシミュレーションするコンピュータを用いることによる構造アラインメントに基づくこともできる。ポリペプチドのアミノ酸が、開示された配列内のアミノ酸に対応するとの記載は、標準的なアルゴリズム、例えばGAPアルゴリズムを用いて、同一性又は相同性を最大限にするような(保存アミノ酸を整列させる)、開示された配列とのポリペプチドのアラインメントにより同定されるアミノ
酸のことをいう。本明細書で用いる場合、「相同な位置で」とは、別の参照核酸分子又はタンパク質中の位置に関する核酸分子又はタンパク質中の興味対象の位置(すなわち塩基
番号又は残基番号)のことをいう。別の参照タンパク質中の位置に対する興味対象の位置
は、例えば、別のCHIK株の同じタンパク質からのアミノ酸配列中にあり得る。相同な位置は、一致するヌクレオチド又は残基の数が最大になるように、例えば、配列間の同一性が95%を超える、好ましくは96%を超える、より好ましくは97%を超える、さらにより好まし
くは98%を超える、最も好ましくは99%を超えるように、配列同士を比較及び整列させることにより決定できる。興味対象の位置は、次いで、参照核酸分子中で割り当てられた番号を与えられる。
うな配列の全体又は一部分を含む、分離されかつ精製されたポリヌクレオチドに関する。
、13又は14)を含むか、より好ましくは該配列からなる。
- 切断部位が該フラグメントを含むポリヌクレオチド内に存在する制限酵素の使用;
- 該フラグメントについての特異的プライマーを用いる増幅;
- インビトロ転写;又は
- 化学合成
により得ることができる。
質の配列に由来する。好ましくは、本発明の精製されたポリペプチドは、本発明により意図されるCHIKウイルスORF 1又は2のアミノ酸配列、例えば配列番号24〜29 (ORF 2)又は配列番号30〜34及び78 (ORF 1)のいずれか1つで定義されるものの全体又は一部分を含む。
より好ましくは、本発明の精製されたポリペプチドは、本発明により意図される糖タンパク質E2のアミノ酸配列、例えば配列番号15〜18 (図18〜21)のいずれか1つで定義されるものの全体又は一部分を含む。さらにより好ましくは、本発明の精製されたポリペプチドは、本発明により意図される糖タンパク質E2の可溶形のアミノ酸配列、例えば配列番号19〜22 (図22〜25)のいずれか1つで定義されるものの全体又は一部分を含む。
数の種類の細胞の形質導入/トランスフェクションのために設計されたポリヌクレオチド構築物のことをいう。ベクターは、例えば、挿入ヌクレオチドの分離、増殖及び複製のために設計された「クローニングベクター」、宿主細胞内のヌクレオチド配列の発現のために設計された「発現ベクター」、又は組換えウイルス若しくはウイルス様粒子の産生をもたらすように設計された「ウイルスベクター」、又は1より多い型のベクターの属性を含
む「シャトルベクター」であり得る。好ましいベクターは、フランス、75724 パリ セ
デックス15、リュ デュ ドクトール 28(28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex
15, France)のCNCM (国立培養微生物コレクション(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes))に、2006年3月15日に、アクセッション番号I-3587、I-3588、I-3589及びI-3590の下で寄託されたものである。本発明により意図される別の好ましいベクターは、TRIP-CHIK.sE2と呼ばれるプラスミドであり、これは、フランス、75724 パリ セデックス15、リュ デュ ドクトール 28のCNCM (国立培養微生物コレクション)に、2007年3月14日に、アクセッション番号I-3733の下で寄託されている。このようなベクターは、本発明の糖タンパク質E2の可溶形をコードするフラグメントを含む。この好ましいベクターは、哺乳動物細胞への組換えE2タンパク質の効率的な産生のために最適化されている。本明細書で用いる場合、用語「最適化された」は、ベクターが、所望のコードされたタンパク質を適切に発現するために、シグナルペプチド配列のような調節配列を組み込んでいることを意味する。
性で結合するが、興味対象のもの以外の分子を実質的に認識せず、結合しない抗体のことをいう。本明細書で用いる場合、用語「比較的高い親和性」とは、少なくとも10-6 M、好
ましくは少なくとも約10-7 M、さらにより好ましくは10-8 M〜10-10 Mの抗体と興味対象
のタンパク質との間の結合親和性を意味する。このような親和性の決定は、当業者に公知である標準的な競合結合イムノアッセイ条件の下で行うのが好ましい。
ラグメントは、Fv、Fab又はF(ab')2フラグメント又はその誘導体、例えば単鎖Fvフラグメントのようなフラグメントであり得る。抗体又は抗体フラグメントは、非組換え、組換え又はヒト化されたものであり得る。抗体は、免疫グロブリンアイソタイプ、例えばIgG、IgMなどのものであり得る。さらに、免疫グロブリン又はそのフラグメントの凝集物、ポリマー、誘導体及びコンジュゲートは、適切な場合に用い得る。
アルボウイルス症を予防及び/又は治療する組成物の製造のための使用である。
有利である。本発明の組成物は、許容される担体をさらに含む。関連する態様において、本発明は、アルボウイルス症を治療及び/又は予防するための方法を提供する。該方法は、本発明の組成物を、必要とする対象に投与する工程を含む。
か又は完全に排除されるプロセスのことをいう。本明細書で用いる場合、用語「予防する」は、CHIKV感染が妨げられるか又は遅延されるプロセスのことをいう。
ミノ酸)、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤、増粘添加剤、着色剤などを含む補助剤を
含む。
本発明者ら(本明細書においてしばしば「我々」という)は、レユニオン、セーシェル、モーリシャス、マダガスカル及びマヨット島からの合計で60人の患者からの6つの選択さ
れた臨床分離株のほぼ完全なゲノム配列とともに、糖タンパク質E1の部分配列を報告する。今回の結果は、この大発生が、東部アフリカ分離株に関係する株により開始されたことを示し、この株から、追跡可能な小進化の経過に従ってウイルス変異株が進化した。大発生分離株の独特の分子的特徴が同定された。特に、非構造タンパク質をコードする領域において、10個のアミノ酸の変化が見出され、そのうち3個はnsP2 (ヘリカーゼ、プロテアーゼ、及びRNAトリホスファターゼ活性を有する)及びポリメラーゼnsP4のアルファウイルスで保存されている位置に位置した。患者の脳脊髄液から得られた唯一の分離株は、nsP1 (T301I)、nsP2 (Y642N)及びnsP3 (E460欠失)において独特の変化を示した。構造タンパク質領域では、2つの注目すべき変化(A226V及びD284E)が、膜融合糖タンパク質E1で観察された。相同3Dモデリングにより、これらの2つの変化が、ビリオンの組み立て及び膜融合に重要な領域に位置づけされた。E1-A226Vの変更は、当初の株では存在しなかったが、レユニオンからのその後のウイルス配列の>85%で観察され、このことは、おそらく蚊ベクターへの適用による進化の成功を示す。
患者。レユニオン(N=43)、セーシェル(N=3)、マダガスカル(N=7)、マヨット(N=4)及びモ
ーリシャス(N=3)を起源とする部分的又は完全なCHIKVヌクレオチド配列を決定した60人の患者。患者及び生物学的試料の特徴は、表1に列挙する。
定反応は、BigDye Terminator v1.1サイクルシーケンシングキット(Applied Biosystems,
USA)を用いて行い、エタノール沈殿により精製した。配列のクロマトグラムを、自動化
配列アナライザABI3100又はABI3700 (Applied Biosystems)で得た。全てのアンプリコン
の両方の鎖を配列決定した。
いずれかを用いて、異なるオペレータ及びソフトウェアにより独立して行った。両方の分析は、全ての株について全く同じコンセンサス配列を示した。11,601 ntの単独のコンテ
ィグが5つの分離株について得られ、05.61株については、S27の5,246位から5,649位(nsP3の390位から524位)の間で配列の一部分が欠失していた。配列アラインメント及び置換テ
ーブル(substitution table)の計算を、プログラムBioNumerics, DNASPバージョン4.10 [12]、及びDAMBEバージョン4.2.13 [13]を用いて行った。選択されたアルファウイルス配
列に対するヌクレオチド及びアミノ酸配列のアラインメントは、ClustalW1.7ソフトウェ
ア[14]を用いて行った。配列同一性は、Phylipパッケージ[15]を用いて計算した。RNAの2次構造は、Vienna RNA 2次構造サーバ[16]を用いて予測した。近隣結合系統樹(Neighbor-joining trees)を、複数置換のKimura-2パラメータ修正を用いるMEGAバージョン3.1 [17]を用いて構築した。分岐点の信頼度は、1,000個の複製のブートストラップ再サンプリン
グにより評価した。同義部位あたりの同義置換(Ks)及び非同義部位あたりの非同義置換(Ka)の量を、DNASPを用いて見積もった。RDP2 [18]を用いて、推定モザイク配列を検出した。
ゲノム構成。我々は、チクングンヤウイルスのインド洋大発生の異なる地理的起源、時点及び臨床形(表1)を示す6つのCHIKV分離株(05.115、05.61、05.209、06.21、06.27及び0
6.49)のほぼ完全なゲノム配列を決定した。1952年のタンザニア分離株S27 (全長11,826 nt)のヌクレオチド配列中の52位(5'NTR)〜11,667位(3'NTR、3番目の反復配列の末端)に相
当する11,601ヌクレオチドを決定した。S27とレユニオン分離株との間には3つの挿入/欠失事象があり、そのうち2つは3'NTRで観察された。まず、S27 (11,440-11,443)で見出さ
れ、おそらく内部ポリ-A部位[9]に相当する14ヌクレオチドの内部ポリ-Aストレッチが、
インド洋分離株において、他のチクングンヤウイルス、例えばRoss株(アクセッション番
号: AF490259)で観察されることと同様に、わずか5 Aのストレッチで置き換えられていた。次に、インド洋分離株において、S27の11,625位での5-Aストレッチ中、1つのAが欠失していた。最後に、分離株06.27において、nsP3コドン460に相当する1つのコドンが欠失していたが、ここでは、他のすべてのインド洋分離株が分析され、入手可能なアルファウイルスの配列は、GluをコードするGAAである。
れたものと似ていた[9, 21, 22]。コード配列は、それぞれ非構造ポリタンパク質(2,474
アミノ酸)と構造ポリタンパク質(1,248アミノ酸)とをコードする7,422 nt及び3,744 ntの2つの大きいオープンリーディングフレーム(ORF)からなっていた。非構造ポリタンパク質は、タンパク質nsP1 (535 aa)、nsP2 (798 aa)、nsP3 (530 aa)及びnsP4 (611 aa)の前駆体であり、構造タンパク質は、タンパク質C (261 aa)、p62 (487 aa, E3 - 64 aa及びE2 - 423 aaの前駆体)、6K (61 aa)及びE1 (439 aa)の前駆体である。非構造ポリタンパク質及び構造ポリタンパク質中の、アルファウイルスファミリーに特徴的な切断部位は保存されていた。E3、E2及びE1中のグリコシル化部位も保存されていた。65 ntの連結配列が、
非構造ORFの停止コドン(TAG, 7499-7501)と、構造ORFの開始コドン(7567-7569)との間で
同定された。5'非翻訳領域(5'NTR)は、76位で終結した。3'NTR領域は11,314位で始まり、以前の研究[9]と矛盾しない予測2次構造(図26)を有する3つの反復配列(RSE)を含んでいた。
ついて1.76%)個のアミノ酸置換を、インド洋分離株で示した(表6)。特に、エンベロープ
タンパク質E2は、14 (3.3%) aaの変更の最も高い変動を示し、これはエンベロープタンパク質E1 (0.68%)及びカプシドタンパク質(0.38%)よりも高かった。S27と05.115分離株との間の同義及び非同義部位の進化の割合の比(Ks/Ka)は、ポリタンパク質全体について11.0
であったが、タンパク質E2では6.12でしかなく、このことは、おそらく、この免疫原性タンパク質におけるアミノ酸変化に好ましいポジティブ選択を示すだろう。比較として、Ks/Kaは、非構造ポリタンパク質について18.75であった。
ク質に独特なaaを有していた(表2)。まず、nsP2-54は、インド洋分離株及びSFVではAsnであったが、他のすべての配列ではSerであった。第2に、nsP2-374は、インド洋分離株ではTyrであったが、他のアルファウイルス配列ではHis又はAsnであった(表2)。第3に、nsP4
の500位は、インド洋配列ではLeuであったが、4つの他に報告されたCHIKV配列ではGlnで
あった。興味深いことに、触媒「GDD」モチーフから約30 aaにあるこの位置は、全ての他のアルファウイルスにおいて厳密にGluに保存されている。残りの7つの変化は、比較的可変性の領域で起こっていた。
スにおいて可変である;これは、中和エピトープを含むとして以前に定義された領域に存在する[5, 25]。312位にて、他のCHIKV、ONNV及びSFVにおいてThrが存在するが、他のア
ルファウイルスでは変動する;これは、E1-E2オリゴマー形成に重要であるとして同定さ
れた領域に存在する[5, 25]。
ち3つ(06.21、06.27及び06.49)に存在する284残基で1つの2つの重要な置換が観察された
。両方の変異体は、図1の3D構造で位置決定した(SFV E1の結晶構造からモデルを作製した)。興味深いことに、残基226は、全ての報告されたCHIKV配列において、Alaであり(表2)。ここで配列決定された我々のインド洋分離株の最初のものにおいてもAlaであった(05.61及び05.115、大発生の初期に得られた)。全てのその後の分離株(2005年11月及び12月に採取された患者から得られた)は、この位置においてVal残基を示した。226位はアルファウイルスのうちで比較的可変性であるが、この位置での単独変異(ProからSer)は、SFVが、コレステロール欠損昆虫細胞での成長に適合されることを可能にする[26, 27]。
で高く保存された位置であり、アルファウイルスのほとんどでAspを示すか、又はSINにおいてAsnを示す(表2)。このアミノ酸は、ビリオンの表面でのE1プロトマー間の界面に位置し、正20面体E1骨格を作り上げる接触に参加する(図1)。
E1タンパク質配列に基づく以前の研究は、チクングンヤウイルス種の強い系統地理的(phylogeographic)構造を示した[6, 10]。インド洋大発生分離株が出現した始原系統群を決定するために、我々は、レユニオン、セーシェル、マダガスカル、マヨット及びコモロからの60人の患者からの63の生物学的検体(表1)、及び29の他の入手可能なチクングンヤ配列(表7)からのE1コード配列(271位〜1314位、すなわちコドン91〜438)内の1,044 nt領域を比較した。系統発生的分析(図2)は、現在のインド洋分離株が、東部、中央及び南部アフリカからの分離株を含む広い群(群ECSA)内で均一の(homogeneous)クレードを表すことを明確に証明した(ECSA、図2)。コンゴ民主共和国での大発生からの分離株[6]も、ECSA群内で均一のクレードを形成した。ECSA群のメンバーでは、インド洋分離株と著しくより近い関係を示したものはなかった。アジア分離株は、インド洋分離株とは関係がより低く、ECSA群とは姉妹群を構成したが、西部アフリカ分離株は、さらにより分岐していた。最も近縁の親戚であるONNを含む他のアルファウイルスを含めると、チクングンヤ分離株の始祖は、西部アフリカ系統群に導かれる枝上に位置する(データ示さず)。
が分離株05.115で明らかになった(表8)。アジアクレードNagpur株は、05.115から5.1%平
均ヌクレオチド分岐を示し、西部アフリカクレードセネガル株37997は、15%の違いを示した(表8)。興味深いことに、後者の株は、東部アフリカ及びインド洋大発生分離株と87ヌ
クレオチド部分(9,958〜10,045、構造タンパク質6KとE1との間の連結)の完全な保存を示
した。この部分の配列同一性は、西部アフリカ株と、東部/中央アフリカ株との間の過去の遺伝的組換え事象を反映し得る。これとは異なって、ヌクレオチド多形のS27分離株及
びレユニオン分離株の密度においていくらかのゲノム領域は異なっていたが、S27分離株
とレユニオン分離株との間の分裂以来、配列モザイク現象又は組換えについての統計学的サポート(P>7E-2)は、見出されなかった。
非構造タンパク質での特定のaaの変化が、分離株05.209 (S358P)と06.27 (nsP1-T301I
、nsP2-Y642N及びnsP3-460del)との間で観察された。構造タンパク質において、変化E1-A226Vが、分離株06.21、06.27及び06.49にて、並びに変化E2-Q146Rが、セーシェル分離株05.209にて観察された。これらの非同義的変化に加えて、05.209、06.27及び06.49にて8つのサイレント置換があった(表3)。
turning)で戻ってきたレユニオン患者から、大発生の開始である2005年3月に単離されたからである。特に、分離株05.61及び05.115 (分析された2番目に初期の分離株であった)
、アフリカ分離株S27、並びにアフリカ及びアジアからの無関係の以前のチクングンヤ分
離株は、14個の多形部位全てで同一であった。よって、分離株05.61及び05.115のコンセ
ンサス配列(コンセンサス配列1)は、レユニオン大発生の先祖の遺伝子型を示すようであ
る。14個の多形の分布は、この創始者が、4つの工程で進化したであろう3つのコンセンサス配列を増加させたことを示唆する。まず、10,670位のゲノムでの置換(E1のA226Vの変化をもたらす)は、2006年11月後期分離株06.21により表されるコンセンサス配列2を増加さ
せた。次いで、6,547位でのGからAへの同義置換(nsP4)が、中間配列を導き、これ自体が2つの後期の配列:4つのさらなる置換及び1つのコドン欠失(表3)に続くコンセンサス配列3
(分離株06.27)、及び3つの異なる同義置換の後に増加する(表 3)コンセンサス配列4 (06.49)を増加させる。5番目のコンセンサス配列は、セーシェル分離株05.209単独で表され、これは、コンセンサス配列1に比較して(図3)、4つの置換を示す(これらの2つはnsP3 - S358P及びE2 - Q146Rにおいてaa変化を引き起こす)。
のCSFからの57個の配列)で残基226を比較した。特に、E1-226の性質は、冬季の前後では
レユニオン島において全く異なった。2005年3月から6月までサンプリングされた患者からの5つの配列(コモロから帰国した旅行者を起源とする配列を含む)は、E1-226Aを有していた。2005年の9月から12月の間に、21個の配列が、E1-226Vを示した。2006年からの17個のレユニオン配列のうち、E1-226Vは12回、E1-226Aは5回観察された(表1)。最初の臨床症例が疑われたとき(すなわちおそらく大発生の最初)に試料が回収されたマダガスカル及びセーシェル配列に対して、E1-226 Alaのみが観察された。マヨット2006配列に対しては、E1-226 Vのみが観察された。モーリシャス2006配列に対しては、E1-226 Ala及びValがともに観察された。
体が配列決定されている[9]。我々は、インビトロで1又は2回しか継代されていない6つの臨床分離株のほぼ完全なヌクレオチド配列を初めて提供する(M&Mの部分を参照)。感染患
者での、変異と天然の選択との間のバランスにより支配される平衡に共存する遺伝子型を有する擬似種と呼ばれる[31〜33]混合ウイルス集団の存在。インド洋分離株でのオパール停止コドンの代わりにS27でArgが存在することは、S27のインビトロでの多数の継代によ
りおそらく説明される。なぜなら、オパールからArgへの進化は、ONNウイルスにおいて実験的に観察されたからである[23]。ウイルス擬似種にとって、オパールコドンをインビボで維持することが有利であるが、Argコドンは、近縁のセムリキ森林ウイルスで観察され
たように[34]、おそらく、インビトロで選択的利点を与える。チクングンヤウイルス擬似種のインビボでの状況は、LCR分離株06.27について観察されるnsP1-T301I多形も説明しうるだろう。実際に、この変化を有する遺伝子型のサブセットについての選択は、LCRの侵
入に関連し得るようである[33]。これらの結果は、実験室の「参照」株のゲノム配列が、天然の状況を正確には反映しないであろうことを強調する。なぜなら、インビボ擬似種の遺伝子型の複雑性が、インビトロ選択による侵食(erosion)を受けやすいからである。こ
こで配列決定されたインド洋分離株は、わずかな世代についてのみインビトロ選択を受けやすいので、これらは、おそらく、以前に配列決定されたチクングンヤ株よりもインビボ遺伝子型により密接に相当するであろう。
原性の特徴に関係し得る。我々のウイルス培養の結果は予備的であるが、これらは、新生児脳症の症例から分離されたCSFからの独特な分離株(06.27)と、疾患の典型的な形又は脳症のいずれかに関連する3つのその他の分離株との間の表現型の違いを明確に示す。06.27を用いる培養で観察されるより大きいフォーカスは、ウイルスのより高い複製速度を反映し、nsP1、nsP2及びnsP3で同定される特定のアミノ酸の変化に連結し得る。Thr/Ile変化(シンドビスウイルスの残基538) [35,36]を含むnsP1における単一アミノ酸変化、及びnsP3における18-nt欠失は、以前に、他のアルファウイルスにおける神経毒性(neurovirulence)に影響することが示されている[35〜37]。しかし、nsP1構造データの非存在下では、06.27分離株で観察されるI301T変化の構造的又は機能的な影響を予測することは困難である。3つの新生児脳症の症例及び成人の髄膜脳炎の症例からの血清又は分離株のいずれかから決定された全てのウイルス配列が、E1-226 Valを有していたことにも注目すべきである。しかし、この遺伝子型は、疾患の典型的な形でも観察されるので、E1-226 Valと神経病因との連結の可能性については、さらに研究する必要がある。疾患の神経学的な形の発生においては、受容者の因子を考慮すべきである。例えば、血液-脳の通過は、若年又は高血圧の受容者に有利であろう。
CHIK 21ウイルス株(Schuffeneckerら, Plos Med., 3:1058, 2006)からのpE2糖タンパク質(E3+E2)をコードするcDNAを含むTOPO/CHIK-21.pE2 (CNCM I-3587)プラスミドを、E2エ
ンベロープ糖タンパク質の外部ドメインのPCRによる増幅のための鋳型として用いた(図29)。gp-E2の外部ドメイン(E2-1〜E2-364; E2の85%)は、2005〜06年の集団発生の間にインド洋で分離されたCHIK-21、-27、49及び115細胞系統の間で厳密に保存されている(図29を参照)。sE2の可溶形は、gp-E2外部ドメインに相当し、これは、その膜貫通アンカー領域のカルボキシル末端で除去される。ウイルス中和抗体を惹起する主要なエピトープを可溶形が有することは、興味深い。PCRプライマーは、図30に示す(配列番号79及び80):これらは、pMT/BiP/V5-HisAベクター(Invitrogen)のユニークBg/II及びNotl部位の間のsE2配列のクローニングを、一方でN-末端のBiPペプチドシグナルに依存する相において、そして他方でそのカルボキシル末端での連続V5 (His)6タグの連結において、可能にする。
ブラスチシジンの存在下での連続形態により得た。細胞系統を、メタロチオネインプロモーターの活性化の後に、CHIK- sE2ウイルスの効率的な分泌を促進するその能力について選択した。
(Amersham Biosciences)の親和性カラムで16時間濃縮した。CHIK sE2タンパク質は、漸
増濃度のイミダゾール(50、100及び500 mM, pH 8)の存在下で親和性カラムから溶出され
る。CHIK sE2タンパク質は、500 mMイミダゾール(E3溶出)の濃度で、E37フラクションか
ら特異的に溶出される(図31)。sE2タンパク質は、PAGESDS、続いてクーマシーブルー染色において、高度に精製されているように検出される。E39フラクションで溶出されるsE2タンパク質は、IMFH単位で産生されたCHIKウイルスに対して過免疫されたマウスの腹水(HMAF)により特異的に免疫検出される(図32)。抗デング(DEN)又は抗西ナイル(WN) HMAHF及びモノクローナル抗体9D12 抗DEN Eとの交差反応性は観察されなかった。上記のプロトコルにより誘導されたS2細胞クローンの上清から精製された可溶性DEN sEタンパク質(DEN-3及びDEN-4)、並びにWN sEを、抗CHIKマウス抗体の特異性についての対照ウイルス抗原として用いる。
CHIK sE2タンパク質をコードする遺伝子は、ウイルスゲノムRNAから得られるcDNAに比
較してG+C含量が増加した合成DNAを提供するように、Genecust社(firm)により最適化した。G+Cリッチコドン(アミノ酸E2-1からE2-364、可溶性gp-E2外部ドメイン、sE2)を、ウイルスタンパク質を分泌経路に輸送するために、ヒトカルレティキュリンのシグナルペプチド配列(ssCRT) MLLSVPLLLLGLLGLAA (配列番号77)に融合させた。5'及び3'の酵素制限部位BamHi及びXholは、ssCRT+sE2融合タンパク質をコードする配列のそれぞれの末端に付加した。
ラスミドを、293細胞の形質導入の後にsE2タンパク質の発現について確認した。
図35は、TRIP-CHIK.sE2ベクターで形質導入された293細胞のような哺乳動物細胞を示す。発現されたsE2タンパク質は、IFにより、抗CHIK抗体を用いて明らかにされている。
本発明者らは、レユニオンCHIKウイルス株からのエンベロープE2-糖タンパク質の可溶
形(sE2)を放出する安定な誘導性S2/CHIK.sE2細胞系統を作製した。本発明者らは、組換えレンチウイルスベクターTRIP/CHIK.sE2により形質導入された安定細胞系統293A/CHIK.sE2も作製した。哺乳動物細胞における最適コドン使用に修飾された合成sE2遺伝子を、ヒト
繊維芽293A細胞におけるCHIKウイルスsE2の効率的な発現を得るために、用いる必要があ
った。TRIP/CHIK.sE2ベクターは、現在、実験的感染のマウスモデルにおいて防御免疫を
誘導するその能力について評価している。CHIK pE2が主に増加したウイルス懸濁物(E2前
駆体又はE3E2)を、Triton X-100を用いて、蚊細胞で成長したCHIKビリオンを可溶化する
ことにより得た。成体マウスを、CHIK構造タンパク質に指向されたハイブリドーマを作製するために、アジュバントの存在下でCHIK pE2を用いて過免疫した。マウスハイブリドーマにより産生された抗CHIK E2モノクローナル抗体を、高度に精製されたCHIKビリオンに
対するELISAアッセイ、及び安定細胞系統S2/CHIK.sE2からの分泌sE2に対するウェスタン
ブロットにより特徴決定した(図50、51及び表9)。細胞内又は表面ウイルス抗原の蛍光免
疫検出アッセイも、CHIKウイルスを感染させたVERO細胞、及び安定293A/CHIK.sE2形質導
入細胞系統に対して確立した(図52〜55)。本発明者らの抗CHIK.sE2 MAbsは、患者のウイ
ルス血症の血液中のCHIKビリオンの免疫捕捉に基づくCHIK疾患の早期のウイルス診断の開発における使用、並びに免疫学的及びウイルス学的な研究のためのツールとしての使用の可能性を有する。
Claims (11)
- 図8に示す配列からなるゲノムを有する、インビトロでヒト細胞に感染可能なチクングンヤウイルス(CHIKV)の分離されかつ精製された野生株06.49。
- 図8に示す配列からなる分離されかつ精製されたポリヌクレオチド。
- 糖タンパク質E2の外部ドメインをコードする請求項2で定義されるポリヌクレオチドのフラグメント。
- 糖タンパク質E2の可溶形をコードする請求項2で定義されるポリヌクレオチドのフラグメント。
- 糖タンパク質E1の外部ドメインをコードする請求項2で定義されるポリヌクレオチドのフラグメント。
- 請求項3〜5のいずれか1項で定義されるフラグメントを含むベクター。
- 請求項6で定義されるベクターを含む宿主細胞。
- 請求項3〜5で定義されるポリヌクレオチドのフラグメントによりコードされる精製されたポリペプチド。
- 図41で定義される配列からなる精製されたポリペプチド。
- - 図8に示す配列からなるポリヌクレオチド;
- 請求項3〜5のいずれか1項で定義されるフラグメント;
- 請求項6で定義されるベクター;
- 請求項7で定義される宿主細胞;
- 請求項8又は9で定義されるポリペプチド;並びに
- 請求項8又は9で定義されるポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル若しくはポリクローナル抗体又はそのフラグメント
からなる群より選択される成分の、アルボウイルス症に関連するCHIKVのインビトロ検出のための使用。 - - 図8に示す配列からなるポリヌクレオチド;
- 請求項3〜5のいずれか1項で定義されるフラグメント;
- 請求項6で定義されるベクター;
- 請求項7で定義される宿主細胞;
- 請求項8又は9で定義されるポリペプチド;並びに
- 請求項8又は9で定義されるポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル若しくはポリクローナル抗体又はそのフラグメント
からなる群より選択される少なくとも1つの成分を含む、アルボウイルス症に関連するCHIKVの検出のためのキット。
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